Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

. ? ) / о „/„у .... .'')

*4 / » к / / /

( * - ГУ/ V,? ( (

/

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.3

КОЛОБАНОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ В СЕГМЕНТНОЙ КОНДЕНСАЦИИ ПЕПТИДОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: чл.-корр. РАН,

профессор В.М. Степанов,

кандидат химических наук, с.н.с. И.Ю. Филиппова

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ

1.1. Общая характеристика субтилизинов. 8

1.1.1. Строение молекулы субтилизинов 8

1.1.2. Активный центр и механизм катализа 12

1.1.3. Зона связывания субстрата и специфичность 15

1.2. Модификация субтилизинов. 23

1.2.1. Модификация активного центра.

1.2.1.1. Тиолсубтшизин и субтшигаза 23

1.2.1.2. Свленосубт ил из ии 37

1.2.1.3. Ангидросубтилизин .. . . 49

1.2.1.4. Модификация остатков А$р32, Н1з64, Абп155 41

1.2.2. Замены аминокислотных остатков вблизи активного

центра и в зоне связывания субстратов. 42

1.2.3. Мутации в участках связывания ионов Са2+. 51

1.2.4. Модификации в областях, удаленных от активного центра. 52

1.3. Заключение. 61

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 63 II. 1.1. Получение и свойства тиолсубтилизина 65 II. 1.2. Тиолсубтилизин как катализатор синтеза различных пептидов 74 II. 2. БВЗ-субтшшзии как возможный катализатор синтеза пептидов

на твердом носителе 82

II. 2.1. Выбор носителя 84

II. 2.2. Выбор спейсера 85

II. 2.3. Модельная реакция 86

II. 2.4. Двух- и трехстадийная конденсация пептидных сегментов

на аминосилохроме 91

II.2.5. Отщепление пептида от твердого носителя 98

II. 3. Заключение 99 III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы 102

III.I. Получение и изучение ферментативных свойств тиолсубтилизина

111,1,1. Получение тиолсубтилизина 104

III. 1.2. Выделение тиолсубтилизина 104 III, 1,3. Определение ферментативной активности

III. 1.3.1. Определение активности по Glp-Ala-Ala-Leu-pNA 105

III. 1.3.2. Определение активности по п-нитрофенилацетату 105

III. 1.3.3. Определение активности по азоказеину 105

III. 1.4. Определение цистеина 106

III. 1.5. Определение сульфгидрильных групп 106 III. 1.6. Гидролиз эфиров пептидов и аминокислот

тиолсубтилизином 106 III. 1.7. Синтез пептидов при помощи тиолсубтилизина

(типичная методика) 107

III. 1.8. Определение выхода пептидов методом ВЭЖХ 107

III. 1.9. Препаративный синтез Z-Phe-Gly-NIfy 107

III. 1.10. Препаративный синтез Z-Phe-Ala-Ala-pNA 108 III.2. Конденсация пептидов на твердом носителе под действием SDS-субтилизина

111.2.1. Получение комплекса SDS-субтилизин 109

111.2.2. Синтез H-Met- Gly-Gly-аминосилохрома

III. 2.2.1. Присоединение Вое-Met-Gly-Gly-ОН к аминосилохрому 109

III. 2.2.2. Ацетилирование свободных аминогрупп 110

III. 2.3. Пикриновый тест 110

III. 2.2.4. Удаление Вос-группы 111

111.2.3. Синтез Dnp-Alu-Ala-Leu-Met-Gly-Gly-амино-

силохрома 111

III.2.4. Катализируемый субтилизином гидролиз пептидил-

аминосилохрома 112

111.2.5. Синтез Dnp-Ala-Ala-Leu-Met-Gly-Gly-aMum-

силохрома 112

111.2.6. Синтез Boc-Ala-Ala-Leu-Phe-Met-Gly-Gly-аминосилохрома 112

111.2.7. Отщепление пептида от твердого носителя с

помощью BrCN 114

ВЫВОДЫ 115

БЛАГОДАРНОСТИ 116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ас - ацетил

ArSH - З-карбокси-4-нитробензилтиол Вое - третбутилоксикарбонил t-Bu (Bu1) - третбутил Bz - бензоил Bzl - бензил

DeD - N - [2 - (2,4 -динитр о ф енил амин о) -этил] - амид

DHA - дегидроаланин

Dnp - 2,4-динитрофенил

ЕН - фермент

Е-ОН - субтилизин

Е-S H - тиол субтилизин

Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил

glc - гликолил (остаток гидроксиуксусной кислоты)

Glp - пироглутаминовая (пирролид-5-он-2-карбоновая) кислота

OEt - этиловый эфир

ОМе - метиловый эфир

ONp - 4-нитрофениловый эфир

OPhCl - 4-хлорфениловый эфир

OSu - N-оксисукцинимидный эфир

PMS F - фенилметансульфонил фторид

pNA - 4-нитроанилид

SBL - субтилизин Bacillus lentus

SBzl (Sbz) - тиобензиловый эфир

SDS - додецилсульфат натрия

Suc - сукцинил

Tos - тозил

Z - бензилоксикарбонил

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ДЦГКД - К^'-дициклогексилкарбодиимид

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ДТТ - дитиотреитол

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Все аминокислоты Ь-ряда, если не указано особо.

ВВЕДЕНИЕ

Биокаталитический способ образования пептидной связи в последнее время рассматривается как перспективный метод для масштабирования и упрощения синтеза коротких пептидов, в том числе биологически активных соединений и лекарственных препаратов. Использование ферментов позволяет проводить пептидный синтез в мягких условиях, без защиты боковых функциональных групп реагентов и опасности рацемизации, исключает применение экологически вредных конденсирующих агентов. Преимущества ферментативного подхода могут быть использованы в синтезе протяженных пептидов при конденсации отдельных сегментов. Разработка новых подходов для проведения ферментативной фрагментной конденсации пептидов, а также расширение круга ферментов, адаптированных к условиям проведения таких реакций, является весьма актуальной проблемой.

Целью данной работы являлось изучение ферментативного метода синтеза пептидов с использованием в качестве катализаторов модифицированных субтилизинов - тиолсубтилизина и Б Б 8 - субтилизина. Задачи исследования включали:

1) получение и разработку метода очистки тиолсубтилизина;

2) изучение функциональных свойств тиолсубтилизина в условиях синтеза различных пептидов;

3) исследование нового подхода к фрагментной конденсации пептидов под действием БВБ-субтилизина на основе сочетания преимуществ ферментативного синтеза пептидов с идеологией твердофазного химического синтеза.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ 1.1. Общая характеристика субтилизинов.

Субтилизиноподобные протеиназы, или субтилазы, принадлежат к классу сериновых протеиназ, названных так по аминокислотному остатку, характерному для их активных центров. Они широко распространены в природе и вместе с ферментами других классов обеспечивают глубокое расщепление белков и целый ряд реакций ограниченного протеолиза, имеющих регуляторное значение [1]. Субтилазы особенно характерны для прокариот, но встречаются также в растениях и животных [2]. Попытка систематизировать субтилизиноподобные ферменты была предпринята Сизеном с сотрудниками [3, 4]. В результате сравнения 170 известных первичных аминокислотных последовательностей субтилизиноподобных ферментов авторы предложили деление субтилаз на шесть семейств (субтилизина, термитазы, протеиназы К, лантибиотической пептидазы, кексина, пиролизина), каждое из которых было поделено еще на несколько подгрупп. Сериновые протеиназы из семейства субтилизина пока обнаружены только в микроорганизмах, главным образом это ферменты из Bacillus. Это семейство включает в себя подгруппы типичных субтилизинов, сильнощелочных протеиназ и внутриклеточных протеиназ [4].

1.1.1. Строение молекулы субтилизинов.

Первые субтилизины были выделены в 40-е - 50-е годы. Сначала в Карлсбергской лаборатории в 1947 году Линдерстром-Ланг и Оттенсен открыли субтилизин, продуцируемый Bacillus licheniformis, и назвали его субтилизин Карлсберг [5]. Несколько позднее в этой же лаборатории из другого вида Bacillus был выделен близкий фермент - субтилизин Novo. В 1958 году в Японии был получен субтилизин BPN' из Bacillus amyloliquefaciens [6]. Было установлено, что субтилизины являются белками

основного характера с положением изоэлектрической точки при pH 8-9 и молекулярными массами порядка 27-29 кДа [7]. Вскоре были определены структуры этих субтилизинов; для субтилизинов Novo и BPN' аминокислотные последовательности оказались одинаковы и содержали 275 аминокислотных остатков. Для субтилизина Карлсберг первичная структура отличалась по 82 различным положениям и содержала на один аминокислотный остаток меньше. На протяжении последующих лет было выделено и охарактеризовано более 50 субтилизинов и их аналогов [4]. В 1979 г. в России в высокоочищенном сосоянии была получена щелочная протеиназа - субтилизин 72, секретируемая Bacillus subtilis штамм 72. N-концевая последовательность (до 35 шага) субтилизина 72 оказалась схожей с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг за исключением двух аминокислотных остатков в положениях 21 и 30. Значительная степень гомологии говорила о том, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен, субтилизину Карлсберг [8].

Для большинства представителей семейства субтилизина был сделан рентгеноструктурный анализ и проведено сравнение с типичными субтилизинами, такими как Карлсберг и BPN' [9-16]. Данные ретгеноструктурного анализа показали, что молекула субтилизина имеет сферическую форму с диаметром 42 А. Вторичная структура субтилизинов представлена тремя ß-слоями (сильно скрученного параллельного ß-слоя, состоящего из семи цепочек, и двух антипараллельных ß-слоев) и девятью а-спиралями (Рис. 1). Центральный параллельный ß-слой делит молекулу на два неравных по размеру домена [10]. Больший домен содержит связку из семи а-спиралей, пять из которых проходят антипараллельно цепям центрального ß-слоя. В состав меньшего домена входят две оставшиеся ос-спирали, также проходящие параллельно ß-слою. Ядро молекулы состоит из 190 гидрофобных аминокислотных остатков, образующих сильно скрученный ß-складчатый слой и две а-спирали [3]. Остальные а-спирали находятся на поверхности молекулы (Рис. 1) [9].

Рис.1. Схематическое изображение вторичной и третичной структуры субтилизинов [4].

Полипептидная цепь ферментов содержит как консервативные, так и вариабильные области. Во всех известных последовательностях субтилизин-подобных протеиназ полностью консервативными являются важные остатки каталитического центра Аяр32, Н1з64 и Бег221 и остаток 01у219*. Четыре других остатка в1у (34, 65, 83 и 154), входящие в состав петель между спиралями и слоями, также, как правило, консервативны, хотя встречаются одна или две их замены. Обычно замена того или иного остатка происходит на структурно похожий аминокислотный остаток.

"Здесь и в последующих примерах нумерация дается в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина ВРГЧ'.

В основном, остатки двух внутренних спиралей hC и hF являются самыми высоко консервативными во всех субтилазах (Рис. 1). Вариабельные области почти всегда соответствуют петлям, связывающим a-спирали и (3-слои, и в основном расположены на внешней поверхности белка [4]. Различия в аминокислотной последовательности не приводят к изменениям каталитических свойств субтилизинов.

На основании данных рентгеноструктурного анализа было обнаружено, что молекулы субтилизинов содержат области повышенной электронной плотности, в которых находятся ионы Са2+ [9, 10]. На одну молекулу фермента может приходиться от двух до четырех ионов Са2+ [4]. Первый участок связывания иона Са2+ (Cal) расположен внутри петли сегмента из аминокислотных остатков 76-81. Ион Са2+ находится в центре почти правильного восьмигранника, образованного атомами кислорода лигандов. Три из этих атомов кислорода принадлежат карбонильным группам остатков Leu75, Thr79 и Val81 (в субтилизине Карлсберг), два других атома входят в состав боковых функциональных групп остатков 2 и 77, обычно это Gin и Asn. Ориентация боковых групп этих остатков способствует образованию тесных контактов между ионом металла и атомами кислорода. Шестой угол восьмигранника занимает карбоксильная группа остатка Asp41 (в субтилизине Карлсберг) [9]. Участок Cal обнаружен почти у всех представителей семейства субтилизинов [4].

Участок связывания иона Са2+, обозначаемый как Са2, присущ далеко не всем субтилизинам. В субтилизине Карлсберг этот участок окружен петлей, образованной остаками 49-58 [10]. Лигандами иона металла являются атомы кислорода, принадлежащие остаткам 49, 52, 54, 94.

Следующий участок связывания иона металла (СаЗ) находится в центре петли, образованной сегментом Рго168-11е175. Этот участок, так же как и участок Са4, слабо связывает ион Са2+ и формируется лигандами боковых цепей одного или двух аминокислотных остатков [9]. Участок СаЗ имеется у большинства представителей семейства субтилизинов, а Са4 является редким и обнаружен только у протеиназы К [17].

1.1.2. Активный центр и механизм катализа.

Активный центр субтилизинов находится в достаточно обширном N-концевом домене. Он состоит из оксианионной впадины и так называемой каталитической триады - остатков Ser221, His64 и Asp32 - которая расположена в углублении на поверхности молекулы у края центрального ß-слоя [15, 18]. В каталитическом механизме серин выполняет функцию основного нуклеофила, гистидин играет двойную роль: на разных стадиях реакции он может быть и акцептором, и донором протона. Роль аспарагиновой кислоты сводится к тому, чтобы привести остаток гистидина в правильную ориентацию для облегчения нуклеофильной атаки серином [15]. Функциональная значимость каталитической триады и оксианионной впадины в катализе была доказана с помощью сайт-направленного мутагенеза [19-22]. Протонированные состояния каталитических остатков His и Asp были изучены с помощью ЯМР [18, 20, 23, 24], нейтронной дифракции [25], а также посредством методов белковой инженерии [26, 27]. Было показано, что вблизи His каталитической триады наблюдается область пониженной электронной плотности [28-30], которая, по мнению Фрея с сотрудниками [28], обусловлена образованием так называемой "низкобарьерной" водородной связи между His64 и Asp32. Исследователи полагают, что такая водородная связь возникает при образовании ацил-фермента и служит для стабилизации переходного состояния. Однако Кухн с сотрудниками [15] попытались опровергнуть это предположение. Для объяснения подобного явления была предложена версия о существовании водородной связи между His64 и Asp32 не только в переходном ацил-ферменте, айв самом ферменте в отсутствии субстрата. В качестве объекта был выбран субтилизин Bacillus lentus (BLS), который отличается от субтилизина BPN' на 103 аминокислотных остатка из 269 возможных, включая делецию 6 остатков. Исследования с помощью ЯМР показали, что в В LS также наблюдается область пониженной электронной плотности вблизи атома N81 His64 [29]. Кроме того, было обнаружено, что Asp каталитической триады участвует в сложной сети водородных связей с

соседними остатками, и одна из этих водородных связей - водородная связь между АБр32 и Шз64 необычно короткая (Рис. 2) [15].

Рис. 2. Схематическое изображение каталитической триады в субтилизинах

Рентгеноструктурный анализ при высоком разрешении (0,78 А) показал, что расстояние между N51 His64 и 052 Asp32 составляет 2,6 А, и атом водорода расположен на расстоянии 1,2 А от His (дальше, чем определено для обычных N-H и С-Н связей) и 1,5 А от Asp (на 0,3 А ближе, чем обычно). Атом водорода, участвующий в этой короткой водородной связи, находится в плоскости боковых цепей His64 и Asp32. Короткую водородную связь исследователи обозначили как каталитическую водородную связь, существующую внутри каталитической триады. Остаток Asp32 образует водородную связь с растворителем (01059) и с остатком Thr33, эти связи

[15]

имеют нормальную длину. Связь 052-Су имеет более выраженный характер двойной связи, чем связь 051-Су, но значительные различия в длине этих связей не были определены. Было обнаружено, что Оу Ser221 находится на расстоянии 3,1 А от Ne2 и является относительно подвижным.

Несмотря на существующие разногласия [18, 31], каталитический механизм действия субтилизинов в общих чертах можно описать, используя схему, представленную на рис. 3 [32]. Остаток Asp32 образует водородную связь с соседней имидазольной группой. Это взаимодействие стабилизирует определенную электронную структуру имидазольного кольца His64 и увеличивает рКа имидазольной группы [33]. Увеличение рКа оказывается выгодным, так как в противном случае, когда в процессе реакции His "закрывается" субстратом, имидазольная группа могла бы иметь пониженную рКа, и His с трудом бы принимал протон.

Catalytic triad

п г у т е

СН,

Т

н n.

-сн.

-Т

н

JL>

н

°ч>

Substrate

Г'

с=о

I

HN _

\

-СН2- 9 -С—о' I

н NH JLn^ r2

-сн2-#-с=о-н+-он"

п-N

Г > Н Н Vx

Tetrahedral intermediate

H

О. о-

\

Acyl intermediate

X,

г

с=о I

он

-сн-#

je:>

н

о. о-

R, И

-с-о он

+н2о

Y

Tetrahedral intermediate

R

2

Рис. 3. Схема механизма катализа сериновыми протеиназами [32].

В процессе каталитической реакции имидазольная группа принимает протон от Оу Ser221, становится положительно заряженной и образует солевой мостик с Asp32. Взаимодействие между остатками Ser и His отличается от взаимодействия между остатками Asp и His, оно энергетически более слабое. Но, скорее всего, сильная связь могла бы помешать переносу протона [32]. Таким образом, способность His64 принимать протон от Оу Ser221 обусловлена не только разницей относительных рКа этих остатков, но и сложной сетью нековалентных контактов, охватывающих фермент-субстратный комплекс. Немаловажную роль в механизме катализа играют взаимодействия, обеспечивающие связывание субстрата с активным центром. Они корректи