Синтез хромогенных субстратов и ингибитора глутамилэндопептидаз с использованием субтилизина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Мильготина, Екатерина Иосифовна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2001 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Синтез хромогенных субстратов и ингибитора глутамилэндопептидаз с использованием субтилизина»
 
 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Мильготина, Екатерина Иосифовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6 1. GLU, ASP-СПЕЦИФИЧНЫЕ ЭНДОПЕПТИДАЗЫ литературный обзор) 8 1.1.Место глутамилэндопептидаз в классификации ферментов (введение)

1.2.0сновные физико-химические свойства

Х.З.Влияние ионов и ингибиторов

1.3.1. Влияние катионов металлов

1.3.2.Влияние анионов буферных растворов

1.3.3. Влияние ингибиторов

1.4.Субстратная специфичность

1.4.1.Гидролиз низкомолекулярных пептидных субстратов, катализируемый глутамилэндопептидазами

1.4.2.Гидролиз белковых субстратов, катализируемый глутамилэндопептидазами

1.5.Функциональная организация глутамилспецифичных эндопептидаз

1.5.1.Анализ первичной структуры

1.5.2. Пространственная структура глутамилэндопептидаз

1.5.2.1.Пространственная структура глутамилэндопептидазы из Streptomyces griseus

1.5.2.2. Компьютерное моделирование пространственных структур глутамилэндлпептидаз

1.5.2.2.1. Модель глутамилэндопептидазы из Bacillus licheniformis

1.5.2.2.2.Модель глутамилэндопептидазы из Bacillus subtilis

1.5.2.2.3.Модель глутамилэндопептидазы из Staphylococcus aureus, шт. V

1.6.Применение глутамилспецифичных эндопептидаз

1.6.1. Применение глутамилэндопептидаз для гидролиза пептидных последовательностей

1.6.2.Использование глутамилспецифичных эндопептидаз в качестве катализаторов реакций образования пептидных связей

1.6.3.Использование концепции субстратов-миметиков в ферментативном пептидном синтезе

 
Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

ВЫВОДЫ

1) Разработан ферментативный метод синтеза пептидов, содержащих на С-конце и-нитроанилиды глутаминовой и аспарагиновой кислот. Впервые показана возможность использования производных Glu и Asp в катализируемом субтилизином пептидном синтезе.

2) По разработанной методике с высокими выходами синтезирована серия хромогенных субстратов, определены кинетические параметры их гидролиза эндопептидазами из Bacillus intermedius и Bacillus licheniformis. Установлена структура оптимального субстрата этих ферментов.

3) Исследован гидролиз хромогенных субстратов мутантными формами эндопептидаз из Bacillus intermedius и Bacillus licheniformis, и показано, что остаток гистидина 213 в большей степени влияет на катализ, осуществляемый ферментом, чем на связывание субстрата в активном центре последнего.

4) Впервые с использованием субтилизина в качестве катализатора синтезирован пептидоальдегид, содержащий Glual, и показано, что полученный пептидил-а-аминоальдегид является сильным конкурентным ингибитором эндопептидаз из Bacillus intermedius и Bacillus licheniformis.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 3.1. Материалы и методы.

В работе использованы: сериновая протеиназа В.subtilis, шт.72 (удельная активность по стандартному субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNA 10.7 ед.акт./мг, выделенная в нашей лаборатории из препарата культуральной жидкости [159]; глутамилспецифичные эндопептидазы из Bacillus intermedins и Bacillus licheniformis, полученные в нашей лаборатории из препарата культуральной жидкости[160]; производные аминокислот и пептидов, синтезированные в нашей лаборатории по стандартным методикам [161]; HONSu фирмы "Serva" (ФРГ);

H-Glu-pNA, Boc-Glu(OtBu)-OH фирмы "Bachem" (ФРГ); диметилсульфоксид, ацетонитрил фирмы "Merk" (ФРГ). NaBH4 фирмы "Aldrich" (ФРГ);

K2Cr207, DMF, PdCl2) пиридин, диоксан, хлористый метилен, гидрохлорид семикарбазида, ацетат натрия, ацетилацетон завода "Реахим" (Москва, Россия); дициклогексилкарбодиимид фирмы "Ferak Berlin" (ФРГ); силохром С-80, средний размер пор 440x450 А° фирмы "Реахим" (Ставрополь, Россия); силикагель Kieselgel Woelm DC, TLC (ФРГ).

Тонкослойная хроматография

Индивидуальность синтезированных соединений подтверждали с помощью ТСХ на пластинках "Silufol" (ЧСФР) в следующих системах:

1) н-бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота, 10:15:12:3 (v/v) (А);

2) хлороформ-метанол-аммиак, 75:25:5 (v/v) (Б);

3) изопропанол-аммиак, 7:3 (v/v) (В);

4) этилацетат-хлороформ, 2:1 (v/v) (Г);

5) хлороформ-метанол, 7:1 (v/v) (Д);

6) хлороформ-метанол, 10:1 (v/v) (Е);

7) этанол (Ж).

Соединения, содержавшие пептидную связь и аминогруппу, давали реакцию со свободным хлором (обнаружение с помощью 1% раствора KJ).

Соединения со свободной а-аминогруппой обнаруживали нингидриновым реактивом (0.4% раствор нингидрина в ацетоне).

Соединения, содержавшие свободную альдегидную функцию, давали реакцию серебряного зеркала.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ

Обращённо-фазовая ВЭЖХ проводилась на приборе "Gilson 704" (Франция) с использованием колонок Ultrasphere ODS (4,6 х 250 мм, 5 мкм, Beckman, США) для аналитического разделения и Ultrasil™-octyl (10 х 250 мм, 10 мкм, Altex, США).

Растворы А и Б для хроматографирования содержали 0.05% трифторуксусной кислоты и 0.05%) триэтиламина. Концентрация ацетонитрила или метанола 5% в растворе А и 90% в растворе Б (все проценты объёмные). Разделение проводили в линейном градиенте раствора Б в растворе А:

1) от 30 до 78% за 40 минут, ацетонитрил, скорость элюции 1.5 мл/мин (система А);

2) от 40 до 80%о за 25 минут, метанол, скорость элюции 1 мл/мин (система Б);

3) от 50 до 80 % за 30 мин, метанол, скорость элюции 1 мл/мин (система В);

4) от 50 до 60% за 12 мин, от 60 до 80 % за 3 мин, 80% в течение 10 мин, метанол, скорость элюции 1 мл/мин (система Г);

5) от 10 до 35% за 25 мин, ацетонитрил, скорость элюции 1.5 мл/мин (система Д).

6) от 30 до 60% за 25 минут, ацетонитрил, скорость элюции 5 мл/мин (система Е);

Детекцию осуществляли при 220 нм и 315 нм.

Спектрофотометрические измерения

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометрах "СФ-26" (Россия) и "Shimadzu" (Япония).

Центрифугирование

Центрифугирование осуществляли на "Centrifuge 5415" С фирмы "Eppendorf (ФРГ) при 16000 об/мин.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса

Структуры полученных соединений подтверждали с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии. Спектры 'Н-ЯМР регистрировали в дейтерохлороформе и дейтерированном диметилсульфоксиде на спектрометрах "Brucker MSL-200" (ФРГ) с рабочей частотой 200.13 МГц и "Brucker АС-300" (ФРГ) с рабочей частотой 300.13 МГц. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (5, м.д.) относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана (5 0,000 м.д.). Величины констант спин-спинового взаимодействия приведены в Гц. При описании спектров приняты следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квадруплет, м - мультиплет, у - уширенный сигнал.

Дисперсия оптического вращения

Углы оптического вращения синтезированных соединений измеряли на поляриметре "Jasko DIP-360" (Япония). Аминокислотный анализ.

Аминокислотный гидролиз полученных соединений проводили в стандартных условиях - 6М НС1, 105 °С, 24 часа. Met превращали в метионинсульфон путем предшествовавшего гидролизу окисления пептидил-п-нитроанилида надмуравьиной кислотой. Соединения, содержавшие Тгр, гидролизовали метансульфоновой кислотой. Гидролизат анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе "Biotronik LC-5001" (ФРГ).

3.2. Синтез исходных соединений 3.2.1. Boc-Asp((fBu)-OH

4 г (8.5 ммоль) ДЦГА-соли Boc-Asp(OlBu)-OH суспендировали в 20 мл этилацетата в делительной воронке. К суспензии добавляли 10.2 мл 1н H2S04 и интенсивно перемешивали до полного растворения соли. Водный слой отделяли и промывали этилацетатом (2x5 мл). Объединенные этилацетатные фракции промывали водой (5x5 мл). Органическую фракцию сушили над Na2S04. Затем раствор концентрировали в вакууме. Масло. Выход продукта 2.47 г (99%). Rf в системе А: 0.7.

3.2.2. Вое-Asp ((?Bu)-pNA

Вос-Азр(01Ви)-ОН (2.47 г, 8.5 ммоль) и p-NA (1.17 г, 8.5 ммоль) растворяли в 15 мл абсолютного этилацетата. Раствор охлаждали до 0 °С. При охлаждении и перемешивании добавляли 1.92 г (9.22 ммоль) ДЦГА. В течение 1 часа реакционную смесь перемешивали при охлаждении, затем-при комнатной температуре в течение ночи. Образовавшийся осадок N-дициклогексилмочевины отфильтровывали. Раствор этилацетата промывали последовательно 0.5 н NaHC03 (5x5 мл), Н20 (4x5 мл), 5%-ной лимонной кислотой (5x5 мл), Н20 (4x5 мл), упаривали. Остаток растворяли в 24 мл метанола. Из полученного раствора высаживали Вос-Asp(OlBu)-pNA 15 мл воды. Полученное в результате переосаждения масло очищали гель-фильтрацией на сефадексе LH-20 в метаноле (колонка 2.5 х 40 см). Выход продукта составил 1.34 г (38 %). Rf в системе А: 0.87.

ВЭЖХ: время удерживания 24.0 мин (система Б).

3.2.3. CF3COOH Asp-pNA

1.24 г (3 ммоль) Boc-AsptO'Bi^-pNA растворяли в 22.8 мл СН2С12, затем добавляли 4.56 мл (60 ммоль) трифторуксусной кислоты. Перемешивали в течение 20 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок промывали декантацией СН2С12 (2x3 мл), эфиром (4x3 мл), гексаном (2x3 мл). Выход продукта 897 мг (81%). Rf в системе А: 0.55.

ВЭЖХ: время удерживания 3.5 мин (система А).

3.2.4. Boc-Glu((УBu)-Glu-pNA

К суспензии 100 мг (375 мкмоль) H-Glu-pNA в 1.5 мл ДМФ добавляли 53 мкл ТЭА, а затем по каплям - раствор 100 мг Boc-GlufO'Bu)-ONSu в 1.4 мл ДМФ. Перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель упаривали. Остаток распределяли между 10 мл НгО и 10 мл этилацетата. После отделения фракции этилацетата водный слой еще раз промывали 10 мл этилацетата. Доводили рН водной фракции 5%-ной лимонной кислотой до 2, затем водный слой промывали этилацетатом (4x5мл). Объединенные этилацетатные фракции промывали водой до нейтральной реакции. Сушили над Na2S04. Растворитель упаривали. Выход продукта 133 мг (96%).

ВЭЖХ: время удерживания 14.7 мин (система А).

3.2.5. Glu-Glu-pNA

117 мг (212 мкмоль) Boc-Gli^O'Bi^-Glu-pNA растворяли в 2 мл хлористого метилена. К полученному раствору добавляли 388 мкл (5 ммоль) трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем упаривали с толуолом. Остаток промывали эфиром декантацией. Выход продукта 79 мг (95%). ВЭЖХ: время удерживания 7.2 мин (система Д).

3.2.6. Приготовление хромового ангидрида (СгО$) [150]

100 г К2Сг207 растворяли в 300 мл Н20 при небольшом нагревании. Насыщенный раствор К2Сг207 отфильтровывали в фарфоровую чашку. Из капельной воронки добавляли 280 мл концентрированной H2S04. Выпавшие красные игольчатые кристаллы СЮ3 отфильтровывали, промывали на фильтре 15 мл ледяной уксусной кислоты. Сушили в вакууме над щёлочью. Выход: 34 г (34%).

Температура плавления 197+199° (литературные данные [162]: 198°).

3.2.7. Приготовление комплекса Ру Сг03 [150]

К охлаждённому раствору 13,46 г СЮ3 в 13,5 мл Н20 при перемешивании добавляли по каплям 10,9 мл пиридина, температура не превышала 30°. Затем смесь разбавляли 53,9 мл ацетона, оставляли на 4 часа при -15°С. Выпавшие оранжевые кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре ацетоном, сушили в вакууме над щёлочью. Выход: 15,7 г (65 %).

Температура плавления 152+154° (литературные данные [162]: 153°).

3.2.8. Приготовление Pd-черни

1.5 г (8.5 ммоль) PdCl2 растворяли в 80 мл кипящей воды. К полученной суспензии коричневого цвета довбавляли 10 мл 0.5 н НС1, после чего реакционную смесь нагревали до полного растворения хлористого палладия. Затем добавляли 0.25 мл 99.7% муравьиной кислоты, 12 мл 11,2%-ного раствора КОН. рН реакционной смеси 9.0. Наблюдали мгновенное обесцвечивание раствора и выпадение черного осадка Pd-черни. Добавляли 200 мкл 99.7%-ной муравьиной кислоты.

Раствор декантировали, несколько раз промывали водой посредством декантации. Pd-чернь оставляли в пробирке под водой.

3.2.9. Приготовление аммиачного раствора серебра

0.25 г. AgN03 растворяли в 4 мл ШО, по каплям прибавляли концентрированный раствор аммиака до растворения образовывавшегося осадка. К полученному раствору добавляли 9 мл 3%-го раствора NaOH, затем концентрированный раствор аммиака до растворения появлявшегося осадка. Доводили суммарный объем раствора водой до 20 мл.

3.3. Синтез хромогенных субстратов

3.3.1. Химический синтез пептидил-п-нитроанилидов

3.3.1.1.Z-Ala-Ala-Pro-Glu-pNA синтезировали по стандартной методике [13].

3.3.1.2. Z-Ala-Ala-Glu-Glu-pNA

63 мг (161 мкмоль) Glu-Glu-pNA растворяли в 1.2 мл ДМФ. К полученному раствору добавляли 53 мкл ТЭА, а затем по каплям -раствор 79 мг Z-Ala-Ala-ONSu в 300 мкл ДМФ. Перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель упаривали. Целевой пептидил-и-нитроанилид выделяли препаративной ВЭЖХ в системе Е.

Rf в системе А: 0.74.

ВЭЖХ: время удерживания 6.1 мин (система А).

3.3.2. Ферментативный синтез п-нитроанилидов N-ацилтетрапептидов

3.3.2.1. Сорбция субтилизина-72 на носителе

8 мг сериновой протеиназы B.subtilis растворяли в 250 мкл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,4). Раствор фермента равномерно наносили на 100 мг силохрома С-80. Силохром с сорбированным на нём ферментом высушивали в вакуум-эксикаторе над КОН.

3.3.2.2. Построение типичных кинетических кривых ферментативного синтеза пептидш-п-нитроанилидов

Смесь 5 мг (11.25 мкмоль) Z-Ala-Ala-Phe-OCH3 и 2.5 мг (9.35 мкмоль) H-Glu-pNA растворяли в 125 мкл ДМФ и 210 мкл ацетонитрила. К полученной суспензии добавляли 2мг субтилизина 72, сорбированного на 25 мг силохрома С-80. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты реакционной смеси по 10 мкл, разбавляли 50 мкл ацетонитрила и 100 мкл раствора А, центрифугировали, анализировали методом ВЭЖХ в системе А. На основе полученных данных проводили построение кинетических кривых (рис. 12).

3.3.2.3. Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA

70 мг (191 мкмоль) CF3COOHAsp-pNA и 96.5 мг (229 мкмоль) Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 растворяли последовательно в 1.1 мл ДМФ и 5.5 мл ацетонитрила. К полученному раствору добавляли 190 мкл раствора 1н ТЭА в ацетонитриле. Затем к образовавшейся суспензии добавляли 40 мг субтилизина-72, сорбированного на 500 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов. Смолу с ферментом отфильтровывали, раствор концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 1 мл метанола. Полученный раствор наносили на колонку с сефадексом LH-20 (2.5x40 см). Элюировали метанолом. Фракции собирали и анализировали спектрофотометрически при длине волны 315 нм. В результате очистки методом гель-фильтрации было получено 93 мг (76%) чистого Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA.

Z-Ala-Ala-Met-Asp-pNA, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA синтезировали аналогично. Условия проведения реакций представлены в таблице 18. Основные характеристики полученных соединений представлены в таблице 19.

3.3.2.4. Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA

К суспензии 113 мг (269 мкмоль) Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 и 60 мг (224 мкмоль) H-Glu-pNA в 1 мл ДМФ добавляли 5 мл ацетонитрила. Затем в реакционную среду вносили 44 мг субтилизина, сорбированного на 550 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали 3 часа. Смолу с ферментом отфильтровывали, раствор концентрировали в вакууме. Дальнейшую очистку соединения проводили, как в опыте 3.3.2.3. Выход продукта 105 мг (70 %)

Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA синтезировали аналогично. Условия проведения реакции представлены в таблице 18. Основные характеристики полученных соединений представлены в таблице 19.

3.3.2.5. Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA

60 мг (163 мкмоль) CF3COOH Asp-pNA и 89.2 мг (196 мкмоль) Z-Ala-Ala-Phe-ОСНз растворяли последовательно в 1.3 мл ДМФ и 3 мл ацетонитрила. К полученному раствору добавляли 163 мкл раствора 1н ТЭА в ацетонитриле. Затем к образовавшейся суспензии добавляли 40 мг субтилизина-72, сорбированного на 500 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов. Смолу с ферментом отфильтровывали, раствор концентрировали в вакууме до минимального объема и высаживали Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA абсолютным этилацетатом. Выход продукта 66 мг (60 %).

Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNA синтезировали аналогично. Условия проведения реакции представлены в таблице 18. Основные характеристики полученных соединений представлены в таблице 19.

3.3.2.6. Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA

102 мг (225 мкмоль) Z-Ala-Ala-Phe-OCH3 и 50 мг (187 мкмоль) H-Glu-pNA растворяли в 2.5 мл ДМФ и 4.2 мл ацетонитрила. К полученной суспезии добавляли 40 мг субтилизина, сорбированного на 500 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при 20 °С. Затем смолу отфильтровывали, раствор концентрировали в вакууме. Дальнейшую обработку проводили аналогично п. 3.3.2.5. Выход продукта 104 мг (81%).

Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNA, Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNA синтезировали аналогично. Условия проведения реакций представлены в таблице 18. Основные характеристики полученных соединений представлены в таблице 19.

3.3.2.7. Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA (аналитический опыт; карбоксильный компонент Z-Ala-Ala-Phe-OH)

9.8 мг (22.4 мкмоль) Z-Ala-Ala-Phe-OH и 3 мг (11.2 мкмоль) H-Glu-pNA растворяли в 150 мкл ДМФ. К полученной суспензии добавляли

104 последовательно 250 мкл ацетонитрила и 4 мг субтилизина, сорбированного на 50 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали при 20 °С, контролируя ход реакции методом ВЭЖХ.

3.3.2.8. Z-Ala-Glu-pNA (аналитический опыт)

17.8 мг (75 мкмоль) Z-Ala-OCH3 и 2 мг (7.5 мкмоль) H-Glu-pNA растворяли в 70 мкл ДМФ. К полученной суспензии добавляли последовательно 250 мкл ацетонитрила и 4 мг субтилизина, сорбированного на 50 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали при 20 °С, контролируя ход реакции методом ВЭЖХ.

3.3.2.9. Z-Ala-Ala-Glu-pNA (аналитический опыт)

4.6 мг (15 мкмоль) Z-Ala-Ala-OCH3 и 2 мг (7.5 мкмоль) H-Glu-pNA растворяли в 50 мкл ДМФ. К полученной суспензии добавляли 250 мкл ацетонитрила и 4 мг субтилизина, сорбированного на 50 мг силохрома С-80. Реакционную смесь перемешивали при 20 °С, контролируя ход реакции методом ВЭЖХ.

Заключение

Из всего вышесказанного становится очевидным, что глутамилэндопептидазы представляют собой весьма удобный инструмент как для научных исследований, так и для решения практических задач. Таким образом, возникает необходимость дальнейшего изучения глутамилспецифичных эндопептидаз, в частности, эндопептидаз из Bacillus intermedins и Bacillus licheniformis, с целью более рационального их использования при исследовании белковых структур и в качестве катализаторов реакций синтеза биологически активных соединений -пептидов и их аналогов.

Решение указанных выше задач невозможно при отсутствии надежных методов контроля каталитической активности и стабильности этих ферментов, а также наличия специфических ингибиторов, необходимых для установления структуры. В связи с этим целью работы была разработка удобного метода синтеза хромогенных субстратов и ингибитора глутамилэндопептидаз.

2. Обсуждение результатов.

Как уже указывалось, данная работа посвящена синтезу хромогенных субстратов и ингибитора и изучению с их помощью свойств глутамилспецифичных эндопептидаз из Bacillus intermedius и Bacillus licheniformis. В нашу задачу входили:

1) разработка ферментативного метода синтеза хромогенных субстратов глутамилэндопептидаз; синтез серии пептидил-п-нитроанилидов, отличающихся пептидной последовательностью;

2) исследование с помощью серии синтезированных субстратов вторичной специфичности нативных и мутантных форм глутамилэндопептидаз из Bacillus intermedius и Bacillus licheniformis; установление на основе полученных кинетических данных структуры оптимального субстрата;

3) синтез ингибитора глутамилспецифичных бациллярных эндопептидаз и определение его ингибирующей способности.

2.1. Синтез субстратов глутамилэндопептидаз

2.1.1. Выбор метода синтеза

Пептидные производные, содержащие на С-конце и-нитроанилиды глутаминовой или аспарагиновой кислот, широко применяются в качестве хромогенных субстратов глутамилспецифичных эндопептидаз [35, 42]. Такие субстраты позволяют, не нарушая специфичности гидролиза, проводить непрерывный контроль активности ферментов спектрофотометрически. Однако, во всех описанных случаях были использованы химически синтезированные субстраты. Химический синтез подобных соединений представляет собой весьма трудоёмкий процесс. Как указывалось выше, глутамилэндопептидазы имеют протяженный активный центр, поэтому субстраты этих ферментов должны содержать не менее четырех аминокислотных остатков (Р1-Р4) слева от гидролизуемой связи. Таким образом, при получении этих пептидов нужно использовать сложную схему блокирования-деблокирования основных и боковых функциональных групп. Кроме того, включение в состав пептидов хромогенной и-нитроанилидной группировки связано с дополнительными трудностями, так как она обладает определенной лабильностыд.

В последние годы для синтеза целого ряда соединений используется ферментативный способ синтеза, поскольку он имеет ряд преимуществ перед химическим. Применение протеиназ в качестве катализаторов образования пептидной связи не требует защиты боковых функциональных групп аминокислот, так как связывание аминокислот в активном центре фермента происходит в такой ориентации, при которой в реакцию вступают только а-амино- и а-карбоксильные группы.

Кроме того, благодаря стереоспецифичности фермента исключена возможность рацемизации субстрата. Реакции проводят преимущественно в водной или водно-органической средах. Ферменты легко растворяются в воде, сохраняя свои свойства. Однако, по мере протекания реакции увеличивается вероятность вторичного гидролиза продукта [101]. Поэтому исследователи всё чаще прибегают к использованию в ферментативном синтезе органических растворителей, которые увеличивают растворимость неполярных субстратов, сдвигают термодинамическое равновесие в сторону синтеза, уменьшают возможность вторичного ферментативного гидролиза [101 - 103]. Но в этом случае возникает опасность инактивации протеиназ органическим растворителем.

Как показано в последнее время, ферменты, распределённые на поверхности твердых носителей, могут катализировать синтетические реакции (в том числе и реакции образования пептидных связей) в органических средах с малым (до 4 ч- 5%) содержанием воды [103, 104], причём могут быть использованы как смешивающиеся, так и не смешивающиеся с водой растворители. Малое содержание воды позволяет обойти затруднения, обусловленные низкой растворимостью исходных соединений в воде [85, 101]. Роль носителя в таких процессах состоит, повидимому, в защите фермента. Гидрофильная поверхность макропористого носителя удерживает сорбированную воду и тем самым создаёт микросреду, предохраняющую фермент от потери гидратной воды и инактивации органическим растворителем [105]. Благодаря этому сорбированные протеиназы длительное время сохраняют стабильность и активность в средах с низким содержанием воды [103, 106].

Ранее в нашей лаборатории был разработан метод ферментативного синтеза различных хромогенных субстратов с использованием в качестве катализатора субтилизина-72 - сериновой протеиназы из В. subtilis, шт. 72 - как в растворенном состоянии, так и сорбированного на макропористом носителе [107, 108]. Этот фермент, выделенный в нашей лаборатории из препарата культуральной жидкости Bacillus subtilis Ладыжинского завода, легко может быть очищен до гомогенного состояния. Фермент достаточно стабилен и обладает широкой специфичностью, что позволяет использовать его в качестве катализатора во многих реакциях ферментативного пептидного синтеза [109].

Субтилизин 72 по своим физико-химическим характеристикам напоминает субтилизин Carlsberg. Было установлено [110], что последний в реакциях гидролиза пептидных субстратов предпочитает в положении Pi' остаток глутаминовой кислоты, однако не было сообщений о попытке использования производных глутаминовой кислоты в качестве аминокомпонента в реакции конденсации пептидных фрагментов, катализируемой субтилизином. Из литературы известны примеры ферментативного синтеза пептидов, в состав которых входят остатки глутаминовой или аспарагиновой кислот, например предшественники аспартама [111, 112], но производные этих аминокислот использовались в качестве карбоксильных компонентов. Примеры введения в ферментативный синтез в составе аминокомпонентов остатков Glu или Asp весьма немногочисленны, а выход синтезированных в таких случаях пептидов не превышал, как правило, 50% [113]. Способность субтилизина-72 катализировать реакции синтеза различных пептидных производных и его сходство с субтилизином Carlsberg позволяли надеяться, что реакции пептидного синтеза с участием и-нитроанилидов глутаминовой и аспарагиновой кислот и с использованием субтилизина-72 в качестве катализатора окажутся возможными.

2.1.2. Синтез п-нитроанилидов пептидов, содержащих С-концевые остатки глутаминовой или аспарагиновой кислот

Ацилирование n-нитроанилидов глутаминовой и аспарагиновой кислот проводили по следующей схеме: субтилизин-72

Z-Ala-Ala-Xaa-ОСНз + H-Yaa-pNA-Z-Ala-Ala-Xaa-Yaa-pNA (1) где Хаа = Ala, Leu, Phe, Trp, Met Yaa = Glu, Asp

В качестве катализатора использовали субтилизин-72, сорбированный на макропористом носителе силохроме С-80.

Синтез пептидной связи в присутствии сериновых протеиназ представляет собой сложный многостадийный процесс, протекающий через стадию образования ацилфермента, в котором субстрат ковалентно связан с ферментом через остаток серина активного центра [114, 115]. Схематично этот процесс представлен на рис. 10 [116].

Ацилфермент (Z-Ala-Ala-Xaa-O)-E подвергается нуклеофильной атаке водой или аминокомпонентом H-Glu-pNA.

В первом случае происходит гидролиз ацилфермента, во втором -аминолиз ацилфермента и образование пептидной связи. Образование пептидной связи - термодинамически невыгодный процесс, и в обычных условиях его равновесие практически полностью сдвинуто в сторону исходных соединений. В выбранных нами условиях сдвиг химического равновесия в сторону образования модифицированных пептидов был достигнут:

1) использованием в качестве ацилирующего компонента эфира пептида, что обеспечивало сдвиг равновесия в сторону образования ацилфермента (реакция 2);

2) проведением реакции в смеси органических растворителей с низким содержанием воды, что сводило к минимуму вторичный гидролиз (реакция 3);

3) применением избытка аминокомпонента или карбоксильного компонента, что благоприятствовало реакции 4 согласно закону действующих масс.

Z-Ala-Ala-Xaa-ОСНз + Е

2)

ZrAla-Ala-Xaa-OH + Е

Н20 (3)

Z-Ala-Ala-Xaa-O-E + СН3ОН

H-Gu-pNA (4)

Z-Ala-Ala-Xaa-Qu-pNA

Рис. 10. Механизм реакций, катализируемых сериновой протеиназой.

Так как карбоксильная группа в эфирах в достаточной мере активирована, то равновесие практически полностью было смещено в сторону образования ацилфермента (реакция 2). Это способствовало быстрому протеканию реакции. Кроме того, структура большинства применявшихся нами ацилирующих компонентов - Z-Ala-Ala-Xaa-OCH3 (где Хаа = Phe Leu, Тгр, Met) и Z-Gly-Ala-Ala-OCH3 - хорошо соответствовала специфичности фермента.

При подборе концентрации фермента, вводимого в синтез, мы руководствовались следующими соображениями. Известно, что зона связывания активного центра субтилизина включает по крайней мере шесть подцентров (S4-S2 согласно номенклатуре Шехтера и Бергера [117]), а его специфичность определяется, в основном, положением Рь в котором предпочтительны гидрофобные аминокислоты, например, Leu, Phe; положение Р2 субтилизина не позволяет использовать аминокислоты с объёмным боковым радикалом, в свою очередь хорошо связывающиеся в обширном гидрофобном кармане Р4 [109]. Наиболее эффективными ацилирующими агентами являются эфиры ацилтрипептидов, занимающие большую часть активного центра субтилизина. В случае же использования более коротких карбоксильных компонентов количество фермента необходимо увеличивать с целью компенсации плохого их связывания с протяженным активным центром субтилизина. Минимальное количество фермента и минимальный избыток карбоксильного компонента были использованы при синтезе Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA, а максимальные - в случае синтеза коротких пептидов Z-Ala-Ala-Glu-pNA и Z-Ala-Glu-pNA. Из этих же соображений мы исходили, применяя значительные избытки карбоксильного компонента при синтезе Z-Ala-Ala-Glu-pNA и Z-Ala-Glu-pNA.

Реакции протекали в среде ДМФ : ацетонитрил с различными концентрациями ДМФ, процентное содержание которого варьировалось в зависимости от растворимости ацилирующего компонента. Учитывая, что ДМФ способен ингибировать ферментативную активность субтилизина, при подборе требуемой концентрации фермента мы принимали во внимание процентное содержание указанного растворителя в реакционной среде.

За ходом реакции синтеза пептидил-и-нитроанилидов следили, исследуя изменение состава реакционной смеси во времени методом ВЭЖХ. Характерная хроматограмма смеси (детекция при 315 нм), содержащей исходное соединение и продукт синтеза, приведена на рис. 11, а рис. 12 показывает динамику превращения аминокомпонента при синтезе Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA. Поскольку синтез проводили в присутствии избытка карбоксильного компонента, то для контроля степени конверсии аминокомпонента удобно было использовать детекцию при 315 нм. Детекцию при 220 нм использовали для контроля содержания исходного эфира ацилтрипептида в реакционной смеси и возможного его гидролиза. Следует отметить, что мы не наблюдали при 220 нм на ВЭЖХ-хроматограмме существенного гидролиза метилового эфира ацилтрипептида: в реакционной смеси присутствовало не более 1015% Z-Ala-Ala-Phe-OH. Это позволяло использовать минимальный избыток карбоксильного компонента. я-Нитроанилиды глутаминовой и аспарагиновой кислот соответствуют специфичности Si'-положения субтилизина и связываются с ним [110]. При этом локальная концентрация аминокомпонентов, вероятно, оказывается высокой. По-видимому, это обстоятельство способствует преимущественному взаимодействию ацилфермента не с молекулами гидратной воды [118], а с молекулами нуклеофила, что приводит к образованию целевого пептида.

Так, выход продукта реакции (5) уже через 2.5 часа приближался к

100%. субгилизин 72

Z-Ala-Ala-Phe-ОСНз + H-Glu-pNA -Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA (5)

Уменьшения количества синтезированного пептида Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA не было отмечено в реакционной смеси даже через 72 часа. Возможно, в предложенных условиях синтеза вторичного гидролиза образованной пептидной связи не происходит. В то же время, как упоминалось выше, мы наблюдали в реакционной смеси от 10 до 15 % Z-Ala-Ala-Phe-OH - продукта гидролиза сложноэфирной связи карбоксильного компонента. Учитывая высокую степень конверсии аминокомпонента и основываясь на ранее полученных данных, мы предположили, что образование целевого пептида возможно так же по реакции (6): субтилизин 72

Z-Ala-Ala-Phe-OH + H-Glu-pNA -^ Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA (6)

Действительно, экспериментально было подтверждено, что ацилтрипептид со свободной карбоксильной группой также может служить ацилирующим агентом. Уже через 3 часа выход и-нитроанилида ацилтрипептида, полученного по реакции (6), составил 98%. Таким образом, вероятно, даже в случае возможного вторичного гидролиза продукта реакции (5) эти потери компенсируются за счет синтеза по реакции (6). Однако, следует отметить, что при использовании карбоксильного компонента со свободной карбоксильной группой требуются больший его избыток и большее количество фермента для компенсации меньшей эффективности Z-Ala-Ala-Phe-OH как ацилирующего агента (таблица 12).

В таблице 12 приведены оптимальные соотношения компонентов реакций, подобранные экспериментально, и выходы синтезированных пептидил-п-нитроанилидов. Необходимо отметить, что аминокислотные остатки в Рг-положении синтезированных соединений были выбраны нами на основе литературных данных о субстратной специфичности известных глутамилспецифичных бациллярных эндопептидаз.

Минимальные избытки карбоксильных компонентов и практически количественная конверсия аминокомпонентов облегчали выделение конечных продуктов. Тетрапептиды, содержавшие остатки Leu и Met в Р2-положении, очищали гель-фильтрацией на сефадексе LH-20. Гидрофобные тетрапептиды, содержавшие остатки Тгр и Phe, высаживали этилацетатом из ДМФ.

Таким образом, нами была разработана удобная, легкая в исполнении методика, позволяющая быстро нарабатывать серии пнитроанилидов пептидов, содержащих на С-конце остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот.

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Мильготина, Екатерина Иосифовна, Москва

1. Н. Philipp, M.L. Bender. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin. // Mol. Cell Biochem. 1983, 51, 5-32.

2. K. Morihara, H.Tsuzuki, T. Oka. Comparison of various types of subtilisins: size and properties of the active site. // Bioche. Biophys. Res. Commun. 1971, 42, 1000-1006.

3. В.М.Степанов. Молекулярная биология. Структура и функции белков. // М.: Высш.школа, 1996, с. 220.

4. Proteinase action. Proceedings of the International Workshop, August 2931,1983, Debrecen, Hungary, pp 88-89.

5. S. Norioka, S. Ohta, T. Ohara, S.I. Lim, F. Sakiyama. Identification of three catalytic triad constituents and Asp-225 essential for function of lysine-specific serine protease, Achromobacter protease I. // J. Biol. Chem. 1994, 269, 1702517029.

6. A.M. Gilles, J.M. Imhoff, B. Keil. a-Clostripain. Chemical characterization, activity, and thiol content of the highly active form of clostripain. // J. Biol. Chem. 1979,254, 1462-1468.

7. T.Yoshimoto, R. Walter, D. Tsuru. Proline-specific endopeptidase from Flavobacterium. Purification and properties. // J. Biol. Chem. 1980, 225, 47864792.

8. JJ. Birktoft, K. Breddam. Glutamyl endopeptidases. // Methods Enzymol. 1994, 244, 114-126.

9. G.R. Drapeau, Y. Boily, J. Houmard. // Purification and properties of an extracellular protease of S. aureus. J. Biol. Chem. 1972,247, 6720-6726.

10. Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров. Glu,Asp-специфичная протеиназа из S. thermovulgaris. Н Биохимия. 1989, 54, 46-53.

11. Svendsen, M.R. Jensen, K. Breddam. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of S. griseus. FEBS Lett. 1991, 292, 165

12. Svendsen, K.Breddam. Isolation and amino acid sequence of glutamic acid specific endopeptidase from B. licheniformis. Eur. J. Biochem. 1992, 204, 165171.

13. I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovitch, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova, M.B. Viryasov, G.N. Rudenskaya, V.M. Stepanov. Glutamyl endopeptidase of B. intermedius , strain 3-19. FEBS Lett. 1997, 404, 241-244.

14. Ch.-Ho Kim, Y.-H. Kho. Domain structure and multiplicity of raw-starch-digesting amylase from Bacillus Circulans: extensive proteolysis with proteinase K, endopeptidase Glu-C and thermolysin. // Biochem. Biophys. Acta. 1993, 1202, 200-206.

15. V. De Filippis, A. Fontana. Semisynthesis of carboxy-terminal fragments of thermolysin. Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 35, 219-227.

16. R. Seetharam, A.S. Acharya. Synthetic potential of Staphylococcus aureus V8-protease: an approach toward semisynthesis of covalent analogs of a-chain of hemoglobin S. J. Cell Biochem. 1986, 30, 87-99.

17. M. Akhkerutzzman, Т. Sumio, J. Hong, M. Hizoshe, Biochem. Biophys. Acta 1988, 955, 77

18. J.Houmard, G.R. Drapeau. Staphylococcal protease: a proteolytic enzyme specific for glutamyl bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. 1972, 69, 3506-3509.

19. G.R. Drapeau. Cleavage at glutamic acid with staphilococcal protease. // Methods in enzymology. 1977, 47,189-191.

20. K. Breddam, M. Meldal. Substrate preferences of glutamic-acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrates based on intramolecular fluorescence quenching. // Eur. J. Biochem. 1992, 206, 103107.

21. K. Nagata, N. Yoshida, F. Ogata, M. Azaki, K. Noda. Subsite mapping of an acidic amino acid-specific endopeptidase from S. griseus, GluSGP, and protease V8. J. Biochem. (Tokio) 1991,110, 859-862.

22. S.J. Dancer, R. Garratt, J. Saldanha, HJhoti, R. Evans. The epidermolytic toxins are serine proteases. // FEBS Lett. 1990,268, 129-132.

23. N.A. Thornbeny, H.G. Bull, J.R. Calaycay, K.T. Chapman et. al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-la processing in monocytes. //Nature (London) 1992,356, 768-774.

24. N.A. Thornbeny, T.A. Rano, E.P. Peterson, D.M. Rasper, T. Timkey et.al. A combinatorial approach defines specificities of member of the caspase family and granzym B. // J. Biol. Chem. 1997,272, 17907-17911.

25. B.A. Malcolm, C.Lowe, Sh. Shechosky, R.T. McKay, Ch.Ch. Yang, VJ. Shah, R.J. Simon, J.C. Vederas, D.V. Santi. Peptide aldehyde inhibitors of hepatitis A virus 3C proteinase. // Biochemistry, 1995, 34, 8172-8179.

26. Г.Н. Руденская. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ. // Биоорганическая химия. 1998, том 24, № 4, с. 256-261.

27. Т. Niidome, N. Yoshida, F. Ogata, A. Ito, K. Noda. Purification and characterization of an acidic amino acid-specific endopeptidase of B. subtilis obtained from a commercial preparation (protease type XVI, Sigma). // J. Biochem. 1990,108,965-970.

28. I.V. Demidyuk, E.A. Nosovskaya, I.A. Tsaplina, G.I. Karavaiko, S.V. Kostrov. Purification and characterization of serine protease of the Glu,Asp-specific enzyme family from Thermoactinomyces species. II Biochemistry (Moscow). 1997, 62,171-175.

29. E.B. Беляева, Г.Н. Руденская, B.M. Степанов, Г.К. Дегтева. Выделение и свойства внеклеточной протеиназы золотистого стафилококка. // Прикл. биохим. и микробиол. 1984, XX, 363-368.

30. A.-C. Ryden, L. Ryden, L. Philipson. Isolation and properties of a staphilococcal protease, preferentially cleaving glutamoil-peptide bonds. II Eur. J. Biochem. 1974, 44, 105-114.

31. J. Houmard. Preparation of chromophoric substrates for the glutamoyl specific staphylococcal protease. // Int. J. Peptide Protein Res. 1976, 8, 199-204.

32. S.B. Sorensen, T.L. Sorensen, K. Breddam, Fragmentation of proteins by S. aureus strain V8 protease. // FEBS. 1991,294, 195-197.

33. J. Houmard. Kinetic investigation of the staphilococcal protease-catalyzed hydrolysis of synthetic substrates. // Eur. J. Biochem. 1976, 68,621-627.

34. G.A. Rufo, B.J. Sullivan, A. Sloma, J. Pero. Isolation and characterization of a novel extracellilar metalloprotease from B. subtilis. II J. Bacteriol. 1990, 172,1019-1023.S.

35. F. Ogata, T. Miyata, N. Fujii, N. Yoshida, K. Noda, S. Makisumi, A. Ito. Purification and amino acid sequence of a bitter gourd inhibitor against an acidic amino acid- specific endopeptidase of S. griseus. II J. Biol. Chem. 1991,266,16715- 16721.

36. Л.П. Ревина, H.B. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Н.И. Гребенщиков, Л.А. Баратова, В.М. Степанов. Исследование действия Glu,Asp-специфичной протеиназы S. griseus на пептидные и белковые субстраты. // Биохимия. 1989, 54, 846- 850.

37. С. Carmona, G.L. Gray. Nucleotide sequence of serine pritease gene of Staphilococcus aureus, strain V8. //Nucleic Acids Res. 1987,75,6757-6757.

38. A. Sloma, C.F. Rudolph, G.A. Rufo, B.J. Sullivan, K.A. Theriault, D. Ally, J. Pero. Gene encoding a novel extracellular metalloprotease in B. subtilis. // J. Bacteriol. 1990, 772, 1024-1029.

39. H. Smith, A. De Jong, S. Bron, G. Venema. Characterization of signal-seqence-coding regoins selected from the B. subtilis chromosome. // Gene. 1988, 70,351- 361.

40. D.A. Rebricov, T.V. Akimkina, A.B. Shevelev, I.V. Demidyuk, A.M. Bushueva, S.V. Kostrov, G.G. Chestukhina, V.M. Stepanov. Molecular cloning and nucleotide sequence of the B. intermedins glutamyl endopeptidase gene. // J. Protein Chem. 1999,18,21-27.

41. Y. Suzuki, M. Yabuta, K. Ohsuye. Cloning end expression of the gene encoding the glutamic acid-specific protese of S. griseus ATCC 10137. // Gene. 1994,150, 149-151.

42. И.В. Демидюк, C.B. Костров. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз. // Молекулярная биология. 1999, 33, 100-105.

43. V.L. Nienaber, К. Breddam, J.J. Birktoft. A glutamic acid specific serine protease utilized a novel histidine triad in substrate binding. // Biochemistry. 1993,52, 11469-11475.

44. J.A.R.G. Barbosa, R.C. Garratt, J.W. Saldanha. A structural model for the glutamate-specific endopeptidase from Streptomyces griseus that explains substrate specificity. // FEBS 1993, 324, 45-50.

45. A.R. Sielecki, W.A. Hendrikson, C.G. Brougton, L.T.J. Delbaere, G.D. Brayer, M.N.G. James. Protein structure refinement: S. griseus serine protease A at 1.8 A resolution. //J.Mol.Bio1. 1979,134, 781-803.

46. R.J. Read, M.N.G. James. Structure of the complex of S. griseus protease В and the third domain of the turkey ovomucoid inhibitor at 1.8 A resolution. // Biochemistry. 1983,22,4420-4433.

47. M. Fujinaga, L.T.J. Delbaere, G.D. Brayer, M.N.G. James. Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. // J.Mol.Biol. 1985,184,479-502.

48. M.N. James, A.R. Sielecki, G.D. Brayer, L.T.J. Delbaere, C.-A. Bauer. Structures of product and inhibitor complexes of Streptomyces griseus protease A at 1.8 A resolution. A model for serine protease catalysis. // J. Mol. Biol. 1980,144, 43-88.

49. J.J. Birktoft, D.M. Blow. Structure of crystalline chymotrypsin V. The atomic structure of tosyl-chymotrypsin at 2 A resolution. // J.Mol.Biol. 1972, 68, 187-240.

50. H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam. Characterization of the S-l binding site of the glutamic acid-specific protease from S. griseus. // Prot. Sci. 1996, 5, 2266-2275.

51. P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. // М.: Мир, 1991, с. 544.

52. М. Prevost. Concurrent interactions contribute to the raised pKa of His 18 in Barnase. // J. Mol. Biol. 1996,260, 99-110.

53. R. Loewenthal, J. Sancho, A.R. Fersht. Histidine-aromatic interactions in barnase. Elevation of histidine pKa and contribution to protein stability. // J. Mol. Biol. 1992,224,759-770.

54. J. Sancho, L. Serrano, A.R. Fersht. Histidine residues at the N- and C-termini of a-helices: perturbed pKas and protein stability. // Biochemistry. 1992, 31, 22532258.

55. R.J. Read, M.N.G. James. Refined crystal structure of Streptomyces griseus trypsin at 1.7 A0 resolution. // J. Mol. Biol. 1988, 200, 523-551.

56. D.A. Jewell, W. Swietnicki, B.M. Dunn, B.A. Malcolm. Hepatitis A virus 3C proteinase substrate specificity. // Biochemistry. 1992, 31, 7862-7869.

57. F. Sakiyama, T. Masaki. Lysyl endopeptidase of Achromobacter lyticus. П Methods Enzymol. 1994, 244,126-137.

58. M. Shuster., A. Aaviksaar, V. Schellenberger, H.-D. Jakubke. Characterization of the S'-subsite specificity of V8 proteinase via acyl transfer to added nucleophiles. // Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1036, 245247.

59. A. Warshel, G. Naray-Szabo, F. Sussman, J.K. Hwang. How do serine proteases really work?// Biochemistry. 1989, 28, 3629-3637.

60. G.D. Brayer, L.T. Delbaere, M.N. James. Molecular structure of crystalline S. griseus protease A at 2.8 A resolution. // J.MoLBiol. 1978,124, 261-283.

61. W. Gebauer, J.R. Harris. Controlled cleavage of KLH1 and KLH2 by the V8 protease from Staphylococcus aureus, reassociation, electroforetic and transmission electron microscopy study of peptide fragments. // Eur. J. Biochem. 1999,262, 166-175.

62. M. Schuster, A. Aaviksaar, H-D. Jakubke. Enzyme-catalyzed peptide synthesis in ice. // Tetrahedron. 1990, 46, 8093-8102.

63. N. Wehofsky, F. Bordusa. Programming of enzyme specificity by substrate mimetics: investigation of the Glu-specific V8 protease reveals a novel general principle of biocatalysis. // FEBS Lett. 1999,443,220-224.

64. S. Kumaran, D. Datta, R.P. Roy. An enigmatic peptide ligation reaction: protease-catalyzed oligomerization of a native protein segment in neat aqueous solution. // Protein Sci. 2000, 9, 734-741.

65. Л.Б. Гулько, H.A. Окорокова, K.E. Воюшин, H.A. Дьяков, Г.Г. Честухина, В.П. Вейко, В.Г. Дебабов. Получение полипептидного препарата VNTR22 (MUC1) с потенциальной противоопухолевой активностью. // Биотехнология. 2000, 3, 3-8.

66. P.L. Huang, Y. Sun, H.C. Chen, H.F. Kung, S. Lee-Huang. Proteolytic fragments of anti-HIV and anti-tumor proteins MAP30 and GAP31 are biologically active. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 262, 615-623.

67. F. Widmer, S. Bayne, G. Houen, B.A. Moss, R.D. Rigby, R.G. Whittaker, J.T. Johansen. // Peptides 1984, Stockholm 1985, p. 193.

68. V. Cerovsky. V8 proteinase-catalyzed peptide synthesis in hydrophilic organic solvents with low water content. // Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3421-3424.

69. M. Haensler, H.-D. Wissmann, N. Wehofsky. Enzymatic formation of Glu-Xaa bonds using Glu/Asp-specific endopeptidase from Bacillus licheniformis in frozen aqueous systems. //J. Peptide Sci. 2000, 6,366-371.

70. M. Haensler, N. Wehofsky, S. Gerisch, H.-D. Wissmann, H.-D. Jakubke. Reverse catalysis of elastase from porcine pancrease in frozen aqueous systems. // Biol. Chem. 1998,379, 71-74

71. M. Haensler, H.-D. Jakubke. Endoproteinase Pro-C catalyzed peptide bond formation in frozen aqueous systems. // Enzyme Microb. Technol. 1998, 22, 617-620.

72. M. Haensler, G. Ullmann, H.-D. Jakubke. The application of papain, ficin, and clostripain in kinetically controlled peptide synthesis in frozen aqueous solutions. // J. Peptide Sci. 1995,1,283-287.

73. M. Schuster, A. Aaviksaar, M. Haga, U. Ullmann, H.-D. Jakubke. Protease-catalyzed peptide synthesis in frozen aqueous systems: the freeze-concentration model. // Biomed. Biochim. Acta. 1991,50, 84-89.

74. G. Sahni, A.S. Acharya. Molecular basis of V8-protease catalysed facile ligation of a-globin fragments. // FASEB J. 1988,2, 1767-1767.

75. G. Sahni, Y.J. Cho, K.S. Iyer, S.A. Khan, R. Seetharam, A.S. Acharya. Semisynthetic hemoglobin A: reconstitution of functional tetramer from semosynthetic a-globin. // Biochemistry. 1989,28, 5456-5461.

76. G. Sahni, A.K. Mallia, A.S. Acharya. Proteosynthetic activity of immobilized Staphylococcus aureus V8 protease: application of the semisynthesis of molecular variants of ?-globin. // Anal. Biochem. 1991,193, 178-185.

77. V. Schellenberger, H.-D. Jakubke, N.P. Zapevalova, Y.V. Mitin. Protease-catalyzed peptide synthesis using inverse substrates: the influence of reaction conditions on the trypsin acyl transfer efficiency. // Biotechnol. Bioeng. 1991, 38, 104-108.

78. H. Sekizaki, K. Itoh, E. Toyota, K. Tanizawa. Trypsin-catalyzed peptide synthesis with various p-guanidinophenyl ester as acyl donors. // Chem. Pharm. Bull. 1996, 44,1585-1587.

79. F. Bordusa, D. Ullmann, C. Eisner, H.-D. Jakubke. Substrate mimetic-mediated peptide synthesis: an irreversible ligation strategy that is independent of substrate specificity. //Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36,2473-2475.

80. N. Wehofsky, F. Bordusa. Programming of enzyme specificity by substrate mimetics: investigations on the Glu-specific V8 protease reveals a novel general principle of biocatalysis. // FEBS Lett. 1999, 443, 220-224.

81. N. Wehofsky, J.-D. Wissmann, M. Alisch, F. Bordusa. Engineering of substrate mimetics as novel-type substrates for glutamic acid specific endopeptidases: design, synthesis, and application. // Biochem. Biophys. Acta. 2000, 1479, 114122.

82. V. Cerovsky, F. Bordusa. Pritease-catalyzed fragment condensation via substrate mimetic strategy: a useful combination of solid-phase peptide synthesis with enzymatic methods. // J. Pept. Res. 2000, 55, 325-329.

83. M. Reslow, P. Aldercreutz, B. Mattiasson. The influence of peptide synthesis in acetonitrile / water mixture. // Eur. G. Biochem. 1988, 777,313-318.

84. H. Kise, A. Hayakowa, H. Noritomi. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents. // J. Biotechnol. 1990,14, 239-254.

85. H. Kise, K. Fujimoto. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. VNI. Medium effect nucleophile specificity in subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1988,10, 883-888.

86. M.Yu. Gololobov, V.M. Stepanov, T.L. Voyushina, LP. Morosova, P. Aldercreutz. Side reactions in enzymatic peptide synthesis in organic media: effects of enzyme, solvent and substrate concentrations. // Enzyme Microb. Technol. 1994,16, June.

87. M. Reslow, P. Aldercreutz, B. Mattiasson. On the importance of the support material for bioorganic synthesis. // Eur. J. Biochem. 1988, 172, 573-578.

88. О.В. Морозова, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов. О взаимодействии с носителями протеолитических ферментов, используемых для энзиматического синтеза пептидов в органических растворителях. // Прикладная биохимия и микробиология 1994, 6, 786-793.

89. Т. L. Voyushina, Е. Yu. Terentjeva, V .М. Stepanov. The synthesis of chromogenic peptide substrates containing p nitroanilides and lysine catalysed by proteinases - adsorbed on support material. // Biomed. Biochim. Acta 1990,10,209-212.

90. Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина, И.Ю. Филиппова,

91. A.Н. Маркарян, Е.Н. Лысогорская, Е.С. Оксенойт, В.М. Степанов. n-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорганическая химия. 1987,13, 748-753.

92. М.Ю.Гололобов, И.П.Морозова, Т.А.Воюшина, Е.А.Тимохина,

93. B.М.Степанов. Субстратная спицифичность сериновой протеазы Bacillus subtilis, 72. // Биохимия 1991,56,230-240.

94. М. Meldal, I. Svendsen, К. Breddam, F.-I. Auzanneau. Portion-mixing peptide libraries of quenched fluorogenic substrates for complete subsite mapping of endoprotease specificity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91, 3314-3318.

95. K. Sakina, K. Kawazura, K. Morihara, Y. Yajima. Termolysin-catalyzed synthesis of peptide amides. // Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 4345-4354.

96. D. D. Petkov, I.B. Stoineva. Enzyme peptide synthesis by an iterative procedure in a nucleophile pool. // Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3751-3754.

97. K. Sakina, K. Kawazura, K. Morihara. Alternative synthesis of the carboxyl terminal tetrapeptide amide of cholecystokinine by means of proteases. //Agric. Biol. Chem. 1987, 51,1717-1718.

98. В.М. Степанов. Молекулярная биология. Структура и функции белков.// М.: Высш. школа. 1996, с. 220.

99. С.- Н. Wong, К.-Т. Wang. New development in enzymatic peptide synthesis. //Experietia. 1991, 47, 1123-1129.

100. J. Fruton. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982, 53, 239-306.

101. J. Schechter, A. Berger. Size of the active site in proteinase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 27, 157-162.

102. М.П. Юсупова, C.A. Новгородова, B.M. Степанов. Последовательное присоединение остатков аргинина к пептидам, катализируемое субтилизином. 1. Влияние состава органического растворителя. // Биоорганическая химия. 1996,22, 523-527.

103. I.P. Kuranova, E.V. Blagova, V.M. Levdikov, G.N. Rudenskaya, N.P. Balaban, E.V. Shakirov. Crystal growth and preliminary X-ray study of glutamic acid specific serine protease from Bacillus intermedius. II J. Crystal Growth. 1999,196,313-318.

104. A. Spaltenstein, G.G. Leban, G.G. Huang, K.R. Reinhardt et al. Design and synthesis of novel protease inhibitors. Tripeptide a', (3' -epoxyketones as nanomolar inactivators of the proteasome. // Tetrahedron Lett. 1996,37, 1343-1346.

105. L.T.G.Delbaere, G.P.Brayer. The 1,8 A° structure of the complex between chymostatin and Streptomyces. // J.Mol.Biol. 1985, 183, 89103.

106. R.C.Thompson, E. R. Blout. Peptide chloromethyl ketones as irreversible inhibitors of elastase. // Biochemistry. 1973,12,44-47.

107. M.H. Gelb, G.P. Svaren, R.H. Abeles. Fluoro ketone inhibitors of hydrolytic enzymes.//Biochemistry. 1985,24, 1813-1817.

108. M.R. Angelastro, S.Mehdi, G.P. Burkhart, N.P. Peet, P.Bey. a-Diketone and a-keto ester derivatives of N-protected amino acids and peptides as novel inhibitors of cysteine and serine proteinases. // J.Med.Chem. 1990,33,11-13.

109. L.-Y.Hu, R.H. Abeles. Inhibition of catepsin В and papain by peptidyl-a-keto esters, a-keto amides, a-diketones and a-keto acids. // Arch.Biochem. Biophys. 1990,281,271-274.

110. M. Igbal, S. Chatterjel, G.C.Kauer et al. Potent inhibitors of proteasome. //J.Med.Chem. 1995,38,2276-2277.

111. R.C. Thompson. Use of peptide aldehydes to generate transition-state analogues of elastase. // Biochemistry. 1973,12,47-51.

112. D.W. Nicholson, A. Ali, N.A. Thornberry, J.P. Vaillancourt, C.K. Ding, M. Gallant, Y. Gareau, P.R. Griffin, M. Labelle. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. //Nature. 1995, 376, 37-43.

113. R. Schafer, D. Karbach, J. Hoppe. Multiple intracellular pathways interfere with the activation of a CPP32-like protease induced by serum deprivation of AKR-2B cells. // Experimental Cell Research. 1998, 240, 28-39.

114. A. Albeck, R. Persky, Kliper. //Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 17671772.

115. M. Nishikata, K. Kasai, S. Ishii. // Biochim. Biophys. Acta. 1981, 660, 256-261.

116. Т. Someno, Т. Saino, К. Katoh, Н. Miyazaki, S. Ishii. // J. Biochem. 1985, 97, 1493-1500.

117. Ж.В. Потетинова, Е.И. Мильготина, B.A. Макаров, Т.Д. Воюшина. Синтез модифицированных пептидов, содержащих на С-конце а-аминоальдегиды. // Биоорганическая химия. 2001, 27, 163-173.

118. Т.А. Shepherd, G.A. Сох, Е. McKinney, J. Tang, М. Wakulchik, R.E. Zimmerman, E.C. Villarreal. Small peptidic aldehyde inhibitors of human rhinovirus 3C protease. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6,2893-2896.

119. K. Maeda, H. Umezawa. Synthetic studies on leupeptins and their analogues. // J. Antibiotic, 1972,25, 515-531.

120. J.A. Fehrentz, M. Paris, A. Heitz, J. Velek, C.F. Liu, F. Winternitz, J. Martinez. Improved solid phase synthesis of C-terminal peptide aldehydes. //Tetrahedron Lett. 1995,35, 7871-7874.

121. K.T. Chapman. Synthesis of a potent, reversible inhibitor of interleukin-1(3 converting enzyme. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 613-618.

122. J.V. Potetinova, T.L. Voyushina, V.M. Stepanov. Enzymatic synthesis of peptidyl amino alcohols and peptidyl amino aldehydes serine proteinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 705-710.

123. T. Voyushina, J. Potetinova, E. Milgotina, V. Stepanov. Synthesis of peptide aldehydes via enzymatic acylation of amino aldehyde derivatives. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7,2953-2959.

124. M. Kubota, О. Nagase, Н. Yajima. Convenient procedure for the preparation of a-aminoalcohols. // Chem. Pharm. Bull. 1981, 29, 11691171.

125. H. Seri, K. Koga, H. Matsuo, S. Okki, J. Matsuo, S. Yamada. Optically active amino acids. Synthesis of optically active amino alcohols by the reduction of a-amino acid esters with the sodium borohydride. // Chem. Pharm. Bull. 1965,13, 995-1000.

126. M. Soucek, J. Urban, D. Saman. Preparation of N-protected a-amino alcohols by acetoxyborohydride redaction of N-protected a-amino acid esters. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1990, 55, 761765.

127. K.E.Rittle, C.F.Homnick, G.S.Ponticello, B.E.Evans. A synthesis of statine utilizing an oxidative route to chiral a-amino aldehydes. // J. Org. Chem. 1982, 47, 3016-3018.

128. G. L. Luly, G.F.Dellaria, G.J.Platther et al. A synthesis of protected aminoalkyl epoxides from a-amino acids. // J. Org. Chem. 1987, 52, 1487-1492.

129. G. Gurczak, A. Golebiowski. Optically active N-protected a-amino aldehydes in organic synthesis. // Chem. Rev. 1989, 89,149-164.

130. Х.Беккер,Г.Домшке, Э.Фангхенель и др. Органикум. // М. Мир.-1992, т. 2, с. 417.

131. G. Garegg, В . Samuelsson. Oxidation of primary and secondary alcohols in partially protected sugars with the chromium trioxide -pyridin complex in the presence of acetic aldehyde. // Carbohydrate Res. 1978,67,267-270.

132. A. Ito, R. Takahashi, Y. Baba. A new method to synthesize a-amino aldehydes. // Chem. Pharm. Bull. 1975,23, 3081-3087.

133. R.S. McConnell, G.E. Barnes, C.F. Hoyng, J.M. Gunn. // J. Med. Chem. 1990, 33, 86-93.

134. R.S. McConnell, J.L. York, D. Frizzel, C. Ezzell // J. Med. Chem. 1993, 36, 1084-1089.134

135. W. Ried, P. Pfaender. // Liebigs Ann. Chem. 1961, 640, p. 111-126.

136. T. Masaki, T. Tanaka, S. Tsunazawa, F. Sakiyama, M. Soejima. I I Biosci. Biotech. Biochem. 1992, 56, 1604-1607.

137. W. Ried, G. Muhle. Zur Spaltbarkeit von Aryl und Acyl-hydrazonen mit Acetylaceton. //Liebigs Ann. Chem. 1962, 656, 119-121.

138. С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. Биокинетика. Практический курс. // Москва: Фаир-Пресс. 1999, с. 204.

139. М.Ю. Гололобов, И.П. Морозова, В.М. Степанов. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы Bacillus subtilis, шт. 72. // Биохимия. 1991, 56, 3340.

140. A.A. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. // Киев. Наук. Думка. 1987.

141. JI. Физер, М. Физер. Реагенты органического синтеза. // М. Мир.-1970, с. 120.

142. Автор выражает глубокую признательность Елене Константиновне Котловой за помощь в обсуждении результатов работы, а также всем сотрудникам лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ГосНИИгенетика за содействие и участие в подготовке диссертации.