Синтез пептидомиметиков - ингибиторов сериновых протеиназ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕ11ИПЛ, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕIIIIЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

11а правах рукописи

004614Э31

СЕРГЕЕВ МАКСИМ ЕВГЕНЬЕВИЧ

СИНТЕЗ ПЕПТИДОМИМЕТИКОВ - ИНГИБИТОРОВ СЕРИПОВЫХ

ПРОТЕИПАЗ

Специальность - 02.00.10 биооргапичсская химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических паук

#

Москва 2010

- 2 ДЕК 2010

004614531

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова Государственного унитарного предприятия Государственного научно-

исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза Гематологического Научного Центра РАМН.

Научные руководители:

кандидат химических наук доцент T.JI. Воюшина

доктор медицинских наук профессор В.А. Макаров

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор И.Ю.Филиппова

доктор медицинских наук профессор Р.Д.Сейфулла

Ведущая организация: Институт биоорганической

химии им. академиков М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАН

Защита состоится "14" декабря 2010 г. в 16 часов па заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Воробьёвы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета /о

кандидат химических паук > г /У И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Система свертывания крови в нормальном состоянии находится в динамическом равновесии, при котором фибриновые сгустки постоянно образуются, а затем растворяются. Ключевыми ферментами системы гемостаза, ответственными за данные противоположные процессы, являются тромбин и плазмип. Аномальный избыток одного из этих ферментов приводит к нарушениям системы кровообращения, и современная медицина требует высокоэффективных препаратов как для предотвращения избыточного фомбообразовапия, так и для остановки кровотечений. Таким образом, центральная роль тромбина и плазмипа в регуляции агрегатного состояния крови подталкивает многих ученых к попытке создания сильных и сслсктнвпых ингибитором данных протеиназ. Исследователям известно довольно большое количество различных классов ингибиторов тромбина и плазмипа, представляющих собой как природные белки и производные пептидов, так и низкомолскулярные синтетические соединения. Однако многие из известных ингибиторов обладают рядом недостатков, таких как недостаточная химическая устойчивость, отсутствие высокой селективности по отношению к различным ферментам крови, усложненными процедурами синтеза и очистки, токсичностью для организма. Разработка структуры веществ, селективно ипгибирующих либо тромбин, либо плазмип, совмещение удобства синтеза и очистки новых низкомолекулярпых производных для использования в медицине в качестве ингибиторов определенных протеиназ системы гемостаза позволит более эффективно осуществлять лечение патологий гемостаза.

Пслыо работы была разработка удобных методов синтеза производных аминокислот для последующего использования их в синтезе нсптидомимстиков - ингибиторов ссриловых протеиназ, а также дизайн и синтез новых эффективных и селективных ингибиторов плазмипа и тромбина.

Это исследование включало следующие этапы:

1) разработка метода синтеза М-защищеппых а-аминоальдегидов аминокислот в мягких условиях с упрощенной процедурой выделения и очистки;

2) синтез вторичных амидов аминокислот для их последующего использования при получении ингибиторов сериповых протеиназ;

3) разработка ферментативного метода синтеза вторичных амидов пептидов путем ацилпровапия вторичных аминов эфирами пептидов; синтез ряда пептидил-амидов, отличающихся пептидной последовательностью и С-тсрминальной амидпой группой.

4) Исследования активности некоторых полученных соединений in vitro и in vivo',

Научная новнзпя н практическая цсипость работы. Разработаны удобные методы синтеза N-защшцениых а-аминоаш.дегидов и вторичных амидов аминокислот для использования их в качестве структурных блоков в последующем синтезе ингибиторов сериповых протеиназ. Разработан ферментативный метод синтеза ингибиторов сериповых протеиназ и нуклеопептидов с использованием субтилизина-72. Подобраны оптимальные условия получения вторичных амидов пептидов, катализируемого этим ферментом, и синтезирован ряд пептидных производных вторичных амидов, обладающих высокой селективностью к различным протенпазам системы гемостаза в зависимости от аминокислотной последовательности пептидной части. Выявлены некоторые аспекты действия синтезированных амидных производных пептидов на функцию гемостаза in vitro и in vivo. Показано, что реакцию ацилировапия эфирами пептидов в условиях катализа субтилизипом-72 в качестве ацил-акцептора могут быть введены дезоксирибопуклеозиды.

Обнаружено, что ацилировапис дсзоксирибопуклеозидов проходит рсгиоселсктивно но кислороду сахарного остатка, не затрагивая ни один атом азота в молекуле азотистого основания. Синтезирован ряд нуклеопептидов, производных четырех дсзоксирибонуклсозидов, хемоселективпо ацилпрованных эфиром пептида.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано пять статен и получено два патента РФ. Результаты работы были представлены па Всероссийском Симпозиуме "Белки и Пептиды" (Пущипо, Россия, 2007) и конференции "Peptides 2008" (Хельсинки, Финляндия, 2008).

Структура и Pili.см работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного ингибиторам ссриновых протспиаз системы гемостаза, обсуждения результатов, экспериментальном части, выводов и списка цитируемой литературы (153 ссылки). Объём работы 120 страниц. Диссертация содержит 30 рисунков и 27 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Синтез N-ацил-а-амипоальдегидов.

В лаборатории В.М.Стспаиова в течение многих лет исследуются реакции ферментативного синтеза пептидной связи и их применение для получения различных пептидных производных. В качестве катализаторов синтеза используются аспартильпые, гиоловые, мсталло- и сериновые ирогсипазы. Разработаны и описаны синтезы пептидных субстратов, ингибиторов различных протсолитических ферментов, а также биологически активных пептидов. Наиболее эффективным из использованных катализаторов оказались микробные ирогсипазы семейства субтнлизипа, в частности ссрииовая протсипаза субтилизнп-72. Этот фермент, продуцируемый Bacillus sublilis sl.72, обладает широкой

специфичностью, достаточной стабильностью и легко может быть очищен до гомогенного состояния.

Уменьшение вклада гидролитических процессов и наиболее эффективное использование образующегося в реакциях, катализируемых сериповыми протеипазами, ацилфермеита достигается проведением реакций в органической среде. Сорбция на маронористом гидрофильном носителе буферного раствора фермента, вероятно, представляет собой наиболее простой способ приготовления катализатора и сохранения его активности в безводной среде. С помощью сорбированного па силохроме С-80 субтилизипа-72 синтезирован целый ряд пептидомиметиков.

Эфиры ацилпеитидов, используемые в качестве карбоксильных компонентов, с высокой эффективностью ацилируют серии активного центра субтнлизииа. Учитывая широкую специфичность этого фермента и практическое отсутствие в реакционной среде воды, которая конкурировала бы с аминокомиопентом, в качестве последнего могут выступать не только производные большинства аминокислот, по и не аминокислотные компоненты - амипоспирты и семикарбазопы амнноальдегидов. Полученные таким способом пептидомиметики, в частности пептидоальдегиды, представляют собой конкурентные ингибиторы сериновых протеипаз.

Синтез пептидоальдегидов возможен различными химическими путями, например, используя в качестве структурных блоков альдегиды а-амипокнелот. При синтезе последних основными недостатками являются высокая стоимость реагентов, сложная процедура очистки, высокая чувствительность этих методов к чистоте исходных соединений, образование множества побочных продуктов.

Нами предложено использование известного окислителя - диоксида марганца (Мп02) для получения Ы-защищенпых а-амипоальдегидов с высокой степенью оптической чистоты и хорошими выходами, схема реакции представлена на рис. 1.

б

.РО

г НО у* _

о ОСС, ЕЮАс г1, 20Ь

ЫаВН4, АсОН НМ'РС Мп02 Ны'рс

МеОНМохапе chloroform К к

Рисунок 1. Общая схема синтеза псптидил-а-амнпоальдсгидов.

Этим методом был синтезирован ряд М-защшцснных а-амипоальдсгидов, производных различных типов природных Ь-амипокислот, гидрофобных (например, фепилалапии, налип), гидрофильных (например, аспарагиповая кислота) и

мультпфупкниопальпых (например, лизин). Выходы полученных соединении представлены в таблице 1.

Таблица 1. Время реакции и выходы пептидил-а-амппоальдегидов.

Альдегид Врсми, ч Выход, %

г-РЬс=а1 24 85

2-Ьси=а1 18 72

2-Уа1=а1 18 86

22-Ьу5=а1 24 74

Рог-Р11с=а1 24 67

Вос-Л5р(0'Ви)=а1 12 91

Вос-РЬс=а1 18 77

Вос-1ли=а1 18 81

Вос-Уа1=а1 12 83

Время реакции окисления подбиралось в каждом случае индивидуально с помощью анализа реакционной смеси методом ГСХ и составляло от 12 до 24 часов. Наиболее высокий выход отмечен при

синтезе Вос-защищенпого аспарагииаля (91%), наименьший - и случае формилфепилалапиналя (67%).

Обличительной чертой предложенного метода является простота выделения целевого продукта, который выделяется после отделения побочных мсталлооргапических и неорганических продуктов фильтрованием и последующим упариванием реакционной смеси.

2. Синтез циклических амидов аминокислот.

Циклические амиды аминокислот представляют собой важный класс соединений, восстановление которых с помощью алюмогпдрида лития позволяет синтезировать альдегиды аминокислот и пептидов. Цнклоамиды аминокислот могут быть превращены в циклоамиды пептидов, которые, как указывалось выше, являются эффективными ингибиторами сериповых протсипаз Механизм действия этих соединений па сериновые прогеиназы аналогичен действию пептидоальдегидов: образуется тетраэдрический амипаль - непродуктивный аналог переходного состояния. В то же время вторичные амиды пептидов несравнимо стабильнее пептидоальдегидов аналогичной структуры.

Синтез циклоамидов аминокислот описан в литературе достаточно широко, по число стандартных методов синтеза этих соединений ограничено. В основном для этой цели применяются метод смешанных ангидридов и ацилировапие амина кислотой в присутствии конденсирующих агентов.

Нами был использован метод сукципимидпых эфиров для синтеза амидных производных различных типов аминокислот, в качестве ацил-компоиепта мы использовали гидрофобные (например, фенилалании), гидрофильные (например, аспарагиповая кислота) и мультифупкциональные (например, лизип, глутамиповая кислота) аминокислоты. Амиио-компоиептами служили алициклические (пиперидин, морфолип, гомопролип) и ароматические амины (имидазол). Схема синтеза приведена на рис. 2. Сукципимидпые эфиры всех типов аминокислот были синтезированы стандартным методом из

соответствующих М-Вос-защшценпых аминокислот и сукцннимида в присутствии дициклогексилкарбодиимпда. Лцилироваиис полученными эфирами свободных аминов позволило выделить защищенные циклоамидные производные аминокислот с выходами выше 77% в течение 4-8 часов. Время реакции подбиралось отдельно для каждой аминокислоты с помощью анализа реакционной смеси методом ТСХ. Синтезированные соединения были охарактеризованы с номощыо масс-спсктрометрии. Времена реакций, выходы и масс-сисктромстрическис данные полученных защищенных циклоамидов приведены в таблице 2.

о.

NN

ОМ

МО

О

1)СС, ЫОАс К Г, 2011

„Вое

NN о

сус1оатшс 1|у'ВоС МС1 / ЛсОМ у! ¡2 х11С1

сПохапс, 111" ^ ^ '

К, К,

О о

Г\1Н

о

он

Рисунок 2. Общая схема синтеза циклических амидов аминокислот.

Таблица 2. Синтезированные защищенные циклоамиды.

Амид Время, ч Выход, % 8Аи01-М8

15осА8р(01Ви)-Р'|р 4 93 201

Вос01и(СИВи)-Р1р 4 89 215

Вос1'го-1'ф 4 89 183

ВосРКс-Р1р 4 90 233

Вос1 ,еи-1Чр 4 87 199

Вос2Ьу8-Рф 4 87 214

Вос'Ггр-Рф 4 72 272

Вос1Пз-Р1р 4 84 223

ВосЛ8р(01Вн)-МГ 6 88 203

ВосС1и(01Ви)-МГ 6 92 217

ВосРго-МГ 6 86 185

ВосРЬе-МС 6 90 235

ВоЫ.си-МГ 6 81 201

Вос2Ьуй-МГ 6 80 216

ВосТгр-МГ 6 82 274

ВосШя-МГ 6 87 225

ВоеЛ5р(01Ви)-1т 8 89 184

Вос01и(СИВи)-1т 8 92 198

ВосРго-1т 8 77 166

ВосРЬе-!т 8 84 216

Вос21.у8-ЬР 8 76 258

Соответствующие соли целевых циклоамидов аминокислот были выделены и охарактеризованы температурами плавления, 8ЛЬ01-М8-спектрами и углами оптического вращения.

Таким образом, использование метода сукципимидпых эфиров позволяет синтезировать циклоамидпые производные практически всех аминокислот в мягких условиях и за короткое время. После отщепления защитных групп (бутоксикарбоиильиой с основной и боковых М^-групп и трет-бутильпой с боковых СООН-групп) полученные циклические амиды аминокислот со свободной а-амипогрупной были использованы в качестве структурных блоков при синтезе вторичных амидов пептидов.

3. Синтез вторичных амидов пептидов.

Как упоминалось выше, вторичные амиды пептидов являются эффективными ингибиторами сериновых протеиназ.

В литературе представлен ряд химических и ферментативных методов синтеза этих соединений, однако ферментативно-катализируемые реакции ограничены применением липаз. Основываясь на имеющемся в лаборатории опыте по использованию субтилизина 72, сорбированного на макропористом носителе, были получены вторичные амиды пептидов Рог/МаРЬеЬуБ^р и РогА1аРЬеЬуз1У^ ацшшрованием вторичных амидов аминокислот, схема реакции представлена на рис. 3.

Рисунок 3. Синтез амидов пептидов ацшшрованием вторичных амидов аминокислот

Учитывая, что обладающий широкой специфичностью субтилизин 72 в катализируемых им реакциях пептидной связи может воспринимать в качестве акцептора ацильной группы неаминокислотные компоненты, нами была исследована возможность ферментативного ацилирования вторичных аминов.

О

Ш.

2

Общая схема синтеза вторичных амидов пептидов с использованием в качестве катализатора реакции субтилизина-72, сорбированного на силохроме С-80, представлена на рисунке 4.

Хаа

5иЫШз1п-72/8Пос11гот-С80

асеЬ)п№1е, г1

О

Рв ¿2

Рисунок 4. Общая схема синтеза вторичных амидов пептидов.

Ацилирование пиперидина эфиром Опр-А1а-А1а-Ьеи-ОМе, содержащим динитрофенильный маркер для облегчения визуального контроля, использовалось в качестве модельной реакции. Невысокое сродство неаминокислотного ацил-акцептора к РГ участку активного центра субтилизина компенсировали 10-кратным избытком пиперидина. Согласно литературным данным, тетрагидрофуран, диоксан и ацетонитрил, менее всего инактивирующие фермент при применении, были выбраны в качестве растворителей для модельных реакций. По сравнению с ТГФ и диоксаном, выходы реакций, проведенных в ацетонитриле, были несколько выше, и дальнейшие синтезы проводились именно в этом растворителе.

При исследовании влияния рН буфера, из которого производится нанесение фермента на силохромовую подложку, оказалось, что наиболее эффективно синтез протекает при использовании фосфатного буфера с рН

Контролируя изменение состава реакционной смеси в процессе ацилирования с помощью ВЭЖХ мы определили, что в первые два дня происходит гидролиз исходного эфира пептида с образованием пептида со свободной карбоксильной группой (рис. 5), которое достигает максимума через трое суток. В этот промежуток времени накопление целевого продукта незначительно. Последующий подъем кривой образования

7.5.

пептамида, что обусловлено тем, что в качестве ацил-донора начинает выступать и продукт гидролиза исходного эфира, через пять дней кривая накопления целевого продукта выходит на плато. Это время было признано оптимальным.

• РпрА|аА1а1_еиОМе * РпрА1аА1а1.еиОН

Рисунок 5. Изменение состава реакционной смеси в синтезе Эпр-ААЬ-

Р!р.

Согласно разработанной методике мы провели реакции между эфирами ацил-пептидов, содержащих различные аминокислотные последовательности, и рядом вторичных аминов. Выходы целевых соединений приведены в таблицах 3-5.

Выходы всех вторичных амидов, за исключением дифениламида, составляют 66-96%. Хуже протекает ацилирование п-аминопиридина и 5-аминосалициловой кислоты: целевые амиды выделены с выходами 56 и 6%, соответственно, а попытки получения производных п-нитроанилина и 3-аминохинолина закончились неудачей, амида пептида зафиксировано не было. Возможно, отсутствие реакции между эфирами пептидов и использованными первичными ароматическими аминами, а также дифениламином, объясняется пониженной нуклеофильностью последних.

В процессе исследования было обнаружено, что целевой продукт находится преимущественно в одной области гетерофазной реакции: либо

сорбируется на поверхности носителя, либо остается растворенным в жидкой фазе. При этом побочный продукт (гидролизат исходного эфира пептида) находится в противоположной фазе.

Таблица 3. Синтезированные вторичные амиды пептидов, содержащие последовательности -А1а-А1а-Ьеи- и -А1а-А1а-01и-

Ацил-донор Амин Пептамид Выход, %

Dnp-AAL-OMe Морфолин Dnp-AAL-A//' 66

Dnp-AAL-OMe Имидазол Dnp-AAL-/m 87

Dnp-AAE(OMe)-OMe Пиперидин Dnp-AAE(OMe)-/,/p 74

Dnp-AAE(OMe)-OMe Морфолин Dnp-AAE(OM é)-Mf 78

Dnp-AAE(OMe)-OMe диэтиламин Dnp-AAE(OMe)-D£/i 69

Dnp-AAE(OMe)-OMe 4-аминопиридин Dnp-AAE(OMeM/V 56

Dnp-AAE(OMe)-OMe Имидазол Dnp-AAE(OMe)-/m 73

Dnp-AAE(OMe)-OMe Индол Dnp-AAE(OMe)-/™/ 70

Cbz-AAL-OMe Имидазол Cbz-AAL-/w 82

Cbz-AAE(OMe)-OMe Индол Cbz-AAE(OMe)-/n¿ 75

Cbz-AAL-OMe диэтиламин Cbz-AAL -DEA 83

Cbz-AAE(OMe)-OMe Имидазол Cbz-AAE(OM e)-Im 96

Cbz-AAE(OH)-OH имидазол Cbz-AAE(OH )-¡m 88

Dnp-AAL-OMe 5-амино-салициловая к-та Dnp-AAL-ASA 14

В том случае, когда в качестве ацил-донора используется Опр-

А1аА1аАг§-ОМе, из-за его низкой растворимости в чистом ацетонитриле, в реакционную смесь необходимо добавлять до 35% диметилсульфоксида.

Таблица 4. Синтезированные вторичные амиды пептидов, содержащие

последовательности -Ala-Ala-Arg-

Ацил-донор Амин Пептамид Выход, %

Dnp-AAR-OMe Морфолин Dnp-AAR-Mf 45

Dnp-AAR-OMe Морфолин Dnp-AAR-A//" 31

Dnp-AAR-OMe морфолин Dnp-AAR-A//" 35

Dnp-AAR-OMe имидазол Dnp-AAR-/m 46

Dnp-AAR-OMe пиразол Dnp-AAR-Pyr 49

Dnp-AAR-OMe диэтиламин Dnp-AAR-£)£4 36

Согласно полученным в нашей лаборатории данным, аминокислотная последовательность -Ак-РЬе-Ьуэ- специфична для плазмина и синтезированные амиды, содержащие эту последовательность, могут быть использованы в качестве ингибиторов этого фермента.

Таблица 5. Синтезированные вторичные амиды пептидов, содержащие последовательности -Ala-Phe-Lys-

Ацил-допор Амии Пептамид Выход, %

For-AFK-OMe Индол For-AFK-Ind 76

For-AFK-OMe Гомопролип For-AFK-hP 68

For-AFK-OMe Диэтиламип For-AFK-DliA 89

For-AFK-OMe Пиперидин For-AFK-Pip 77

For-AFK-OMe Морфолин For-AFK-МГ 64

Таким образом, нами разработан эффективный метод синтеза вторичных амидов пептидов с использованием ферментативного катализа в мягких условиях и с высокими выходами. Предложенный метод позволяет синтезировать пептидные производные, содержащие различные аминокислотные последовательности и амидпые модификаторы.

4. Синтез пуклеопептидов.

Нуклеотиды и олиго/полипуклеогиды, модифицированные разнообразными пептидными последовательностями, находят широкое применение в органическом синтезе, медицинской химии, биологических исследованиях. Их можно получать различными методами, основные недостатки которых - низкая региоселективпость ацилировапия и, следовательно, необходимость блокирования и последующего деблокирования реакциопиоспособных групп, а также невысокие выходы. Описано применение липаз из различных источников (Candida antarctica, Pseudomonas sepacia) в фермептативно-катализируемом синтезе пуклеопептидов. Выход целевых соединений в этом случае составляет около 60%. Липазы давно и широко известны как катализаторы реакций ацилировапия эфирами органических кислот различных соединений: Сахаров, пуклеозидов и др. Описаны аналогичные синтезы и с помощью ферментов семейства субтилизина.

Производные нуклеиновых кислот, имеющие своей структуре —N11— группу, могут рассматриваться в качестве вторичных аминов, поэтому опи

также были введены в реакцию ферментативного ацилировапия, катализируемую субтилизином-72. Однако прямое повторение разработанной нами методики не привело к желаемому результату. Учитывая имеющийся в литературе опыт по адаптации активного центра фермента путем лиофилизации его с псспсцифичсским луклеофилом, мы предварительно лиофилизовали пуклеозид с субтилизином, а затем полученный адцукт сорбировали па силохромс. При такой лиофилизации активный центр фермента, по-видимому, принимает искаженную форму, способную вмеез и гь в себя молекулу песпсцифичного ацил-акцептора.

Оказалось, что, в огличис от реакции с аминами, при ферментативном ацилировании пуклеозидов пс затрагиваются имеющиеся в их структуре атомы азога, ацилировапию подвергаются исключительно З'-О атомы, что приводит к хемо- и рсгиосслсктивному образованию З'-О-пептидилиуклеозидов. Схема реакции приведена па рис. 6.

Dnp-Ala-Ala-Lcu-OMc

НО V_7 _2

HQ* Sublilisin-72

j TIIF/pyridinc, RT

Nb: guanine, thymine, adenine,cytosine Dnp: 2,4-dinitrophenyl-

1'исуиок 6. Схема реакции ацилировапия дсзоксирибопуклеозидов пептидом Dnp-AIa-Ala-Leu-OMe.

По згой методике нами были получены производные дсзоксирибопуклеозидов (таблица 6). Оптимальной смссыо растворителей при ацилировании гидрофильиых компонентов нуклеиновых кислот оказалась смесь тстрагндрофуран-ниридип. Отсутствие ацилировапия предложенным методом рибоиуклеозидов и пуклеотидов (как рибо-, так и дсзоксирибо-) возможно объясняется стсричсскими затруднениями при укладке ацил-акцешора в S1' кармане субтилизина. Выходы реакции

Leu 3 Ala'

ЧА1а Dnp

ацилировапия и масс-спектры полученных соединении приведены в таблице 6.

Таблица 6. Выходы и свойства ацил-дезоксирибонуклеозидов.

Ацил-акцсптор Продукт Выход, % SALDI-MS (MU I)

dT 3'-0-(Dnp-AAL)-dT 89 664.3

dC 3'-0-(Dnp-AAL)-dC 87 649.7

dA 3'-0-(Dnp-AAL)-dA 71 673.3

dG 3'-0-(Dnp-AAL)-dG 77 689.6

Таким образом, используя измененную методику, разработанную для получения вторичных амидов пептидов, нами показана возможность хемо-и региоселективиого ацилирования дсзоксирибопуклеозидов эфиром пептида в условиях ферментативного катализа субтилизином.

5. Исследования фармакологической активности синтезированных соединений.

Как уже упоминалось выше, вторичные амиды являются ингибиторами сериновых протеиназ. Взаимодействие с тем или иным ферментом обуславливается последовательностью аминокислот, входящих в состав пептида и специфично узнаваемой активным центром фермента. Нами синтезированы соединения, являющиеся потенциальными ингибиторами субтилизипа, глутамип-снецифичпой и ключевых протеиназ системi)i гемостаза - тромбина и плазмина. Определенные для некоторых пептидных производных константы ипгибирования сопоставимы с константами пептидоальдегидов соответствующей структуры, синтезированных ранее (For-AlaAlaI,ys=al, Z-A la Alai cu al).

Для амидов трипептидов, содержащих аминокислотную последовательность Alal'hcLys, специфично связывающуюся с плазмииом, проведены эксперименты по определению биологической активности ш vilro и in vivo.

Известно, что образующиеся при кровотечениях сгустки крови, замедляют, а впоследствии и останавливают кровотечение. Однако наряду с процессом образования тромбов иод действием тромбина происходит их параллельное растворение под действием плазмипа. Таким образом, возникает задача ингибировапия плазмипа для более эффективной остановки кровотечения. Эксперименты по измерению времени эуглобулипового фактор ХНа-зависимого лизиса были проведены на человеческой плазме крови, в которой лизис был инициирован с помощью каолина. Время лизиса сгустков представлено в таблице 7. В качестве положительного контроля использовался стандартный коммерческий препарат с-амипокапроповой кислоты. В результате проведенных экспериментов показано, что производные пептидов Рог-Лк-РЬс-Ьуя-МГ и 1"()Г-А1а-РМс-1 .у.ч-1'1р по сравнению с контролем заметно замедляют ХПа-зависимый эуглобулиповый лизис и удлиняют время растворения сгустка до 22.6 ± 0.9 и 21.9 ± 1.2 минут, соответственно. По времени действия данные результаты сравнимы с действием с-аминокапроповой кислоты (30.0 ±0.7 минут).

Таблица. 7. Время эуглобулипового фактор ХНа-зависимого лизиса

№ Вещество Время лизиса, мин

1 Рог-Л 1а-1Чю-Ьун-а1 3.8^0.3

2 1ч>г-Л1а-РЬе-1,ук-Рф 21.9±1.2

3 Гч)г-Л1а-РЬе-[.ух-МГ 22.610.9

4 Гог-Л1а-Р1|е-Ьу8-1пс1 9.5±0.6

5 Гог-АЫ'Ьс-Ьуя-ИР 8.3±0.6

6 Гог-Ма-РИе-Ьуя-ОЕД 7.5±0.4

7 с-ЛКК 3.0±0.8

8 Контроль 3.0±0.8

Два соединения из приведенных в таблице, а именно РогЛ1аР11сЬуБР1р и ГогЛЫ'ЬсЬухМГ, показали сущсствсшюе увеличение времени растворения образующихся сгустков по сравнению с контрольным, и таким образом, они, вероятно, могут способствовать более эффективной остановке кровотечения. Совместное действие пептида Рог-ЛЬ-РИе-Ьуя-МГ и с-ЛКК замедляет ХНа-зависимый эуглобулиповый лизис до 42.5 ± 0.9 минут, что превышает растворение сгустка при контроле в 6 раз (7.0 + 0.9

минут). Композиция 1'ог-Л1а-1'||С-1.у5-[)1р и с-АКК увеличивает время лизиса до 40.5 ± 0.9 минут. Результаты экспериментов приведены в таблице 8.

Таблица 8. Время эуглобулипового фактор ХПа-зависимого лизиса

Вещество Время лизиса (минуты)

For-Ala-Phe-Lys- Mf 22.6 ± 0.9

For-Ala-Phe-Lys- Pip 21.9 ± 1.2

For-Ala-Plic-Lys-Mf+ с-ЛКК 42.5 ± 0.9

For-Ala-Phe-Lys-Pip + с-ЛКК 40.5 ± 0.9

с-ЛКК 30.0 + 0.7

Контроль 7.0 ± 0.9

Таким образом, отмечена сипергиетическая активность

синтезированных пептамидов при сочетаппом применении с с-аминокапроповои кислотой.

Опыты ш vivo проводились па кроликах, имеющих поверхностную рану печени, обуславливающую капиллярно-паренхиматозное кровотечение. Размер раны подбирался таким образом, чтобы истечение крови составляло примерно 1 мл/мин. Время остановки кровотечения сравнивалось с контрольным (отсутствие кровоостанавливающего агента) и с положительным контролем (е-амипокапроновая и трапексамовая кислоты, стандартные коммерческие кровоостанавливающие препараты). Для удержания растворов пептидов па раневой поверхности их наносили на текстильный носитель (двухслойная марлевая салфетка). Результаты экспериментов приведены в таблице 9.

Таблица 9. Время остановки кровотечения на открытой рапе, пептид

нанесен на тканевую основу.

Пептид Доза вещества, мг/см2 Время остановки кровотечения,с

For-Ala-Phe-Lys-al 5 83±5

For-Ala-Phe-Lys-Pip 5 60±1

For-AIa-Phe-Lys-Mf 5 77±7

с-амипокапроновая к-та 5 140Ь7

трапексамовая к-та 5 98±15

контроль 237±13

Учитывая влияние пептидов па эуглобулиновмй лизис, сравнимый по силе действия с е-амипокапроповой кислотой, и усиление данного эффекта при совместном применении пептидов Рог-ДЬ-РЬс-ЬуБ-МГ и 1''ог-А1а-РЬе-Ьув-Рф и е-АКК, было решено провести сравнительное исследование гемостатической активности растворов с-АКК и композиции пептидов с данной кислотой. Мы изучили влияние раствора с-ЛКК в различных дозах па время остановки кровотечения и объем кровопотсри на модели раневой поверхности. Раствор с-АКК также наносился на текстильный носитель (двухслойная марлевая салфетка). Результаты экспериментов приведены в таблице 10.

Таблица 10. Влияние с-ЛКК па время остановки кровотечения и объем

кровопотсри в условиях эксперимента на животных

Вещество Доза вещества, мг/см2 Время остановки кровотечения, сек Объем кровопотсри,г

с-АКК 1 153±12 3.210.2

с-ЛКК 2 145±9 3.2±0.3

с-ЛКК 5 14017 2.910.4

Контроль 180И6 3.610.3

В результате исследования было выявлено, что при увеличении дозы с-АКК с 1 до 5 г/см2, происходит снижение времени остановки кровотечения и объема кровопотсри. При изучении с-ЛКК в дозе 1 мг/см2 был отмечен небольшой гемостатический эффект, который выражался в снижении времени остановки кровотечения до 153±12 сек при контрольном времени 180±16 сек. Также было отмечено снижение объема кровопотсри по сравнению с контрольным (3.2±0.2 г и 3.610.3 г, соответственно). с-ЛКК в дозе 5 мг/см2 заметно снижает время остановки кровотечения и уменьшает объем кровопотсри.

При изучении гемостатической активности композиций производных пептидов Гог-А1а-РЬс-Ьуз-МГ и Гог-ЛЬ-РЬе-Ьуз-Рф с е-амипокапроповой кислотой в соотношении 1:1 в дозах 2,5 мг/см2 и 5 мг/см2 было обнаружено,

что смесь аминокапроповой кислоты и пеитамида обладает синергистическим эффектом. Результаты экспериментов приведет,! в таблице 11.

Таблица. 11. Влияние композиций непгида и с-АКК на время остановки кровотечения и объем кровогютери в условиях эксперимента на животных

Вещество Сооти. вещ-в Доза , мг/см2 Время остановки кровотечения, с Обьем кровопотери, г

Гог-Л1а-РИе-Ьу8-М 1" +с-Л К 1С 1:1 2,5 63И4 0.7Ю.1

Гот-ЛЫ'Ье-Ьуя-МГ+с-ЛКК 1:1 5 65Н0 0.9Ю.2

Гог-А1а-Р11е-1,у5-Рф н-с-ЛКК 1:1 2,5 6019 0.7Ю.1

Рог-ЛЬ-РЬе-Ьуя-Рф +С-ЛКК 1:1 5 70111 1.0Ю.З

Контроль 205±1I 2.910.2

В результате проведенного исследования было показано, что композиция пептида Гог-АЬ-РЬе-ЬуБ-МГс с-АКК в дозе 2,5 мт/см2 снижала время остановки кровотечения до 63И4 сек при контрольном времени остановки кровотечения 205±11 сек. Объем кровопотери снизился с 2.910.2 г до 0.710.1 г. При исследовании композиции пептида 1'ог-Л1а-Р1]С-1.у.ч-МГ с с-АКК в дозе 5 мг/см2 было также отмечено снижение времени остановки кровотечения до 65±10 сек, а объема кровопотери до 0.910.2 г. Исследование композиции пептида 1'ог-А1а-Р1ю-Ьуз-Р1р с е-АКК в дозе 2,5мг/см2 показало снижение времени остановки кровотечения и объема кровопотери до 60±9 сек и 0.7Ю.1 г, соответственно. При увеличении дозы изучаемой композиции до 5 мт/см2 было также отмечено снижение времени остановки кровотечения и объема кровопотери, которые составили 70111 сек и 1.0Ю.З г, соответственно.

Таким образом, синтезированные нами соединения обладают лучшей гемостатической активностью, чем традиционные коммерческие препараты, и потенциально могут быть использованы для создания новых лекарственных форм для лечения геморрагических нарушений.

выводы.

1. Предложено использование двуокиси марганца для получения N-защищенпых а-амипоальдегидов окислением N-ацил-р-амииоспиртов.

2. Подобраны оптимальные условия ацилировапия вторичных аминов, катализируемого субтилизипом 72, и синтезирован ряд производных пептидов, содержащих вторичные амиды лизина и аргинина.

3. Показано, что в качестве ацил-акцептора в катализируемом субтилизипом синтезе могут выступать дезоксирибонуклсозиды. В этом случае хемоселективно ацилирусгся З'-О атом сахарного остатка.

4. Исследована биологическая активность некоторых синтезированных пептидов и показано, что два из них, запатентованные производные Por-Ala-Phe-Lys-Pip и For-AIa-Phe-Lys-Mf, обладают выраженной гсмостатической активностью и могут быть использованы в качестве компонентов при создании медицинских препаратов.

5. Выявлена целесообразность комбинирования пептидов For-Ala-Phe-Lys-Pip и For-Ala-Phc-Lys-Mf с с-АКК для усиления гсмостатичсского эффекта.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях.

]. Maxim Е. Scrgccv, Taliana L.Voyushina. Procedure for the oxidation of p-aminoalcohols to a-aminoaldchydcs. // Synlctt. 2005, 18, p.2802-2804.

2. Maxim E. Sergecv, Tatiana L.Voyushina. Convenient synthesis of a-amino acid-derivcd cyclic amides for use as building blocks lor protease inhibitors. // Letters in Org. Chern. 2006, 3, p.857-560.

3. N. N. Drozd, A. S. Tolstcnkov, V. A. Makarov, 'Г. L.Voyushina, M. E. Scrgccv. Anticoagulant activity of original synthetic peptide derivatives. // Dull. Exp. Iîiol. Med.. 2008, 145, p.57-60.

4. В. Л. Макаров, Г. Г. Белозерская, Т. J1. Воюшипа, О. Е. Неведрова, М. Е. Сергеев, О. Л. Сергеева, Л. С. Малыхипа, Л. Л. Тер-Лрутюпяпц. Оригинальные синтетические пептиды, обладающие гемостатической активностью. // Гематология и Трапсфузиология. 2007, 52, с.32-35.

5. Maxim Е. Sergeev, Tatiana L.Voyushina. Enzymatic acylation of nucleosides - novel route to nucleopeptides. // J. Mol. Cat. B. 2010, 62, p. 105-107.

6. Voyushina T. L., Sergeev M. E., Chestukhina G. G. Enzymatic synthesis of peptide secondary amides. // J. Pept. Sci. 2008, suppl. 14(B), p.57.

7. Г. Г. Белозерская, Т. Л. Воюшипа, В. Л. Макаров, Л. С. Малыхипа, О. Е. Неведрова, М. Е. Сергеев, О. А. Сергеева, А. А. Тер-Арутюняпц. Новые оригинальные синтетические пептиды, обладающие гемостатической активностью. // Материалы конференции "III всероссийский симпозиум Белки и Пептиды". 2008, с.90.

8. Т. Л. Воюшипа, Г. Г. Честухипа, М. Е. Сергеев. Ферментативный синтез вторичных амидов пептидов. // Материалы конференции "III всероссийский симпозиум Белки и Пептиды". 2008, с.23.

9. Т. Л. Воюшипа, Н. II. Дрозд, В. А. Макаров, М. Е. Сергеев, А. С. Толстеиков, И. Т. Мифтахова. Синтетическое производное пептида, проявляющее антикоагулянтную активность. // Патент РФ 2 377 246 С2. 2007.

10. Г. Г. Белозерская, Т. Л. Воюшипа, В. А. Макаров, JI. С. Малыхипа, О. Е. Неведрова, М. Е. Сергеев, О. А. Сергеева, А. А. Тер-Лрупопяиц. Синтетические производные пептидов. // Патент РФ 2 341 532 С2. 2006.

Подписано в печать 08.11.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

I.1 Ингибиторы протеиназ системы гемостаза.

1.1.1. Тромбин и плазмин - ключевые ферменты системы гемостаза.

1.1.2. Природные ингибиторы ферментов системы гемостаза.

1.1.3 Бифункциональные синтетические ингибиторы тромбина.

1.1.4 Сайт-направленные синтетические ингибиторы тромбина.

1.1.5 Ингибиторы плазмина.

1.1.5.1 Природные ингибиторы плазмина.

1.1.5.2 Синтетические ингибиторы плазмина.

1.1.6. Ингибиторы других протеиназ системы гемостаза.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

II. 1. Синтез N-ацил-а-аминоальдегидов.

11.2. Синтез циклических амидов аминокислот.

11.3. Синтез вторичных амидов пептидов.

11.4. Синтез нуклеопептидов.

11.5. Фармакологические исследования.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

III. 1. Материалы и методы.

III.2. Синтез а-аминоальдегидов.

III.2.1. Общая процедура на примере синтеза Boc-Asp(OtBu)=al.

3.2.1.1. Boc-Asp(OlBu)-OH.

111.2.1.2. Boc-Asp(OlBu)-ONSu.

111.2.1.3. Boc-AspCO'BiO-ol.

1Л.2.1.4. Вос-Азр(0'Ви)=а1.

IH.2.1.5 Синтез пептидил-а-аминоальдегидов, производных Val, Leu, Phe и Lys.

111.3. Синтез циклических амидов аминокислот.

Ш.3.1. Общая процедура на примере синтеза Lys-Pip*2HCl.

III.3.1.1. Синтез Boc2Lys-ONSu.

Ш.3.1.2. Синтез Boc2Lys-Pip.

111.3.1.3. Синтез Lys-Pip*2HCl.

Ш.3.1.4 Синтез защищенных и свободных циклических амидов аминокислот.

111.4. Ферментативный синтез амида пептида ForAlaPheLys-Pip.

111.4.1 Приготовление катализатора (субтилизина-72, сорбированного на силохроме С-80).

111.4.2 Синтез амида ForAlaPheLys-Pip.

111.5. Синтез вторичных амидов пептидов.

111.5.1. Общая процедура на примере синтеза (имидазол-1 -ил)амида N"'-(бензилоксикарбонил)-Ь-аланил-Ь-аланшт-Ь-(0-метил)-глутаминовой кислоты (Cbz-AlaAlaGlu(OMe)-Im).

111.5.2. Синтез вторичных амидов пептидов.

111.6. Синтез нуклеопептидов.

III.6.1. Общая процедура на примере синтеза 3'-O-[N0>-(2,4динитрофенил)-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-лейцил]-2'-дезокситимидина.

III.6.2 Синтез нуклеопептидов, производных dC, dA и dG.

111.7. Методы фармакологических исследований.

111.7.1. Методика определения активности сериновых протеиназ.

111.7.2. Методика ингибирования субтилизина.

111.7.3. Методика ингибирования плазмина.

111.7.4. Методика определения времени эуглобулинового фактор ХПа-зависимого лизиса.

111.7.5. Методика определения времени остановки кровотечения in vivo.

111.7.6. Методика определения объема кровопотери in vivo.

ВЫВОДЫ.

Система свертывания крови в нормальном состоянии находится в динамическом равновесии, при котором фибриновые сгустки постоянно образуются, а затем растворяются. Ключевыми ферментами системы гемостаза, ответственными за данные противоположные процессы, являются тромбин и плазмин. Аномальный избыток одного из этих ферментов приводит к нарушениям системы кровообращения, и современная медицина требует высокоэффективных препаратов как для предотвращения избыточного фибринобразования, так и для остановки кровотечений. Таким образом, центральная роль тромбина и плазмина в регуляции агрегатного состояния крови подталкивает многих ученых к попытке создания сильных и селективных ингибиторов данных протеиназ. Исследователям известно довольно большое количество различных классов ингибиторов тромбина и плазмина, представляющих собой как природные белки и производные пептидов, так и низкомолекулярные синтетические соединения. Однако многие из известных ингибиторов обладают рядом недостатков, такими как недостаточная химическая устойчивость, отсутствие высокой селективности по отношению к различным ферментам крови, усложненные процедуры синтеза и очистки, токсичность для организма. Разработка структуры веществ, селективно ингибирующих либо тромбин, либо плазмин, совмещение удобства синтеза и очистки новых низкомолекулярных производных для использования в медицине в качестве ингибиторов определенных протеиназ системы гемостаза позволит более эффективно осуществлять профилактику и лечение тромбозов и геморрагий.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Ингибиторы протеиназ системы гемостаза.

1.1.1. Тромбин и плазмин - ключевые ферменты системы гемостаза.

Основными ферментами регуляции агрегатного состояния крови являются тромбин, ответственный за свертывание крови, и плазмин -центральное звено фибринолитической системы. Особое внимание исследователи уделяют изучению тромбина, так как он обладает уникальной функцией в коагуляционном каскаде [1].

Тромбин, инициирующий превращение фибриногена в фибрин и активирующий тромбоциты, является ключевым ферментом тромбообразования. Как и большинство ферментов системы гемостаза, тромбин - это мультикаталитическая сериновая протеиназа, состоящая из двух полипептидных цепей [2]. Тромбин гидролизует четыре связи Arg-Gly в фибриногене [3], при этом из молекулы фибриногена удаляются два фрагмента — отрицательно заряженные фибринопептиды, и образуется фибрин-мономер. Длинные нерастворимые молекулы фибрин-мономера спонтанно ассоциируются в регулярные зигзагообразные структуры с образованием нерастворимого полимерного фибринового сгустка. Он захватывает тромбоциты, эритроциты и другие компоненты крови, в результате чего образуется тромбоцитная пробка - тромб. Кроме превращения фибриногена в фибрин, функция тромбина заключается в переводе множественных факторов коагуляции (например V, VIII) и фактора стабилизации XIII, стабилизирующего фибрин, в активную форму (Va, Villa, Xllla), а также в инициации антикоагулянтных путей через активацию протеина С [4, 5]. Тромбин инициирует некоторые клеточные и сосудистые реакции, такие как агрегация тромбоцитов, эндотелиальное клеточное размножение (пролиферация), сужение и/или расширение самих сосудов и др. [6, 7]. Так как тромбин участвует в таких различных биорегуляторных процессах, ингибирование его активного центра должно быть высокоэффективным при лечении различных заболеваний. При этом важно, чтобы используемые ингибиторы были в достаточной степени специфичными, так как сайт-направленные ингибиторы могут взаимодействовать и с другими компонентами крови.

Плазмин также является сериновой протеиназой, катализирующей расщепление фибрина, в результате чего происходит разрушение тромбов. В фибрине плазмин гидролизует пептидные связи, образованные остатками лизина и аргинина. Субстратами плазмина являются также: фибриноген, факторы свертывания крови V, VIII и ХГ1, гликопротеины мембран тромбоцитов, компоненты Cl, СЗ и С5 системы комплемента и другие. В плазме крови плазмин находится в виде предшественника (профермента) плазминогена, который существует в двух формах, различающихся содержанием углеводного компонента [8]. Одна форма содержит гликозилированные остатки Asn-288 и Thr-345, другая - только гликозилированный Thr-345. Плазмин представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую у человека из 790 аминокислотных остатков (полностью расшифрованы первичная структура плазмина и его гена). Третичная структура плазминогена представлена семью доменами: пять из них-гомологичные кренделеобразные структуры, массой около 10 кДа. Подобные структуры обнаружены также у протромбина, тканевого активатора плазминогена, урокиназы и фактора XII свертывания крови. Два домена сформированы участком полипептидной цепи, соответствующим легкой цепи плазмина. В пяти кренделеобразных доменах расположены участки связывания субстрата с лизином и аргинином, представляющие собой полости, в формировании которых участвуют остатки аминокислот, преимущественно ароматической природы. Эти участки определяют сродство плазминогена и плазмина к фибрину, на поверхности которого происходит превращение плазминогена в плазмин. Оно сопровождается расщеплением одной пептидной связи между аргинином и валином в положениях 560 и 561, соответственно. При этом образуется двухцепочечная структура плазмина. Тяжелая цепь плазмина содержит все пять кренделеобразных доменов плазминогена. Нативный плазмин с остатком глутаминовой кислоты на конце (С1и-плазмин) способен автокаталитически, в результате гидролиза пептидной связи между двумя аминокислотными остатками лизина в положениях 76-77 и отщепления ТЧ-концевого пептида с массой 9 к Да, превращаться в ЬуБ-плазмин, обладающий более высоким сродством к фибрину. Обе формы плазмина способны расщеплять эту связь в проферменте с образованием Ьуз-плазминогена. Последний превращается в Ьуз-плазмин в результате действия ферментов - тканевого активатора плазминогена, урокиназы, комплекса плазминогена со стрептокиназой. Активация плазминогена ускоряется в 1000 раз в присутствии фибрина, на поверхности которого происходит концентрирование профермента и его активаторов. Связывание с фибрином защищает плазмин от инактивации ингибитором а2-антиплазмином плазмы крови, так как во взаимодействии с ним участвуют те же фрагменты структуры фермента, которые участвуют при связывании с фибрином [9].

Так как тромбин и плазмин осуществляют противоположные функции в системе гемостаза, целенаправленное воздействие на один из этих ферментов играет важную роль в лечении как тромбозов, так и геморрагий.

Система свертывания крови в нормальном состоянии находится в динамическом равновесии, при котором фибриновые сгустки постоянно образуются, а затем растворяются. Центральная роль тромбина и плазмина в регуляции агрегатного состояния крови подталкивает многих ученых к попытке создания сильных и селективных ингибиторов данных протеиназ. Некоторые результаты этих исследований рассмотрены в настоящем обзоре.

выводы

1) Предложено использование двуокиси марганца для получения защищенных а-аминоальдегидов окислением М-ацил-|3-аминоспиртов.

2) Подобраны оптимальные условия ацилирования вторичных аминов, катализируемого субтилизином 72, и синтезирован ряд производных пептидов, содержащих вторичные амиды лизина и аргинина.

3) Показано, что в качестве ацил-акцептора в катализируемом субтилизином синтезе могут выступать дезоксирибонуклеозиды. В этом случае хемоселективно ацилируется З'-О атом сахарного остатка.

4) Исследована биологическая активность некоторых синтезированных пептидов и показано, что два из них, запатентованные производные Рог-А1а-РЬе-Ьу5-Р1р и Рог-А1а-РЬе-Ьу8-М^ обладают выраженной гемостатической активностью и могут быть использованы для создания медицинских препаратов.

5) Выявлена целесообразность комбинирования пептидов Рог-АЬ-РЬе-Ьуз-Р1р и Рог-А1а-Р11е-Ьу8-М^ с с-АКК для усиления гемостатического эффекта.

1. Fenton J.W. Regulation of thrombin generation and functions. // Semin. Thromb. Haemost. 1988. v. 14. p.234-240.

2. Stubbs M.T., Bode W. A player of many parts: the spotlight fallson thrombin's structure. // Thromb. Res. 1993. v.69 p.1-58.

3. Blomback B. Fibrinogen and fibrin proteins with complex roles in haemostasisand thrombosis. // Thromb. Res. 1996. v.83 p. 1-75.

4. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance and regulation. // Biochemistry. 1991. v.30. p.10364-10370.

5. Esmon C.T. The roles of protein С and thrombovodulin in the regulation of blood coagulation. //J. Biol. Chem. 1989. v.264. p.4743-4746.

6. Levin E.G., Stern D.M., Nawroth P.P., Marlar R.A., Fair D.S., Fenton J.W., Harker L.A. Specificity of the thrombin-induced earelse of tissue plasminogen-activator from cultured human endothelial cells. // Thromb. Haemost. 1986. v.56. p. 115-119.

7. Moon D.G., Horgarn M.J., Anderson T.T., Krystek S.R., Fenton J.W., Malik A.B. Endothelial-like pulmonary vasoconstrictor peptide release by a-thrombin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. v.86. p.9529-9533.

8. Березов T.T., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. // Под ред. Академика АМН СССР Дебова С.С. Москва. «Медицина». 1990. с.439-446.

9. Castellino F. J. Recent advances in the chemistry of the fibrinolytic system. // Chem. Rev. 1981. v. 81. N5. p.431-446.

10. Bjork I., Lindahl V. Mechanism of the anticoagulant action of heparin. // Mol. Cell. Biochem. 1982. v.48. p. 161-182.

11. Parker K.A., Tollefsen D.M. The protease specificity of heparin cofactor II: inhibition of thrombin generated during coagulation. // J. Biol. Chem. 1985. v.260. p.3501.

12. Olson S.T., Shore J.D. Demonstration of a two-step reaction mechanism for inhibition of a-thrombin III and idendification of the step affected ЬЗЗЗу heparin. // J. Biol. Chem. 1982. v.257. p. 14891-14895.

13. Stone S.R., Hofsteenge J. Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin. // Biochemistry. 1986. v.25. p.4622-4628.

14. Markward F. The development of hirudin as an antithrombotic drug. // Thromb. Res. 1994. v.74. p. 1-23

15. Qiu X., Yin M. Padmanabhan K.P., Krstenansky J.L., Tulinsky A. Structures of thrombin complexes with a designed and a natural exosite peptide inhibitor. //J. Biol. Chem. 1993. v.268. p.20318-20326.

16. Модифицированные аминокислоты и пептиды на их основе. Под редакцией ЧипенсаГ.И. // Рига: Зинанте. 1987. с.214.

17. Aoyagi Т., Takeuchi Т., Matsuzaki A., Kawamura К., Kondo S., Hamada М., Maeda К., Umezawa Н. Leupeptins, new protease inhibitors from actinomycetes. //J. Antibiotics. 1969. v.22. p.283-286

18. Kondo S., Kawamura K., Iwamaga J. Hamada M., Aoyagi Т., Maeda K., Takeuchi Т., Umezawa H. Isolation and characterization of leupeptins produced by actinomycetes. // Chem. Pharm. Bull. 1969. v. 17. p. 18961901.

19. Maeda K., Umezawa H. Synthetic studies on leupeptins and their analogs. //J. Antibiotics. 1972. v.25. p.515-523.

20. Aoyagi Т., Miyata S., Takeuchi Т., Umezawa H. Biological activities of leupeptins. //J. Antibiotics. 1969. v.22. p.558-568.

21. Kamiyama Т., Umino Т., Nakamura Y., Itezono I., Sawairi S., Satoh Т., Yokose K. Bacithrocins А, В and C, novel thrombin inhibitors. // J. Antibiotics. 1994. v.47. p.959-968.

22. Maraganore J.M., Bourdon P., Jabloncky J., Ramachandran K.L., Fenton J.W. Design and characterization of girulogs: a novel class of divalent peptide inhibitors of thrombin. // Biochemistry. 1990. v.29. p.7095-7101.

23. Naski M.C., Fenton J.W., Maraganore J.M., Oslon S.T., Shafer J.A. The COOH-terminal domain of hirudin. // J. Biol. Chem. 1990. v.265. p.13484-13489.t

24. Lombardi A., Nastri F., Morte R.D., Rossi A., De Rosa A., Ataiano N., Pedone C., Pavone V. Rational design of true hirudin mimetics: synthesis and characterization of multisite-directed a-thrombin inhibitors. // J. Med. Chem. 1996. v.39. p.2008-2017.

25. Maraganore J.M., Chao B., Joseph M.L., Jablonski J., Ramachandran K.L. Anticoagulant activity of synthetic hirudin peptides. // J. Biol. Chem. 1989. v.264. p.8692-8698.

26. DiMaio J., Gibbs B., Munn D., Lefebre J., Ni F., iConishi Y. Bifunctional thrombin inhibitors based on the sequence of hirudin 45-65. // J. Biol. Chem. 1990. v.265. p.21698-21703.

27. Nienaber V.L., Amparo E.C. A non-cleavable retro-binding peptide that spans the substrate binding cleft of serine protease. Atomic structure of nazumamide A: human thrombin. // J. Am. Chem. Soc. 1996. v. 118. p.6807-6810.

28. Tabernero L., Chang C.Y.Y., Ohringer S.L., Lau W.F., Iwanowcz E.J., Han W., Wang T.C., Seiler S.M., Roberts D.G.M., Sack J.S. Structure of a retro-binding peptide-inhibitor complexed with human a-thrombin. // J. Mol. Biol. 1995. v.246. p. 14-20.

29. Lewis S.D., Ni A.S., Baldwin J.J., Fusetani N., Naylor A.M., Shafer J.A. Inhibition of thrombin and other trypsin-like serine proteinases by cyclotheonamide A. // Thromb. Res. 1993. v.70. p. 173-190.

30. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. //Nature. 1992. v.355. p.564-566.

31. Paborsky L.R., McCurdy S., Griffin L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. // J. Biol. Chem. 1993. v.268. p.20808-20811.

32. Kubik M.F., Stephens A.W., Schneider D., Marlar R., Tasset D. High-affinity RNA ligands to human a-thrombin. // Nucleic Acids Res. 1994. v.22. p.2619-2626.

33. Hauptmann J., Sturzebercher J. Synthetic inhibitors of thrombin and factor Xa: from bench to bedside. // Thromb. Res. 1999. v.93. p.203-241.

34. Fareed J., Callas D.D., Hoppensteadt D., Jeske W., Walenga J.M. Recent developments in antithrombotic agents. // Exp. Opin. Invest. Drugs. 1995. v.4. p.389-412.

35. Callas D.D., Fareed J. Comparative pharmacology of site-directed antithrombin agents. Implication in drug development. // Thrombosis and Haemostasis. 1995. v.74. p.473-481.

36. Callas D.D., Iqbal O., Hoppensteadt D., Fareed J. Fibrinolytic compromise by synthetic and recombinant thrombin inhibitors: implications in the treatment of thrombotic disorders. // Clin. Appl. Thrombosis and Haemostasis. 1995. v.l. p.l 14-124.

37. Hauptmann J., Markwardt F. Pharmacologic aspects of the development of selective synthetic thrombin inhibitors as anticoagulants. // Seminars in thrombosis and haemostasis. 1992. v. 18. p.200-217. '

38. Bagdy D., Barabas E., Sebastyen I., Dioszegi M., Fittler Zs., Baiusz S., Szell E. Correlation between the anticoagulant and antiplatelet effect of D-Phe-Pro-Arg-H. //Thromb. Haemost. 1987. v.58. p.177-186.

39. Bagdy D., Barabas E., Szabo G., Bajusz S., Szell E. In vivo anticoagulant and antiplatelet effect of D-Phe-Pro-Arg-H and D-MePhe-Pro-Arg-H. // Thromb. Haemost. 1992. v.67. p.357-365.

40. Bajusz S., Barabas E., Szell E., Bagdy D. Inhibition of thrombin and trypsin by tripeptide aldehydes. // Int. J. Protein. Res. 1978. v. 12. p.217-221.

41. Bagdy D., Barabas E., Bajusz S., Szell E. In vitro inhibition of blood coagulation by tripeptide aldehydes a retrospective screening study focused on the stable D-MePhe-Pro-Arg-H*H2S04. // Thromb. Haemost. 1992. v.67. p.325-330.

42. Bajusz S. Interaction of trypsin-like enzymes with small inhibitors. // Symposia Biologica Hungarica. 1984. v.25. p.277-295.

43. Kettner C., Shaw E. D-Phe-Pro-ArgCH2Cl a selective affinity label for thrombin. // Thromb. Res. 1979. v. 14. p.969-973.

44. Lijnen H.R., Uyterhoeven M., Collen D. Inhibition of trypsin-like serine proteinases by tripeptide arginyl and lysyl chloromethylketones. // Thromb. Res. 1984. v.34. p.431-437.

45. Hauptmann J., Markwardt F. Studies on the coagulant and antithrombotic action of an irreversible thrombin inhibitor. // Thromb. Res. 1980. v.20. p.347-351.

46. Collen D., Matsuo O., Stassen J.M., Kettner C., Shaw E. In vitro studies of a synthetic inhibitor of thrombin. // J. Lab. Clin. Med. 1982. v.99. p.76-83.

47. Stuber W., Kosina H., Heinburger N. Synthesis of a tripeptide with a C-terminal nitrile moiety and the inhibition of proteinases. // Int. J. Pept. Protein Res. 1988. v.31. p.63-70.

48. Neises B., Tarnus C. Trombin inhibition by the tripeptide trifluoromethylketone D-Phe-Pro-ArgCH2CF3 (MDL73756). // Thromb. Haemost. 1991. v.65. p. 1290.

49. Cheng L., Scully M.F., Goodwin C.A. Peptide a-aminophophonic acids: a new type of thrombin inhibitor. // Thromb. Haemost. 1991. v.65. p. 1289.

50. Kettner C., Mesinger L., Knabb R. The selective inhibition of thrombin by peptides of boroarginine. //J. Biol. Chem. 1990. v.265. p. 18289-18297.

51. Cacciola J., Fevig J.M., Alexander R.S., Brittelli D.R. Synthesis of conformationally-restricted boropeptide thrombin inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. v.6. p.301-306.

52. Tapparelli C., Metternich R., Ehrhardt C., Claeson G., Scully M.F., Stone S.R. In vivo and in vitro characterization of a neutral boron-containing thrombin inhibitor. // J. Biol. Chem. 1993. v.268. p.4734-4731.

53. Wienand A., Ehrhardt C., Metternich R., Tapparelli C. Design, synthesis and biological evaluation of selective boron-containing thrombin inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. 1999. v.7. p. 1295-1307.

54. Hijikata-Okonomiya A., Okamoto S. A strategy for a rational approach to design synthetic selective inhibitors. // Seminars in thrombosis and haemostasis. 1992. v.18. p.135-149.

55. Morishita K., Iwamoto M. Synergistic antithrombotic effects of argatroban and ticlopidine in the rat venous thrombosis model a small-molecule, direct thrombin inhibitor. //Thromb. Res. 1998. v.92. p.261-266.

56. Sakai M., Ohteki H., Narita I., Naitoh K., Natsuaki M., Itoh T. Argatroban as a potential anticoagulant in cardiopulmonary bypass studies in a dog model. // Cardiovascular Surgery. 1999. v.7. p. 187-194.

57. Markwardt F., Wagner G., Sturzebercher J., Walsmann P. Na-arylsulfonyl-o)-(4-amidinophenyl)-a-aminoalkylcarboxylic amides novel selective inhibitors of thrombin. // Thromb. Res. 1980. v. 17. p.425-431.

58. Hauptmann J. Pharmacology of benzamidine-type thrombin inhibitors. // Folia Haemotol (Leipz.) 1982. v. 109. p. 118-123.

59. Sturzebercher J., Markwardt F., Voigt B., Wagner G., Walsmann P. Cyclic amides of Na-arylsulfonylaminoacylated 4-amidinophenylalanine tight binding inhibitors of thrombin. // Thromb. Haemost. 1983. v.29. p.635-642.

60. Claeson G., Gustavsson S., Mattsson C. New derivatives of p-guanidinophenylalanine as potent reversible inhibitors of thrombin. // Thromb. Haemost. 1983. v.50. p.53-58.109

61. Oweida S.W., Ku D.N., Lamsden A.B., Kam C.M., Powers J.C. In vivo determination of the anticoagulant effect of a substituted isocoumarin (ACITIC). //Thromb. Res. 1990. v.58. p.191-197.

62. Pizzo S.V., Turner A.D., Porter N.A., Gonias S.I. Evaluation of p-amidinophenyl esters as potential antithrombotic agents. Thromb. Haemost. 1986. v.56. p.387-390.

63. Ascenzi P., Gallina C., Bolognesi M. Thrombin inhibition by highly selective 'revercible suicide substrate' N-ethoxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-a-azalysine p-nitrophenyl ester. // Protein Pept. Lett. 2005. v.5. p.433-438.

64. Бумблите И.А.Ингибиторы плазмина. // Гематологическая трансфузиология. 1992. т.37. с.26-28.

65. Matsuzaki К., Matsui К., Tanoue Y., Nagano I., Haraguchi N., Tatewaki H. Antifibrinolytic therapy with tranexamic acid in cardiac operations. // Cardiovascular Surgery. 1999. v.7. p. 195-199.

66. Harpel P.C. Plasmin inhibitor interactions. The effectiveness of a2-plasmin inhibitor in the presence of a2-macroglobulin. // J. Exp. Med. 1977. v. 146. p. 1033-1040.

67. Lee K.N., Jackson K.W., Terzyan S., Christiansen V.J., McKee P.A. Using substrate specificity of antiplasmin-cleaving enzyme for fibroblast activation protein inhibitor design. // Biochemistry. 2009. v.23. p.5149-5158.

68. McConnell R.S., York J.L., Frizzel D., Ezzell C. Inhibition studies of some serine and thiol proteinases by new leupeptin analogues. // J. Med. Chem. 1993. v.36. p. 1084-1089.

69. Livingston D. In vitro and in vivo studies of ICE inhibitors. // J. Cell. Biochem. 1997. v.64. p. 19-26.

70. Thopmpson R.C. User of peptide aldehydes to generate transition state analogs of elastase. // Biochemistry. 1973. v. 12. p.47-51.

71. Dobson G., Wlodawer A. Catalytic triads and their relatives. // Trends. Biochem. Sci. 1998. v.23. p.347-352.

72. Степанов B.M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. // Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа. 1996. с.203-233.

73. Uoet D., Uoet J.G. Biochemistry. // New York. J. Wiley & Sons, Inc. 1995.

74. Potetinova J.V., Milgotina E.I., Makarov V.A., Voyushina T.L. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2001. v.3. p.141.

75. Потетинова Ж.В. Стратегия биокаталитического синтеза модифицированных пептидов ингибиторов протеиназ. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2000.

76. Lynas J.Р., Martin S.L., Walker В. Synthesis and kinetic evaluation of peptide a-keto-P-aldehyde-based inhibitors of trypsin-like proteases. // J. Pharm. Pharmacol. 2001. v.4. p.473-480.

77. Garrett G.S., McPhail S.J., Tornheim K., Correa P.E., Mclver J.M. Synthesis of potent and selective inhibitors of human plasma kallikrein. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. v.9. p.301-306.

78. Teno N., Wanaka K., Okada Y., Tsuda Y., Okamoto U., Hijikata-Okunomiya A., Naito T., Okamoto S. Development of center-directed inhibitors against plasmin. // Chem. Pharm. Bull. 1991. v.39. p.2340-2346.

79. Sanders T.C., Seto C.T. 4-heterocyclohexanone-based inhibitors of the serine proteinase plasmin. // J. Med. Chem. 1999. v.42. p.2969-2976.

80. Hovhannisyan N., Harutyunyan S., Hovhannisyan A., Hambardzumyan A., Chitchyan M., Melkumyan M., Oganezova G., Avetisyan N. The novel inhibitors of serine proteases. // Amino Acids. 2009. v.37. p.531-536.

81. Midura-Nawaczek K., Roszkowska-Jakimiec W., Lepieutsko I., Bruzgo I. Synthesis of benzylamides of dipeptides as potential inhibitors of plasmin. // Pharmazie. 2003. v. 10. p.687-689.

82. Markowska A., Midura-Nawaczek K., Bruzgo I. Low molecular peptides as potential inhibitors of plasmin. // Acta. Pol. Pharm. 2007. v.4. p.355-358.

83. Purwin M., Bruzgo I., Markowska A., Midura-Nawaczek K. Short peptides containing L-lysine and s-aminocaproic acid as potential plasmin inhibitors. // Pol. Pharmazie. 2009. v.l 1. p.765-767.

84. Wanaka K., Okamoto S., Horie N., Hijikata-Okonomiya A., Okamoto U., Naito T., Ohno N., Tsuda Y., Okada Y. Use of an active center-directed plasmin inhibitor elucidates the multiplicity of plasmin actions.

85. Nakamura K., Suzuki T., Hasegawa M., Kato Y., Sasaki H., Inouye K. Characterization of p-aminobenzamidine-based sorbent and its use forhigh-performance affmity-chromatography of trypsin-like proteases. // J. Chromat. A. 2003. v. 1009. p.133-139.

86. Lee E., Enomoto R., Takemura K., Tsuda Y., Okada Y. A selective plasmin inhibitor, trans-aminomethylcyclohexanecarbonyl-L-(0-picolyl)tyrosine-octylamide (YO-2), induces thymocyte apoptosis. // Biochem. Pharmacol. 2002. v.7. p.1315-1323.

87. Szende B., Okada Y., Tsuda Y., Horvath A., Bokonyi G., Okamoto S., Wanaka K., Keri G. A novel plasmin-inhibitor inhibits the growth of human tumor xenografts and decreases metastasis number. // In Vivo. 2010. v.5. p.281-286.

88. Okada Y., Tsuda Y., Tada M., Wanaka K., Hijikata-Okonomiya A., Okamoto U., Okamoto S. Development of plasma kallikrein selective inhibitors. // Biopolymers. 1999. v.51. p.41-50.

89. A. Differences in substrate and inhibitor sequence specificity of human, mouse and rat tissue kallikreins. // J. Biochem. 2004. v.380. p.775-781.

90. Мильготина E. И. Синтез хромогенных субстратов и ингибитора глутамилэндопептидаз с использованием субтилизина. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2001.

91. Потетинова Ж. В. Стратегия биокаталитического синтеза модифицированных пептидов ингибиторов протеиназ. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2000.

92. Reetz М. Т. S Synthesis and diastereoselective reactions of N,N-dibenzylamino aldehydes and related compounds. // Chem. Rev. 1999. v.99. p.l 121-1162.

93. McConnell R., Barnes G., Hyong C., Gunn M. Improved solid phase synthesis of C-terminal peptide aldehydes. // J. Med. Chem. 1990. v.33. p.86

94. Rooseboom M., Commandeur J. N. M., Vermeulen N. P. E. Enzyme-catalyzed activation of anticancer prodrugs. // Pharm. Rev. 2004. v.56. p.53-102.

95. Potetinova J. V., Voyushina T. L., Stepanov V. M. Enzymatic synthesis of peptidyl amino alcohols and peptidyl amino aldehydes-serine proteinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. v.7. p.705-710.

96. Voyushina T. L., Potetinova J. V., Milgotina E. I., Stepanov V. M. Synthesis of peptide aldehydes via enzymatic acylation of amino aldehyde derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. v.7. p.2953-2959.

97. Schulze A., Giannis A. IBX-mediated conversion of primary alcohols and aldehydes to N-hydroxysuccinimide esters. // Adv. Synth. Catal. 2004. v.346. p.252-256.

98. Myers A.G., Zhong B. Movassagi M., Kung D. W. Synthesis of highly epimerizable N-protected a-amino aldehydes of high enantiomeric excess. // Tetrahedron Lett. 2000. v.41. p. 13 59

99. Saeed A., Ashraf Z. Sodium borohydride reduction of aromatic carboxylic acids via methyl esters.//J. Chem. Sci. 2006. v. 118. p.419-423.

100. Dale D. J., Dunn P. J., Golightly C., Hughes M. L., Levett P. C., Pearce A. K., Searle P. M., Ward G., Wood A. S. The chemical development of the commercial route to sildenafil: a case history. // Org. Proc. Res. Dev. 2000. v.4. p. 17-22.

101. Couladouros E. A., Moutsos V. I. A general synthetic route towards bastadins. Part 2: Synthesis of the western part of bastadins 4-16, and fully functionalized macrocycle of bastadin 12. // Tetrahedron Lett. 1999. v.40. p.7027-7030.

102. Shioiri T., Sasaki S., Hamada Y. Synthetic approach to microsclerodermins: construction of three building blocks. // ARKIVOC. 2003. ii. p.103-122.

103. Livingston D. In vitro and in vivo studies of ICE inhibitors. // J. Cell. Biochem. 1997. v.64. p. 19-26.

104. Reichert D., Kutscher B., Bang H., Brune K., Quinkert G., Schaible H.G. Specific immunophilin ligands as antiasthmatics and immunosuppressants. // Patent US 6258815B 1. 2001.

105. Benedetti F., Berti F., Miertus S., Romeo D., Schillani F., Tossi A. Design, synthesis and preliminary evaluation of peptidomimetic inhibitors of FIIV aspartic protease with an epoxyalcohol core. // ARKIVOC. 2003. xiv. 140-154.

106. Sergeev M. E., Pronin V. B., Voyushina T. L. Procedure for the oxidation of (3-amino alcohols to a-aminoaldehydes. // Synlett. 2005. v. 18. p.2802-2804.

107. Kinugi S., Kobayashi I., Takano K., Murakami I. Effect of pressure on subtilisin catalysis: hydrolysis and peptide synthesis. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1996. v.69. p.3375-3380.

108. Kim J., Dordick J.S. Pressure affects enzyme function in organic media. // Biotech. Bioeng. 1993. v.42. p.772-776.

109. Lopez-Garcia M., Alfonso I., Gotor V. Chemoenzymatic approach to a (R)-3,4-diaminobutanoic acid derivative with a suitable orthogonal protection for solid phase peptide synthesis. // Lett. Org. Chem. 2004. v. 1. p.254-256.

110. Белозерская Г. Г., Воюшина Т. Л., Макаров В. А., Неведрова О. Е., Сергеев М. Е., Сергеева О. А. Синтетические производные пептидов. // Патент РФ 2 341 532 С2. 2008.

111. Favaudon V. Radiation-induced crosslinking between poly(deoxyadenylic-deoxythymidylic acid) and tripeptides containing aromatic residues . // Int. J. Radiat. Biol. 1989. v.55. p.353-364.

112. Harrison J. G., Balasubramanian S. Synthesis and hybridization analysis of a small library of peptide-oligonucleotide conjugates. // Nucleic Acids Res. 1998. v.26. p.3136

113. Debethune L., Kohlhagen G., Grandas A., Pommier Y. Processing of nucleopeptides mimicking the topoisomerase I-DNA covalent complex by tyrosyl-DNA phosphodiesterase. // Nucleic Acids Res. 2002. v.30. p. 1198-1204.

114. Chaloin L., Vidal P., Lory P., Mery J., Lautredou N., Divita J., Heitz F. Design of carrier peptide oligonucleotide conjugate with rapid membranetranslocation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. v.243. p.601-608.

115. Juliano R. L. Peptide-oligonucleotide conjugates for the delivery of antisense and siRNA. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. v.7. p. 132-136.

116. Marchan V., Grandas A. Synthesis of peptide oligonucleotide conjugates by Diels-Alder cycloaddition in water. // Curr. Protoc. Nucleic Acids Chem. 2007. v.4. p.4.32.

117. Arar K., Aubertin A. M., Roche A. C., Monsigny M., Mayer R. Synthesis and antiviral activity of peptide-oligonucleotide conjugates prepared by using N"-(bromoacetyl)peptides. // Bioconjug. Chem. 1995. v.6. p.573-577.

118. Danieli B., Peri F., Roda G., Carrea G., Riva S. On the regioselectivity of the protease subtilisin towards the acylation of enantiomeric pairs of benzyl and naphthyl glycopyranosides. // Tetrahedron. 1999. v.55. p.2045-2060.

119. Maruyama T., Nagasawa S. I., Goto M. Enzymatic synthesis of sugar amino acid esters in organic solvents. // J. Biosci. Bioeng. 2002. v.94. p.357-361.

120. Liu C. F., Tarn J. P. Subtilisin-catalyzed synthesis of amino acid and peptide esters. Application in a two-step enzymatic ligation strategy. // Org. Lett. 2001. v.3. p.4157-4159.