Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Бачева, Анна Владимировна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
2002 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей»
 
 
Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Бачева, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОВАЛЕНТНО ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Характеристика ферментов, иммобилизованных на носителях с использованием диалъдегидов.

1.2. Свойства сериновых протеиназ, иммобилизованных на эпокси-содержащих носителях.

1.3. Иммобилизация сериновых протеиназ с использованием карбодиимидов и свойства полученных биокатализаторов.

1.4. Иммобилизация сериновых протеиназ на носителях, активированных другими методами.

1.5. Сравнительная характеристика свойств сериновых протеиназ, иммобилизованных различными способами.

1.6. Сайт-специфическая иммобилизация сериновых протеиназ.

1.7. Получение и свойства биокомпозитов.

1.8. Поведение иммобилизованных ферментов средах, содержащих органические растворители.

 
Введение диссертация по химии, на тему "Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей"

В последние годы, наряду с химическими, интенсивно развиваются ферментативные методы синтеза соединений пептидной природы под действием протеиназ, в частности субтилизинов. Распространенность, доступность, широкая субстратная специфичность делают субтилизины весьма привлекательными для катализа реакций пептидообразования. Особый интерес представляет проведение реакций ферментативного синтеза в нетрадиционных для функционирования ферментов средах. В органической среде уменьшается риск протекания побочных процессов гидролиза, а также снимаются ограничения, связанные с низкой растворимостью гидрофобных субстратов. С этой точки зрения использование протеиназ в органической среде для синтеза различных пептидов представляется весьма перспективным.

Исследование функциональных особенностей поведения протеиназ в системах органических растворителей с низким содержанием воды является необходимым элементом изучения "неводного" биокатализа. Традиционный подход контроля ферментативной активности протеолитических ферментов, основанный на измерении скорости гидролиза специфических субстратов, в безводных средах практически невозможен. Одним из способов адекватной оценки состояния протеиназ может быть изучение их "сингетазной" активности в реакциях пептидообразования. В связи с этим актуальной задачей является изучение каталитической эффективности ферментов в системах с высоким содержанием органических растворителей с целью разработки подходов для использования и адаптации биокатализаторов к условиям функционирования в таких средах.

Пслыо работы являлось изучение биокаталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей. Задачи исследования включали:

Сравнительное изучение гидролитической активности и стабильности нативного субтилизина, его нековалентного комплекса с полиакриловой кислотой и фермента, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта, в средах различного состава.

Изучение синтетазной активности нативного и модифицированных субтилизинов в смесях полярных органических растворителей.

Разработку ферментативных методов получения пептидов, содержащих полифункциональные аминокислотные остатки, без защиты боковых ионогенных групп в органических растворителях.

 
Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

1. Получены и охарактеризованы нековалентный полиэлектролитный комплекс субтилизина с полиакриловой кислотой и препарат субтилизина 72, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта.

2. Установлено, что нативный и модифицированный субтилизины сохраняют активность в смесях, содержащих 30-70% ДМФ/ацетонитрил. При увеличении концентрации ДМФ до 90% наибольшей стабильностью обладает иммобилизованный субтилизин.

3. Изучена каталитическая эффективность нативного и модифицированных субтилизинов в реакции ферментативной пептидной конденсации в смесях органических растворителей с низким содержанием воды в зависимости от состава среды, времени реакции и концентрации биокатализатора. Установлено, что в смесях органических растворителей, содержащих более 80% ДМФ, синтетическая активность модифицированных субтилизинов выше, чем у нативного фермента.

4. Показана возможность многократного применения одного и того же образца иммобилизованного субтилизина в средах полярных органических растворителей, содержащих от 60 до 95 % ДМФ, как с промежуточной промывкой препарата буфером, так и без регидратации биокатализатора в течение нескольких циклов.

5. Обнаружено, что при ферментативном синтезе, катализируемом иммобилизованным субтилизином в среде полярных органических растворителей, возможно использование в качестве ацилирующего компонента N-ацилпептидов со свободной карбоксильной группой. В присутствии иммобилизованного фермента с выходами 70 - 98 % в среде ДМФ-ацетонитрил без активации карбоксильного компонента и защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот получена серия п-нитроанилидов тетрапептидов, содержащих основные и кислые аминокислотные остатки.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен руководителям работы И.Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за постоянное внимание, огромную моральную поддержку, помощь в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении результатов, и особенно в написании данной работы. Автор выражает глубокую благодарность В.И. Лозинскому за ценные идеи, послужившие основой экспериментов с иммобилизованным субтилизином, критическое обсуждение проводимых исследований и содействие в написании работы. Автор чрезвычайно признателен А.К. Гладилину за неоценимую помощь, интересные предложения и практические советы, а также научные дискуссии при проведении кинетических экспериментов и при подготовке работы. Автор особенно благодарен Е.С. Оксенойт за синтез исходных пептидов. Огромную помощь в изучении полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л.А. Баратова, Н. Федорова и А.Л. Ксенофонтов. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность О.В. Байбак и Ф.М. Плиевой за получение препаратов иммобилизованных ферментов, И.В. Гетун за помощь в поиске литературы и масс-спектрометрическом анализе, A.B. Беляевой за проведение некоторых экспериментов, а также всем сотрудникам лаборатории за внимание и полезные советы.

1.9. Заключение.

Таким образом, из литературных данных следует, что иммобилизация является широко используемым методом стабилизации сериновых протеиназ по отношению к различным инактивирующим воздействиям. Ферментативная активность иммобилизованных протеиназ в большинстве случаев ниже, чем у нативных ферментов [134]. Это связано как с ограничением доступности активного центра, так и инактивации во время самого процесса образования ковалентных связей биокатализаторов с матрицей. На каталитические свойства иммобилизованных ферментов большое влияние оказывают свойства и природа носителя. Весьма важны такие параметры матрицы, как возможность образования многоточечных контактов, заряд поверхности, гидрофильность и пористость. Самыми удачными с точки зрения сохранения ферментативной активности иммобилизованных протеиназ являются гидрофильные макропористые подло лжи.

В подавляющем большинстве работ приводятся данные по свойствам иммобилизованных биокатализаторов в водных средах. Круг исследований, посвященных изучению поведения иммобилизованных ферментов в присутствии органических растворителей, очень незначителен. Установлено, что иммобилизованные сериновые протеиназы обладают достаточно высокой активностью и стабильностью в смесях с низким содержанием воды. Синтетазная активность иммобилизованных протеиназ в таких средах исследована на ограниченном числе реакций этерификации (переэтерификации) производных аминокислот и синтеза модельных ди- и трипептидов. Данные по синтезу гидрофобных протяженных пептидов в литературе отсутствуют.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Комплекс невалентных взаимодействий, поддерживающих трехмерную структуру белков, в значительной степени определяется свойствами среды, окружающей макромолекулы. При изменении полярности и гидрофильности окружения молекулы фермента, например, в органических растворителях, баланс взаимодействий, среди которых основными являются гидрофобные и электростатические, нарушается. В результате этого гидрофобные взаимодействия в структуре фермента ослабевают, электростатические усиливаются, что может приводить к разворачиванию белковой глобулы. Результатом увеличения силы межмолекулярных взаимодействий может быть агрегация, а в случае протеолитических ферментов - ускорение реакции автолиза [135-137]. При умеренном содержании большинства полярных органических растворителей образуются гомогенные истинные растворы ферментов, а каталитическая активность остается неизменной вплоть до некоторой критической концентрации растворителя [134]. Инактивация при дальнейшем увеличении доли органической компоненты в системе носит пороговый характер. Однако при низком содержании воды в смеси белок существует уже не в виде раствора, а в виде суспензии [138, 139]. В последние годы показано, что многие ферменты могут использоваться как катализаторы в средах с низким содержанием воды. Низкая активность ферментов в водно-органических средах с высоким содержанием органической компоненты по сравнению с безводной обусловлена именно присутствием воды, которая действует как молекулярная "смазка", усиливая конформационную подвижность белковой глобулы и облегчая денатурацию [140]. Для адаптации ферментов к условиям функционирования в среде органических растворителей и повышения их стабильности используются различные методы: химическая модификация [141, 142], сайт-направленный мутагенез для гидрофобизации и стабилизации белковой глобулы [143-147], получение сшитых кристаллов [148, 149], варьирование состава и рН буфера, из которого лиофилизуют фермент [150, 151], получение нековалентных комплексов ферментов с детергентами или полиэлектролитами [152-155], ковалентная и нековалентная иммобилизация на различных сорбентах [156-158]. Исследования стабильности и активности ферментов проводились чаще всего на примерах катализа реакций гидролиза специфических пептидных субстратов [143-147, 159-161].

Целью данной работы являлось изучение биокаталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей.

В первой части работы был получен комплекс субтилизина с полиакриловой кислотой и изучены его характеристики, в том числе стабильность в водных средах, а также охарактеризованы препараты субтилизина, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта.

Во второй части работы исследовалось поведение нативного и модифицированного субтилизина в смесях органических растворителей с низким содержанием воды в реакциях пептидного синтеза.

Субтилизин 72 - внутриклеточная щелочная сериновая протеиназа [1-6, 148, 162], продуцируемая микроорганизмом Bacillus subtilis, штамм 72. Фермент впервые был получен в высокоочищенном состоянии в 1979 г. в нашей стране. N-концевая последовательность субтилизина 72 (до 35 шага) оказалась схожей, за исключением двух позиций, с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг, продуцируемого Bacillus licheniformis. Высокая степень гомологии позволяет сделать предположение, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен по свойствам субтилизину Карлсберг [163]. Субтилизин - распространенный, доступный фермент, обладающий широкой субстратной специфичностью и катализирующий разнообразные реакции образования пептидной связи и этерификации [157, 164-170].

2.1. Получение и характеристики комплекса ПАК-субтшизин

Ранее в нашей лаборатории был получен нековалентный комплекс субтилизина с додецилсульфатом натрия (SDS-субтилизин). Фермент в составе такого комплекса обладал высокой стабильностью и активностью в средах полярных органических растворителей с низким содержанием воды [154, 155]. В данной работе мы исследовали другой способ нековалентной модификации субтилизина для адаптации его к функционированию в органических растворителях - образование комплекса фермента с полиэлектролитами [152, 171-174]. Белок-полиэлектролитные комплексы образуются в водных растворах за счет электростатических взаимодействий между противоположно заряженными группами белка и полиэлектролита (рис. 21). Согласно литературным данным [175-179], такие комплексы обладают высокой прочностью в водных растворах за счет многоточечного кооперативного взаимодействия. Состав и свойства белок-полиэлектролитных комплексов зависят от таких параметров как pH, ионная сила, количество и плотность заряда поверхности белка а также цепи заряженного полимера и степени полимеризации полиэлектролита [175, 177, 180-183].

Ферменты, связанные в комплекс с полиэлектролитом, приобретают высокую стабильность в водном растворе во всем диапазоне рН, в котором существует комплекс [184]. Возможным объяснением этого эффекта является то, что фермент является высокомолекулярным соединением, а наличие оболочки из одноименных зарядов на молекулах фермента препятствует взаимодействию частиц образующегося комплекса между собой в результате электростатического отталкивания.

Комплексы белок-полиэлектролит устойчивы и в различных смесях органических растворителей. Это связано с тем, что в органической среде, диэлектрическая проницаемость которой ниже, чем водной, электростатические взаимодействия между полиионом и белком усиливаются. Ферменты в составе полиэлектролитного комплекса в водно-органических смесях характеризуются большей стабильностью по сравнению с нативными по двум причинам: Во-первых, за счет многоточечного взаимодействия происходит фиксация нативной конформации фермента; Во-вторых, заряженные звенья полииона препятствуют взаимодействию белковых молекул друг с другом и защищают от агрегации.

Нами было исследовано образование комплекса субтилизина 72 с полианионом -полиакриловой кислотой (ПАК) (рис. 22) в условиях, описанных для аналогичного комплекса с а-химотрипсином [173].

CH2-ÇH соон

М.М =240 ООО г/моль п

Рис.22. Полиакриловая кислота

Комплекс образовывался сразу после сливания водных растворов фермента и полиакриловой кислоты при комнатной температуре. Соотношение ПАК/субтилизин составляло 0.14 моль/моль, что примерно соответствовало 10-кратному превышению числа отрицательных зарядов полиакриловой кислоты по отношению к количеству аминогрупп субтилизина (в состав молекулы субтилизина 72 входит 9 Lys, и 4 Arg -остатков основных аминокислот, с которыми возможно взаимодействие). Необходимо отметить, что, поскольку ПАК - кислота, то при ее растворении в 0.05М Трис-НС1 буфере значение pH снижалось с 8.4 до 5.25.

УФ-спектр полученного комплекса ПАК-субтилизин в водном буфере (рис.23) аналогичен спектру нативного субтилизина (на рисунке не показан).

250 зса 350 il I I ' l t I ! I I ! I I

------ ь. .—.

-!-!--»— - ~ -, г:: ; - ::: V г -1- -f--—r Г". -1 p= ------ -------- — - ------------- ----

42 -40 38 , 30, 34 j M ' 30 28

Рис. 23. УФ-спектр раствора комплекса ПАК-субтилизин в 0.05 M Трис-HCl буфере, рН 8.2.

Нами были определены кинетические константы нативного субтилизина и комплекса ПАК-субтилизин по гидролизу 01р-А1а-А1а-Ьеи-рКА в 0.05 М Трис-НС1 буфере, рН 8.2, содержащем 1.5 мМ СаСЬ (табл. 9).

 
Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Бачева, Анна Владимировна, Москва

1. Степанов В. М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. А. С. Спирина. Москва. Высшая школа. 1996. с. 220-233.

2. Антонов В. К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С. 135-147.

3. Kraut J. Serine proteases: strucrure and mehanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977. V.46 P. 331-338.

4. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорг. химия. 1994. Т.20 С. 475-484.

5. Voet D. Voet J. G. Biochemistry. П. New York. Wiley. 2nd ed. 1995. p. 397-399.

6. Siezen R. J., Leunissen J. A. M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6 P. 501-523.

7. Bachovchin W. W. 15N NMR Spectroscopy of hydrogen-bonding interaction in the active site of serine proteases: evidence for a moving histidine mechanism. // Biochemistry. 1986. V.25 P. 7751-7759.

8. Березин И. В., Клесов А. А., Швядас В. К., Угарова Н. Н., Варфоломеев С. Д., Ярополов А. И., Казанская Н. Ф., Егоров А. М. Биотехнология. // Инженерная энзимология. Москва. Высшая школа. 1987.

9. Adlercreutz P., Clapes P. Mattiasson В. Enzymatic peptide synthesis in organic media. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. V.613 P. 517-520.

10. Adlercreutz P., Mattiasson В., Otamiri M. Synthetic polymers as solubilizing vehicles for enzymes in water-poor media. // Bioorg Med Chem. 1994. V.2 P. 529-533.

11. Березин И. В.Мартинек К. М. Химическая энзимология. // Москва. Издательство Московского Университета. 1983.

12. Березин И. В., Мартинек К. М., Антонов В. К. Иммобилизованные ферменты. // Москва. Издательство Московского Университета. 1976. Т. 1.

13. Березин И. В., Клячко Н. Л., Левашов А. В., Мартинек К. М., Можаев В. В., Хмельницкий Ю. Л. Иммобилизованные ферменты. // Биотехнология. Москва. Высшая школа. 1987.

14. Isgrove F. Н., Williams R. J., Niven G. W., Andrews A. T. Enzyme immobilization on nylon-optimization and the steps used to prevent enzyme leakage from the support. // Enzyme Microb. Technol. 2001. V.28 P. 225-232.

15. Kise H., Hayakawa A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1991. V.13 P. 584-588.

16. Chae H. J., In M. J., Kim E. Y. Optimization of protease immobilization by covalent binding using glutaraldehyde. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V.73 P. 195-204.

17. Bachinski N., Panek A. D.Paiva C. L. Nylon-6 cylinders and a sponge-like derivative as supports for immobilizing trypsin. // Braz J Med Biol Res. 1994. V.27 P. 1507-16.

18. Лозинский В. И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Успехи Химии. 1998. Т.67 с. 641 -655.

19. Lozinsky V. I., Plieva F. М. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. // Enz. Microb. Technol. 1998. V.23 P. 227-242.

20. Trzmiel Т., Galas E., Fortak M. Investigations of subtilisin (Novo type) immobilization on cellulose by means of various methods of support activation. // Acta Biotechnol. 1994. V.14P. 205-209.

21. Trzmiel Т., Fortak M., Galas E. The properties of subtilisin, Novo type, immobilized on porous glass. // Acta Biotechnol. 1995. V.15 P. 123-129.

22. Krogh T. N., Berg Т., Hojrup P. Protein analysis using enzymes immobilized to paramagnetic beads. //Analytical Biochemistry. 1999. V.274 P. 153-162.

23. Parrado J.Bautista J. Immobilization-Stabilization of Kerase, a Serine Protease from Streptomyces fradiae, by Covalent Attachment to Porous Glass. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V.59 P. 906-907.

24. Wang P., Dai S., Waezsada S. D., Tsao A. Y., Davison В. H. Enzyme stabilization by covalent binding in nanoporous sol-gel glass for nonaqueous biocatalysis. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.74 P.249-255.

25. Puleo D. A. Biochemical surface modification of Co-Cr-Mo. // Biomaterials. 1996. V.17 P.217-222.

26. Mikulec L. J., Puleo D. A. Use of p-nitrophenyl chloroformate chemistry to immobilize protein on orthopedic biomaterials. // J Biomed Mater Res. 1996. V.32 P. 203-208.

27. Holt L. J., Puleo D. A. Stability of trypsin immobilized on inorganic orthopedic biomaterials. //Art if Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1996. V.24 P. 613-620.

28. Chellapandian M. Preparation and characterization of alkaline protease immobilized on vermiculite. // Process Biochem. 1998. V.33 P. 169-173.

29. Tanksale A., Chandra P. M., Rao M., Deshpande V. Immobilization of alkaline protease from Conidiobolus macrosporus for reuse and improved thermal stability. // Biotechnol. Lett. 2001. V.23P. 51-54.

30. Ohmori T., Yang R. Y. Self-sustained pH oscillations in immobilized proteolytic enzyme systems. // Biophys Chem. 1996. V.59 P. 87-94.

31. Abdel-Naby M. A. Ismail A.-M. S., Ahmed S. A., Abdel F., Ahmed F. Production and immobilization of alkaline protease from Bacillus mycoides. // Bioresour. Technol. 1998. V.64P. 205-210.

32. Ge S.-J., Bai H., Zhang L.-X. Trypsin immobilization on shrimp chitin with formaldehyde and its application to continuous hydrolysis of casein. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V.24 P. 1-5.

33. Shmanai V. V., Bylina G. S. Protein immobilization on formylated polystyrene supports. // React. Funct. Polym. 2000. V.43 P. 243-251.

34. Guisan J. M., Bastida A., Cuesta C., Fernandez-Lafuente R., Rosell C. M. Immobilization-stabilization of a-chymotrypsin by covalent attachment to aldehyde-agarose gels.//Biotechnol. Bioeng. 1991. V.38P. 1144-1152.

35. Bryjak J.Kolarz B. N. Immobilization of trypsin on acrylic copolymers. // Process Biochem. 1998. V.33 P. 409-417.

36. Compagnone D., O'sullivan D., Guilbault G. G. Amperometric bienzymic sensor for aspartame. // Analyst. 1997. V. 122 P. 487-90.

37. Pyun J. C., Park J. S. Effective termination method for proteolytic reaction using trypsin immobilized on a PEI-cellulose TLC strip. // Biotechniques. 1995. V.19 P. 728-30.

38. Mateo C., Abian O., Fernandez-Lafuente R, .Guisan J. M. Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment. // Enzyme Microb. Technol. 2000. V.26 P. 509-515.

39. Yiu H. H. P., Wright P. A., Botting N. P. Enzyme immobilization using SBA-15 mesoporous molecular sieves with functionalized surfaces. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2001.V.15 P. 81-92.

40. Xiu G.-H., Jiang L., Li P. Mass-transfer limitations for immobilized enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemate in a batch reactor. // Ind. Eng. Chem. Res. 2000. V.39 P. 4054-4062.

41. Silva M. A. D., Gill M. H., Guiomar A. J., Martins C., Guthrie J. T. Immobilization of chymotrypsin onto hydrolyzed poly(ethylene)-g-co-hydroxyethyl methacrylate. // J. Appl. Polym. Sci. 1990. V.41 P. 1629-1639.

42. Bahar T., Tuncel A. Immobilization of trypsin onto newly produced poly(hydroxypropyl metharylate-co-metharylic acid) hydrogel beads. // Reactive and Functional Polymers. 2000. V.44 P. 71-78.

43. Malmsten M., Larsson A. Immobilization of trypsin on porous glycidyl methacrylate beads: effects of polymer hydrophilization. // Colloids Surf B Biointerfaces. 2000. V.18 P. 277-284.

44. Zacharieva E. I., Konstantinov C. I. Coated macroporous carriers with oxirane groups and their reactivity. // Biomaterials. 1993. V.l4 P. 953-7.

45. Lorenzen P. C., Schlimme E. Characterization of trypsin immobilized on oxirane-acrylic beads for obtaining phosphopeptides from casein. // Z Ernahrungswiss. 1995. V.34 P. 118-30.

46. Blanco R. M., Bastida A., Cuesta C., Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Rosell C. M., Guisan J. M. Immobilization-stabilization of proteases as a tool to improve the industrial design of peptide synthesis. // Biomed Biochim Acta. 1991. V.50 P. SI 10-3.

47. Hailing P. J. Biocatalysis in low-water media: understanding effects of reaction conditions. // Curr Opin Chem Biol. 2000. V.4 P. 74-80.

48. Kang E. T., Tan K. L., Kato K., Uyama Y., Ikada Y. Surface Modification and Functionalization of Polytetrafluoroethylene Films. // Macromolecules. 1996. V.29 P. 6872-6879.

49. Kang E. T., Neoh K. G., Tan K. L., Senn B. C., Pigram P. J., Liesegang J. Surface modification and functionalization of poly(tetrafluoroethylene) films via graft copolymerization. // Polym. Adv. Technol. 1997. V.8 P. 683-692.

50. Loh F. C., Tan K. L., Kang E. T., Kato K., Uyama Y., Ikada Y. XPS characterization of surface functionalized electroactive polymers.// Surf. Interface Anal. 1996. V.24 P.597-604.

51. Kang E. T., Neoh K. G., Tan K. L., Loh F. C. Surface modified and functionalized polyaniline and polypyrrole films. // Synth. Met. 1997. V.84 P. 59-60.

52. Kulik E. A., Kato K., Ivanchenko M. 1., Ikada Y. Trypsin immobilization on to polymer surface through grafted layer and its reaction with inhibitors. // Biomaterials. 1993. V.10 P. 763-769.

53. Shimomura M., Sugiyama N., Yamauchi T., Miyauchi S. Immobilization of enzymes on poly(acrylic acid)-attached magnetite particles. // Polym. J. (Tokyo). 1998. V.30 P. 350351.

54. Shimomura M., Ohta M., Sugiyama N., Oshima K., Yamauchi T., Miyauchi S. Properties of a-chymotrypsin covalently immobilized on poly(acrylic acid)-grafted magnetite particles. // Polym. J. (Tokyo). 1999. V.31 P. 274-278.

55. Kumar A., Gupta M. N. Immobilization of trypsin on an enteric polymer Eudragit S-100 for the biocatalysis of macromolecular substrate. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1998. V.5 P. 289-294.

56. Galaev I. Y., Mattiasson B. 'Smart' polymers and what they could do in biotechnology and medicine. // Trends Biotechnol. 1999. V.17 P. 335-40.

57. Oh Y., Shih I. I., Tzeng Y., Wang S. Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes. // Enzyme Microb Technol. 2000. V.27 P. 3-10.

58. Arasaratnam V., Galaev I. Y., Mattiasson B. Reversibly soluble biocatalyst: optimization of trypsin coupling to Eudragit S-100 and biocatalyst activity in soluble and precipitated forms. // Enzyme Microb. Technol. 2000. V.27 P. 254-263.

59. Kondo A., Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and their application to bioprocesses. // Colloids Surfaces A: Physiochemical and engineering Aspects. 1999. V. 153 P. 435-438.

60. Shiroya T., Tamura N., Yasui M., Fujimoto K., Kawaguchi H. Enzyme immobilization on thermosensitive hydrogel microspheres. // Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 1995. V.4 P. 267-274.

61. Sun Y., Jin X. H., Dong X. Y., Yu K., Zhou X. Z. Immobilized chymotrypsin on reversibly precipitable polymerized liposome. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. V.56 P. 331-339.

62. Koneracka M., Kopcansky P., Antalik M., Timko M., Ramchand C. N., Lobo D., Mehta R. V., Upadhyay R. V. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles. //J. Magn. Magn. Mater. 1999. V.201 P. 427-430.

63. Dogruel D., Williams P., Nelson R. W. Rapid tryptic mapping using enzymatically active mass spectrometer probe tips. // Anal. Chem. 1995. V.67 P. 4343-4348.

64. Chen J. P. R., Su D. Latex particles with thermo-flocculation and magnetic properties for immobilization of alpha-chymotrypsin. // Biotechnology Prog. 2001. V.17 P. 369-375.

65. Chen J. P., Hsu M. S. Preparations and properties of temperature-sensitive poly(N-isopropylacrylamide)-chymotrypsin conjugates. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 1997. V.2 P. 233-241.

66. Chen J.-P. Immobilization of a-chymotrypsin to a temperature-responsive reversibly soluble-insoluble oligomer based on N-isopropylacrylamide. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1998. V.73 P. 137-143.

67. Xie S., Svec F., Frechet J. M. Design of reactive porous polymer supports for high throughput bioreactors: poly(2-vinyl-4,4-dimethylazlactone-co-acrylamide- co-ethylene dimethacrylate) monoliths. // Biotechnol Bioeng. 1999. V.62 P. 30-35.

68. Ding L., Jiang Y., Huang L., Li Y., Huang J. New supports for enzyme immobilization based on copolymers of vinylene carbonate and acrylamide. // Appl Biochem Biotechnol. 2001. V.95P. 11-21.

69. Sagar S. L., Zanapolidou H. A., Domach M. M. Protein speciation and potential effects on membrane transport and immobilization illustrated by alpha-chymotrypsin. // Bioseparation. 1994. V.4 P. 175-82.

70. Goldstein L., Niv A. Isonitrile derivatives of polyacrylamide as supports for the immobilization of biomoiecules. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. V.42 P. 19-35.

71. Willner 1., Rubin S. Reversible photoregulation of the activities of proteins. // React. Polym. 1993. V.21 P. 177-186.

72. Willner I., Rubin S., Shatzmiller R., Zor T. Reversible light-stimulated activation and deactivation of a-chymotrypsin by its immobilization in photoisomerizable copolymers. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V.l 15 P. 8690-8694.

73. Gonchar A. M., Auslender V. L. Immobilization of bacterial proteases on water-solved polymer by means of electron beam. // Radiat. Phys. Chem. 1996. V.48 P. 795-797.

74. Huckel M., Wirth H. J. Hearn M. T. Porous zirconia: a new support material for enzyme immobilization. // J Biochem Biophys Methods. 1996. V.31 P. 165-79.

75. Marshall J. J., Rabinowitz M. L. Enzyme stabilization by covalent attachment of carbohydrate. // Arch Biochem Biophys. 1975. V.167 P. 777-9.

76. Fermi P., Biffi R., Conti V., Ramoni R., Grolli S., Accornero P., Bignetti E. Single turnover mechanism of a trypsin-reactor with high enzyme concentration. // J Biotechnol. 1998. V.60P. 81-95.

77. Martin M. T., Sinisterra J. V., Heras A. Influence of the modification procedure of support materials on the microenvironment of immobilized a-chymotrypsin. // J. Mol. Catal. 1993. V.80 P. 127-136.

78. Mohapatra S. C., Hsu J. T. Immobilization of a-chymotrypsin for use in batch and continuous reactors. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2000. V.75 P. 519-525.

79. Huang X. L., Catignani G. L., Swaisgood H. E. Comparison of the properties of trypsin immobilized on 2 Celite derivatives. // J Biotechnol. 1997. V.53 P. 21-7.

80. Val G. D., Swaisgood H. E., Horton H. R. Preparation and characterization of thionyl chloride-activated succinamidopropyl-glass as a covalent immobilization matrix. // J. Appl. Biochem. 1984. V.6 P. 240-250.

81. Janolino V. G., Swaisgood H. E. Analysis and optimization of methods using water-soluble carbodiimide for immobilization of biochemicals to porous glass. // Biotechnol. Bioeng. 1982. V.24P. 1069-1080.

82. Bonde M., Pontoppidan H., Pepper D. S. Direct dye binding—a quantitative assay for solid-phase immobilized protein. // Anal Biochem. 1992. V.200 P. 195-198.

83. Ford J. M., Chambers R. P., Cohen W. An active-site titration method for immobilized trypsin.//Biochem. Biophys. Acta. 1973. V.309 P. 175-180.

84. Clark D. S. Can immobilization be exploited to modify enzyme activity? // Trends Biotechnol. 1994. V.12 P. 439-43.

85. Turner D. C., Testoff M. A., Conrad D. W., Gaber B. P. Enzymatic Hydrolysis of a Chemisorbed Peptide Film Using Beads Activated with Covalently Bound Chymotrypsin. // Langmuir. 1997. V.13 P. 4855-4860.

86. Ganapathy R., Sarmadi M., Denes F. Immobilization of alpha-chymotrypsin on oxygen-RF-plasma functionalized PET and PP surfaces. // J Biomater Sci Polym Ed. 1998. V.9 P. 389-404.

87. Ganapathy R., Manolache S., Sarmadi M., Simonsick W. J. J., Denes F. Immobilization of active a-chymotrypsin on RF-plasma-functionalized polymer surfaces. // J. Appl. Polym. Sci. 2000. V.78 P. 1783-1796.

88. Martinez A. J., Manolache S., Gonzalez V., Young R. A., Denes F. Immobilized biomolecules on plasma functionalized cellophane. I. Covalently attached alpha-chymotrypsin. // J Biomater Sci Polym Ed. 2000. V.l 1 P. 415-438.

89. Tao G., Furusaki S. Synthesis of porous polymer carrier and immobilization of a-chymotrypsin. // Polym. J. (Tokyo). 1995. V.27 P. 111-121.

90. Leemputten E., Horisberger M. Immobilization of trypsin on partially oxidized cellulose. //Biotechnol. Bioeng. 1974. V.16 P. 997-1003.

91. Chen L., Tsao G. T. Chemical procedures for enzyme immobilization on porous cellulose beads. // Biotechnol. Bioeng. 1974. V.l9 P. 1463-1473.

92. Kay G., Lilly M. D. The chemical attachment of chymotrypsin to water-insoluble polymers using 2-amino-4,6-dichloro-s-triazine. // Biochem. Biophys. Acta. 1978. V.l98 P. 276-285.

93. Habeeb A. F. Preparation of enzymatically active, water insoluble derivates of trypsin. // Arch. Biochem. Biophys. 1967. V.l 19 P. 264-268.

94. Hailing P. J., Duhnil P. Magnetic supports for immobilized enzyme and bioaffinity adsorbents. // Enz. Microb. Technol. 1980. V.2 P. 2-10.

95. Bode W., Papamolcos E., Musil J. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c, an elastase inhibitor from the leech Hirudo medicinalis. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 166 P. 673-692.

96. Bryan P. N. Protein engineering of subtilisin. // Biochim Biophys Acta. 2000. V.1543 P. 203-222.

97. Березин И. В., Мартинек К. М., Антонов В. К. Иммобилизованные ферменты. // Москва. Изд-во Московского Университета. 1976. Т. 2.

98. Mansfeld J., Ulbrich-Hofmann R. Site-specific and random immobilization of thermolysin-like proteases reflected in the thermal inactivation kinetics. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V.32 P. 189-195.

99. Huang W., Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L. G. Improving the activity of immobilized subtilisin by site-specific attachment to surfaces. // Anal Chem. 1997. V.69 P. 4601-4607.

100. Vishwanath S., Bhattacharyya D., Huang W., Bachas L. G. Site-directed and random immobilization on functionalized membranes: kinetic studies and models. // J.Membr. Sci. 1995. V.108 P. 1-13.

101. Vishwanath S., Watson C. R., Huang W., Bachas L. G., Bhattacharyya D. Kinetic studies of site-specific and randomly immobilized alkaline phosphatase on functionalized membranes. // J.Chem.Technol.Biotechnol. 1997. V.68 P. 294-302.

102. Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L. G. Improving the activity of immobilized subtilisin by site-directed attachment through a genetically engineered affinity tag. // Fresenius J Anal Chem. 2001. V.369 P. 280-285.

103. Turkova J. Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function. // J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1999. V.722 P. 1131.

104. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 1): sol-gel encapsulated biologicals. // Trends Biotechnol. 2000. V.18 P. 282-96.

105. Tischer W., Kasche V. Immobilized enzymes: crystals or carriers? // Trends Biotechnol. 1999. V. 17 P. 326-35.

106. Hinze W. L., Uemasu I., Dai F., Braun J. M. Analytical and related applications of organogels. // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 1996. V.l P. 502-513.

107. Topchieva I. N., Efremova N. V. Conjugates of proteins with block co-polymers of ethylene and propylene oxides. // Biotechnol Genet Eng Rev. 1994. V.12 P. 357-82.

108. Wang P., Sergeeva M. V., Lim L., Dordick J. S. Biocatalytic plastics as active and stable materials for biotransformations. //Nat Biotechnol. 1997. V.15 P. 789-93.

109. Michels P. C., Khmelnitsky Y. L., Dordick J. S., Clark D. S. Combinatorial biocatalysis: a natural approach to drug discovery. // Trends Biotechnol. 1998. V.16 P. 210-215.

110. Dordick J. S., Khmelnitsky Y. L., Sergeeva M. V. The evolution of biotransformation technologies.//CurrOpin Microbiol. 1998. V.l P. 311-8.

111. Novick S. J., Dordick J. S. Preparation of active and stable biocatalytic hydrogels for use in selective transformations. // Chem. Mater. 1998. V.10 P. 955-958.

112. Novick S. J., Dordick J. S. Investigating the effects of polymer chemistry on activity of biocatalytic plastic materials. // Biotechnol. Bioeng. 2000. V.68 P. 665-671.

113. Yang Z., Mesiano A. J. Venkatasubramanian S., Gross S. H., Harris J. M., Russell A. J. Activity and Stability of Enzymes Incorporated into Acrylic Polymers. // J. Amer .Chem. Soc. 1995. V.l 17 P. 4843-4850.

114. Brummer W., Hennrich N., Klockow M., Lang H., Orth H. D. Preparation and properties of carrier-bound enzymes. // Eur J Biochem. 1972. V.25 P. 129-35.

115. Van Unen D. J., Engbersen J. F., Reinhoudt D. N. Sol-gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.75 P. 154-8.

116. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 2): non-sol-gel protein-polymer biocomposites. // Trends Biotechnol. 2000. V.18 P. 469-79.

117. Kim Y., Dordick J., Clark D. Siloxane-based biocatalytic films and paints for use as reactive coatings. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.72 P. 475-82.

118. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. On the importance of support material for bioorganic synthesis. // Eur. J. Biochem. 1988. V.172 P. 573-578.

119. Blanco R. M., Guisan J. M., Hailing P. J. Agarose-chymotrypsin as a catalyst for peptide and amino acid ester synthesis in organic media. // Biotechnol. Lett. 1989. V.ll P. 811816.

120. Narayan V. S., Klibanov A. M. Are water-immiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency? // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.41 P. 390-393.

121. Lozano P., Diego T. D., Belleville M. P., Rios G. M., Iborra J. L. A dynamic membrane reactor with immobilized chymotrypsin for continuous kyotorphin synthesis in organic media. // Biotechnology Letters. 2000. V.22 P. 771-775.

122. Blanco R. M., Rakels J. L., Guisan J. M., Hailing P. J. Effect of thermodynamic water activity on amino-acid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. // Biochim Biophys Acta. 1992. V.l 156 P. 67-70.

123. Ueno Y., Morihara K. The use of immobilized trypsin for semisynthesis of human insulin. //Biotechnol. Bioeng. 1989. V.33 P. 126-128.

124. Valivety R. H., Hailing P. J., Peilow A. D., Macrae A. R. Relation between water activity and catalytic activity of lipases in organic media. // Eur. J. Biochem. 1994. V.222 P. 461466.

125. Klibanov A. M. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. // Acc. Chem. Res. 1990. V.23 P. 114-120.

126. Griebenow K., Klibanov A. M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? // Biotech. Bioeng. 1997. V.53 P. 351 362.

127. Gorman L. S., Dordick J. S. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39 P. 392-397.

128. Wangikar P. P., Carmichael D., Clark D. S., Dordick J. S. Active-site titration of serine proteases in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50 P. 329-335.

129. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media: a comparative study of water-iniscible and water-immiscible solvent systems. // J. Biotechnol. 1990. V.15 P. 323-338.

130. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. Nucleophile specificity and medium engineering in a-chymotrypsin catalyzed reactions. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V.12 P. 376-386.

131. Klibanov A. M. Improving enzymes by using them in organic solvents. // Nature. 2001. V.409P. 241-246.

132. Ampon K., Salleh A. B., Teoh A., Yunus W. M. Z. V., Razak C. N. A., Basri M. Sugar esterification catalyzed by alkylated trypsin in dimethylformamide. // Biotechnol. Lett. 1991. V.13 P. 25-30.

133. Sakurai K., Kashimoto K., Kodera Y., Inada Y. Solid phase synthesis of peptides with polyethylene glycol-modified protease in organic solvents. // Biotechnol Lett. 1990. V.12 P. 685-688.

134. Wong C.-H. Enzymatic catalysts in organic synthesis. // Science. 1989. V.244 P. 1145-52.

135. Arnold F. H. Engineering enzymes for non-aqueous solvents. // Trends Biotechnol. 1990. V.8 P. 244-9.

136. Kidd R. D., Yennawar H. P., Sears P., Wong C.-H., Farber G. K. A Weak Calcium Binding Site in Subtilisin BPN' Has a Dramatic Effect on protein Stability. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118P. 1645-1650.

137. Wong C.-H. Engineering enzymes for chemoenzymatic synthesis. Part 2: Modifying proteases for peptide synthesis. // Trends Biotechnol. 1992. V.10 P. 378-81.

138. Haring D., Shreier P. Novel Biocatalysts by Chemical Modification of Known Enzymes: Cross-Linked Microcrystals of the Semisynthetic Peroxidase Seleno-Subtilisin Publication. //Angew. Chem. 1998. V.37 P. 2628 -2631.

139. Wang Y.-F., Yakovlevsky J. K., Zhang В., Margolin A. L. Cross-Linked Crystals of Subtilisin: Versatile Catalyst for Organic Synthesis. // J. Org. Chem. 1997. V.62 P. 34883495.

140. Sears P., Witte K., Wong C.-H. The effect of counterion, water concentration, and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999. V.6P. 297-304.

141. Schulze В., Klibanov A. M. Subtilisins in neat organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1991. V.38 P. 1001-1006.

142. Гладилин А. К., Левашов А. В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998. Т.63 С. 408-421.

143. Meyer J. D., Kendrick В. S., Matsuura J. E., Ruth J. A., Bryan P. N., Manning M. C. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. /V Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47 P. 177-181.

144. Getun I. V., Filippova 1. Y., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S. SDS-subtilisin catalyzed synthesis of tetra-peptides containing multifunctional amino acids in ethanol. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2001. V. 15 P. 105-110.

145. Gololobov M. Y., Stepanov V. M., Voyushina T. L., Morozova 1. P., Adlercreutz P. Side reactions in enzymatic peptide synthesis in organic media: effects of enzyme, solvent, and substrate concentrations. // Enzyme Microb Technol. 1994. V.6 P. 522-8.

146. Stepanov V. M., Terent'eva E. Y., Voyushina T. L., Gololobov M. Y. Subtilisin and a-chymotrypsin catalyzed synthesis of peptides containing arginine and lysine p-nitroanilides as c-terminal moietes. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V.3 P. 479-485.

147. Terent'eva E. Y., Voyushina T. L., Stepanov V. M. Enzymatic synthesis of YIGSR -Laminin pentapeptide i'ragment derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995. V.5 P. 2523-2526.

148. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X., Vulfson E. N. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production. // Enzyme Microb Technol. 1996. V.18 P. 16383.

149. Dordick J. S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1989. V.l 1 P. 194-211.

150. Dordick J. S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V.8 P. 259-267.

151. Kuhn P., Knapp M., Soltis S. M., Ganshaw G., Thoene M., Bott R. The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. // Biochemistry. 1998. V.37 P. 1344613452.

152. Акпаров В. X., Беляиова Jl. П., Баратова Л. А., Степанов В. М. Субтилизин 72-сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44 С. 886-891.

153. Stepanov V. M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68 P. 1335.

154. Воюшина Т. Л., Люблинская Л. А., Степанов В. М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорг. химия. 1985. T.l 1 с. 738-744.

155. Morihara К., Oka Т. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain, and pepsin. // J. Biochem. (Tokyo). 1981. V.89P. 385-390.

156. Gron H., Meldal M., Breddam К. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching.//Biochemistry. 1992. V.31 P. 6011-6018.

157. Vakurov A. V., Gladilin A. K., Levashov A. V., Khmelnitsky Y. L. Dry enzyme-polymer complexes: stable organosoluble biocatalysts for nonaqueous enzymology. // Biotechnology Letters. 1994. V.16P. 175-178.

158. Кабанов В. А., Мустафаев В. И. Влияние ионной силы и рН среды на поведение БСА с поли-4-винил-Ы-этилпиридинийбромидом в водных растворах. // ВМС. 1981. Т.23 С. 255-260.

159. Изумрудов В. А. Зезин А. Б., Кабанов В. А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами. // ДАН СССР. 1984. Т.275 С. 168-172

160. Изумрудов В. А., Зезип А. Б., Кабанов В. А. Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами. // ДАН СССР. 1984. Т.291 С. 1150-1154.

161. Изумрудов В. А., Марголин A. JI., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Свойства нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, содержащих фермент. // ДАН СССР. 1982. Т.269С. 15-22

162. Xia J., Dubin P. L., in Macromolecular complexes in Chemistry and Biology, P.L. Dubin, R.M. Davies, D.N. Schultz, C. Thies, Eds. 1994: Berlin, Heidelberg, p. 247-270.

163. Lawton J. В., Mekras С. I. The effect of polycations on the activity of pepsin. // J Pharm Pharmacol. 1985. V.37 P. 396-400.

164. Mekras С. I., Lawton J. В., Washington R. J. The interaction of papain with polycations. //J Pharm Pharmacol. 1989. V.41 P. 22-6.

165. Mekras С. I. Inhibition of pepsin by polyions and c.d. studies. // Int. J. Biol. Macromol. 1989. V.ll P. 207-215.

166. Mellgren R. L. Interaction of human erythrocyte multicatalytic proteinase with polycations. //Biochim Biophys Acta. 1990. V.1040 P. 28-34.

167. Колобанова С. В. Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 1999.

168. Mcphalen С. A., James М. N. G. Structural comparison of tow serin proteinase-protein inhibitor complexes: eglin-c-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo. // Biochemistry. 1988. V.27 P. 6582-6598.

169. Гололобов M., Морозова И. П., Воюшина Т. JI., Тимохина Е. А., Степанов В. М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56 С. 230239.

170. Лозинский В. И., Плиева Ф. М., Зубов А. Л. // Биотехнология. 1995 Т. С. 32-37.

171. Fitzpatrick P. A., Steinmetz А. С. U., Ringe D., Klibanov А. М. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90 P. 8653-8657.

172. Schmitke J. L., Stern L. J., Klibanov A. M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94 P. 4250-4255.

173. Schmitke J. L., Stem L. J., Klibanov A. M. Comparison of x-ray structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous acetonitrile and in water.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95 P. 12918-12923.

174. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Acyl transfer reactions catalyzed by native and modified a-chymotrypsin in acetonitrile with low water content. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.16P. 596-600.

175. Voyushina T. L., Potetinova J. V., Milgotina E. I., Stepanov V. M. Synthesis of peptide aldehydes via enzymatic acylation of amino aldehyde derivatives. // Bioorg Med Chem. 1999. V.7 P. 2953-9.

176. Milgotina E. I, Shcheglov A. S., Lapa G. B., Chestukhina G. G., Voyushina T. L. Enzymatic synthesis of chromogenic substrates for Glu,Asp-specific proteinases. // J Pept Res. 2001. V.58P. 12-6.

177. Klibanov A. M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends Biotechnol. 1997. V.15 P. 97-101.

178. Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53 P. 239-306.

179. Hailing P. J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.16 P. 178-206.

180. Barbas C. F., Matos J. R., West J. B., Wong C.-H. A search for peptide ligase: cosolvent-mediated conversion of proteases to esterases for irreversible synthesis of peptides. // J. Am. Chem. Soc. 1988. V.l 10 P. 5162-5166.

181. Shechter J., Berger A. Size of the active site in proteinases. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V.27P. 157-162.

182. Гетун И. В., Филиппова И., Лысогорская Е. Н., Колобанова С. В., Оксенойт Е. С., Анисимова В. В., Степанов В. М. Синтез три-и тетраиеитидов, катализируемый субтилизином в органических растворителях. // Биоорганическая Химия. 1998. Т.24 С. 306-312.

183. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // Москва. Мир. 1976.

184. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов. //Киев. Наукова Думка. 1992.

185. Filippova I. Yu., Lysogorskaya Е. N., Anisimova V. V., Suvorov L. I., Oksenoit E. S., Stepanov V. M. Fluorogenic peptide substrates for assay of aspartyl proteinases. // Anal. Biochem. 1996. V.234. P. 113-118.

186. Филиппова И., Лысогорская E. H., Оксенойт Е. С., Комаров Ю. Е., Степанов В. М. Флуоресцентные субстраты аспартильных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. Биоорг. химия. 1986. Т. 12 С. 1172-1180.

187. Патент РФ; А. С. // Бюллетень Изобрет. 1995. Т.15.

188. Люблинская Л. А., Хайду И., Баландина Г. Н., Филиппова И., Маркарян А. Н., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. и-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорг. химия. 1987. Т.13 С. 748-753.

189. Schonbaum G. R., Zerner В., Bender М. L. Mechanism of action of proteolytic enzymes. VIII. Spectrophotometric determination of the operational normality of an chymotrypsin solution. // J. Biol. Chem. 1961 P. 2930-2935.