Катализируемый субтилизином 72 пептидный синтез в органических растворителях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

гГБ ОД

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ м

- 2 .'.::;? Л

На правах рукописи УДК 577.152.3

ГЕТУН ИРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ СУБТИЛИЗИНОМ 72 ПЕПТИДНЫЙ СИНТЕЗ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

Специальность - 02.00.10 Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2000

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического Факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

чл. - корр. РАН,_

профессор В.М. Степанов I

кандидат химических наук, с.н.с. И.Ю. Филиппова

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор В. Швядас

доктор химических наук Л.Д. Румш

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится "25" мая 2000 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. Автореферат разослан "25" апреля 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

Eoii.su. и, о

г? au.?-Ч .0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время довольно широко ведутся исследования в >бласти так называемой "неводной энзимологии". Органические растворители обладают рядом 1реимуществ перед традиционной водной средой при проведении ферментативных реакций, >сновными из которых являются сдвиг термодинамического равновесия в сторону целевых 1родуктов и решение проблемы растворимости гидрофобных реагентов.

Изучение особенностей протекания неводного биокатализа существенно расширяет 1редставления о функциональных возможностях ферментов, об их устойчивости к различным ¡енатурирующим воздействиям. В связи с этим весьма актуальным является проведение 1сслед0ваний, направленных на изучение каталитической эффективности ферментов в средах с ¡ысоким содержанием органических растворителей.

Целью работы являлось изучение каталитических свойств нативного и аддифицированного субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия (ЗББ-:убтилизин) в реакциях образования пептидной связи в средах полярных органических >астворителей.

Новизна и практическая ценность работы. Изучено поведение субтилизина 72 в ряде яротонных органических растворителей. Показано, что субтилизин в виде суспензии в щетонитриле катализирует синтез п-нитроанилидов и амидов три-тетрапептидов с достаточно !Ысокими выходами. Исследовано влияние на ход синтеза количества добавленной воды в :истеме, временн реакции и концентрации фермента. Показано,' что увеличение концентрации фермента в реакционной смеси приводит к образованию продуктов двойного присоединения [уклеофила и соосаждению фермента с целевым соединением. Получен нековалентный :омплскс субтилизина 72 с додецилсульфатом натрия и изучены его растворимость и табильность в полярных органических растворителях. Впервые показана высокая 'ффективность субтилизина в комплексе с ЭБЭ для катализа образования пептидной связи в ааноле и изопропаноле. С помощью ЭОЗ-субтилизина с высокими выходами синтезирован ряд ри-гексапептидов различного состава, содержащих флуорогенные и хромогенные группировки. Троведена олигомеризация трипептида с получением нона- и додекапептидов. В реакциях, :атализируемых ЭЭЗ-субтилизином, продемонстрирована возможность использования в :ачестве ацилирующих соединений компонентов со свободными карбоксильными группами, готорые оказались не менее эффективными, чем их эфирные аналоги. На примере синтеза •етралептидов с ЗВБ-субтилизином впервые показана возможность создания пептидной связи

между полифункциональными аминокислотными остатками, не содержащими защитные группы в боковой цепи.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 1 находится в печати. Результаты работы были представлены на IV Симпозиуме "Химия протеолитичсских ферментов" (Москва, Россия, 1997), Международной конференции "Биокатализ - 98" (Пущино, Россия, 1998), 25 Европейском Пептидном Симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском Пептидном Симпозиуме "Peptides for the new millennium" (Миннеаполис, Миннесота, 1999).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,, обзора литературы, посвященного адаптации сериновых протеиназ к условиям функционирования в органических растворителях, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ссылок). Содержит/^- рисунков и Д"таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа состоит из двух частей:

1) изучения поведения нативного субтилизина 72, суспендированного в полярных органических растворителях в реакциях образования пептидной связи;

2) исследования свойств и биокаталитической активности комплекса SDS-субтилизин в реакциях ферментативного синтеза пептидов в средах полярных органических растворителей.

1.1. Изучение поведения нативного субтилизина в полярных органических растворителях.

Поведение нативного субтилизина 72 было исследовано в ряде полярных органических растворителей - ацетонитриле, диоксане, тетрагидрофуране, этаноле, наиболее подходящих для проведения пептидного синтеза. Лиофильно высушенный субтилизин вносили в органический растворитель, образующуюся суспензию перемешивали, центрифугировали, после чего определяли содержание и активность фермента в полученном супернатанте. В ацетонитриле и диоксане (рис. 1) субтилизин образовывал мелкодисперсную суспензию, а в тетрагидрофуране и в этаноле значительная часть фермента растворялась, причем спектры растворенного белка в органическом растворителе и в воде практически не отличались.

Сохранение субтилизином активности после инкубации его взвеси или раствора в диоксане, тетрагидрофуране и ацетонитриле определяли по способности фермента гидролизовать стандартный хромогенный субстрат - Z-Ala-Ala-LeuipN'A после разбавления пробы фермента большим объемом воды. Определенная таким образом удельная активность

Рнс. 1. УФ - спектры раствора субтшшзина в воде (7) и тетрагидрофуране (2) и суспензии в диоксане (3) и ацетонитриле (¥). Кривая (5) получена после повторного центрифугирования суспензии субтилизина в ацетонитриле при 4 °С.

оказалась наибольшей для субтилизина, находящегося в органическом растворителе в суспендированном состоянии и существенно снижалась при увеличении доли растворимого фермента. Активность фермента, выдержанного в ацетонитриле, была сопоставима с удельной активностью раствора субтилизина в воде, что свидетельствует об отсутствии денатурации в этих условиях. Значительная потеря активности наблюдалась при инкубации фермента в диоксане и практически полная - в тетрагидрофуране и этаноле (табл. 1).

Таблица 1. Активность субтилизина в органических растворителях

Растворитель А280 Удельная активность, ед/А28о

Ацетонитрил 0.02 6.9

Диоксан 0.35 0.72

Тетрагидрофуран 0.62 0.03

Этанол 0.2 0

Вода 0.25 7.5

После инкубации в течение 6 суток при 20 °С активность субтшшзина в ацетонитриле уменьшалась в 7 раз. В диоксане за 4.5 суток наблюдалось падение активности в 4 раза.

1.2. Изучение синтетических возможностей субтилизина, суспендированного в ацетонитрше.

1.2.1. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA.

Исходя из полученных данных по активности и стабильности субтилизина в органических растворителях, мы выбрали ацетонитрил для проведения пептидных синтезов.

В качестве модельной изучалась кинетически контролируемая реакция образования п-нитроанилида трипептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA, катализируемая субтилизином (схема 1).

Z-Ala-Ala-OH + Е

U +н2о

Z-Ala-Ala-ОСНз + Е-> Z-Ala-Ala-0-Е

4-î + H-Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA + Е Схема 1

Концентрация исходных соединений в реакционной смеси составляла 35 мМ, соотношение [S]/[E] = 10б:1. Фермент вносили в виде суспензии в безводном ацетонитриле. За ходом реакции следили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Через 2 суток выход Z-Ala-Aia-Leu-pNA составил 60% (рис. 2), затем наблюдалось медленное накопление продукта, и через 7 суток выход достиг 83%. В препаративном варианте выход этой реакции составил 70% (табл. 2).

сут

Рис. 2. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA, катализируемый суспензией субтилизина в безводном ацетонитриле ([S] =35 мМ, [Е] = 35 нМ, 2% ДМФА).

Проводя синтез в таких условиях, мы исследовали влияние воды на выход продукта реакции, добавляя в реакционную среду от 0 до 10 % воды. Наличие воды в системе уменьшало выход основного продукта и приводило к появлению г-А1а-А1а-ОН - продукта гидролиза карбоксильного компонента ( схема 1). Наибольший выход Z-Ala-Ala-Leu-pNA достигался при проведении реакции без добавления воды.

1.2.2. Синтез п-нитроанияидов тетрапептидов.

В безводном ацетонитриле, содержащем 22% диметилформамида, с помощью суспензии субтилизинз (отношение [8]/[Е] - 105:1), исходя из эфиров г-А1а-А1а-1,еи-ОСНэ или г-А1а-А1а-РЬе-ОСНз и п-нитроанилидов Ьси-рИА или РЪе-рМА, были синтезированы п-нитроанилиды тетрапептидов, приведенные в табл. 2.

Таблица 2. Синтез пептидов в безводном ацетонитриле, кат&тизируемый суспензией субтилизина

Ацилирующий Амино- Продукт [S]/[E] Время, Выход, %

компонент компонент сутки

Z-Ala-Ala-ОСНз H-Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA 106:1 7 78(70)*

Z-Aia-Ala-Leu-OCHj H-Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Leu-pNA 105:1 7 96(90)*

Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA 105:1 7 96(90)*

Z-Ala-Ala-Phe-ОСНз H-Leu-pNA Z-Aia-Ala-Phe-Leu-pNA 105:1 7 92

Z-AIa-Ala-Leu-ОСНз H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Phe-Phe-pNA 105:1 7 90

Z-Ala-Aia-OCHj H-Leu-pNA Z-Ala-Aia-Leu-pNA 103:1 5 77

Z-Ala-Ala-Leu-Leu-pNA 13

Z-Ala-Aia-ОСНз H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Phe-pNA 103:1 5 67

Z-Ala-Ala-Phe-Phe-pNA 33

Z-AIa-AIa-ОСНз H-Phe-NH2 Z-Ala-A!a- Phe-NH2 103:1 3 56

Z-Ala-Ala-Phe-Phe-NHz 41

" В скобках приведен препаративный выход пептида.

Синтезы тетрапептидов проходили заметно быстрее и с большими выходами по сравнению с синтезом модельного трипептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA (рис. 3). Это объясняется тем, что аминокислотный остаток в Pi - положении (Leu или Phe) в большей степени, чем Aia, соответствует специфичности субтилизина и, кроме того, в - положении находится гидрофобная бензилоксикарбонильная группа, способная встраиваться в S« • гидрофобный карман фермента. Уже через 2 суток содержание целевых пептидов превышало 80 %, а через б суток - 90 %.

10 сут

Рис. 3. Синтез 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рКА, катализируемый суспензией субтилизина в безводном ацетонитриле ([Б] = 15.7 мМ, [Б]/[Н] = 105:1, 22% ДМФА).

1.2.3. Влияние количества субтилизина на протекание реакций в ацетонитриле. Для оценки влияния количества субтилизина на протекание реакции в ацетонитриле, мы провели синтез амида и п-нитроанилидов трипептидов - 2-А1а-А1а-1,еи-рНА, Z-Ala-Ala-Phe-pNA и г-Ак-Ак-РЬе-ЫНг, увеличив содержание фермента в реакционной смеси на 3 порядка. Концентрация исходных веществ в синтезах п-нитроанилидов составила 50 мМ, в синтезе амида - 67 мМ, отношение [Э]/[Е] - 103:1. Возрастание содержания субтилизина привело к значительному ускорению реакции: очевидно, что в реакции участвует только поверхностный слой биокатализатора, и поэтому для ее ускорения необходимо большее количество фермента. Так, выход г-А1а-А1а-Ьеи-рНА уже через 7 ч составил 70% (рис. 4), тогда как при соотношении [Э]/[Е] в реакционной смеси 106:1 такой выход достигался только через 3 суток (рис. 2).

При увеличении времени реакции в этих условиях, наряду с основным, наблюдалось образование побочного продукта, содержащего два остатка лейцина, - Z-Ala-Ala-Leu-Leu-pNA (схема 2, рис. 4).

г-А1а-А1а-1еи-ОН + Е

Т4- +Н20

2-А1а-А1а-1.еи-рЫА + Е->• г-А1а-А1а-Ьеи-0-Е + рЫА

¿Т + Н-Ьеи-рИА г-А1а-А1а-Ьеи-Ьеи-рКА + Е

Схема 2

б

сут

Рис. 4. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA, катализируемый суспензией субтилизина в ацетонитриле при соотношении [8]/[Е]=103:1 ([Э] = 50 мМ, 4 % ДМФА).

Выход продукта повторного присоединения нуклеофила в проведенных синтезах уменьшался в ряду г-Ак-Ак-РЬе-РЬе-ИНг > 2-А1а-А1а-РЬе-РЬе-рКА > 2-А1а-А1а-Ьеи-1,еи-рКА (табл. 2). Необходимо отметить, что в синтезе Z-Ala-Ala-Phe-pNA и 2-А1а-А1а-РЬе-МНг ([Б]/[Е] = 1000:1) в процессе реакции вьгоадали осадки, которые могли захватывать фермент и препятствовать дальнейшему ходу реакции. Действительно, результаты аминокислотного анализа осадков свидетельствовали о наличии в них фермента, причем молярное отношение, пептида к белку составляло примерно 1000:1, что указывало на почти полное соосаждение субтилизина.

Таким образом, показано, что субтилизин, суспендированный в ацетонитриле, способен катализировать синтез три- и тетрапептидов с достаточно высокими выходами, однако скорость проводимых реакций относительно невысока. Кроме того, в ряде случаев синтез сопровождается образованием побочных соединений и соосаждением фермента вместе с продуктом реакции.

Более удобными для проведения ферментативных реакций в органической среде являются гомогенные системы, в которых фермент находится в растворенном состоянии.

2.1. Солюбилизация субтилизина в полярных органических растворителях посредством образования комплекса с додецилсульфатом натрия.

Недавно был предложен метод, позволяющий адаптировать ферменты к функционированию в полярных органических растворителях. Он заключается в получении стехиометрического комплекса фермента с анионным детергентом при концентрациях детергента ниже его критической концентрации мицеллообразования. Комплекс формируется за счет образования так называемых гидрофобных ионных пар между положительно заряженными аминогруппами остатков лизина белковой глобулы фермента, расположенных на поверхности, и сульфогруппами детергента. Достигаемое таким образом увеличение гидрофобизации поверхности фермента создает предпосылки для его растворения в органической среде.

2.1.1. Растворимость и стабильность комплекса SDS-субтилизин.

Нами был получен комплекс субтилизина 72 с SDS и изучена его растворимость и стабильность в ряде полярных органических растворителей.

Субтилизин 72 имеет в своем составе 11 остатков Lys и 2 остатка Arg, которые наиболее вероятно могут вступать во взаимодействие с сульфогруппами SDS.

На основании расчета прироста массы субтилизина в результате образования комплекса с SDS, исходя из данных элементного анализа о процентном содержании азота в составе комплекса и нативного фермента, количество молекул SDS в комплексе составило 12 ± 1.

С помощью метода скоростной седиментации были определены коэффициенты седиментации для комплекса, растворенного в этаноле, и нативного белка в воде. На кривой распределения скорости оседания имеющихся в этаноле частиц наблюдалось два платообразных участка, соответствующих образованию легкой и тяжелой молекулярных фракций. Первая приблизительно отвечала стехиометрическому составу комплекса, содержащего около 10 молекул SDS, а во второй, видимо, содержались макромолекулярные ассоциаты комплексов между собой.

Субтилизин в составе комплекса плохо растворялся в диоксане (Aj8q= 0.1), значительно лучше в изопропаноле (A:go= 0.5), этаноле (A2so= 0.8), тетрагидрофуране (А28о= 1.3), а в метаноле и ацетонитриле образовывал суспензию. УФ - спектры исходного раствора субтилизина в воде и растворов комплекса SDS-субтилизин в органических растворителях практически не различаются (рис. 5).

Было показано, что раствор SDS-субтилизина в этаноле и изопропаноле сохранял активность в течение длительного времени, причем более высокую, чем фермент,

суспендированный в ацетонитриле (рис. 6). В диоксане, метаноле, тетрагидрофуране и ацетонитриле комплекс субтилизина с ЭОЭ был неактивен.

Рис. 5. УФ - спектры раствора комплекса ЗОБ-субтилизин в этаноле (1), изопропаноле (2), тетрагидрофуране (3) и раствора нативного субтилизина в воде, содержащей 1 мМ СаСЬ (4).

время,

Рис. 6. Стабильность ЗОЭ-субтилизина в в этаноле (7), изопропаноле (2) и пативного субтилизина в ацетонитриле (5).

2.2. Изучение синтетазной эффективности ЗОЗ-субтшизина.

В качестве модельной реакции нами был выбран синтез г-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рКА из г-А1а-

А1а-Ьеи-ОСНз и РЬе-рМЛ, проходящий по схеме 3:

г-А1аА1а-1.а)-ОН Ч

НгОЦ Пте-рМА

1-А1аА1а-1еи-ОСН3+Е^=^ Р-А1а-А1а-1_еи-0-Е] г-Ла-А^еи-Рте-рИА

СН£>Н 4

СгНйОН!,

г-А^Ла^ш-ОСзНз

Схема 3

В данном синтезе структура исходных компонентов хорошо соответствует представлениям о специфичности субтилизина. В реакцию вводили эквимолярные количества амино- и карбоксильного компонентов. Субтилизин вносили в виде спиртового раствора

комплекса с БОБ. Молярное соотношение [Е]/[5] составило 1:5*103, концентрация исходных компонентов - 30 мМ. За ходом реакции следили с помощью обрахценнофазовой ВЭЖХ.

Максимальный выход продукта (87 %) через 2 ч реакции достигался при концентрациях фермента выше 7 мкМ (молярное соотношение [Б]/[Е] = 5*103:1) (рис. 7).

Выход, К

100-

60 -

20-

—Г" 10

—г-15

20

[Е],мкМ

Рис.7. Зависимость выхода 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рИА от концентрации ЗОБ-субтилизина в этаноле. Условия: [Б] = 30 мМ, 30 % ДМФА, 2 ч.

Рис. 8. Синтез 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рМЛ. катализир; емый комплексом ЗБЗ-субтилизин в этаноле (1), изопропаноле (2) и раствором нативного фермент в этаноле (3).

В этих условиях в этаноле реакция протекала довольно быстро: через 30 мин выход Ъ-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рКА составлял 56 %, а через 2 ч - 87 %, после чего содержание продукта не менялось в течение 8 ч. Препаративно 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рКА был получен с выходом 82%. В изопропаноле процесс шел медленнее, и выход 80 % достигался через 8 ч (рис. 8). Для сразнения на рис. 8 приведена кривая накопления продукта при катализе данной реакции нативным субтшшзином, растворенным в этаноле. За 2 ч выход пептида составлял всего 10 %.

В условиях, подобранных для модельной реакции, с помощью комплекса ЭОЗ-субтилизин как катализатора, с достаточно высокими выходами был синтезирован целый ряд

три-гекса пептидов, которые могут быть использованы как хромогенные и флуорогенные субстраты для различных протеиназ (табл. 3,4).

В проведенных синтезах варьировалась длина и состав ацилирующего и аминокомпонентов, аминокислотные остатки в Pi и P¡' - положениях, а также исследовалось влияние на ход синтеза активации карбоксильной группы ацилирующего компонента.

Как видно из табл. 3, увеличение длины ацилирующего компонента способствовало более эффективному протеканию реакции с аминокомпонентом (пептиды. 1-5). Наибольший выход продукта (87%) за 2 ч проведения реакции достигался при использовании в качестве ацилирующего компонента метиловых эфиров N-защищенных трипептидов. (пептиды 3, 5), в то время как с метиловым эфиром бензнлоксикарбониллейцина синтез не проходил вообще (1). Полученный результат согласуется с представлениями о протяженной зоне связывания в активном центре фермента, специфичность которого в значительной степени определяется взаимодействием его Si и S4 - связывающих участков с боковыми цепями остатков пептидного субстрата в положениях Р[ и Р4.

Используя Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз либо Abz-Val-Ala-Phe-ОСНз в качестве ацилирующих компонентов, мы провели серию синтезов с производными аминокислот, ди- и трипептидов, содержащих в Pi'-позиции остатки Ala, Phe, Leu, Val, Не, а на С-конце амидную, п-нитроанилидную (pNA), п-нитробензиламидную (NBA) группы или остаток 2,4-динитрофенилэтилендиамина (DeD) (пептиды 6-10, 21-27). Наилучшими нуклеофилами оказались п-нитроанилиды, содержащие в Р|' - положении гидрофобные остатки Phe, Leu или Val (пептиды 5, 6, 21, 23); несколько медленнее реакция проходила с небольшим Aia-pNA (24) и стерически затрудненным Ile-pNA (22). Более эффективно протекал синтез с п-нитроанилидами дипептидов (7, 8).

Используя Phe-pNA как аминокомпонент, мы провели ряд синтезов с Z-защищенными трипептидами, содержащими в Р] - положении остатки Gly, Ala, Leu, Met, Phe, PhefNOí), Trp, и Туг (3, 5-16). Исходя из данных о выходах соответствующих соединений за 2 ч, по предпочтительности аминокислотные остатки в Р, - положении ацилирующего компонента можно расположить в ряд: Ala Leu = Met > Phe > Gly >Tyr >Тгр. Ацилирующие компоненты с остатками D-Leu, а также Не и Pro в Pi - положении не вступали в реакцию (пептиды 17-19).

С помощью комплекса SDS-субтилизин при соотношении [S]/[E] = 3*104:1 нами была проведена также олигомеризация метилового эфира трнпептида H-Phe-Ala-Leu-ОСНз в этаноле с выходом 63 % три- и 37 % тетраолигомеров (схема 4 ).

Таблица 3. Выходы пептидов, синтезированных с помощью SDS-субтилизина

Ацилирующий компонент Аминокомпонент Продукт Время, ч Выход, %

Z-Leu-OCH, H-Phe-pNA Z-Leu-Phe-pNA 1 24 0

Z-Ala-Leu-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Leu-Phe-pNA 2 24 53

Z-Ala-Ala-Leu-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA 3 2 87(82)

Z-Ala-Ala-Leu-OH H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA 3 2 83

Z-Ala-Ala-OCHj H-Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA 4 2 50

Z-Ala-Ala-Ala-OCH, H-Phe-pNA Z-A la-Ala-Ala-Phe-pNA 5 2 87

Z-Ala-Ala-Leu-OCH, H-Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Leu-pNA 6 24 98 (80)

Z-Ala-Ala-Leu-OCH, H-Ala-Ala-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Ala-Ala-pNA 7 2 95

Z-Ala-Ala-Leu-OCH, H-Ala-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Ala-Phe-pNA 8 2 82

Z-Ala-Ala-Leu-OCHj H-Phe-NH, Z-Ala-Ala-Leu-Phe-NH, 9 24 50

Z-Ala-Ala-Leu-OCHj H-Leu-NHi Z-Ala-Ala-Leu-Leu-NH2 10 24 50

Z-Ala-Ala-Phe-OH H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Phe-Phe-pNA 11 2 45

Z-Ala-Ala-Gly-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Gly-Phe-pNA 12 24 78

Z-Ala-Ala-Met-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Met-Phe-pNA 13 2 86

Z-Gly-Gly-Tyr-OCH, H-Phe-pNA Z-Gly-Gly-Tyr-Phe-pNA 14 2 60

Z-Ala-Ala-Trp-OCH, H-Phe-pNA г-А1а-А1а-Тф-Р11е-рЫА 15 2 33

Z-Ala-Ala-Phe(N02K>CI I, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Phe(NO;)-Phe-pNA 16 2 85

Z-Ala-Ala-D-Leu-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-D-Leu-Phe-pNA 17 24 0

Z-Ala-Ala-lIe-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-lle-Phe-pNA 18 24 0

Z-Ala-Ala-Pro-OCH, H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 19 24 0

Abz-Ala-Ala-OCH, H-Phe-pNA Abz-Ala-Ala-Phe-pNA 20 24 30

Abz-Val-Ala-Plie-OCH, H-Leu-pNA Abz-Val-Ala-Phe-I.eu-pNA 21 2 80

Abz-Val-Ala-Phe-OCH, H-lle-pNA Abz-Val-Ala-Phe-lle-pNA 22 2 44

Abz-Val-Ala-Phe-OCH, H-Val-pNA Abz-Val-Ala-Phe-Val-pNA 23 2 75

A bz-Val-A la-Phe-OCH] H-Ala-pNA Abz- Val-Ala-Phe-Ala-pNA 24 24 45

Abz-Val-Ala-Plie-OCH, H-Phe-DeD Abz-Val-Ala-Phe-Phe-DeD 25 24 85

Abz-Val-Ala-Plie-OCH, H-Phe-Ala-Ala-DeD Abz-Val-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-DeD 26 24 70

Abz-Val-Ala-Plie-OCH, H-Plie-NBA Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-NBA 27 24 80

Примечание. Условия конденсации: 31 мМ ацилирующий и амннокомпоиент, 6 мкМ SDS-субтилизин в этаноле, 20 "С.

Н-РЬе-А1а-Ьеи-0СН3 ЗОБ-субтилизин, этанол, 24 ч, 20 °С;

2 мкМ

Н-(РЬе-А1а-Ьеи)зОСНз + Н-(РЬе-А1а-Ьеи)4ОСН3 63% 37%

(согласно данным масс-спектрометрического анализа) Схема 4

2.2.1. Влияние активации карбоксильной группы ацилирующего компонента на протекание

синтеза.

На примере реакции г-А!а-А1а-1.еи-(Ж + Н-РЬе-рКА 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рНА, где Я=Н, СНз или р-СбН5С1 ([Б]:[Е] = 5000:1) мы изучили влияние активации ацилирующего компонента на скорость образования пептидной связи под действием ЗБЗ-субтилизина. Как было показано, во всех случаях уже за 2 ч достигались практически количественные выходы (рис. 9, пептид 3) и заметного влияния активации карбоксильной группы ацилирующего компонента на скорость образования продукта не прослеживалось.

Однако анализ всех реакционных смесей за более короткие времена, проведения реакции показал, что наряду с исходным ацилирующим компонентом в них присутствует и его этиловый эфир. По-видимому, во всех случаях первой и наиболее быстрой стадией реакции является, этерификация (рис. 9) либо переэтерификация ацилирующего компонента этанолом из-за его большого избытка в системе. Образующийся 7-А1а-А1а-Ьеи-ОС2Н5 с одинаковой эффективностью взаимодействует далее с аминокомпонентом, что и нивелирует влияние активации ацилирующего компонента на ход синтеза. Таким образом, проведете реакций образования пептидной связи с использованием БОЗ-субтилизина в спирте дает возможность с одинаковой эффективностью использовать в качестве ацщшрующих компонентов наряду с эфирами К-защищенных пептидов их аналоги со свободными карбоксильными группами.

Рис. 9. Влияние активации карбоксильного Рис. 10. ВЭЖХ реакционной смеси в син-

компонента на ход синтеза г-А1а-А1а-1хи-РЬе-рЫА, тезе г-А1а-А1а-Ьеи-ОН + Н-РЬе-рКА за 1 ч, катализируемого БОЗ-субтилизином в этаноле. катализируемом ЗОЭ-субтилизином в этаноле.

2.2.2. Синтез тетрапептидов, содержащих в Pi и Pi '- положениях остатки Glu, Asp, His, Lys и Arg без защиты боковых функциональных групп.

Мы изучили возможность синтеза пептидов, содержащих в Pi и Pi'-положениях остатки полифункциональных аминокислот с незащищенными функциональными группами в боковых цепях.

В синтезе тетрапептидов Z-Ala-Ala-Xaa-OR + H-Phe-pNA -> Z-Ala-Ala-Xaa-Phe-pNA, где Хаа = Lys, Arg, His, Glu, Asp; R = H, ОСНз, эффективными ацилирующими компонентами оказались как метиловые эфиры N-защищенных трипептидов, так и их и их аналоги со свободными карбоксильными группами с остатками Arg и Lys в Pi - положении. Выход

продуктов достигал 70 % уже через 2 ч проведения реакции (табл. 4, пептиды 28-30). При использовании Z-Ala-Ala-His-OCHj реакция протекала несколько медленнее (пептид 31).

При введении в Pi - положение остатка Glu выход продукта за 6 ч составил 84 % (пептид 33). В ходе синтеза наблюдалось образование единственного продукта, в котором у-карбоксильная группа Glu не была этерифицирована, как следовало из масс-спектральных данных. Следует заметить, что эффективными оказались как диметиловый эфир трипептида, так и его аналог со свободными а- и у- карбоксильными группами, одинаково быстро вступавшие в реакцию с H-Phe-pNA. Замена Glu на Asp приводила к снижению выхода продукта (пептид 32).

Таблица 4. Синтезы тетрапептидов, содержащих остатки Arg, Lys, His, Glu и Asp в Pi и Pi'-положениях

с помощью SDS-субтилизина

Ацилирующий компонент Аминокомпонент Продукт Время, ч Выход, %

Z-Ala-Ala-Arg-ОСНз H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 28 2 19 70 92

Z-Ala-Ala-Lys-ОСНз H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Lys-Phe-pNA 29 2 20 71 81

Z-Ala-Ala-Lys-OH H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Lys-Phe-pNA 30 1.5 20 71 83

Z-Ala-Ala-His-OCH3 H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-His-Phe-pNA 31 2 23 13 42

Z-Ala-Ala-Asp-OH H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Asp-Phe-pNA 32 2 26 0 31

Z-Ala-Ala-Glu-OH H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Glu-Phe-pNA 33 2 6 64 84

Z-Ala-Ala-Glu(OCH3)-OCH3 H-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Glu(OCH3)-Fhe-pNA 34 2 20 85 92

Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз H-Glu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA 35 2 84

Abz-Val-Ala-Phe-ОСНз H-Arg-pNA Abz-Val-Ala-Phe-Arg-pNA 36 2 86

Z-Ala-Ala-Arg-ОСНз H-Arg-pNA Z-Ala-Ala-Arg-Arg-pNA 37 2 17 30

Z-Ala-Ala-Glu-OH H-Arg-pNA Z-Ala-Ala-Glu-Arg-pNA 38 19 120 52 92

Z-Ala-Ala-Lys-OH H-Glu-pNA Z-Ala-Ala-Lys-Glu-pNA 39 21 120 38 83

Примечание. Условия конденсации: 31 мМ ацилирующий и аминокомпонент, 6 мкМ SDS-субтилизин в зтаноле, 20 °С.

В синтезе тетрапептидов с помощью комплекса SDS-субтилизин в этаноле одинаково эффективно образовывалась пептидная связь между метиловыми эфирами трипептидов, содержащих остатки гидрофобных аминокислот в Р| - положении (Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз и Abz-Val-Ala-Phe-ОСН.з) и п-нитроанилидами как положительно (Arg) так и отрицательно заряженных (Glu) аминокислот (пептиды 35, 36). Варьируя остатки Glu, Asp, Lys и Arg в Pi и Pi'- положениях исходных реагентов, мы показали возможность образования пептидной связи между разноименно заряженными полифункциональными аминокислотами (пептиды-38, 39), а также связи между двумя остатками Arg (пептид 37), содержащих незащищенные боковые функциональные группы. По-видимому, при проведении реакций в среде с высоким содержанием полярного органического растворителя диссоциация боковых ионогенных групп в значительной степени подавлена, поэтому они остаются незаряженными и лучше связываются с активным центром фермента.

Состав всех синтезированных пептидов подтверждали данными аминокислотного анализа, а в ряде случаев и масс-спектральными данными.

ВЫВОДЫ

1. Изучена каталитическая эффективность сериновой протеиназы субтилизина 72, суспендированного или солюбилизированного за счет образования нековалентного комплекса с додецилсульфатом натрия в полярных органических растворителях.

2. Показано, что субтшшзин, суспендированный в ацетонитриле, катализирует синтез п-нитроанилидов и амидов три-тетрапептидов с высокими выходами. Установлено, что увеличение содержания фермента в реакционной смеси в ряде случаев приводит к образованию побочных продуктов и соосажденшо субтилизина с целевым соединением.

3. Впервые показана высокая эффективность субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия для катализа образования пептидной связи в этаноле и изопропаноле. Изучена возможность синтеза три-гексапептидов различного состава, в том числе хромогенных и флуорогенных субстратов для различных классов протеиназ. Проведена олигомеризация трипептида с получением нона- и додекапептидов.

4. Исследовано влияние активации карбоксильной группы ацилирующего компонента на ход ферментативного синтеза под действием SDS-субтилизина в этаноле и установлено, что

цилирующие компоненты со свободными карбоксильными группами не менее эффективны, ем их эфирные аналоги.

5. Впервые показано, что SDS-субтилизин способен катализировать образование ептидной связи между Lys, Arg, His, GIu, Asp - аминокислотными остатками, содержащими езащищенные ионогенные группы в боковой цепи.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. I. V. Getun, I. Yu. Filippova, Е. N. Lysogorskaya, Е. S. Oksenoit, V. V. Anisimova, S. V. Lolobanova, A. V. Bacheva, V. M. Stepanov. - SDS-subtilisin complex efficiently catalyzed synthesis f peptides in ethanol and 2-propanol - Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, V. 7, N 20, 1997, P. 691-2696.

2. И.В. Гетун, И.Ю. Филиппова, E.H. Лысогорская, C.B. Колобанова, Е.С. Оксенойт, В.В. .нисимова, В.М. Степанов. - Синтез три- и тетрапептидов, катализируемый субтилизином в яде суспензии в органических растзорителях - Биоорг. химия. Т. 24. No 4. 1998, Р. 306-312.

3. И.В. Гетун, И.Ю. Филиппова, Е.Н. Лысогорская, А.В. Бачева, Е.С. Оксенойт. -'ептидный синтез, катализируемый субтилизином 72 в органических растворителях - Биоорг. имия. 1999. Т. 25. No 8. С. 591 - 596.

4. I.V. Getun, I.Yu. Filippova, E.N. Lysogorskaya, V.V. Anisimova, E.S. Oksenoit, A.V. acheva, V.V. Stepanov. - Peptide synthesis catalyzed by subtilisin and thermolysin in organic solvents in: S. Bajusz, F. Hudecz (Eds.), Peptides 1998 (Proceedings of the 25th EPS), Akademiai Kiado, udapest, 1999, P.132-133.

5. I.V. Getun, I.Yu. Filippova, E.N. Lysogorskaya, A.V. Bacheva, E. Oksenoit. -Extending the tility of subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents - in G. Barany, G.B. Fields (Eds), eptides for the new millennium (Proceedings of the 16th APS), 2000 (in press).

6. И.В. Гетун, И.Ю. Филиппова, E.H. Лысогорская, C.B. Колобанова, Е.С. Оксенойт, В.В. нисимова, В.М. Степанов. - Использование комплекса субтилизина с додецилсульфатом зтрия в ферментативном пептидном синтезе. - IV Симпозиум "Химия протеолитических ерментов"', Москва, Россия, Апрель 21-23, 1997, с. 112.

7. И.Ю. Филиппова, Е.Н. Лысогорская, И.В. Гетун, С.В. Колобанова, Е.С. Оксенойт, В.В. Анисимова, В. М. Степанов. - Катализ субтилизином синтеза три- и тетрапептидов в органических растворителях - IV Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, Россия, Апрель 21-23, 1997, С. 111.

8. I.V. Getun, I.Yu. Filippova, V.V. Anisimova. - SDS-subtilisin complex in enzymatic peptide synthesis - International Conference "Biocatalysis - 98", Pushino on the Oka, Russia, June 13-18, 1998,

9. I.V. Getun, I.Yu. Filippova, E.N. Lysogorskaya, V.V. Anisimova, E.S. Oksenoit, A.V. Bacheva, V.V. Stepanov. - Peptide synthesis catalyzed by subtilisin and thermolysin in organic solvents - 25th European Peptide Symposium, Budapest, Hungary, August 30 - September 4, 1998, P. 23.

10. I.V. Getun, I.Yu. Filippova, E.N. Lysogorskaya, A.V. Bacheva, E. Oksenoit. -Extending the utility of subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents - 16th American Peptide Symposium, Minneapolis, Minnesota, June 26 - July 1,1999, P. 219.

P. 34.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

1.1. Поведение сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.1. Растворимость и активность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.2. Вторичная структура суспендированного и растворенного в органических растворителях субтилизина

1.1.3. Третичная структура сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4. Структура активного центра сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4.1. Геометрия активного центра фермента

1.1.4.2. Сольватация активного центра

1.1.5. Конформационная подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.6. Влияние воды на активность и конформационную подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.7. Способы активации ферментов в органических растворителях

1.1.7.1. Активация сериновых протеиназ в присутствии солей

1.1.7.2. Стабилизация сериновых протеиназ в присутствии аналогов субстрата и краун-эфиров

1.1.7.3. Стабилизация сериновых протеиназ в органических растворителях посредством образования гидрофобных ионных пар с поверхностно активными веществами

1.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами в органических растворителях.

1.2.1. Ферментативный синтез с использованием суспендированных сериновых протеиназ

1.2.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами, солюбилизированными в органических растворителях

1.2.3. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами, иммобилизованными на органических и неорганических носителях

1.3. Влияние органических растворителей на специфичность сериновых протеиназ

В последнее время довольно широко ведутся исследования в области так называемой "неводной этимологии". Органические растворители обладают рядом преимуществ перед традиционной водной средой при проведении ферментативных реакций, основными из которых являются сдвиг термодинамического равновесия в сторону целевых продуктов и решение проблемы растворимости гидрофобных реагентов.

Изучение особенностей протекания неводного биокатализа существенно расширяет представления о функциональных возможностях ферментов, об их устойчивости к различным денатурирующим воздействиям. В связи с этим весьма актуальным является проведение исследований, направленных на изучение каталитической эффективности ферментов в средах с высоким содержанием органических растворителей.

Решающее значение для оценки состояния ферментов имеют данные по определению каталитической активности. Однако традиционный подход контроля ферментативной активности протеолитических ферментов, основанный на измерении скорости гидролиза специфических субстратов, в безводных средах затруднен. Определение активности в таких системах возможно только после переноса пробы фермента в воду. Но полученная таким образом информация в большей мере отражает способность фермента к реактивации, чем дает представление об истинном состоянии протеиназы в среде органических растворителей. Поэтому весьма важна разработка новых путей и подходов, позволяющих оценивать активность ферментов в системах органических растворителей с низким содержанием воды в функционирующем состоянии непосредственно в ходе ферментативного процесса. Оценка состояния фермента в неводных средах наиболее адекватно может быть проведена из данных по синтетазной активности протеолитических ферментов.

Целью работы являлось изучение каталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия (Б Ов-субтилизин) в реакциях образования пептидной связи в средах полярных органических растворителей.

Работа состоит из двух частей:

1) изучения поведения нативного субтилизина 72, суспендированного в полярных органических растворителях в реакциях образования пептидной связи;

2) исследования свойств и биокаталитической активности комплекса ЗББ-субтилизин в реакциях ферментативного синтеза пептидов в средах полярных органических растворителей.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

Сериновые эндопептидазы представляют собой хорошо изученный класс протеолитических ферментов, включающий, по меньшей мере, два семейства: химотрипсины и субтилизины. Эти семейства весьма обширны и объединяют протеиназы со значительно различающимися свойствами. Общим для данного класса ферментов является однотипность строения активных центров и сходство механизмов действия [1-6].

Распространенность, доступность, стабильность, широкая субстратная специфичность сериновых протеиназ создают предпосылки для их эффективного использования в качестве катализаторов образования пептидной связи [7-9].

Проведение ферментативного катализа в среде с малым содержанием воды или в практически безводных органических растворителях обладает рядом неоспоримых преимуществ. Во-первых, гидрофобные субстраты, слабо растворимые в воде, хорошо растворяются в органических растворителях. Кроме того, так как большинство ферментов не растворимо в органических растворителях, их легко выделить из реакционной смеси обыкновенным фильтрованием. Биокаталитические реакторы, использующие неводные растворители, не подвержены бактериальному заражению.

В данном литературном обзоре будет рассмотрено поведение и каталитическая эффективность сериновых протеиназ в системах с высоким содержанием полярных и гидрофобных органических растворителей.

выводы

1. Изучена каталитическая эффективность сериновой протеиназы субтилизина 72, суспендированного или солюбилизированного за счет образования нековалентного комплекса с додецилсульфатом натрия в полярных органических растворителях.

2. Показано, что субтилизин, суспендированный в ацетонитриле, катализирует синтез п-нитроанилидов и амидов три-тетрапептидов с высокими выходами. Установлено, что увеличение содержания фермента в реакционной смеси в ряде случаев приводит к образованию побочных продуктов и соосаждению субтилизина с целевым соединением.

3. Впервые показана высокая эффективность субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия для катализа образования пептидной связи в этаноле и изопропаноле. Изучена возможность синтеза три-гексапептидов различного состава, в том числе хромогенных и флуорогенных субстратов для различных классов протеиназ. Проведена олигомеризация трипептида с получением нона- и до декапептидов.

4. Исследовано влияние активации карбоксильной группы ацилирующего компонента на ход ферментативного синтеза под действием SDS - субтилизина в этаноле и установлено, что ацилирующие компоненты со свободными карбоксильными группами не менее эффективны, чем их эфирные аналоги.

5. Впервые показано, что SDS - субтилизин способен катализировать образование пептидной связи между Lys, Arg, His, Glu, Asp - аминокислотными остатками, содержащими незащищенные ионогенные группы в боковой цепи.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор бесконечно благодарен проф. В.М. Степанову, под руководством которого была начата эта работа, за его постоянный интерес к проводимым исследованиям, внимательное, плодотворное и критическое обсуждение полученных результатов и планирования эксперимента.

Автор глубоко признателен И.Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и в особенности оформления данной работы. Автор особенно благодарен Е.С. Оксенойт, осуществившей синтез исходных пептидов. Автор приносит искреннюю благодарность Г.И. Лавреновой, Г.Н. Баландиной и Г.Н. Руденской за полезные дискуссии и ценные практические советы. Автор благодарен A.B. Бачевой, C.B. Колобановой и В.В. Старовойтовой за помощь в проведении экспериментов и оформлении данной работы. Большую помощь при исследовании полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л.А. Баратова, В.В. Меркулов и АЛ. Ксенофонтов. Автор чрезвычайно признателен сотруднику Гарвардской Медицинской Школы А.Ф. Киселеву за помощь, оказанную при поиске литературы. Автор благодарен сотруднику Канзасского Университета Д.Р. Бэнсону за помощь в проведении большей части масс-спектрометрических анализов.

1.4. Заключение.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что в большинстве органических растворителей сериновые протеиназы не растворимы и образуют суспензию. При попадании в среду органического растворителя ферменты не претерпевают значительных конформационных перестроек. Вместе с тем, при этом может меняться степень сольватации и искажаться геометрия активного центра фермента, что сказывается на падении каталитической активности. Кроме того, наблюдаются некоторые изменения в динамических свойствах белковой молекулы. Существенную роль для стабилизации фермента в органической среде играет вода, присутствующая в системе, а также факторы, оказывающие влияние на степень гидратации фермента. Активность ферментов, суспендированных в органических растворителях, может значительно повышаться при введении в реакционную среду добавок различных солей и краун-эфиров, а также при поддержании необходимой для катализа конформации активного центра фермента с помощью импринтинга.

Синтетазная эффективность сериновых протеиназ в основном изучена в реакциях переэтерификации. Круг исследований, направленных на изучение сериновых протепиназ как катализаторов реакций образования пептидной связи, достаточно ограничен. В литературе в основном имеются сведения о синтезе в органических растворителях под действием сериновых протеиназ амидов дипептидов. Данных об использовании этих ферментов для синтеза более протяженных пептидов не приводится. Кроме того, биокаталитические системы в большинстве случаев оказываются гетерогенными, что накладывает ряд ограничений на протекание реакций.

Отмечается, что для перевода в гомогенную среду может использоваться метод солюбилизации-стабилизации фермента комплексообразованием с ПАВ. Однако подобные комплексы изучены, в основном, в реакциях переэтерификации, хотя и имеются данные образования пептидной связи, катализируемого химотрипсином-АОТ в изооктане. Между тем наиболее удобными для проведения пептидного синтеза являются полярные органические растворители, так как в них хорошо растворимы исходные соединения. В литературе не имеется данных об исследовании каталитической эффективности гидрофобных ионных комплексов ферментов с ПАВ для целей пептидного синтеза в полярных органических средах.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Целью данной работы являлось изучение пептидного синтеза, катализируемого субтилизином 72 в средах с высоким содержанием полярных органических растворителей.

Щелочная протеиназа субтилизин 72, секретируемая Bacillus subtilis штамм 72, была получена в высокоочищенном состоянии в 1979 г. в России. N-концевая последовательность субтилизина 72 (до 35 шага) оказалась схожей, за исключением двух позиций, с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг. Высокая степень гомологии позволяет сделать предположение, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен по свойствам субтилизину Карлсберг [135].

Субтилизин - распространенный, доступный фермент, обладающий широкой субстратной специфичностью и катализирующий разнообразные реакции образования пептидной связи [7, 8, 136-140].

Синтез пептидной связи в присутствии субтилизина происходит по схеме 1 (см. лит. обзор). Так как присутствующая в реакционной системе вода является конкурентным нуклеофилом по отношению к аминокомпоненту, как ацил-фермент, так и продукт реакции могут вступать с ней в реакции гидролиза, что влечет за собой ряд побочных процессов. Использование органических растворителей с низким содержанием воды как среды для проведения ферментативного пептидного синтеза с использованием субтилизина позволяет существенно сдвинуть термодинамическое равновесие реакций в сторону образования продукта, а также дает возможность проведения синтеза с гидрофобными субстратами [14, 16,141].

Как следует из литературных данных, при высоком содержании органического растворителя большинство ферментов не растворимо в реакционной среде, и система представляет собой суспензию частиц биокатализатора в органической среде. Полярные растворители, по сравнению с неполярными, оказывают более сильное инактивирующее воздействие на суспендированные ферменты, так как способны непосредственно воздействовать на фермент, лишая его необходимой для осуществления каталитических функций водной оболочки. Не смешивающиеся с водой растворители в большинстве случаев инертны по отношению к биокатализатору [30, 54, 142].

Между тем наиболее подходящими для проведения реакций ферментативного пептидного синтеза являются именно полярные органические растворители, так как большинство аминокислот, их производных и пептидов не растворяется в неполярных средах. Поэтому весьма актуальной задачей является разработка подходов для использования и адаптации ферментов к условиям функционирования в среде с высоким содержанием полярных органических растворителей.

II.I. Изучение поведения нашивного субтилизина в полярных органических растворителях.

Нами была изучена растворимость и стабильность нативного субтилизина 72 в ацетонитриле, диоксане, тетрагидрофуране, этаноле - органических растворителях наиболее удобных для проведения пептидного синтеза [143, 144]. Оценка, тем более количественная, состояния фермента, находящегося в растворенном состоянии в среде органических растворителей, не содержащих воды, весьма сложна и неоднозначна, поскольку трудно разграничить, находится ли фермент в растворе или в мелкодисперсном состоянии. Для изучения состояния фермента лиофильно высушенный субтилизин вносили в органический растворитель, образующуюся суспензию перемешивали, центрифугировали при 16000 g 10 мин, после чего определяли содержание и активность фермента в полученном супернатанте, который в дальнейшем мы будем называть низкоконцентрированной суспензией.

Количественно содержание субтилизина в органических растворителях оценивалось спектрофотометрически и по результатам аминокислотного анализа. УФ-спектр субтилизина в тетрагидрофуране (рис. 11) в наибольшей степени соответствовал спектру белка, растворенного в воде, и имел характерный максимум поглощения при 280 нм, что указывает на образование субтилизином истинного раствора. Содержание субтилизина в тетрагидрофуране составило 20 мкМ.

В спектре пробы субтилизина в диоксане отчетливого максимума при 280 нм не наблюдалось; значение А280 составило 0,35, что соответствует 11,7 нмоль/мл (табл. 9). Вероятно, в диоксане наряду с растворенным ферментом присутствовала и его взвесь.

Рис. 11. УФ-спектры раствора субтилизина в воде (/) и низкоконцентрированной суспензии субтилизина в ТГФ (2), диоксане (3) и ацетонитриле(¥). Кривая 5 получена после повторного центрифугирования суспензии суспензии в ацетонитриле.

В УФ-спектре пробы субтилизина в ацетонитриле максимума при 280 нм не наблюдалось, вид спектра свидетельствовал о сильном светорассеянии. По-видимому, субтилизин, по крайней мере, основная его часть, существует в ацетонитриле в виде суспензии, а не истинного раствора. После повторного центрифугирования суспензии субтилизина в ацетонитриле при 10 ООО g и 4°С спектр полученного супернатанта принял иной вид (рис. 11, кривая 5), видимо, в результате осаждения, по крайней мере частичного, белка, хотя осадка наблюдать не удалось из-за малого его содержания. Появился небольшой максимум при 280 нм, однако минимум при 260 нм был выражен неявно. Вероятно, и после повторного центрифугирования фермент в ацетонитриле нахфщлся в виде мелкодисперсной суспензии, хотя нельзя исключить, что часть его все же образовывала истинный раствор. Содержание фермента в появившемся пике по поглощению при 280 нм за вычетом вклада в спектр светорассеяния составило 0,36 нмоль/мл.

Мы оценили содержание субтилизина в ацетонитриле и диоксане также по данным аминокислотного анализа (табл. 9). Различия в величинах, полученных этими двумя способами, очевидно, свидетельствуют о вкладе в поглощение мелкодисперсной суспензии фермента в органическом растворителе. Следует отметить, что при спектральной оценке растворимости субтилизина его молярный коэффициент поглощения в органическом растворителе принимался равным этой величине для белка в воде. Кроме того, ошибка при определении малых значений молярного коэффициента и малых концентраций аминокислот очень велика. Таким образом, речь идет о полуколичественной оценке содержания фермента.

1. Степанов В.М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа. 1996. С.220-233.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С.135-147.

3. Kraut J. Serine proteases: strucrure and mehanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977. V.46. P.331-338.

4. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорг. химия. 1994. Т.20. С.475-484.

5. Voet D., Voet J.G. // Biochemistry (Wiley, New York), 2nd Ed. 1995. P.397-399.

6. Siezen R.J., Leunissen J.A.M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6. P.501-523.

7. Moree W.J., Sears P., Kawashiro K., Witte K., Wong C.-H. Exploitation of subtilisin BPN' as catalyst for the synthesis of peptides containing noncoded amino acids, peptide mimetics and peptide conjugates. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.3942 3947.

8. Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68. P.1335-1339.

9. Isowa Y., Ohmori M., Ichikawa Т., Kurita H., Sato M., Mori K. The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977. V.50. P.2762-2767.

10. Гладилин A.K., Левашов A.B. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998. Т.63. С.408-421.

11. Narayan V.S., Klibanov A.M. Are water-immiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency? // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.41. P.390-393.

12. Dordick J.S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1989. V.ll. P. 194-211.

13. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V.8. P.259-267.

14. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. P. 178-206.

15. Chang N, Hen SJ, Klibanov A.M. Protein separation and purification in neat dimethyl sulfoxide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V.176. P. 14621468.

16. Barbas C.F., Matos J.R., West J.B., Wong C.-H. A search for peptide ligase: cosolvent-mediated conversion of proteases to esterases for irreversible synthesis of peptides. //J. Am. Chem. Soc. 1988. V.110. P.5162-5166.

17. Chen S.-T., Chen S.-Y., Chen-Chen Т., Chiou S.-H., Wang K.-T. Physicochemical properties of alkaline serine proteases in alcohol. // J. Protein Chem. 1995. V.14. P.205-215.

18. Xu K., Griebenow K., Klibanov A.M. Correlation between catalytic activity and secondary structure of subtilisin dissolved in organic solvents. // Biotech. Bioeng. 1997. V.56. P.485-491.

19. Castro G. R. Enzymatic activities of proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1999. V.25. P.689-694.

20. Практическая химия белка. // Под ред. Дарбре А. Москва. Мир: 1989. С291.

21. Lowry О.Н., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

22. Rariy R.V., Klibanov A.M. Correct protein folding in glycerol. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.13520-13523.

23. H. Kise. Difference in catalytic activities of subtilisin Carlsberg and immobilization-activation for ester synthesis and transesterification in ethanol. // Bioorg. Chem. 1990. V.18. P.107-115.

24. Kise H., Fujimoto K. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. VIII. Medium effect and nucleophile specificity in subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1988, V.10. P.883-888.

25. Kise H., Shirato H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. V. Medium effect on the esterification of aromatic amino acids by a-chymotrypsin. // Enzyme Microb. Technol. 1988. V.10. P.582-585.

26. Yamamoto Y., Kise H. Catalysis of enzyme aggregates in organic solvents. An attempt at evaluation of intrinsic activity of proteases in ethanol. // Biotechnol. Lett. 1993. Y.15.P.647-652.

27. A. Zaks, A.M. Klibanov. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.3194-3201.

28. A. Zaks, A.M. Klibanov. Enzymatic catalysis in organic media at 100 °C. // Science. 1984. V.244. P. 1249-1251.

29. Garza-Ramos G., Darszon A., Tuena de Gomez-Puyou M., Gomez-Puyou A. Enzyme catalysis in organic solvents with low water content at high temperatures. // Biochemistry. 1990. V.29. P.751-757.

30. Griebenow K., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? //Biotech. Bioeng. 1997. V.53. P.351 362.

31. Fitzpatrick P.A., Ringe D., Klibanov A.M. X-ray structure of cross-linked subtilisin Calsberg in water vs. acetonitrile. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V.198. P.675-681.

32. Fitzpatrick P.A., Steinmetz A.C.U., Ringe D., Klibanov A.M. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V.90. P.8653-8657.

33. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. Comparison of x-ray structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous acetonitrile and in water. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V.95. P.12918-12923.

34. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V.94. P.4250-4255.

35. Allen K.N., Bellamacina C.R., Ding X., Jeffery C.J., Mattos C., Petsko G.A., Ringe D. An eperimental approach to mapping the binding surfaces of crystalline proteins. // J. Phys. Chem. 1996. V.100. P.2605-2611.

36. Yennawar N.H., Yennawar H.P., Farber G.K. X-ray crystal structure of y-chymotrypsin in hexane. // Biochemistry. 1994. V.33. P.7326-7336.

37. Kidd R.D., Sears P., Huang D.-H., Witte K., Wong C.-H., Farber G.K. Breaking the low barrier hydrogen bond in a serine protease. // Protein Sei. 1999. V.8. P.410-417.

38. Zhu G., Huang Q., Wang Z., Qian M., Jia Y., Tang Y. X-ray studies on two forms of bovine ß-trypsin crystals in neat cyclohexane. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1429. P. 142-150.

39. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics study of the effect of carbon tetrochloride on enzyme structure and dynamics: subtilisin. // Protein Eng. 1996. V.9. P.485-492.

40. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics and quantum mechanics analysis of the effect of DMSO on enzyme structure and dynamics: subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118. P.4175-4180.

41. Frey P.A., Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. // Science. 1994. V. 264. P. 1927-1930.

42. Burke P. Demonstration of structural integrity of an enzyme in organic solvents by solid-state NMR. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V.l 11. P.8290-8291.

43. Burke P.A., Griffin R.G., Klibanov A.M. Solid state NMR assessment of enzyme active center structure under nonaqueous conditions. // J. Biol. Chem. 1992. Y.267. P.20057-20064.

44. Schmitke J.L., Stern L., Klibanov A.M. Organic solvent binding in mostly aqueous media and in the neat solvents. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.248. P.273-277.

45. Toba S., Merz K.M. The concept of solvent compatibility and its impact on protein stability and activity enhancement in nonaqueous solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.l 19. P.9939-9948.

46. Blinkovsky A.M., Martin B.D., Dordick J.S. Enzymology in monophasic organic media. // Curr. Opin. Biotechnol. 1992. V.3. P.124-129.

47. Gomez-Puyou M.T., Gomez-Puyou A. Enzymes in low water systems. // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1998. V.33. P.53-89.

48. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends Biotechnol. 1997. V.15. P.97-101.

49. Desai U.R., Klibanov A.M. Assessing the structural integrity of a lyophilized protein in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.l 17. P.3940-3945.

50. Affleck R., Haynes C.A., Clark D.S. Solvent dielectric effects on protein dynamics. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.5167-5170.

51. Affleck R., Xu Z.-F., Suzawa V., Frocht K., Clark D.S., Dordick J.S. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.l 100-1104.

52. Burke P.A., Griffin R.G., Klibanov A.M. Solid-state nuclear magnetic resonance investigation of solvent dependence of tyrosyl ring motion in an enzyme. // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.42. P.87-94.

53. Gorman L.S., Dordick J.S. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39. P.392-397.

54. Zaks A., Klibanov A.M. The effect of water on enzyme action in organic media. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.8017-8021.

55. Correa de Sampaio T., Melo R.B., Moura T.F., Michel S., Barreiros S. Solvent effects on the catalytic activity of subtilisin suspended in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P.257-264.

56. Kise H., Shirato H., Noritomi H. Protease catalyzed synthetic reactions and immobilization - activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents. // J. Biotech. 1990. V.14. P.239-254.

57. Partridge J., Dennison P.R., Moore B.D., Hailing P.J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1386. P.79-89.

58. Bell G., Hailing P.J., Moore B.D., Partridje J., Rees D.G. Biocatalyst behaviour in low-water systems. // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P.468-473.

59. Bone S., Pethig R. Dielectric studies of protein hydration and hydration-induced flexibility. // J. Mol. Biol. 1985. V.181. P.323-326.

60. Bone S. Time-domain reflectrometry studies of water binding and structural flexibility in chymotrypsin. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.916. P. 128-134.

61. Almarsson O., Klibanov A.M. Remarkable activation of enzymes in nonaqueous media by denaturating organic cosolvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.49. P.87-92.

62. Khmelnitsky Yu.L., Welch S.H., Clark D.S., Dordick J.S. Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.116. P.2647-2648.

63. Dabulis K., Klibanov A.M. Dramatic Enhancement of enzymatic activity by lyoprotectants. //Biotech. Bioeng. 1993. V.41. P.566-571.

64. Unen D.-J., Sakodinskaya I.K., Engbersen J.F.J., Reinhoudt D.N. Crown ether activation of cross-linked subtilisin Carlsberg crystals in organic solvents. // J. Chem. Soc., PerkinTrans. 1998. V.l. P.3341-3343.

65. Khmelnitsky Yu.L., Rich J.O. Biocatalysis in nonaqueous solvents. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V.3. P.47-53.

66. Kazlauskas R.J., Weber H.K. Improving hydrolases for organic synthesis. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.2. P.121-126.

67. Sears P., Witte K., Wong C.-H. The effect of counterion, water concentration, and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999. V.6. P.297-304.

68. F.H. Enzyme engineering for nonaqueous solvents. II. Additive effects of mutations on the stability of subtilisin E in polar organic media. // Biotechnol. Prog. 1991. V.7. P.125-129.

69. Chen K., Arnold F.H. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. N.12. P.5618-5622.

70. You L., Arnold F.H. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. // Protein Eng. 1996. V.9. P.77-83.

71. Zhong Z., Liu J.L.-C., Dinterman L.M., Finkelman M.A.J., Mueller W.T. Engineering subtilisin for reaction in dimethylformamide. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.l13. P.683-684.

72. Kise H., Shirato H. Synthesis of aromatic amino acid ethyl esters by a-chymotrypsin in solutions of high ethanol concentrations. // Tetrahedron Lett. 1985. V.26. P.6081-6084.

73. Sasaki T., Kise H. Effects of calcium ion on the catalytic activity of a-chymotrypsin in organic solvents. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V.58, P. 10501053.

74. Sasaki T, Kise H. Increase of catalytic activity of alpha-chymotrypsin by metal salts for transesterification of an amino acid ester in ethanol. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. P. 1196-1197.

75. Yamamoto Y., Kise H. Unusual enhancement of protease activity in organic solvents by amines. // Chem. Lett. 1993. V.l 1. P.1821-1824.

76. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. // Trends Biochem. Sci. 1989. V.14. P.141-144.

77. Costantino H.R., Griebenow K., Langer R., Klibanov A.M. On the pH memory of lyophilized compounds containing protein functional groups. // Biotech. Bioeng. 1997. V.53. P.345-348.

78. Yang Z., Zacher D., Russel A.J. pH Dependence of subtilisin dispersed in organic solvents. //J. Am. Chem. Soc. 1993. V.l 15. P.12251-12257.

79. Schulze B., Klibanov A.M. Subtilisins in neat organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1991. V. 38. P. 1001-1006.

80. Zacharis E., Hailing P.J., Rees D.G. Volatile buffers can override the "pH memory" of subtilisin catalysis in organic media. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. P.1201-1205.

81. Blackwood A.D., Curran L.J., Moore B. D., Hailing P.J. 'Organic phase buffers' control biocayalyst activity independent of initial aqueous pH. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1206. P.161-165.

82. Russell A.J., Klibanov A.M. Inhibitor-induced enzyme activation in organic solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.l 1624-11626.

83. Klibanov A.M. Enzyme memory. What is remembered and why? // Nature. 1995. V.374. P.596.

84. Kawasaki Y., Takahashi Y., Nakatani M., Murakami M., Dosako S., Osaki H. Enzymatic functions of fatty-acid-modified chymotrypsin and trypsin in aqueous-organic media. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V.3. P.512-516.

85. Inada Y., Katsunobu T., Yoshimoto T., Ajima A., Matsushima A., Saito Y. Application of polyethylene glycol-modified enzymes in biotechnological processes: organic solvent-soluble enzymes. // Trends Biotechnol. 1986. V.ll. P. 190-194.

86. Yang Z., Domach M., Auger R., Yang F.X., Russell A.J. Polyethylene-glycol-induced stabilization of subtilisin. // Enzyme Microb. Technol. 1996. V.18. P.82-89.

87. Wong C.-H. Engineering enzymes for chemoenzymatic synthesis. Part 2: modifying proteases for peptide synthesis. // Trends Biotechnol. 1992. V.10. P.378-341.

88. Paradkar V.M., Dordick J.S. Extraction and solubilization of chymotrypsin into isooctane in the presence of low concentration of Aerosol OT in the absence of reversed micelles. // Biotechnol. Bioeng. 1994. V.43. P.529-540.

89. Powers M.E., Matsuura J., Brassell J., Manning M.C., Shefter E. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. //Biopolymers. 1993. V.33. P.927-932.

90. Matsuura J., Powers M.E., Manning M.C., Shefter E. Structure and stability of insulin dissolved in 1-octanol. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V.l 15. P. 1261-1264.

91. Meyer J.D., Kendrick B.S., Matsuura J.E., Ruth J.A., Bryan P.N., Manning M.C. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47. P. 177-181.

92. Paradkar V.M., Dordick J.S. Aqueous-like activity of a-chymotrypsin dissolved in nearly anhydrous organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.l 16. P.5009-5010.

93. Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.S., Dordick J.S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.l 19. P.70-76.

94. Kendrick B.S., Meyer J.D., Matsuura J.E., Carpenter J.F., Manning M.C. Hydrophobic ion pairing as a method for enhancing structure and activity of lyophilized subtilisin BPN' suspended in isooctane. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V.347. P.113-118.

95. Meyer J.D., Matsuura J.E., Kendrick B.S., Evans E.S., Evans G.J., Manning M.C. Solution behavior of a-chymotrypsin dissolved in nonpolar organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Biopolymers. 1995. V.35. P.451-456.

96. Gimel J.C., Brown W. A light scattering investigation of the sodium dodecyl sulfate-lysozyme system. // J. Chem. Phys. 1996. V.104. P.8112-8117.

97. Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // Boca Raton. Florida CRC Press Inc. 1987.

98. Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53. P.239-306.

99. C.R. Wescott, A.M. Klibanov. Solvent variation inverts substrate specificity of an enzyme. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 1629-1631.

100. Zaks A., Klibanov A.M. Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs. water is reversed. // J. Am. Chem. Soc. 1986. Y.108. P.2767-2768.

101. Homandgerg G.A., Mattis J.A., Laskowski M. Synthesis of peptide bonds by proteinases. Addition of organic cosolvents shifts peptide bond equilibria toward synthesis. // Biochemistry. 1978. V.17. P.5220-5227.

102. Cerovsky V., Martinek K. Free chymotrypsin-catalyzed synthesis of peptide bond in aliphatic alcohols with low water content. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1989. V.54. P.266-275.

103. Cerovsky V., Martinek K. Peptide synthesis catalyzed by native proteinase K in water-miscible organic solvents with low water content. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1989. V.54. P.2027-2041.

104. Cerovsky V. Free-trypsin-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile with low water content. // Biotechnol. Lett. 1990. V.12. P.899-904.

105. Ricca J.M, Crout D.H.G. Peptide synthesis catalyzed by chymotiypsin in organic solvents. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1989. V.l. P.2126-2127.

106. Wang Y.-F., Yakovlevsky K., Zhang B., Margolin A.L. Cross-linked crystals of subtilisin: versatile catalyst for organic synthesis. // J. Org. Chem. 1997. V.62. P.3488-3495.

107. Matsushima A., Okada M., Inada Y. Chymotrypsin modified with polyethylene glycol catalyzes peptide synthesis reaction in benzene. // FEBS Lett. 1984. V.178. P.275-277.

108. Gaertner H., Watanabe T., Sinisterra J.V., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by modified a-chymotrypsin in low-water organic media. // J. Org. Chem. 1991. V.56. P.3149-3153.

109. Gaertner H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P.207-213.

110. Gaertner H., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by polyethylene glycol-modified chymotrypsin in organic solvents. Proteins: Structure, Function and Genetics. 1988. V.3. P.130-137.

111. Ito Y., Fujii H., Imanishi Y. Catalytic peptide synthesis by trypsin modified with polystyrene in chloroform. // Biotechnol. Prog. 1993. V.9. P.128-130.

112. Sergeeva M.V. Paradkar V.M. Dordick J.S. Peptide synthesis using proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1997. V.20. P.623-628.

113. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem. 1988. V.177. P.313-318.

114. Pugniere M., Skalli A., Coletti-Previero M.-A., Previero A. Peptide and ester synthesis in organic solvents catalyzed by seryl proteases linked to alumina. // Proteins: Structure, Function, Genetics. 1986. V.l. P. 134-138.

115. Coletti-Previero M.-A., Previero A. Alumina-phosphate complexes for immobilization of biomolecules. //Analytical Biochem. 1989. V.l 80. P. 1-10.

116. Kise H., Hayakawa A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1991. V.13. P.584-588.

117. Kise H., Hayakawa A., Noritomi H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. IV. Chitin-alpha-chymotrypsin complex as a catalyst for amino acidesterification and peptide synthesis in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1987. V.9. P.543-548.

118. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media: a comparative study of water-miscible and water-immiscible solvent systems. // J. Biotechnol. 1990. V.15. P.323-338.

119. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. Nucleophile specificity and medium engineering in a-chymotrypsin catalyzed reactions. //Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V.12. P.376-386.

120. Adlercreutz P., Clapes P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. V.613. P.517-520.

121. Clapes P., Adlercreutz P. Substrate specificity of a-chymotrypsin-catalyzed esterification in organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.l 118. P.70-76.

122. Wescott C.R., Klibanov A.M. The solvent dependence of enzyme specificity. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1206. P.l-9.

123. Gololobov M.Yu., Voyushina T.L., Stepanov V.M., Adlercreutz P. Organic solvents changes the chymotrypsin specificity with respect to nucleophiles. // FEBS Lett. 1992. V.307. P.309-312.

124. Jonsson A., Wehtje E., Adlercreutz P., Mattiasson B. Temperature effects on protease catalyzed acyl transfer reactions in organic media. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1996. V.2. P.43-51.

125. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Acyl transfer reactions catalyzed by native and modified a-chymotrypsin in acetonitrile with low water content. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.l6. P.596-600.

126. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Nucleophile specificity of subtilisin in an organic solvent with low water content: Investigation via acyl transfer reactions. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.49. P.553-558.

127. Kise H., Tomiuchi Y., Nagashima T. Substrate specificity and stereospecificity of proteases in hydro-organic cosolvent systems. // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V.50. P.127-130.

128. Schellenberger V., Jakubke H.-D. Protease-catalyzed kinetically controlled peptide synthesis. // Angew. Chem. Int. Ed/ Engl. 1991. V.30. P.1437-1449.

129. Schellenberger V., Schellenberger U., Mitin Y.V., Jakubke H.-D. Characterization of the S' subsite specificity of bovine pancreatic a-chymotrypsinvia acyl transfer to added nucleophiles. // Eur. J. Biochem. 1990. V.187. P. 163167.

130. Акпаров B.X., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72- сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44. No 5. С.886-891.

131. Воюшина Т. Л., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорг. химия. 1985. Т.2. С.738-744.

132. Morihara К., Oka Т. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain, and pepsin. //J. Biochem. (Tokyo). 1981. V.89. P.385-390.

133. Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V.31. P.6011-6018.

134. Gololobov M.Yu., Morozova I.P., Voyushina T.L., Timokhina E.A.,, Stepanov V.M. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.l 118. P.267-276.

135. Michels P.C., Khmelnitsky Yu.L., Dordick J.S., Clark D.S. Combinatorial biocatalysis: a natural approach to drug discovery. // Trends Biotechnol. 1998. V.16. P.210-215.

136. Wangikar P.P., Carmichael D., Clark D.S., Dordick J.S. Active-site titration of serine proteases in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P.329-335.

137. Гетун И.В., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Бачева А.В., Оксенойт Е.С. Пептидный синтез, катализируемый субтилизином 72 в органических растворителях. // Биоорг. химия. 1999. Т.25. No 8. С.591-596.

138. Колобанова C.B., Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Гетун И.В., Бачева

139. A.В., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Сегментная конденсация пептидов на твердой фазе с помощью субтилизина в комплексе с додецилсульфатом натрия. Биоорг. химия. 2000. Т.26. No 6. С.411^116.

140. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.Л., Тимохина Е.А., Степанов

141. B.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.230-239.

142. Юсупова М.П., Новгородова С.А., Степанов В.М. Последовательное присоединение остатков аргинина к пептидам, катализируемое субтилизином. I. Влияние состава органического растворителя. // Биоорг. химия. 1996. Т.22. С.523-527.

143. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Выделение протеиназы Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.33-40.

144. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // Пер. с англ. Москва. Мир. 1976.

145. Гершкович A.A., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев. Наукова Думка. 1992.