Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

БЕЛЯЕВА Анастасия Валерьевна

ПРОТЕИНАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА, КАК КАТАЛИЗАТОРЫ ПЕПТИДНОГО СИНТЕЗА В ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ

Специальность - 02.00.10 Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

'Ааучны? руководители: доктор химических наук

Филиппова Ирина Юрьевна доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Кочетков Константин Александрович кандидат химических наук Воюшина Татьяна Львовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 31 октября 2006 года в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при московском университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.!, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан Z9 сентября 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез пептидов, катализируемый протеиназами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратной оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалентная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе из-за опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе.

Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (криоПВСГ), как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

В работе решались следующие задачи: (1) получение и характеристика препаратов трипсина, субтилизина, термолизина и химотрипсина, иммобилизованных на криоПВСГ; (2) выявление оптимальных условий протекания реакции пептидообразования, катализируемого данными биокатализаторами; (3) изучение биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов в реакциях пептидного синтеза; (4) синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ - с использованием ферментов, иммобилизованных на криоПВСГ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведена оптимизация условий получения биокатализаторов на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на криоПВСГ. Показано, что полученные образцы иммобилизованных ферментов катализируют

образование пептидной связи в органической среде. Выявлены оптимальные условия проведения ферментативного пептидного синтеза под действием протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ, в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных биокатализаторов получены ди-, три- и тетрапептиды различного строения. Показано, что субстратная специфичность иммобилизованного субтилизина в органических средах «расширяется», в то время как иммобилизованный термолизин практически сохраняет свою специфичность в таких средах. Установлена возможность многократного использования одного и того же препарата иммобилизованной протеиназы для эффективного синтеза пептидов.

Практическая ценность работы заключается в разработке биокаталитической системы, сохраняющей высокую активность и позволяющей, варьируя составляющие ее элементы (иммобилизованный фермент, набор органических растворителей), с высокой эффективностью проводить целенаправленный синтез пептидов различной структуры, включая хромогенные и флуорогенные субстраты протеиназ.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей. Результаты работы были представлены на Международной конференции "Biocatalysis" (Москва, 2002; Кижи-Валаам-Санкт-Петербург, 2005), V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок» (Тверь, 2002), Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов» (Москва, 2003), I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), III Московском международном конгрессе "Biotechnology: state of the art and prospects of development" (Москва, 2005), 28 и 29 Европейском Пептидном Симпозиумах (Прага, Чехия, 2005; Гданьск, Польша, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного модифицированным протеиназам как катализаторам синтеза пептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( /¿0 ссылок). Содержит 32 рисунка и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта

Для иммобилизации были использованы сериновые протеиназы трипсин, химотрипсин, субтилизин и металлопротеиназа термолизин. Выбор этих отличных по своей природе и каталитическому механизму ферментов был связан с их доступностью, стабильностью и высоким синтетическим потенциалом в реакциях пептидной конденсации. Присутствие в структуре ферментов достаточного количества остатков лизина, экспонированных на поверхность белковой глобулы, позволяло провести ковалентное присоединение протеиназ к носителю.

В качестве матрицы для ковалентной фиксации ферментов был выбран криоПВСГ. Уникальной особенностью криоПВСГ является его макропористая структура, а также совместимость как с водной, так и с полярной органической средой. Эти свойства носителя обеспечивали возможность иммобилизации на нем крупных молекул ферментов, минимизируя затрудненную диффузию субстрата, а также инактивацию биокатализатора в органической среде.

Для иммобилизации протеиназ использовали криоПВСГ в виде сферических гранул диаметром 1 мм, .полученных с помощью специальной криогрануляционной установки в Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН.

В качестве объекта для отработки методики получения иммобилизованных ферментов был использован трипсин, который является доступной и хорошо охарактеризованной протеиназой. Процесс ковалентной иммобилизации на криоПВСГ включал две основные стадии: введение реакционноспособных группировок в матрицу носителя (активацию криогеля) и присоединение молекул фермента по этим группировкам. Для прививки реакционноспособных группировок к криоПВСГ использовали активацию дивинилсульфоном (ДВС) в щелочной среде и активацию диальдегидами в кислой среде (схемы 1 и 2). Поскольку известно, что подбором длины сшивающего агента можно изменять каталитические характеристики иммобилизованного фермента, для активации матрицы применялись диальдегиды с «ножкой» разной длины: глиоксаль (ГО), янтарный (ЯА), глутаровый (ГА) и терефталевый (ТА) альдегиды.

Непрорсагировавшие резкционноспособные группы носителя блокировали трис-гидроксиметиламинометаном. Количество присоединенного фермента оценивали по данным аминокислотного анализа навески иммобилизованного биокатализатора после его гидролиза 5.7 н. НС1. Результаты экспериментов по иммобилизации трипсина на гранулах криоПВСГ, приведены в таблице 1.

О

-он

сн2 =сн — ^ -сн-сн3

•_о_

ОН"

-о —СН

о

I - СН 2 -1 - сн-сн 3

н — ФЕРМ Е Н Т

-О —СН2-СНг —- СН2—СНг—NN -ФЕРМЕНТ О

Схема 1. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем винилсульфоновые реакционноспособные группировки

^ОН ОН

ОН ОНС-(СН2)з-СНО

н*

уР —фермент

сн(сн2)з-с:Г -

о н

>Н(СН2)з-СН=К -ФЕРМЕНТ

Схема 2. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем альдегидные реакционноспособные группировки

Таблица 1. Характеристика препаратов трипсина, иммобилизованного на криоПВСГ, активированном различными диальдегидами и ДВС

Астивирующий агент Содержание трипсина на криоПВСГ, мг/г Активность трипсина, иммобилизованного на криоПВСГ

ед. актУг носителя ед. акт./мг белка

ГО следы - -

ТА 0.3 ± 0.1 0.013 0.042

ЯА 7.2±0.1 0.147 0.020

ГА 6.9 ±0.1 1.21 0.175

ДВС 4.3£0.1 1.35 0.314

Наилучшие результаты по количеству присоединяемого белка в результате ковалентной иммобилизации трипсина на криоПВСГ наблюдались при активации ДВС и ЯА или ГА с подвижной алифатической спейсерной группировкой. Использование ТА с конформационно-жестким бензольным кольцом не позволило получить иммобилизованный биокатализатор с приемлемым содержанием фермента на носителе. В случае использования криоПВСГ, активированного ГО, полученный образец биокатализатора содержал только следовые количества трипсина, по-видимому, из-за малой стерической доступности для макромолекул белка реакционных групп гелевой матрицы, модифицированной таким «коротким» диальдегидом, как ГО.

Каталитическую активность препаратов трипсина, иммобилизованного на криоПВСГ, оценивали спектрофотометрически по гидролизу специфического хромогенного субстрата Вг-Максимальную активность проявлял препарат на основе трипсина, иммобилизованного на носителе, активированном ДВС. Активность биокатализатора, полученного активацией криоПВСГ ГА, была несколько ниже, однако в этом случае матрица криоПВСГ после обработки диальдегидом обладала лучшими механическими свойствами. Исходя из этого, в качестве оптимальных были выбраны условия получения иммобилизованных биокатализаторов путем присоединения ферментов к криоПВСГ после модификации носителя с помощью ГА.

В ходе работы были получены биокатализаторы на основе субтилизинов 72 и Карлсберг, субтилизина Карлсберг в присутствии ингибитора Вг-Туг->)Н2, а также несколько партий препаратов на основе химотрипсина и термолизина (табл. 2). Активность полученных биокатализаторов определяли по гидролизу специфичных для каждого фермента окрашенных пептидных субстратов: С1р-Д1а-А1а-Ьеи-рМА (в случае субтилизина), С1р-РЬе-рМА (в случае химотрипсина), Опр-С1у-С1у-Пе-А^ (в случае термолизина).

Содержание белка на носителе в зависимости от условий проведения иммобилизации варьировало в пределах 1.6 — 15 мг/г носителя. Все полученные препараты проявляли достаточно высокую гидролитическую активность, которая сохранялась в течение длительного времени при хранении в водном буфере при +4°С. На рис. 2 приведены данные по стабильности иммобилизованных на криоПВСГ субтилизина и термолизина. Термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ, сохранял не менее 80% первоначальной активности (кривая 1), и этот эффект наблюдался даже через 8 месяцев хранения в водном буфере.

Иммобилизованный субтилизин (кривые 2 и 3) также проявлял достаточно высокую стабильность - даже через 5 месяцев хранения (рис. 2) фермент сохранял более 50% первоначальной активности, в то время как активность нативного субтилизина в этих условиях снижалась до 40% уже через трое суток. Иммобилизованный субтилизин 72 (кривая 2) проявлял более высокую стабильность, чем иммобилизованный субтилизин Карлсберг (кривая 3).

Таблица 2. Характеристики биокатализаторов, полученных в результате иммобилизации препаратов субтилизина, термолизина и химотрипсина на криоПВСГ, активированном ГА

Образец Содержание фермента на носителе, мг/г Активность, мкмоль/мг белка *мин

Субтилизин 72 5.4 0.24

Субтилизин Карлсберг - Вг-Туг-МНг 5.3 0.24

Субтилизин Карлсберг 1.6 0.43

Термолизин 2.6 0.048

11.6 0.043

Химотрипсин 5.7 15.0

14.6 7.1

Рис. 2. Изменение удельной активности термолизина(1),

иммобилизованного на криоПВСГ, при инкубации в 0.05 М Тиб-НС! буфере рН 7.2, 0.05 М СаС12, субтилизина 72 (2) и субтилизина Карлсберг (3), иммобилизованных на криоПВСГ, при инкубации в 0.05 М Тпэ-НС! буфере рН 8.2, 2 мМ СаС12

интерес представляло изучение стабильности иммобилизованных биокатализаторов при инкубации в органических смесях диметилформамид (ДМФ)/ацетонитрил (МеСЫ), соответствующих по своему составу реакционным средам, используемым для проведения ферментативного пептидного синтеза. Ранее при изучении стабильности иммобилизованного субтилизина при хранении в МсСК и смесях МсСЫ/ДМФ

различного состава было показано, что данный биокатализатор сохраняет до 60% гидролитической активности через 2-3 суток. На рис. 3 приведено изменение удельной активности образцов иммобилизованного термолизина, инкубированных в смесях органических растворителей ДМФ/МеСМ различного состава, не содержащих воды. За 100% активности принимали удельную активность иммобилизованного фермента, измеренную непосредственно после получения.

Рис. 3. Остаточная активность препарата термолизина, иммобилизованного на

криоПВСГ, после инкубации в течение 72 ч в смесях ДМФ/МеСК различного состава

25 40 60 80 95

содержание ДМФ, %

.Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемый препарат обладает достаточно высокой стабильностью при хранении. В течение 3 и 5 суток в среде, содержащей 25% ДМФ, активность препарата не менялась. Инкубация иммобилизованного термолизина в смесях с 40-80% ДМФ приводила к некоторой инактивации биокатализатора, но даже через 10 дней препарат сохранял не менее 60% своей активности. Более резко потеря активности наблюдалась в среде 95% ДМФ/МеСМ, однако и в этом случае биокатализатор сохранял более 40% активности.

Таким образом, иммобилизация ферментов на криоПВСГ приводила к ожидаемому повышению стабильности образцов, предотвращая автолиз при хранении в буфере и денатурацию в смеси полярных органических растворителей.

1.2. Протеиназы, иммобилизованные на криоПВСГ, как катализаторы синтеза пептидов в органической среде с низким содержанием воды

1.2.1. Использование субтгтизина, иммобилизованного на криоПВСГ, в пептидном синтезе

На примере модельной реакции г-А1а-А!а-1,еи-ОСНз + РИе-рИА > г-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рЫА + СНзОН, (1)

катализируемой субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, была изучена синтазная активность биокатализатора в зависимости от состава органических растворителей, концентрации субстратов в реакционной смеси и химической структуры ацилкомпонента. Общая схема реакции представлена ниже:

г-А1а-А1а-Ьеи-ОСН3 + Е [7-А1а-А1а-1_еи-0-Е] 2-Л1а-А1а-Ьеи-РЬе-рМА

Реакции проводили при эквимолярном соотношении парциальной концентрации амино- и карбоксильного компонентов, а соотношение фермент-субстрат варьировалось от 1:6000 до 1:31000 (здесь, и далее моль/моль). За ходом реакции следили с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ.

Зависимость эффективности синтеза от состава смеси органических растворителей была изучена на примере синтеза модельного тетрапептида (реакция 1) в смесях ДМФ/МеСЫ с концентрацией ДМФ от 60 до 95%. Наибольшая скорость реакции образования 2-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рК'А наблюдалась в системе, содержащей 60% ДМФ (рис. 4). Уже через 1 час выход целевого продукта составил 96%. Увеличение концентрации ДМФ приводило к снижению скорости накопления продукта, однако даже в 95% ДМФ синтез продукта не прекращался и через трое суток выход г-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-рКА составил 70%.

Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что соотношение ДМФ/МеСИ, равное 60:40 об.%, является оптимальным и для активности биокатализатора, и для растворимости исходных соединений.

н2о

Х-А 1а-А1а-1,еи-ОН

1

Рис. 4. Синтез г-А1а-А1а-Ьеи-РЬе-р^,

100

30-¡/ .

катализируемый субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, в смесях ДМФ/МеСМ с различным содержанием ДМФ. (I - 60% ДМФ; 2 - 80% ДМФ; 3 - 95% ДМФ), И = 200 мМ. 5:Е = 1:31000

о 4—■—I—■—| ■ ■,—.—|—.—,—.—I—.—т—.—, О 10 20 30 40 50 60 70 80

Время, ч

Па рис. 5 представлены результаты изучения зависимости эффективности синтеза модельного тетрапептида (1) от начальной концентрации реагентов в среде 60% ДМФ/40% МеСК (об.%). Видно, что чем выше были концентрации исходных реагентов, тем выше была и скорость образования продукта. Таким образом, для наиболее эффективного проведения синтезов желательно использовать максимально высокие концентрации исходных реагентов (подразумевается, что максимально высокие концентрации ограничены растворимостью субстратов).

Рис. 5. Зависимость выхода Х-Ма-А1а-Ьеи-РЬе-рКА от времени реакции, катализируемой

субтилизином,

иммобилизованным на криоПВСГ, в смеси, содержащей 60% ДМФ и 40% МеСК

► ЗОмМ я 10 мМ . 2 мМ Х0.5мМ «ЮОмМ • 200 тМ

На примере синтеза модельного тетрапептида (реакция 1), катализируемого субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, была изучена необходимость активации карбоксильного компонента. Оказалось, что при введении в реакцию компонента со свободной карбоксильной группой 7-А1а-А1а-РКе-ОН синтез в целом протекает менее эффективно, чем при использовании его эфирного аналога (рис. 6).

Для проверки стереоспецифичности ферментативного синтеза, катализируемого субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, были проведены рёакции, аналогичные модельной, с использованием амино- и ацилкомпонентов, содержащих в Р| и Р1'-положении остатки О-аминокислот вместо соответствующих Ь-аминокислот. Даже через 3 суток с п-нитроанилидом О-аминокислоты не было отмечено появление продукта реакции, что свидетельствовало о сохранении ферментом стереоселективности.

ацилком понента

Рис. 6. Влияние структуры

на

70 -* 60 • I 50

эффективность синтеза 2-А1а-А1а-Ьеи-Р[1е-рМА, катализируемго субтилизином,

иммобилизованным

не

криоПВСГ, в смеси, содержащей 60% ДМФ и 40% \1eCN, [Б] = 200 мМ

0

20

40 60

1, мин

80

100

В условиях, подобранных для модельной реакции, с помощью иммобилизованного субтилизина с достаточно высокими выходами был синтезирован ряд ди- и трипептидов (табл. 3). Реакции проводили при начальной концентрации исходных реагентов 100 мМ и в ряде случаев 200 мМ.

На примере синтезов пептидов 1-4 было изучено влияние длины ацилирующего компонента на скорость образования продукта реакции. Показано, что длина ацилкочпонента даже в условиях высоких концентраций субстрата оказывала заметное влияние на эффективность синтеза. Так, аналитический выход защищенного дипептида 2-Ьеи-РЬе-рЫА (2) через 19 ч составил 76%, а защищенного трипептида г-А1а-Ьеи-РНе-рКА (4) уже через 0.5 ч - 98%. Известно, что в водной среде более длинные пептидные фрагменты легче конденсируются под действием субтилизина, что хорошо согласуется с представлениями о протяженной зоне связывания этих ферментов. В случае использования субтилизина, иммобилизованного на криогеле ПВС, сохраняются те же закономерности.

Одним из преимуществ ферментативного пептидного синтеза является отсутствие необходимости защиты боковых функциональных групп пептидов, содержащих полифункционачьные аминокислоты. В этом случае появляется возможность снизить не только количество стадий, но и избежать опасности рацемизации при каждом шаге блокирования или снятия защиты.

Ю

Таблица 3. Выходы пептидов, синтезированных с помощью субтилизина, иммобилизованного на криоПВСГ

Карбоксильный компонент Амино-компонент Продукт реакции Время, ч Выход, %

Z-Leu-OCHj Phe-pNA 1 Z-Leu-Phe-pNA 19 76

Boc-Leu-OCam* Phe-pNA 2 Boc-Leu-Phe-pNA 0.5 98

Z-AIa-Leu-ОСНз Phe-pNA 3 Z-Ala-Leu-Phe-pNA 2 100

Z-Ala-Ala-OCHj Leu-pNA 4 Z-Ala-Ala-Leu-pNA 2 94

Z-Ala-Ala-Leu-OCHj Phe-pNA 5 Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA 1 98

Z-Ala-Ala-D-Leu-ОСНз Phe-pNA 6 Z-Ala-Ala-D-Leu-Ph&pNA 72 0

Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз D-Phe-pNA 7 Z-Ala-Ala-Leu-D-Phe-pNA 72 0

Z-Ala-A(a-Arg-OH Phe-pNA 8 Z-AIa-AIa-Arg-Phe-pNA 24 26

Z-Ala-Ala-Arg-ОСНз Phe-pNA 8 Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 24 82

Z-Ala-Ala-Arg-ОСНз Glu-pNA 9 Z-Ala-Ala-Arg-Glu-pNA 24 70

Z-Ala-Ala-Arg-OCHj Asp-pNA 10 Z-Ala-Ala-Arg-Asp-pNA 24 34

Z-Thr-Ala-Thr-ОСНз Asp-pNA 11 Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 1 98

Z-A la-A la-GIy-ОСНз Phe-pNA 12 Z-Ala-AIa-GIy-Phe-pNA 2 56

Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз Gly-pNA 13 Z-Ala-Ala-Leu-Gly-pNA 24 70

Z-Ala-Ala-Gly-OCH] Gly-pNA 14 Z-Ala-Ala-Gly-Gly-pNA 2 63

Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз Phe-ОСНз 15 Z-Aia-AIa-Leu-Phe-ОСНз 72 0

Z-Ala-Ala-Leu-OCHj Phe-NHj 16 Z-Ala-Ala-Leu-Phe-NH2 24 62

GIp-Phe-OMe Ala-pNA 17 Glp-Phe-Ala-pNA 24 95"

GIp-Phe-OMe Gly-pNA 18 G!p-Phe-Gly-pNA 24 100™

Boc-Ala-Glu-Phe-OCam" Phe-DeD4** 19 Boc-Ala-Glu-Phe-Phe-DeD 2 15

Boc-AlaGlu-Phe-OCam" Phe-pNA 20 BooAla-Glu-Phe-Phe-pNA 2 88

Z-Ala-AIa-Glu-ОСНз Phe-Phe-DeD*™ 21 Z-Ala-AWjlu-Phe-Plie-DeD 24 20

" - Cam - карбамоилметил, -CH1-CO-NH2

т - реакцию проводили при соотношении ДМФ/MeCN 20:S0 об.% - DeD - 1Ч-[2-(2,4-динитрофениламино)-этил]-амид Условия: 200 мМ амино- и карбоксильный компонент, ДМФ/ МеСЫ 60:40 об.%, E:S =1:104

И

Ранее было показано, что при использовании иммобилизованного субтилизина в органической среде с минимальным содержанием воды можно эффективно синтезировать N-ацилированные тетрапептиды, содержащие Lys и остатки Asp и Glu в Р< и Р('-положениях без защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот. Реакции проводили без активации карбоксильного компонента.

Нами был проведен ряд синтезов тетрапептидов 8-10, содержащих Arg в Pi-положении (табл. 3). Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA синтезировали, используя в качестве карбоксильного компонента трипептид Z-Ala-AIa-Arg-OH и его эфирный аналог - Z-Ala-Ala-Arg-OMe. Выход продукта реакции через сутки в первом случае составил 26%, в то время как использование Z-Ala-AIa-Arg-OMe позволило повысить выход целевого пептида до 82%.

Под действием иммобилизованного субтилизина удалось осуществить синтез тетрапептидов 9 и 10, содержащих в Pi ' и Pi'-положении разноименно заряженные аминокислотные остатки Arg, Glu и Asp. Выход продуктов 9 и 10 через сутки составил 87% и 34% соответственно. Возможность протекания такого синтеза можно объяснить спецификой биокаталитической системы. При работе в безводной органической среде, вероятно, отсутствуют условия для ионизации и, как следствие этого, электронейтральные гидрофобные аминокислотные остатки хорошо связываются в активном центре субтилизина.

Были проведены синтезы тетрапептидов 12-14, содержащих Gly в Р| и Р|'-положении. Реакции с участием пептидов, содержащих Gly в Р]'-положении, протекали быстрее, чем реакции синтеза пептидов, содержащих Gly в Pi-положении. Например, выход Z-Ala-Ala-Gly-Phe-pNA (12) за 2 часа составил 56%, a Z-Ala-Ala-Leu-Gly-pNA (13) за это же время - 70%. При попытке синтезировать пептид, содержащий Pro в Pi'-положении, с помощью иммобилизованного субтилизина даже через 3 суток после начала реакции не наблюдалось образования продукта ферментативного синтеза.

Было показано, что субтилизин, иммобилизованный на криоПВСГ, способен катализировать конденсацию пептида с амидом аминокислоты с образованием пептида 16, в то время как конденсацию аналогичного пептида с эфиром аминокислоты осуществить не удалось (15).

При проведении синтезов пептидов 19-21 оказалось, что при использовании в качестве аминокомпонентов сильно гидрофобных и стерически объемных Phe-DeD и Phe-Phe-DeD реакция протекает менее эффективно, чем при использовании Phe-pNA (табл. 3).

Таким образом, при помощи субтилизина, иммобилизованного на криогеле ПВС, в смеси ДМФ/МеСМ проведен синтез ряда л-нитроанилидов ди-, три- и тетрапептидов, в том числе содержащих основные и кислые аминокислотные остатки без защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот. Установлено, что использование активированных карбоксильных компонентов способствует более быстрому образованию продукта конденсации. Проведенные исследования указывают на то, что субгилизин, иммобилизованный на криогеле ПВС, является эффективным катализатором образования пептидной связи между аминокислотными остатками различной природы, причем стереоселективность синтеза в исследованных условиях сохраняется.

1.2.2. Использование термолизина, илшобилизованного на криоПВСГ, в пептидном синтезе

Исходя из данных о субстратной специфичности термолизина, синтазные свойства этого фермента, иммобилизованного на криоПВСГ, были изучены на примере модельной реакции синтеза хромогенного субстрата сериновых протеиназ 2-А1а-А1а-Г,еи-р№А в средах полярных органических растворителей ДМФ/МеСМ и диметилсульфоксид (ДМСОУМеСМ:

„ . , ___ . иммобилиз. термолизин . „ , . .

г-А1а-А1а-ОН + [хи-р^А ^ — — " -> 7,-Л!а-А1а-1_еи-рКЛ (2).

Зависимость эффективности образования продукта реакции от количества биокатализатора представлена на рис. 7. На основании полученных данных было установлено, что приемлемым содержанием фермента в реакционной смеси для проведения дальнейших экспериментов является 1.4 нмоль при соотношение фермент-субстрат 1:9000.

Для выбора необходимой оптимальной концентрации субстратов был проведен ряд синтезов с одинаковым количеством препарата иммобилизованного фермента и различным содержанием исходных реагентов в реакционной смеси. На рис. 8 представлены результаты синтеза через 24 ч. Видно, что при увеличении концентрации исходных компонентов до 30 мМ скорость синтеза резко возрастает, а, начиная с 40 мМ - практически не изменяется.

Для определения условий наиболее эффективного использования препарата в синтезе пептидов была проведена оптимизация соотношения органических растворителей в реакционной смеси. Для этого была изучена синтазная активность препарата иммобилизованного термолизина в двух типах систем органических растворителей, ДМФ/'МеСЫ и ДMCO/MeCN и изучено влияние количеств ДМФ и ДМСО в реакционной смеси на выход образующегося продукта.

Рис. 7. Зависимость выхода '¿-А\а-Ala-Leu-pNA от количества термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ, через I ч после начала реакции в смеси, содержащей 25% ДМФ и 75% МеСЫ, [8] = 40 мМ

Рис. 8. Зависимость выхода 2-А1а-А1а-Ьеи-рЫА от концентрации исходных компонентов в смеси 25%ДМФ/75%МеСМ через 24 ч

И.мМ

В смесях ДМФ/МсСК и ДМСО/ МеСМ, содержащих от 10 до 95% ДМФ и ДМСО, были проведены синтезы пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA (реакция 2) (рис. 9а, б). Показано, что увеличение концентрации ДМФ и ДМСО в реакционной смеси, как и ожидалось, приводило к снижению активности биокатализатора, а наиболее приемлемыми для использования являются смеси, содержащие 10-30% ДМФ и 10-40% ДМСО. Вместе с тем, для достаточно надёжного растворения продукта и исходных веществ в объёме реакционной среды количество диметилформамида должно быть не слишком малым. Поэтому для дальнейших экспериментов было решено использовать смесь, содержащую 20 об.% ДМФ.

Термодинамически контролируемый пептидный синтез, катализируемый термолизином, является процессом, обратным гидролитической реакции, а вода непосредственно участвует в механизме катализа реакций гидролиза. Поэтому для выбора условий наиболее эффективного использования препарата было необходимо определить концентрацию воды в реакционной смеси, при которой достигается наибольшая скорость синтеза, а продукт и исходные вещества полностью растворимы в реакционной среде.

2 3 4 5 6 7 количество фермента, кмоль

а)

20 40 60 80 содержание ДМФ, об. %

0-----

о

б)

20 40 60 80 100 содерж. ДМСО, об.%

Рис. 9. Зависимость выхода Л-Л!а-А1а-Ьеи-рХА от содержания ДМФ (а) и ДМСО (б) в реакционной смеси через 1ч после начала реакции

Для этого в системах 20%ДМФ/МеСЫ была изучена зависимость выхода продукта реакции (2)

от содержания воды в реакционной смеси (рис. 10). Было показано, что количество воды,

соответствующее 10-15 об. %, является необходимым для проявления наибольшей

каталитической активности препарата иммобилизованного термолизина.

Рис. 10. Зависимость выхода г-А1а-А1а-11еи-рЛЧА от концентрации воды, добавленной в реакционную смесь, через 2 и 24 часа (системы 20% ДМФ/НгО/МеСМ)

5 10 15 20 25 содерж. HjO, об.%

При помощи термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ, в выявленных оптимальных условиях был получен ряд пептидов с общей формулой Z-Ala-Ala-Xaa-pNA, где Хаа = lie, Phe, Val, Ala (22-25). Специфичность термолизина в реакциях гидролиза такова, что фермент преимущественно расщепляет пептидные связи перед остатками Leu, [le, Phe или Val. Данные, приведенные в табл. 4, свидетельствуют о том, что иммобилизованный термолизин наиболее эффективно катализирует образование пептидной связи в органической среде именно с теми остатками (Leu, lie, Phe и Val), которые соответствуют его субстратной специфичности в реакциях гидролиза. Следует отметить, что термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ,

практически не катализировал синтез пептидов, содержащих"дикарбоновые аминокислоты, а также остатки Gly и Pro в Pi'- положении.

На основании полученных данных можно выдвинуть предположение, что термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ, преимущественно сохраняет первичную субстратную специфичность в реакциях ферментативного синтеза в органической среде.

Ввиду отсутствия у термолизина эстеразной активности, стало возможным осуществить • конденсацию N-зашищенного дипептида с эфирами и амидом аминокислоты (табл. 4, 26-28), причем в случае использования Leu-NH2 в качестве аминокомпонента, реакция протекала наиболее эффективно.

Таблица 4. Пептиды, синтезированные с помощью термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ

Карбоксильный компонент Амино-компонент Продукт реакции Время,ч Выход, %

Z-Ala-Ala-OH Leu-pNA 4 Z-Ala-Ala-Leu-pNA 24 91

Z-Ala-Ala-OH Phe-pNA 22 Z-Ala-Ata-Phe-pNA 24 73

Z-Ala-Ala-OH Val-pNA 23 Z-Ala-Ala-Val-pNA 24 80

Z-Ala-Ala-OH Ile-pNA 24 Z-Ala-Ala-lle-pNA 24 82

Z-Ala-Ala-OH Ala-pNA 25 Z-Ala-Ala-Ala-pNA 24 30

Z-Ala-Ala-OH Leu-OCHj 26 Z-Ala-Ala-Leu-OCHj 24 33

Z-Asp-OH Phe-ОСНз 27 Z-Asp-Phe-ОСНз 48 49*

Z-Ala-Ala-OH Leu-NH2 28 Z-Ala-Ala-Leu-NH2 24 100

Z-AIa-AIa-OH Pro-pNA 29 Z-Ala-Ala-Pro-pNA 72 0

Z-Ala-Ala-OH Gly-pNA 30 Z-Ala-Ala-Gly-pNA 72 0

Z-Ala-Ala-OH Asp-pNA 31 Z-Ala-Ala-Asp-pNA 72 0

Z-Ala-Ala-OH Glu-pNA 32 Z-Ala-AIa-Glu-pNA 72 0

* - Реакцию проводили в трет-бутаноле, содержащем 5% Н20.

Условия реакций: 20% ДМФ/Ю%Н20/МеСК (об.%), [Э] = 40-90 мМ, +20°С.

1.2.3. Изучение эффективности повторного использования протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ, в пептидном синтезе

Синтазная эффективность термолизина, иммобилизованного на крио ПВСГ, была изучена в последовательных циклах синтеза модельного пептида 2-А1а-А1а-Ьеи-рЫА под

действием одного и того же образца биокатализатора без его промежуточной реактивации (рис. На). Было показано, что наибольшую каталитическую активность, определяемую по выходу г-А1а-А1а-Ьеи-рЫА, препарат проявлял 8 течение первых 2 циклов (выходы за 2 часа достигали 87 и 85% соответственно). Затем выходы снижались и в дальнейшем практически не изменялись, оставаясь достаточно высокими даже после шестикратного применения биокатализатора (72% за 2 часа).

Для изучения каталитических свойств иммобилизованного химотрипсина при его повторном применении в среде 20%ДMФ/MeCN были проведены последовательные циклы синтеза хромогенного пептидного субстрата цистеиновых протеиназ - С1р-РЬе-А1а-рМА (реакция 3) с одним и тем же образцом иммобилизованного биокатализатора без его промежуточной регидратации (рис. 116):

СТр-РЬе-ОМе + А1а-р^ "■> С1р-РИе-А1а-рКА + МеОН (3), где в!р - остаток пироглутаминовой кислоты.

юо...............—

< 40 N

i 20

100 -

S0 -

<

7

U. < 60 -

о.

О 40 -

X

m 20 -

3 4 номер цикла

б)

3 4

номер цикла

Рис. 11. Выход пептидов Z-AJa-AJa-Leu-pNA в смеси 20% ДМФ/10%H;0/MeCN (а) и Glp-Phe-Ala-pNA в 20% ДМФ/MeCN (б) в последовательных циклах синтеза, катализируемого одним и тем же образцом иммобилизованного термолизина (а) и химотрипсина (б), без промежуточной регидратации биокатализатора между циклами.

Иммобилизованный химотрипсин, так же как и иммобилизованный термолизин, эффективно катализировал реакцию пептидной конденсации даже после 6-кратного использования.

1.2.4. Синтез хромогенных и флуорогениых субстратов под действием протеиназ, чшюбилчзованныхла кргюПВСГ, в органической среде

Возможности изученной биокаталитической системы были продемонстрированы на примере препаративных синтезов ряда хромогенных (и-нитроанилидных, -pNA) пептидных

субстратов сериновых и цистеиновых протеиназ (табл. 5); Иммобилизованные ферменты использовали на заключительной стадии синтеза субстратов, согласно общей схеме:

Z-(Glp-)A + B-pNA > Z-(Glp-)A-B-pNA,

где А - Ala-Ala-OH, Ala-Ala-OMe, Phe-OMe, Thr-Ala-Thr-OMe; В - Leu, Ala, Asp.

С использованием именно этого подхода впервые в препаративных количествах был получен чувствительный и специфичный флуорогенный субстрат папаина - GIp-Phe-Ala-AMC, в состав которого входит остаток 4-амино-7-метилкумарина (флуорогенная группа).

Таблица 5. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов под действием протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ___

Субстрат Выход*, . % Иммобилизованный на криоПВСГ фермент Определяемый фермент

Z-A!a-Ala-Leu-pNA 100(74) Субтилизин Субтилизин

99(71) Термолизин Субтилизин

GIp-Phe-Ala-pNA 95 Субтилизин Папаин

88 Химотрипсин Папай н

Glp-Phe-Ala-AMC 100(46) Химотрипсин Папаин

Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 75 Субтилизин Каспазоподобная протеиназа

* - В скобках приведен препаративный выход пептида.

Реакции проводили с эквимолярными количествами исходных реагентов и соотношении фермент-субстрат 1:104. Использование ферментов на стадии конденсации обеспечивало получение продуктов с высокими выходами, гарантировало их оптическую чистоту, облегчало выделение и очистку целевых пептидов. Все продукты охарактеризованы данными ВЭЖХ и аминокислотного анализа, а некоторые субстраты - масс-спектрометрически.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы препараты трипсина, термолизина, химотрипсина и субтилизина, иммобилизованных на криогеле ПВС.

2. Показана возможность использования полученных препаратов в качестве эффективных катализаторов синтеза пептидов в органической среде. Изучена каталитическая эффективность иммобилизованных субтилизина и термолизина в пептидном синтезе в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных протеиназ с высокими выходами получены ди-. три- и тетрапептиды разного строения.

3. На основании исследования биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов установлено, что в органической среде для иммобилизованного субтилизина наблюдается «расширение» субстратной специфичности, в то время как иммобилизованный термолизин сохраняет свою субстратную специфичность.

4. Показана возможность многократного использования одного и того же образца иммобилизованных термолизина и химотрипсина в синтезах различных пептидов в органической среде без регидратации биокатализаторов в течение, по крайней мере, б циклов.

5. Разработана схема синтеза хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ в препаративных количествах под действием иммобилизованных ферментов.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. A.B. Бачева, О.В. Байбак, A.B. Беляева. E.H. Лысогорская, Е.С. Оксенойт, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Нативный и модифицированный субтилизии 72 как катализатор пептидного синтеза в средах с низким содержанием воды. - Биоорг. химия. Т.29. N 5.2003. С.551-558.

2. A.B. Бачева, О.В. Байбак, A.B. Беляева. Е.С. Оксенойт, Т.Н. Величко, E.H. Лысогорская, А.К. Гладилин, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Активность и стабильность натиеного и модифицированного субтилизинов. - Биохимия, Т.68. N 11. 2003. С.] 5671574.

3. А.У. Belvaeva. E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.l. Lozinsky and I.Yu. Filippova Optimization of synthesis of various peptides catalyzed by immobilized subtilisin 72. - Proc. of the 28 European Peptide Symposium (Flegel, Fridkin, Gilon and Slaninova) Kenes International, Tel-Aviv, Israel, 2005, pp. 315-316.

4. A.V. Bacheva, A.V. Belvaeva. E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.l. Lozinsky and I.Yu. Filippova. Biocatalytic properties of native and immobilized subtilisin 72 in aqueous-organic and low water media. -J. Mol. Cat. B: Enzymatic. V.32. 2005. P.253-260.

5. A.B. Беляева. A.B. Бачева, Е.С. Оксенойт, E.H. Лысогорская, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Синтез пептидов в органической среде при использовании субтилизина 72, иммобилизованного накриогеле ПВС. Биоорг. химия, Т.31, N6, 2005. С.586-592.

6. A.B. Бачева, О.В. Байбак, A.B. Беляева. E.H. Лысогорская, Е.С. Оксенойт, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Синтез пептидов в органической среде, катализируемый субтилизином, иммобилизованным на криогеле ПВС. V симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, ИБХ РАН. 2002. С. 113.

7. A.V. Bacheva, A.V. Belvaeva. S.V. Krylov, O.V. Baibak, H.N. Lysogorskaya, B.S. Oksenoit, V.I. Losinsky, I.Yu. Filippova. Subtilisin covalently immobilized on PVA-cryogel: characteristics and biocatalytic properties. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals and Application". Moscow, 2002. P.68.

8. A.B. Беляева. A.B. Бачева. Каталитические свойства субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС. - Международная конференция молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». Тверь, 2002 г. С.8.

9. А.В. Беляева. О.М. Аникина. Кинетические характеристики субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС. - Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов», секция «Химия», Москва, МГУ, 2003 г. С. 102.

10. И.Ю. Филиппова, Е.Н, Лысогорская, А.В. Бачева, А.В. Беляева. Е.С. Оксенойт, Т. В. Рослякова, В.И. Лозинский. Синтез пептидов, катализируемый протеиназами, иммобилизованными на криогеле ПВС. - Тезисы докладов I Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва, 2003. С.5.

11. А.У. Belvaeva. E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.l. Lozinsky, and I.Yu. Filippova. Optimization of synthesis of various peptides catalyzed by immobilized subtilisin 72. -Abstracts of 3rd International and 28й1 European Peptide Symposium. 2004. P.76.

12. A.B. Беляева. Е.С. Оксенойт, Е.Н. Лысогорская, О.М. Аникина, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Синтез пептидов, содержащих полифункциональные аминокислоты. Тезисы докладов II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 2005. С. 18.

13. A.V. Belvaeva. T.V. Roslyakova, E.S. Oksenoit, E.N. Lysogorskaya, V.I. Lozinsky, and I.Yu. Filippova. Novel biocatalysts based on proteases immobilized on macroporous poly(vinyl alcohol) cryogel. 3rd Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development". Moscow, 2005. Congress proceedings, part 2. P. 182.

14. O.M. Anikina, A.V. Belvaeva. E.N. Lysogorskaya, and I.Yu. Filippova. Modified subtilisin Carlsberg is effective catalyst for peptide synthesis in organic mixtures. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals and Application", St.Petersburg-Kizhiy-Valaame, 2005. P.62.

15. A.V. Belvaeva. T.A. Semashko, E.N. Lysogorskaya, V.I. Lozinsky, and I.Yu. Filippova. Enzymatic synthesis of high specific substrate for cysteine proteases assay. Abstracts of 29lh European Peptide Symposium. Gdansk, 2006. P. 163.

Подписано в печать ОЯ. 200йгода. Заказ № Формат 60x90/,6. Усл. печ. л. . Тираж /2О экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Модифицированные протеиназы как катализаторы синтеза пептидов в органической среде (обзор литературы)

1.1. Механизм катализа пептидного синтеза протеиназами

1.1.1. Механизм катализа пептидного синтеза металлопротеиназами 11 на примере термолизина

1.1.2. Механизм катализа пептидного синтеза сериновыми 14 протеиназами

1.2. Влияние различных факторов на синтазную активность 15 ферментов

1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными 17 протеиназами

1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными 17 протеиназами

1.3.1.1. Нековалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе 18 пептидов

1.3.1.2. Ковалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе 27 пептидов

1.3.1.3. Протеиназы, модифицированные альтернативными 36 способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде

1.3.2. Влияние содержания воды в реакционной среде на 42 эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифицированными протеиназами

1.3.3. Субстратная специфичность нативных и модифицированных 45 протеиназ в пептидном синтезе в органической среде

1.3.3.1. Субстратная специфичность металлопротеиназ в реакциях 46 пептидного синтеза на примере термолизина

1.3.3.2. Субстратная специфичность сериновых протеиназ в реакциях 48 пептидного синтеза в органической среде

Синтез пептидов, катализируемый протеипазами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратной оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалентная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе из-за опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе.

Мы предлагаем новые биокатализаторы на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта. Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта, как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

1. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ КАК КАТАЛИЗАТОРЫ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ В ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

При определенных условиях протеиназы могут выступать как катализаторы образования пептидной связи. Для этого используют большинство коммерчески доступных сериновых, металло-, аспартильных эндо- и экзопептидаз [1]. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и увеличивается растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает негативное воздействие на каталитическую функцию ферментов, приводя к их инактивации [2].

Одной из причин ингибирования фермента в органическом растворителе является прямой контакт растворителя с биокатализатором. Следствием такого контакта является нарушение гидратной оболочки фермента, а также изменение состояния ионизации полярных групп на поверхности фермента (по сравнению с водной средой), что может приводить к частичному изменению его структуры. Существенную роль в стабилизации ферментов играет вода, а также факторы, вызывающие влияние на степень гидратации ферментов. Для понижения инактивации ферментов в среде органических растворителей применяют различные подходы: добавление солей, введение краун-эфиров при лиофилизации, ковалентную и нековалентпую иммобилизацию на различных инертных носителях, образование нековалентных комплексов с ПАВ [3-9].

Наиболее эффективным способом стабилизации протеиназ в неводных средах является их модификация [3]. В данном литературном обзоре будут рассмотрены сведения о поведении и возможности использования модифицированных протеиназ различных классов - сериновых и металлопротеиназ, в частности, термолизина, в качестве катализаторов синтеза пептидов. Основное внимание будет уделено ферментам, иммобилизованным на нерастворимых подложках, а также протеиназам, ковалентно или нековалентно модифицированным «сшивающими» или полимерными реагентами.

выводы

1. Получены и охарактеризованы препараты трипсина, термолизина, химотрипсина и субтилизина, иммобилизованных на криогеле ПВС.

2. Показана возможность использования полученных препаратов в качестве эффективных катализаторов синтеза пептидов в органической среде. Изучена каталитическая эффективность иммобилизованных субтилизина и термолизина в пептидном синтезе в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных протеиназ с высокими выходами получены ди-, три- и тетрапептиды разного строения.

3. На основании исследования биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов установлено, что в органической среде для иммобилизованного субтилизина наблюдается «расширение» субстратной специфичности, в то время как иммобилизованный термолизин сохраняет свою субстратную специфичность.

4. Показана возможность многократного использования одного и того же образца иммобилизованных термолизина и химотрипсина в синтезах различных пептидов в органической среде без регидратации биокатализаторов в течение, по крайней мере, 6 циклов.

5. Разработана схема синтеза хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ в препаративных количествах под действием иммобилизованных ферментов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен руководителям работы Ирине Юрьевне Филипповой и Елене Николаевне Лысогорской за ценные советы в ходе выполнения работы и огромную моральную поддержку во время ее написания. Автор также признателен руководителю со стороны ИНЭОС РАН Владимиру Иосифовичу Лозинскому за советы по выполнению экспериментов и написанию работы. Автор особенно благодарен Е. С. Оксенойт за синтез отдельных исходных соединений. Автор чрезвычайно признателен отделу хроматографии НИИ ФХБ им. Белозерского в лице Л. А. Баратовой, Н. В. Федоровой, А. Л. Ксенофонтова и А. В. Тимофеевой за помощь в изучении структуры синтезированных пептидов и анализе хроматографических данных. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность А. В. Бачевой за помощь в поиске литературы и ценные советы по написанию работы, Т. А. Семашко, 10. А. Смирновой и О. А. Аникиной за помощь в выполнении отдельных экспериментов и моральную поддержку в ходе написания работы, а также всем сотрудникам лаборатории химии белка Химического факультета МГУ и Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН за внимание и полезные советы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как следует из литературного обзора, как ковалентно, так и нековалентно модифицированные ферменты могут обладать достаточно высокой эффективностью в синтезе, в связи с чем решающим фактором выбора биокатализатора для пептидного синтеза в органической среде является высокая технологичность, связанная с легкостью о тделения продукта реакции и регенерации катализатора, а также отсутствием диффузионных ограничений. Все эти качества удачно сочетает в себе метод ковалентной иммобилизации на макропористых носителях [101]. В основном, за активностью полученных биокатализаторов следят по реакциям гидролиза и переэтерификации, данных же по использованию иммобилизованных протеиназ в синтезе меньше.

В литературе описаны случаи «расширения» субстратной специфичности модифицированных протеиназ при использовании их в качестве катализаторов пептидного синтеза в органических средах, в то время как субстратная специфичность термолизина в органической среде преимущественно сохраняется.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как следует из литературного обзора, ковалентно иммобилизованные протеиназы, по-видимому, являются наиболее удобными катализаторами для проведения синтеза пептидов в органической среде. Целью настоящей работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (криоПВСГ), как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

В работе решались следующие задачи:

1. Получение и характеристика препаратов трипсина, субтилизина, термолизина и химотрипсина, иммобилизованных на криоПВСГ;

2. Выявление оптимальных условий протекания реакции пептидообразования, катализируемого данными биокатализаторами;

3. Изучение биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов в реакциях пептидного синтеза;

4. Синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ с использованием ферментов, иммобилизованных на криоПВСГ.

2.1. Получение и характеристика биокатализаторов на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта

2.1.1. Выбор протеиназ для иммобилизации

Для иммобилизации были использованы ферменты различных классов -трипсин, химотрипсин и микробные ферменты субтилизин и термолизин. Химотрипсин, трипсин и субтилизин принадлежат к классу сериновых протеиназ, который получил свое название благодаря присутствию остатка серина в активном центре. Химотрипсин и субтилизин характеризуются стабильностью и широкой субстратной специфичностью. Для трипсина свойственна высокая избирательность, он гидролизует только те пептидные связи, карбонильная группа которых принадлежит аргинину и лизину. Термолизин относится к классу металлопротеиназ и содержит в активном центре ион цинка; этот фермент гидролизует пептидные связи, образованные аминогруппой таких гидрофобных аминокислот, как изолейцин и валин. Выбор этих отличных по своей природе и каталитическому механизму ферментов был связан с их доступностью, стабильностью и высоким синтетическим потенциалом в реакциях пептидной конденсации.

Известно, что для успешного осуществления ковалентной иммобилизации ферментов требуется, чтобы белок образовывал с носителем не менее четырёх-шести ковалентных связей, а соответствующие аминокислотные остатки, участвующие в их образовании, располагались как можно дальше от активного центра белка [102]. Из литературных данных известно [11], что молекулы всех иммобилизуемых ферментов содержат достаточное количество остатков лизина (8-14), причем все они расположены на поверхности глобулы на значительном удалении от активного центра, что позволило провести ковалентное присоединение протеиназ к носителю.

2.1.2. Получение носителей для иммобилизованных ферментов, базирующихся на криогелях поливинилового спирта

В качестве матрицы для ковалентной фиксации ферментов был выбран криоПВСГ. Уникальной особенностью криоПВСГ является его макропористая структура, а также совместимость как с водной, так и с полярной органической средой. Эти свойства носителя обеспечивали возможность иммобилизации на нем крупных молекул ферментов, минимизируя затрудненную диффузию субстрата, а также инактивацию биокатализатора в органической среде [103105].

КриоПВСГ образуется при замораживании, выдерживании в замороженном состоянии и последующем оттаивании с определенной скоростью концентрированного водного раствора данного полимера. При замерзании раствора ПВС сначала кристаллизуется чистый растворитель, а растворенные вещества концентрируются ещё в жидкой части образца [106]. Такие неглубоко замороженные растворы поливинилового спирта представляют собой как минимум двухфазные системы, включающие кристаллическую фазу замороженного растворителя и фазу высококонцентрированного раствора полимера - так называемую незамерзшую жидкую микрофазу (схема 1). Подобное криоконцентрирование существенно усиливает взаимодействия полимер-полимер, что, в конце концов, приводит к образованию устойчивых узлов пространственной сетки криогеля. Поскольку кристаллизация чистого растворителя и концентрирование растворенного вещества протекают в гетерогенной системе, то после её оттаивания получается гетерогенный гель. В нем под действием кристаллов замерзшего растворителя формируются поры различной величины и геометрии. Таким образом, растворитель играет роль порообразователя. Ярко выраженная гетерогенность, т.е. наличие микро- и макропор, характерна для любых криогелей поливинилового спирта [106, 107]. (в) Исходная снсгсма (Ь) Замороженная (с)Опаявшая система система

5 8

Рис. 4. Образование криогелей. 1) высокомолекулярные гелеобразователи, 2) растворитель, 3) низкомолекулярные гелеобразователи или вещества в растворе, 4) поликристаллы замороженного растворителя, 5) незамерзшая жидкая микрофаза, 6) полимерный каркас криогеля (гелевые стенки макропор), 7) макропоры, 8) растворитель.

В ходе экспериментов был получены образцы криогеля ПВС по стандартной методике [108] и криоПВСГ с диаметром пор, примерно в 10 раз большим (рис. 5 и 6). Для этого при приготовлении раствора ПВС добавляли в него додецилсульфат натрия (SDS) с тем, чтобы конечная концентрация ПАВ составляла 0.75 ККМ; а затем проводили криогрануляцию. В ходе работы использовали криоПВСГ в виде сферических гранул диаметром около 1 мм (рис.

7), полученных с помощью специальной криогрануляционной установки; в случае получения криогеля в присутствии SDS размер гранул составил 0.3-0.8 мм.

Рис. 5. Криогель поливинилового спирта.

Рис. 6. Криогель поливинилового спирта, полученный из раствора ПВС, содержащего SDS.

100 u III

I I

Рис. 7. Гранулы криоПВСГ.

2.1.3. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта Процесс ковалентной иммобилизации белков на криоПВСГ включал две основные стадии: введение реакционноспособных группировок в матрицу носителя (активация криогеля) и присоединение молекул фермента по этим группировкам [109, 110]. Для прививки реакционноспособных группировок к криоПВСГ использовали известные методики химической модификации этого носителя - активацию диальдегидами в кислой среде (схема 7а) и активацию дивинилсульфоном (ДВС) в щелочной среде (схема 76) [111].

ОН

ОН

ОНС-(СН2)з-СНО н

СН(СН2)з-СС п / х и н

H?N —ФЕРМЕНТ

•О.

0^>CH(CH2)3-CH=N -ФЕРМЕНТ б) о

II о н сн2 =сн - сн=сн2 о о

Ln 'I о —сн2-сн2 о

11 2n —фермент

-сн=сн оно о - ch2-ch2-^-ch2-ch2-nh - фермент о fl

II

Схема 7. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем а) альдегидные и б) винилсульфоновые реакционноспособные группировки.

2.1.3.1. Иммобилизация трипсина на криогеле поливинилового спирта

В качестве объекта для отработки методики получения иммобилизованных ферментов был использован трипсин, который является доступной и хорошо охарактеризованной протеиназой.

Активацию криоПВСГ с помощью ДВС проводили по методике [111], но специально исследовалось влияние различных концентраций раствора NaOH (0.05, 0.1, 0.25 и 0.5 М) на результаты реакции носителя с ДВС (схема 76). Было установлено, что все полученные активированные носители плавились при 65°С. В дальнейшей работе при модификации носителя ДВС использовали 0.1 М раствор NaOH, но обработку проводили разными количествами ДВС. Присоединение трипсина к активированной матрице проводили в водном буфере при рН 7.5. Следует заметить, что в результате реакции трипсина с таким производным криоПВСГ образуется стабильная C-N связь, более прочная, чем альдиминная, формирующаяся при реакции белков с матрицей, активированной диальдегидами. Результаты экспериментов по иммобилизации трипсина на гранулах криоПВСГ, модифицированных в среде 0.1 М NaOH разными количествами ДВС, представлены в таблице 3. Видно, что с повышением концентрации активирующего агента возрастали как содержание иммобилизованного белка, так и удельная ферментативная активность препаратов биокатализатора, но после их хранения в течение 25 суток у изначально более активных образцов активность заметно снижалась.

1. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X. and Vulfson E. N. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production. // Enz. Microb. Techn. 1996, 18, 162-183.

2. Gorman L.S., Dordick J. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992,39,392-397.

3. C. O'Fagain. Enzyme stabilization recent experimental progress. // Enz. Microb. Technol. 2003,33,137-149.

4. Sears P., Witte K., Wong C. The effect of counterion, water concentration and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999,6, 297-304.

5. Meyer J., Kendryck В., Matsuura J. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotiypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996,47,177-181.

6. Kendryck В., Meyer J., Matsuura J., Manning M. Hydrophobic ion pairing as a method for enhancing structure and activity of lyophilized subtilisin BPN' suspended in isooctane. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1997, 1, 113118.

7. Wangikar P. P., Michels P. C., Clark D. S., Dordick J. S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 70-76.

8. Okazaki S., Goto M., Furusaki. Surfactant-protease complex as novel biocatalyst for peptide synthesis in hydrophilic organic solvents. // Enz. Microb. Technol. 2000,26,159-164.

9. Pelmenschikov V., Blomberg M.R.A., Siegbahn P.E. M. A theoretical study of the mechanism for peptide hydrolysis by thermolysin. // J. Biol. Inorg. Chem. 2002, 7, 284-298.

10. Cassells J.M., Hailing P.J. Protease-catalyzed peptide synthesis in aqeous-organic two-phase systems: reactant precipitation and interfacial inactivation. // Enz. Microb. Tecnol. 1990,12,755-759.

11. Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on protease-catalyzed peptide synthesis in mainly organic media. // Biomed. Biochim. Acta, 1991, 50, 61-66.

12. Cassells J.M., Hailing P.J. Protease-catalyzed peptide synthesis in low-water organic two-phase systems and problems affecting it. // Biotechnol. Bioeng. 1989, 33,1489-1494.

13. Proteolytic enzymes. A practical approach. Ed. by RJ.Beynon, J.S.Bond // IRL Press, Oxford. 1988,125-143.

14. Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 1987.

15. Wayne S.I., Fruton J.S. Thermolysin-catalyzed peptide bond synthesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80,3241-3244.

16. Oyama K., Kihara K., Nonaka Y. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1981,2, 356-360.

17. Riechmann L., Kasche V. Reaction mechanism, specificity and pH-dependence of peptide synthesis catalyzed by the metalloproteinase thermolysin. // Biochim. Biophys. Acta. 1986, 872,269-276.

18. Степанов B.M. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. А.С. Спирина. Москва. Высшая школа. 1996. с. 220-233.

19. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977,46,331-338.

20. Антонов В. К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С. 135-147.

21. Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996, 68,1335-1339.

22. H.-D. Jakubke. Enzymatic synthesis. // In: Future aspects in peptide chemistry. Ed. by W. Voelter, G. Fisher. Collection. 1999,1,47-67.

23. Ulijn R.V., Erbeldinger M., Hailing P.J. Comparison of methods for thermolysin-catalyzed peptide synthesis including a novel more active catalyst. // Biotechnol. Bioeng. 2000,69,633-638.

24. Cassells J.M., Hailing P.J. Effect of thermodynamic water' activity on Thermolysin-catalysed peptide synthesis in organic two-phase systems. // Enzyme Microb. Technol. 1988,10,486-491.

25. Clapes P., Torres J.-L., Adlercreutz P. Enzymatic peptide synthesis in low-water systems: preparative enzymatic synthesis of Leu.- and [Met]- enkephalin derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1995,3,245-255.

26. Ruiz S., Feliu J.A., Caminal G., Alvaro G., Lopez-Santin J. Reaction engineering for consecutive enzymatic reactions in peptide synthesis: application to the synthesis of a pentapeptide. // Biotecnnol.Prog. 1997, 13,783-787.

27. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysin. // J. Biochem. 1992, 112,335-340.

28. K. Inouye, S.B. Lee, and B. Tonomura. Effect of amino acid residues at the cleavable site of substrates on the remarkable activation of thermolysin by salts. // Biochem. J. 1996,315(1), 133-138.

29. Trusek-Holownia A. Synthesis of Z-Ala-Phe-OMe, the precursor of bitter dipeptide in the two-phase ethyl acetate-water system catalyzed by thermolysin. // J. Biotechnol. 2003, 102,153-163.

30. Березин И.В., Мартинек К.М. Химическая эизимология // Москва. Издательство Московского Университета, 1983.

31. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К.М., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. // Иммобилизованные ферменты. Биотехнология. М.: Высшая школа. 1987.

32. L. Cao. Immobilised enzymes: science or art? // Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9, 217-226.

33. A. Triantafyllou, D. Wang, E. Wehtje, P. Adlercreutz. Polyacrylamides as immobilization supports for use of hydrolytic enzymes in organic media. // Biocat. Biotransform. 1997,15, 185-203.

34. G.-W. Xing, X. Li, G. Tian, Y. Ye. Enzymatic peptide synthesis in organic solvent with different zeolites as immobilization matrixes. // Tetrahedron. 2000, 56, 35173522.

35. M. Yu. Gololobov, V. M. Stepanov, T. L. Voyushina, I. P. Morozova, P. Adlercreutz. Side reactions in enzymatic peptide synthesis in organic media: effects of enzyme, solvent, and substrate concentrations. // Enz. Microb. Technol. 1994,16, 522-528.

36. D. Unen, J. Engbersen, D.N. Reinhoudt. Sol-gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents. // Biotechn. Bioeng. 2001, 75, 154158.

37. Martin M.T., Sinisterra J.V., Heras A. Influence of the modification procedure of support materials on the microenvironment of immobilized a-chymotrypsin. // J. Mol.Cat. 1993,80,127-136.

38. Magnin D., Dumitriu S., Chornet E. Immobilization of enzymes into a polyionic hydrogel: ChitoXan. //J. Bioact. Compat. Pol. 2003,18, 355-373.

39. Miyazawa Т., Hiramatsu М., Murashima Т., Yamada Т. Bacillus licheniformis protease-catalyzed synthesis via kinetically controlled approach using the carbamoylmethyl ester as an acyl donor in anhydrous acetonitrile. // Lett. Pept. Sci. 2002, 9, 173-177.

40. Miyazawa Т., Masaki S., Yanagihara R., Yamada T. Peptide synthesis mediated by Bacillus subtilis protease. // Pept. Sci. 1999: N. Fujii (Ed.), 133-134.

41. Valivety R. H., Hailing P. J., Peilow A. D., Macrae A. R. Relation between water activity and catalytic activity of lipases in organic media. // Eur. J. Biochem. 1994, 222,461-466.

42. Basso A., Martin L., Gardossi L., Linda P. High isolated yields in thermodynamically controlled peptide synthesis in toluene catalyzed by thermolysin adsorbed on Celite R-640. // Chem. Commun. 2000,467-468.

43. M.P. Bemquerer, P. Adlercreutz, M. Tominaga. Pepsin-catalyzed peptide synthesis in organic media: studies with free and immobilized enzyme. // Int. J. Pept. Protein Res. 1994,44,448-456.

44. X. Zhang, X. Wang, S. Chen, X. Fu, X. Wu, C. Li. Protease-catalyzed small peptide synthesis in organic media. // Enz. Microb. Technol. 1996,19, 538-544.

45. Ferreira L., Ramos M.A., Dordick J., Gil M.H. Influence of different silica derivatives in the immobilization and stabilization of a Bacillus licheniformis protease (subtilisin Carlsberg). // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002,21,189-199.

46. C. Mateo, O. Abian, R. Fernandez-Lafuente, J.M. Guisan. Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports byfavoring additional multipoint covalent attachment. // Enz. Microb. Technol. 2000,26,509-515.

47. Kondo A., Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and their application to bioprocesses. // Colloids Surfaces A: Physiochemical and engineering Aspects. 1999,153,435-438.

48. Wang P., Sergeeva M.V., Lim L., Dordick J.S. Biocatalytic plastics as active and stable materials for biotransformations. //Nat. Biotechnol. 1997,15,789-793.

49. S. Novick, J. Dordick. Investigating the effects of polymer chemistry on activity of biocatalytic plastic materials. // Biotechn. Bioeng. 2000, 68,665-671.

50. Y. Kim, J. Dordick, D. Clark. Siloxane-based biocatalytic films and paints for use as reactive coatings. // Biotechn. Bioeng. 2001,72,475-482.

51. G.D. Altun, S.A. Setinus. Immobilization of pepsin on chitosan beads. // Food Chem. 2005,100,964-971.

52. Hinze W. L., Uemasu I., Dai F., Braun J. M. Analytical and related applications of organogels. // Curr. Opinion in Colloid & Interface Science. 1996,1,502-513.

53. G.P. Royer. Immobilized enzyme catalysis. // Catal. Rev.-Sci. Eng., 1980, 22(1), 29-73.

54. P. Lozano, T. De Diego, M.P. Belleville, G.M. Rios, J.L. Iborra. A dynamic membrane reactor with immobilized a-chymotrypsin for continuous kyotorphin synthesis in organic media. // Biotechn. Lett. 2000,22, 771-775.

55. Blanco R.M., Rakels J.L., Guisan J.M., Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on amino-acid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. // Biochim Biophys Acta. 1992,1156,67-70.

56. R. Blanco et al. Immobilization-stabilization of proteases as a tool to improve the industrial design of peptide synthesis. // Biomed. Biochim. Acta. 1991, 50, 110113.

57. Ueno Y., Morihara K. The use of immobilized trypsin for semisynthesis of human insulin. // Biotechnol. Bioeng. 1989,33,126-128.

58. Blanco R. M., Guisan J. M., Hailing P. J. Agarose-chymotrypsin as a catalyst for peptide and amino acid ester synthesis in organic media. // Biotechnol. Lett. 1989, 11,811-816.

59. Kunugi S., Morikawa Y., Kondoh Т., Nomura A. Effect of acylation on peptide synthesis by immobilized thermolysin. // Polymer J. 1988,20,945-947.

60. S.M. Cramer, C. Horvath. Peptide synthesis and deamidation with chemically modified immobilized carboxypeptidase Y. // Enz. Microb. Techn. 1989, 11, 7479.

61. P. Adlercreutz, B. Mattiasson, M. Otamiri. Synthetic polymers as solubilizing vehicles for enzymes in water-poor media. // Bioorg. Med. Chem. 1994, 2, 529533.

62. A. Gladilin et. al. Enzyme-polyelectrolyte noncovalent complexes as catalysts for reactions in binary mixtures of polar organic solvents with water // Biotechn. Lett. 1995,17,1329-1324.

63. E. Kudryashova et. al. Enzyme-polyelectrolyte complexes in water-ethanol mixtures: negatively charged groups artificially introduced into a-chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. // Biotechn. Bioeng. 1997, 55,267-277.

64. A. Vakurov et. al. Peptide synthesis in dimethylformamide-based organic media catalysed by non-covalent chymotrypsin-polyelectrolyte complexes. // Biocatal. Biotrans. 1999,17,283-291.

65. A. Murphy, C. O'Fagain. Stability characteristics of chemically modified soluble trypsin. // J. of Biotechnology. 1996,49,163-171.

66. A. Murphy, C. O'Fagain. Dipeptide synthesis using acetylated trypsin derivative. //Biotechn. Techniques. 1997,11,13-16.

67. A. Murphy, C. O'Fagain. Chemically stabilized trypsin used in dipeptide synthesis. // Biotechn. Bioeng. 1998, 58, 366-373.

68. Ferjancic A., Puigserver A., Gaertner H. Unusual specificity of polyethylene glycol-modified thermolysin in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Biotecnnol. Lett. 1988,10,101-106.

69. Gaertner H., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by polyethylene glycol-modified chymotrypsin in organic solvents. // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1988,3,130-137.

70. Gaertner H., Watanabe Т., Sinisterra J.V., Puigserver A. Peptide synthesis catalyzed by modified a-chymotrypsin in low-water organic media. // J. Org. Chem. 1991,56,3149-3153.

71. Dordick J.S., Khmelnitsky Y.L., Sergeeva M.V. The evolution of biotransformation technologies. // Curr. Opin. Microbiol. 1998,1, 311-8.

72. Novick S. J., Dordick J. S. Preparation of active and stable biocatalytic hydrogels for use in selective transformations. // Chem. Mater. 1998,10, 955-958.

73. P. Wang, S. Dai, S. D. Waezsada, A. Tsao, B. Davison. Enzyme stabilization by covalent binding in nanoporous sol-gel glass for nonaqueous biocatalysis. // Biotechn. Bioeng. 2001, 74,249-255.

74. Partrige J., Hutcheon G., Moore В., Hailing P. Exploiting hydration hysteresis for high activity of cross-linked subtilisin crystals in acetonitrile. // J. Am. Chem. Soc. 1996,118(51), 12873-12877.

75. Y. Ito, H. Fujii, Y. Imanishi. Catalytic peptide synthesis by trypsin modified with polystyrene in chloroform. // Biotechnol. Prog. 1993,9,128-130.

76. Zaks A. In: Biocatalysts for Industry. Dordick J.S. Ed., Plenum: New-York. 1991, 161-180.

77. Hailing P.J. Effect of thermodynamic water activity on protease-catalyzed peptide synthesis in mainly organic media. // Biomed. Biochim. Acta, 1991, 50, 61-66.

78. L. Gardossi. Immobilization of Enzymes and Control of Water Activity in Low-Water Media: Properties and Applications of Celite R-640 (Celite Rods). // Methods in Biotechnology. 2001,15, 151-172.

79. Xing G.-W., Tian G.-L., Ye Y.-H. Influence of reaction conditions on syntheses of sweetener precursors catalyzed by thermolysin in tert-amyl alcohol. // J. Peptide Res. 1998, 52,300-304.

80. Shin J., Kim B. Revisiting the effect of water content on enzymatic peptide synthesis in non-aqueous medium. // Biotechnology Letters. 2002,24,1903-1905.

81. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem. 1988,177,313-318.

82. Schechter I., Berger A. Size of the active site in proteinases. (I) Papain. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967,27,157-162.

83. Kimura Y., Muraya K., Araki Y., Matsuoka H., Nakanishi K., Matsuno R. Synthesis of peptides consisting of essential amino acids by a reactor system using three proteinases and an organic solvent. // Agric. Biol. Chem., 1990, 54, 33313333.

84. Cheng E., Machini de Miranda M.T., Tominaga M. Thermolysin and a-chymotrypsin mediated synthesis of tripeptides containing proline. // Int. J. Peptide Protein Res. 1988,31,116-125.

85. Machini de Miranda M.T., Cheng E., Muradian J., Seidel W.F., Tominaga M. Thermolysin as a catalyst in enzymatic synthesis of asparagine-containing peptides.//Bioorg. Chem. 1986,14, 182-193.

86. Fernandez M.M., Margot A.O., Blanch H.W., Clark D.S. Enzymatic synthesis of peptides containing unnatural amino acids. // Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 964-971

87. Morihara К., Oka T. The complex active sites of bacterial neutral proteases in relation to their specificities. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968, 30, 625630.

88. Gaertner H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989,181,207-213.

89. Watanaba К., Ueji S. Dimethyl sulfoxide-induced high enantioselectivity of subtilisin Carlsberg for hydrolysis of ethyl-2(4-substituted phenoxy)propionates. // Biotecnnol. Lett. 2000,22, 599-603.

90. Adlercreutz P., Clapes P. Catalytic properties of a-chymotrypsin in organic media. // Biomed. Biochem. Acta. 1991,50, 55-60.

91. M.Yu. Gololobov, V.M. Stepanov, T.L. Voyushina, P. Adlercreutz. Organic solvents changes the chymotrypsin specificity with respect to nucleophiles. // FEBS Lett. 1992,307,309-312.

92. A. Alcantara et al. Organic reactions catalyzed by insolubilized enzymes. Part III. Synthesis of peptides, catalyzed by a-chymotrypsin immobilized on graft copolymers. // J. Mol. Cat. A: Chemical. 1995,101,255-265. v.

93. O'Fagain C. Understanding and increasing protein stability. // Biochim. Biophys. Acta. 1995,1252,1-14.

94. В.И. Лозинский. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Усп. Хим. 1998, 67(7), 641-655.

95. В.И.Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Усп. Хим. 2002, 71(6), 559-585.

96. Сергеев Г.Б., Батюк B.A. Криохимия. M.: Наука. 1978.

97. A. c. 2036095 РФ; Бюлл. изобрет. 1995. 15.

98. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов A.JI. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. // Биотехнология. 1995,1-2, 32-37.

99. Гладилин A.K., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998, 63(3), 408-421.

100. Oh Y., Shih I. I., Tzeng Y., Wang S. Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes. // Enz. Microb. Technol. 2000,27(1-2), 3-10.

101. ИЗ. Акпаров B.X., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72 сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизинуКарлсберг. //Биохимия. 1979,44,886-890.

102. Bacheva A.V., Plieva F.M., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Yu., Lozinsky V.I. Peptide synthesis in organic media with subtilisin 72 immobilized on polyvinyl alcohol)-cryogel carrier. // Bioorg.& Med. Chem. Lett. 2001, 11, 10051008.

103. Klein J. U., Prykhodzka A., and Cerovsky V. The applicability of subtilisin Carlsberg in peptide synthesis. // J. Pept. Sci. 2000,6, 541-549.

104. C.R. Wescott, A.M. Klibanov. The solvent dependence of enzyme specificity. //Biochim. et Biophys. Acta. 1994,1206,1-9.

105. Stepanov V. M., Voyushina T. L., Terent'eva E. Yu., Golobov M. Yu. Subtilisin or a-chymotrypsine catalyzed synthesis of peptides containing arginine or lysine p-nitroanilides as C-terminal moieties. // Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 479-485.

106. Voyushina T.L., Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M. The synthesis of chromogenic peptide substrates containing p-nitroanilides of arginine and lysine, catalyzed by proteinases adsorbed on support material. // Biomed. Biochim. Acta. 1991,50,209-212.

107. Milgotina E.I., Shcheglov A.S., Lapa G.B., Chestukhina G.G., Voyushina T.L. Enzymatic synthesis of chromogenic substrates for Glu,Asp-specific proteinases. // J. Pept. Res. 2001, 58,12-16.

108. Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M. Voyushina T.L. Enzymatic synthesis of YIGSR laminine pentapeptide fragment - derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1995,5,2523-2526.

109. Jakubke H.-D., Kuhl. P., Konnecke A. Basic Principles of Protease-Catalyzed Peptide Bond Formation. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1985, 24, 8593.

110. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S. et al. A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. // The plant cell. 2004,16, 157-171.

111. М.Ю. Гололобов, И.П. Морозова, Т.Л. Воюшина, E.A. Тимохина, B.M. Степанов. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991,56,228-240.

112. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // М.: Мир. 1976, с. 443-444.

113. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов // Киев. Наукова Думка. 1992.

114. Erlanger B.F., Kokowsky N., Gohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. // Arch. Biochem. Biophys. 1961, 95(2), 271-278.

115. Люблинская Л. А., Хайду И., Баландина Г. Н., Филиппова И. Ю., Маркарян А. Н., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорг. химия. 1987,13,748-753.