Пепсин в ферментативном синтезе пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Ш,5НЕСК1М ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.344'135

АНИСИМОВА ВЕРОНИКА ВАЛЕРЬЕВНА

ПЕПСИН В ФЕРМЕНТАТИВНОМ СИНТЕЗЕ ПЕПТИДОВ

02.00.10 - Виоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1995

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор В.М.Степанов

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Ю.В.Митин

кандидат химических наук

Т.В.Ротанова

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Ленинские г:ры, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Защита состоится "14" ноября 1995 г. в

Автореферат разослан

?»

октября 1995 г.

Ученый секретарь

\

Специализированного совет?

кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеш. Ферментативный метод образования гтидных связей имеет ряд преимуществ перед химическими: :рео- и региоселектигность, возможность введения в реакции шокислот и пептидов с незащищенными боковыми функциональны™ тагами, проведение реакций в мягких условиях, легкость выделения »дуктов. Использование протеиназ в качестве катализаторов синтеза гаидов позволяет получать физиологически активные соединения, а ;же различные субстраты, применяющиеся при исследовании логических объектов. Более глубокое понимание процессов, исходящих при конденсации пептидов под действием неолитических ферментов и изучение поведения ферментов в ходе ттеза весьма актуально, так как способствует расширению 5можностей данного метода. С другой стороны, использование зтеиназ в пептидном синтезе открывает новые перспективы для гчения свойств самих ферментов.

Целью данной работы является развитие ферментативного пептидного гтеза под действием пепсина в водных растворах органических ;творителей, в органических растворителях с малым содержанием хы и в системах, содержащих денатурирующие агенты - мочевину, фохлорид гуанидина и додецилсульфат натрия. В нашу задачу эдило изучение некоторых закономерностей процессов конденсации, >текающих с участием этого фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. В

дао-органической среде синтезирована серия пептидов с хорошими содами. Изучено поведение пепсина в реакциях конденсации пептидов таких условиях и показано, что при использовании больших пичеств фермента происходит его соосавдение в ходе реакции с разующимся осадком продукта. Показана возможность применения

' распределенного на поверхности неорганического носителя, качестве катализатора образования пептидной связи з органически растворителях, и в зтих условиях получен ряд пептидов различно, длины. Исследована возможность применения пепсина в синтез, гидрофобных октз- и декапептидов в концентрированных раствора мочевины. Показана возможность синтеза пептидов з присутстви других денатурирующих агентов - гидрохлорида гуанидинз з додецилсульфата натрия.

Публикация и апробация работы. Материалы исследования по тем диссертации опубликованы в 6 статьях, а также были представлены н vil Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Москва, 1991) Международной конференции "Протеиназы в пептидном синтезе (Богензее, 1991) и ill Симпозиуме по химии протеолитическг ферментов (Москва, 1993).

Структура и объем работы. Диссертация состоит ' из введения обзора литературы, посвященного специфичности пепсина в реакци* гидролиза и синтеза пептидных связей, обсувдения результатов экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литератур ( ссылки). Диссертация содержит 29 рисунков и ¿2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Протеолитический фермент пепсин довольно редко использовался реакциях конденсации пептидов несмотря -на доступность стабильность, достаточно широкую специфичность. Пепсин мохе принимать участие только в равновесном синтезе пептидной связи Ввиду этого, в отличие от кинетически контролируемых процессоЕ субстратами в реакциях конденсации, катализируемых пепсином, Morj служить только неактивированные производные аминокислот и пептидо! В этом случае роль фермента сводится к ускорению скорост достижения равновесия реакции синтеза-гидролиза пептидной связ!

о

;я смешения равновесия в етсрону сорагсзання пептидного продукта •обходимо его выведение из сферы реакции га счет осакдения иди .■стракцни з другую фазу, либо псннжкне активности зоды в системе ;и проведении реакций в органических' растворителях с очень малым > содержанием. Работа состоит из тред частей: | синтез пептидов в водно-органической среде; ) синтез пептидов в органических растворителях с малым дерганием вода;

) синтез пептидов в системах, ссдернашх денатурируксие агенты.

I. Катализируемый пепсином синтез пептидов в водно-органической

среде

1.1 .Подбор агтикиькых условиг синтеза. 3 качестве модельной дстемы изучалась катализируемая пепсином реакция мехду трипептидами -А1а-А1а-РЬе-0Н и Н-1>еи-А1а-А1а-ССН3 в водно-органической среде:

г-АХа-АХа-РИе-ОН + Н-Ьен-АХа-АХа-ОСН,

-' I

| -гепсмн

г-А1а-А1а-РЬе-Ьеи-А1з-А1а~0СН3(раств0р) + 1^0

2;-А1а-А1а-РКе-Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 (ссадок)

Чтобы сохранить постоянным значение рН реакционной смеси, ¡ксперименты проводились в 1М ацетатном буфере, рН 4,6, в который ум повышения растворимости исходных пептидов вводили 18-20% щметилформамвда (ДМФА). Продукт реакции, защищенный гептапептид, шпенный ионогенных групп, гораздо хуке растворяется з реакционной зреде и выпадает в осадок. Этим достигается смещение равновесия в

"23 7v"b _,2~СМ Г г ^ ' ПГ ^^ >f ]' I * т'.^л-; c.—~

r.z'ii изучении 3 3H'/.g;lvoct;; выхода г5ксз"~гтг;1ла er нодичестза пепсина, введенного в реакций, препаративный нь^ссд продукта составляет 56-сс-г в интервале ссотнсаэкй! [S]:[E] ст ю-3:-! до 2*ic":i. Гак™ с'разом, показано, что для эффективного катализа образования пептидной связи достаточно небольших концентраций пепсина, хотя в литературе есть примеры использования очень бользих его количеств.

1.2.Пепсин на:-: пализапер сушеза различных пеплисод. С помощью пег.с;ез былэ синтезирована серия пептидов (Табл.1). На их выход Елиет ряд фактсроЕ: соотвествие исходных соединений специфичности пепсина, длина с:с-:тезируемого пептида, растворимость образующихся продуктов реакции. Соединения (i)-(vili), где в положениях Р1 н находятся гидрофобные аминокислоты (?he, Leu, Met), были получены с достаточно высокими выходами. Заметно повышает эффективность синтеза введение С-концевсй п-нитроанилидной группировки в аминокомпенент (соединения (XII) - (ZIY)). п-Нитроанилиды аминокислот, кроме аминокислотного остатка, способного связываться в подцентре s^, содержат гидрофобную п-нитроанилидную часть, взаимодействующую с подцентром Sg субстрат-связывавдей области фермента. Появление -NH-группы в молекулах п-нитроанилидов также, возможно, улучшает связывание таких субстратов с ферментом за счет образования водородных связей. Вследствие этого п-ттроашшщы аминокислот как аминокомпоненты лучше соответствующих эфиров. Кроме того, наличие остатка п-нитроанллина ухудшает растворимость целевых пептидов по сравнению с соответствующими метиловыми эфирами, что приводит к

ллее глубокому сдвигу равновесия в сторону- синтеза. Так, например, случае соединения (XII) удается ввести в пологени? ?1 заряхенный зтаток Особого внимания заслугивает гзразсвание связи ?*е-А1а хептид (XIII)), поскольку гон глдрслкЕе различных субстратов л, в ;обенности, белков, связь Хаа-л1а расселяется пепсином довольно здко.

Таблица 1. Синтез пепгяюаб с испольговател пепсина в еодно-органической среде*

пептид кснл. ВЫХОД, Я5

2-А1а-А1а-Р1ге-»Ьеи-А1а-А1г-0СН7 (I) 13 58

Вос-РЬе-Ме^РЬе-А1а-А1а-0СНт (II) 15 59

2-А1а-Р1ге-»Ьеи-А1а-А1а-0СЕ, (III) ' 1 я 53

г-А1а-А1а-РЬ.е-»РЬе-А1а-А1а-0СН3 (IV) 13 I 58 | |

2-А1а-А1а-РКе-»РЬе-0СН3 (V) : со с-

г-А1а-А1а-Ьеи-»РЬе-ОСН3 (VI) 13 1 66

г-А1а-А1а-Ьеи-»РЬе-А1а-А1а-ОСН-, (VII) 24 59

г-А1а-А1а-Ьеи-*Ьеи-А1а-А1а-ОСЕ, > (VIII) 23 64

Воо-11е-Р1ге-»РЬе-А1а-А1а-ОСНт (IX) 33 15

2-А1а-А1а-РЬе-»Р11е-01у-01у-ССНт (X) 18 39

2-А1а-РЬе-»РЬе-ОСН3 (XI) 11 47

2-А1а-А1а-01и-»Ьеи-рЫА (XII) 8 60

г-А1а-А1а-Р11е-»А1а-А1а-рНА (хш; ГО 77

2-А1а-А1а-Р}ге-»?}1е-А1а-А1а-р?{А (XIV) 33 67

Стрелкой показаны образушиеся в синтезе связи.

с

1.3 .СэдС-йхдение пепсиж с продуктам, ферлентсягибного сикхе пепхиЭоЗ как ^хисг.ор, ограничиваема эфрэглывноспь ферлента. Д более полного понимания процессов, протекающих с участием пепсин мы изучили поведение фермента в реакции конденсации А1а-А1а-?Ье-ОН и Н-1,еи-А1а-А1а-ОСН~ при рН 4,5 (соотнесение [Б]:[ ю-'п). Было обнаружено, что в процессе синтеза пептн 2-А1а-А1а-?Ье-Ьеи-А1а-А1а-0СН3 активность пепсина в раствор определяемая по скорости гидролиза бычьего гемоглобина, постеаег утрачивается (рис.1). Присутствующий в реакционной смеси ДЬЯ исходные компоненты и продукт реакции не оказывают ингибирующе действия на пепсин.

Мы предположили, что потеря активности фермента в процесг синтеза связана с его соосаздением с формирующимся осадком пептиде Исчезновение активности фермента коррелировало с уменьшение содержания белка в растворе, которое оценивалось по поглощению щ 280 нм. Так, через час с момента начала реакции в надосадочкс жидкости содержалось только 33% белка от первоначально! количества. Кроме того, аминокислотный анализ кислотног гидролизата осадка синтезированного пептида обнаруживал присутстЕ! небольших количеств аминокислот, содержание которых саответствуе составу пепсина. Это свидетельствовало о том, что снижет активности пепсина в растворе связано с его соосаждением продуктом реакции.

Было показано, что при проведении катализируемого пепсин« синтеза г-А1а-А1а-РЬе-Ьеи-А1а-А1а-0СН3 в присутствии посторонн белков в реакционной смеси (лизоцима или карбоангидразы) осаждает« и пепсин, и посторонний белок. Так, при введении в реакционн; смесь лизоцима наблюдается уменьшение суммарной концентрации Селю в растворе в ходе реакции, что определялось по поглощению цри 2 нм (рис 2, кривая 1). Одновременно падает и активность пепсина

растворе (рис. 2, кривая 2), однако, соосгждение фермента происходит медленнее, чем в отсутствие постороннего белка. Наличие лизоцима в осадке также подтверждалось методом дискэлектрофореза в иолиакрилатдноы геле. '

i z ъ Время реакции, ч

1 2 Ъ k Время реакции, ч

Рис.1. Изменение активности пепсина в растворе в процессе синтеза

Z-Ala-Ala-Phe-Leu-Ala-Ala-OCHj

Рис.2. Изменение активности пепсина (1) я суммарной концентрации белков (А2ао) (2) в растворе в процессе синтеза 2-А1а-А1а-Р1ге-1,ец-А1а-А1а-ОСН3 в присутствии лизоцима. (Пепсин: лизоцим 1:5 (по массе))

Пепсин, захваченный осадком, можно частично элюировать 2 м Nací и 20% изопропиловым спиртом в 1М ацетатном буфере (рН 4,6). Качественно была показана возможность извлечения активного фермента из образовавшегося осадка электроэлвцией в электрическом поле. Интересно, что соосажденный с осадком фермент может катализировать образование пептидной связи. Например, конденсация Z-Ala-Ala-Phe-OH и H-Phe-Ala-Ala-ocEj, катализируемая пепсином, осавденным при получении пептида z-Ala-Aia-Phe-Leu-pNA, прошла с 55%-ным выходом.

Было исследовано изменение активности пепсина в растворе пр

синтезе пептидов общей формулы Z-Ala^-Xaa+Yaa-Aia-Ala-ocH-j (п=1 ил

2, Хаа, Yaa=Phe или Leu). Полученные кривые снижения активност

пепсина во времени распадаются на дзэ группы (рис.3). В случая

синтеза пептидов Z-Ala-Phe-»Phe-OCH3 И Z-Ala-?he->Leu-Ala-Ala-OCK

(кривые 1, 2) активность пепсина сохраняется без значительны

изменений в течение нескольких часов. При синтез

Z-Ala-Ala-Phe->Phe-OCH-,, Z-Ala-Ala-Phe-»Leu-Ala-Ala-OCH-,

У j

Z-Ala-Ala-Leu-»Phe-Ala-Ala-OCH3, Z-Ala-Ala-Leu->Phe-OCH3

Z-Ala-Ala-Leu-»Leu-Ala-Ala-00H3 (кривые 3-7) уже через час с момент начала реакции в растворе остается лишь 20-30% фермента. Пр использовании в качестве исходных соединений да-, а не трипептидо (кривые 1, 2 на рис.3) происходит менее эффективное связывание их активным центром фермента и, следовательно, уменьшение скороса синтеза продукта реакции. При этом замедляется образование осада пептида и пепсин дольше остается в растворе, не соосакдаясь продуктом синтеза.

12 Ъ к Время реакции, ч

Рис.3. Изменение активное! пепсина в реакциях синтез различных пептидов:

1 Z-Ala-Phe-»Phe-OCH3

2 Z-Ala-Phe-»Leu-Ala-Ala-OCH3

3 Z-Ala-Ala-Phe-»Phe-OCH3

4 Z-Ala-Ala-Phe-»Leu-Ala-Ala-OC

5 Z-Ala-Ala-beu-*Phe-Ala-Ala-OC

6 Z-Ala-Ala-Leu-»Phe-OCH3

7 Z-Ala-Ala-ieu-»beu-Ala-Ala-OC

Оказалось, что уменьшение активности пепсина в растворе може происходить не только в ходе синтеза пептидов, но и просто щ осавдении пептида из раствора, содержащего фермент. Так, щ

добавлении растворенного в ЛМФА 2-А1з-А1з-?1хе-Ьеи-А1а-А1а-осн3 в водный раствор пепсина, выпадет осадок пептида, захватывающий фермент. В аналогичных условиях осаждающимся пептидом захватывется -не только пепсин, но и другие бедки лизоцим, рибонуклеаза А, яичный альбумин.

Очевидно, важным фактором, определяющим эффективность пепсина в пептидном синтезе, является соосаждение фермента с аморфным осадком пептида. Можно предположить, что механизм соосаждения пепсина с образующимся в результате синтеза пептидом состоит в следующем. В результате кэковалентных взаимодействий между достаточно длинными молекулами продукта реакции образуются более или менее протяженные агрегаты. Из них на начальных стадиях синтеза происходит формирование геля, пронизывающего весь реакционный объем, причем в крупные ячейки геля оказываются включенными, помимо раствора исходных веществ, и молекулы бежа. Реакция продолжается дальше, гель становится все более плотным, и молекулы пепсина, катализирующие синтез, остаются заключенными внутри этой растущей структуры. В конце концов гель разрушается, при этом происходит "выталкивание" раствора низкомолекулярных компонентов, в то время как включенный белок остается внутри образовавшегося твердого (не обязательно кристаллического) осадка.

II. Катализируемый пепсином синтез пептидов в органических

растворителях.

Существует ряд преимуществ проведения реакции синтеза в органической среде по сравнению с водными растворами, в частности, возможность более глубокого сдвига равновесия реакции за счет малого содержания воды в системе, увеличение растворимости гидрофобных субстратов, легкость отделения фермента от продуктов синтеза. Мы показали возможность применения пепсина,

г»

распределенного на поверхности неорганических носителей, ферментативном синтезе пептидной связи.

и.;.Оптилалъные условия синтеза. Для приготовления катализатор раствор пепсина в 25мМ цитратном буфере (рН 4,5) смешивается носителем и высушивается до постоянного веса. После высушивая приготовленный катализатор содержит пепсин, осажденный на порист неорганическом материале, причем фермент, очевидно, находится водно-солевой оболочке, покрывающей поверхность носителя. Д проведения реакции на такой катализатор наслаивается раств исходных соединений в органическом растворителе. Реагируют пептида, содержащие заряженные группы, лучше растворимы в воде поэтому концентрируются в водной "микрофазе", непосредствен контактирующей с ферментом. Таким образом, повышается локальн концентрация реагирующих веществ вблизи активного центра фермент: и, следовательно, реакция синтеза должна протекать более эффективнс Продукт реакции, обладающий большей длиной и лишенный заряженш а-карбоксильной и а-аминогрупп, хуже растворяется в воде диффундирует в органический растворитель. В результате происходи разделение исходных веществ и продукта реакции и равновесие долж! более глубоко сдвигаться в сторону синтеза. Существенно, ч: понижение активности еоды в системе приводит к уменьшен! вероятности гидролиза образующегося пептида.

На модельной реакции конденсации трипептидов г-А1а-А1а-РЬе-он I Н-Ьеи-А1а-А1а-0СН3 были подобраны оптимальные условия синтез; пептидов. В качестве носителей пепсина использовали силохром С-80 аминосилохром, макропористое стекло и целит. Синтез пептид! наблюдался во всех случаях, однако лучший результат был получен < ферментом, осажденным на целите, и в дальнейших исследования; именно он использовался как носитель.

Прочного связывания фермента ни с одним из носителей ш

каоладайтсл - белок легко смывается уже при суспеядирсвзнии катализатора з 1М ацетатном буфере, рН 3,5. Однако, в условиях реакции пепсин удерживается носителем, будучи нерастворимым в органической фазе, что позволяет использовать одну и ту же порцию пепсина, осажденного на целите, в четырех циклах синтеза гексапептида г-А1а-А1а-Р1ае-Ьеи-А1а-А1а-осн3 з ацетонитриле. Выход продукта несколько понижается от цикла к циклу и составляет соответственно 90, 86, 80 и 71%. Снижение выхода продукта синтеза можно объяснить частичной инактивацией фермента органическим растворителем и, кроме того, постепенным переходом воды в органическую фазу.

Синтез модельного гексапептида проводили в ацетонитриле, хлористом метилене, этаноле, этилацетате, из которых ацетонитршь оказался наиболее подходящим. На ход реакции влияет содержание солей на носителе. Нанесение белка на целит в буферном растворе позволяет поддерживать постоянное значение рН в микроокружении пепсина и стабилизирует гидратную оболочку, предотвращая переход воды в органическую фазу. " Так, синтез

г-А1а-А1а-РЬе-Ьеи-А1а-А1а-осн3 не наблюдается, если пепсин нанесен на целит не в буфере, а просто в подкисленной до рН 4,5 воде, несмотря на то, что фермент не инактивируется. Максимальный выход продукта достигается значительно быстрее, если пепсин нанесен на носитель в 25 мМ буфере. Таким образом, существует оптимальное соотношение между количествами пепсина и солей на поверхности катализатора (60-600 нмоль фермента и 200 мкмоль солей на 1 г носителя).

Реакции, катализируемые пепсином в органической среде, протекают в достаточно широком диапазоне значений рН ( 3 - 4,5 ) буфера, в котором происходит нанесение фермента на целит. В случае конденсаций в ацетонитриле, катализируемых, пепсином, распределенным

на поверхности целита, 90%-НЫЙ ЕЫХОД г-А1а-А1а-РЬе-Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 достигается за 2 ч при молярном соотношении субстратгфермент ю3:1.

Таблица 2. Синтез различных пептидов прч полет осажденного на целите пепсина.

пептид к выход, % (ПО ВЗЖХ) условия реакции

2-А1а-А1а-Р1ге-»1,еи-А1а-А1а-0СН3 (I) 90 20ч, 30°С

г-А1а-А1а-Р1ге->РЬе-ОСН3 (V) 20(70) 2ч, 30°С

Воо-11е-Р1ге-»Ьеи-А1а-А1а-0СН3 (IX) 25(70) 14ч, 18°С

г-А1а-А1а-РЬе-»Тгр-А1а-А1а-ОСН3 (XV) 90 24ч, 18°С

2-А1а-А1а-РЬе-»Туг-А1а-А1а-ОСН3 (XVI) 50(60) 20ч, 30°С

2;-А1а-А1а-Тгр-»Ьец-А1а-А1а-ОСН3 (XVII) 20(90) 18ч, 18°С

г-А1а-А1а-Тгр-*Р11е-А1а-А1а-ОСН3 (XVIII) 55(90) 20ч, 30°С

2-А1а-А1а-Туг^Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 (XIX) 60(85) 24, 30°С

2-А1а-А1а-Ту1^РЬе-А1а-А1а-0СН3 (XX) 50(90) 204, 30°С

2-А1а-А1а-РПе-»РИе (Ш2 )-ОСН3 (XXI) 50(70) 54, 30°С

2-А1а-А1а-РКе-»Тгр-А1а-Ьеи-

А1а-РЬе-0СН3 (XXII) 80 484, 30°С

Вос-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-Р1ге-»Ьеи-

А1а-А1а-0СН3 (XXIII) 80 484, 30°С

Вос-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬе->Тгр- 484, 30°С,

А1а-Ьеи-А1а-Р1ге-0СН3 (XXIV) 70 10% буф.

Вос-Тгр-А1а-1еи-А1а-Р11е-»Туг- 484, 30°С,

А1а-Ьеи-А1а-РЬе-ОСН3 (XXV) 40 1056 буф.

*В скобках приводится выход за 72 ч., 30°С.

а.2.Синтез различных пептидов в ацетоишрюё, нтализируеяьсй пепсинол, распределении! на поверхности цел-лпа. С удовлетворительными выходами сыла синтезирована серия пептидов строения г-А1а-А1а-Хаа->Уаа-А1а-А1а-0СН3, где Хаа = ?1ге, Туг, Тгр; Уаа = 1еи, РИе, Тут, Тгр (Табл.2).

Синтез некоторых гоптидоз ((V), (IX), (XVII)) требует большего времени для установления равновесия (до 72 ч), но они образуются с хорошими выходами. Следует отметить значительное увеличение выхода продуктов синтеза в случаях пептидов (I) и (IX) при проведении реакций в органической среде по сравнению с водно-органической. Это связано с более глубоким сдвигом равновесия реакций в сторону синтеза из-за снижения активности воды в системе.

Нами была показана возможность введения в реакции конденсации более длинных гидрофобных пептидов (соединения (ххи)-(XXV)). Октапептиды (XXII) и (XXIII) образуются с хорошими аналитическими выходами. Условия синтеза декапептидов (XXIV) и (XXV) пришлось немного изменить. В последних случаях в реакционную смесь требуется введение до 10% буферного раствора.

III. Синтез пептидов в присутствия денатурирующих агентов.

1x1.1.Синтез серии опта- и декапептидов. Получение относительно длинных гидрофобных пептидов в водно-органической или органической среде затруднено. Так, например, конденсация пентапептидов Вос-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-ОН И Н-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-Р1ге-0СН3 С образованием Вос-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬечЭСН3 В смеси ДМФА с водой практически невозможна из-за низкой растворимости -исходных соединений. При проведении этой ке реакции в органической среде с использованием пепсина, распределенного на поверхности целита, продукт реакции осаждается на катализаторе.

Мы предположили, что введение денатурирующих агентов - мочевины,

гуанидинз или додецилсульфата натрия - в реакционную смесь уменье гидрофобные взаимодействия между молекулами исходных соединений повысит за растворимость з водно-органической среде. Нами бы показано, что после 24 ч инкубации в 1М цитратном буфере, рН 4,6 содержащем 8М мочевину, пепсин не утрачивает своей активност! Учитывая это, мы вводили мочеьину в реакционную смесь п конденсации пептидов с участием пепсина. Так, добавляя 8М мочевш в 1М цитратном буфере к растворам пентапептидов в ДМФА, удаетс провести синтез окта- и декапептидов в 27% ДМФА и 4,3 М мочевш (Табл. 3).

Таблица 3. Пептиды, полученные с полощью пепсина в растворах, содержащих 4,3 М лочевину и 2?%-шй ДМФА.

Аналитические выходы определяли с помощью ВЗНОС.

Пептид

анал щ

2-А1а-А1а-РЬе-»Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-0СН3

2-А1а-А1а-РЬе-*Туг-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-ОСН3

Вос-Туг-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-»Ьеа-А1а-А1а-ОСН3

Вос-Т2^р-А1а-Ьеи-А1а-РКе-»Ьеи-А1а-А1а-ОСН3

Воо-Туг-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-»Туг-А1а-1еи-А1а-РЬе-

Вос-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РКе-»Тгр-А1а-Ьеи-А1а-Р11е-

Воо-Тгр-А1а-Ьеи-А1а-Р1ге-»Туг-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-

Вос-Туг-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-»Тгр-А1а-Ьеи-А1а-РЬе-

(XXII) 95

(XXVI) 95

(XXVII) 84

(XXIII) 46

3(XXVIII) 66

3 (XXIV) 51

3 (XXV) 42

3 (XXIX) 55

Оптимальные условия были подобраны на примере реакции синт< октапептида 2-А1а-А1а-РЬе-*Тгр-А1а-Ьеи-А1а-Р1-1е-ОСН3 (XXI:

полученном с 95%-ным выходом за 48ч. при соотношении [Б]:[Е] ю3

В этих условиях с 84-95&-ными выходами были синтезированы также октапептиды г-АХа-АХа-Рке^т^АХа-Ьеи-АХа-РЬе-ССН^ (XXVI),

Вос-Туг-А1а-Ьеи-А1а-?Ье*Ьеи-А1а-А1а-ССН3 (XXVII). Так как реакции синтеза проходил:! практически до :-;онца, то после промывания образовавшегося осадка водой легко выделяются чистые продукты реакции. Конденсация пентапептидов проходят в 4,3 М мочевине при 32Ж-ном содержании ДМФА в реакционной смеси (Табл. 3).

ш.г.Сравнение поведения пепсина как кажииэалюра образования пептидных связей в присутствии и в отсутствие лочевинн. Представляет интерес сравнение поведения пепсина как в присутствии, так и в отсутствие денатурирующего агента ез примере синтеза модельного пептида' г-АХа-АХа-РЬе-^Ьеи-АХа-АХа-осн^ Увеличение концентрации мочевины уменьшает выход пептида (Рис. 4). В специальном спыте было показано, что в 8 М мочевине 20%-ный выход гексапептида й-АХа-АХа-РЬе-Ьеи-АХа-АХа-осн^ Слизок к равновесному, поскольку при инкубации гексапептидэ в этих же условиях он расщепляется пепсином на трипептиды, так что через 48 ч в смеси сохраняется 25% гексапептида (Рис. 5). Очевидно, мочевина повышает растворимость не только исходных соединений, но и продукта реакции.

Нами была выбрана концентрация мочевины, при которой еыход 2-А1а-А1а-Р1ге-Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 был достаточно большим - (5,5 М мочевина в 20% ДМФА) и в этих условиях изучалась зависимость выхода гексапептида от концентрации пепсина. Через 20 часов при 20°С достигалось равновесие при соотношении [Б]:[Е] ю5:1, так ге как и в отсутствие мочевины. Мочевина не оказывает влияедя и на рН-оптимум равновесного синтеза - максимальные выходы достигаются при рН 4-5 так же, как и в отсутствие денатурирующего агента.

. п

35 ¿С 'I-

1=1 О >4

20,-

г * 6 в [Мочевина), JM

¿0 ■

3 20' N

¿4 Зо (М

Время, ч

Рис. 4. Зависимость Еыхода г-А1а-А1а-РЬе-Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 от содержания мочевины в реакционной смеси.

3'

Рис. 5. Зависимость от времени синтеза (1) и гидролиза (2) 2-А1а-А1а-?Пе-Ьеи-А1а-А1а-ОСН3 катализируемых пепсином в 8 М мочевине и 20% ДМФА. По оси ординат отложено молярное процентное содержание гексапептида в реакционной смеа

г

Соосаздение пепсина с продуктом реакции наблюдается и I присутствии 5,3 М мочевины. Так, при соотношении [Б]:1Е] ю3:1, потеря активности пепсина происходит немного медленнее по сравненю с обычными условиями. При использовании меньших количеств ферментг ([Б]:[Е] Ю5:1) активный пепсин значительно дольше находится ] растворе (рис. 6), но увеличение выхода продукта сопровождаете: захватом фермента из раствора.

Следовательно, введение в реакционную среду мочевины существен» не изменяет поведение пепсина как катализатора образована пептидной связи, хотя нельзя исключить влияния мочевины на кинетик; процессов.

Рис. 6. Активность пепсина з гастзоге (1) * -

И ЕЫХОД 2-А1а-А1а-РЬе-1«и-А1а-А1а-ОСЕ, (2) в хсде синтеза в 5,3 М мочевине ([Б]: [Е]=ю5:1 ).

[оказано, что пепсин такге сохраяет активность после 24 ч гСир-эвания з растворах 6 М гидрсхлсридэ гуанидинэ и 0,5? ;цилсульфатэ натрия. При проведении конденсации трягептидэз .з-А1а-РЬе-сн и н-Ьеи-А1а-А1а-0С1Ц, катализируемой пепсином, при гении 4,8 М гидрохлорида гуаниджа или 0,35$ додецилсульф-ата :ия в реакционную смесь модельный гексапептид образуется с 60 и -ными выходами соответственно.

штор выражает глубокую благодарность И.Ю.Филипповой и .Лысогорской за постоянную помощь з планировании и проведении тедований и Е.С.Оксенойт за осуществление синтеза исходных идов.

т

выводы.

1.Развит метод ферментативного синтеза пептидов при помощи пепсина в годно-органической среде, о препаративными выходами получена серия три - гексгпептидов. Обнаружено, что в процессе реакции происходит соосаздение фермента с образующимся осадком пептида, при этом пепсин не теряет активности. Скорость соосаждения фермента зависит от структуры синтезируемого соединения и от условий проведения реакции.

2.Показана возможность использования пепсина, распределенного нг поверхности неорганического носителя, в реакциях синтеза пептидов е органической среде, что обеспечивает более глубокий сдвиг равновесия в сторону образования продуктов конденсации. Применение органических растворителей с малым содержанием воды позволяв провести синтез гидрофобных тетра - декапептидов разлкчногс строения с высокими выходами (60-90%).

3.Найдено, что пепсин может катализировать образование пептидно связи в концентрированных растворах денатурирующих агентов мочевины, гидрохлорида гуанидина, а также додецилсульфата натрия Изучены закономерности ферментативного синтеза пептидов катализируемого пепсином, в присутствии высоких концентраци мочевины. Введение денатурирующих агентов в реакционную смес открывает возможности для препаративного получения протяжений гидрофобных пептидов, склонных к образованию вторичной структуры.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Адли К., Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Анисимова В.В.

Лавренова Г.И., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Использовани

пепсина в синтезе п-нитроанилидов и эфиров пептидов. - В сб.

Тезисы докладов vil Всесоюзного симпозиума "Инженерна

энзимология". Москва, 1991, с.71.

Pilippova I.Yu., Lysogorskaya 3.N., Anisimova Y.V., Abdel Malak C.A. , Lavrenova G.I., Stepancv 7.if.. Pepsin behavior as a catalyst in equilibrium-control_=d peptide synthesis. - Workshop "Enzymes in Peptide Synthesis", 3cgensee (Germany). Sept.2-6. 1991. P.71.

Lysogcrskaya E.N., Pilippova I.Yu., Abdel Malak C.A., Anisimova V.V., Oksenoit E.S., Lavrenova G.I., Stepanov V.M.. Pepsin-catalyzed synthesis of protected peptide p-nitrcanilides and esters. - Workshop "Enzymes in Peptide Synthesis", Bcgensee (Germany). Sept.2-6. 1991. P.76.

Pilippova I.Yu., Lysogorskaya Z.X., Anisimova V.V., Abdel Malak C.A., Lavrenova G.I., Stepancv Y.J£.. Pepsin behavior as a catalyst in equilibrium-controlled peptide synthesis. - Biomed. Biochim. Acta. 1991.V.50, No.10/11. ?.98-101. Лысогорская E.H., Филиппова И.Б., Абделъ Малак К.А., Лазренова Г.И., Анисимова В.В., Оксенойт Н.С., Степанов В.М. Пепсин в ферментативном синтезе эфиров л п-нитроанилидов пептидов. -Биоорган, химия. 1992. Т.18. о. С.1081-1088. Abdel Malak С.А., Pilippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Anisimova V.V., Lavrenova G.I., Stepanov 7.M.. Pepsin as a catalyst of peptide synthesis - enzyme cc-prs-cipitation with emerging peptide products. - Int. J. Pept. к Prot. Res. 1992. V.39. N0.5. p.443-449.

Анисимова B.B., Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Пепсин как катализатор образования пептидных связей в органических растворителях. - ill симпозиум "Химия протеолитических ферментов". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 1993. С.124.

Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Аннсимова В.В., Абдель Малак К.А., Лавренова Г.И., Анисимова В.Е., Оксенойт Е.С., Степанов

ш

B.M. Соосзждение пепсина с продуктами ферментативного синтез' пептидов как фактор, ограничивающий эффективность фермента. Биохимия. 1993. Т.53. Вып.6. С.921-927.

9. Анисимова В.В., Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю., Оксенойт E.G. Степанов В.М. Катализируемый пепсином синтез пептидов органических растворителях. - Биоорган, химия. 1994. Т.20. J6 3

C.316-322

10.Anisimova V.V., Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoi1 E.S., Kolobanova S.Y., Stepanov V.M. Proteinase-catalyze peptide synthesis in concentrated solutions c£ urea and о the., denaturing agents. - Int. J. Pept. & Prot. Res. (in press).

/