Специфичность и механизм действия протеолитических ферментов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

О П '■ 9'

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БЖЮРГАНИЧЕСКОЙ ХЕШИ иы.М.М. ШЕМЯКИНА

На правах: рукогжи УДК 577.152.34 ' И

РУЛИ Лев Давидович

СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПРОТЕОШТИЧЕСШ ФЕРМЕНТОВ.

02.00.10 - бйооргашческвя тгая, отш природах и физиологически активных вепеств

ДИССЕРТАЦИЯ нй соискание учзясЯ степени доктора тяпескюс наук в фориа научного доклада

МОСКВА 1991

РаСота вшюлнени и лаборатории химии протсолитических ферментов ордена Трудошго Красного Знамени Института бнооргв1!)1чсской химии им.U.M.Шемякина Академии Наук СССР

Официальные оппонента

доктор химических наук, профессор В.М. СТКПЛ1ЮН доктор химических наук II.Ф. КАЗАНСКАЯ доктор хш,шческ"Х наук 11.11.М0ДН1ЮН

Ведущая организация - Институт биохимии им.л.ll.Uaxa .ill СССР

Зашита состоится " VcCPtä^r rj'.M года в ^ часои

.на заседании специализированного соьета Д 002.3b.0l по зашите диссертации па соискании учиной степени доктора химических ниук при Институте бноорганическои химии им.U.U.Шемякина Ali СССР по адресу: 11ТВТ1, ГСП Москва В- 437, ул. Миклухо-Маклая )$/)£>.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке Института биоорганическоЛ химии им. 1.1. М. Шемякина ЛИ СССР

Диссертация разослана года

Учений секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.Л.Несмеянов

ГиТЖеШ t

. »3

Актуальность проблеял. Ферментативный пиролиз амидной связи '.^ЖЗДптидах и белках давно привлекает значительное внимание исследователей в связи с той ролью, которую этот процесс играет в живой природе. Долгое время функции протеолитических ферментов сводили, главным обрассм, к деструктивным нроцесаи. Олнако ид значение не ограничивается только утилизацией полипептидного материала; и в последнее время все большее внимание уделяется протеолнзу в регуляции механизма жизнедеятельности клетки. Поэтому вопрос, каким образом протеолитические ферменты выполняют свои функции, является одним из важнейвнх вопросов сегодняшней биоорганической химии.

Несмотря на то, что механизм гидролиза пептидной связи проте-олитическими ферментами имеет много общего с химическим нефермэн-тативкнм катализом, сушествеиним отличием биологичесих катализаторов является их специфичность я эффективность. Огромное число про-теолитических ферментов, выполнлкяш в конечном итоге одинаковую функцию - гидролиз пептидной связи, объясняется вероятнее всего необходимостью специфического (в том числе и ограниченного) проте-олиза пептидной связи в каждом конкретном случае. При этом специфичность связана с одной стороны со структурой субстрата, который должен быть подвергнут гидролиза, а с другой стороны с условиями функционирования ферментов в отношении рН, температуры, состава среды.

Первой стадией любой ферментативной реакции является связывание фермента с субстратом. При анализе субстратной специфичности протеаэ различают несколько уровней специфичности (первичная, вторичная, третичная и четвертичная). Следует отметить, что субстратная специфичность ферментов изменяется в весьма широких пределах -от ферментов с абсолютной специфичностью (ренин) до протеаз типа пепсина, расщепляющих широкий набор субстратов. Именно такие низко специфические ферменты представляют наибольший интерес с точки зрения изучения их вторичной специфичности.

Следующей после связывания субстрата с ферментом стадией является собственно акт расщепления пептидной связи. Здесь возникает сразу же ряд вопросов, связанных с характером нуклеофильной группы, атакующей субстрат, образованием промежуточных соединений, их структурой, а также структурой комплекса фермента с продуктом реакции и механизмом катализируемой протеанами реакции транспепти-дании.

Цельр работы являлось изучение первичной и вторичной специфичности на примере, главкам образом, свиного пепсина, создание

метода, позволяющего проводить количественную характеристику специфичности, выяснение причины значительного влияния вторичной специфичности на эффективность ферментативного катализа. Создание новых высокорастворимых в широкой области рН субстратов аспартильных протеаз. Следующей задачей была разработка принципиально нового общего метода изучения механизма действия пептидгидролаз и установление природы промежуточных соединений в ходе катализа. Это было достигнуто путем исследования функционирования"ферментов в тяжелокислородной воде. Наконец, необходимо было провести подробное кинетическое исследование катализируемой некоторыми пептидгидрола-зами реакции транспептидацш с целью установления особенностей строения комплексов фермент-продукт.

Научная новизна и практическая ценность работа. Разработан метод статистического анализа расщепления пепсином белков и пептидов. Метод позволяет априорно рассчитать кинетические параметры гидролиза пепсином любых расщепляемых пептидных связей. Предложенный нами анализ скоростей расщепления пептидных связей может иметь большое практическое значение в современной белковой инженерии для селективного отщепления целевого продукта от белка-носителя посредством создания линкера высоко специфического к ферментативному расщеплению пепсином.

Впервые обнаружены активаторы пепсино'вого катализа и исследован механизм активации.

Предложен новый тип пептидных субстратов с ч-морфолинопро-пиламидной С-концевой группировкой, обладающих высокой растворимостью во всем диапазоне рН действия кислых протенназ. Исследование взаимодействия подобных субстратов с пепсином позволило в последнем обнаружить группировку с рКа^З,0, ответственную за связывание заплженных субстратов.

Разработаны методы, позволяйте надежно установить механизм катализируемого протеазами гидролиза пептидной связи. Показано, что в качестве нуклеофилыюго агента, атакующего карбонильный атом углерода пептидной связи, могут выступать боковые ОН- или SH- группы активных центров (иуклеофильный катализ), или вода (общеосновной катализ). Методы основаны на проведении исследуемой реакции в тнжелокислорояной воде Н0'йи с последующим определением

4 О

О в лепрогидролнзованном субсграге, в ашишнои компоненте субстрата (в присутствии и отсуттьиг ашшокомнонента), в" продукте '¡ринспеп'шдацпи, в ферменте. в ксюингиопторах - аналогах пептидных субстратов. Наличие или отсутствие включения ,80 в вниепере-

численных случаях может служить доказательством того или иного механизма катализа.

Предложенные нами методы были апробированы на химотршсше -Ферменте, для которого независимым способом был доказан нуклео-фильннй механизм катализа с образованием ковалентного промежуточного соединения (анил-фермепта) как при гидролизе эфирных, так и пептидных субстратов. Нами впервые было показано, что пепсин при гидролизе пептидных субстратов функционирует по типу обшего основного катализатора, не образуя ковалентного промежуточного продукта (аминофермента или ацилфермена). Были исследованы также механизмы действия папаша, термолизина, карбоксипептидаз А и Ч, лейцинами-нопептидазы. Предложена новая классификация протеаз по механизму их действия.

Доказательство обшего основного катализа пепсином поставило задачу установления механизма реакции транспептидэцни - процесса, до этого времени считавшегося характерным лишь для ферментов, образующих ковалентные промежуточные соединения с фрагментом субстрата. С этой целью был разработан спектрофотометричесчий метод изучения катализируемой пепсином реакции транспелтидации, основанный на использования хромофорсодержащнх акцепторов. Это позволило впервые получить каталитические константы соответствующих реакций. Было доказано образование обшего промежуточного соединения фермента с фрагментом субстратов, имеющих одинаковые переносимые на акцептор остатки.

Таким образом, было ус-гановдено, что транспептидаиия происходит при взаимодействии акцептора с нековалентно связанным с ферментом Фрагментом субстрата и лада объяснение различий реакции транспелтидации и ресинтеза. Все эти данные легли в основу разрабатываемых в лаборатории теоретических представлений о причинах эффективности и специфичности пептидгидрэлаз.

Г. Специфичность.

Субстратная специфичность пептидгидролаз может проявляться на нескольких уровнях: на уровне остатков аминокислот, образующих своей карбоксильной или аминогруппой расщепляемую связь (первичная специфичность),на уровне аминокислотами остатков, находящихся на удалении более чем одной аминокислоты от растеплямой связи (вторичная специфичность), а в случае гидролиза белков необходимо таксе рассматривать общую пространственную организаш:.-: ларолизуе-мой молекулы (третичная специфичность) и его олигомерную структуру (четвертичная специфичность),

В качестве меры специфичности ферментов в отношения разных субстратов обычно используют константу второго порядка (ккат_/Ку), независящую от степени непродуктивного связывания.

Основным объектом исследований специфичности нами был выбран свиной пепсин, характеризующийся широкой первичной и явно выраженной вторичной специфичностью.

IЛ■Первичная специфичность.

Исследование первичной специфичности пепсина посвящено большое число работ. Однако к началу наших исследований оставалась нерешенной проблема вклада в катализ й-ациламиногруппы субстрата. Известно, что замена -МН-группи в метиловом эфире ацетилфенил-аланина на атом кислорода резко снижает возможность гидролиза этого субстрата хииотрипоином. Соотношение значений констант ккат /Кц для субстратов, содержащих -НН-группу или атом кислорода, составляет в этом случае около 4000. Возникает вопрос, является ли это общим свойством различных протеаз или характерно лишь для отдельных их представителей.

Чтобы выяснить этот вопрос, мы исследовали способность пепсина катализировать гидролиз метиловых зфиров О-ацетил-1- и О-фенил-лактнл-Ь-фенилаланина (I) и Ь-фениллактил-Ь-фенилаланина (II). Эти соединения отличаются от обычных дипептидных субстратов пепсина теп, что атом азота {¡-концевого аминокислотного остатка заменен на изостерный атом кислорода, не способный быть донором протона при образовании водородной связи с ферментом.

» I ¡: о о ,¿00

сн3с-оснсо-ннснсооан3 ВОСНСОЧШСНСООСНд

¿н2с6н5 сЬ6Н5

АсИаРПеОЫе (Г) . НР1аР11еОМе (II;

О-Ацетил-Ь- и В-Фенилмолочные кислоты и Ь-фенилмолочная кислота били синтезированы из I и 1)-фенплаланина. Кинетические измерения проводили по методу, основанному на реакции свободных аминогрупп с 2,.},6-гр11Ш1трооенэолсульфокислотой.

Способность пепсина катализировать гидролиз метилового эфира О-ацс'гил -1-ф|ециллактил-1-феннлалин1ша ' и метилового эфира 1-фе-шшактидЧ-феннлаланина изучали при рН 4,0 в 0,Ш ацетатном буфе-ре■ годержаини,! С об Л неганола. При инкубашш этих соединений (!,Ь ПГ'ЧП г пепсином (2 ,¿>3-Ю^'Ш в течении 20 часов при 37°С не было выявлено заметного прироста свободных аминогрупп. Таким образом.

указанные соединения не проявляют субстратных свойств в отношении катализируемого пепсином гидролиза. Ингибируииие свойства этих соединений, а также метилового зФира о-ацетил-й-фениллактил-ь-фенил--аланина изучали по отношению к гидролизу пепсином П-ацетил-Ь-фе-

. г>

инлаланпятнрозшт при концентрации субстрата 2-10 И и концентрации ингибиторов в интервале 0,2-!О'"3- 1-1(Г°И. Обработка экспериментальных данных по уравнению ч/ч^ = НП при различных концентрациях субстрата показала конкурентный характер ингпбирования. Величины К} приведена в таблице 1.

Таблица 1

Ингибироваше гидролиза пепсином М-аиетал-Ь-фенилаланил-тирозина (2-Ю"3Н) производными фенилмолочной кислоты.

Ингибитор -104®

Ас-Р1а-Р11е-0Ме 1 ,79 ± 0,17

г,20 1 0.23

Н-Р1а-Р1ю-0Мэ 2,60 1 0.33

[II = 0,2-10 3 - 1-1(Г311; Ш = 2.93-10"5 1!; рН 4,0; 0,1М ацетапшй буфер; 6 обЛ СН.-.0Н; ЗТ°С.

Полученные значения К^ очень близки и практически не отличаются от величины Км для метилового эфира Н-ацетнл-Ь-фенилаланил-Ь-фенилаланшга (1,9-10~'3М). Т.о., если субстрат все же взаимодействует своей ашяноП группой с ферментом, то выигрыш в свободной энергии, вносимый этим взаимодействием, не отражается на величине константы диссоциации фермент-субстратного комплекса. Полученные нами данные свидетельствуют о важности П-ациламипогруипн яииептид-ного субстрата для катализа, но не для связывания субстрата.

Следует отметить, что на свойствах ингибиторов не сказывается замена ацетоксигруппы, на оксигруппу, а также конфигурация фенил-молочной кислотг.

Интересным является отноиенне кярбоксипептидазы У к замене в субстрате аиилашиогруппы на ацетоксигруппу. Карбоксипептилаза У -сериновая тиолзависнмая экзопептидаза, обладавшая помимо пептида зной активности ямидазноЯ и эстеразной. Было проведено сравнительное изучение действия карбоксипептидазы У на метиловые эфирн зцетокси-Ь-фенилмолочной кислоты и анетил-Ь-фенилаланина. Полученные данные прсдставлеин в таблице 2.

Как видно из зтоП таблицы, запена -!Ш- группы на атом кислорода не сказывается столь драматично, как это имеет место в случае

пепсина или химотрипсина. Соотношение величин ккат /К^ составляет около 200, что на порядок меньше, чем для химотрипсина. Следует отметить,, что и в этом случае ухудшение каталитических свойств происходит главным образом за счёт ухудшения kKQT , а не связывания.

Таблица 2

Кинетические параметры катализируемого карбоксипептидазой У гидролиза метиловых эфиров О-ацетил-Ь-фениллактага и Я-ацетил-Ь-фешшалашна.

Субстрат ''кат. . (сек. ') % t.ií.í ккат/КМ кквтУКМ ккат./йМ (2) (1)

1. Ас-Р1а-0Ые 2. ic-Phe-Ofle 0,18 63 2,4 3,6 0,075 17,5 233

рН 7,0; 0.05U фосфатный буфер; 3?°С.

Заканчивая этот раздел, можно сделать вывод о важности -ЛН-грушш в первичной специфичности ферментов. Вероятнее всего роль -Ш- группы заключается в образовании дополнительной водородной связи с ферментом для правильной ориентации гидролизуеыой свя-" '. Однако роль этого взаимодействия, по-видимому, не носит универсального характера и для каждого фермента имеет свое определенное значение.

I.¿.Вторичная специфичность.

К началу семидесятых годов было проведено немало исследований по влиянию вторичных взаимодействий на эффективность пепсинового катализа. На иебольиих модельных субстратах было показано, что по мере увеличения их размеров происходит в основном увеличение ккат> при практически постоянном' значении Ку. Эти данные были относительно немногочисленны и часто получены в различных условиях. В связи с этим возникла необходимость проверки имевшихся данных на серии специально синтезированных субстратов.

1.2. а) Кинетический ана.'.из специфичности пепсина.

Одной из трудностей получения надежных кинетических параметров пепсинового катализа является плохая растворимость гидрофобных пептидов в воде при низких значениях рН. Кроме того, кинетические измерения скорости гидролиза бчлышшства использованных ранее субстратов нельзя било выполнить слектрофотометрическимп методами. Чтобы преодолеть эти трудности, нами были синтезированы новые суб-

страта пепсина, содержащие 7-амшюпропилморфолиновую С-затитную группировку íApm> и л-нитрофенилоланин íPhe^j в качестве хромофорной метки:

О

I 2 3 \_/

т2

где А - аиильная запитая группировка или пептид. Преимуществом субстратов подобного типа по сравнению с известными из литературы является их существенно большая растворимость в воде, что позволяет добиться в кинетических опытах условий, когда концентрация субстрата С SQ3 соизмерима с'величиной константы Михаэлиса Всего нами был осуществлен синтез четырнадцати не описанных ранее ли-, три- и тетрапептидов типа A-P!ie,|-Y-Apm и A-X-Phe¡j-Apji, где А -Z-. ZAsn-, ZVal-, ZLeu-Val-; Y - Gly, Ala, Val, Phe, Glu(OBzl): X - Phe, Val, Ala; Phej¡. Кроме того, были синтезированы пептидные субстраты типа C-Píe^-Phe-D, где С - Z-, Ac-, a D - -ArgOíin, и -AlaAlaOMe. Растворимость субстратов с аминопропилморфолиновой с-зашитной группировкой находится в пределах 0,5-5 мМ (см. табл. 3). Нами было показано, что изменение оптической плотности остатка л-нитрофеиилалашна при \-320 ни происходит не только тогда, когда разрывается пептидная связь, образованная карбоксильной группой этого остатка, но и при разрыве пептидной связи, образованной его аминогруппой. При этом ÍT320 ие!,явт свое значение от -1000 до + 900.

Результаты кинетических исследований полученных субстратов

приведены в таблице 3. Как видно из этой таблицы, диапазон измене-

s

ний кинетической специфичности (kKaT ^j) составляет 10 , причем значения ffjj изменяются не более, чем на порядок. Это ещб раз демонстрирует отмечавшуюся ранее, рядом авторов роль вторичных взаимодействий в пепсиновом катализе. Действительно, удлинение пептидной цепи субстрата резко увеличивает значение ккат , мало сказываясь на величине сродства фермента к субстрату. 8 ряду дипептидов варьирование в структуре аминокислотных остатков изменяет также, главным образом, каталитическую константу. Снижение гидрофобности остатка в положении Pj качественно коррелирует со снижением кинетической специфичности. В положении Р1 такой корреляции, по-видимому, нет. Характер аминокислотного остатка в положении Pj имеет меньшее значение для скорости растепления, чем структура

Таблица 3

Кинетические параметры катализируемого пепсином гидролиза пептидов

* сор Субстрат Аезго [2)-!031 Ш- 105М %'°3 М к •л лкат ккат/ЕЫ

тт.}'. Р3 Рг г, Р.' р' Р3 мин"1 мгоГ1мМ'

1 г А 1а А1а РЬем РЬе Арш -эоо 0,6-0,2 0.02 1 ,51 2630 1740

г г 1еи Уа1 РЬе^ АЗ а Ара -800 0,5-0,12 0,01 0.59 258 439

3 Ас РЬе!, РПе А1а А1а ОМе -воо 0,5-0,12 0,02 0.85 313 356

1 7 а! РЪе^ РЯе Ар 31 -900 1,0-0,2 0,5 0,17 19.1 111

5 1 7а 1 РКе^ А1а Ари -800 1,0-0,2 0,5 0,96 . 33,7 34,9

6 г Азп Рйе",, РЬе Арш -900 1.0-0,2 0,5 0,8-1 27,0 32.3

•7 С1у 01у РЬе"' РПе Арш -1 ООО 5,0-0,8 0.25 3,90 57,0 14.7

8 £ РЬеч Рйе Арт -700 1,0-0,25 5,0 0,74 3,11 4,2

9 АС РПе* РЬе АрШ -1000 5,0-1 ,0 5,0 2,37 5,12 2.53

10 г Рйе РПе„ Ар® +85 0 1..0-0.2 5,0 0.88 2.0Л 2,33

1 1 г РИе ОМе ■ -1100 1 .0-0,17 5.0 0,92 2.03 2.21

12 г Ьеи РЬеч Ара) +850 ! ,0-0,2 .5,0' 0,73 0,55 0,88

13 г 7а1 Арш -950 1,0-0,2 5.0 0 ,'78 0,60 0,77

1 4 ъ РЦ С1и Арт 1) Ара -1000 1,0-0,2 5,0 1.01 . 0,39 0.36

15 ъ РЬеч (ВЕ А1а -700 2,0-0,2 5,0 1 .30 0.41 г> и

16 г А1а* Р1те„ Арш + 850 2,0-0,2 20,0 , 1 ,¿6 0,12 0,035

17 г РПеч 01/ Аря -800 2,0 50,0 В ЭТИХ УСЛОВИХ не

18 ъ 7а1 РЬе.д Арш +900 1 .0 50,0 гидролизуются

Ь% лиметилФормамила. рН 4,0, 0,1 ацтатный буфер, 37°С.

остатка в Р,. Так, замена остатка фенилаланина на остаток аланина в Р] даже увеличивает КкаТ1. хотя и ухудшает связывание (твбл.З, соединения № 4 и 5). В ряду дшептшюв такие замены сильнее сказываются на каталитических константах, чем замена в трипептидах. Сравнение соединений (8) и (II) показывает, что остаток т-аминопропилморфолинамила вносит примерно такой же вклад в специфичность, как и остаток метилового эфира аргинина. По-видимому, положительный заряд этих остатков взаимодействует с отрицательно заряженной группой связывающего участка активного центра фермента.

Дополнительным подтверждением выше сказанного является изучение рН-зависимости катализируемого пепсином гидролиза гРЬе^РйеАрш, которое показало, что кривые рН-зависимости Км и 1?кат/К1( отличаются от известных в литературе для субстратов других типов (рис.1). Полученные данные указывают на участие в связывании исследуемого субстрата групп пепсина с рК»3,9.

5 4,0' 3,5-о, 3,02.5-

ёо,5-а 0.01,5+3 1.0-1с:

21 0.5-1-1-1-1-1-1-1-

2.0 3.0 Д.О рН

Рис. 1. Зависимость констант ферментативного гидролиза гРЬе^ГЬеАртп от рН.

1.2.6) статистический анализ специфичности пепсина. Анализ специфичности на основе кинетических исследований гидролиза синтетических субстратов весьма трудоемок и, вследствие

ограниченного числа объектов, не всегда статистически достоверен. Однако пепсин широко используется в структурных исследованиях белков и к .-началу пашей работы накопилось большое число данных такого рода. Поэтому мы решили разработать метод статистического анализа специфичности пепсина, основываясь на частотах расщепления связей в белках.

llenad. расчеиз.

Были проанализированы литературные данные по расщеплению пепсином различных белков: рибонуклеазы к, рибонуклеазы Т,, а, р, г-цепей ншлуно.глобулинов человека, лдзошша белка куриного яица, лизошша фага Т4, субтилизика ВР1Г, бзлка вируса табачной мозаики, легкой цепи иммуноглобулина шеломы человека, А и В цепей инсулина, аир цепей кортикотрошшов и др. белков , a также различных белковых фрагментов (образующихся в результате брошшанового, трппсинового и др. избирательных расщеплений белковых молекул).

Методика анализа заключалась в следующем. Для каждой расщепляемой связи рассматривали структуру пептида, содержащего десять аминокислотных остатков в сторону N-конца от расщепляемой связи (Р, Q-P,) и десять остатков в сторону С-кокца (P]-PJq)- При этом предполагалось , что гидролиз идет не последовательно, а независи-ио, т.е. в тех случаях, когда в рассматриваемый пептид, содержащий 20 остатков, входят две иди более расщепляемых связей анализировали соответственно два или более двадцатичлелных пептидов с расщепляемыми связями, образованными аминокислотами в положении +1 и -1 .

Ниже приведен подход к расчету произвольно взятого пептида.

! i I

I 2 3 4 5 в 7 8 9 10 1! 12 13 20

H-.41a-Phe-Pro-Val-Ile-Phe-yal-Ser-Ieu-Phs-Trp-rhr-Cys-Hl3-.. .ArgOli

Для расчета индекса специфичности ' расщепляемой связи

PhSg-Val.f рассматривали пептид ¿la, -А1а16(Р6~Р|0); для связи Leu9-P!ie1Q- пептид Ala,-Ala,д (Pg-Pj0)-

В выделеных таким образом 500 пептидах была подсчитаны частоты встречаемости всех 20 аминокислот в 20 положениях. Затем былз

рассчитана частота встречаемости аминокислот данного типа в каждое из 20 положений пептида по формуле:

где а^ - общее число аминокислот данного типа во всех после дованных полилептидах,

- число аминокислот данного типа в каждом из положений.

Необходимо отметить, что а^ и Ь^ - дробине числа. Это связано с тем, что при рассмотрении коротких пептидов, коротких- белковых фрагментов и в случае, когда расщепляемая связь находилась близко от П- или С-конна молекулы белка, не удавалось выделить полные 20 членные пептиды. Поэтому вводили поправочные коэффициенты- 500/3^ (а^ - число аминокислотных остатков в данном положении), разные для каждого (кроме -1 и +1) положения, полипептида.

Полагая, что частоты встречаемости аминокислот разного типа и данном положении при отсутствии какой-либо специфичности в связывании субстрата ферментом должны различаться незначительно, вычисляли среднюю частоту встречаемости аминокислот в данном положении % X,

Ч'

20

И, = Е И, ,/20, ' (2)

И 1=0

Отношение этих величин

' Кц = —— (3)

13 гт

1}

характеризовало отклонение 'от среднего распределения аминокислотных остатков для данного положения.

Границы доверительных интервалов для значений к^ данного типа аминокислот рассчитывали по формуле

Ах^ = го, (4)

где о»Зп - среднеквадратичное отклонение к^ от единицы; е = Я для вероятности а = 0,95.

В результате получили значения верхней и нижней границ доверительных интервалов для к^ аминокислот каждого типа соответственно:

1.+ Ау^ И 1 - ¿Хр (5)

Характеристикой предпочтительности аминокислоты данного типа в данном положении считали

ки

= ГТТх, для 1 (6)

I = - -т^ "я < ь

Предпочтительными для данного положения считали остатки аминокислот, для которых 3^5+1; нежелательными - такие, для которых 3^-1.. Аминокислотные остатки с +1*5^-1 считали индифферентными.

В качестве примера приведем расчеты для остатка изолейшша в положенииях -1 и +1. В исследованных пептидах встретилось 372,3 остатка изолейцина, из них в положении -1 три остатка, в-положении +1 31 остаток.

Согласно формуле (1)

*А11е1_, = 0,81. *АПе> + , - 8.33 По формуле (2) считали среднюю частоту встречаемости аминокислот в положениях -1 и +1

Я_,= 4,99, 5,13!

отсюда по формуле (3)

Верхняя граница доверительного интервала для изолейцина равна 1,1Б, нижняя -0,84 [см. формулы (5)1.

Таким образом, по формулам (Б) имеем '

^11е,-1 = -5'25 11 = *<'40,

т.е. в положении -1 изолейцин явно нежелателен, в положении +1 это предпочтительная аминокислота,

Таким образом были рассчитаны значения для всех 20 аминокислот в положениях от -10 до чЮ.

Результат- статистического анализа.

Результаты статистического анализа для всех типов аминокислот в каждом из 10 положений (Р'5-Р£) приведены в таблице 4.

Представляется интересной зависимость от 3, где *

20

= I |81}|/20.

1=0

для взяты абсолютные значения; ';) - положение аминокислотных остатков по отношению к расщепляемой связи (рис.2). Эта зависимость, видимо, отражает "жесткость" требований различных участков связывающей зоны фермента к структуре аминокислотных остатков субстрата. На обшей фоне равномерного распределения по положениям выделяются значения В интервале -3 V \2. Очевидно, область фермен-

Рис,2. Зависимость значений ЕГ, от 3.

та, соответствующая этому интервалу в пептиде, наиболее существенна для взаимодействия субстрата с ферментом. Наибольшее значение (ЕГ^=2,22! приходится на положение -1. Видимо, тип аминокислотного остатка в этом положении является определяющим при расщеплении субстрата пепсином. Аналогичный вывод следует из рассмотрения значений (табл,4). Для положения -1 спектр значений весьма широк: от +2,46 для лейцина, наиболее предпочтительной аминокислоты, до -6,2-3 для аргинина, наиболее нежелательной в этом положении аминокислоты (■ остаток пролина абсолютно нежелателен в этом положении и ни разу здесь не встречается). В то же время в положении +1 интервал значений суйественно уже: от +1,52 для триптофана и тирозина до -2,3 для треонина.

Рассмотрим требования, предъявляемые ферментом к характеру аминокислотных остатков в положениях -1 и +1. т.е. первичную специфичность пепсина (см. табл. 4). Как уже отмечалось, требования эти довольно жесткие: в положении -1 индифферентных остатов нет вообще, в положении +1 их-всего два. Наиболее предпочтительными остатками в полс:кении -1 являются лейцин, фенилаланин. триптофан и глутаминовая кислота. Весьма нежелательны здесь аргинин, изолей-цин, цистеин, лизин,/серии, валин, гистидин и глицин. {Необходимо, однако, отметить, что данные для цистеина вряд ли корректны, ибо в разных белках этот остаток находился в различных формах в зависимости от способа денатурации гилролизуемого белка). Очевидно,, что боковая цепь аминокислотных остатков в этом положении не должна содержать разветвлений при 0-С-атоме и Не должна быть положительно заряженной.

Таблица 4

Значения для положений от -5 до +5.

1 1 1 -5 -4 -3 -2 -1 + 1 +2 +3 + 4 + 5

Иу + 1 ,23 + 1 ,02 + 1 ,45 -1,52 -1,82 -1.15 -1 ,63 + 1,26 + 1,12

А1а -0,99 -1,16 + 1,27 + 1 ,36 + 1 ,15 + 1,08 + 1 ,33 -1,00 -1,13 + 1 ,05

7а1 +0,95 -1.00 + 1,11 + 1 ,24 -1,95 + 1,16 + 1 ,14 -1.12 -1,19 -1,30

Ьеи +0,92 + 0,90 -0,97 -7,56 + 2,46 + 1 ,ОЭ -1.09 + ! .02 -1,13 -1,45

Не -игг И ,00 + 1,29 -0,88 -5,2 5 + 1,40 + 1,34 -0,97 +0,86 +1,17

Эег + 1 ,19 -0,9В + 1,53 + 1,18 -2,5? -1,37 + 0,94 -1,08 + 1г08 + 1,07

т11г -1,08 -1,01 + 1,34 -1.03 -1,32 -2,31 + 1 ,36 +0,95 -1.08 -0,93

Мег +0,78 -1,23 -2,16 +0,91 + 1,16 -1,29 -1,23 + 0,97 +0,75 -0,61

Суа -1,08 +0,94 +0,95 -0,84 -3,55 -1,03 + 1,42 + 1,21 -0.В5 -0,95

Рго + 1 ,16 + 1 ,25 + 1,45 -1,43 -1,43 -1,89 -1,08 + 1,06 + 1 ,31

РЬе -0,95 +0,99 -2,03 -1,43 + 2,28 + 1,39 -5,13 -1,22 1 1,03 -0,92

Гуг +0,97 + 1,37 + 0,88 -3,0-4 -1,04 И ,52 -1,37 -1.18 -1,08 + 0,95

Тгр -0,74 -1,27 -1,70 -1.27 + 1,67 И ,52 -0,64 + 1 ,02 -0,97 +0,92

Н1а + 0,97 -0,80 -1,76 -0,89 -! ,66 -0,95 -1,33 + 1,12 + 1,21 + 0,80

Ьуэ +0,33 +0,97 -2,90 -1,32 -3,48 + 0,92 +0,93 + 0,96 + 1,43 + 0,91

Агй -0,36 + 0,87 -¡,72 + 1,24 -6,23 -1 ,37 + 1 ,45 -0,91 -0,98 -0,88

АБр + 1,11 + 1 ,04 + 0,95 -1,17 + 1 ,04 + 1 ,04 •-1,69 -1,21 -1,07 -0,96

АвП -1,14 -0,98 + 1 ,05 + 1 ,07 -1,10 -1,2 5 -0.98 + 0,93 -1,02 -1,05

«и -1,06 -МО Н.25 + 1 ,63 »1 ,49 -1.16 + 1 ,29 -1,14 -1.00 -0,93

аш -0,92 -0,91 -0,98 + 1,14 + 1,14 -1,09 + 1 ,08 + 0,95 -1,02 -1.16

1.01 1 ,04 1 ,43 1,32 2,22 1 ,31 1 .44 1 ,09 1 ,06 1,03

Жирным шрифтом обозначены предпочтительные аминокислоты, курсивом - нежелательные.

Если сравнивать ряд аминокислотных остатков, предпочтительных в положениях +1, со шкалой гидрофобности, легко заметить между ними весьма удовлетворительную корреляцию. Отсюда можно заключить, что гидрофобные взаимодействия в этом положении играют определяющую роль. Для положения -1 такой корреляции не наблюдается.

При обсуждении вторичноспецифичности мы ограничились областью -5 - +5, ибо трудно предположить, что для связывания суб-

страта на ферменте существенны все 20 рассмотренных нами положений. Анализ данных показывает, что требования к структуре субстратов при переходе от близких к расщепляемой связи остатков к более удаленны.! имеют тенденцию к снижению. Число индифферентных остатков в положениях -2 и +2 по четыре, в положениях -3 и +3 - пять и семь соответственно, в положениях -5 и t5 - по 11 аминокислотных остатков. Та же тенденция наблюдается и для изменения Sjj - сужение интервалов с удалением от расщепляемой связи. Гидрофобные взаимодействия в положениях -3, -2 и -)2, видимо, играют важную роль. В этой группе интересно положение -3. Все положительно заряженные аминокислотные остатки относятся к явно нежелательным, тогда как остаток глутаминовой кислоты предпочтителен. Возможно, здесь имеют место электростатические взаимодействия.

1.2.В) Связь индексов специфичности и кинетических паралеяров катализа пепсином.

Чтобы выявить соответствие кинетических параметров исследованных субстратов и индекса специфичности, мы вычислили для соединений, приведенных в таблице 3, .суммарный индекс специфичности (J^jj+^j), где Sj- значение среднего для всех остатков индекса данного положения; при этом остатку 7-аминопропилморфолина приписывали индекс остатка аргинина, а бензилоксикарбонильной группе -индекс остатка фенилаланина. Индексы специфичности для всех ост ai ков в положениях от РГ) до P¿ приведены в таблице 4.

Метод расчета суммарных индексов специфичности продемонстрирован на примере тетрапептгда ZAlaAlarhe^PheAprn.

Р4 Р3 Р2 Р, Р{ P¿

Z - Ala - Ala - Phs(Ji02) - Píie - Apm 5\j 1,04 1 ,43 1 ,32 2,22 1 ,31 1 ,44

Sjj 0,99 1,27 1,36 2,28 1,39 1,45

* =-17,50

Как видно из рис.3, наблюдается хорошая корреляция <г»0,974) суммарных индексов, специфичности и каталитических констант (Ккат<) в логарифмических координатах. Эта зависимость описывается уравнением

lnkkqt.= l3.T51n(g>1j+gr;))-31,34. (7)

Несколько худшая корреляция (М3.952) наблюдается между величинами lní^ij1"!^) и 1п(Ккаг_/К()). Здесь корреляционное уравнение

1.п(ккат/Ки) = ШИЗШ^^ЬЗбЛ?. (8)

Рис.3. Зависимость константы скорости Ккат,<а> и ккат/% ^ от суммарного индекса специфичности. "Д - Обозначения соответствуют нумерации в табл.3. о - данные взяты из литературы.

Как видно из рис.3, на одну прямую ложатся данные как по константам синтезированных нами субстратов, так и по константам соединений, взятым из литературы.

В тоже время значения Ку для тех же соединений не коррелируют с суммарным индексом специфичности (рис.4). Этот факт говорит о том, что суммарный индекс специфичности отражает лишь кинетическую специфичность, а не специфичность связывания. Вероятно, зависимость ккат/Кн от суммарного .индекса специфичности может выражать степень специфичности любого фермента, для которого такая зависимость получена. Эта зависимость может выражаться тангенсом угла наклона, Очевидно, что ферменты со специфичностью близкой к абсолютной будут характеризоваться графиком с в то же время ферменты с очень широкой специфичностью, т.е. гндролизущие любые связи с ошшакивыми скоростями, будут иметь tg*•Q.

1пКм -6-

-8 -9 -ЮН

Л7

8,12

A4 о

о

о

о

о

-Ъ

tn (ESjj

Рис.4. Зависимость К)( от суммарного индекса специфичности; обозначения те же, что на рис.3.

1.2. г) Использование пепсина в ограниченном протеолизе на оснобв данных статистического анализа.

Используя полученные нами данные статистического анализа специфичности пепсина, можно, с одной стороны, заранее определить скорость гидролиза любой пептидной связи, а с другой. - определить структуру лучшего субстрата пепсина. Полагая, что основной вклад вносят взаимодействия фермента с субстратом в области активного центра, наилучшим субстратом пепсина (см. табл.4) является -Туг Ser Азп Leu Тгр Arg Leu

Í Р4 Р3 h P1 Pi ' P2 P3

5_j 1 ,03 1,43 1,32- 2,22 1 .3t 1,44 1,09

Sjj 1.37 1,53 1,70 2,46 1,52 1,45 1,20 Суммарный индекс специфичности для такого субстрата составляет + SSj) = 21,08, отсюда по уравнению (8) находим значение ккат/км= (4,0+1,3) • 10%"'сек"1. Таким образом, наиболее быстрые субстраты пепсина - ZAlaÜnPhePheOP4P 1,1кат/км = 7,1 ' 1°6

M"1 сек""' ) и ZGlyLsuPhePheOP4P (к^Д = 4,2-Ю6 М"1сек_1> являются предельно быстрыми субстратами. Известно, что значение Ккат/Кы ограничивается величиной к] - константой скорости образования комплекса Михазлиса, которая находится в пределах 107- 108 М-1сек-1, что вполне согласуется с полученными нами данными.

Хорошей проверкой справедливости всего вышеизложенного может служить обратная операция - предсказание мест гидролиза белков пепсином, исходя из первичной структуры, данных по статистическому анализу и корреляционных уравнений. Для проверки был взят р-меланостимульрующий гормон из гипофиза свиньи. При изучении его первичной структуры было установлено, что в условиях эксперимента непсином лучше всего расщепляется пептидная связь HlSg-Phejg в последовательности -

MgAspGluGlyProTyrLyslJetSluHls-PlieArgTyrGlySerProProlysispOB

Был проведен расчет суммарных индексов специфичности для всех 17 связей. Исходя из корреляционных уравнений, найдены значения ккат/Км для всех 'этих связей. Анализ полученных данных показал, что скорость гидролиза связи His-Phe на несколько порядков превышает скорости гидролиза любой другой связи (ближайшее значение ккат/Км для связи Met-Glu в 100 раз меньше). Соответствие эксперимента и расчетных данных очевидно.

Аналогичное совпадение теоретически полученных данных с экспериментальными было получено и для расщепления пепсином трипсино-вого фрагмента Т~8 - Т-13 цепи иммуноглобулина \-типа (Вепсе-Jonss-Protein-Kera ).

В заключении этого раздела хотелось бы сказать о возможном практическом применении полученных нами результатов по ограниченному протеолиэу белков в современной биотехнологии.

В производстве рекомбинантных белков одной из стадий является специфическое отщепление целевого продукта, присоединенного к белку-носителю через соответствующий линкер. Расщепление проводят, используя бромциан или высокоспецифические протеазы, набор которых ограничен. Поэтому на наш взгляд в подобных ситуациях может быть использован широко доступный фермент - пепсин, специфически расщепляющий с высокой скоростью специально подобранную последовательность аминокислот линкера.

I.2.J) З'ерлзаич.-ццческцА анализ специфичности.

¡1з приведенных выше данных ясно следует роль вторичных взаимодействий при катализируемом пепсином гидролизе достаточно длинных пептидов. Чтоси ьилснить причины tliwî'o влияния, мы иселедова-

ли температурную зависимость констант к , Кн и ккат /Кн для гидролиза трех субстратов - гРйе^РЬеАрт, г7а1РЬе,(Р11еАря и йЬеиШ-РНеиРЬеАрл в интервале от 283°К до 310°К. Каталитические константы этих соединений при 37°С возрастают иа два порядка при переходе от ди- к тетрапелтпдному субстрату.

График Лррениуса для тетрапсптидного субстрата в отличие от графиков для ди- и трипептпдов проявляет заметную нелинейность в области низких температур. Причем такая нелинейность наблюдается для 1пккат и Зпккат /К^ от 1/Г, но не для зависимости ХпК^ от 1/Т (рис,5), которая линейна и мало меняется с температурой.

Если процесс пепсинового гидролиза протекает по трехстадийиой

Ко Ко

I * Б —и Р9 + Е

^тгу е 2

Схема 1.

схеме (схема 1), где ЕА - промежуточный комплекс ("аминофериент" или "ацилфермент"). то наблюдаемую нелинейность можно было бы объяснить изменением при низких температурах определяющей скорость стадии процесса. Однако в этом случае следовало бы ожидать, что нелинейность будет проявляться для зависимости 1пКч от 1/Т, так как в случае к3 << К2 Км=К3К3/Нг, а при к3 >> к2 Кц=К3. График зависимости 1вКкат/Кн от 1/Т (=1пк2/К5) не должен при этом отклоняться от линейного. В нашем случае же наблюдается противоположная картина (рис.5).

Другой причиной нелинейности графика Аррениуса может быть индунированное субстратом конформационное изменение фермента. В этом случае больших отклонений следует ожидать для более специфических субстратов, так как последние связываются белком, реализуя большее число контактов. Следует отметить, что конформаиионные изменения пепсина при связывании специфических субстратов и активаторов были зарегистрированы физико-химическими методами.

При сравнении термодинамических параметров активации гидролиза исследованных соединений, т.е. изменения стандартных свободных энергий, энтальпии и энтропии коиплексообразования фермента с субстратами (табл.5), обращает на себя внимание то обстоятельство, что основной вклад в свободную энергию активации вносит отрицательное изменение энтропии активации. Неблагоприятное изменение энтропии, возможно, обусловлено коифорчационными изменениями фермента в переходном состоянии реакции.

6-

8-

1пКм

7-

7-

1-

3,6

-I-1--—

15 20 25

в)

3,2 ЗА 3,6 32 3,4

1УТ-Ю3

а)" б)

Рис.5: а) и б) - зависимости изменения ккат/Ки и от температуры; в) изокинетическая зависшость ассоциации пептидов с пепсином. Номера соединений соответствуют приведенным в таблице 5.

В ряду ди-, три- и тетрапептидов практически все изменение свободной энергии активачии обусловлено понижением энтальпии активации, Очевидно, это отражает способность более длинного пептида образовывать дополнительные связи с ферментом в основном состоянии за счет удаленных от реакционного центра аминокислотных остатков.

' Таблица 5

Термодинамические параметры ассоциации и гидролиза

Л Соединение Ы* ¿н* э.е. о *аас О АНас 0 АЭ э.е.

ккал/м ккал/м

1 гРйе^Ьелрш 19,5 7,8 -39,3 -4,25 0.6 16,3

2 гУа1РПе,,А1аАрш (3,0 6.1 -40,0 -4,15 1,2 18,0

3 21еиУате,(А1аАрз1 16,7 3,4 -44,6 -4,35 1 ,9 21 ,0

Анализ изменения стандартных термодинамических параметров ассоциации показывает, что движущей силоп комплексообразования является положительное изменение энтропии системы. Энтальпия ком-

плексообразования имеет положительное значение, увеличивающееся при переходе от ди- к три- и тетрапептиду. Это согласуется с представлением об индуцированном субстратом конформашюнном изменении фермента. Следует отметить компенсационный характер изменений лй° и лЯ0 в ряду этих трех соединений с изокинетической температурой «278°(рис.5 в).

Г 3. Эффекторы и акяиваяоры ферментативного катализа.

р (атШщя и ингийировпше пепсинового ктхиза) В литературе и независимо нами было показано, что гидролиз ЯЬеиГугШ12 VI некоторых др. "медленных" субстратов пенициллопепси-ном и пепсином свиньи ускоряется при добавлении в систему пептидов, не способных расщепляться этими ферментами. Возникает вопрос, связана ли активирующая способность пептидов со вторичной специфичностью фермента. Для этого было исследовано взаимодействие ряда пептидных эффекторов с ди- и трилептидными субстратами пепсина.

Использованные нами субстраты (табл.6) содержали остаток п-нитро-Ь-фенилаланина, что облегчало кинетические измерения. Были выбраны соединения, содержащие только ч-аминопропилморфолиновую (Арга) С-звиитную группировку Ссоед. (1)-(Ш)1, загашенные как по С~, так и по Н-концевой аминокислоте (соед. Ц/)1 и не содержащие защитных групп Ссоед.(V)). Кинетические константы ферментативного гидролиза этих субстратов приведены в табл.6. В качестве эффекторов использовались не гидролизушиеся пепсином пептиды, содержащие защитные группы.

Измерялись скорости гидролиза субстратов в зависимости от концентраций как субстрата, так и эффектора. Обработку результатов проводили, используя обаую схему взаимодействия фермент - субстрат - эффектор (1).

кз к2

£ + Б -—» 1Б ;-► Е + Р

ЕЪ + Э -—» Е1Э -* ЕЬ * Р

II Л, 1|

Схема 2

Соответственно скорость гидролиза субстрата дается выражением

•чКэ + рШ

к2 аК_ + Ш Шо 151о

7 = -~-

кз + (Ы а5 -- i [5]

5 + Ш 0

В зависимости от значений а и р эффектор выступает или в роли ак-

«гора (К3 = Ка), или в роли ингибитора (Кэ = К^) реакции.

Из-за низкой растворимости некоторых субстратов и эффекторов, а также рлабого влияния ряда эффекторов на гидролиз субстратов не во всех 'случаях удалось получить все параметры активации (Ка, а и р) и параметр ингибирования (Кр. Б ряде случаев пришлось ограничиться констатацией активирующего или ингибируюшего действия эффектора. Результаты исследований приведены в таблице 6.

Анализируя полученные нами данные (табл.в), следует, во-первых, обратить внимание на тот факт, что в качестве активаторов могут выступать лишь соединения, имеющие по крайней мере одну незащищенную концевую аминокислоту, при этом субстрат также должен содержать такого рода аминокислотный остаток. Обнаружить активаторы гидролиза полностью завиденного субстрата гЬеиРйе^Арш (IV) нам не удалось. Очевидно, что для образования тройного комплекса субстрат - активатор - фермент существенное значение имеет электростатическое взаимодействие зарядов субстрата и активатора, и схему активации гидролиза по сорбшюнному механизму можно представить достраиванием субстрата с И- или С-конца в области связывающего центра. Ускорение гидролиза субстрата обусловлено в этом случае тем, что активатор как бы дополняет субстрат и, возможно, индуцирует конформациошше изменения фермента, способствующие катализу.

Интересно, что между сродством активатора к ферменту и его способностью ускорять гидролиз субстрата существует четкая корреляция. Для неконкурентных активаторов обнаружена линейная зависимость между суммарными индексами специфичности Е*^ * 5^) активаторов, вычисленными из предположения о расположении их в тройном комплексе (табл.6), и величиной р (см. рис.6). Эта корреляция описывается уравнением

1110 = 0,23 ИБу + 5ра + 2,45 с коэффициентом корреляции г = 0,99; + рассчитывали из

предположения, что размеры активного центра - Вд.

Ряд испытанных нами соединений проявляет смешанный тип активации (а ^ 1), причем один и тот же эффектор, например гЬеиЬеи-БагОН ШП). может выступать активатором по отношению к одному субстрату, НРИеРЦе^Арш (П, и конкурентным ингибитором - к другому, ЯАвлРйе^РЬеАрю (И), В отсутствие эффектора субстрат 1Ш&Р1>е^А1аАрт (III) очень медленно гндролизуется по связи Р!1е?(-А1а, однако добавление рффектора (VI) приводит к активации гидролиза, при этом расщепление субстрата происходит по связи А1а-Гпз,}. Существенное значение при этом имеет конфигурация амннокис-

Таблица 6

Расположение субстратов и эффекторов в активном центре и их кинетические константы

Роль в-ва

Субстраты и эффекторы

место в концент- К,

активном рация центре мМ мин"' мМ

м

К„

ß

h мН

v„/v.

Тип действия

3 H-Phe-PhSjj-Apm (I) (3,-sp 0,2-1 0,22 0,62

А" Z-Leu-Ser-Ala-OH (VI) (34-Sp) Q.,5-5 7,9 1 .0 69

А Z-Phe-Ala-Ala-OH (VII) (34-S2) 0,5-5 4,8 1 ,0 62

А Z-Leu-leu-Ser-OH (VIII) (3¡-3pJ 0.25-1 0,4 5.2 41

< * Z-C-Phe-Ala-Ala-OH (IX) I3d-s2! 2 6,0 смеш.

I Z-7al-ryr-Gly-;iH2 (X) Op-sp • 2 3,5**

5 H-Asn-Phejj-Phe-ApB (II) fSo-i'Л) 0,2-2 0,36 1 .05

А Z-Leu-Ser-Ala-OH (VI) (a"4-a ~3) 2 0,54 1 ,05 1 ,5 неконк.

А Z-Phe-Ala-Ala-OH ' (VII) !зл-э3) 1 ,0-5 14,3 1 ,0 20.3

I H-Phe-Ala-Ala-Oile (IX! 0-2 0,3 KOHR, 1

Т Z-beu-Leu-äer-OH (VIII) fs?-s}) 0-2 1,1 rv GJ

I Z-Ssr-Tyr-Gly-OH (XII) (Sg-Sp) 4 11.5** 1

3 H-Ala-PüSjj-Ala-Apm (III) (3g-3p) гияролизуется очень медленно

А Z-Leu-Ser-Ala-OH*** (VI) (згзг) 2 0,48 2,85

3 Z-L-8u-Phe^-Apm (IV) (3g~S.j) 0,2-1 0,65 0,73

I H-Phe-Ala-Ala-Oäle (XI) !'3гФ 8 1 ,4**

I H-3-Phe-Ala-Ala-0Me (XIII) {srs3> 16 1 3, 4

S Н-А1а-РЬея-РЬе-0Н (V) (32-3j) 0.2-2 0,48 4.2

А H'-Pha-Ala-Ala-OMe (XI) t'Sp-SgJ 2,0-10 4,3 1 .0 5

I Я-S-Phe-Ala-Ala-OSe (XIII) (s^) 0-16 10,75 конк.

Расположение в активном центре произвольно. Рассчитаны из 7^/у из предположения о конкурентном ингиби-ровании. ***Гидролиз субстрата (III) в присутствии этого активатора идет по связи Ala-Phs.j.

ИР

Рис.6. Зависимость значений р от суммарных индексов специфичности активаторов. Нумерация активаторов соответствует приведенной в табл.6. Низший индекс показывает субстрат, с которым рассчитывали величину р для данного активатора.

дотных остатков. В то время как НР1шА1аА1аОМе (XI) активирует гидролиз ШаР&е^РЬеОН (V), его знантиомер (XIII) выступает в отношении этого субстрата как конкурентный ингибитор. В случае защищенного субстрата '¿ЬеиРЛе^Арш (IV) оба энантиоыера проявляют свойства ингибитров.

Интересно сравнить, как эффективно активатор дополняет субстрат, т.е. насколько наблюдаемая при насыщении фермента активатором скорость гидролиза "плохого" субстрата соответствует скорости гидролиза пептидного субстрата, включающего все остатки как активатора, так и. "плохого" субстрата. В системе субстрат НРЬе-Р1генАрл1 (I) и активатор гЬеиЗеШаОН (VI) ккаТ(3а)= 15,4 мин."*1, где ккат. >=^кагр (ккаг='0,22 ыия~'« Р = 69, см- табл.6). Для субстрата гЬеи$егА1аРЬеРЛе(К02)Ар;п рассчитанная по индексам специфичности величина Ккат= 3500 мшГ1. Таким образом, пентапептидный субстрат должен гидролизоваться более чем в 200 раз быстрее по сравнению с динептидным субстратом в присутствии трипептидного активатора, Это указывает на не адекватность замены ковалентной связи в пептиде электростатически взаимодействующими карбоксил-ионом и аминогруппой.

Нельзя исключить, од'пНко, того, что механизм активации заключается в синтезе нового пи гида из субстрата и активатора, который затеи н гидролизуется. В 1 эм случае различие экспериментальной и

вычисленной констант скоростей может быть обусловлено лимитированием всего процесса стадией синтеза пептида.

ZPheAlaAlaOH + HPhe^PheApra —ZPheAlaAlaOFi-i!PheNPheApm.-»•

-» ZPheAlaAlaOH + HPheN08 + HPheApm

активация гидролиза по сорбционному механизму

ZPheAlaAlaOH + HPhe„PheApai —ZPheAIba 1 aPhe^PheApm -

-* ZiheilailaPhCjjOH v HPheApia -ZPüeOH + HAlaAlaPheHOH

активация гидролиза по механизму синтеза-гидролиза схема 3

В случае такого механизма ( механизм синтеза-гидролиза) субстрат и активатор образуют ковалентную, амидную связь, н далее гидролизу подвергается вновь образованный пептид (см. схему 3).

Для проверки возможности существования подобного механизма нами в качестве субстрата был выбран PhejjPheApm, а в качестве активаторов -трипептиды - ZFheAlaAla и ZbeuSerAla. Молярный коэффициент поглощения исходного субстрата при >.=320 нм равен 1300 М'^сьГ1, Ptiejj - 1650 М-1 см""1. Если активация осуществляется по сорбционному механизму, т.е. в реакционной смеси накапливается -Р1шя. ожидаемое изменение молярного коэффициента поглощения- при полном гидролизе как в присутствии, так и в отсутствие активатора должно быть одинаковым и составлять ts = 550 М-1 см-'. Если же в ходе реакции из активатора и субстрата синтезируется пентапептид, который далее гидролизуется па связи Phe^-Phe, то будет образовываться тетрапептид ZPheAlaAlaPhe;(OH или (ZLeuSerAlaPhef(OH). Для соединения такого типа e32Q= 2800 М~'см~1. т.е. изменение молярного коэффициента поглощения в результате полного превращения субстрата по такой схеме должно составлять 150Q Ii"1 «Г',

Проведение полного гидролиза HPhe,jPheApa в присутствии ZPheAlaAlaOH соответствовало изменению молярного коэффициента поглощения - 1250 irW1. Таким образом, полученные результаты говорят в пользу активации по механизму синтеза-гидролиза.

Дополнительный подтверждением такого механизма явилось выделение из реакционной снеси в качестве продуктов реакции Ala-Alq-Ph3,(, который может образовываться лишь в случае активации по механизму синтеза-гидролиза (см. схему 3).

Таким образом, получение нами данные однозначно доказывают.

что в ряде случаев механизм активации заключается в синтезе из субстрата и активатора нового пептида и последующего его гидролиза по наиболее чувствительной к растеплению связи. Не исключено, что такой механизм ускорения является единым во всех случаях активации, и при зтом получаемые результаты в конечном итоге зависят от соотношения скоростей синтеза нового продукта и его расшепленпя.

Однако независимо от механизма активации (сорбнионный или синтез-гидролиз) сущность его заключается в значительном влиянии вторичных фермент-субстратных взаимодействий на каталитическую константу скорости гидролиза (но не на Км), и эти взаимодействия являются определяющими при образовании субстратом продуктивного комплекса с ферментом.

II. Механизм протеолиза.

Амидная связь, которая подвергается гидролизу под действием протеаз, представляет собой резонансно-стабилизированную структуру с энергией стабилизации »16 ккал/моль. Порядок связей и распределение связей показано на рис.7.

-0,25 И С^Го.З Рис.7. Распределение зарядов И ло-

В^"" О рядок связей в анидной группе.

Отсюда очевидно, что атака молекулой воды или др. нуклеофиль-Шш реагентом должна быть направлена на атом углерода карбонильной Группы. Однако вола очень слабый нуклеофил (рКа -1,75), поэтому {¡екатализнруемый гидролиз амидной связи протекает исключительно ¡ледленно. Чтобы ускорить реакцию, необходимо либо увеличить положительный заряд на карбонильном атоме углерода, либо отрицательный йаряя на атакующей группе. В принципе, этого можно достигнуть тре-способами:

1. протоннрование карбонильного атома кислорода (общий кислотный катализ).

2. отшепление протона от молекулы воды (общий основной катализ ).

3. замена воды более сильным нуклеофилом, образующим с амидом энергетически более "богатое" промежуточное соединив (например, эфир), с последующим растеплением этого соединения водой (ковалентный или йуклеофилышй катализ).

К началу наших исследований по механизму действия протеаз ряд основных положений в этой области .оставался практически нерешенным. Б первую очередь возникает капвпг п тятактере каталитического

действия нуклеофильных групп активного центра на стадии расщепления пептидной связи. Эти группы могут функционировать в качестве общего основного катализатора, способствуя отщеплению протона от молекулы воды, атакующей субстрат (схема 4), или а качестве кова-лентного (иуклеофильнго) катализатора, непосредственно атакуя карбонильный атом углерода гидролизуемой связи (схема 5).

Ковалентний механизм довольно легко доказать лишь в тех случаях, когда скорость образования промежуточного "ацилфермента" существенно больше скорости его распада. Однако такое положение наблюдается лишь при катализируемом сериновыми или' тиоловыми про-теазаии гидролизе зфиров. При гидролизе пептидных субстратов задача оказывается более сложной, поскольку в этом случае промежуточный '"ацилфермент" не накапливается. По этой причине долгое время существовали противоречивые мнения относитетелъно справедливости ацилферментного механизма гидролиза пептидных субстратов химотрип-

с1ш01.1.

Лишь в 073 году в лаборатории химии ферментов ИБХ им.М.М. Шемякина АН СССР били получены доказательства тождественности механизмов катализируемого химотрипсином гидролиза эфирных и вмшшых субстратов на основе сравнения скоростей включения меченных продуктов гидролиза и тяжелого кислорода воды в субстрат в состоянии термодинамического равновесия системы.

Что же касается представителей класса кислых протеаз, то для них на основании наличия реакции транспептидашм „априори" считали, что гидролиз пептидной связи также осуществляется через кова-лентное промежуточное соединение. Для других типов пептидгидролаз сведения о механизме катализа практически отсутствовали.

XI. I.Исгледо&анце механизма действия протеаз с гюлощът> изотопного оОжена

Рассматривая вобием виде химический механизм ферментативного катализа, следует сказать, что в конечном счете вопрос сводится к тому, участвует ли молекула воды на первой стаями химического превращения субстрата и нуклеофильнал группа активного центра служит обшим основным катализатором (схема 4), или вода участвует на последующих стадиях распада промежуточного соединения, а нуклесфиль-ная группа фермента образует ковалентную связь с фрагментом субстрата (схема 5).

Для ответа на поставленные вопросы мы разработали ряд методов, позволяюяих различать коваленгный и обаий основной механизмы гидролиза амилнкх связей.

» Л

1 к.

Г Л1 Г 2 I

Е-Х Н-0 0=0 —» Е-ХЗ-НО-Й-О" -—* 1-Х" с=1

^ 1НЙ2

к

Й3НН2

Ан

5

Е-Х" + С=0

л.

Е-ХН ~0-С-ННЕо —Е-Х" + 1=0

1- I

6н ЮШ,

схема 4 (общий основной катализ)

к< * к, ?1 ?1

¿Вй, к

I" "Ч Г Г Г

Е-Х" С=0 Е-Х-С-0" -—> Е-Х-С-0 -—► Е-Х-С-0- -—► Е-Х" + С=0

¿н

ш, -I ;даа

к3ю2

1 1

-->■ Е-Х" + ¿=0

+ ¿=0 Де

схема 5 (нуклеофильный катализ)

13п

II. I. а) иосл&Оование вклтекия тяжелого кислорода гр0) из воды в непрогидролизовактй субстрат.|

Как видно из схем 4 и 5, включение тяжелого кислорода в карбонильную группу .гидролизуемого субстрата может происходить лишь в случае общего основного катализа и при условии, что скорость распада промежуточного тетраэдрического адпукта в направлении исходного вещества выше, чем скорость его распада в направлении продуктов реакции (к_1>>к2). Таким образом, обнаружение включения 180 в субстрат свидетельствует в пользу общего основного механизма катализа, тогда как отсутствие такого включения Не дает оснований для ответа на вопрос о типе каталитического механизма.

Этот метод иироко применялся при изучении неферментативного гидролиза с целью идентификации промежуточного тетраэдрического соединения. Однако попытки обнаружить обмен кислорода в ходе химо-трипсинового гидролиза оказались безуспешными, Им подтвердили это наблюдение. Но выяснилось, что в случае реакций, катализируемых пепсином. леЯнинаминопептидазой и термолизином, наблшгатся включе-

1Я

ние 0 в непрогидролизованный субстрат (табл. 7).

Хотя эти данные свидетельствуют в пользу общего основного катализа указанными тремя ферментами, как оказалось при дальнейшем исследовании, они не могут рассматриваться как доказательство образования тетраэдрнческих промежуточных соединений. Изучение кинетики обмена кислорода в субстрате и зависимости степени обмена от концентрации субстрата (рис. 8) показало, что обмен в заметной степени происходит лишь при значительных степенях гидролиза субстрата, Снижение концентрации субстрата с 0,3 до 0,2Н при одинаковой глубине гидролиза резко снижает степень обмена. Все это наво-

Таблица 7

Включение из тяжелокислородноЯ воды в карбонильную группу непрогидролизовагашх субстратов.

Фермент ш0 мкМ Субстрат 1Б]0 нМ Условия Обмен вй на 100% Но,80

Химотрип- 400 ЬеиЬеиНН2 1 ,0 0.05М трис/НС1 0

син" рН 8,0, 37°С, 4 4.

Пепсин 30 ЬеиТугНН2 7,2 0,2М апетат, рН 3,6 9-1,5

20°с, 72 часа

Лейцинами- 0,5 1еиШ2 300 0,5« трис/НС1 48±3

нопептида- рН 8,5, 22°С,

за 20 мин,

Термоли- 27 ЬеиЬеиН!^ 2,0 0,1М трис/НС1, • 52-5

зин 1пШ СаС1о, рН 7,1, 374:, 2 ч.

-е-

дит на мысль, что важную роль в обмене кислорода в лейцинамиде играют продукты гидролиза - лейцин и аммиак, и обмен может быть связан с переносом лейцина на образующийся в ходе гидролиза аммиак (схема 6). Аналогичные данные были получены при катализируемом пепсином гидролизе ЬеиТугКН., в присутствии лейцина и '4С-тирозинамида.

Следует отметить, что соотношение степени включения 1®0 и (или 14С) в субстрат, которое, учитывая разбавление метки, должно быть 1:2, на самом деле близко к 1:1, т.е. наряду с трвнспептида-цией, вклад в обмен, по-видимому, вносит образование и распад те-траэдрического промежуточного соединения (схема 4).

I + й

л

Но,80

15

Ш

Е К.

°он

ян2в2

й, -С-' 5Ш2

нн2н2

схема 6.

I о

Таким образом, включение. 0 в непрогилролизованный субстрат при инкубации последнего с ферментом в тяжелокислородной воде может служить доказательством общего основного катализа. Однако при этом не следует забывать, что включение кислорода может быть следствием реакции транспептидашм и для вычисления величины собственного обмена необходимо проведение дополнительных экспериментов.

Обмен, %

5040 30' 20-1 Ю

ОБмен.%

АО 30' 201 20

Ю-0

12 % 16 18 20 Мин

»-//-т— 0,1'

~02

0,3 [БШ

Рис.8, а) кинетическая кривая обмена кислорода в амидной группе лейцинамшш, катализируемого лейшшашнопептидазой. Цифры на кривой - степень гидролиза лейцинамида.

б) зависимость степени обмена кислорода в лейцинашше от начальной концентрации субстрата при степени гидролиза 80%.

II. I. 0) исследование Включения тяжелого кислорода воды в продукт катлизируехой форлетол пранапеппидации по пипц ацилъного перекоса.

Многие лротеазы катализируют реакции транспептилании по типу ацильного переноса (схема 7). Если перенос ашмьной группы происходит из ацилфермента (схема 5), т.е. без участия воды, то, прово-I р

дя реакцию в Н^ 0» иы не обнаружим тяжелого кислорода в амидной группе продукта транспептилании. Очевидно, что если реакция идет по схеме 4 с участием воли на первой химической стадии процесса,

то должно наблюдаться включение 180 в продукт транспептидацни, которое будет составлять 509! от метки (см.схему 4)..

ÍU«,

I-C00H + RC0MHR1 --<■ fE-CO-O-COR! ~—Е-СООН + RC0OTR2

схема 7

Необходимым условием такого включения должно быть свободное вращение карбоксильной группы ü-концевого фрагмента субстрата в комплексе с ферментом. Таким образом, отсутствие включения может и не быть свидетельством в пользу механизма ковалентного катализа, тогда как наличие включения четко говорит о протекании реакции по общему основному механизму.

Данные таблицы 8, в которой приведены результаты опытов по включению тяжелого кислорода в продукты транспептидацни, катализи-

Таблица 8

Содержание 180 в анидной группе продуктов транспептидацни*.

Фермент Изучаемая реакция Содержание

180 в %.

Химотрипсин Папаин

2LeuLeufiH,

Leuleuleu + LeuHH-, ÜHj

ZOlyHHg f LsuGly ZSlyLeuGiy + NH3 0

ZGlyOIie + LeuGly —* ZGlyLeuQly +■ NeOH 0

Кврбоксипеп-тидаза У

■Пепсин

Лейцинамино-пептидаза.

ZPheAla + LeuHH ZPheO.'ie + Leulllú

2

ZíhebeutíHg + Ala ZPheLeu.'lHo + MeOH

2LeuTyrNH2 ^ Leubeu + 2Туг1Шг

2LeuIlH0 ,1

21 OlteuKH,

leuLeuííH, t HH-j

¡ra

[ OJLeuLeufiH, t ЯН.

3

Термолизин 2Leuí.euNH3 —► leuLeu + 2LeuIIH

2

0 0

56Í10

48±3 55ÍS

47±5

* Условия те же, что и в таблице 7; подчеркнут продукт, в котором измеряется содержание метки. Измерение масс-спектрокетрическое.

О

руемой различными протеаэаии, показывают, что сериновые и тиоловые протеазы, к которым относятся химотрипсин, папаин, карбоксипепти-

даза У, функционируют по ковалентному типу катализа с образованием промежуточного аиилфермеита. Остальные, перечисленные в таблице ферменты, относящиеся к аспартильным и металл-зависимым эндо- и экзопептидазам, функционируют по типу общего основного катализа с участием воды на первой, химической стадии процесса.

II. 1. 8) исследование скорости обмена кислорода 6 карбок-сильков группе ацильного продукта гидролиза на 1в0 из бобы 6 ои-суясяйче и 6 присущешбии второго, шинного продукта реакции.

Известно, что многие протеолитические ферменты катализируют обмен атомов кислорода в карбоксильной группе ацильного продукта гидролиза пептида на ,80 из воды. Если в систему ввести второй, аминный продукт гидролиза, то наряду с реакцией обмена будет происходить обратимая реакция синтеза - гидролиза пептида, так же

приводящая к включению яукта.

(8,

О в карбоксильную группу ацилыюго про-

нуклеофильннй катализ

к

1-Х"

и

+ $=0 ' ¿н

обпий основной катализ

Ег9

И

II

«

н2»

Е-Х"

схема

Когда последняя реакция происходит через ковалентный ацилфермент •{схема 8), то она не может ускорить процесс'обмена кислорода, т.к. вода те участвует в образовании ашифермента. Если же реакция снн-тсза-тшпролиза идет по общему основному механизму и скорость ее

.превышает скорость собственного обмена, то введение амшшого продукта должно увеличивать наблюдаемую скорость обмена атомов кислорода в карбоксильной группе ацильного фрагмента субстрата (схема 8). "

Полученные нами данные по скорости обмена кислорода в аниль-ных фрагментах субстратов в отсутствие и в присутствии амшшых фрагментов представлены в таблице 9.

Таблица 9

Скорости обмена кислорода

Фермент Субстрат и вмино- Время Макс.ско- Отношение компонента инкубации рость об- скоростей

мин. мена Н мин-' обмена

Химотрипсин АсР1)еОН АсРЬеОН + А1аННг АсРЬеОН + 31уНН2 1.8 0,8 1.0 Ю-5 1СГ® 10"5 0,44 0,56

Пепсин АсРЬеОЙ 360 АсР11еОН+РЬеА1аАЛ а0!4е 360 2.5 5.6 Ю-5 10 0 2,2

Лейцин- аминопеп- тидаза ЬеиОй 8 ХеиОН + НИ4С1 8 ЬеиОН + Ьеи1Ш(СН2)20Н 8 1,6 1,5 3,5 ю-3 10"3 ю-3 0,9 2,2

Карбокси-пептида- АсРЬеОН АсРйеОН + РЬеОН 7,9 1,8 ю-6 ю-5 2,3

за А

Эти данные вновь подтверждают ковалентний механизм гидролиза, катализируемого сериновой протеазой - химотрипсином и общий основной катализ аспартильными и металл-зависимыми протеаззми. Отсутствие ускорения обмена в лейцине при добавлении аммиака указывает на то, что в этом случае скорость синтеза лейцинамида и его гидролиза меньше скорости собственного обмена кислорода. Действительно, расчет скорости обмена за счет синтеза - гидролиза для этого случая дал значение 8,3-10~6 Н мин что почти на три порядка ниже скорости собственного обмена в леГшине.

IГ. 1.г! Исследование обхена кислорода в кеяо~гь<№е кеяохча-лоеов - ччгибчяосэ5 прэтеолишичеотх ¡(есленпов.

Участие молекулы води на первой химической стадии фермен-

тативного гидролиза может приводить к обмену кислорода группе ингибиторов - аналогов субстратов протеаз {схема 9).

кето-

Е-Х Н-0 ¿=0 -^ 1нгк!

К

Е-ХН НО-С-О :

¿н2к,

я

Е-Х~ + Н-0 + А=0 г I

СН-Е,

схема 9.

Мы синтезировали ряд подобных ингибиторов, определили значения К^ и исследовали обмен 1®0 в кето-группе этих ингибиторов в присутствии и отсутствие ферментов. Полученные данные представлены в таблице 10. Они полностью подтверждают выводы, сделанные на основе использования приведенных выше методов установления механизма катализа протеолитическими ферментами.

Таблица 10

1 й

Обмен 0 в кето-аналогах субстратов

Фермент

Кето-аналог

К

1

Обмен в %

мМ с фермент, без фермен.

химотрисин СеН5С01ШСНСаСН2СН2СЕ)ОС.Ч О,! 5 10 ¿н2сбн5

10

Карбокси- СбН5СОМНСНСОСН2СНгСООН 1.0 70

пептида-за А

Лп

иН2С6Н5

10

Лейаина- НгНСйСОСН2Сй2СООЯ

ыинопеп-тидаза *

СНгСЙ(СН3)г

0,05 65

20

-ч -7

Условия: III = 1-10 М, [Е1 = ЫО !Л, время инкубации 2 часа,

рН 7,2. *рН 8,5,

II. 1. д)■ исследование вк.'.ючешя !80 6 групяч активного ц°чи-са .

В тех случаях, когда нуклеофилыюй группой активного центра является карбоксильная группа остатка аспарагнновой кислоты (например, пепсин}, дополните.•■мюе свидетельство с пользу общего ос-

новного катализа можно получить, исследуя включение '0 в карбоксильные группы активного центра фермента, При проведении реакции

1 я

ферментативного гидролиза в Н2 0 в случае образования ковалент-ного промежуточного продукта последний при распаде может включать метку в фермент.

Чтобы проверить эту возможность, пепсин инкубировали в тяжелокислородной воде с субстратом - АсРЬеТугОН. Фермент далее инги-бировали И-диазоацетил-М'-и.Д-динитрофенилЬэтилешшамином и 2,3-эпокси-3-(п-нитрофенокси)-пропаном, реагирующими, соответственно, с карбоксильными группами остатков Азр-215 и Азр-32 активного центра (схема 10).

Авр-215-,—СООЙ й

и

Аэр-32

-с00 йнй

-СОШШ, н 180

-соосои

-со18он

N СНК 2 2

-с0,80н 1!/ил" сн2—снк3

-со18осн2к2

Ой"

со'80СН.,СН1Ц

-соои

-соон

Н,о0СН2К2 Й,80СЯРСН1Ц

С. I ^ с I о

6н 6н

1*2 -с0г1н(сн2)21шс6н3(то2)2 е3 -сн2:,:6:14л32

схема 10,

Полученные производные подвергали мягкому щелочному гидролизу и определяли содержание 180 в отщепившихся ингибиторах. Как видно из схемы 10, в случае; если карбоксильные группы фермента содержали метку, она должна обнаружиться в продуктах щелочного гидролиза. Кроме того, было определено содержание метки непосредственно в АзрСООСН2Н2 (схема 10), которое было получено в результате растепления обработанного диазоингибитором пепсина препаратом "Оризина". Ни в одном случае не наблюдалось обогащения этих продуктов тяжелым кислородом. Таким образом, эти данные указывают на отсутствие ко-валентного промежуточного соединения в ходе пепсинового катализа, что однозначно свидетельствует об общем основном механизме пепсинового катализа. ,

Протеазы, для которых нами были проведены исследования по механизму действия представлены в таблице 11.

Суммируя данные по механизму растепления вмкдных связей про-

2

Таблица 11

Пептигидролазн с установленным типом катализа при гидролизе

пептидов.

Фермент

Химотрипсин Карбоксипзпти-даза Y Папаин Пепсин

Карбоксипепти-даза А

Лейшшашшо-

пелтидаза

Термолизин

сериновая нуклеоф. еериновая нуклеоф.

тиоловвя карбоксильная металло-зависим.

нуклеоф. об лий основной

Группа Тип ка- Использованные подходы тализа в б в г д

+

+ +

+ + + +

+ +

+

t

+

+

теазами, можно представить, что четыре группы протеаз (сериновые, тиоловые, карбоксильные и металлозависимые) по типу осуществляемого ими катализа могут быть разделены на две группы:

1 группа - фермента, осуществляющие гидролиз по нуклеофиль-ному механизму; к ним относятся сериновые и тиоловые протеазы.

2 группа - ферменты, осуиествлямие гидролиз по общему основному механизму; к ним относятся карбоксильные и металлозависимые протеазы.

Полученные результаты ставят вопрос о том, как пептидгидро-лазы второй группы катализируют реакции транспептидацни, учитывая отсутствие ковалентного промежуточгого соединения с переносимой группой.

111.Транспепшидация.

' Еще в 50-х годах было показано, что иротеолитические ферменты обладают способностью не только расщеплять или образовывать пеп-- тилные связи, но и катализировать реакции транспептидацни. Существует два вяла подобных реакции:

1) реакция транспептидацни по типу ацильног.о переноса -О О

SEI

к-:-:™, + ¡¡2ю2 -—► R-c-NHü, * к,:ш2

донор акцептор

2) реакция транспептидашш по типу аминопереноса -ООО О

к2 -¡5-ОН + Й-1-ИН-В, + П-5-0Н

акцептор донор

В подобных реакциях исходный субстрат (пептид) обычно называют донором, а соединение, на которое происходит перенос фрагмента донора, акцептором транспептидации.

Вероятно большинство ферментов обладают способностью катализировать реакцию транспептидации. Подобные реакции известны для химотрипсина, трипсина, папаина, пепсина, лейшшаминолептидазы, термолизина карбоксипептидазы У. Однако ни нам. ни другим иследо-вателям не удалось обнаружить реакцию транспептидации для карбоксипептидазы А.

Говоря о важности реакции транспептидации в энзимологии, следует сказать, что изучение еб является часто единственным способом исследования промежуточных продуктов ферментативной реакции.

III.I. Исследование аяинопереноса, тшализирцелого пепсином, с использованием хромгеннт субстратов.

К началу наших исследований изучение реакции транспептидации носило, главным образом, качественный характер из-за отсутствия удобного метода регистрации начальных скоростей образования продукта реакции. Поэтому нами был разработан новый способ регистрации реакции транспептидации, основанный на использовании в качестве акцептора хромофор-содержаших соединений, таких, как производные п-нитро-Ь-фенилаланина, имевших различную величину молярной экстинкшш в зависимости от наличия или отсутствия свободной карбоксильной группы. В системе, содержащей нехромофориый субстрат, акцептор - Н~ащ|л-РПе}(Ьн и фермент, образование продукта транспептидации должно сопровождаться изменением оптической плотности при соответствуюжей длине волны.

На рис.9 показаны кривые образования продуктов транспептидации - гРЬе^Тугоа и гРЬе^РЬзАрт при катализируемом пепсином гидролизе АсРЬеТугОН и АсРйеРйеАрЯ!.

Что касается пепсина, то, ранее существовала точка зрения, что транспептидация по типу "ашшопереноса" имеет место лишь при гидролизе субстратов со свободной С-концевой карбоксильной группой. Вероятно, отрицательные результаты по обнаружению реакции транспептидации с субстратами АсРЬеТугПН, и АсРйаРПеОЕ! связаны с низкой их растворимостью. Действительно, при уменьшении концентрации

1Р3}/Юэм

432Т

~20 ДО 80 80 100 120 Мин

Рис.9. Кинетические кривые образования продукта транспептидаши для субстратов АсРйеТутСН (а) и АсРЬеР1шАрт (б) и акцептора гРЬе^ОЯ.

АсРЬеТуг в 10 раз скорость транспептидапии в присутствии АсРЬе^ существенно падает. Поэтому в качестве субстратов с. защищенной С-карбоксильной группой мы выбрали предложенные нами . т-морфолшопропиламиды пептидов, которые обладают растворимостью в воде близкой к растворимости соединений со свободной карбоксильной■ группой. Нами были использовании субстраты АсРиеРЬеАри. АсТугРЛе-Ари н С1у01уР1)е?1)еАрт, которые в присутствии акцептора йРЬвд и пепсина образуют с достаточно высокой скоростью продукты транспептидапии.

Полученные нами данные позволяют сделать заключение, что наличие реакции транспептидапии, катализируемой пепсином, является общим свойством, а не принадлежит только какому-либо виду субстратов, как это предполагалось ранее.

111.2. кинетика траиспептдщии.

Применение хромогенного акцептора позволило нам провести подробное исследование кинетики реакции транспептилашш.

Для. определения начальных скоростей образования продуктов реакции транспептилашш в зависимости от концентрации субстрата 131, акцептора Ш и фермента Ш рассмотрим следушую систему урввнешШ -

К» Кт Хг}

Е + Г> -г^-!» ЕЗ -К' -I *■ Р, (9)

К' +

Р,

к к

15' + А -—Е5'Л -I + Р3 (10)

к-4 К к

Е + Р3 —ЕР3 —I 1- Р2 + А (11)

I г А -—¿у 1А (12)

где Ей' - "амииофермеит", Р( и Р2 - соответственно К- и С-концевыа продукты гидролиза субстрата, Р3 - продукт трвнспептидации.

Предварительно нами были определены константы гидролиза исходных субстратов и продуктов транспептидации (таблица 13).

Таблица 12

Константы скорости гидролиза субстратов-доноров и продуктов транспептидации.

№ Соединение (5,1 1Е!а ккат К„

мМ мМ мин-1 м!1

1 АсРПеТугОЯ 3,0-20 0,05 1 ,62-1,04 43,9-2,86

2 АсТугТугОН 8,0-40 0,05 0,63*0,27 144*63

3 2РПе(Шг)ТугОН 0,25-1,5 0,05 0,63*0,11 4,71-0,83

4 АсРйеРЬеАря 1,0-5,0 0,005 6,12-0,22 2,37*0,1

5 НС1уС1уР11еРиеАрга 0,8-5,0 0,00025 56,5-21 3,87*1,5

6 гРЬе <Н02)РЬеАрл 0,3-1,0 0,004 2,02*0,10 0,51*0,03

рН 4,6, 0,111 ацетатный буфер, 37°С.

Из таблицы видно, что скорость гидролиза продуктов транспептидации не превышает скорости гидролиза исходных субстратов, и за время измерения начального периода реакции транспептидации количество прогидролизованного продукта ничтожно мало. Исходя из этого, уравнением (11) можно пренебречь. Кроме того, так кап величина К^ « !0"2!< на порядок выше концентрации акцептора (10"^), то конкурентным ингибироданием можно таете пренебречь. Далее, допустив, что Ш>Ш. и к7<<ку получаем следующее уравнение для начальной скорости реакции транспептидации-

ТТ = __У*У*У"о_

КТ if <Vl51o' + Ш0 if <V[SV + ulo[S]o

К « + kc lc i + ko

где % = \4 . а Кй - .

После- преобразования этого уравнения но методу двойных обратных величин имеем:

К3 .

КТ Ц км ч [S]0 1 1 К,, + tS!0 1/т --(.J-—j — + t-+ —а-£ ). (14)

Т *5Шо IS}0 Ш0. K5m0 k2tEVS}0

Из этого уравнения видно, что измеряя начальные скорости реакции транспептилшнга при постоянных концентрациях субстрата IS1 и переменных концентрациях акцептора Ш и обрабатывая полученные результаты по методу двойных обратных величин 1/?т от 1/Ш0> получаем из отсечения на оси ординат значение

■ а_ J_ , С51о. ()5)

К5!1]0 k2iE)0ISJ0

а из пересечения с осью абсцисс, значение

1 (Sk k5 b = - (-2— f -Ч (16),

кТ(эфф) км + tsIo k2 K3

гле кто$ФГ •

В выражении (15) второе слагаемое - величина, обратная скорости гидролиза субстрата в отсутствие акцептора и может быть определена в независимом опыте; Это позволяет найти величину константы скорости транспептиданю! далее учитывая, что для пепсинового катализа ^^кат' М(ЖЮ найти величину

Аналогичный вывод приводит к выражению начальной скорости гидролиза субстрата в присутствии акцептора ~ koUlS] ГЕ1„

7г= -0-2--- (17)

КГ S~!Km + [SV + tAio + [S V + шо[5!о

Анализируя выражения ¡13) и (1?) - скорости транслептидашш и скорости гидролиза в присутствии акцептора, можно сделать ряд выводов в отношении механизма действия пепсина.

1. Субстрата, имевшие одну л ту же транспортируемую в ходе транспептидации группировку, должны характеризоваться одинаковыми

константами кс

«Г

Значение КГ(Э,М) = %

к

3

для таких субстратов будут обратно пропорциональны величинам !!кат(;:!:^) этих субстратов.

3. Отношение скорости гидролиза к скорости транспептидации для каждой пари субстратов указанного типа должно быть равно и линейно зависеть от величины обратной концентрации акцептора.

II

v„

кзкт 1

(18)

"Г 1й,о

Нами были определены велпчини констант транспептидации для двух пар субстратов:

I. а 1 AsPheTyrOH II.a) AcPhePtieAprs

б) АсТугТугГГп 6) HGU'GlyPhaPiteApm.

Субстраты второй пари имеют особое значение, так как позволили нам впервые обнаружить реакцию транспептидации в случае субстратов с защищенной С-концевой карбоксильной группой. Получение результаты приведены в таблице 13.

Таблица 13

Константы транспептидации и отношение скоростей гидролиза и

траисиеитиаации.

Субстрат

-1

мин

Кн

'(эфф) 1.11Í

(а) К',

Т( =

(о) 'гидр.

W7^ КТ(Эфф)(аТ

V

трансп.

AcPheTyrOH (а) 3,10 0, , 1 56 ?,, 56 2 ,72 22,0

АсТугТугОН (б) 2,03 0, ,424 22 ,2

AcPhePheApm (а) 4,65 1 , ,697 9,65 351

HGly'jlyPhePlieApai (б) 4,89 0, 176 38'J

рн 4,61, 0.1IÍ ацетапшп буфер, 37 С.

Как видно из этой таблицы, два из трех предположении, сделанных нами ранее, хар.мо подтверждается, а именно, соышлавт ы:ли-чини к^ для каждой из нар субстратов и выполняется обратно пропорциональная зависимость величин И ккат этих же пар сусстра-

Рис. 10 и данные таб. 13 демонстрируют выполнение третьего условия: линейную зависимость отношения скорости гидролиза и транспепгидашш от обратной величины концентрации акцептора и совпадение этих зависимостей для каждой пары субстратов.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что гидролиз субстратов, содержащих одинаковую С-концевую группу, происходит с образованием общего для них промежуточного соединения с пепсином, как в случае субстратов со свободной карбоксильной группой, так и в случае амидов пептилов. Однако здесь очень важно отметить, что из полученных нами данных следует лишь доказательство образования при пепсиновом катализе промежуточного комплекса фермента с переносимым фрагментом субстрата, и в то же время ничего нельзя сказать о природе этого промежуточного продукта.

Однако, как свидетельствуют данные по исследованию гидролиза в тяжелокислородной воде, пепсин не образует ковалентное промежуточное соединение и следовательно соединение фермента с переносимым фрагментом субстрата имеет нековалентную природу. Как же можно объяснить в этом случае реакцию транспелтидации?

Рис. 10. Зависимость отношения скоростей гидролиза к скоростям транспептпдацш! от концентрации акцептора.

а) АсРйеТугОН —о—о — , АсТугТугОН — л—д—

б) АсРПеРПеАрз) —о—о — . НС 1УБ 1уРПеРПеАрп1 — й—Д—

Если реакции переноса идут из нековэлентного комплекса фермент-продукт. то этот комплекс лолкен существовать достаточное время, чтобы обеспечить связывание акцептора транспеппшашш и

образование химической связи между переносимым фрагментом и акцептором.

Скорость распада комплекса фермент-продукт можно оценить из уравнения (Ш), если допустить, что к3«к_4:

к3 = VA10 * <,9>

Принимая значение • 107!Г1с-' и используя данные таблицы 13, можно показать, что константы скорости распада комплекса фермент-продукт, необходимые для обеспечения наблюдаемых скоростей гранспептидашш, составляют 10-50 с-'. Однако реально наблюдаемые константы скорости этого процесса составляют 1-10^ - 1-Ю5 с-'.

Это противоречие можно репить, если предположить, что диссоциация комплекса фермент-продукты реакции происходит ступенчато

К- .. Кр Ка К,

Е + S ES —^ EVP| Р2 Е Р| EP1 7-i«- Е t Pj ,

h

где зведочка указывает на особое (конформационное) состояние фермента. В этом случае кажущаяся константа диссоциации комплекса Е*Р| будет К1(каж)= к^ку (1 +Kq) , где Ка - I IP,I/1Е*Р,I. Если KQ>1, то наблюдаемая константа ингибпрования продуктом т.е.

характеризует лишь образование комплекса IPj. Превращение 1Р( в Е*Р1 лимитируется в этом случае низкой константой скорости Uc.q) в реакции:

Е fi . £Pi •

Если превращение*. Е*Р^ в ЕР( идет , с константой скорости (liq=K3) порядка 10-50 с-1, то при Kg>l должна быть меньше указанных величин.

Таким образом, можно предположить, что транспептидация происходит в комплексе E*Pt, способном связывать акцептор. Образование этого комплекса легко идет из субстрата в ходе его гидролиза. Если же в системе субстрата нет, то образование комплекса Е*Р, ограничивается низкой скоростью преврапения ЕР( в Е*Р,. В этом случае продукт и акцептор могут реагировать, образуя новый пептид в количестве, определяемом константой равновесия всего процесса.

Очевидно, что комплекс Е'Р^ может распадаться, элиминируя не только Р|, но и Р2- В зависимости от относительного сродства обоих продуктов в эгсм комплексе может происходить реакция аииль-

кого переноса или ашшопереноса. Так, в случае пепсина и субстратов со свободной карбоксильной группой рядом с гидролизуемой связью происходит преимущественно ампноперепос, а у субстратов со свободной аминогруппой наблюдается в основном аинльный перенос.

IV. Заключение.

Приведенные выше данные показывают, что субстратная специфичность пепгидгилролаз определяется как взаимодействием остатков, непосредственно образующих расщепляемую связь, так ц удаленных от неб остатков, прячем для разных ферментов вклад вторичных взаимодействий может быть разным. В случае пепсина вторичные взаимодействия влияют, главным образом, не на связывание (КИ), а на собственно катализ (ккат ). Таким образом, значительная часть суммарной энергии взаимодействия фермента с субстратом расходуется на пониженно активашшшюго барьера химической стадии. Каков же механизм использования энергии связывания субстрата для понижения актива-циошгого барьера? Ми полагаем, что возможное объяснение заключается в следующем. Первичная и вторичная специфичности фермента проявляются на разных стадиях образования продуктивного фермент-субстратного комплекса. На первой стадии реализуется первичная специфичность, т.е. субстрат как бы „заякоривается" ферментом (рис.11),

Рис.11. Схема связываания субстрата с ферментом.

. на второй стадии реализуется вторичная специфичность и происходит точная ..подгонка" фермента и субстрата. При этом продуктивный фермент-субстратный комплекс приобретает особое состояние (см. ниже).

В таком случае наблюдаемое значение К,

Е *

л.

Е5

V

К,

м(кпж) е*г1р2

для следующей схсмы

п т.д.

Ц IЕ* 5| к Кр

«мскажг тп; -где кга ]нг13 ккаг-= '

Если равновесие сдвинуто в сторону £3, т.о. К^О, наблюдаемое значение а Ккат= т,е> для субстратов с одинаковой (или сходной) „заякориваемой" группой значения КМ(КаЖ) будут оди-наковши, а к будет изменяться в зависимости от положения равновесия ЕБ -—»- Е*3. Такая схема подтверждается прямыми данными, имеющимися в литературе, о ступенчатом образовании фермент-субстратного комплекса, а также нашими данными по транспептидации.

В чем же особенность строения комплекса 1*3? Наши данные показали, что для аспартатных и металлозависимых протеаз нуклеофиль-ным агентом, атакующим субстрат, является молекула воды, т.е. очень слабый нуклеофил. Чтобы обеспечить наблюдаемое ускорение в случае ферментативного катализа необходимо предположить, что в продуктивном комплексе или сильно повышается нуклеофильность связанной води или дестабилизируется расщепляемая связь. Базируясь на приведенных в этой работе данных, а тага: других данных, полученных как в нашей, так и в других лабораториях, была разработана концепция (Антонов В.К.), согласно которой в продуктивном Фермент-субстратном комплексе амштая группа субстрата резонансно-дестабилизирована за счет, главным образом, выхода карбонильного атома углерода из плоскости С , II и 0 атомов („нирамидцдизаиил"), Эта концепция легла в основу гипотезы, позволяющей объяснить высокую эффективность и специфичность ферментативного гидролиза пептидной связи пептидгидролазами.

Вывода^

1. Разработан метод статистического анализа расщепления пепсином белков и пептидов, Метод позволяет рассчитать скорость гидролиза пептидных связей в любой последовательности аминокислот.

2. Предложен новый тип пептидных субстратов аспартильних про-теиназ с т-морфолннпропилашщной группой, облапавших высокой растворимостью в широкой области pli.

3. Впервые обнаружены активаторы пепсинового катализа и исследован механизм актив' ции.

4. Созданы методы, позволимте надежно устанавливать механизм действия любых протеаз, основатше на исследовании ферментативных реакций в тлжелокпслоролной воде. Показано, что сериновые и тиоло-вые протеиназы (химотрипсии, карбоксипьптилаэа У, папагш) функшш-

нируют по нуклеофильному механизму, в то время как карбоксильные и металлозависимые протеиназы (пепсин, карбоксипептидаза А, лейцин-аминопептидаэа, термолизин) функционируют по общему основному механизму.

5. Впервые разработан метод непрерывной регистрации реакции транспептидаиин с использованием нового типа хромогенных акцепторов.

6. Доказана возможность прохождения реакции транспептндации через нековалентиый промежуточный продукт.

7. Предложена классификация протеаз, основанная на механизме их действия.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Тиходеева Л.Г., Зинченко A.A., Румш Л.Д., Антонов В.К. Новые субстраты пепсина. - ДАН СССР, 19ТЗ. т..214, с. 355-358.

2. Румш Л.Д., Тиходеева А.Г., Антонов В.К. Роль Н-ациламиногруппы б образовании продуктивного комплекса пепсина с субстратом. -Биохимия, 1974, т. 39, с. 899-902.

3. AntonoY V.R.. Raus)! I.D., Tlkhodeeva A.C. KlnetlC3 oî pepsin catalysed transpeptldatlon: evidence ior the amino-enzyme Intermediate. - FEBS Lett., 1974. 4. 46, № 1. p. 29-33.

4. Тиходеева А.Г., Румш Л.Д.. Антонов B.K. Стадийность катализируемого непсином гидролиза пептидов. - Биоорган, химия, 1975, т. 1 , № 7, с. 993-994.

5. Зинченко A.A., Румш Л.Д., Антонов В.К. Статистический анализ специфичности пепсина в отношении гидролиза белков. - Биоорган. химия, 1976, т. 2, № 6, с. 803-810.

6. Михайлова А.Г., Пожарский С.Б., Костецкий П.В., Румш Л.Д., Антонов В.К. pH-Зависимость катализируемой пепсином транспептидаиин по типу аминолереноса. - Биооорган, химия, 1977, т. 3, .4 8, с. 1090-1099.

7. Зинченко A.A., Румш Л. Д.. Антонов В.К. Кинетический и термодинамический анализ специфичности пепсина. -'Биоорган, химия, 1977, т. 3, JS 12, с. 1ВБЗ-1670.

S. Antonov V.R.. Qlnodman I.il., Kapltannlkov Yu.V., Barehevskaya Т.Н., Gurova A.G., Rumsh L.D. Mechanism ol pepsin catalysis: general base catalysis by active-site carboxvlate l?n. - FIBS Lett., 1973. 7. 83. If U p. 3'-93.

9. Зинченко A.A., Гуня Л.Д., Антонов В,К. Активация и шп'Нбирава-

Hue пепсинового катализа. - Биоорган, химия, 1978, т. 4, № 8, с. 1122-1128.

10. Антонов В.К., Гинодоан Л.М., Руш Л.Д., Капитанников В,В., Баршевскал Т.Н., Явашев Л.П., Гурова А.Г., Волкова Л.И. Как различить ковалентнин и общий основной механизмы ферментативного гидролиза? - Биоорган. химия, 1980, т. 6, № 3, с. 436-445.

11. Aritonuv 7.К., Rums!) L.D., Zinctienko A.A. The role of secondary specificity in catalysis by proteolytic enzymes. - Irontiers of bloorganlc chemistry and mol. biology. Pergamon press Oxford and Ilevi York, 1980, p. 29-34.

12. Antonov V.K., Glnodman L.M., Rumsli L.D., Kapitannlkov Yu. V., Barstievskaya T.N., Yavashev L.P., Gurova A.G., Volkova L.I. Studies on the mechanism of action or proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. - Eur. J. Blochem., 1981. r. 117, № 1, p. 195-200.

13. Казакова O.B., Орехович B.H., Румш Л.Л., Антонов В.К. Катепсин Д из печени кур: необратимое ингибирование и локализация каталитически активных групп в тяжелой цепи фермента. - Биохимия, 1981, т. 46, J6 10, с. 1795-1798.

14. Зинченко А.А., Румш Л.Д., Гинодман Л.М., Антонов В.К. Механизм активации катализируемого пепсином гидролиза дипептидов. -Биоорган, химия, 1981, т. 7, № 8, с. 1195-1200.

15. ReKharsky U.V., Rumsh L.D., Antonov V.K., Galchenko G.L. Thermochemistry of the N-aeetllphenllalanlne methylester hydrolysis reaction catalyzed bj a-chymotrypsln.- Thermochlralca Acta, 1934, V. 81, Й1, p. 167-174.

16. Антонов В.К., Гшюдыан Jl.П., Румш Л.Д. Механизмы протеолиза. -Биоорган, химия, 1984, т. 10, J5 8, с. 1044-1058.

17. Rumsh L.D., )l:i ПЛ.. Antonov Y.K. Catalytic astivlty of monocllnlc p з г с1п с pepsin crystals. - J. Biol. Chen. v. 259, H 18, p. 11365. ■

18. Попов А.А., Капитанников Ю.В., Румш Л.Д., Антонов В.К. Установление типа катализа при функционировании карбоксипептидазы У. - Биоорган, химия, 1986. т. 12, № 4, с. 467-469.

19. Капитанников Ю.В., Попов А,А., Шимбаревич Е.В., Румш Л.Д., Антонов В.К. С-Кониевое амндирование ацилашшокислот и пептидов методом транепептидации, катализируемой карбоксипептндазой У, - Биоорган, химия, 1988, т. 14, И 6, 797-801,

20. Попов А.А., Ротанова Т.В., Румш Л.Д. Исследование топографии-активного центра карбоксипептидазы Y методом бифункционального

л.

обратимого мотивирования. - Биоорган, химия, 1988, т. 14, И 12, с. 1650-1655. 21. Гинолман Л.М., Капитанников Ю.В., Руми Л.Д.. Антонов В.К. Установление типа катализа, ооушествляемого пептидгидролазами, по скорости изотопного обмена кислорода ациламинокислот - продуктов гидролиза специфических субстратов. - Биоорган, химия, 1988. т. 14, J6 12, с. 1641-1649.

Результаты диссертационной работы были представлены на I и II Всесоюзных симпозиумах по химии протеолитичских ферментов (Вильнюс 1973, Углич 1979), IX, XII, XX Конференциях ФЕБО (Будапеит 1974, Дрезден 1978, Будапешт 1990), II Международном симпозиуме по строению и 'реакционной способности органических соединений (Бургас 1975), Советско-американском симпозиуме по химии и физике белка (Рига 1976), III Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям активных центров'ферментов (Пущино 1976), Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки, структура, функция, взаимодействия" (Москва 1979), VII Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Тбилиси 1983), XIV Международном симпозиуме по химии природных соединений (Познань 1984), У Всесоюзном биохимическом съез-' де (Киев 1936), Международной конференгчи "Химическая физика и ферментативный катализ (Таллинн 1987), VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Вильнюс 1988), Конференции по проблемам и перспективам биотехнологии (Братислава 1989), XIV Менделеевском съезде по обшей и прикладной химии (Ташкент 1989).

Зак,482р.Тир. Г00.Tira.3/0 "Знаете'