Выделение, физико-химические характеристики и иммунохимические свойства эмбрионального альфа-2-глобулина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

БУЛГАКОВ Александр Александрович

ВЫДЕЛЕНИЕ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ИММУНОХИМИЧЕСХИЕ СВОЙСТВА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ПРЕАЛЬБУМИНА-1 И ЭМБРИОНАЛЬНОГО АЛЬФА-2-ГЛОБУЛИНА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 1992

Работа выполнена в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической - химии Дальневосточного отделения РАН.

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущее предприятие:

доктор химических наук |а.Ф. Павленко]

член-корреспсмчант РАН Ю.С.Оводов

доктор химических наук, профессор Г.С.Катруха

кандидат химически... наук Г.М.Фролова .

Институт органической химии им.Н.Д.Зелинского РАН

Защита состоится "£-<> " ¿¿^¿^¡Ч 1992 г. в часов на

заседании специализированного совета Д 003.93.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022 г.Владивосток, проспект Столетия 159, ТИБ0Х.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО РАН: г.Владивосток, проспект Сто£етия Владивостоку, 159, ДВГИ.

Автореферат разослан "¿/^уу 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук, ст.н.с. Г.И.Прокопенко

С/''

Актуальнсстьпроблемы. В настоящее время ^известно, что ачественная трансформация клеток сопровождается изменением структур клеточной поверхности и молекулярного профиля антигенов, способных индуцировать специфический клеточный иммунный ответ хозяина и ксеногенных животных. Эти антигены, являясь биохимическими маркерами опухолевого роста получили название антигенов, ассоциированных с опухолями (ААО). К одной из наиболее универсальных для опухолевого роста групп ААО относятся онкофетальные антигены (ОФА).Предполагается, что ОФА тесно связаны с факторами регуляции молекулярных механизмов эмбрионального и злокачественного роста. В настоящий момент ОФА нашли широкое применение в практической онкологии для мониторинга злокачественных новообразований, дифференциальной диагностики и иммунолокализации опухолей. Изучение строения,иммунохимических и Физико-химических свойств ОФА дает возможность полнее понять молекулярные механизмы малигниэации и существенно улучшить иммунодиагностику и иммунотерапию ОФХ-синтезирующих опухолей. Чрезвычайный интерес представляет определение строения углеводных цепей OÍA, изучение взаимосвязи антигенной активности с конформацией белкового кора, определение природы и . локализации антигенных детерминант.

К числу менее известных и слабо исследованных ОФА относятся эмбриональный О^-глобулин (ЭО^Г) и эмбриональный преальбумин-1 (ЭПА-1), открытке ранее Татариновым й.С. и Калашниковым В.В.

Ц§55_работы. Целью настоящего исследования явилось:

1. Поиск дешевого, доступного сырьевого источника для выделения иммунохимически гомогенных ЭПА-1 и эа2Г.

2. Иммунохимическая идентификация выделенных . антигенов. Физико-химическое изучение их свойств.

3. Разработка высокочувствительных методов определения антигенной активности.

4. Исследование пространственной структуры ЭПА-1 и Э0^1" "л влияния различных факторов на ее стабильность.

5. Исследование роли углеводного и белкового компонентов в Формировании антигенпах детерминант.

6. Подтверждение специфичности разработанных тест-систем по

определению уровня ЭПА-1 и ЭС^Г в биологических жидкостях.

Данная работа является частью исследования маркеров опухолей, проводимого в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

1. Предложено использовать отходы переработки абортивной крови в качестве нового доступного источника ЭС^Г и двух иммунохимических изоформ ЭПА-1: гликозилированной формы (ЭПА-1Г) и негликозилированной формы (ЭПА-1НГ), представляющей собой низкомолекулярный белок. Разработаны способы получения высокоочищенных Э<Х,г, ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ. Впервые показано, что в процессе беременности в кровь секретируются обе Формы ЭПА-1: ЭПА-1Г И ЭПА-1НГ.

На основании сравнительного иммунохимического изучения ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ, а такхе антисывороток против них установлено, что гликозилирование белковой части молекулы не приводит, к появлению новых антигенных детерминант. Впервые показано, что углеводные цепи ЭПА-1Г построены по общему принципу, характерному для И-гликанов.

Исследование пространственной структуры ЭПА-1НГ показало, что данный антиген относится к ^-структурированным белкам. Отмечена высокая обратимость конформационных изменений, обусловливающая стабильность нативной конформэции ЭПА-1НГ.

. Доказана топографическая природа антигенных детерминант.

В целях иммунодиагностики злокачественных новообразований разработаны высокочувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения ЭПА-1НГ и -^Г в биологических жидкостях.

Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получены три авторских свидетельства.

Апробация_работы. Результаты работы представлены и доложены на следующих конференциях: УПВсесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1S87), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( (Ташкент, 1988), XVIII Международной конференции "Onoodevelopmental Proteins and Clinical Application"

(Москва, 1990).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах, содержит 38 рисунков, 14 таблиц и 190 литературных ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение_ц_очистка_ЭПА;1Г_и_ЭПА;1НГ

С целью поиска дешевого и доступного источника ЭПА-1 были исследованы 42 фракции, полученные в процесса переработки ретроплацентарной и абортивной крови на предприятии по производству бактериальных препаратов при Хабаровском научно-исслодовательском институте микробиологии и эпидемиологии Министерства здравоохранения РСФСР. Иммунсдиффуэионноо исследование показало, ■ что только две фракции обладают активностью ЭПА-1. В концентрации 1-2 мкг/мл ЭПА-1 содержится в "осадке А0" и "осадке являющихся отходами промышленной

переработки абортизной крови.

Схема, предложенная для выделения и очистки ЭПА-1Г из абортивной крови, приведена на рис.1.

Экстракт ¡'осадка А0" *

Хроматография, рехронато-графия на ДЭАЭ-целлюлозе

Гельфильтрац^я на сефадексе в-ЮО

Хроматография на 9АЕ-сефадексе

Гельфильтрация на биогеле Р-30 ЭПА-1Г

Рис.1. Схема выделения ЭПА-1Г из "осадка Ао" абортивной крови.

Экстракт "осадка Ао" представляет сложную смесь белков сыворотки крови, тканевых антигенов. Сходство некоторых из них по Физико-химическим свойствам (молекулярная масса, изоэлектрическая ,точка) с ЭПА-1Г затрудняло' выполнение поставленной задачи. При разработке схемы выделения ЭПА-1 мы учитывали, что сульфатные группы и остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот придают

- 6 -

молекуле ЭПА-1 кислый характер

ЗПА-1НГ выделяли из "осадка А^", также являющегося отходом

переработки абортивной крови. В экстракте "осадка А^" по данным

предварительного ипм/нохимического тестирования содержится

антиген, иммунохимически идентичный стандартному ЭПА-1 и ЭПА-1Г.,-

выделенному из "осадка Ао".

Однако физико-химическое исследование этого компонента

показало, что он существенно отличается по своей природе и ряду

свойств от стандартного ЭПА-1 и ЭПА-1Г. Учитывая это

обстоятельство, а также то, что "осадок Акачественно и

количественно отличается от "осадка Ао" по спектру образующих его-

белков и специфических антигенов, мы разработали способ выделения

ЭПА-1НГ, который приводится на рис. 2.

Экстракт '^осадка А1"

Хроматограф.-я, рехроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

Хроматография на КМ-целлвлоз« .

Гельфчльтрация на сефадексе в-50

Хроматография замещения амфолинами на ДЭАЭ -сефацеле

Негативная аффинная хроматография

Высокоэффективная обращенная хроматография на С^-силасорбе

ЭПА-1НГ

Рис. 2. Схема выделения ЭПА-1НГ из "осадка Д^" абортивной крови.

В таблице 1 приведены основные физико-химические свойства обои

препаратов ЭПА-1.

Как видно из таблицы 1, ЭПА 1Г является также, как и ЭПА-1

из сыворотки плодов человека, сулефатированным сиалогликопро-теином. Он отличается заметной молекулярно-весовой гетерогенностью.

ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ имеют близкий аминокислотный состав (табл. 2).

Таблица 1

Физико-химические свойства ЭПА-1

Свойства ЭПА-1Г ЭПА-1НГ ЭПА-1 из сыворотки

плодов человека

Молекулярная масса, (М, кДа) по данным:

ДСН-электрофореза* 11±3

гельфильтрации 32±0.5

Электрофоретичес-кая подвихность^в

агаре (рн 8.6) 1.15

Изоэлектрическая

точка 3.5

Н-Концевая аминокислота

Белок (вес %) 78.5

Углеводы (вес, X) 20.6

Из них: Fue 3.0

Man - 3.2

Gal .7.8

Glc 0

GloNAo 5.4

GalNAo 1.2

NANA 1.0

Сульфат 2.0

6.5±0.5 41+3.2 , 23+0.8

2 H0.5 32±0.5

1.20 1.17

<3 3.5

Gly и.о.

98.1 76.9

0 21

0 2.1

0 13.2

0 1.8

0 1.8

0 2.1

0 ' следы

0 1.0

• 0 2.0

электрофорез в 7.5-30Х ПААГ в присутствии ДСН.

**

относительно человеческого сывороточного альбумина.

Иммунохнкическую гомогенность ЭПА-1Г и*ЭПА-1НГ подтверждали рядом методов.

С помощью двойной радиальной иммунодиффузии и иммуноэлек-трофореза показано, что полученное ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ не дают перекрестных реакций с нормальной белками человеческой плазмы, другими антигенами амниотической жидкости, а также с такими онкофетальными антигенами, как раково-эмбриональный антиген(РЭА), <Х-фетопротеин (АФП), трофобласт-специфический Р^глобулин (ТБГ). Б иммуноэлектрофорезе со стандартной моноспецифической

Таблица 2.

Аминокислотный состав ЭПА-1Г и ЗПА-1НГ Аминокислоты ЭПА-1Г ЗПА-1НГ АМИНОКИОЛОТЫ ЭПА-1Г ЭПА-1НГ

Азх 6 8 Ме1 О О

Т)1г 5 3 Не 12

Бег 5 3 1.еи 3 3

й1х 7 8 Туг 4 2**

Рго 6 10 РЬе 2 1

01у 7 5' Тгр 1 5** ■

А1а 5 5 Ьуу 3 2

1/2 Суэ 13 Н1г 11

Уа1 4 5 Агб ' 1 1

* Содержание аминокислот приведено в остатках на молекулу.

_ ** Содержание триптофана определено спектрофотометрически.

антисывороткой к ЭПА-1 обе формы ( ЭПА-1Г и ЭПА-1КГ) образуют по одной дуге преципитации в области преальбуминов. Кроме того, к обоим препаратам были получены моноспецифические

поликлональные гипериммунные антисыворотки .которые не потребовали дополнительного истощения донорской плазмой, что свидетельствует о высокой степени чистоты ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ.

Иммунохимическое сравнение ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ со стэндартной тест-системой на ЭПА-1 показывает полную иммунохимическую идентичность полученных антигенов и антисывороток к ним стандартному ЭПА-1 и антисыворотке к нему соответственно.

СтЕоение_£ГЛ§водного_компонента_ЭПА-1Г

Показано, что имеются существенные различия в строении углеводных цепей и, характере гликозилирсвания гликопротеинов нормальных и неопластических клеток.

Нам не удалось получить антител.., направленные к углеводным цепям ЭПА-1Г, о чем свидетельствует полная иммунохимическая идентичность гликозилированной и негликозилированной Формы антигена. В связи с этим можно предположить, что углеводные цепи 'антигена построены по общему принципу, характерному для

Н-гликанов, и не участвуют в формировании детерминантных групп ЭПА-1Г.

Данный вывод не является строгим доказательством, так как вопрос иммуногенности углеводных цепей ЭПА-1Г остается открытым. Несомненный интерес в этой связи представляет изучение строения углеводного компонента ЭПА-1Г.

Для определения характера гликозидных связей между моносахаридными остатками углеводных цепей ЭПА-1Г подвергали исчерпывающему метилированию по методу Хакомори. Количественное соотношение полученных метиловых эфиров представлено в таблице 3. Для выяснения места присоединения остатков нейраминовой • кислоты было проведено дасиалирование ЭПА-1 нейраминидазой из Vibrio cholerae с последующим метилированием. При этом наблюдается резкое уменьшение содержания 2,4,6-три-0-метил галактозы, что свидетельствует о присоединении остатков нейраминовой кислоты по С-3 остатков галактозы.

Таблица 3.

Соотношение метилированных производных моносахаридов гидролизата ЭПА-1Г

Моносахарид ЭПА-1Г

1.4 1.8 2.65 1.7 1.2 0.8 0.5 0.6 1.0 0.1 1.6 0.2'

* Рассчитано относительно 2,4-ди-0-метилманнозы.

2,3,4,6-Me4Gal 2

2,3,4-MegFuc 1

2,4,6-MegGal 3

2,3,4-HegGal 6

3,4,6-МвдНап 4

2,3,6-MegMan 5

2,4-Me2Gal f 9

3,6-Me2Man 7

2,4-Me2Man &

3,4-Me2Man 10

3,6-tfe2GlcN(Me)Ac 11

6-Me-GlcN(Me)Ac 12

Место локализации сульфатных групп определяли метилированием предварительно десульфатированного ЭПА-1. В продуктах гидролиза полностью отсутствует 2,4,6-три-0-метил-гллактоза, что можно объяснить наличием сульфатной группы при С-3 остатков галактозы и десиалированием в процессе сольволитического десульфатирования.

На основании анализа литературных данных, касающихся вопроса биосинтеза углеводных цепей, а такие результатов метилирования ЭПА-1Г, его десиалированного и десульфатированного производных, нами предложена ориентировочная структура углеводных цепей ЭПА-1Г содержащих Н-гликозидные связи (рис. 3).

±Гис(Х1

3

Са1|Э1-401сКАсР1-2Напа1.

±Н503 /

-ЗСа1Р1-401сНАоР1-2МапС11 /

±ИаМа 0а1Р1-401сйАсРГ . ±РисС11 3

0а1Р1-401сНАсР1-2Мап<11.

^НапР1-

3 НапР1—Е?

±Н503-ЗСа1Р1-401сНАсР1-2Иапа1-^ II

Рис. 3. Ориентировочная структура три- (I) и диантенных (II) углеводных цепей ЭПА-1Г.

Результаты метилирования подтверждают, что углеводная часть' ЭПА-1 Г построена по общему принципу, характерному для Н-г.'чканов и, вероятно, выполняет роль фактора, стабилизирующего конформацию молекулы антигена, или принимает участие в защите от протеолитического воздействия ферментов.

Пространственная структура ЭПА-1НГ г ее связь с антигенной активностью

Изучение вторичной и третичной структуры ЭПА-1НГ проводили методами кругового дихроизма (КД) и УФ-спектроскопии.

ЭПА-1НГ представляет собой белок с коэффициентом молярной экстинкции £279 ~ 8300±150 моль"* см-1. Определение числа остатков ароматических аминокислот в молекуле ЭПА-1НГ, проведенное нами по методу второй производной УФ-спектра в растворе 6М гуанидингидрохлорида, дает 5 остатков триптофана и 2 остатка тирозина.

В спектре КД нативного ЭПА-1НГ в области поглощения ароматических хромофоров наблюдается одна широкая положительная полоса с максимумом при 278 нм и плечом в области 282-284 нм и две отрицательные полосы при 282 и 305 нч. относящиеся- к переходам остатков тирозина и триптофана (рис. 4а). ~В области поглощения пептидных связей наблюдаются две отрицательные полосы с максимумами при 202 и 192 нм (рис.46) и слабая положительная полоса с максимумом при 230 нм, вероятно, обусловленная вкладом ароматических аминокислот. Наличие интенсивной отрицательной полосы в области 200-210 ' нм характерно для белков с преимущественным содержанием Р-структур.

Исследование зависимости спектров ЭПА-1НГ от температуры (рис.4) показывает, что эллиптичность всех полос в ароматической области плавно уменьшается с повышением температуры раствора (рис. 4а,в). В интервале температур 40-50°С наблюдается конформационный переход в третичной структуре молекулы ЭПА-1НГ. При 60°С происходит полное нарушение натипной третичной структуры ЭПА-1НГ. Охлаждение раствора ЭПА-1НГ до 20°С приводит к частичному восстановлению эллиптичности полос при 240,276,292 и 305 нм. Через один час после охлаждония указанные полосы восстанавливают до 80% исходной эллиптичности.

Как следует из спектров КД ЭПА-1НГ в пептидной области (рис. 46,г), увеличение температуры раствора ЭПА-1НГ до 70°С приводит также к конформационноР. перестройке вторичной структуры белка. Спустя один час после прогревания раствора полоса при 202 нм восстанавливает до 70Х, а полоса при 192 нм - до 60Х исходной эллиптичности. '

\

Расчет по методу Лровинчера элементов вторичной структуры

Рис.4. Спектры КД ЭПА-1НГ в 0,01М К^РО^, рН 7.2.'

1 - 20 С; 2 - 70 С; 3 - 20 С через 1 ч<»с после 70 С. а - С 1,0 ыг/ыл, 1-1 см; б - С 0,28 мг/мл 1-1 ыи; в - изменении эллиптичности полосн 276 ни от теыпературы; г - кзметтние пллкптичности полоси 192 нм от температуры.

ЭПА-1НГ в зависимости от температуры показывает, что конформационный переход (температура раствора выше 40°С) приводит к уменьшению содержания бета-структуры и бета-изгибов и к увеличению доли неупорядоченной структуры. Для предварительно инкуСировйнного при 70°С раствора ЭПА-1НГ содержание элементов вторичной структуры белка восстанавливается полностью через один час после охлаждения раствора до 20°С. С вычетом вклада ароматических хромофоров в пептидную часть спектра ЭПА-1НГ конформационный переход сопровождается увеличением содержания альфа-спирали. Таким образом, конформационный переход в молекуле ЭПА-1НГ под действием тепловой денатурации обратим. На это также указывает сравнение антигенной активности нативного ЭПА-1НГ и денатурированного после тепловой обработки.

Сопоставление полученных результатов иммуноферментного анализа со спектральными данными показывает, что до конформационного перехода антигенная активность не изменяется. После конформационного перехода наблюдается ее уменьшение на 17Х . Антигенная активность восстанавливается полностью через два- часа после охлаждения раствора ЭПА-1НГ, нагретого до 70°с.

Наряду с изучением влияния температуры на пространственную структуру ЭПА-1НГ , проведено исследование еэ зависимости от рН раствора. На рис. 5(а,б) приведены спектры КД растворов ЭПА-1НГ в процессе титрования их кислотами и щелочами. С понижением рН от 7.2 до 4.0 в ароматической области спектра КД ЭПА-1НГ не наблюдается заметных изменений. При значениях рН ниже 4.0 происходит плавное уменьшение эллиптичности положительной полосы при 270 нм. Спектра КД ЭПА-1НГ при рН 2.1 и при 45°С подобны. Полного разрушения нативной третичной структуры молекулы ЭПА-1НГ не происходит даже при рН меньше 2.0. Титрование раствора ЭПА-1НГ до рН 11.2 вызывает очень незначительное изменение КД-спектра в ароматической области. Дальнейшее увеличение значения рН до 13.0, при котором происходит полная ионизация остатков тирозина, ^вызывает исчезновение наблюдаемых полос и появление интенсивной широкой положительной полосы при 252 нм.