Ионы металлов как метки для определения иммунореагентов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ5 ОД

„2 2 Ш глоз

На правах рукописи

ДЫХАЛ ЮЛИЯ ИВАНОВНА

ИОНЫ МЕТАЛЛОВ КАК МЕТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОРЕАГЕНТОВ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань -2000

Работа выполнена на университета Научные руководители:

кафедре

аналитической химии Казанского государственного

академик МАНВШ, член-корр. РАЕН, доктор химических наук, профессор Г.К. БУДНИКОВ

доктор химических наук, профессор Э.П.МЕДЯНЦЕВА

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Абдуллин И.А.

кандидат химических наук, Боос Г. А.

Ведущая организация:

Казанский государственный технологический университет, г. Казань

Защита состоится

Г/П\Я,¿¿М- 2000 г. в У'/

часов

на заседании диссертационного Совета К 053.29.02 по химическим наукам Казанского государственного университета, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КГУ, научная часть. Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

£о¥Лс,(>. о

кандидат химических наук

У

\ктуальностъ темы. Иммунологические реакции все чаще используются в астоящес время в практике аналитической химии. Это обусловлено их высокой елективностью и чувствительностью при регистрации степени протекания иоспецифнчесютх взаимодействий, что достигается при использовании различных 1еток. Несмотря на существующее многообразие методов иммунохимического нализа (ИХА), постоянно появляются новые варианты, в основном, благодаря «пользованию новых меток и способов их детекции. Этому способствует также омбинирование и совмещение уже известных аналитических подходов с Филиппами иммунологии. Привлекательным в этом плане является использование в ачестве меток электрохимически активных соединений (металлоорганических, :оординационных) или непосредственно ионов металлов. Одним из недостатков «пользования ионов металлов в качестве меток в иммунохимическом анализе вляется достаточно высокий предел обнаружения при использовании в качестве налитического сигнала диффузионных токов восстановления ионов металлов. В то <е время известно, что в растворах ионов Co(II, III) в присутствии соединений белковой природы в условиях полярографии (вольтамперометрии) наблюдаются аталитические токи выделения водорода (волны Брдички), которые могут в [есколько раз превышать по величине диффузионные токи. Это позволяет [редположить, что сочетание таких электрокаталитических реакций с принципами ммунохимического анализа может позволить снизить нижнюю границу щределяемых концентраций иммунореагентов, а так же упростить и удешевить нал из.

Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов [ммунохимического анализа с вольтамперометрическим контролем с использованием ;олн каталитического выделения водорода в присутствии ионов переходных металлов i качестве меток для оценки биоспецифических взаимодействий.

Научная новизна и практическая значимость. Показана и обоснована озможность использования ионов Со(П) и Ni(II) в качестве меток для [ммунохимического анализа некоторых антигенов (Аг). Разработаны новые варианты [ммунохимического анализа, отличающихся по способу введения метки в один из :омпонентов биоспецифического взаимодействия. Для оценки степени протекания [ммунных реакций использована способность комплексов белков с ионами Со(П) и •П(П) вызывать каталитическое выделение водорода. Определено влияние различных икторов (pH и природы буферных растворов, буферной емкости, концентрации [ммунореагентов, ионов металла) на величину аналитического сигнала.

Получены нитроцеллюлозные мембраны с иммобилизованными антителами (Ат против панкреатической рибонуклеазы быка, позволяющие сохранить их способности к иммунохимическим взаимодействиям.

Показана возможность получения конъюгата, включающего исследуемы! антиген, бифункциональный хелатобразующий реагент

диэтилентриаминопентауксусную кислоту (ДТПА) и металлическую метку. Найдень условия функционирования систем на основе иммобилизованных Ат и конъюгата А: с металлической меткой, позволяющие регистрировать каталитическую волнз выделения водорода.

Предложены новые варианты иммунохимических определений < аналитическими характеристиками, отвечающими требованиям иммуноаиализа Обоснованы подходы, позволяющие предложить разработанные методики дш определения рибонуклеазы в биологических жидкостях и вируса крапчатосп гвоздики в растительных экстрактах на уровне наномолей.

Разработанные способы анализа основаны на использовании доступны? реагентов в качестве метки (ионы металлов) и более просты в исполнении пс сравнению, например, с классическим иммуноферментным методом. На защиту выносятся

- обоснование выбора индикаторной системы иммунореагент - ион металла;

- интерпретация данных об электровосстановлении ионов металлов в присутствш изучаемых' антител или антигенов и факторы, определяющие величин) аналитического сигнала (рН и природа буферных растворов, буферная емкость концентрации иммунореагентов и ионов металла);

- совокупность стадий предлагаемых вариантов иммунохимического анализа;

- характеристики конъюгата, включающего исследуемый антиген, бифункциональны? хелатобразующий реагент и металлическую метку;

- условия функционирования систем на основе антител, иммобилизованных е нитроцеллюлозные мембраны, антигенов или конъюгатов, включающих антиген к металлическую метку;

- новые методики иммунохимического определения рибонуклеазы.

Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с координационном планом РАН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 97-03-33232 и №00-03-32389).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Н-ой Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 1999г.), ЬХХХ Поволжской региональной конференции "Физико-химические методы в координационной и аналитической химии" (Казань, 1999г.), 5-ой Всероссийской конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1999г.), 8-ой Международной конференции по электроанализу (Бонн, 2000г.), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000г.), Всероссийской конференции с международным участием "Сенсор 2000. Сенсоры и микросистемы" (Санкт-Петербург, 2000г.)

Щблищш По теме диссертации опубликовано 6 работ. Из них 1 статья и 5 тезисов докладов на Есероссийских и международных конференциях, одна статья принят! к печати.

Структура_и объем работы.__Диссертация изложена на 117 страницах

машинописного текста, содержит 6 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 140 наименований.

В первой главе (литературный обзор) представлена классификация иммунохимических методов анализа в основу которой положены различные признаки. Аналитические возможности основных вариантов иммуноанализа показаны на примере результатов работ, опубликованных в последнее время. Отмечены основные достоинства и недостатки ра; личных методов, а так же тенденции развития иммунохимического анализа.

Вторая глава литобзора обобщает сведения о каталитическом выделении водорода в раствора * комплексных соединений некоторых металлов с органическими лигандами. Рассмотрены факторы, влияющие на величину каталитического эффекта, а также возможные механизмы этого процесса.

Третья глава содержит постановку задачи, описание объектов исследования и использованные методики проведения эксперимента.

Четвертая глава посвящена выбору индикаторных систем переходный металл -определяемый Аг для разработки новых вариантов иммунохимического анализа. Описано электрохимическое поведение ионов металлов в присутствии изучаемых Аг. Рассмотрено влияние различных факторов на величину аналитического сигнала (рН и природа буферного раствора, буферная емкость, начальный потенциал, концентрации иммунереагентов и ионов металлов). Установлено, что наблюдаемые процессы могут бь;ть отнесены к каталитическому выделению водорода. Предложено несколько

вариантов введения металлической метки в структуру Аг, на примере рибонуклеазы, позволяющих регистрировать каталитические токи выделения водорода. Подобраны рабочие условия проведения иммуноанализа некоторых Аг.

В пятой главе показаны аналитические возможности нового варианта конкурентного иммунохимического анализа, основанного на использовании специально получаемого конъюгата состава Аг- ангидрид Д'1ПА -ионы металла Описаны условия получения конъюгата рибонуклеаза -ангидрид ДТ11А- ионы Со(П). определено соотношение компонентов в нем. и концентрация металла. Подобраны условия отщепления металлической метки, позволяющие сохранить свойстве рибонуклеазы и регистрировать каталитические токи выделения водорода на заключительной стадии иммуноанализа. Предложена методика определения рибонуклеазы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспериментальная часть работы выполнена на осцшшографмчсскоч полярографе ПО-5122(ЦЛА) модели 03 с ячейкой, термостатированной при (25+0.2)°С, с помощыс термостата ТС-50. Рабочим электродом служил стационарные ртутно-плецочный электрод с серебряной подложкой, электрод сравнения - насыщенный каломельный, Объекты исследования: Рибонуклеаза (РНКаза), Carnation motile virus (C'arMV), Phoma Betae (PhB), Candida albicans (CA), Trichophyton rubrum (TrR) и соответствующие At против них. В качестве металлической метки применяли ионы Со(П), Ni(II), Cr(III) и Fe(III). Для введения метки в иммунореагент использовали ДТПА. Для иммобилизации Ат использовали нитрат целлюлозь: типа коллоксилин. Применяли буферные растворы: глицин - НО, ацетатный, нитратный, фосфатный, трис - НС1, боратный, аммиачный, охватывающие диапазон рН 2.2 И0.0.

ВЫБОР ИНДИКАТОРНОЙ СИС ТЕМЫ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.

Электрохимическое поведение систем: нон переходного металла -иммунореагент. Для разработки нового варианта ИХА о использованием ионов металлов в качестве метки необходимо было выбрать систему ион переходного металла - иммунореагент (антитело или антиген), позволяющую оценить изменение концентраций определяемых компонентов биоспецифического взаимодействия. С этой целью проведена оценка возможности использоьания исшоз Со(П), Ni(II), Cr(III) и Fe(III) в качестве меток для анализа Аг Candida albican, Phoma Betae,

Trichophyton rubrum. Carnation mottle virus, Рибонуклеазы или соответствующих At против них. Для этого регистрировали величину диффузионного катодного тока восстановления ионов металлов и ее изменение на фоне буферных растворов различной природы в широком, диапазоне рН (2.2-10.0) в отсутствие и в присутствии антигена и иммобилизованных или нативных антител. В зависимости от природы изучаемого Лг, йена металла, природы и рН используемого буферного раствора, в некоторых случаях наблюдалось изменение тока при потенциалах, соответствующих восстановлению используемых ионов металлов (ЕПИКа= -1.4В для Со(П) и Enmi= -1.1В для Ni(II)).

Ma вольтамперограммах растворов, содержащих ионы Со(П) или Ni(II) на фоне трис-HCl и аммиачного буферных растворов в присутствии изучаемых Аг наблюдается необратимая солна, превышающая по величине уровень диффузионного тока, отвечающего восстановлению соответствующих ионов. Кроме того, пик превращается в вглну (рис.1), что указывает на изменение характера электродного процесса.

2 мкЛ

2 мкА

Рис I. Вольтакперограммы растворов Со(П) с С=5х10 М на фоне трис-НС1 буфера с рН 7.5 (а) и N¡(11) с (>5х10"'М на фоне аммиачного буфера с рН 9.5(6) в отсутствии (кривые 1а,16) и в присутствие Аг САгШ (крива! 2а) и Аг РНКазы (кривые За,26) в концентрациях 0.02 мг/мл. V-1 В/с, Ь,д=2с.

1.5

Е. El

Проведенные исследования показали, что изменение тока происходило в следующих условиях:

1). В присутствии Лг РНКсзы в распоре соли Со(И) на фоне фосфатного, трис-НС1, боратного и аммиачного буферных растворов при Е=-1.4 В, а также в растворе N¡(11) в трис-НС1, бератном и аммиачном буферных растворах при Е=-1.0 -5-1.1 В;

2). В присутствии Аг РкВ в растворе Со(П) на фоне трис-НС1 и аммиачного буферны растворов, а так же в растворе соли N¡(11) в трис-НС1 буфере;

3). В присутствии Аг ТгК в растворе Со(И) в трис-НС1 и боратном буферны растворах.

4). В присутствии Аг СагМУ в растворе соли Со(Н) на фоне фосфатного, трис-НС боратного и аммиачного буферных растворов, а также в растворе N¡(11) в трис-НС боратном и аммиачном буферных растворах.

Наибольшее увеличение тока в изученных системах наблюдалось пр добавлении Аг РНКазы, Аг РкВ и Аг СМУ в раствор трис-НС1 буфера, содержащег ионы Со(Н) (рис.1а).

При использовании растворов №(П) этот эффект меньше по величине п сравнению с системами, содержащими ионы Со(П) (рис. 16), поэтому наиболыне внимание было уделено использованию ионов Со(П) в качестве метки.

При этом меняются и некоторые электрохимические характеристики. Если дл диффузионных токов коэффициент Семерано Д^ У Л^ V составляет 0.55-0.60, то присутствии Аг РНКазы его величина составляет уже 0.3-0.32, а в присутствии А СагМУ - 0.18-0.2 (в различных буферных растворах), что указывает на кинетическу! природу электрохимических реакций.

Влияние некоторых факторов на процессы электровосстановления ионов Со(П) N¡(11) в присутствии белков Установлено, что на изменение величины тока изученных системах влияют, в частности, рН и буферная емкость раствора.

В присутствии РНКазы в растворе Со(П) на фоне трис- НС1 буфера в области р! от 6.8 до 9.0 наблюдалась колоколообразная зависимость с максимумом при рН 7.5, для РЬВ - максимальное увеличение тока происходило при рН 8.0

Кривая зависимости тока (I, мкА) от буферной емкости (Р) выходит на предел аммиачном буфере при 0=0.5 и в трис-НС1 буфере при р=0.2 в растворе ионов Со(П) присутствии Аг РНКазы.

Такие зависимости характерны для процессов, связанных с участием ионо водорода в электродных реакциях. К их числу относится и процесс каталитическог выделения водорода На каталитическое выделение водорода указывает и выделени пузырьков водорода при электролизе при потенциалах наблюдаемых волн.

Каталитическое выделение водорода может быть обусловлено возможность! образования комплексов между ионами металлов и исследуемыми соединениям! белковой природы (Аг). Поскольку на вольтамперограммах отсутствует волн

восстановления комплекса Со(П) с Аг до комплекса Со(0), механизм каталитического выделения водорода можно представить следующей схемой: СоЬ„ + Н+» СоЦН* СоЬ„Н+ + е -» СоЬл + '/2 Н2 где Ь - соединение белковой природы (Ат или Аг).

Величина волн каталитического выделения водорода зависит как от концентрации Аг (при постоянной концентрации ионов Со(П)), так и от концентрации ионов металла (при постоянной концентрации Аг)(рис.2,3).

Ток пика, мкА

1 2 3 4 5

С Аг РНКазы, мг/мл

Рис.2 Зависимость величины тока от концентрации Аг РНКазы в растворе ионов Со(П) с С=5х1(Г,М на фоне трис-НС1 буфера с рН 7.5.

Ток пика, мкА

я- 5.5 6.0 6,5 7.0

С раствора ионов Со(П), М

Рис.3 Зависимость каталитического тока выделения водорода от концентрации ионов Со(П) в присутствии 0.02 мг/мл Аг РНКазы в трис-НС1 буфере с рН 7.5.

Иммунохимическое определение рибонуклеазы. Проведенные исследования послужили основой для разработки нового варианта иммунохимического определения антигенов, обладающих способностью вызывать каталитическое выделение водорода в растворах ионов Со(П). Поскольку гетерогенные варианты ИХА всегда предполагают наличие одного из компонентов биоспецифического взаимодействия в иммобилизованном виде, изучаемые Ат иммобилизовали в НЦ мембрану.

Иммунохимическое определение предполагает проведение четырех последовательных стадий анализа:

• образование иммунного комплекса Ат-Аг в среде трис-НС1 буфера с рН 7.5 (или аммиачного буфера) на поверхности НЦ мембран, содержащих иммобилизованные Ат, в течении 15 мин;

• удаление несвязавшегося Аг трис-НС1 (или аммиачный) буфером;

• разрушение иммунного комплекса в среде глицин-НС1 буферного раствора с рН 2. (или ацетатного буфера с рН 4.5) в течении 10 сек;

• нейтрализация 1М раствором аммиачного буфера до рН 7.2-7.7;

• электрохимическое детектирование металлической метки (оггределени концентрации Аг).

Первую стадию ИХА проводили в нескольких вариантах, варьируя услови образования иммунного комплекса (рН и природу буферного раствора, врем инкубации, концентрации компонентов) и меняя порядок сливания реагентов. Иош кобальта вводили или на стадии образования иммунного комплекса или н заключительной стадии анализа для регистрация аналитического сигнала. Дл введения метки на стадии обргоования ИК использовали ДТГ1А. Некоторые и полученных результатов приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Иммунохимическое определение Аг РНКазы с использованием ионов Со(П) в качеств метки в присутствии иммобилизованных Ат в разведении 1:5.

п=5, р=0.95

Вариант анализа Введено РНКазы, мг/мл Нгйдсно РНКазы, мг/мл Sr

а* 2x10-3 (2.1±0.3)хКГ3 0.13

2x10"4 (1.9±0.3)х1Сг" 0.15

4x10"5 (3.8±0.8)х10° 0.20

б** 2x10'3 (2.1±0.2)х10"3 0.0&

2x10"4 (2.2±0.3)х10"4 0.12

2x10"5 (2.0±0.3)х10° O.H-

4x10-5 (3.7±0.6)х 10° O.l 6

4x10"6 (3.7±0.8)х IG"6 0.21

а* - при введении ионов Со (II) на первой стадии анализа

б** - при введении ионов Со(П) в реакционную среду после разрушения иммунноп комплекса

Данные таблицы показывают, что при введении метки на заключительной стадш анализа достигается большая чувствительность определений с меньше! погрешностью: сн рнкты = 2х10'6 мг/мл (при С Со(П)=5хЮ'4М), с„ Со(П) х 10"8М

(при С рнказы = 2x10"2 мг/мл), а при введении метки на стадии образования иммунного комплекса с„ рнказы = 6x10"6 мг/мл (при С с0(П)=5хЮ"4М) и сн Со(п)=5х10"7М (при С РНКазы = 2х 10"2 мг/мл).

Способность Аг Р/гВ и СагМУ вызывать каталитическое выделение водорода в присутствии солей Со(П) также позволяет предложить для их определения варианты иммунохимического анализа с использованием ионов Со(П) в качестве метки. Результаты определения представлены в табл.2.

Некоторые аналитические характеристики разработанного неконкурентного варианта иммунохимического определения РНКазы, РЬВ и СагМУ представлены в табл.3.

Таблица 2.

Результаты определения САгМУ и РкВ с использованием ионов Со(П) с С=5хЮ"4М в

качестве метки. п=4, р=0.95.

Определяемый Аг Введено, мг/мл Найдено, мг/мл Эг

1 СагМУ 2.0 2.2+0.2 0.09

1.5 1.4+0.2 0.13

1.0 1.1 ±0.2 0.18

0.5 0.5+0.1 0.19

0.1 0.1110.03 0.27

2 РИВ " 0.06 0.065Ю.005 0.07

0.04 0.045±0.005 0.09

0.03 0.025±0.003 0.11

0.02 0.025±0.004 0.16

0.01 0.020±0.005 0.23

1 - в среде аммиачного буфера с рН 9.5;

2 - в среде трис-НС1 буфера с рН 7.5;

КОНКУРЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЪЮГАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИОНЫ МЕТАЛЛА

Для разработки конкурентного варианта иммуноанализа специально получали конъюгат, включающий металлическую метку, состава иммунореагент -ангидрид ДТПА- ион металла. Молекула ДТПА способна взаимодействовать с белковой молекулой с образованием слабых ионных связей. Однако для получения прочных и стабильных конъюгатов этого недостаточно.

Таблица 3

Аналитические характеристики для определения концентраций Аг С А г Л/К, Г ИВ и РНКазы

Антиген Динамический диапазон концентраций, мг/мл Уравнение градуировочного графика 1р=ахС'Аг+Ь, г

а Ь г

СагМУ 0.5-2.0 0.97±0.04 3.0110.05 0.5971

РИВ 0.01-0.06 5.6±0.2 2.5010.08 0.9899

РНКаза 2х10'2-4Х10"6 8.9±0.9 2.3+0.1 0.9878

Для этой цели использовали ангидрид ДТПА. При ззалмодействии такого ангидрида с молекулой белка происходит реакция нуклеофильного присоединения предпочтительно по -№12 (возможно и по -£!Н или -ОН) групг.ам аминокислотных остатков протеина.

При введении максимального количества метки з конъюгат варьировали соотношение и время контакта компонентов при получении коныогата. По изменению поглощения при Х.=260 нм было установлено, что для присоединения максимального количества молекул ангидриде. ДТПА к молекуле РНКазы достаточно 60 мин.

Для удаления несвязавшихся или избыточных молекул ангидрида ДТПА проводили диализ в слабокислой среде цитрат-юго буфера с р11 5.5.

При введении ионов Со(П) в модифшлровапный ангидридом ДТПА белок, варьировали концентрацию металлической метки в области 1x1 Э"2-1х10'3М. Раствор кобальта добавляли к модифицированной ангидридом ДТПА РНКазе и выдерживали в течение часа при комнатной температуре. Для удаления несвязавшихся или неспецифично адсорбировавшихся ионов Со(П) тькжг проводили диализ в слабокислой среде.

Для оценки количества металлической метки, которое связывается с одной молекулой белка, к полученному конъюгату РНКаза- ангидрид ДТПА -Со(П) добавляли хлористоводородную кислоту с различной концентрацией (0.01-1М) и после нейтрализации среды до рН 7.8-8.0 определяли конценграцию металла но каталитическим волнам выделения водорода. Степень отщепления металлической метки от конъюгата зависит от концентрации кислоты (рис.2). При использовании 1М раствора хлористоводородной кислоты процент отщепления металлической метки от коныогата около 90%.

Рис.4 Эффективность отщепления ионов Со(П) от конъюгата в зависимости от концентрации используемой хлористооводородной кислоты

Максимальная концентрация металла в копыогате • составила Концентрацию металла, в данном случае Со(П), определяли вольтамперометрически при Е= -1.413 в растворе, содержащем Аг РНКазы. Соотношение ионов Со(П) к молекуле РНКазы в полученном кокъюгате составило 6:1. Реакция преципитации показала, что Аг при этом сохраняет свои иммунологические свойства и образует иммунные комплексы с соответствующими Ат.

Предлагаемый вариант конкурентного иммуноанализа предполагает проведение следующих стадий:

• получение хонъюгага состава: РНКаза- ангидрид ДТПА- Со(П) и определение молярного соотношения компонентов л нем;

• образование иммунного комплекса Ат-Аг в среде трис-НС1 буфера на поверхности нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными Ат в течении 25 мин;

• удаление несвязамиегося Л г и конъюгата с металлической меткой в среде трис-НС1 буфера;

• разрушение иммунных комплексов и отщепление металлической метки под действием 1М НС1 и течении 10 сек;

• нейтрализация сре ды 1М раствором трис или аммиака до рН 7.2-7.7;

• регистрация ангци тического сигнала и определение Аг.

Основное отличие от предложенного неконкурентного варианта имммуноанапиза состоит в получении конъюгата, содержащего металлическую метку и использования его на первой стадии анализа.

Обязательным процессом любого конкурентного иммуноанализа является конкуренция меченых н немеченых Аг за ограниченное число связывающих центров Ат. При постоянной концентрации Меченого Аг добавляли в раствор определенное количество немеченого Аг с известной концентрацией. Область исследуемых концентрации Аг в модельных растворах составляла 2х10"2- 2х10"6 мг/мл.

% отщепления м лю:

Ко( п^нтраиич НС , М

со

:,2

Разрушение иммунокомплексов и отщепление металлической метки являет определяющей стадией в предлагаемом варианте иммуноанализа. Отщепление Со( от конъюгата в составе иммуного комплекса проводили как описано выше (см. рис.: В этих условиях, очевидно, происходит не только отщепление метки, но разрушение иммунокомплекса (возможно при использовании уже 0.02М раство хлористоводородной кислоты).

В конкурентном иммуноанализе с использованием ионов металлов в качест метки количество Аг (или Ат) пропорционально количеству отщепившейся мел. Необходимая для ИХА чувствительность определения достигается в предлагаем! варианте путем использования способности РНКазы вызывать каталитическ выделение водорода в присутствии ионов Со(П), что было доказа предварительными исследованиями.

После разрушения иммунных комплексов Ат- Аг РНКазы в растворе мог присутствовать ионы Со(П), молекулы немеченого Аг и молекулы А модифицированного ангидридом ДТПА. Оказалось, что не только Аг РНКазы, но модифицированный белок проявляет способность вызывать каталитическ выделение водорода в присутствии ионов Со(П). Так как в случае данного вариан иммуноанализа суммарная концентрация меченого и немеченого Аг остает постоянной, а концентрация отщепившейся металлической метки изменяется обрат1 пропорционально количеству немеченого Аг, возможно определение содержания Аг растворе, регистрируя волну каталитического выделения водорода. Зависимость то пика от концентрации раствора РНКазы выражается уравнением у=(3.0+0.2)+( 4±1)х10"7)х, г=0.9902.

Общая схема предлагаемого конкурентного варианта иммуноанализа мож быть представлена следующим образом:

+ НС1

—<Дт

вариант а). Аг <( | + ДТПА + М

/

/

вариант б). Аг ДТПА + М

где </ | - Аг РНКаза,

^ [- Аг РНКазы, модифицированный ангидридом ДТПА М - ионы Со(П)

Проведенные исследования позволяют предложить новый вариант конкурентного иммуноанализа для определения некоторых Аг, способных вызывать каталитическое выделение водорода в присутствии ионов переходных металлов. Такая возможность показана на примере иммунной пары Ат-Аг РНКазы с использованием специально полученного конъюгата, содержащего ионы Со(П). Результаты определения РНКазы представлены в табл.4.

Таблица 4.

Иммунохимическое определение Аг РНКазы с использованием конъюгата, содержащего Со(П) в качестве метки с С=5х в присутствии иммобилизованных Ат в разведении 1:5.

п=5, р=0.95

ВВЕДЕНО РНКазы, мг/мл НАЙДЕНО РНКазы, мг/мл Б,

2x10"2 (2.0±0.2)х10"2 0.09

2x10"3 (2.1±0.3)х10"3 0.12

2x10" (1.9±0.3)х10"4 0.14

2x10"5 (2.0±0.4)х10° 0.20

Диапазон определяемых концентраций РНКазы составил 2х10"2 - 2х10"5 мг/мл с сн = 4х10"6 мг/мл.

Таким образом, предложено два варианта иммунохимического анализа -неконкурентный и конкурентный - для определения некоторых антигенов. Одно из преимуществ предлагаемых вариантов состоит в отсутствии необходимости удалять 5елок из сферы реакции. Напротив, его присутствие позволяет регистрировать шалитический сигнал с чувствительностью, удовлетворяющей требованиям шмунохимического анализа, благодаря использованию наблюдающихся саталитических токов выделения водорода. К преимуществам предлагаемых вариантов также следует отнести применение доступных реагентов в качестве меток I упрощение отдельных стадий анализа.

ВЫВОДЫ

. Предложены новые варианты иммунохимического анализа некоторых антигенов. Збоснован выбор индикаторных систем иммунореагент - ион переходного металла -

буферный раствор, позволяющих регистрировать каталитические токи выделен водорода.

2. Каталитический эффект наблюдается в присутствии в растворах ионов Со(П] N¡(11) антигенов РНКазы, СагМУ и РЬВ на фоне аммиачного буфера с рН 9.5-10.С трис-НС1 буфера с рН 7.2-7.8. Каталитическое выделение водорода обнаружено так в растворе ионов Со(П) в присутствии нативных Ат против РЬВ в облас концентраций от 5х10'2 до 5x10'" мг/мл. Максимальный каталитический эффе наблюдается в среде трис-НС1 буфера с рН 7.5 и р=0.2 при концентрации ионов Со( 5Х10"4 М в присутствии РНКазы и РЬВ, а так же в аммиачном буфере с рН 9.5 и Р=( в присутствии СагМУ.

3. Разработан способ иммобилизации антител против РНКазы, путем включения пленку из нитроцеллюлозы, позволяющий сохранить их способность иммунохимическим взаимодействиям в течение месяца.

4. Предложен вариант иммунохимического анализа для определения РНКазы использованием ионов Со(П) в качестве метки. Наибольшая чувствительное анализа реализуется при введении металлической метки на стадии регистращ аналитического сигнала, что позволяет определять РНКазу в области концентрат 2х10"2-4х10'3 мг/мл с с„ = 4х10"6 мг/мл; СагМУ в интервале 0.5-2.0 мг/мл и РЬВ диапазоне 0.01-0.06 мг/мл.

5. Разработан конкурентный вариант ИХА, основанный на использовании специалы полученного конъюгата состава РНКаза- -ангидрид ДТПА-ион Со(П). Максимальн« соотношение Со(П): белок составляет 6:1. При этом модифицированный Аг сохранж свои иммунологические свойства.

6. Наиболее полное отщепление металлической метки (85-90%) от конъюгат достигается при использовании 1М НС1 или глицин-НС1 буферного раствора с рН 2.: при этом РНКаза сохраняет способность участвовать в реакции каталитическог выделения водорода.

7. Найдены рабочие условия проведения конкурентного иммуноанализа РНКазь позволяющие регистрировать металлическую метку на заключительной стади анализа. Предложена методика определения Аг РНКазы в области концентраци 2x10"2- 2х Ю"5 мг/мл с с„ = 4х 10'6 мг/мл.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: 1. Бормотова Ю.И., Медянцева Э.П., Будников Г.К. Электрохимический контрол иммунологических реакций для определения патогенных грибов и бактерий/

Международная конференция по аналитической химии: тез.докл. - Алмааты, 1998. -С.69

2. Бор мотога Ю.И., Лавриненко Е.В. Вольтамперометрический контроль иммунологических реакций для определения патогенных грибков// 11-ая Всероссийская конференция молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии": тез. докл. - Саратов, Россия, 1999. -С. 175

3. Бормсггова Ю.И, Медянцева Э.П., Калачева Н.В., Будников Г.К. Использование каталитических вопи выделения водорода для оценки степени биоспецифических взаимодействий// LXXX-ая Поволжская региональная конференция "Физико-химические методы в координационной и аналитической химии": тез. докл. - Казань, России, 1999. - С.89

4. Бормотова Ю.И, Медянцева Э.П., Калачева Н.В., Будников Г.К. Использование электрокаталитнчееких процессов для контроля иммунологических реакций// 5-ая Всероссийская конференция "Электр^химические методы анализа (ЭМА-99)": тез. докл. - Москва, Россия, 1999. - С.18-19

5. Dyklial Y I., Medyantseva Е.Р., Kahcheva N.V, Budnikov H.K. Catalytic waves of hydrogen in volti.mmetric control of irrmunoreactiens//8 -th International Conference on Electroanalysis.: proceeding abstracts. - Bonn, Germany, 2000. - P.F41

6. Дыхал Ю.И., Муртазшы H.P., Медянцева Э.П., Будников Г.К. Аналитические возможности ионо! Со(П) как метки в иммунохимическом анализе//Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор 2000. Сенсоры и микросистемы": тез. докл. - Санкт-Петербург, Россия, 2000г. - С.96

7. Дыхал Ю.И., Медянцева ЭЛ., Будников Г.К. Применение электрокаталнтических реакций в иммуноанализг рибонуклеапы и вируса крапчатости гвоздики//Сб. научных трудов "'Электрохимические, оптичесше и кинетические методы в химии". - Казань: Изд-во КГУ, 2000г. - С. 127-134

8. Использование ионов металлов для оценки биоспецифических взаимодействий /Дыхал Ю.И., Медянцева Э.П., Муртазина Н.Р., Сафина Г.Р., Будников Г.К., Калачева Н.В.//Журн.акалит.химии. ■• 2000г. (в печати).

^/¿¿w WW. /' г и. VP. tf)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1. КЛАССИФИКАЦИЯ ИММУ НОХИМИ ЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА

1.1. Основные факторы, лежащие в основе классификации методов ИХА

1.1.1 Метки, используемые в иммунохимическом анализе 1.1.2. Способы детекции биоспецифических взаимодействий

1.2. Тенденции развития иммунохимического анализа

2. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ВОДОРОДА И ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ИММУНОАНАЛИЗА

2.1. Общая характеристика процессов, связанных с каталитическим выделением водорода

2.2. Механизм каталитического выделения водорода

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

3.1. Постановка задачи

3.2. Объекты исследования и приготовление растворов

3.3. Приборы и техника измерений

3.4. Иммобилизация иммунореагентов для проведения иммунохимических определений

3.5. Определение удельной активности рибонуклеазы

3.6. Получение ангидрида ДТПА

3.7. Получение меченного ионом Со(П) антигена РНКазы

3.8. Качественная оценка образования иммунокомплексов

4. ВЫБОР ИНДИКАТОРНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

4.1. Электрохимическое поведение систем: ион переходного металла-иммунореагент

4.2. Влияние некоторых факторов на процессы электровосстановления ионов Со(П) и №(П) в присутствии белков

4.3. Изучение свойств нитроцеллюлозных мембран с некоторыми модификаторами в присутствии ионов металлов

4.4. Иммунохимическое определение Аг РНКазы

4.5. Использование каталитических волн выделения водорода для оценки биоспецифического взаимодействия в системах [Ат-Аг] РкВ и [Ат-Аг] СагМУ

4.6. Влияние рибонуклеиновой кислоты на рибонуклеазу

4.7. Влияние различных факторов на удельную активность рибонуклеазы

5. КОНКУРЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЪЮГАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИОНЫ МЕТАЛЛА

5.1. Получение конъюгата РНКаза-ангидрид ДТПА-Со(П) и определение молярного соотношения компонентов в нем

5.2. Оценка иммунологических свойств конъюгата и образование иммунных комплексов в присутствии и в отсутствие немеченых антигенов

5.3. Отщепление метки и разрушение иммунных комплексов

5.4. Определение антигена рибонуклеазы

Развитие иммунологии послужило основой исследований, сформировавшихся в самостоятельные научные направления и имеющих важное прикладное значение. Одной из таких ветвей иммунологии является иммунохимический анализ (ИХ А), в основу которого положены иммунологические принципы для выявления и количественного определения как высоко-, так и низкомолекулярных соединений.

Интерес к разработке новых вариантов ИХА не ослабевает [1-3]. Достижения современной иммунологии, биотехнологии, с одной стороны, и развитие новых методов регистрации физико-химических процессов, с другой, способствуют внедрению ИХА в различные области жизнедеятельности человека. Иммунохимический анализ имеет широкий спектр применения в фундаментальных биохимических исследованиях, в клинических анализах, медицинской диагностике, в контроле состояния окружающей среды, качества пищевых продуктов.

Иммунологические реакции все чаще используются в настоящее время в практике аналитической химии. Это обусловлено высокой селективностью этих реакций и возможностью с высокой чувствительностью регистрировать степень протекания биоспецифических взаимодействий, что достигается при использовании различных меток. Наиболее часто в качестве меток используют ферментные и флуоресцентные маркеры, при этом детекция метки может осуществляться различными физико-химическими методами. Предпочтительно для регистрации ферментной метки используют спектрофотометрические методы, а для обнаружения флуоресцентной метки - эффект поляризации флуоресценции. В меньшей мере используются способы анализа с электрохимической регистрацией биоспецифических взаимодействий. В последнее время определенное развитие получили электрохимические 6 иммуноферментные сенсоры, основанные на сочетании иммунологических и ферментативных реакций. Применение ферментативных реакций в качестве инструмента, позволяющего оценить степень протекания иммунологических реакций, имеет и свои преимущества, и определенные недостатки. Одним из ограничений иммуноферментного анализа с электрохимическим детектированием является необходимость использования в качестве метки тех фермент-субстратных систем, которые сами по себе или продукты их взаимодействия обладают электрохимической активностью.

При решении конкретных аналитических задач не всегда имеется возможность реализовать эти подходы и возникает необходимость в простых по выполнению способах иммунохимического анализа, не требующих использования дорогостоящих препаратов, к числу которых относятся и очищенные ферменты. Один из путей достижения этой цели -использование для регистрации биоспецифических взаимодействий в качестве меток ионов металлов.

Несмотря на многообразие существующих методов, использованию металлов в качестве меток уделяется мало внимания. Ионы металлов легко детектируются по своей собственной электрохимической активности в достаточно широкой и доступной области потенциалов, а использование каталитических эффектов с их участием может позволить снизить нижний предел определяемых концентраций, сделать анализ более чувствительным и значительно расширить число определяемых биологически активных соединений, включив в их ряды и те, которые сами по себе не обладают электрохимической активностью.

Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов иммунохимического анализа с вольтамперометрическим контролем с использованием эффекта каталитического выделения водорода в 7 присутствии ионов переходных металлов в качестве меток для оценки биоспецифических взаимодействий.

Научная новизна и практическая значимость. Показана и обоснована возможность использования ионов Со(П) и N1(11) в качестве меток для иммунохимического анализа некоторых антигенов. Разработаны новые варианты иммунохимического анализа, отличающиеся по способу введения метки в один из компонентов биоспецифического взаимодействия. Для оценки степени протекания иммунных реакций использована способность комплексов некоторых белков в присутствии ионов Со(П) и №(П) вызывать каталитическое выделение водорода. Определено влияние различных факторов (рН и природы буферных растворов, буферной емкости, концентрации иммунореагентов, ионов металла) на величину аналитического сигнала.

Получены нитроцеллюлозные мембраны с иммобилизованными антителами (Ат) против панкреатической рибонуклеазы быка.

Показана возможность получения конъюгата, включающего исследуемый антиген, бифункциональный хелатобразующий реагент и металлическую метку. Найдены условия функционирования систем на основе иммобилизованных Ат и конъюгата антигена (Аг) с металлической меткой, позволяющие регистрировать каталитическую волну выделения водорода.

Предложены новые варианты иммунохимических определений с аналитическими характеристиками, отвечающими требованиям иммуноанализа. Обоснованы подходы, позволяющие предложить разработанные методики для определения рибонуклеазы в биологических жидкостях и вируса крапчатости гвоздики в растительных экстрактах на уровне наномолей. Разработанные способы анализа основаны на использовании доступных реагентов в качестве метки (ионы металлов) и 8 более просты в исполнении по сравнению с используемыми в настоящее время видами иммуноанализа.

На защиту выносятся

- обоснование выбора индикаторной системы иммунореагент - ион металла (для разработки новых вариантов иммунохимического анализа);

- интерпретация данных об электровосстановлении ионов металлов в присутствии изучаемых антител или антигенов и факторы, определяющие величину аналитического сигнала (рН и природа буферных растворов, буферная емкость, концентрации иммунореагентов и ионов металла);

- совокупность стадий предлагаемых вариантов иммунохимического анализа;

- характеристики конъюгата, включающего исследуемый антиген, бифункциональный хелатобразующий реагент и металлическую метку;

- условия функционирования систем на основе Ат, иммобилизованных в нитроцеллюлозные мембраны, антигенов или конъюгатов, включающих антиген и металлическую метку;

- новые методики иммунохимического определения рибонуклеазы.

Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с координационном планом РАН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 97-03-33232 и №00-03-32389). Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на П-ой Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 1999г.), ЬХХХ Поволжской региональной конференции "Физико-химические методы в координационной и аналитической химии" (Казань, 1999г.), 5-ой Всероссийской конференции "Электрохимические методы анализа" 9

Москва, 1999г.), 8-ой Международной конференции по электроанализу (Бонн, 2000г.), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000г.), Всероссийской конференции с международным участием "Сенсор 2000. Сенсоры и микросистемы" (Санкт-Петербург, 2000г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ. Из них 1 статья и 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, одна статья принята к печати.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы, включающего 140 наименований.

ВЫВОДЫ

1. Предложены новые варианты иммунохимического анализа некоторых антигенов. Обоснован выбор индикаторных систем иммунореагент - ион переходного металла - буферный раствор, позволяющих регистрировать каталитические токи выделения водорода.

2. Каталитический эффект наблюдается в присутствии в растворах ионов Со(П) и М(П) антигенов РНКазы, СагМУ и РИВ на фоне аммиачного буфера с рН 9.5-10.0 и трис-НС1 буфера с рН 7.2-7.8. Каталитическое выделение водорода обнаружено также в растворе ионов Со(П) в присутствии нативных Ат против РИВ в области концентраций от 5x10" до 5x10"'1 мг/мл. Максимальный каталитический эффект наблюдается в среде трис-НС1 буфера с рН 7.5 и (3=0.2 при концентрации ионов Со(П) 5х 10"4 М в присутствии РНКазы и РИВ, а так же в аммиачном буфере с рН 9.5 и (3=0.5 в присутствии СагМУ.

3. Разработан способ иммобилизации антител против РНКазы путем включения в пленку из нитроцеллюлозы, позволяющий сохранить их способность к иммунохимическим взаимодействиям в течение месяца.

4. Предложен вариант иммунохимического анализа для определения РНКазы с использованием ионов Со(П) в качестве метки. Наибольшая чувствительность анализа реализуется при введении металлической метки на стадии регистрации аналитического сигнала, что позволяет определять

О с

РНКазу в области концентраций 2х10~~-2х10" мг/мл; СагМУ в интервале 0.5-2.0 мг/мл и РИВ в диапазоне 0.01-0.06 мг/мл.

5. Разработан конкурентный вариант ИХА, основанный на использовании специально полученного конъюгата состава РНКаза- -ангидрид ДТПА-ион Со(П). Максимальное соотношение ионы Со(П): белок составило 6:1.

101

При этом модифицированный Аг сохраняет свои иммунологические свойства.

6. Наиболее полное отщепление металлической метки (85-90%) от конъюгата достигается при использовании 1М НС1 или глицин-НС1 буферного раствора с рН 2.2, при этом РНКаза сохраняет способность участвовать в реакции каталитического выделения водорода.

7. Найдены рабочие условия проведения конкурентного иммуноанализа РНКазы, позволяющие регистрировать металлическую метку на заключительной стадии анализа. Предложена методика определения Аг РНКазы в области концентраций 2x10" - 2x10" мг/мл.

102

1. Новые методы иммуноанализа/Под ред. У.П. Коллинза. - М.: Мир, 1991. -280 с.

2. Теория и практика иммуноферментного анализа/А.М. Егоров, А.П. Осипов, В.Б. Дзантиев и др. М.: Высш. Шк., 1991. - 288 с.

3. Morgan C.L., Newman D.J., Price С.P. Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine//Clin.Chem. 1996. - V.42, №2. - P. 193209

4. Katoh S., Miura T. Sandwich-type immunoassay with an affinity column coupled to anti-peptide antibodies//J. of Chromatog. -1999. V.852, №1. -P.97-104

5. Application of hemin as a labeling reagent in mimetic enzyme immunoassay for hepatitis surface antigen/Q.Z. Zhu, X.Y.Zheng, J.G. Xu e.a.//Anal.Lett.1998. V.31, №6. - P.963-971

6. An enzymatic amplification cycle for high sensitive immunoassay/F.F. Bier, E. Ehrentreichforster, A. Makower e.a.//Anal.Chim.Acta. 1996. - V.328, №1. - P.27-32

7. Шманай B.B., Найденов В.Э. Экспресс-определение иммуноглобулина G человека твердофазным иммуноферментным методом//Журн.аналит.химии. 1999. - Т.54, № 6. - С.659-665

8. Fernandezsanchez С., Costagarcia A. Competitive enzyme immunosensor developed on a renewable carbon paste electrode support//Anal.Chim.Acta.1999. V.402, №1-2. - P.l 19-127

9. A general method to perform a noncompetitive immunoassay for small molecules/G. Giraudi, L. Anfossi, I. Rosso, C. Bagiani, C. Giovannoli, C. Tozzi//Anal.Chem. 1999. - V.71, №20. - P.4697-4700103

10. Zhang S.S., Jiao К., Chen H.Y., Wang M.X. Detection of ferritin in human serum with m-aminophenol H202 - horseradish peroxidase voltammetric enzyme-linked immunoassay system//Talanta. - 1999. - V.50, №1. - P. 95-101

11. Simultaneous homogeneous immunoassay of phenytoin and phenobarbital using a Nafion-loaded carbon paste electrode and two redox cationic labels/A.L. Bordes, B. Limoges, P. Brossier e.a.//Anal.Chim.Acta. 1997. -V.356, №2-3.-P.l95-203

12. Determination of fenoterol and ractopamin in urine by enzyme immunoassay/W. Haasnat, P. Stouten, A. Lomnen e.a.//Analyst. 1994. -V.l 19, №12. - P.2675-2680

13. Иммобилизованные ферменты/И.В. Березин, H.JI. Клячко, А.В. Левашов, К. Мартинек и др.//Сер. Биотехнология.-М.: Высш. Шк., 1987. -Т.7. 159с.

14. Годжевъргова Ц., Барева Р. Иммобилизация иммуноглобулина G на модифицированной полиамидной мембране //Год.Висш.хим.технол.инст., Бургас. 1992. - Т.27. - С.31-36.

15. Тарун Е.И., Савенкова М.И., Метелица Д.И. Определение строфантина К иммуноферментным методом с использованием антител, иммобилизованных на активированных полистирольных шариках//Журн.аналит.химии. -1993.-Т.48, № 1. С. 145-150

16. Fung Y.S., Si S.H., Zhu D.R. Piezoelectric crystal for sensing bacteria by immobilizing antibodies on divinylsulphone activated poly-m-aminophenol film//Talanta. 2000. - V.51, №1. - P.l51-158

17. Zen J.M., Yu T.Y., Shih Y. Determination of teophylline in tea and drug formulation using a Nafion (R)/ lead-ruthenium oxide pyrochlore chemically modified electrode//Talanta. 1999. - V.50, №3. - P.635-640104

18. Direct on-filter immunoassay of some beta-lactam antibiotics for rapid analysis of drug captured from the workplace atmosphere/F.G. Rowel, F. Miaoz, R.N. Reeves e.a.//Analyst. 1997. - V.122, №12. - P. 1505-1508

19. Enzyme immunoassay for the detection of isoxazolyl penicilin antibiotics in milk/E. Usleber, M. Lorber, M. Straka e.a.//Analyst. 1994. -V.119, №12. -P.2765-2768

20. Immunochemical detection of antibiotics and sulfonamides/E. Martlbauer, E. Usleber, E. Schneider e.a.//Analyst. 1994. - V.l 19, №12. -P.243-2548

21. Арефьев А.А., Осипов А.П. Проточно-инжекционный твердофазный иммуноферментный анализ биологически активных соединений//Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1990. - Т.24. - С.4-83

22. Highly sensitive flow-injection immunoassay system for rapid detection of bacteria/I. Abdelhamid, D. Ivnitski, P. Atanasov, E. Wilkins.//Anal.Chim.Acta. 1999. -V.399, №1-2. - P.99-108

23. Ghous Т., Townshend A. Flow-injection method for the determination of tiroxine by inhibition of glutamat dehydrogenase//Anal.Chim.Acta. 2000. -V.411. - P.45-49

24. Automated stande-alone flow injection immunoanalysis system for the determination of cephalexin in milk/U.J. Meyer, Z.L. Zhi, E. Loomans e.a.//Analyst. 1999. - V. 124, № 11. - P. 1605-1610

25. Watanabe H., Satake A., Kido Y., Tsuji A. Production of monoclonal antibodies and development of ELISA for kanamicin in biological matrices//Analyst. 1999. - V. 124, №11. - P. 1611-1615105

26. Syntheses of novel hapten-protein conjgates for production of highly specific antibodies to formononetin, daidzein and genistein/C. Lehouerou, C. Bennetaupelissero, V. Lamothe e.a.//Tetragedron. 2000. - V.56, №2. - P.295-301

27. Multiple-analyte fluoroimmunoassay using an integrated optical waveguide sensor/T.E. Plowman, J.D. Durstchi, H.K. Wang e.a.//Anal.Chem. 1999. -V.71, №19. - P.4344-4352

28. Ткачева Г.А., Балаболкин И.П., Ларичева М.И. Радиоиммунологические методы исследования. М: Медицина, 1983. -192с

29. Gow S.M., Caldwell G., Toft A.D., Beckett G.J. SimuTRAC™ Simultaneous Radioimmunoassay of Thyrotropin and Free Thyroxin Evaluated//Clin.Chem. 1986. - V.32, №12. - P.2191-2194

30. Gutcho S., Mansbach L. Simultaneous Radioassay of Serum Vitamin Bi2 and Folic Acid.//Clin.Chem. 1977. - V.23, №9. - P. 1609-1614

31. Khaw B.A., Fallon J.T., Strauss H.W., Haber E. Myocardial Infarct Imaging of Antibodies to Canine Cardias Myosin with Indium-lll-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid.//Science. 1980. - V.209, №11. - P.295-297

32. Radioactive Labeling of Antibody: A Simple and Efficient Method/D.J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childs, D. Lanteigne, M.A. Davis//Science. -1980. V.209, №11. - P.

33. Кашкин А.П. Иммуноферментный анализ биологически активных веществ. М.: Медицинская промышленность, 1985. - 43с.106

34. Иммуноферментный анализ/Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М.: Мир, 1988. - 446с.

35. Егоров A.M. Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития//Журн.Всесоюз.хим.общества. 1988. - Т.ЗЗ, №5. - С.494-501

36. Иммунологические методы исследований/Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988. 530 с.

37. Твердофазный иммуноферментный анализ//Сборник научных трудов.- Л.: Изд. Института им. Пастера, 1988. 160с.

38. Immunoelectrochemical assay in combination with homogeneous enzyme-labeled antibody conjugation for rapid detection of Salmonella/Y. Zhongrin, L. Yanbin, Ch. Bahgtas, M. Slavik, D. Paul//Electroanalysis. 1998. - V. 10, №13.- P.913

39. Kokado A., Arakawa H., Maeda M. New electrochemical assay of alkaline phosphatase using ascorbic acid 2-phosphate and its application to enzyme immunoassay//Analyt.Chim.Acta. 2000. - V.407, №1-2. - P.l 19-125

40. Enzyme-linked immunosorbent assay for 2-deoxycytidine/I. Darwish, S. Emara, H. Askal, N. Elrabbat e.a.//Anal.Chim.Acta. 2000. - V.404, №2. -P. 179-186

41. Wijayawardhana C.A., Halsall H.B., Heineman R. Micro volume rotating disk electrode amperometric detection for a bead-based immunoassay//Anal.Chim.Acta. 1999. - V.399, №1-2. - P.3-11

42. Kreuzer M.P., Osullivan C.K., Guilbault G.G. Development of an ultrasensitive immunoassay for rapid measurement of okadaic acid and its isomers//Anal.Chem. 1999. - V.71, №19. - P.4198-4202

43. O-aminophenol H202 - horseradish peroxidase voltammetric enzyme-linked immunoassay for trace ferritin in human serum/S.S. Zang, K. Jiao, H.Y. Chen e.a.//Acta Chim.Sinica. - 1999. - V.57, №8. - P.914-921

44. Zang S.S., Jiao K., Chen H.Y. Voltammetric enzyme-linked immunoassay for trace a-fetoprotein in human serum using o-, m- and p-aminophenol as substrate//Anal.Lett. 1999. - V.32, №9. - P. 1761-1773

45. Савицкий А.П. Флуоресцентный иммуноанализ//Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1987. Т.З. - С.117-166

46. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск: УрО АН СССР, 1988. С.6

47. Гаврилова Е.М. Люминесцентный иммуноанализ//Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1987. Т.З. - С.6 -55

48. Kricka L.J. Chemiluminescent detection of enzyme labels : clinikal applications// Pittsburgh Conf. presents PITTCON '95, New Orleans, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. P.l 1

49. Marguette C.A., Coulet P.R., Blum L.J. Semi-automated membrane based chemiluminescent immunoassay for flow-injection analysis of ocadaik acid in mussels//Anal.Chem.Acta. 1999. - V.398, № 2-3 - P. 173-182

50. Dreveny D., Klammer C., Michalowsky J., Gubitz G. Flow-injection and sequential-injection immunoassay for triiodothyronine using acridinium ester chemiluminescence detection//Anal.Chim.Acta. 1999. - V.398, №2-3. -P.183-190

51. Ashimona I., Rokugawa K. High sensitive microcapsule immunoassay for protein antigen or antibody//Anal.Chim.Acta. 1993. - V.248, №1. - P.227-234108

52. Immunoassay using chemiluminescence detection of dyestuff-containing liposomes as a labeling reagent/K. Tsukagoshi, H. Akasaka, Y. Okumura, R. Fukaya e.a.//Anal.Sciences. 2000. - V. 16, №2. - P. 121 -124

53. Thermally reversible hydrogel based fluoroimmunoassay of methyltestosterone/J. Gao, Y.Z. Li, Z.Q. Guo, W.B. Chang, Y.X. Ci//Anal.Lett. 1999. - V.32, №9. - P. 1787-1798

54. Mounsly A., Strachan D., Rowell V., Tison F.D. Direct determination of some phenothiazine seditives in greyhound urine by fluoroimmunoassay//Analyst. 1996. - V.121, №7. - P.955-958

55. Gutierrez M.C., Gomer-Hens A., Perer-Bendito D. Immunoassay methods based on fluorescence polarization//Talanta. 1998. - V.36, № 12 - P. 11871201

56. Development of a for sulfamethazine using an automated analyser// S.A. Eremin, J. Landon, D.S. Smith e.a.//Analyst. 1994. - V.119, №12 - P.2723-2726

57. Gooch J.C., Gallacher G., Machmood S.A. Detection of phencyclidine in urine using polarization fluoroimmunoassay//Analyst. 1994. - V.119, №8 -P.1797-1800

58. Harma H., Aronkyto P., Lovgren T. Multiplex immunoassays on size-categorized individual beads using time-resolved fluorescence//Anal.Chim.Acta. 2000. - V.410. - P.85-96

59. Vuori S., Rasi T., Takala K. Vaananen.Dual-Label. Time-Resolved Fluoroimmunoassay for simultaneous Detection of Myoglobin and Carbonic Anhydrase HI in Serum//Clin.Chem. 1991. - V.37, №12. - P.2087-2092

60. Hemmila L., Hoittinen S., Pettersson K., Lovgren T. Double-Label Time-Resolved Immunofluorometry of Lutropin and Follitropin in Serum//Clin.Chem. 1987. - V.33, №12. - P.2281-2283109

61. Heineman W.R., Anderson C.W., Halsall H.B. Immunoassay by differential pulse polarografy//Seience.- 1979. -Y.204. P.865-866

62. Wehmeyer K.R., Halsall H.B., Heineman W.R. Electrochemical Investigation of Hapten-Antibody Interaction by Differential Pulse Polarography//Clin.Chem. 1982. - V.28. - P. 1968-1972

63. Hile H.A.O. Assay techniques utilising specific binding agents. European Patent Application № 84303090.9. 1984

64. Robinson G.A., Martinazzo G., Forrest G.C. A homogeneous bioelectrochemical immunoassay for thyroxine//.!. Immunoassay. 1986. - V.7. -P.1-15

65. Heineman W.R., Halsall H.B. Strategies for electrochemical immunoassay//Anal.Chem. 1985. - V.57, №12. - P.1321A-1331A

66. A new application of bioorganometallics: the first simultaneous triple assay by the carbonylmetalloimmunoassay method/M. Salmain, A. Vessieres, A.varenne, P. Brossier, G. Jaouen//J. of Organometallic Chem. 1999. - V.589, №1. - P.92-97

67. Alam I.A., Christian G.D. Voltammetric Immunoassay of Human Albumin and Goat Antiserum to Human Albumin by Nickel Labeling//Frez.Z.Anal.Chem. 1985. - V.320. - P.281-284

68. Alam I.A., Christian G.D. Voltammetric Immunoassay of Human Albumin and Goat Antiserum to Human Albumin by Cobalt Labeling//Frez.Z.Anal.Chem. 1984. - V.318. - P.33-36но

69. Alam I.A., Christian G.D. Voltammetric Detection of Lead Labelled Albumin and of Albumin Antiserum by Immunoassay//Anal.Lett. 1982. -V.15(B18). - P.1449-1456

70. Doyle M.J., Halsall H.B., Heineman W.R. Heterogeneous immunoassay for serum proteins by pulse anodic stripping voltammetry//Anal.Chem. 1982. -V.54. -P.2318-2322

71. Hayes F.J., Halsall H.B., Heineman W.R. Simultaneous Immunoassay using electrochemical detection of metal ion labels//Anal.Chem. 1994. - V.66. - P.1860-1865

72. Дячина M.H., Титова О.JI., Яковлева Л.В.//Тез. докл. Всерос. конф. "Химический анализ веществ и материалов". Москва, 2000. С.116

73. Биосенсоры: основы и приложения/Под ред. Э. Тернера, И. Краубе, Дж. Уилсона. М.: Мир, 1992. - 616с.:

74. Dual immunoassay of human horionic gonadotropin and human placental lactogen at a microfabricated substrate by scanniny electrochemical microscopy/H. Shiku, Y. Нага, T. Matsue e.a.//J.Electroanal.Chem. 1997. -V.438, №1-2. - P.187-190

75. Immunoelectrochemical assay in combination with homogeneous enzyme-labeled antibody conjugation for rapid detection of Salmonella/Z.P. Yang, Y.B. Li, C. Balagatas e.a.//Electroanalysis. 1998. - V. 10, №13. - P.913-916

76. Xu J.Q., Song J.F., Guo W. Polarografic enzyme immunoassay for trace hepatitis В surface antigen//Anal .Lett. 1996. - V.29, №4. - P.565-573

77. Beta-lactamase label-based potentiometric biosensor for a-2 interferon detection/T.A. Sergeyeva, A.P. Soldatkin, A.E. Rachkov, M.I. Tereschenko e.a.//Anal.Chim.Acta. 1999. - У.390, №1-3. - P.73-81

78. Capillary enzyme immunoassay with electrochemical detection for determining indol-3-acetic acid in tomato embryos/H.Y. Gao, T.B. Jiang, W.R.1.l

79. Heineman, H.B. Halsall, J.L. Caruso//Frez.J.Anal.Chem. 1999. - V.364, №12. - P.170-174

80. Амперометрический иммуноферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы/Э.П. Медянцева, С.С Бабкина, Г.К. Будников, И.Л. Федорова, И.Н. Ибрагимова //Журн.аналит.химии. 1992. - Т.47, № 6. - С.1101-1106

81. Определение антигена Candida Albicans с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора/М.П. Кутырева, Э.П. Медянцева, Е.В. Халдеева, Г.К. Будников, Н.И. Глушко //Вопросы медицинской химии. 1998. - Т.44, №2. - С. 172-178

82. Определение антигена Phytophtora infestans с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора/Э.П. Медянцева, М.П. Кутырева, Е.В. Халдеева, Н.И. Глушко, Г.К. Будников //Журн.аналит.химии. 1999. - Т.54. № 12. - С.1294-1299

83. Бабкина С.С., Винтер В.Г., Зайнуллина А.С. Иммуноферментный метод определения органических соединений со спектрофотометрической индикацией аналитического сигнала//Журн.аналит.химии. 1994. - Т.49, №9. - С.1119-1123

84. Label of a-fetoprotein antibody and electrochemiluminescence immunoassay/H.S. Zhuang, Q.E. Wang, G.N. Chen, J.L. Huang, P.C. Lin//Chem.J.Chinese Univers. 1999. - V.20, №8. - P. 1194-1199

85. Arai K., Takahashi K., Kusu F. An electrochemiluminescence flow throught-cell and its applications to sensitive immunoassay using N-(Aminobutyl)-N-ethylisoluminol//Anal.Chem. 1999. - V.71, №11. - P.2237-2240

86. Ohkuma H., Abe K., Kosaka Y., Maeda M. Simultaneous assay of pepsinogen I and pepsinogen II in serum by bioluminescent enzyme112immunoassay using two kinds of Luciola lateralis luciferase//Anal.Chim.Acta. -1999. V.395, №3. - P.265-272

87. Lam M.T., Wan Q.H., Boulet C.A., Le X.C. Competitive immunoassay for staphylococcal enterotoxin A using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection//J.of Chromatography. 1999. - V. 853, №1-2. - P.545-553

88. Roederer J.E., Bastiaans G.J. Microgravimetric immunoassay with piezoelectric crystals//Anal.Chem. 1983. - V.55. - P.2333-2336

89. Curi C.R., Raje M., Mishra G.C. Determination of immunoglobulin M concentration by piezoelectric crystal immunobiosensor coated with protamine//Biosens.Bioelectron. 1994. - V.9. - P.325-332

90. Piezoelectric crystal immunosensor for sensitive detection of methamphetamine (stimulant drug) in human urine/N. Miura, H. Higobashi, G. Sakai, A. Takeyashu, T. Uda, N. Yamazoe//Sensors.Actuators.B.Chem. 1993. - V.13. - P.188-191

91. Gizeli E., Goddard N.J., Lowe C.R., Stevenson A.C. A love plate biosensor utilizing a polymer layer//Sensors.Actuators.B.Chem. 1992. - V.6. - P. 131137

92. A silicon based ultrasonic immunoassay for detection of breast cancer antigens/A.W. Wang, R. Kiwan, R.M. White e.a.//Sensors and Actuators B-Chemical. 1998. - V.49, №1-2. - P. 13-21

93. Choi M.J., Kim S.Y., Choi J., Paeng I.R. Labeling digoxin antibody with colloidal gold and ferrocene for its use in a membrane immunostrip and immunosensor//Microchemical J. V.63, №1. - 1999. - P.92-99

94. Heiss C., Weller M.G., Neiessner R. Dip-and-read test strips for the determination of trinitrotoluene in drinking water//Anal.Chim.Acta. 1999. -V.396, №2-3. - P.309-316113

95. Scladal P. Advances in electrochemical immunosensors //Electroanalysis. 1997. - V.9, №10. - P.737-745

96. Ивницкий Д.М., Курочкин И.Н., Варфоломеев С. Д. Электрохимические биосенсоры//Журн.аналит.химии. 1991. - Т.46, №8. -С.1462-1479

97. Sadik О.A., Van Emon J. М. Applications of electrochemical immunosensors to environmental monitoring//Biosens.Bioelectron. 1996. -V.l 1, №8. - P. 1-10

98. O'Sullivan C.K., Vaughan R., Guilbault G.G. Piezoelectric immunosensors theory and applications//Anal.Lett. - 1999. - V.32. - 1999. -P.2353-2377

99. Иванов И.Д. Полярография белков, энзимов и аминокислот. М.: Изд-во Академии наук СССР, 1961. - 255с.

100. Кузнецов Б. А., Шумакович Г.П. Полярографический анализ микроколичеств белков//В сб. "Методы современной биохимии". М.: Наука. 1975. - с. 160-163

101. Полярография. Проблемы и перспективы/Под ред. Я.\ I. Страдыня и С.Г. Майрановского. Рига: Зинатне, 1977. 416 с.

102. Прохорова Г.В., Виноградова Е.Н., Пронина И.В. О каталитическом выделении водорода в присутствии комплексов кобальта с диоксимами//Журн.аналит.химии. 1970. - Т.25. - С.2073

103. Езерская Н.А., Киселева И.Н., Казакевич И.Л. Каталитические токи водорода в растворах комплексов родия (III) с органическими лигандами, содержащими различные функциональные группы//Журн.аналит.химии. -1984. Т.39, №4. - С.654-658

104. Прохорова Г.В., Виноградова Е.Н., Гребнева И.С., Скобелкина Е.В. Экстракционно-полярографическое определение микрограммовых количеств никеля//Журн.аналит.химии. 1973. - Т.28, №1. - С. 123-126114

105. Улахович H.A., Медянцева Э.П., Фролова В.П., Романова О.Н. Использование каталитических токов водорода комплексных соединений металлов с серосодержащими лигандами в экстракционной вольтамперометрии//Журн.аналит.химии. 1983. - Т.38, №11. - С.1963-1968

106. Каталитические токи водорода в растворах комплексных соединений кобальта с этилксантогенатом/ В.Ф. Торопова, Г.К. Будников, H.A. Улахович, Э.П. Медянцева, В.П. Фролова//Журн.общей химии. 1978. -Т.48, №2. - С.420-423

107. Toropova Y.F., Budnikov Н.С., Ulahovich N.A., Medyantseva E.P. Catalytic evolution of hydrogen on a mercury electrode in cyclic voltammetry and its analytical apphcatiorV/J.Electroanal.Chem. 1983. - V.144, №1. - P.l-10

108. Гейровский Я., Кута Я. Основы полярографии. М.: Мир, 1965. -559с

109. Торопова В.Ф., Анисимова JI.A., Ибрагимов Д.А., Павличенко JI.A. Исследование каталитической волны водорода в растворах комплексных соединений кобальта с тиогликолевой кислотой//Журн.общей химии. -1968. Т.38, №6. - С.1360-1365

110. Торопова В.Ф., Будников Г.К., Медянцева Э.П., Фролова В.П. Изучение каталитических токов водорода в растворах 2-меркаптобензтиазола в присутствии ионов Со(П)//Журн.общей химии. -1977. Т.47, №1. - С. 154-156

111. Торопова В.Ф., Будников Т.К., Улахович H.A. Изучение механизма каталитического выделения водорода в растворах комплексных соединений кобальта с производными дитиокарбаминовой кислоты//Журн.общей химии. 1976. - Т.46, №3. - С.638-645115

112. Езерская Н.А., Киселева И.Н. Каталитические полярографические токи в растворах комплексов платиновых металлов и их применение для определения микроконцентраций этих элементов//Журн.аналит.химии. -1984. т.39, №9. - С.1541-1549

113. Езерская Н.А., Киселева И.Н. Каталитические токи водорода в буферных растворах комплексов родия с тиосемикарбазидом и их использование для полярографического определения микрограммовых количеств родия//Журн.аналит.химии. 1973. - Т.23, №2. - С.316-322

114. Езерская Н.А., Казакевич И.А., Прохорова F.B., Щубочкин J1.K. Каталитические токи ионов водорода в присутствии комплексов с а-фурилмонооксимом и их применение для определения иридия//Журн.аналит.химии. 1981. - Т.36, №3. - С.523-529

115. Торопова В.Ф., Елизарова Г.Л. Полярографические каталитические токи водорода в растворах комплексных соединений некоторых металлов//Журн.аналит.химии. 1963. - Т. 18, №1. - С.4-8

116. Будников Т.К., Медянцева Э.П., Фролова В.П., Торопова В.Ф. Каталитические токи водорода в растворах комплексных соединений некоторых переходных металлов с 8-меркаптохинолином//Журн.общей химии. 1975. - Т.45, №11. - С.2361-2364

117. Майрановский С.Г. Каталитические и кинетические волны в полярографии. М.: Наука, 1966. - 287с.

118. Kolthoff I. М., Mader P. Diffusion controlled polarographic catalytic hydrogen (Brdicka) currents in systems containing cobalt(II), cycteine-like116compounds, and alkaline buffers//Anal.Chem. 1970. - V.42, № 14. - P.1762-1769

119. Гороховская В.И. Каталитические системы типа системы Брдички в вольтамперометрии переменного тока с прямоугольным напряжением//Журн.аналит.химии. 2000. - Т.55, №4. - С.401-405

120. Krejcarek G.E., Tucker K.L. Covalent attachment of chelating groups to macromolecules//Biochem.Biophys.Res.Commun. 1977. - V.77. - P.581-585

121. Christian G.D. Analytical Chemistry. Publ. University of Washington, 1977. -P.578

122. Кузнецов Б.А., Шумакович Г.П. Изучение адсорбции белков на ртутном электроде по емкости двойного электрического слоя и каталитические реакции Брдички//В сборнике "Адсорбция и двойной электрический слой в электрохимии". М.: Наука, 1972. - С.227-234

123. Медянцева Э.П., Будников Т.К. Каталитическое выделение водорода на графитовом и угольно-пастовом электродах в растворах комплексов свинца и кадмия с серосодержащими лигандами//Журн.аналит.химии. -1991. Т.46, №4. - С.783-788

124. Н.М. Дятлова, В.Я. Темкина, И.Д. Колпакова. Комплексоны. М.: "Химия", 1970. -с.

125. Лененджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - Т.1. - 367с.

126. Лещинская И.Б., Варламов В.П., Куриненко Б.М. Нуклеазы бактерий. Казань: Изд-во Казанского университета, 1991. - 232с.

127. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высш.шк., 1998. - 479с.

128. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии.- М.: Высш.шк., 1993. 496с.

129. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Общие принципы торможения. М.: Мир, 1966. - 862с.