Иммунохимические методы определения высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

МУРТАЗИНА НАИЛЯ РАШИДОВНА

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКО- И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им Л М Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанского государственного университета им В И Ульянова-Ленина» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель

доктор химических наук,

профессор Эльвина Павловна МЕДЯНЦЕВА

Официальные оппоненты

доктор химических наук, доцент Сергей Юрьевич ГАРМОНОВ кандидат химических наук, доцент Софья Сауловна БАБКИНА

Ведущая организация

Башкирский государственный университет

Защита состоится «1 б» декабря 2004 г в И часов на заседании диссертационного Совета К 212 081 04 по химическим наукам Казанского государственного университета по адресу г Казань, ул Кремлевская, 18, Химический институт им А М Бутлерова, Бутлеровская аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в научной библшмеке им Н И Лобачевскою Казанского государственного университета

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу 420008, г. Казань, ул Кремлевская, 18, КГУ, Научная часть

Автореферат разослан «16» ноября 2004 г

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат химических наук Шайдарова Л Г

-

Актуальность темы: Разработка экспрессных, точных и чувствительных способов определения физиологически активных соединений - одна из актуальных задач современной аналитической химии Исследования в этой области стимулируются потребностями медицины, ветеринарии, пищевой промышленности, необходимостью мониторинга окружающей среды Особый интерес представляют биохимические методы, которые в последнее время получают все большее распространение Среди них доминирующее положение занимает иммуноанализ, как наиболее подходящий для эффективного, быстрого и недорогого определения большого количества образцов Интерес к иммунохимическим методам анализа связан еще и с возможностью относительно простого варьирования селективности анализа по отношению к ряду соединений, в основном за счет использования антител с различной специфичностью Исследования, проводимые в настоящее время, включают разработки в области мультианализа, когда анализируют содержание не только индивидуального соединения, но группу соединений, обладающих родственными структурными особенностями, либо принципиально различные по структуре

Определение высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений имеет как практическое, так и теоретическое значение для изучения их свойств, содержания в сыворотке крови и других матрицах, влияния на организм человека и животных, фармакокинетики, структуры синтезированных соединений и биохимических реакций с их участием Лекарственные соединения, как и многие физиологически активные вещества, способны оказывать положительное или отрицательное воздействие на организм в зависимости от дозы, длительности воздействия и метаболизма в конкретном организме Кроме того, в связи с широким применением высокоэффективных лекарств и в других областях жизнедеятельности (например, в сельском хозяйстве) в воде и пищевых продуктах могут содержаться остатки этих препаратов в количествах, превышающих безопасный уровень. В связи с требованиями повышения качества жизни и увеличением поступлений фальсифицированной продукции на фармацевтический рынок, в последнее время необходимы разнообразные варианты количественного определения широкого круга лекарств, включающих высоко- и низкомолекулярные соединения, для оценки их качества, а также для определения их содержания в организме человека и животных

Научный консультант по вопросам электрохимии биологически а-тивных соединений - д х н , профессор, академик МАНВШ, академик РАЕН Г.К. Будников, научный консультант по вопросам, связа физации

флуоресценции - к х н, в н с С.А. Еремин

Работа является частью исследований по основному научному направлению химического факультета Казанского государственного университета «Развитие теоретических и прикладных основ методов определения малых количеств биологически активных веществ» (№ гос регистрации 0120107141) и проводилась при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 03-03-33116, и Министерства образования РФ, проект А03-2 11-24 (грант для поддержки научно-исследовательской работы аспирантов высших учебных заведений)

Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов иммуноанализа высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм высокомолекулярного белка рибонуклеазы (панкреатической и микробной рибонуклеазы) и низкомолекулярных антимикробных препаратов сульфаниламидного класса, выборе параметров аналитических систем для определения, как индивидуальных соединений, так и группы родственных соединений, с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, а также поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• получить необходимые иммунореагенты - конъюгаты (соединения с высокомолекулярным носителем), трейсеры (соединения с низкомолекулярным носителем) Охарактеризовать их различными методами, определить содержание компонентов, степень связывания, устойчивость при хранении Предложить способ иммобилизации и соиммобилизации имунореагентов, в том числе, фермента, специфичных антител, конъюгатов, на поверхности планарного платинового электрода для получения биочувствительной части иммуно- и иммуноферментных сенсоров,

• разработать варианты определения высоко- и низкомолекулярньтх лекарственных соединений с помощью иммуно- и иммуноферментных сенсоров с амперометрическим детектированием и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, используя полученные иммунореагенты,

• определить и сопоставить аналитические характеристики предлагаемых конкурентных и неконкурентных вариантов определения рибонуклеаз и сульфонамидных лекарственных соединений,

• обосновать схемы вариантов иммуноанализа и провести апробацию разработанных методик на различных объектах,

• выявить особенности- способов определения, как индивидуальных соединений, так и груйпы близкие по-структуре соединений

Научная новизна: Разработаны варианты конкурентного и неконкурентного электроиммуноанализа высокомолекулярных соединений - двух форм рибонуклеаз (барназы и биназы) и низкомолекулярного лекарственного соединения сульфаметазина. основанные на использовании амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, и варианты конкурентного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкочолекулярньгх лекарственных соединений сульфонамидного ряда (сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаниламида) Впервые синтезированы конъюгаты панкреатической рибонуклеазы и бутирилхолинэстеразы, а также конъюгаты бычий сывороточный альбумин-сульфаметазин и антитела-холинэстераза Показана возможность определения удельной активности фермента в полученных конъюгатах Получены различные по структуре и составу конъюгаты соединений сульфонамидного ряда с производными флуоресцеина (трейсеры) Выявлено влияние структуры конъюгатов гаптенов на специфичность антител, оценена специфичность иммунореагентов по отношению к структурно-подобным соединениям Предложены наилучшие пары антитела - меченый антиген д^я наиболее чувствительного определения, как индивидуальных соединений, так и группы структурно-родственных соединений

Практическая значимость: Предложены варианты иммуноанализа для определения РНКазы А и сулъфонамидных препаратов (сульфаметазина, сульфаниламида) в лекарственных формах, сыворотке крови, пищевых продуктах (молоко), природной воде Разработаны методики пробоподготовки таблеток сульфаметазина с использованием метанола, ацетонитрила, гидроксида калия и хлороводородной кислоты, а также способы пробоподготовки молока с помошью щавелевой и трихлоруксусной кислот для определения содержания сульфаниламида На защиту выносятся:

• новые варианты иммуноанализа высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм рибонуклеаз и сульфонамидных препаратов с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа,

• получение иммунореагентов и их характеристика, определение молярного соотношения компонентов,

• выбор условий функционирования иммуноаналитических систем и определение их аналитических характеристик,

• параметры аналитических систем для определения индивидуальных соединений или группы родственных соединений

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), V

Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003» с международным участием (Санкт-Петербург, 2003), IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблему теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), VIIth International Conference on Agri-Food Antibodies (Uppsala, 2003), Всероссийской конференции посвященной 100-летию со дня рождения академика И П Адимарина «Аналитика России» (Москва, 2004)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ Из них 2 статьи в международном и отечественном рецензируемых научных журналах и 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях

Структура и объем работы: Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит 20 таблицы и 4S рисунка Работа состоит из введения, пяти глав, выводов списка литературы, вкдючающего«££?ссылок

В первой главе представлен обзор литературы по иммунохимическим методам определения физиологически активных соединений разных классов, включающих высоко- и низкомолекулярные соединения, описание объектов исследования с точки зрения их физиологической активности и других свойств, а также существующие био- и иммунохимические методы определения объектов исследования

Вторая глава содержит постановку задачи, методы и условия эксперимента Третья глава посвящена разработке иммуно- и иммуноферментных сенсоров с амперометрическим детектированием на основе планарных электродов для определения двух форм рибонуклеаз (барназы и биназы) в неконкурентном и конкурентном форматах иммуноанализа

В четвертой главе описано получение и характеристика конъюгатов гаптен-белок и антитела-фермент для проведения конкурентного иммуноанализа сульфаметазина-с помощью амперометрического иммуносенсора

В пятой главе представлены варианты поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкомолекулярных лекарственных соединений на примере сульфонамидов Обсуждается специфичность антител и селективность иммуноанализа в условиях варьирования структуры иммунореагентов для наиболее чувствительного определения, как индивидуального соединения, так и группы структурно-родственных соединений

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы исследования: Электрохимические измерения проводили с помощью многоцелевого электрохимического детектора «МЕВ» Основой для

иммуноферментных сенсоров (ИФС) служили четырехканальные пленарные платиновые электроды фирмы BVT Technologies (Brno, Czech) Электродом сравнения служила серебряная проволока, впаянная в рабочую микроячейку, которая при работе в растворе иодидсодержащего субстрата БТХИ образует псевдо-иодидсеребряный электрод Для работы использовали ячейку объемом 200 мкл, сделанную из фторопласта

Поляризацию и интенсивность флуоресценции измеряли на приборе Beacon 2000 фирмы Pan Vera (Wisconsin, USA), а также на приборе TDx Analyzer фирмы Abbott Laboratories (Illinois, USA) в статическом режиме при 25°С Для измерений использовали боросиликатные кюветы

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Hitachi U-2000 (Japan)

Объекты исследования: Применяли химически чистый препарат кристаллической рибонуклеазы А (РНКазы А) фирмы «Диа М» (Москва), а также химически чистый препарат РНКазы Bacillus intermedms, полученный на кафедре микробиологии Казанского государственного университета Сульфаметазин (СМЗ), сульфадиазин (СДЗ), сульфаниламид (САМ) и другие сульфонамиды были приобретены в фирме «Sigma» (Poole, Dorset, UK).

В работе применяли поликлональные антитела против РНКазы, полученные иммунизацией кроликов коммерческим препаратом фермента

Использовали антисыворотки к сульфонамидам, полученые 1) на амидную группу производных сульфаниламида, 2) на ароматическую аминогруппу общего фрагмента сульфонамидов Применяемые антисыворотки подразделяются на три группы:

1) Антисыворотка, специфичная к группе нескольких сульфонамидов, полученная после иммунизации овец смесью семи конъюгированяых с бычьим сывороточным альбумином (БСА) фталевых производных сульфонамидов (сульфадиметоксина, сульфатиазола, сульфадиазина, сульфат етазина. сульфаметоксазола, сульфаметизола, сульфаметоксипиридазина), каждый из которых пришивается к белку через общую ароматическую аминогруппу Такая антисыворотка представляет собой смесь поликлональных антител с разной специфичностью Антисыворотка любезно предоставлена Dr Ramadan Abuknesha (King's College, London, UK)

2) Антисыворотки с индивидуальной специфичностью к сульфонамидам, полученные путем иммунизации овец конъюгатами овальбумина с сукцинатам'и сульфадиазина и сульфаметазина Антисыворотки предоставлены для исследований Dr Roy Jackman (Veterinary Laboratories Agency, New Haw, Surrey KT15 3NB, UK)

3) Антисыворотки с групповой специфичностью к нескольким сульфонамидам, полученные против конъюгатов синтетического гаптена М-сульфанил-4-аминобутановой кислоты с овальбумином и соевым ингибитором трипсина Антисыворотки были предоставлены для исследований проф , д х н Б Б Дзантиевым (Институт биохимии РАН им А Н Баха, Москва)

Применяли бутирилхолинэстеразу (ХЭ) с активностью 29 АЕ/мг, изготовленную НПО «Биомед» (Пермь, Россия) В качестве субстрата холинэстеразы использовали бутирилтиохолин иодид (БТХИ) фирмы «ICN Biomedicals Inc » (Ohio, USA)

Получение иммунореагентов: Синтез конъюгатов производных сульфаметазина с белками и трейсеров (соединений гаптенов с аминопроизводньши флуоресцеина) проводили с помощью метода активированных эфиров Конъюгат ХЭ-РНКаза потучали с помощью селективной модификации белка за счет активации ос-аминогрупп N-терминальных аминокислот глутаровым альдегидом Конъюгат антитела против сульфаметазина-ХЭ получали с помощью водорастворимых карбодиимидов

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

В качестве объектов исследования выбраны две формы РНКазы и антимикробные сульфаниламидные препараты Как лекарственный препарат РНКазы обладают противовирусным, противоопухолевым действием Количественная характеристика содержания РНКазы дает возможность избирательно регулировать механизм ее противоопухолевого действия Кроме того, определение содержания некоторых других форм РНКаз существенно для оценки процесса опухолевого ангиогенеза Существует необходимость определения РНКазы, независимо от ее каталитической активности, например, в виде денатурированных молекул или в комплексах с другими соединениями Сульфонамиды обладают широким спектром антимикробного действия В настоящее время их применение в медицине ограничено лечением бронхитов и инфекций мочеполовой системы, они применяются также в ветеринарии для профилактики, лечения заболеваний животных и в качестве i енераторов их роста

При разработке новых способов иммунохимического определения лекарственных соединений было использовано несколько подходов в том числе, предложены различные варианты электроиммуноанализа и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, рассмотрены их аналитические возможности Сочетание иммунологической, биокаталитической и электрохимической реакций

лежит в основе функционирования иммуно- и иммуноферментных сенсоров Явление поляризации флуоресценции связано с процессами поглощения плоскополяризованного света и эмиссии флуоресценции меток низкомолекулярного соединения после его связывания в комплекс антиген-антитело

Иммуноанализ рибонуклеаз и сульфонамидных препаратов с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров

Принцип детектирования амперометрических иммуноферментных сенсоров основан на регистрации тока окисления продукта ферментативного гидролиза субстрата БТХИ (тяола) с помощью холинэстеразы, которая в данном случае выступает в качестве ферментной метки

СзН7С05СН2СН2М+(СНз)з1 + Н20-> С3Н7СООН + ШСН2СН2К+(СНз)зг

тиол

2(СНз)зЫ ТН 2СН 28Н -» 2Н~+2е~+ (СН3)3Ы *СН 2СН 28-8СН 2СН 2Ы +(СН ■,),

тиохолин

Изучено влияние иммунореагентов (антигенов, специфичных антител и иммунного комплекса) на иммобилизованную ХЭ, которая входила в состав биочувствительной части амперометрического биосенсора Установлено, что РНКаза не обладает собственной электрохимической активностью и способностью изменять каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы (ИХЭ) на фоне трис буфера (рН 7,8) при потенциале 500 мВ Сульфаметазин также не обладает собственной электрохимической активностью в изучаемых условиях В области концентраций СМЗ 1-100 мкг/мл наблюдалось небольшое увеличение каталитической активности ХЭ (2-7 нА) по сравнению со средним значением тока окисления продукта ферментативной реакции в отсутствие соединения Эффект незначительного увеличения каталитической активности фермента зависит от концентрации сульфаметазина Однако величина этого эффекта не позволяет использовать е! о в качестве аналитического сигнала

Исходя из полученных результатов, была предпринята попытка разработки иммуно- и иммуноферментных сенсоров на основе пленарных платиновых электродов для определения РНКаз и сульфаметазина

Конкурентное и неконкурентное иммунохимическое определение РНКаз

Предложены варианты электроиммуноанализа РНКаз с помощью амперометрических иммуносенсоров в конкурентном и неконкурентном формате иммуноанализа

Для получения биочувствителъной части иммуносенсоров в неконкурентном варианте для определения РНКаз проводили совместную иммобилизацию антител против РНКазы и фермента ХЭ на рабочую поверхность платинового электрода с помощью глутарового альдегида В конкурентном электрохимическом иммуноанализе РНКазы на поверхность электрода иммобилизовали антитела против РНКазы Каталитическая активность иммуноферментных сенсоров и иммунологическая активность антител сохранялась в течение не менее месяца

С целью выбора наилучших условий функционирования иммуносенсоров варьировали потенциал, концентрацию субстрата, рН (рис 1) и природу буфера, соотношение иммобилизованных XI и антител Были выбраны следующие параметры аналитических систем рН трис буфера 7,8, потенциал - 500 мВ, концентрация субстрата БТХИ - 1 мМ, разведение антител для иммобилизации - 1 50 для неконкурентного иммуноанализа РНКазы (рис 2) и 1 5 - для конкурентного варианта иммуноанализа РНКазы

0,014 0,012 0,010 <Й 0,008 | 0,006 _Р 0,004 ~ 0,002 0,000

рН

0,020

0,016

0,012

^ 0,008 I

~ 0,004

М-

10 100 1000 Разведение антител

Рис. 1. Зависимость тока окисления продукта гидролиза субстрата (I, мкА) от величины рН при Е = 500 мВ

Рис. 2. Зависимость тока окисления продукта гидролиза субстрата (I, мкА) от разведения антител против РНКазы в неконкурентном варианте анализа в присутствие РНКазы (1 мг/мл) при Е = 500 мВ

Неконкурентный вариант иммуноанализа основан на эффекте ингибирования каталитической активности ИХЭ вследствие образования иммунного комплекса на поверхности электрода Это отражается в уменьшении тока окисления субстрата по сравнению с сигналом в отсутствие аналита Аналитические характеристики и возможности этого варианта иммунохимического определения панкреатической и микробной РНКазы представлены в табл. 1

Таблица 1.

Аналитические характеристики градуировочных зависимостей для определения панкреатической и микробной РНКаз с помощь амперометрического иммуноферментного сенсора

Форма РНКазы Линейный интервал концентра ций, мг/мл 1С 50, мг/мл Уравнение градуировочного графика I=a(-lgC)±b г

ахЮ 3 j bxlO3

Барназа 1-1,6х10~3 0,3307 3,34±0,03 11,68±0,04 0,9986

Биназа 1-1х10'2 0,2359 | 8,11 ±0,06 | 19,37±0,07 0,9990

Максимальная степень ингибирования процесса ферментативного гидролиза, что отражается в уменьшении тока окисления тиола, в присутствии антигена составляет (75.5±0.5) и (91,2±0.3)%, нижняя граница определяемых концентраций (с„) - 1,2 и 3,1 мкг/мл, для панкреатической РНКазы и РНКазы Bacillus intermedius, соответственно Большая кросс-реактивность используемых поликлональных антител по отношению к обеим РНКазам (100 и 140% для РНКазы А и РНКазы Bacillus mtermedim, соответственно) объясняется структурным сходством их молекул Известно, что степень гомологии РНКазы А и РНКазы Bacillus intermedius составляет 85%

Правильность разработанного варианта иммуноанализа проверена методом «введено-найдено» (табл 2)

Таблица 2.

Определение рибонуклеазы А с помощью амперометрического

иммуноферментного сенсора в неконкурентном варианте (п = 3, Р = 0,95)

Концентрация антигена, мг/мл

Введено I Найдено % открытия Sr

2 х 10ч П,87±0,05)х10~1 93,5 0,01 ,

2 х 10'2 ' (2,07±0,08)х10~2 103,5 0,02

2 х 10~3 j (2,1±0,1)х103 105 0,03

Применение неконкурентного иммуноанализа РНКаз ограничено в тех случаях, когда необходимо их определять в виде во шожных соединений, особенно высокомолекулярных, например, с белками, которые могут образовываться в организме Поэтому более привлекательным становится конкурентный иммуноанализ с испотьзованием ферментной метки

Конкурентный вариант иммуноанализа предполагает конкуренцию анализируемого соединения и его меченого аналога за центры связывания иммобилизованных антител При фиксированной концентрации антител равновесное соотношение концентраций связанного и свободного антигена зависит от его общей концентрации Для проведения конкурентного иммуноанализа РНКазы синтезирован конъюгат РНКазы с холинэстеразой

Конъюгат очищали с помощью гель-фильтрации и характеризовали методами вольтамперометрии и спектрофотометр ни Для определения количества ХЭ в конъюгате использовали зависимость величины тока окисления продукта ферментативного гидролиза на платиновых электродах от количества нативной ХЭ Уравнение линейной зависимости I = (0,175±0,001)~(0,n5±0,001)xlgCX3, г = 0,9992, где I - ток окисления тиола (мкА), Схэ - концентрация активного фермента в объеме ячейки (мг/мл) Концентрация ХЭ в конъюгате составила 1,29 мг/мл Количество РНКазы вычисляли по уравнению градуировочного графика зависимости оптической плотности при 278 нм (максимум поглощения белков, обусловленный поглощением ароматических групп) от концентрации РНКазы в смеси РНКазы с ХЭ, где концентрация ХЭ остается постоянной и равной концентрации ХЭ в конъюгате Уравнение линейной зависимости оптической плотности смеси от концентрации РНКазы имеет вид А = (l,98±0,08)+(l,35±0,23)xlgCpHKaM, где А - оптическая плотность смеси белков, Срнюш - концентрация РНКазы (мг/мл) Количество РНКазы в конъюгате, вычисленное по этому уравнению составило 0,21 мг/мл Таким образом, молярное соотношение компонентов конъюгата ХЭ РНКаза - 1 5 Активность ХЭ после конъюгирования вычисляли по формуле Act = (I I0)xa/(tymxV), где I - среднее значение тока окисления продукта ферментативной реакции (мкА), 1 о — ток в холостом опыте (мкА), a - коэффициент, равный 0,766 (мМ/мкА), t - время ферментативной реакции, мин, m - масса активного фермента, мг/мл, V объем раствора ХЭ или конъюгата (мл) Удельная активность фермента в конъюгате составила 0,028 мМ/мгхмин

Практическое выполнение конкурентной схемы иммунохимического анализа с амперометрическим детектированием предполагает осуществление следующих стадий

• получение конъюгата РНКаза-ХЭ,

• приготовление исследуемого раствора для анализа (смесь аналита. содержащего неизвестное количество РНКазы, конъюгата и буферного раствора),

• инкубирование исследуемого раствора в присутствии иммуносенсора с иммобилизованными антителами,

• удаление несвязавшегося с иммобилизованными антителами коньюгата и антигена (РНКазы),

• добавление раствора субстрата фермента,

• регистрация наблюдаемого аналитического сигнала и определение аналита Область изученных концентраций в данном варианте анализа составляет 1-

SxlO"6 мг/мл Линейный интервал определяемых концентраций составил 1-7,6x10 5 мг/мл и ему соответствует уравнение I/I0(xlOO%) = (16,55±0,25)+(-17,97±0,10) xlgCpHKua, г = 0,9993 Нижняя граница определяемых концентраций составляет 21 нг/мл.

Амперометрический иммуносенсор для определения сульфаметазина Для конкурентного иммуноферментного определения сульфаметазина был разработан амперометрический иммуносенсор, причем, если в иммунохимическом анализе РНКазы ХЭ являлась меткой для антигена, в этом случае ХЭ выступает в качестве метки антител

Для проведения конкурентного иммуноферментного анализа сульфаметазина с помощью амперометрического иммуносенсора были синтезиоованы и охарактеризованы различными методами конъюгаты СМЗ - БСА и антитела - ХЭ Иммобилизованный в виде коньюгата с белком антиген конкурирует со свободным антигеном за связывание с антителами, находящимися в растворе Вслед за стадией отделения иммунных комплексов, образовавшихся на поверхности электрода, о г иммунных комплексов в объеме раствора, его количество фиксируется после добавления субстрата, специфичного ферменту-метке

Для характеристики коньюгата СМЗ-БСА применяли известные методы определения концентрации белков Бредфорд и Фолина Для построения градуировочных графиков зависимости оптической плотности от концентрации белка использовали БСА в области концентраций 0,001-0,1 мг/мл (метод Фолина). 5-50 мкг/мл (метод Бредфорд) и разведения коньюгата от 1 2 до 1 100 Содержание белка определяли согласно уравнениям линейного участка градуировочных зависимостей при 595 нм (метод Бредфорд), при 500 и 750 нм (метод Фолина), количество БСА, определенное этими методами, составило 0 12 мг/мл и 0,11 мг/мл, соответственно Содержание гаптена определяли по УФ-спектрам поглощения смесей, приготовленных на основе растворов белка с концентрацией 0,5 мг/мл и различных концентраций сульфаметазина (область концентраций 0,0001-0,01 мг/мл) Количество гаптена в конъюгате определяли при 260 нм по уравнению линейной зависимости оптической плотности раствора от концентрации сульфаметазина- А = (6,214±0,037)^(2,957±0,023)xlgC, г = 0,9999, где А -

оптическая плотность, С - концентрация сучьфаметазина (мг/мл) Оно составило 0,01 мг/мл На основе полученных результатов соотношение компонентов в конъюгате подсчитано как 1 21 Соотношение бе юк-гаптен при синтезе конгьюгата составляло 1.42

Удельная активность фермента в конъюгате составила 0 68 мМ/мгхмин Удельная активность, подсчитанная для нативной ХЭ, - 0,79 мМ/мгхмии Для проведения конкурентного определения использовали разведение конъюгата 1 3

Область изученных концен граций в данном конкурентном варианте иммуноанализа составляет 100-0,001 мкг/мл Линейный интервал определяемых концентраций составил 0,01-2,1 мкг/мд Нижняя граница определяемых концентраций - 5,3 нг/мл

Применение разработанных амперометрических иммуно-и иммуноферментных сенсоров для анализа объектов Возможности применения разработанных амперометрических иммуносенсоров для анализа конкретных объектов показаны на примере определения РНКазы А в таблетках и модельных растворах на фоне сыворотки крови Результаты представлены в табл 3

Таблица 3.

Определение рибонуклеазы в лекарственном препарате и на фоне сыворотки крочи

с помощью иммуно- и иммуноферментных сенсоров (п = 3, Р = 0,95)

Вариант ИФА (объекты анализа) Концентрация антигена, мг/мл % открытия 8,

Неконкурентный (спрессованные таблетки, «СамсонМед», Санкт-Петербург) Введено Найдено

1х10~2 (0,97±0,05)х10"2 97 0,02

5x10 3 (4,92±0,06)х10~3 98,4 0,05

1x10 3 (1,05±0,07)х10~3 105 0,07

Конкурентный (сыворотка крови) 2x10 2 (1,97±0,04)х10~2 98,5 0,02

2x10"3 (2,04±0,06)х10~3 102 0,03

2x10"* (1,95+0,07)х10^ 97,5 0,04

Поляризационный флуоресцентный имчуноанализ низкомолекулярных лекарственных соединений на примере сульфонамидов

Если проведение иммуноанализа с амперометрическим детектированием требует меток или конъюгатов, обеспечивающих электрохимическую активность соотве гствующих соединений для получения аналитического сигнала, то метод

поляризации флуоресценции основан на применении флуоресцентных меток Аналитическим сигналом в данном методе выступает величина поляризации флуоресценции, пропорциональная времени релаксации при повороте молекулы на определенный угол

Рассмотрены варианты конкурентного поляризационного иммуноанализа некоторых сульфонамидов сульфаметазила, сульфадиазина и сульфаниламида Иммуноанализ основан на конкуренции между аначитом и его меченым флуоресцеином аналогом за центры связывания антител Учитывая современные тенденции решения аналитических задач, когда анализируют содержание не только отдельного соединения, но группы соединений, обладающих родственными структурными особенностями, представляло интерес разработать варианты иммуноанализа, как для чувствительного определения индивидуальных соединений, так и для определения группы нескольких сульфонамид )в С этой целью в работе использовали антитела с различной специфичностью, полученные после иммунизации животных производными су-тьфонамидов. кокьюгированных с белком-носителем разными способами

• связывание с белком через амидную группу сульфонамида

Варьировали структуру трейсеров, типы флуоресцентных меток (этилендиаминофлуоресцеинтиокарбамат (ЭДФ), 5-([4,6-дихлоротриазин-2 ил]амино)-флуоресцеин (ДТАФ), флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТС)), а также использовали гомологичные и гетерологичные пары гаптен-трейсер и антитела-трейсер

белок

• связывание с белком через общую ароматическую аминогруппу сульфонамида

белок

Иммунохимическое определение индивидуальных сулъфонамиоов При разработке варианта поляризационного флуоресцентного иммуноанализа сульфаметазина использовали смесь поликлональных антител, полученных на общий сульфаниламидный фрагмент, и трейсер с меткой этилендиаминофлуоресцеинтиокарбамат с дополнительным мостиком между гаптеном и меткой Нижняя граница определяемых концентраций в этом случае составила 6 нг/мл, а линейный интервал концентраций 0,05-25,7 мкг/мл

Сопоставление результатов определений сульфаметазина с помощью амперометрического иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа по рассчитанным и табличным значениям Р - и ^критериев (Ррасч(18)<Ртабл(19), (^с.,(3>9)<1тя6л(4,3)) показало, что методы является равноточными в диапазоне определяемых концентраций, а расхождения между средними результатами незначимы Разработанные методы являются точными и позволяют проводить определение сульфаметазина на уровне нг/мл

Из сульфонамидных препаратов судьфаметазин и сульфадиазин наиболее широко используются в сельском хозяйстве Поэтому необходимы способы индивидуального определения этих судьфонамидов Для проведения иммуноанализа сульфадиазина и сульфаметазина использовали антитела, полученные против конъюгатов этих соединений, в которых индивидуальная Л-группа сульфонамида была удалена от носителя и максимально доступна для распознавания антителами Оценивали кросс-реактивность антител по отношению к соединениям суяьфонамидного ряда Большинство изученных сульфонамидов слабо связывались с изучаемыми антителами кросс-реактивность < 0,1% Кросс-реактивность антител по отношению к сульфамеразину более существенна (.4,8%), по сравнению с остальными соединениями этого класса, что может быть обусловлено его структурой он отличается от сульфадиазина присутствием в структуре пиримидинового кольца одной метальной группы

В табл 4 представлены аналитические характеристики градуировочных зависимостей (ГЗ) для определения сульфадиазина и сульфаметазина с помощью гомологичных (СДЗ-ДТАФ и СМЗ-ДТАФ, для СДЗ и СМЗ, соответственно) и гетерологичных трейсеров, а также с использованием гомологичных и гетерологичных антител, полученных против СДЗ и СМЗ

Таким образом, показана возможность определения индивидуальных соединений сульфонамидного ряда

Таблица 4.

Аналитические характеристики градуировочных зависимостей для определения сульфадиазина и сульфаметазина с помощью различных трейсеров и антител с индивидуальной специфичностью

Трейсер СДЗ-ДТАФ Трейсер СМЗ-ДТАФ

Параметры Среднее Среднее Б

значение значение

Антитела Ся (нг/мл) 0,2 0,1 0,9 0,3

против 1С50 (нг/мл) 4,2 0,7 6,0 0,8

сдз линейный

участок ГЗ (нг/мл) 0,54-32 - 0,9-42 -

коэффициент

чувствительности 0,86 С,08 0,71 0,07

Антитела Сн (нг/мл) 2,1 0,2 4 2

против 1С5о (нг/мл) 1900 560 240 86

СМЗ линейный участок

ГЗ (нг/мл) 100-36600 - 34-1715 -

коэффициент

чувствительности 0,45 0,05 0,71 0,13

Особенности иммуноанализа группы структурно родственных соединений При анализе реальных объектов, в большинстве с ту чае в неизвестно какой именно сульфонамид содержится в образце, поэтому варианты определения группы нескольких сульфонамидов весьма актуальны Предложены варианты иммуноанализа группы сульфонамидов с помощью антител, обладающих групповой специфичностью Для этой цели исследовали поликлональные антитела двух типов 1) смесь поликлональных антител, полученных на индивидуальную группу нескольких сульфонамидов, 2) антитела, полученные на общий фрагмент всех сульфонамидов с помощью синтетического гаптена М-сулъфанил-4-аминобутановой кислоты

В первом случае использовали гомологичные и гетерологичные пары трейсер - стандарт, причем исследовали ингибирование сигнала в присутствии, по крайней мере, семи сульфонамидов и двух производных гаптенов Сравнительная оценка значений кросс-реактивности смеси поликлональных антител по отношению к некоторым сульфонамидам, в том числе к тем, которые применялись для получения иммуногена (сульфатиазол, сульфадиазин, сульфаметазин, сульфаметоксазол), с использованием всех исследуемых трейсеров представлена на

рис 3 Общая картина распознавания исследуемых сулъфонамидов антисывороткой показывает, что данная антисыворотка обладает наибольшим сродством к сульфатиазолу (СТЗ), сульфаметоксазолу (СМК), сульфамеразину (СМР) Антисыворотка весьма чувствительна к СТЗ независимо от трейсера, и может применяться для определения сульфатиазола с чувствительностью до 1 нг/мл

Рис. 3. Сравнительная оценка значений кросс-реактивности смеси поликлональных

антител по отношению к некоторым сульфонамидам и производным сульфаметазина при тР = 0,5 с использованием гомологичных и

гетерологичных трейсеров

4

Siooo-"и 2 800 -

5

600

н сх

§400 X

Я 200

н о

О

— ■ — сульфадиметоксин-ЭДФ| —• —сульфадназин-ЭДФ I сульфаметоксазол-ЭДФ| —»—сульфаметизол-ЭДФ / *■ сульфаметокси- / пиридазин-ЭДФ

* глутарат сульфа метазина-ЭДФ

сдз

CM3 СМР СГД сукцинатСМЗ

СМК CXK глутармСМЗ

Высокая чувствительность достигается при детектировании производных сулъфонамидов (глутарата СМЗ и сукцината СМЗ). В общем, наблюдается закономерность в повышении чувствительности при использовании гомологичных пар трейсер-сулъфонамид Антисыворотка обладает малым сродством к сульфагуанидину (СГД), сульфаметазину и сульфахиноксалину (СХК) Однако, подбирая условия проведения иммуноанализа и варьируя структуру трейсеров можно повысить чувствительность определения, например, это наблюдается для сульфаметазина.

Выбор структуры гапгена для получения иммуногена является одним из основополагающих моментов для получения антител, обладающих специфичностью к нескольким сульфонамидам Напряжение, вызываемое вариабельными частями сулъфонамидов (К-группами), оказывает различное влияние на общий сульфаниламидный фрагмент, так что он проявляет разные для каждого отдельного сульфонамида стерические и электронные свойства Поэтому синтетические производные сульфаниламида по сравнению с сульфонамидами могут быть подходящими гаптенами для реализации высокой кросс-реактивности антител, так как они не содержат «мешающей» Я-группы

Предложен новый синтетический гаптен М-сульфанил-4-аминобутановая кислота (САБ) для получения антител против сулъфонамидов Структура гаптена близка к структуре сульфаниламида и отличается наличием остатка бутановой

кислоты Карбоксильную группу, удаленную от общего сульфонамидного фрагмента, пришивали к аминогруппам беткового носителя для получения иммуногена Использовали различные бетки для конъюгирования гаптена Исследовали связывание полученных антител с гаптеном, меченьм флуоресцентной меткой, в зависимости от природы белка носителя и цикла иммунизации Наилучшие характеристики (титр антител, значения с,„ ТС50) были получены при использовании антител против гаптена, конъюгированного с соевым ингибитором трипсина (СИТ) после третьего цикла иммунизации

Антисыворотка обтадает принципиально новой специфичностью по отношению к группе нескочьких сульфонамидов Значения кросс-реактивности для некоторых сульфонамидов приведены в табл 5

Таблица 5.

Кросс-реактивность антител против М-сульфани-4-аминобутановой кислоты

по отношению к соединениям сульфонамидного ряда

Сульфонамид Я-группа 1С50, мкг/мл Кросс-реактивность, %

Сульфаниламид (САМ) Н 0,7 100

Сульфагуанидин (СГД) 0,8 96

Сульфаметоксипиридазин (СМП) N=N -( ОСНз 1,0 75

Сульфахлорпиридазин (СХП) 2,6 28

Сульфатиазол (СТЗ) 10,2 7

Сульфаметизол (СМТ) —/ К Ь СН3 12,4 6

Сульфадиазин (СДЗ) 16,5 4

Сульфаметазин (СМЗ) -О ^СНз 17,0 4

Сульфаметоксазол (СМК) СНз ""V0 55 1

Сульфадиметоксин (СДМ) ОСНз N м ОСН3 121 <1

Сульфахиноксалин (СХК) 94 <1

Антисыворотка высоко специфична по отношению к сульфаниламиду, сульфагуанидину, сульфаметоксипиридазину и сульфахлорпиридазину Средние значения кросс-реактивности были получены для сульфатиазола, сульфаметизола, сульфаметазина и сульфадиазина Остальные изученные сульфонамиды дают слабое связывание (<1%) Очень низкое значение кросс-реактивности получено для сульфахиноксалина, в структуру которого входят два сопряженных бензольных кольца Наиболее близкие по структуре соединения - сульфаниламид и сульфагуанидин распознаются антителами с кросс-реактивностью 100 и 96%, соответственно

Определение сульфонамидов в различных объектах Вариант поляризационного флуоресцентного иммуноанализа сульфаметазина был опробован при определении его содержания в речной воде (р Воронеж, г Липецк) и в таблетках сульфаметазина (производства ФГУП «Мосхимфармпрепараты» им Н А. Семашко, 0,5 г) Концентрацию сульфаметазина в определяемых образцах рассчитывали согласно уравнению шР = ((112.5-34,613)/(ЬС/0,8827)°'568б)+34,613 (уравнение градуировочной зависимости для определения СМЗ) в пределах линейной зависимости

Известно, что результаты определения зачастую зависят от пробоподготовки образцов, поэтому при определении сульфаметазина в таблетках рассмотрены и сопоставлены методики пробоподготовки с использованием метанола, ацетонитрила, гидроксида калия и хлороводородной кислоты в качестве растворителей Результаты определений, наиболее близкие к фармакопейной прописи содержания сульфаметазина, наблюдаются при использовании ацетонитрила и 0,1 М НС1 (табл 6)

Таблица 6.

Результаты определения сульфаметазина в таблетках, (п = 3, Р = 0,95)

Растворитель Разведени е порошка таблеток Значение поляризации флуоресценции шР Рассчитано, мкг/мл Найдено мкг/мл Открыт ие, %

метанол 91,4±4,5 0,15*0,06 71

ацетонитрил 1-100000 86,1 ±4,8 0,21 0,20±0,04 95

HCl (0,1М) 88,3±4,0 0,22±0,08 104

КОН (0,1М) - - -

метанол 74.4±3,1 0,84±0,20 78

ацетонитрил 1 20000 71,8±1,3 1,1 1,03±0,11 94

HCl (0,1М) 70,8±3,3 1,14±0,30 104

КОН (0,1М) 61,7±2,7 2,67±0,62 243

метанол 65,7±4,3 1,81±0,59 86

ацетонитрил 1 10000 64,0±2,6 2,1 2,14±0,38 102

HCl (0,1М) 64,4^3,1 2,05±0,52 98

KOH(O.IM) 50,2±3,7 10,1±3,9 481

В речной воде не было обнаружено сульфаметазина, что было подтверждено методом «Введено-найдено» (табл 7)

Таблица 7.

Результаты определения сульфаметазина в речной воде, (п = 3, Р = 0,95)

Концентрация СМЗ, мкг/мл

0,25

0,5

10

Значение поляризации флуоресценции

(тР)

104±3 7Ь4 72±1 6б±3 47±1 43±2

Найдено, мкг/мл

0

0,26±0,11 0,51=0,07 1,0±0,3 10,5±1,4 19,4±5,2

97

Возможность применения антисыворотки против К-сульфанил-4-аминобутановой кислоты для иммуноанализа сульфонамидов в реальных объектах

показана на примере определения сульфаниламида в искусственно приготовленных образцах на основе молока (1,5%, производитель - Очаковский молочный комбинат, г Москва)

Разработаны и сопоставлены методики пробоподготовки молока, которые включают разбавление боратным буфером, преципитацию с помощью щавелевой и трихлоруксусной кислот Были выбраны те способы пробоподготовки, при которых влияние матрицы было минимально разбавление цельного молока, преципитация с помощью щавелевой кислоты с дальнейшим разбавлением надосадочной жидкости после центрифугирования боратным буфером до концентрации кислоты 0,1% Градуировочные зависимости, построенные для определения сульфаниламида на фоне матриц после пробоподготовки, представлены на рис 4

Рис. 4. Зависимости

i__, буфер поляризации флуоресценции,

* • молоко (1 100) - , с •

- измеренной на фоне буфепа,

- т надосадочная жидкость г J т *

» (0,1% v/v щавелевой кислоты) разбавленного молока и

надосадочной жидкости после

преципитации белков молока

с помощью щавелевой

кислоты, от концентрация

сульфаниламида

1,0

0 8

о

Q. Q.

Е

04

0 0 01 01 1 10 100 С (САМ), мкг/мл

Аналитические характеристики некоторых зависимостей представлены в табл 8

Таблица 8.

Аналитические характеристики зависимостей поляризации флуоресценции 01 концентрации сульфаниламида на фоне матрицы

Матрица Разбавление/Содержание осадите ля 1С50, мкг/мл ПрО, мкг/мл Линейный интервал, мкг/мл

вода - 0,7 0,03 0,1-4,1

молоко 1 100 0,9 0,15 0,2-5,0

надосадочная жидкость 0,1% щавелевой кислоты 0,7 0,08 0,1-3,3

0,25% трихлоруксусной кислоты 1,0 0,22 0,2-4,0

выводы

1) Разработаны конкурентный и неконкурентный варианты электроиммуноанализа для определения РНКаз на примере панкреатической РНКазы (барназы) и РНКазы Bacillus mtermedius (биназы) с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров В неконкурентном варианте Сн составила 1,2 и 3,1 мкг/мл, для панкреатической РНКазы и РНКазы Bacillus imermedius, соответственно, в конкурентном иммуноанализе РНКазы А -21 нг/мл Предложена модель амперометрического иммуносенсора для определения низкомолекулярного лекарственного соединения сульфаметазина Сн составляет 5,3 нг/мл Рабочие условия проведения иммуноанализа pH трис буфера 7 8, потенциал окисления продукта ферментативной реакции - 500 мВ, концентрация субстрата БТХИ - 1 мМ, разведение антител для иммобилизации -1 50 и 15 в неконкурентном и конкурентном иммуноанализе РНКазы, соответственно

2) Получены конъюгаты ХЭ-РНКаза, СМЗ-БСА, антитела-ХЭ Молярное соотношение компонентов в конъюгатах ХЭ РНКаза и СМЗ-БСА составляет 1 5 и 1 21 Удельная каталитическая активность ХЭ в конъюгатах с РНКазой и антителами против СМЗ - 0.028 и 0 68 мМ/мгхмин Синтезированы конъюгаты сульфонамидов с флуоресцентными метками с молярным соотношением компонентов 1 1

3) Разработаны новые варианты конкурентного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкомолекулярных лекарственных соединений сульфонамидного ряда (сульфаметазина, сульфадиазина, сучьфаниламида) Сн сульфаметазина при использовании смеси поликлональных антител - 6 нг/мл, сульфадиазина с помощью гомологичных антител с индивидуальной специфичностью - 0,2, 0,9 и 51 нг/мл при использовании трейсеров СДЗ-ДТАФ, СМЗ-ДТАФ и СДЗ-ФИТС, и с помощью гетерологичных антител с индивидуальной специфичностью - 2,1 и 4 нг/мл при использовании трейсеров СДЗ-ДТАФ и СМЗ-ДТАФ, соответственно С„ сульфаниламида с антителами против САБ - 0,03 мкг/мл

4) ПФИА сульфадиазина с использованием гомологичного трейсера СДЗ-ДТАФ и антител против СДЗ оказался наилучшим титр антител - 1 13000, концентрация трейсера - 3,4 нМ Оптимальные характеристики иммуноанализа (титр антител, значения 1С5о, с„) с использованием антител против САБ были получены при использовании антител против гаптена, конъюгированного с СИТ после третьего цикла иммунизации Рабочие условия проведения иммуноанализа с

использованием антисыворотки САБ-СИТ концентрация трейсера САБ-ЭДФ -О 26 нМ, титр антител - 1 600

5) Установлено, что антитела полученные на индивидуальную И-группу сульфонамида, высокоселективны по отношению к сульфонамиду, который применяли для иммунизации Кросс-реактивность антител против сульфадиазина по отношению к соединениям сульфонамидного ряда для большинства сульфонамидов составляет <0,1%, для сульфамеразина - 4 8% Смесь поликлональных антител, полученная на индивидуальные фрагменты семи конъюгированных с белком сульфонамидов, обладает наибольшим сродством к сульфатиазолу (СТЗ) сульфаметоксазолу, сульфамеразину Антисыворотка чувствительна к СТЗ независимо от структуры исследованных трейсеров, и может применяться для определения сульфатиазола с чувствительностью до 1 нг/мл Антитела против синтетического гаптена К-сульфанил-4-аминобутановой кислоты показывают принципиально новую кросс-реактивность по отношению к сульфаниламиду, сульфагуанидину, сульфаметоксипиридазину и сульфахлорпиридазину ее значения составляют 100, 96, 75 и 28%, соответственно

6) Предложены методики иммунохимического определения РНКазы А и сульфонамидных препаратов в лекарственных формах, сыворотке крови пищевых продуктах (молоко), природной воде Проценты открытия - 97-105 % При определении сульфаметазина в таблетках в качестве растворителей предпочтительнее испочъзовать ацетонитрил и 0.1 М НС1 Наименьшие значения ГС50 (0,9 и 0,7 мкг/мл) при определении сульфаниламида в молоке получены при использовании разбавленного молока и надосадочной жидкости после преципитации с помощью щавелевой кислоты Относительное стандартное отклонение не больше 0,05

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1 Муртазина Н Р Иммунохимическое определение сульфаниламидных антибиотиков с электрохимической детекцией / Н Р Муртазина, И И Галкина, Э П Медянцева, Г К Будников // Тез докл IV Всерос конф «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» - Саратов, 2003 -С 178

2 Муртазина Н Р Определение сульфадиазина с помощью иммунохимических методов анализа / Н Р Муртазина, Э П Медянцева, С А Еремин, Г К Будников // Тез докл XVII Менделеевского съезда по общей и

' прикладной химии - Казань, 2003 - С 280

3 Муртазина Н Р Амперометрический иммуноферментный сенсор в анализе сульфаниламидных антибиотиков / Н Р Муртазина, Э П Медянцева, Г К

Будников // Тез докл V Всерос конф по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003>* с международным участием - СПб , 2003 - С 328

4 Murtazina X R Sulfamethazine - bovine serum albumin immunoconjugate used for competitive electrochemical immunoassay / N R Murtazina, E P Medyantseva, S A Eremin, H К Budmkov // Abstract of VIIth International Conference on Agri-Food Antibodies - Uppsala, 2003 - P 97

5 Муртазина H P Иммунохимическое определение рибонуклеазы с амперометрическим детектированием / Н Р Муртазина, И И Галкина, ЭII Медянцева, Г К Будников // Тез докл Всерос конф . посвященной 100-летию со дня рождения академика И П Алимарина «Аналитика России» - М , 2004 - С 214-215

6 Муртазина Н Р Определение лекарственных препаратов с помощью поляризационного флуоресцентного иммуноанализа / HP Муртазина, И С Нестеренко, С А Еремин // Тез докл Всерос конф, посвященной 100-летию со дня рождения академика И П Алимарина «Аналитика России» - М , 2004 - С 197-198

7 Murtazina N R Polarization fluoroimmunoassay for sulfadiazine using a high specificity antibody / N R Murtazina, S A Eremin, О V Mozoleva, S J Everest, A J Brown, R Jackman//Intern J Food Sci Tech -2004 -V 39, № 8 -P 879-891

8 Муртазина H P Амперометрический иммуносенсор для конкурентного определения сульфаметазина / Н Р Муртазина, Э П Медянцева, Г К Будников // Сенсор -2004 -№3 - С 21-29

Отпечатано в ООО «Печатный двор» Казань, уч Журналистов 1/16, оф 207 Тел V-74-59, 41-76-41 41-76-51 Лицензия ПД№7-0215 от 01 11 01 Выдана Поволжским межрегиона iьным территориальны м управ iение м МПТР РФ Подписано в печать 15 11 2004 г Усч п ч 1 56 Заказ № К-2229 Тираж 100 зкз Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать -ризография

»2 718*

РНБ Русский фонд

2006-4 792

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Иммунохимические методы определения физиологически активных соединений

1.1. Особенности определения высокомолекулярных и низкомолекулярных антигенов

1.2. Методы иммуноанализа некоторых высокомолекулярных соединений

1.2.1. Методы иммуноанализа, основанные на преципитации и агглютинации белков

1.2.2. Иммуноферментное определение белков

1.2.3. Электрохимические методы определения высокомолекулярных соединений с использованием иммунологических взаимодействий

1.2.4. Современные варианты био- и иммуносенсоров для определения белков

1.3. Методы иммуноанализа некоторых низкомолекулярных соединений

1.3.1. Особенности определения пестицидов, лекарственных и наркотических препаратов

1.3.2. Метод поляризации флуоресценции для определения низкомолекулярных соединений

1.4. Некоторые аспекты определения отдельных лекарственных соединений

1.4.1. Свойства рибонуклеаз и методы их определения

1.4.1.1. Рибонуклеазы и их свойства

1.4.1.2. Методы определения рибонуклеаз

1.4.2. Свойства сульфаниламидных соединений и методы определения сульфонамидов

1.4.2.1. Действие и метаболизм сульфонамидов в организме

1.4.2.2. Методы определения сульфонамидов

1.4.3 Специфичность иммуноанализа

1.4.3.1 Группоспецифичный иммуноанализ сульфонамидных препаратов

ГЛАВА 2 Постановка задачи, приборы, реактивы, объекты исследования и условия эксперимента

2.1. Постановка задачи

2.2. Материалы и оборудование

2.3. Условия и методика эксперимента

2.3.1. Синтез иммуногенов, конъюгатов, определение их состава

2.3.2. Проведение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа: синтез трейсеров, тестирование поликлональных антисывороток

2.3.3. Определение аналитических характеристик

ГЛАВА 3 Иммунохимическое определение рибонуклеаз

3.1. Выбор условий регистрации токов на планарных платиновых электродах

3.2. Неконкурентный иммуноанализ РНКаз с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора

3.2.1. Иммобилизация биореагентов на поверхности платиновых электродов

3.2.2. Условия функционирования иммуноферментного сенсора

3.2.3. Оценка возможности применения ИФС для определения рибонуклеаз

3.2.3.1. Разработка способа определения рибонуклеазы А

3.2.3.2. Определение рибонуклеазы Bacillus intermedins

3.3. Конкурентный иммуноанализ рибонуклеазы А с использованием ферментной метки

3.3.1. Синтез конъюгата РНКаза-ХЭ и определение его состава

3.3.2. Определение удельной активности ХЭ в конъюгате с РЖазой з.з.з.

3.4.1.

3.4.2.

ГЛАВА

ГЛАВА

5.1.1.

5.1.2. 5.2.

5.2.1.

5.2.2.

5.2.3. 5.3.

5.3.1.

Проведение конкурентного иммуноанализа РНКазы

Аналитические возможности определения РНКазы в некоторых объектах

Определение РНКазы в лекарственных формах

Определение РНКазы в сыворотке крови

Иммуноферментный анализ сульфаметазина с помощью амперометрического иммуносенсора

Получение и характеристика конъюгатов гаптен-белок и антитела-фермент

Определение сульфаметазина в формате конкурентного иммуноанализа

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ сульфонамидов

Определение индивидуальных сульфонамидов на примере сульфаметазина с помощью антисыворотки, специфичной к группе нескольких сульфонамидов

Выбор условий проведения ПФИА

Специфичность иммуноанализа

Определение отдельных сульфонамидов на примере сульфадиазина с помощью антисыворотки с индивидуальной специфичностью

Выбор условий определения сульфадиазина: структура трейсеров и их связывание с антителами

Использование гомологичных и гетерологичных трейсеров в различных вариантах иммуноанализа

Специфичность антисыворотки против сульфадиазина

Аналитические возможности определения сульфонамидов с помощью антител, специфических к группе структурно подобных соединений

Применение антител, полученных на синтетический аналог сульфонамидов - 1Ч-сульфанил-4-аминобутановую кислоту

5.3.1.1. Сравнение подходов в дизайне гаптенов для получения иммуногенов

5.3.1.2. Выбор антисывороток в зависимости от природы белка иммуногена и количества циклов иммунизации для иммуноанализа

5.3.1.3. Оценка специфичности антител

5.3.2. Применение смеси поликлональных антител: аналитические характеристики и специфичность

5.4. Определение сульфонамидов в объектах

5.4.1. Определение сульфаметазина в таблетках и природной воде

5.4.2. Определение сульфаниламида в молоке 138 ВЫВОДЫ 141 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг - антиген Ат - антитело

БСА - бычий сывороточный альбумин БС-РНКаза - рибонуклеаза семени быка БТХИ - бутирилтиохолин иодид

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГА - глутаровый альдегид ГГ - градуировочный график ГС - N-гидроксисукцинимид ДМФА - диметилформамид

ДТАФ - 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин

ДЦК - дициклогексилкарбодиимид

ЖХ - жидкостная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФС - иммуноферментный сенсор

ИХА - иммунохимический анализ

ИХЭ - иммобилизованная холинэстераза

КР - кросс-реактивность антител

МАт - моноклональные антитела

ОВА - овальбумин

ПДК - предельно допустимая концентрация ПАт - поликлональные антитела ПрО - предел определения

ПФИА - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

РНК аза - рибонуклеаза

РНК аза А - панкреатическая рибонуклеаза сн - нижняя граница определяемых концентраций

САБ - М-сульфанил-4-аминобутановая кислота

САМ - сульфаниламид

СГД - сульфагуанидин

СДЗ - сульфадиазин

С ДМ - сульфадиметоксин

СМЗ - сульфаметазин

СМК - сульфаметоксазол

С МП - сульфаметоксипиридазин

СМР - сульфамеразин

СМТ - сульфаметизол

СТЗ - сульфатиазол

СИТ - соевый ингибитор трипсина

СХК - сульфахиноксалин

СХП - сульфахлорпиридазин

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФИТС - флуоресцеин-5-изотиоцианат

ХЭ - холинэстераза

ЭДК - 1-этил-3(3-диэтиламинопропил)карбодиимид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат

ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) - твердофазный иммуноферментный анализ

1С5о - концентрация анализируемого вещества, вызывающая 50 % ингибирование сигнала

Ig G - иммуноглобулин G

Разработка экспрессных, точных и чувствительных вариантов определения физиологически активных соединений - одна из актуальных задач современной аналитической химии. Исследования в этой области стимулируются потребностями медицины, пищевой промышленности, ветеринарии, необходимостью мониторинга окружающей среды. Особый интерес для этих целей представляют биохимические методы, которые в последние годы получают все большее распространение. Среди них, доминирующее положение занимает иммуноанализ, как наиболее подходящий для эффективного, экспрессного и недорогого определения большого количества образцов. Интерес к иммунохимическим методам анализа связан еще и с возможностью относительно простого варьирования селективности определений по отношению к ряду соединений, в основном за счет использования антител с различной специфичностью. Несмотря на существующие варианты иммуноанализа, разнообразие объектов исследования, усложнение аналитических задач требуют дальнейшего усовершенствования подходов к разработке вариантов анализа и схем иммунохимических методов.

Определение высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений представляет как практический, так и теоретический интерес для изучения их свойств, содержания в сыворотке крови и других матриксах, влияния на организм человека и животных, фармакокинетики, структуры синтезированных соединений и биохимических реакций с их участием. Лекарственные соединения, как и многие физиологически активные вещества, способны оказывать положительное или отрицательное воздействие на организм в зависимости от дозы и длительности воздействия. Кроме того, в связи с широким применением высокоэффективных лекарств в других областях жизнедеятельности (например, в сельском хозяйстве) в воде и пищевых продуктах могут содержаться остатки этих препаратов, в количествах, превышающих безопасный уровень. В связи с требованиями повышения качества жизни и увеличением поступлений фальсифицированной продукции на фармацевтический рынок, в последнее время необходимы разнообразные варианты количественного определения широкого круга лекарств, включающих высоко- и низкомолекулярные соединения, для оценки их качества, а также для определения их содержания в организме человека и животных.

Направленность разрабатываемых иммунохимических методов на решение конкретных практических задач обуславливает смещение иммунохимических исследований больше в сторону оптимизации уже существующих методов иммуноанализа. Такая оптимизация включает поиск новых иммунореагентов, способов иммобилизации, условий и схем проведения иммуноанализа, возможность миниатюризации технологии и автоматизации процесса измерения аналитического сигнала, в сочетании с относительной простотой работы, высокой чувствительностью и селективностью определений. Исследования, проводимые в настоящее время, включают разработки в области мультианализа, когда анализируют содержание не только индивидуального соединения, но группу соединений, обладающих родственными структурными особенностями, либо принципиально различные по структуре. Весьма перспективными в этом отношении являются био- и иммуносенсоры, обладающие преимуществом on-site тестирования, а также иммунохимические методы, позволяющие анализировать большое количество образцов в день (иммуноферментный анализ, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ). Выбор того или иного метода зависит от конкретной задачи, стоящей перед исследователем.

Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов иммуноанализа высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм высокомолекулярного белка рибонуклеазы (панкреатической и микробной рибонуклеазы) и низкомолекулярных антимикробных препаратов сульфаниламидного класса, выборе параметров аналитических систем для определения, как индивидуальных соединений, так и группы родственных соединений, с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, а также поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Научная новизна работы. Разработаны варианты конкурентного и неконкурентного элекгроиммуноанализа высокомолекулярных соединений - двух форм рибонуклеаз (барназы и биназы) и низкомолекулярного лекарственного соединения сульфаметазина, основанные на использовании амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, и варианты конкурентного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкомолекулярных лекарственных соединений сульфонамидного ряда (сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаниламида). Впервые синтезированы конъюгаты панкреатической рибонуклеазы и бутирилхолинэстеразы, а также конъюгаты бычий сывороточный альбумин-сульфаметазин и антитела против сульфаметазина-холинэстераза. Показана возможность определения удельной активности фермента в полученных конъюгатах. Получены различные по структуре и составу конъюгаты соединений сульфонамидного ряда с производными флуоресцеина (трейсеры). Выявлено влияние структуры конъюгатов гаптенов на специфичность антител, оценена специфичность иммунореагентов по отношению к структурно подобным соединениям. Предложены наилучшие пары антитела-меченый антиген для наиболее чувствительного определения, как индивидуальных соединений, так и группы структурно родственных соединений.

Практическая значимость работы. Предложены варианты иммуноанализа для определения РНКазы А и сульфонамидных препаратов (сульфаметазина, сульфаниламида) в лекарственных формах, сыворотке крови, пищевых продуктах (молоко), природной воде. Разработаны методики пробоподготовки таблеток сульфаметазина с использованием метанола, ацетонитрила, гидроксида калия и хлороводородной кислоты, а также способы пробоподготовки молока с помощью щавелевой и трихлоруксусной кислот для определения содержания сульфаниламида.

На защиту выносятся:

• Новые варианты иммуноанализа высоко - и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм рибонуклеаз и сульфонамидных препаратов с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа;

• Получение иммунореагентов и их характеристика, определение молярного соотношения компонентов;

• Выбор условий функционирования иммуноаналитических систем и определение их аналитических характеристик;

•Параметры аналитических систем для определения индивидуальных соединений или группы родственных соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2003" с международным участием (Санкт-Петербург, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 2003); VIIth International Conference on Agri-Food Antibodies (Uppsala, 2003); Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И.П. Алимарина "Аналитика России" (Москва, 2004).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ. Из них 2 статьи в международном и отечественном рецензируемых научных журналах и 6 тезисов докладов на Всероссийских и международных конференциях. Одна статья принята к печати.

Научный консультант по вопросам электрохимии биологически активных соединений - д.х.н., профессор, академик MAHB1II, академик РАЕН Г.К. Будников, научный консультант по вопросам, связанным с методом поляризации флуоресценции - к.х.н., в.н.с. С.А. Еремин.

142 ВЫВОДЫ

1) Разработаны конкурентный и неконкурентный варианты электроиммуноанализа для определения РНКаз на примере панкреатической РНКазы (барназы) и РНКазы Bacillus intermedins (биназы) с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров. В неконкурентном варианте сн составила 1,2 и 3,1 мкг/мл, для панкреатической РНКазы и РНКазы Bacillus intermedins, соответственно, в конкурентном иммуноанализе РНКазы А -21 нг/мл. Предложена модель амперометрического иммуносенсора для определения низкомолекулярного лекарственного соединения сульфаметазина. Сн составляет 5,3 нг/мл. Рабочие условия проведения иммуноанализа: рН трис буфера 7,8; потенциал окисления продукта ферментативной реакции - 500 мВ; концентрация субстрата БТХИ - 1 мМ; разведение антител для иммобилизации -1:50 и 1:5 - в неконкурентном и конкурентном иммуноанализе РНКазы, соответственно.

2) Получены конъюгаты ХЭ-РНКаза, СМЗ-БСА, антитела-ХЭ. Молярное соотношение компонентов в конъюгатах ХЭ: РНКаза и СМЗ-БСА составляет 1:5 и 1:21. Удельная каталитическая активность ХЭ в конъюгатах с РНКазой и антителами против СМЗ - 0,028 и 0,68 мМ/мгхмин. Синтезированы конъюгаты сульфонамидов с флуоресцентными метками с молярным соотношением компонентов 1:1.

3) Разработаны новые варианты конкурентного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкомолекулярных лекарственных соединений сульфонамидного ряда (сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаниламида). Сн сульфаметазина при использовании смеси поликлональных антител - 6 нг/мл; сульфадиазина с помощью гомологичных антител с индивидуальной специфичностью - 0,2, 0,9 и 51 нг/мл при использовании трейсеров СДЗ-ДТАФ, СМЗ-ДТАФ и СДЗ-ФИТС, с помощью гетерологичных антител с индивидуальной специфичностью - 2,1 и 4 нг/мл при использовании трейсеров СДЗ-ДТАФ и СМЗ-ДТАФ, соответственно. С„ сульфаниламида с антителами против САБ - 0,03 мкг/мл.

4) ПФИА сульфадиазина с использованием гомологичного трейсера СДЗ-ДТАФ и антител против СДЗ оказался наилучшим: титр антител - 1:13000, концентрация трейсера - 3,4 нМ. Оптимальные характеристики иммуноанализа сульфаниламида (титр антител, значения 1С50, сн) были получены при использовании антител против САБ, конъюгированного с СИТ после третьего цикла иммунизации. Рабочие условия проведения иммуноанализа с использованием антисыворотки САБ-СИТ: концентрация трейсера САБ-ЭДФ 0,26 нМ; титр антител - 1:600.

5) Установлено, что антитела, полученные на индивидуальную R-rpynny сульфонамида, высокоселективны к сульфонамиду, который применяли для иммунизации. Кросс-реактивность антител против сульфадиазина по отношению к соединениям сульфонамидного ряда для большинства сульфонамидов составляет <0,1%, для сульфамеразина - 4,8%. Смесь поликлональных антител, полученная на индивидуальные фрагменты семи конъюгированных с белком сульфонамидов, обладает наибольшим сродством к сульфатиазолу (СТЗ), сульфаметоксазолу, сульфамеразину. Антисыворотка чувствительна к СТЗ независимо от структуры исследованных трейсеров, и может применяться для определения сульфатиазола с чувствительностью до 1 нг/мл. Антитела против синтетического гаптена N-сульфанил-4-аминобутановой кислоты показывают принципиально новую кросс-реактивность: по отношению к сульфаниламиду, сульфагуанидину, сульфаметоксипиридазину и сульфахлорпиридазину ее значения составляют 100, 96, 75 и 28%, соответственно.

6) Предложены методики иммунохимического определения РНКазы А и сульфонамидных препаратов в лекарственных формах, сыворотке крови, пищевых продуктах (молоко), природной воде. Проценты открытия от 97 до 105 %. При определении сульфаметазина в таблетках в качестве растворителей предпочтительнее использовать ацетонитрил и ОД М НС1. Наименьшие значения IC50 (0,9 и 0,7 мкг/мл) при определении сульфаниламида в молоке получены при щ использовании разбавленного молока и надосадочной жидкости после преципитации с помощью щавелевой кислоты. Относительное стандартное отклонение не больше 0,05.

1. Giraudi G. A general method to perform a noncompetitive immunoassay for small molecules / G. Giraudi, L. Anfossi, I. Rosso, C. Baggiani, C. Giovannoli, C. Tozzi // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - P. 4697-4700.

2. Porstmann T. Enzyme immunoassay techniques in overview / T. Porstmann, S. T. Kiessig // J. Immunol. Methods. 1992. - V. 150, № 1-2. - P. 5-21.

3. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров и др.; отв. ред. М. М. Пенкина. М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

4. Kreuzer М. P. Alkaline phosphatase as a label for immunoassay using amperometric detection with a variety of substrates and an optimal buffer system / M. P. Kreuzer, С. K. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Anal. Chim. Acta. 1999. -V. 393, № 1-3.-P. 95-102.

5. Kricka L. J. Clinical applications of chemiluminescence / L. J. Kricka // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 500, № 1-2. - P. 279-286.

6. Franek M. Determination of sulfadimidine (sulfamethazine) residues in milk, plasma, urine and edible tissues by sensitive ELISA / M. Franek, V. Kolar, A. Deng, S. Crooks // Food Agric. Immunol. 1999. - V. 11. - P. 339-349.

7. Staimer N. Development of a sensitive enzyme immunoassay for the detection of phenyl-p-D-thioglucuronide in human urine / N. Staimer, S. J. Gee, B. D. Hammock // Fresen. J. Anal. Chem. 2001. - V. 369. - P. 273-279.

8. Valentini F. Electrochemical ELISA for the screening of DDT related compounds: analysis in waste water / F. Valentini, D. Compagnone, G. Giraudi, G. Palleschi // Anal. Chim. Acta. -2003. V. 487, №1.-P. 83-90.

9. Skladal P. Detection of pesticides in the environment using biosensors based on cholinesterases / P. Skladal, M. Fiala, J. Krejci // Int. J. Environ. Anal. Chem. -1996.-V. 65.-P. 139-148.

10. Skaladal P. Sensitive detection of pesticides using amperometric sensors based on cobalt phthalocyanine-modified composite electrodes and immobilized cholinesterases / P. Skaladal, M. Mascini // Biosens&Bioelectron. 1992. - V. 7, №5.-P. 335-343.

11. Skladal P. Detection of organophosphate and carbamate pesticides using disposable biosensors based on chemically modified electrodes and immobilized cholinesterase / P. Skladal // Anal. Chim. Acta. 1992. - V. 269. - P. 281-287.

12. Evtugyn G. A. Sensitivity and selectivity of electrochemical enzyme sensors for inhibitor determination / G. A. Evtugyn, H. C. Budnikov, E. B. Nikolskaya // Talanta. 1998. - V. 46, № 4. - P. 465-484.

13. Marty J-L. Biosensors: potential in pesticide detection / J-L. Marty, D. Garcia, R. Rouillon // Trends Anal. Chem. 1995. - V. 14. - P. 329-333.

14. Skladal P. Biosensors based on cholinesterase for detection of pesticides / P. Skladal // Food Technol. Biotechnol. 1996. - V. 34, № 1. - P.43-49.

15. Голиков С. H. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества / С. Н. Голиков, В. И. Розенгарт. JL: Медицина, 1964. - 382 с.

16. Suzuki С. Open sandwich enzyme- linked immunosorbent assay for the quantitation of small haptens / C. Suzuki, H. Ueda, W. Mahoney, T. Nagamune // Anal. Biochem. 2000. - V. 286, № 2. - P. 238-246.

17. Volland H. Recent developments for SPIE-IA, a new sandwich immunoassay format for very small molecules / H. Volland, P. Pradelles, F. Taran, L. Buscarlet, C. Creminon // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. - V. 34, № 4. - P. 737-752.

18. Choi M. J. Development of single reagent for fluorescence polarization immunoassay of atrazine / M. J. Choi, J. R. Lee, S. A. Eremin // Food Agric. Immunol. 2002. - V. 14, № 2. - P. 107-120.

19. Buscarlet L. Use of free radical chemistry in an immunometric assay for 176-estradiol / L. Buscarlet, H. Volland, J. Dupret-Carruel, M. Jolivet, J. Grassi, C. Сгёттоп, F. Taran, P. Pradelles // Clin. Chem. 2001. - V. 47. - P. 102-109.

20. Gonzales-Martinez M. A. On-line immunoanalysis for environmental pollutants: from batch assays to automated sensors / M. A. Gonzales-Martinez, R. Puchades, A. Maquieira // Trends Anal. Chem. 1999. - V. 18. - P. 204-218.

21. Hermanson G. T. Peptide antigens, antibodies and immunoglobulin binding proteins / G. T. Hermanson, A. K. P. Mallia, P. Smith // Immobilized Affinity Ligand Techniques. San Diego: Academic Press, 1992. - P. 210-251.

22. Lu B. Oriented immobilization of antibodies and its application in immunoassay and immunosensors / B. Lu, M. R. Smyth, R. O'Kenedy // Analyst. 1996. - V. 121.-P. 29R-39R.

23. Osipov A. P. Immunoenzyme sensors based on an immunosorbent flow-injection technique with enhanced chemiluminescence detection of a peroxidase label in a kinetic regime / A. P. Osipov, В. B. Kim, A. M. Egorov // Adv. Biosens. 1995. -V. 3.-P. 127-142.

24. Gubitz G. Flow-injection immunoassays / G. Gubitz, S. Shellum // Anal. Chim. Acta. 1993. -V. 263. - P. 421-428.

25. Ghindilis A. L. Immunosensors: electrochemical sensing and other engineering approaches / A. L. Ghindilis, P. Atanasov, M. Wilkins, E. Wilkins // Biosens&Bioelectron. 1998. - V. 13, № 1. - P. 113-131.

26. Калмыкова E. H. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений / Е. Н.

27. Калмыкова, Т. Н. Ермолаева, С. А. Еремин // Веста. Моск. Ун-та.

28. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43, № 6. - С. 399-403.

29. Horacek J. Improved direct piezoelectric biosensors operating in liquid solution for the competitive label-free immunoassay of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid / J. Horacek, P. Skladal // Anal. Chim. Acta. 1997. - V. 347. - P. 43-50.

30. Cinader B. Methods of Immunology and Immunochemistry / B. Cinader. -Orlando, Florida, USA: Acad. Press, 1976. P. 313-375.

31. Жердев А. В. Иммуноанализ ферментов / А. В. Жердев, А. А. Резчиков, Б. Б. Дзантиев, А. М. Егоров // Журн. ВХО им. Д. И. Менделеева. 1989. - Т. 34, № 1.-С. 38-46.

32. Филипович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филипович. М.: Высш. шк., 1993.-138 с.

33. Eckfeldt J. Н. Diagnostic enzymes for pancreatic disease / J. H. Eckfeldt, M. D. Levitt // Clin. Lab. Med. 1989. - V. 9, № 4. - P. 731-734.

34. Cordoba J. Diurnal variation of serum alanine transaminase in chronic liver disease / J. Cordoba, K. O'Riordan, J. Dupuis // Hepatology. 1998. - V. 28, № 6. -P. 1724-1725.

35. Панченко H. И., Гусева H. P., Масленникова H. К. // Лаб. диагностика. -1993.-№4.-С. 37-41.

36. Sylven В. Lysosomal enzyme activity in the interstitial fluid of solid mouse tumour transplants / B. Sylven // Eur. J. Cancer. 1968. - V. 4. - P. 463-474.

37. Sylven B. Cellular detachment by purified lysosomal cathepsin В / B. Sylven // Eur. J. Cancer. 1968. - V. 4. - P. 559-562.

38. Poole A. R. Differences in secretion of the proteinase cathepsin В at the edges of human breast carcinomas and fibroadenomas / A. R. Poole, K. J. Tiltman, A. D. Recklies II Nature. 1978. - V. 273. - P. 545-547.

39. Keppler D. Secretion of cathepsin В and tumor invasion / D. Keppler, M. Abrahamson, B. Sordat // Biochem. Soc. Trans. 1994. - V. 22. - P. 43-49.

40. Pietras R. J. Lysosomal cathepsin B-like activity: mobilization in prereplicative and neoplastic epithelial cells / R. J. Pietras, С. M. Szego, J. A. Roberts, B. J. Seeler // J. Histochem. Cytochem. 1981. - V. 29. - P. 440-450.

41. Dickson R. В. A novel matrix- degrading protease in hormone-dependent breast cancer / R. B. Dickson, Y. E. Shi, M. D. Johnson // Biochem. Soc. Trans. 1994. - V. 22. - P. 49-52.

42. Brinck U. L- and M2-pyruvate kinase expression in renal cell carcinomas and their metastases / U. Brinck, E. Eigenbrodt, M. Oehmke, S. Mazurek, G. Fischer // Virch. Arch. 1994. - V. 424. - P. 177-185.

43. L3ftner D. Tumor type M2 pyruvate kinase expression in advanced breast cancer / D. L3ftner, J. Mesterharm, C. Akrivakis, R. Geppert, P. E. Petrides, K.-D. Wernecke, K. Possinger // Anticancer Res. 2000. - V. 20. - P. 5077-5082.

44. Hardt P. D. Tumor M2-pyruvate kinase: a promising tumor marker in the diagnosis of gastro-intestinal cancer / P. D. Hardt, В. K. Ngoumou, J. Kupp, H. Schnell-Kretschmer, H. U. Kloer // Anticancer Res. 2000. - V. 20. - P. 49654968.

45. Hoopmann M. Tumor M2 pyruvate kinase determination in breast cancer patients receiving trastuzumab therapy / M. Hoopmann, M. Warm, P. Mallmann, A. Thomas, U.-J. Gohring, T. SchOndorf// Cancer Lett. - 2002. - V. 187, № 1-2. -P. 223-228.

46. O'Brian, V. J. Vogel, S. E. Singletary, N. E. Ward // Cancer

47. Res. 1989. - V. 49. - P. 3215-3217.

48. Sakanoue Y. Protein kinase С activity as marker for colorectal cancer / Y.

49. Sakanoue, T. Hatada, M. Kisunoki, H. Yanagi, T. Yamamura, J. Utsunomiya // Int. J. Cancer. 1991. - V. 48. - P. 83-86.

50. Basu A. The potential of protein kinase С as a target for anticancer treatment / A. Basu // Pharm. Ther. 1993. - V. 59. - P. 257-280.

51. Wang Y. Two-site ELISA for the quantitative determination of fatty acid synthase / Y. Wang, F.P. Kuhajda, L.J. Sokoll, D.W. Chan // Clin. Chim. Acta. 2001. - V. 304, № 1-2.-P. 107-115.

52. Westin T. Evaluation of ornithine decarboxylase activity as a marker for tumor growth rate in malignant tumors / T. Westin, S. Edstrom, K. Lundholm, B.

53. Gustafsson // Amer. J. Surgery. 1991. - V. 162, № 4. - P. 288-293.

54. Yalow R. S. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man / R. S. Yalow, S.

55. A. Berson // J. Clin. Invest. 1960. - V. 39. - P. 1157-1175. бО.Кэбот E. Экспериментальная иммунохимия / E. Кэбот, M. Майер. - М.:

56. Медицина, 1968. 683 с. 61.Sheehan С. Clinical Immunology: principles and laboratory diagnosis / C.

57. Иммунохимия в клинической лабораторной практике / Под ред. А. М. Уорда, Дж. Т. Уичера. М.: Медицина, 1981. - 237 с.

58. Медянцева Э. П. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы и перспективы / Э. П. Медянцева, Е. В. Халдеева, Г. К. Будников // Журн. аналит. химии. 2001. - № 10. - С. 1015-1024.

59. Бонецкий П. О. Исследование иммуноглобулинов методом иммуноферментного анализа / П. О. Бонецкий; Ин-т иммунологии. М., 2003.-С. 243-249.

60. Punzi L. Clinical significance of cytokine determination in synovial fluid / L. Punzi, L. Calo, M. Plebani // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2002. - V. 39, № 1. - P. 63-88.

61. Grellner W. Quantitative analysis of proinflammatory cytokines (IL-lp, IL-6, TNF-a) in human skin wounds / W. Grellner, T. Georg, J. Wilske // Forensic Sci. Int. 2000. - V. 113, № 1-3. - P. 251-264.

62. Ярилин А. А. Моделирование элементов микроокружения тимуса in vitro. Взаимодействие между эпителиальными и лимфоидными клетками тимуса человека: природа сигналов / А. А. Ярилин. М.: Ин-т иммунологии, 2002. -С. 103-111.

63. Dequaire М. An electrochemical metalloimmunoassay based on a colloidal gold label / M. Dequaire, C. Degrand, B. Limoges // Anal. Chem. 2000. - V. 72, № 22.-P. 5521-5528.

64. Salmain M. A new application of bioorganometallics: the first simultaneous triple assay by the carbonylmetalloimmunoassay method / M. Salmain, A. Vessieres, A. Varenne, P. Brossier, G. Jaouen // J. Organometall. Chem. 1999. - V. 589, № 1. -P. 92-97.

65. Weber S. G. Homogeneous voltammetric immunoassay: a preliminary study / S. G. Weber, W. C. Purdy //Anal. Lett. 1979. - V. 12, № 1. - P. 1-9.

66. Gleria Di K. Homogeneous ferrocene-mediated amperometric immunoassay / K. Di Gleria, H. A. O. Hile, C. J. McNeil, M. J. Green // Anal. Chem. 1986. - V. 58.-P. 1203-1205.

67. Alam I. A. Voltammetric immunoassay of human albumin and goat antiserum to human albumin by nickel labeling / I. A. Alam, G. D.

68. Christian // Frezen. Z. Anal. Chem. 1985. - V. 320. - P. 281-284.

69. Alam I. A. Voltammetric detection of lead labelled albumin and of albumin antiserum by immunoassay /1. A. Alam, G. D. Christian // Anal. Lett. 1982. - V. 15 (B18).-P. 1449-1456.

70. Гейровский Я. Основы полярографии / Я. Гейровский, Я. Кута- М.: Мир, 1965.-559 с.

71. Кузнецов Б. А. Адсорбция и двойной электрический слой в электрохимии / Б. А. Кузнецов, Г. П. Шумакович. -М.: Наука, 1972. С. 227-234.

72. Лещинская И. Б. Нуклеазы бактерий / И. Б. Лещинская, В. П. Варламов, Б. М. Куриненко. Казань: Изд-во КГУ, 1991.-232 с.

73. Guo W. Study and application on polarographic catalytic wave of human serum albumin in the presence of KJ03 / W. Guo, Y. Yang, J. Song // Anal. Lett. 2000. -V. 33, №5.-P. 847-859.

74. Дыхал Ю.И. Неконкурентное иммунохимическое определение рибонуклеазы с использованием ионов переходных металлов и эффекта каталитического выделения водорода / Ю.И. Дыхал, Э.П. Медянцева, Н.Р. Муртазина, Г.Р.

75. Сафина, Г.К. Будников, Н.В. Калачева // Прикладная биохимия имикробиология. 2003. - Т. 39, № 6. - С. 630-636.

76. Dykhal Y. I. Use of metal ions for the estimation of the efficiency of antibody -antigen interactions / Y. I. Dykhal, E. P. Medyantseva, N. R. Murtazina, G. R. Safma, H. K. Budnikov, N. V. Kalacheva // J. Anal. Chem. 2001. - V. 56, № 2. -P. 1118-1123.

77. Иванов Д. Детекция поверхностного антигена вируса гепатита В с помощью оптического биосенсора / Д. Иванов, О. В. Гнеденко, В. А. Конев // Вопр. мед. химии. 2001. - Т. 47, № 4. - С. 419-425.

78. Sakai Н. Potentiometric immunoelectrode for immunoglobulin / H. Sakai, N. Kaneki, H. Нага, К. Ito // Anal. Chim. Acta. 1990. - V. 230, № 1-3. - P. 189194.

79. Mutlu S. An immunosensor: Immobilization of anti-HBs antibody on glow-discharage treated piezoelectric quartz crystal for HBs-AG detection / S. Mutlu, R. Saber, C. Kocum, E. Piskin // Anal. Lett. 1999. - V. 32, № 2. - P. 317-334.

80. Chu X. Polymer agglutination-based piezoelectric immunoassay for the determination of human serum albumin / X. Chu, G. L. Shen, F. Y. Xie, R. Q. Yu //Anal. Lett. 1997. - V. 30, № 10. - P. 1783-1796.

81. Шеллер Ф. Ферменты в электрохимических биосенсорах / Ф. Шеллер, Д. Киргштайн, Ф. Шуберт, Д. Прайффер, К. МкНейл // Электрохимия. 1993. -Т.29, № 12.-С. 1522-1527.

82. Sol6 S. Determination of toxic substances based on enzyme inhibition. Part I. Electrochemical biosensors for the determination of pesticides using batch procedures / S. Sote, A. Merko^, S. Alegret // Crit. Rev. Anal. Chem. 2003. - V. 33,№2.-P. 89-126.

83. Hennion M.-C. Strengths and limitations of immunoassaya for effective and efficient use for pesticide analysis in water sample: A review / M.-C. Hennion, D. Barcelo // Anal. Chim. Acta. 1998. - V. 362. - P. 3-34.

84. Uttley A. H. Hight-level vancomycin-resistant enterococci causing hospital infections / A. H. Uttley, R. C. George, J. Naidoo // Epidemiol. Infect. 1989. -V. 103.-P. 173-181.

85. Leclercq R. Transferable vancomycin and teicoplanin resistance in Enterococcus faecium / R. Leclercq, E. Derlot, M. Weber, J. Duval, P. Courvalin // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - V. 33. - P. 10-15.

86. Svojanovsky S. R. High sensitivity ELISA determination of taxol in various human biological fluids / S. R. Svojanovsky, K. L. Egodage, J. Wu, M. Slavik, G. S. Wilson // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. - V. 20, № 3. - P. 549-555.

87. Weber G. Polarization of fluorescence of macromolecules / G. Weber // Biochem. J. 1952.-V. 51.-P. 155-167.

88. Dandliker W. B. Fluorescence polarization immunoassay. Theory and experimental method / W. B. Dandliker, K. J. Kelly, J. Dandliker, J. Levin // Immunochem. 1973. - V. 10. - P. 219-227.

89. Spenser R. D. Design, construction and two applications for an automated flow-cell polarization fluorometer with digital read-out / R. D. Spenser, F. B. Toledo, B. T. Williams, N. L. Yoss // Clin. Chem. 1973. - V. 19. - P. 838-844.

90. Бекбергенов Б. M. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакинетики антибиотиков / Б. М. Бекбергенов, В. Г. Житников // Антибиотики и химиотер. 1988. - Т. 33, № 1.-С. 72-76.

91. Gutierrez М. С. Immunoassay methods based on fluorescence polarisation / M. C. Gutierrez, A. Gomez-Hens, D. Perez-Bendito // Talanta. 1989. - V. 36, № 12. -P. 1187-1201.

92. Лунская И. M. Разработка поляризационного флуороиммуноанализа 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты с использованием моноклональных антител / И. М. Лунская, С. А. Еремин, А. М. Егоров, В. Колар, М. Франек // Агрохимия. 1993. - Т. 2. - С. 113-118.

93. Sanchez F. G. Antibody production and development of a polarization fluoroimmunoassay for the herbicide triclopyr / F. G. Sanchez, A. N. Diaz, A. F. G. Diaz, J. Lovillo // Anal. Chim. Acta. 2001. - V. 439. - P. 131138.

94. Krasnova A. I. Polarization fluorescence immunoassay for the herbicide propanil / A. I. Krasnova, S. A. Eremin, M. Natangelo, S. Tavazzi, E. A. Benfenati // Anal. Lett. 2001. - V. 34, № 13. - P. 2285-2301.

95. Jolley M. E. Fluorescence polarization immunoassay for determination of therapeutic drug levels in human plasma / M. E. Jolley // J. Anal. Toxicol. 1981. -V. 5.-P. 236-240.

96. Adamzchyk M. Synthesis of 6b-(2'-aminoethyl)carboxamidomethyl.estradiol and preparation of estradiol probes / M. Adamzchyk, D. Donald, D. D. Jonson, R. E. Reddy // Bioconjug. Chem. 1998. - V. 9, № 3. - P. 403-408.

97. Adamzchyk M. Synthesis of conjugates for a barbiturate screening assay / M. Adamzchyk, J. Grote, J. Douglas, R. Dubler, C. Harrington // Bioconjug. Chem. -1997. V. 8, № 3. - P. 281-288.

98. Eremin S. A. Development of a polarization fluoroimmunoassay for sulfamethazine using an automated analyzer / S. A. Eremin, J. Landon, S. Smith, R. Jackman // Analyst. 1994. - V. 119. - P. 2723-2726.

99. Murtazina N.R. Polarization fluoroimmunoassay for sulfadiazine using a high specificity antibody / N.R. Murtazina, S.A. Eremin, O.V. Mozoleva, S.J. Everest, A.J. Brown, R. Jackman // Intern. J. Food Sci. Tech. 2004. - V. 39, № 8. - P. 879-891.

100. Kolosova A. Y. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for gentamicin in human blood serum / A. Y. Kolosova, A. N. Blintsov, J. V. Samsonova, A. M. Egorov // Fresen. J. Anal. Chem. 1998. - V. 361, № 3. - P. 329-330.

101. ПЗ.Вихоть H. E. Влияние экзогенных нуклеаз на течение латентной аденовирусной инфекции клеток миндалин человека / Н. Е. Вихоть // Цитология и генетика. 1973. - Т. 7, № 3. - С. 248-252.

102. Чижов Н. П. Противовирусное действие нуклеаз и гистонов // Вопр. Вирусологии / Н. П. Чижов. 1974. - № 6. - С. 647-652.

103. Bartholeyns J. Inhibition of tumor cell proliferation by dimerised ribonuclease / J. Bartholeyns, P. Baudhuin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 73, № 2. - P. 573-576.

104. Bartholeyns J. In vitro and in vivo antitumor effect of dimerized ribonuclease A / J. Bartholeyns, A. Zenebergh // Eur. J. Cancer. 1965. - V. 15, № 1. - P. 85-91.

105. Ngai P.H.K. A ribonuclease with antimicrobial, antimitogenic and antiproliferative activities from the edible mushroom Pleurotus sajor-caju / P.H.K. Ngai, T.B. Ng // Peptides. 2004. - V. 25, № 1. - P. 11-17.

106. Колпаков А. И. Биохимические аспекты стимулирующего действия экзогенных рибонуклеаз / А. И. Колпаков, Ф. Г. Куприянова // Ферменты микроорганизмов: IX конф. межвуз. проекта. Казань, 1991. - С. 149-152.

107. Бабак С. JI. Комбинированные препараты в лечении обструкгивных болезней легких / С. JI. Бабак // Русский мед. журнал. 2003. - Т. 11, № 4. -С. 180-182.

108. Манойлов С. Е. Биохимические основы злокачественного роста / С. Е. Манойлов- JL: Медицина, 1971. 229 с.

109. Matou£ek J. Ribonucleases and their antitumor activity / J. MatouS ek // Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology.-2001.-V. 129, №3.-P. 175-191.

110. Киселев С. M. Опухолевый ангиогенез / С. М. Киселев, С. В. Луценко, С. Е. Северин // Вопросы биол. мед. и фарм. химии. -2002, № 3. - С. 3-9.

111. Куриненко Б. М. Противоопухолевая активность рибонуклеаз / Б. М. Куриненко // Экспериментальная онкология. 1985. - Т. 7, № 2. - С. 3-8.

112. Laccetti P. Seminal ribonuclease inhibits tumor growth and reduces the metastatic potential of Lewis lung carcinoma / P. Laccetti, D. Spalletti-Cernia, D. Portella, P. De Corato, G. D'Alessio, G. Vecchio // Cancer Res. 1994. - V. 54. -P. 4253-4256.

113. Tarnowsky G. S. Comparison of antitumor activities of pancreatic ribonuclease and its cross-linked dimmer / G. S. Tarnowsky, R. L. Kassel, I. M. Mountain, P. Blackburn, G. Wilson, D. Wang // Cancer Res. 1976. - V. 36. - P. 4074-4078.

114. Иванченко О. Б. Генотоксические и антимутагенные эффекты рибонуклеазы Bacillus intermedius: Дис. канд. биол. наук / О. Б. Иванченко; Казан, гос. ун-т. Казань, 1993. - 203 с.

115. Wu H. Determination the role of the human Rnase HI in the pharmacology of DNA-like antisense drugs / H. Wu, W. F. Lima, H. Zhaug, A. Sun, S. T. Crooke // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279, № 1. - P. 189-196.

116. Лещинская И. Б. Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов / И. Б. Лещинская, Н. П. Балабан, М. Н. Капранова. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1980. - С. 53-60.

117. Youle R. J. Ribonucleases: structures and functions / R. J. Youle, G. D'Alessio. -NY: Acad. Press, 1997. P. 491-514.

118. Raspi G. Kallikren and kallikrein-like proteinases and determination by chromatographic and electrophotometric methods / G. Raspi // J. Chromatogr. -1996.-V. 684.-P. 265-287.

119. Abel R. L. Fluorescence assay for the binding of ribonuclease A to the ribonuclease inhibitor protein / R. L. Abel, M. C. Haigis, C. Park, R. T. Raines // Anal. Biochem. 2002. - V. 306, № 1. - P. 100-107.

120. New Technologies for Drug Discovery: Special edition of Panvera Corporation. -Wisconsin, USA. 1997. - P. 37-38.

121. Crook E. E. Spectrophometric assay of bovine pancreatic ribonuclease by the use of cytidine 21, 3'-cyclic phosphate / E. E. Crook, A. P. Mathias, B. R. Rabin // Biochem. J. 1960. - V. 74. - P. 234-238.

122. Greiner-Stoeffele T. A general ribonuclease assay using methylene blue / T. Greiner-Stoeffele, M. Grunow, U. Hahn // Anal. Biochem. 1996. - V. 240, № 1. -P. 24-28.

123. Медянцева Э. П. Определение рибонуклеазы с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора / Э. П. Медянцева, Е. В. Халдеева, Г. Р. Сафина, Г. К. Будников Н Завод, лаб. диагн. материалов. -2004. Т. 70, № 5. - С. 3-8.

124. Koditz J. PH-stat titration allows the continuous determination of ribonuclease A activity toward cytidine 21, 3'-cyclic phosphate at high substrate concentrations / J. Koditz, R. Ulbrich-Hofmann // Anal. Biochem. 2002. - V. 305. - P. 281-284.

125. Wang R. Rapid determination of ribonuclease and microanalysis of heparin with a SAW/conductance sensor / R. Wang, Q. Cai, W. Wei, L. Nie, S. Yao, C. Liu, T. Jiang // Talanta. 1977. - V. 44. - P. 641-617.

126. Foreman U. Stripping voltammetric determination of traces of peptides and proteins containing disulphide linkages / U. Foreman // Anal. Chim. Acta, 1985. -V. 166.-P. 141-151.

127. Shimoyama S. Angiogenin in sera as an independent prognostic factor in gastric cancer / S. Shimoyama, M. Kaminishi // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2003. - V. 129.-P. 239-244.

128. Wagner A. P. A simple spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity in biological fluids / A. P. Wagner, M. C. Iordachel, L. P. Wagner // J. Biochem. Biophys. Methods. 1983. - V. 8, № 4. - P. 291-297.

129. Korn K. Analysis of the RNase T1 mediated cleavage of an immobilized gapped heteroduplex via fluorescence correlation spectroscopy / K. Korn, S. Wennmalm, H.-H. Foerster, U. Hahn, R. Rigler // Biol. Chem. 2000. - V. 381. - P. 259-263.

130. Bravo J. A versatile negative-staining ribonuclease zymogram / J. Bravo, E. Fernandez, M. Rib6, R. de Llorens, С. M. Cuchillo // Anal. Biochem. 1994. - V. 219.-P. 82-86.

131. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии электронный ресурс.: Ш^руководства / Под ред. JI. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. Режим доступа: http://www.antibiotic.ru/ab, свободный.

132. Машковский М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский. М.: ООО «Новая волна», 2002. - Т. 2. - 608 с.

133. Commission of the European Communities. The rules governing medical products in the European Community IV, 1991.

134. U.S. Department of Agriculture. Compound Evaluation and Residue Information; Food Safety and Inspection Service, Science and Technology Evaluation Branch; U.S. GPO: Washington, DC. 1994. - P. 1-5.

135. McCaughey W. J. Residues in pigmeat / W. J. McCaughey, D. L. G. McEvoy, B. McCartan // The Pig J. 1997. - V. 39. - P. 105-114.

136. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия: в 2 ч. Ч. 2. Специальная фармацевтическая химия / В. Г. Беликов. Пятигорск, 1996. - С. 229-250.

137. Bogaerts R., Wolf F. // Fleischwirtschaff. 1980. - V. 60. - P. 672.

138. Buick R. K. A microtitre plate assay for the detection of antibiotics in porcine urine / R. K. Buick, N. M. Greer, С. T. Elliott // Analyst. 2000. - V. 125. - P. 395-396.

139. Molina M. Antimicrobial agent detection in ewes' milk by the microbial inhibitor test brilliant black reduction test-BRT AIM(R) / M. Molina, R. Althaus, A. Molina, N. Fernandez // J. Int. Dairy. 2003. - V. 10. - P. 821-826.

140. Jen J.-F. Simultaneous determination of seven sulfonamide residues in swine wastewater by high-performance liquid chromatography / J.-F. Jen, H.-L. Lee, B.-N. Lee // J. Chromatogr. A. 1998. - V. 793. - P. 378-382.

141. Kishida К. Matrix solid-phase dispersion extraction and hight performance liquid chromatographic determination of residual sulfonamides in chicken / K. Kishida, N. Furusawa // J. Chromatogr. A. 2001. - V. 937, № 1-2. -P. 49-55.

142. Zheng N., Li Y.-Z., Wen M. J. Sulfamethoxazole-imprinting polimer for sensitive determination of sulfamethoxazole in tablets / N. Zheng, Y.-Z. Li, M. J. Wen // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1033. - P. 179-182.

143. Haller M. Quantification of veterinary antibiotics (sulfonamides and trimethoprim) in animal manure by liquid chromatography-mass spectrometry / M. Haller, S. Muller, C. McArdell, A. Alder, M. Suter // J. Chromatogr. A. -2002.-V. 952.-P. 111-120.

144. Fuh M.-R. S. Quantitative determination of sulfonamide in meat by liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry / M.-R. S. Fuh, S.-An. Chan II Talanta. -2001. V. 55.-P. 1127-1139.

145. Pang G. Liquid chromatography-fluorescence detection for simultaneous analysis of sulfonamide residues in honey / G. Pang, Y. Cao, C. Fan, J. Zhang, X. Li, Z. Li, G. Jia // Food Addit. Contam. 2001. - V. 18, № 1. - P. 11-18.

146. Manedero M.C. Flow-injection analysis of pharmaceuticals / M. C. Manedero, J. J. Aaron // Anal. Chim. Acta. 1992. - V. 269, № 2. - P. 193-198.

147. Mahedero M. C. Photochemically induced fluorescence analysis of several sulfonamides / M. C. Manedero, J. J. Aaron // Analusis. 1992. - V. 20. - P. 5357.

148. Mahedero M.C. Determination of sulfamethoxazole by photochemically induced fluorescence in drug and milk / M.C. Mahedero, Galeano T. Diaz, Pascual S. Galan // Talanta. 2002. - V. 57. - P. 1-6.

149. Калмыкова E. H. Определение сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора / Е. Н. Калмыкова, Е. В. Мелихова, С. А. Еремин, Т. Н. Ермолаева // Антибиотики и химиотер. 2004. - Т. 49, № 1. -С. 8-13.

150. Bjurling P. Biosensor assay of sulfadiazine and sulfamethazine residue in pork / P. Bjurling, G. A. Baxter, M. Caselunghe, C. Jonson, M. O'Connor, B. Persson, C. T. Elliott // Analyst. 2000. - V.125. - P. 1771-1774.

151. Tschmelak J. Biosensor for seven sulphonamides in drinking, ground and surface water with difficult matrices / J. Tschmelak, M. Kumpf, G. Proll, G. Gauglitz // Anal. Lett. 2004. - V. 37, № 8. - P. 1701-1718.

152. Haasnoot W. Biosensor immunoassay for the detection of eight sulfonamides in chicken serum / W. Haasnoot, M. Bienenmann-Ploum, F. Kohen // Anal. Chim. Acta.-2003.-V. 483.-P. 171-180.

153. Мискиджьян С. П. Полярография лекарственных препаратов / С. П. Мискиджьян, JI. П. Кравченюк. Киев: Изд-во «Вища шк.», 1976. - 219 с.

154. Titus A. Voltammetric detection of sulfonamides at a poly(3-methylthiophene) electrode / A. Titus, J. Msagati, C. Ngila // Talanta. 2002. - V. 58. - P. 605-610.

155. You T. Determination of sulfadiazine and sulfamethoxazole by capillary electroforesis eith end-column electrochemical detection / T. You, X. Yang, E. Wang // Analyst. 1998. - V. 123. - P. 2357-2360.

156. Susan S. Т., Timothy J. S. // Anal. Lett. 1994. - V. 27. - P. 1507.

157. Numan A. Photochemical reactivity of sulfamethoxazole and other sulfa compounds with photodiode array detection / A. Numan, J. L. Villemure, К. K. Lockett, N. D. Danielson // Microchem. J. 2002. - V. 72, № 2. -P. 147-154.

158. Rao Т. N. Electroanalytical study of sulfa drugs at diamond electrodes and their determination by HPLC with amperometric detection / T. N. Rao, В. V. Sarada, D. A. Tryk, A. Fujishima // J. Electroanal. Chem. 2000. - V. 491, № 1-2.-P. 175-181.

159. Fleeker J. R. Drug residues in animal tissues. Enzyme immnoassay for screening sulfamethazine residues in swine blood / J. R. Fleeker, L. J. Lovett // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1985. - V. 68, № 2. - P. 172-174.

160. Singh P. Enzyme immunoassay for screening of sulfamethazine in swine / P. Singh, B. P. Ram, N. Sharkov // Agric. Food Chem. 1989. - V. 37. - P. 109-114.

161. Lee N. Immunochemical approaches to detection of sulfathiazole in animal tissues / N. Lee, C. Holtzapple, M. Muldon, S. Deshpande, L. Stanker // J. Food Agric. Immunol. 2001. - V. 13. - P. 5-7.

162. Sheth H. B. Enzyme immunoassay for screening of sulfathiazole in honey / H. B.

163. Crooks S. R. H. Immunobiosensor an alternative to enzyme immunoassay screening for residues of two sulfonamides in pigs / S. R. H. Crooks, G. A. Baxter, M. C. O'Connor, С. T. Elliott // Analyst. - 1998. - V. 123. -P. 2755-2757.

164. Fodey T.L. Comparison of porcine urine and bile as matrices, to screen for the residue of two sulfonamides using a semi-automated enzyme immunoassay / T.L. Fodey, S.R.H. Crooks, C.T. Elliott, W.J. McCaughey //Analyst. 1997. -V. 122. -P. 165-168.

165. Price C. P. Principles and Practice of Immunoassay / C. P. Price, D. J. Newman.- 2nd. ed. N. Y.: Grove's Dictionaries, 1997. - 667 p.

166. Marco M.-P. Immunochemical techniques for environmental analysis. Part II. Antibody obtention and immunoassay development / M.-P. Marco, S. Gee, B. D. Hammock // Trends Anal. Chem. 1995. - V. 14. - P. 415-425.

167. Hock B. Antibodies for immunosensors a review / B. Hock // Anal. Chim. Acta.1997. V. 347.-P. 177-186.

168. Tijssen P. Kinetic and nature of antibody-antigen interaction. In: Practice and theory of enzyme immunoassay / Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology // R. H. Burdon, P. H. Knippenberg (eds.). -Amsterdam, 1985.-V. 15.-P. 122-145.

169. Kauvar L.M. Toxic-chemical detection by pattern recognition / L.M. Kauvar // New-Frontiers in Agrochemical Immunoassay / D. A. Kurtz, J. H. Skerritt, L. Stanker (eds.). Arlington, VA: AOAC International, 1995.

170. Karu A. E. Use of multivariate statistical methods to identify immunochemical cross-reactants / A. E. Кати, Т. H. Lin, L. Breiman, M. T. Muldoon, J. Hsu // Food Agric. Immunol. 1994. - V. 6. -P. 371-384.

171. Muldoon M.T. Evaluation of ELISA for the multianalyte analysis of s-triazines in pesticide waste and rinsate / M.T. Muldoon, G.F. Fries, J.O. Nelson // J. Agric. Food. Chem. 1993. -V. 41. - P. 322-328.

172. Jones G. A procedure for the immunoanalysis of samples containing one or more members of a group of cross-reacting analytes / G. Jones, M. Wortberg, B. D. Hammock, D. M. Rocke // Anal. Chim. Acta. 1996. - V. 336. - P. 175-183.

173. Corbert D. L., Chliderstone M. Multiple Drugs of Abuse in Urine Detected with a Single Reagent and Fluorescence Polarization / D. L. Corbert, M. Chliderstone.

174. Spinks C. Molecular modeling of hapten structure and relevance to broad specificity immunoassay of sulphonamide antibiotics / C. Spinks, G. Wyatt, H. Lee, M. Morgan // Bioconjug. Chem. 1999. - V. 10. - P. 583-588.

175. Sheth H. Development of a single ELISA for the detection of sulfonamides / H. Sheth, P. Sporns // J. Agric. Food Chem. 1991. - V. 39. - P. 1696-1700.

176. Assil H. An ELISA for sulfonamide detection using affinity-purified polyclonal antibodies / H. Assil, H. Sheth, P. Sporns // J. Food Res. Int. 1992. - V. 25. - P. 343-353.

177. Haasnoot W. Monoclonal antibodies against a sulfathiazole derivative for immunochemical detection of sulfonamides / W. Haasnoot, J. Du Pre, G. Cazemier, A. Kemmers-Voncken, R. Verheijen // J. Food Agric. Immunol. 2000. -V. 12.-P. 127-138.

178. Spinks C. Atipical antibody specificity: Advancing the development of a generic assay for sulphonamides using heterologous ELISA / C. Spinks, G. Wyatt, S.

179. Everest, R. Jackman, M. Morgan // J. Sci. Food. Agric. 2002. - V.82. -P. 428-434.

180. Korpimaki T. Engineering of a broad specificity antibody for simultaneous detection of 13 sulfonamides at the maximum residue level / T. Korpimaki, E.-C. Brockmann, O. Kuronen, M. Saraste // J. Agric. Food Chem. 2004. - V. 52, № 1.-P. 40-47.

181. Nistor C. Competitive flow immunoassay with fluorescence detection for determination of 4-nitrophenol / C. Nistor, A. Oubina, M.-P. Marco, D. Barcel6, J. Emneus // Anal. Chim. Acta. 2001. - V. 426. - P. 185-195.

182. Porath J. Chemical coupling of protein to agarose / J. Porath, R. Axon, S. Emback // Nature. 1967. - V. 215. - P. 1401-1492.

183. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардт. М.: Мир, 1984. -Т.З. - С. 237-248.

184. Harlow Е. Antibodies: a laboratory manual / Е. Harlow, D. Lane. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. - 673 p.

185. Голиков С. H. Холинэстеразы и антихолинэстерахные вещества / С. Н. Голиков, В. И. Розенгарт. JL: Медицина, 1964. - 383 с.

186. Никольская Е. Б. Применение холинэстераз в аналитической химии / Е. Б. Никольская, Г. А. Евтюгин // Журн. аналит. химии. 1992. - Т. 46, № 8. - С. 1358-1377.

187. Справочник физико-химических величин / Н. М. Барон и др.. JL: Химия, 1983.-232 с.

188. Ruttkay-Nedecky G. Voltammetry of tobacco mosaic virus and its isolated protein at the graphite electrode / G. Ruttkay-Nedecky, V. Brabec // Gen. Phys. Biophys. 1985. - V. 4, № 4. - P. 393-410.

189. Bonnet C. Adsorption: an easy and efficient immobilisation of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes / C. Bonnet, S. Andreescu, J.-L. Marty // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 481, № 2. - P. 209-211.

190. Иммунологические методы исследований / Под. ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988. - 530 с.

191. Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование: Сб. науч. тр./ Под ред. Г. Д. Бердышева, Н. Е. Хурсина. Киев: Наук, думка, 1985. - 112 с.

192. Loewenthal R., Sancho J., Fersht A. R. // J. Mol. Biol. 1992. - V. 224. - P. 759-770.

193. Rector E. S. A method for the preparation of protein-protein conjugates of predetermined composition / E. S. Rector, R. J. Schwenk, K. S. Tse, A. H. Sehon // J. Immunol. Methods. 1978. - V. 24, № 3-4. - P. 321 -336.

194. Fasman G. D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology / G. D. Fasman. Florida, Boca Raton: CRC Press, 1989.

195. Sesay M. A. Monoclonal antibody conjugation via chemical modification электронный ресурс. // M. A. Sesay. BioPharm. International. - 2003. - № 1. - Режим доступа: http://www.biophann-mag.com/biopharm/article /articleDetail.jsp?id=80226, сводный.

196. Fahnrich К. A. Disposable amperometric immunosensor for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using screen-printed electrodes . K. A. Fahnrich, M. Pravda, G. G. Guilbault // Biosens&Bioelectron. 2003. - V. 18. -P. 73-82.

197. Haasnoot W. Immunochemical detection of aminoglycosides in milk and kidney . W. Haasnoot, P. Stouten, G. Cazemier, A. Lommen, J.F. Nouws, H.J. Keukens // Analyst. 1999. - V. 124. -P. 301-305.

198. Adamczyk M. Immunoassay reagents for thyroid testing. 1. Synthesis of thyroxine conjugates / M. Adamczyk, L. Fino, J. R. Fishpaugh, D.D. Johnson, P.G. Mattingly // Bioconjug. Chem. 1994. - V. 5. - P. 459-462.

199. Kalab T. A disposable amperometric immunosensor for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid / T. Kalab, P. Skladal // Anal. Chim. Acta. 1995. -V. 304.-P. 361-368.

200. Drabick J J. Covalent polymyxin В conjugate with human immunoglobulin G as an antiendotoxin reagent / J J. Drabick, A.K. Bhattachaijee,

201. D.L. Hoover, G.E. Siber, V.E. Morales, L.D. Young, S.L. Brown, A.S. Cross // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - V. 42. - P. 583-588.

202. Lundblad R.L. Chemical reagents for protein modification / R.L. Lundblad, C.M. Noyes. Florida, Boca Raton: CRC Press, 1984. - V. 2. - P. 105.

203. Pradelles P. Enzyme immunoassays of eicosanoids using acetylcholinesterase as label / P. Pradelles, J. Grassi, J. Maclouf // Anal. Chem. 1985. - V. 57. - P. 1170-1173

204. Creminon C. Enzyme immunometric assay for endothelin using tandem monoclonal antibodies / С. Сгёпипоп, Y. Frobert, A. Habib, J. Maclouf, C. Patrono, P. Pradelles, J. Gras // J. Immunol. Methods. 1993. - V. 162, № 2. - P. 179-192.

205. Etienne E. Enzyme immunometric assay of thyroliberin (TRH) / E. Etienne, C. Сгёттоп, J. Grassi, D. Grouselle, J. Roland, P. Pradelles // J. Immunol. Methods. 1996. - V. 198, № 1. - P. 79-85.

206. Chambers Н. F. Sulfonamides, trimethoprim, and quinolones / H. F. Chambers,

207. E. Jawetz; Ed. by B. Katzung // Basic Clin. Pharm. 1998. - P. 761-763.

208. Bagdon R. E. Experimental pharmacology and toxicology of sulfonamides / R. E. Bagdon // Exp. Chemother. 1964. - V. 2. - P. 249-306.

209. Wofsy С. В. Use of trimethoprim- sulfamethoxazole in the treatment of Pneumocystis carinii in patients with acquired immunodeficiency syndrome / C. B. Wofsy // Rev. Infect. Dis. 1987. - V. 9. - Suppl. 2. - P. 184-194.

210. Lindsay D. S., Blagburn B. L. Antiprotazoal drugs // Veterinary Pharmacology and Therapeutics / Ed., H.R. Adams. Ames, IA: Iowa State University Press, 1995.-P. 955-983.

211. Choi M. J. Development of single reagent for fluorescence polarization immunoassay of atrazine / M. J. Choi, J. R. Lee, S. A. Eremin // Food. Agric. Immunol. 2002. - V. 14, № 2. P. 107-120.

212. Jackman R. The use of a specific ELISA to monitor the persistence of penicillin G in milk following intra mammary antibiotic treatment / R. Jackman, S.J. Mitchell, S.D. Dyer, J. Chesham // Food Agric. Immunol. -1991. V. 3. - P. 1-12.

213. Cliquet, P. Generation of group-specific antibodies against sulfonamides / P. Cliquet, E. Cox, W. Haasnoot, E. Schacht, B.M. Gooddeeris // J. Agric. Food Chem. 2003. - V. 51. - P. 5835-5842.

214. Li J. S. Determination of sulfonamides in swine meat by immunoaffinity chromatography / J. S. Li, X. W. Li, J. X. Yuan, X. Wang // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 2000. - V. 83. - P. 830-836.

215. Haasnoot W. Sulphonamide antibodies: from specific polyclonals to generic monoclonals / W. Haasnoot, G. Cazemier, J. Du Pre, A. Kemmers-Voncken, M. Bienenmann-Ploum, R. Verheijen // Food Agric. Immunol. 2000. - V. 12, № 1. -P. 15-30.

216. Kaufinann A. Contamination of honey by the herbicide asulam and its antibacterial active metabolite sulfanilamide / A. Kaufmann, A. Kaenzig // Food Addit. Contam. 2004. - V. 21. - 564-571.