Структурные и функциональные аспекты многокомпонентной системы тироксинсвязывающих белков плазмы крови человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

и

3 о МАЙ

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.112+577.175.444+577.171.6+611.018.5.54

СВИРИДОВ Олег Васильевич

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

АСПЕКТЫ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ТИРОКСИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Минск 1994

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии паук Беларуси, г. Минск.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук А. И. МИРОШНИКОВ

Доктор химических паук, профессор Д. И. МЕТЕЛИЦА Доктор биологических наук А. И. ЗИНЧЕНКО

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова (Биологический факультет).

Защита диссертации состоится 30 июня 1994 г. в 10.00 часов на заседании Специализированного совета Д 006.22.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу: 220141, Минск, ул. Жодинская, 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси.

Диссертация разослана « . . . 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук

Н. М. Литвинко

-3-

Ис.юльзованные сокращения: ЛЖ - амниотическая жидкость

ЛНС - 8-анилин-1-нафталинсульфонат

АлоЛ-1 - аполипоиротеин А-1

АпоА-1-ЛВП - аиоА-1 в составе липопротеилных частиц

высокой плотности Белок 25К - белок с Иг-25000, идентифицированный как апоА-Г-ЛВП Белок 80/27К - белок с Мг субъединиц •80000 и 27000,

идентиФициованный как 1«м БОА и ЧСА - альбумины сывороток крови быка и человека С5 и С16 - 5- и 16-доксилстеариновые кислоты ЛВ1Ь - субфракция липопротеилных частиц высокой плотности

С ¿=1 ,125-1,210 Г/МЛ КД - круговой дихроизм

КонА - конканавалин А 1

Т> - .1,3' ,5-трийод-ь-тиронин

Т< - 3,3'5,5'-тетрайод-ь-тиронин; тироксин

Т«-N0- - тироксин, меченный нитроксильным радикалом

[' • ■ I]Т<(Т» > - тиреоидный гормон, меченный изотопом йод-125 ТСГ - тироксинсвязывающий глобулин

ТСГ-1 - структурный вариант ТСГ с особым строением

углеводного компонента, не взаимодействую™« с КонА ТСПА - тироксинсвяэыцающий преальбумин

УФ - ультрафиолетовая часть спектра

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ЭФ в ПЛАТ - электрофорез в полиакриламидном геле В..I - максимальная емкость связывания лиганда

с 1ч - первый компонент системы комплемента

0а-На - додецилсульфат натрия

1в - иммуноглобулин(и)

К. и К« - равновесные константы ассоциации и диссоциации

К| - равновесная константа конкурентного мнгибирования

«I - константа скорости ассоциации

к-1 - константа скорости диссоциации

М, - относительная молекулярная масса

/1 - время полужизни белка в кровообращении

или полудиссоциации гормон-белкового комплекса

Д&ТУадьцосхь„JipoÔJUîMUГормоны щитовидной железы тироксин (T«) и трийодтиронин <Т> > оказывают регуляторное действие на многие физиологические. процессы, составляющие основу нормального развития и функционирования организма. U русле крови более UUX общей массы тиреоидных гормонов присутствует в виде комплексов . с гормон -связывающими транспортными белками. Долгое время считалось, что плазма кропи человека содержит только три белка, взаимодействующих с тиреоидными гормонами: T«-связывающий глобулин (ТОГ), преальбумин (TCIIA, транстщкггин ) и альбумин (ЧСА).

И рамках гипотезы активных свободных гормонов, выдвинутой еще в . 50-х годах и недавно представленной в виде физиологически обоснованной математической модели, трем "классическим" транспортным белкам отводилась пассивная функция поддержания стационарного пула свободных T« и Ti за счет быстрого высвобождения йодтиронинов из комплексов в отпет на потребности организма.

II области исследований етероидсвязывающих белков плазмы па смену подставлениям, вытекающим из гипотезы свободных гормонов, пришла •зкспериментально обоснованная концепция о биологической активности комплексов стщюидних гормонов со специфическими глипощютеинами плазмы, способных взаимодействовать с мембранными («цепторами и осуществлять направленный транспорт глюкокортикоидов и половых сте1к>идов в компетентные клетки (O.A. (,"трельченок с соавг. , цикл работ 1983-1992 гг.). йти результаты инициировали развитие нового итнна химических и биомедицинских исследований и и области Î4-связывающих белков плазмы человека.

I) последнее время интенсивно проводится поиск ранее не идентифицированных T«-связывающих белков плазмы и изучаются генетические варианты-ТСГ', т1шнстиретина и ЧСА.

В многочисленных наблюдениях и системных исследованиях охарактеризованы приобретенные изменения в системе транспорта тиреоидных гормонов у человека, которые заключаются в появлении аномальных связывающих белков, аутоантител, относящихся к иммуноглобулинам Пк) (тзличних классов. U ходе работ по изучению "патологического" связывания горнонов щитовидной »слезы с аномальными белками били получены данные, косвенно указывающие на взаимодействие Т4 и Ti с нормальными lg человека.

-50 способности ■ липофильных молекул Т4 и Ti ассоциировать с липонротеидными частицами плазмы было известно давно, однако многие ил ранних работ страдали обнаруженными в современных публикациях методологическими недостатками и отдавали приоритет . линидному компоненту липопротсинов в связывании* йодтиронинов.

Исследования последних лет выявили активною роль некоторых транспортных белков и их клеточных рецепторов в механизмах взаимодействия тиреоидиых гормонов с компетентными тканями.

Изучение структурных аспектов функционирования Т«-связывающих белков плазмы важно для диагностики заболеваний человека и в перспективе для правильного применения этих белков в терапевтических целях, а также для использования современных фармакологических средств, которые могут влиять на комплексообразование тиреоидных гормонов с транспортными белками. Разработки иммунохимических систем для медицинского микроанализа общих и свободных тиреоидных гормонов и связывающих белков в сыворотке человека не могут проводиться без знания свойств этих биомолекул и взаимодействий между ними.

Цель и задачи исслеловяния■ В соответствии с актуальными вопросами исследований в данной области цель настоящей работы состояла в сравнительном изучении Физико-химических и Функциональных свой' тв -связывающих белков, выделенных в чистом виде из различных биологических жидкостей организма человека. Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи: I разработать методические подходы к выделению, очистке и идентификации Т«-связивающих компонентов биологических жидкостей; 2 -изучить макромолекулярные свойства очищенных белков; 3 - определить количественные параметры их взаимодействия с тиреоидными гормонами; 4 - выяснить влияние различных физико-химических факторов на гормон-белковое связывание; 5 - изучить природу и структурные характеристики гормонсвязывающих центров; 6 - исследовать взаимодействия в системе in vitro, включающей связывающий белок, тире-оидный гормон и его мембранный рецептор; 7 - разработать на основе полученных результатов методы и средства количественного определения тиреоидных гормонов и связывающих белков в крови человека.

Нахчиг)Я Цовизна_._ В ходе системного исследования разработана методология поиска, идентификации и изучения физико-химических и биологических свойств Т«-связывающих белков, присутствуюцих во внеклеточных жидкостях организма человека, которая включает: (я) использование хроматографии по сродству к лиганду и отдельным структурным компонентам макромолекулы; <<5) иммунохимический анализ ь

сочетапии с другими аналитическими методами белковой химии; (в) определение характеристик комплексообразования в кинетическом и равновесном режимах; ( г) спектральный анализ изменений молекулярных состояний белка и гормона в результате комплексооОразования, (л) aíM/шшое зондирование молекул белка йодтиронинами, конъюгировашшми с репортерными группами, и соединениями, имитирующими природные лиганды; (е) ингибирование гормон-белкових взаимодействий низкомо-лекулярними веществами и макромолекулами, специфичными к отдельным фрагментам полипептидной цепи связывающего белка; (si нротеолити-ческая фрагментация белка с последующим исследованием T«-связывающей активности выделенных фрагментов; (з) изучение свойств белков в биологических системах in vivo и in vitro.

В результате применения зтого методического подхода обнаружено новое биологическое свойство аполипопротеина (ano) A-l , igA, igQ, и IgM - способность специфически связывать тиреоидные гормоны - и сделан вывод о том, что указанные белки являются нормальными компонентами системы транспорта йодгиронинов в плазме человека. Разработаны новые методики выделения препаративных количеств высокоочи-щсшшх апоА-1, IgM и ТСГ. Измерены параметры комплексообразования T« с компонентами системы связывающих белков и оценено влияние различных физико-химических факторов на реакцию гормон-белкового связывания. Изучено сродство большого числа йодтиронинов, их аналогов и производных к этим белкам. Впервые описаны T«-связывающие центры аноА-1 и IgM, выявлены новые характеристики активного центра ТСГ. Показано, что ТСГ-1 - фракция чистого ТСГ ретроплацентарной сыворотки, не взаимодействующая с конканавалином А (КонА) из-за особого строения углеводного компонента - не отличается от ТСГ нормальной сыворотки по характеристикам полипептидной цепи и свойствам гормонсвязывающего центра, но имеет . специфические моно-сахнридный состав и микрогетерогенную структуру и увеличенное время жизни в кровообращении. ТСГ-Г является минорным Т.-связывающим компонентом плазмы в норме, в относительно высоких концентрациях присутствует в организме при беременности и в поздний послеродовый период, а также у людей со злокачественными новообразованиями различной локализации и заболеваниями печени. Найдено, что ТСГ, ТСПА м апоА-1-ЛВ11 ингибируют связывание Ti и Т« с плазматическими ненбрама>м • синцитиотрофобласта человека in vitro. IgM также инги-бмрует взаимодействие T« с • мембранами, но при определенной концентрации оказывает стимулирующее действие на мембранное связывание Т». Обнаружены и охарактеризованы места обратимого связывания IgM на

плазматических мембранах. Эти результаты дают основание рассматривать IgM как возможный модулятор рецепции тиреоидннх гормонов плацентарной тканью.

Исходя из полученных в настоящей работе новых данных и известных результатов исследований в этой области можно говорить о концепции системы транспортных белков плазмы, компоненты которой связаны между собой и тиреоидннми гормонами общим равновесным соотношением, обладают схожими элементами строения активных центров,, но имеют специфичные для каждого белка места связывания на мембранах компетентных клеток и- в составе мембранного комплекса выполняют индивидуальные функции по избирательной доставке одного из двух гормонов в ткань-мишень .

Практическая значимость. Результаты настоящей работы представляют интерес для исследовательской и практической медицины, а также для технологии производства средств иммунохимического микроанализа.

Предложены биоспецифические методы очистки и контроля качества связывающих белков, меченых тиреоидннх гормонов и антител к йодти-ронинам, соответствующих самым высоким современным требованиям к компонентам радиоиммунологических систем.

Разработаны технологические формы радиопрепаратов для радиоим-муноанализа Т« и ТОГ, осуществлен синтез новых химических соединений - N-оксисукцинимидних эфиров Ы-ацетилйодтиронинов и иммуногенных коныогатов тиреоидннх гормонов с белками-носителями. Получены новые производные Т«, содержащие ароматические заместители по карбоксильной и(или) аминогруппе, для приготовления устойчивых радиоактивных меток без введения йода-125 в структуру йодтиронина.

Оптимизированы условия протекания иммунохимических реакций в радиоиммунологических системах для количественного определения Т«, Ti, ТСГ, ТСГ-1 и апоА-i и проведена широкая апробация этих систем на клиническом материале. На основе разработанных радиои«1унологических систем, стандартизованных методик и реагентов созданы и производятся наборы реактивов рио-Т«-ПГ, рио-Т« -"' 1-М, рио-Т« '11-СП, рно-Т>-ПГ, рио-ТСГ-ПГ и рио-ТСГ-М, предназначенные для комплексной диагностики тиреоидннх заболеваний и скрининга гипотиреоза новорожденных. За период с начала опытно-промышленног< выпуска и по настоящее иремя 'Хозрасчетным опытным производством И1ЮХ АНБ изготовлено и направлено медицинским потребителян в общей сложности 163566 наборов, что достаточно для обследования более 3 миллионов пациентов по трем показателям Функционального состояния щитовидной железы.

Указанные разработки защищены 14 авторскими свидетельствами на изобретения, 11 из которых реализованы и в настоящее время применяются в производственной практике.

Результаты проведенных исследований, составляющие предмет научной новизны и практической значимости, можно рассматривать как основу научного направления: "Изучение физико-химических . свойств и биологических . функций комплексов тиреоидных гормонов со связывающими белками плазмы и разработка новых способов и средств диагностики тиреоидных заболеваний у человека".

Диссертационное исследование выполнено в соответствии с плановыми темами Института биоорганической химии ЛИ Беларуси в рамках Программы фундаментальных исследований АН СССР "Физико-химические основы биологии и биотехнологии", Комплексной программы научных исследований АН СССР и АМН СССР "Фундаментальные науки - медицине", Общесоюзной научно-технической программ 0.74.05 (задание 02.11.1), Программы фундаментальных исследований All Беларуси по разделу "Биоорганическая химия", Республиканских комплексных программ фундаментальных исследований "Здоровье", "Регуляция" и "Биотехнология", Общесоюзной научно-технической программы 0.69.09 "Микроанализ", Государственной программы по Ликвидации в Белорусской ССР последствий аварии на Чернобыльской АЭС (задание 9.2.7).

Положения, рыносииис на заааггу.

1. Новое биологическое свойство аполипопротеина A-I и иммуноглобулинов плазмы крови человека - способность связывать тиреоидние гормоны.

2. Способы выделения и очистки T«-связывающих белков плазмы, их шкромолекулярныо свойства и структурные характеристики активных центров.

3. Стимулирующее и ингибирующав действие T«-связывающих белков на рецепции тиреоидных гормонов плазматическими мембранами плаценты.

4. Разработка научных основ, создание и внедрение в производство наборов реактивов для комплексной ига-1унохимической диагностики тиреоидных заболеваний.

flju>o6amm тебот». Результаты настоящей работы были представлены в виде докладов и обсуздалмсь на следующих главных научных форумах: 7 3 F.se годный съезд американского эндокринного общества "(Вашингтон, 1991 г.) (59); И Российско-израильский симпозиум по пептидам и белкам (Москьа, 1992 г.) (62 J; IV .Неадународный симпозиум стран-членов СОВ по радмофарнедевтическим препаратам и наборам реактивов для piUWo-цннунологмческого анализа (Обнинск, 1986 г.) [45,46); Международный

симпозиум "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986 г.) [471; Международный симпозиум 'Проблемы развития работ по лабораторно-диагностической технике" (Смоленск, 1988 г.) 1491; v Всесоюзны!, биохимический съезд (Киев, 1986 г.) [441; Всесоюзный симпозиум "Химия белков" (Тбилиси, 1990 г.) [55, 5GJ; III Всесоюзный съезд эндокринологов (Ташкент, 1989) [51}; Всесоюзный симпозиум "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки' (Суздаль, 1989 г.) [52]; Всесоюзный симпозиум "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии" (Москва, 1989 г.) [53, 54 1; Всесоюзный симпозиум "Биохимия рецепторннх систем" (Таллинн, 1990 г.) [57], а также на других научных конференциях и совещаниях [43, 48, 50, 58, 60, 61].

1. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

С целью выявления белков, связывающих тиреоидине гормоны в биологических жидкостях, традиционно используется метод, основанный на внесении в исследуемую пробу меченого гормона, электрофоретичееком разделении гормонсвязывающих компонентов и их радиометрической детекции. Мы применили для этой цели новый методический подход, основанный на аффинной хроматографии [13, 21J. Схема синтеза ИЗ' и химическое строение аффинного сорбента представлены на рис. 1.

Рис. 1. Схема синтеза Т, -сефврозы

Характеризуя химическую структуру аффинного сорбента, следует отметить, что молекула Т« отделена от поверхности полисахаридной матрицы алифатической цепью из трех углеродных атомов. Оптимальная длина пространственной вставки Позволяла, с ода. Л стороны, избежать стерических препятствий биоспецифическим взаимодействиям, а с другой - предотвратить неспецифическую'сорбцию посторонних белков.

В течение нескольких лет были проведены многочисленные эксперименты по аФФишюй хроматографии сыворотки и проанализированы более ста образцов пмделенных белковых смесей [2Ц. В них с помомъю тоета

на связывание T<, хроматографических, электрофоретических и иммуно-химических методой с использованием известных Т«-связывающих белков в качестве стандартов были идентифицированы ТСГ и ЧОА. Транстиретин сыворотки не взаимодействовал с Т.-сефарозой из-за недоступности иммобилизованному лиганду активных центров, расположенных во внутреннем канале тетрамерной макромолекулы. Кроме того, постоянными компонентами воспроизводимо получаемой белковой смеси были два ранее не описанных белка, которые проявляли Т<-связывающую активность в стандартных тестах [10, 13, 21]. Один из них по данным ЭФ в ПААГ с Ds-Na мигрировал в виде одной полосы с Мг-25000 независимо от того, была ли белковая проба обработана 2-меркаптоэганолом или нет. Игорей белок при ЭФ ь ПАЛГ с Ds-Na в отсутствие восстановителя проявлялся в виде одной полосы с И, >150000. Если проба предварительно восстанавливалась 2-меркаптоэтанолом, то на электрофореграмме присутствовали две полосы с Mr-80000 и 27000. Основываясь на значениях* молекулярных масс, мы предварительно обозначили эти белки 2 5К и 80/27К 113]. При ЭФ в иативном 7,5%-ном ПААГ белок 25К проявлялся В зоне лидирующего красителя, а белок 80/27К из-за своих больших размеров оставался на старте. Поэтому не удивительно, что эти белки ранее не были обнаружены при использовании традиционного метода детекции Т«-связывающей активности компонентов сыворотки.

В табл. 1 обобщены результаты экспериментов по выделению белков из ретроплаценгарной сыворотки человека путем биоспецифической адсорбции на Т«-сефарозе в различных условиях 1211. Изменение концентрации иммобилизованного Т» в сыворотке позволяло получать белковую смесь с различным относительным содержанием Т«-связывающих белков. Кроме того, работа в выбранных условиях инкубации давала возможность селективного извлечения конкретного белка из сыворотки.

Табл. 2 отражает результаты экспериментов по дифференциальной элюции биоспецифически адсорбированных белков 121). Тест на связывание t•••11Т« элюированными белками 25К, 80/27К и ТСГ после удаления элюирующих агентов показал, что десорбция этих белков с Т«-сефароэи детергентом, хаотропными агентами и специфическими ингибиторами не приводит к их необратимой денатурации, и все очищенные белки проявляют Ti -связывающую активность в растворе.

Хроматографическое поведение на Т«-сефарозе белков нормальной сыворотки не отличалось от поведения белков ретроплацентарной сыворотки. Однако выделенные мз этих двух источников белковые смеси несколько различались по количественный составам.

Таблиц» I

Влияние условий инкубации сшюротки кропи с Т. -сефярояой на количества биоспецифмчески адсорбированных белков

Условия инкубации Адсорбированные белки, мг

тег 80/27К 25К чел

Стандартные 30 1.4 10 0,«

Концентрация иммоби-

лизованного 'Г< , нкМ

5 21 0,4 0,8 0,2

40 31 1.1 12 5

80 33 2,4 35 10

РН

5 18 0 0 2

10 Я 0 0 0,4

Температура, °С

4 29 1.2 8 0,4

37 32 1,5 И 0,8

Продолжительность, ч

3 20 0,5 3 0,1

6 28 0,7 Э 0,5

40 32 1.7 40 15

Примечании. Псе расчеты даны на I л сыворотки. Стандартные услония: концентрация иммобилиронянного н инкубационной смеси 20 мхН, рН 7, температура 22°, продолжительность инкубации 18 ч. Элюция с Г« -сефароэы осуществлялась 1 мМ Нион.

Таблица 2

Относительные количества Т« -связывающих белков сыноротки, элюированных с Т4-сефароэы различными агентами

Элюирующий агент

Белок -----------------------------------------------------

ЫяОН, ХОЛЯТ Ыа, А11С. Т. , МйС1,, N11. аси

1 ИМ 12 мМ 1 мМ 10 мкМ 3 М 3 М

тег 100 К 90 85 0 100

25К 100 98 10 8 90 100

80/27К • 100 0 10 . 6 93 100

ЧСА 100 95 5 " 0 96 100

Примечания. Л 5 сорбция белков на Т, -сефврозе осуществлялись в стаи пьртпых услопичх (табл. I). За 100% принята нпсса кпхяото бел/;п, ОЛЮЩЬУЩШНОГО 1 М/1 ЫпОН И оЧИГуННЩ О с ПОМОЩЬ»' ЛОНОЛННТеЛЫтХ Ч)Л1Н-

ТОГрвФНЧС; -НИХ СТИДНЙ ■

Элюат, полученный из нормальной сыворотки в стандартных условиях (табл. 1), содержал примерно в 2 раза меньше ТОГ и в 1,2 раза больше белка 2 5К и ЧСА, чем элюат из послеродовой сыворотки. Количества белка В0/27К .в этих элюатах были одинаковыми. Можно предположить■ что сыворотка крови человека в норме и при беременности имеет один и гот же набор Т»-связывающих белков, концентрации которых, за исключением ТОГ, при этих двух физиологических состояниях существенно не различаются.

Аффинная хроматография амниотической жидкости (АЖ) (13, 14] в стандартных условиях приводила к выделению почти чистого < 90%1 ТОГ с примесью ЧСА. Это указывает на то, что системы Т»-связывающих белков АЛ и сыворотки крови матери различаются по набору и (или) относительным концентрациям компонентов.

Аффинная хроматография на Т«-сефарозе эффективно применялась нами и для очистки антител к Т« из асцитических жидкостей мыши и иммунной сыворотки кролика 174], которые использовались в последующей работе в качестве моделей анти-Т» аутоантител человека и компонентов 1>адиоиммунологических систем. В этом случае концентрация иммобилизованного Т« в 5-20 раз превышала максимальную связывающую емкость антител, природные Т4-связывающие белки удалялись с аффинной матрицы промывкой раствором с рН 10-12, а десорбция антител осуществлялась 15-50Х-НШ1 водным ацетонитрилом, подкисленным до рН 2-4.

2. ОЧИСТКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ, СВОЙСТВА

Ьелки сыворотки, проявляющие сродство к Т«-сефарозе, в предварительных экспериментах [Ю, 13] были разделены хроматографией на оксиапатите и очищены в аналитических количествах хроматографиями на цибакрон козд-сефарозе и ТЗК-геле 55 ПК.

Чистые белки 25К и 80/27К связывали 1«»«1)Т« в растворе и не давали полой преципитации с антисыворотками к ТСГ и ЧСА в экспериментах по двойной радиальной итуиодиффузии в геле [22]. Результаты сравнительного анализа аминокислотных составов Т«-связывающих белков приведены в табл. 3 (13].

Поскольку выделенные Оелкн не имели общих антигенных детерминант и сук»ественно отличались по химическим составам, был сделан вывод о том, что белли 25К И 80/27К не являются фрагментами или агрегатами известных Т.-связывающих белков, а представляют собой эндогенные компоненты системы белков крови, связывающих тиреоидине гормоны.

Тяб.цицн J

Аминокислотные составы T« -связывающих белков

Содержание, ммоль/юо мг белка Аминокислота -----------------------------------

ТСГ 80/27K 2 5K

Ar« 15,0 34,5 49,8

Ьуя 54,3 55,5 5Г. ,R

Н i я 21,3 19,5 10,5

Phe 42,5 30,0 16,8

Туг 13,5 32,0 16,3

Leu 78,0 67,5 112,2

De 30,0 25,5 0

Met 22,0 11,3 10,0

VhL 52,0 50,5 37 , 4

Л1а 55,0 50,0 69, 7

Gl у 37,0 61 ,5 ЗЯ .!)

Pro 26 , 0 44,5 35,2

diu 102,0 81 ,5 142,4

3er 53,0 82,5 50,6

Thr 36, 5 59,5 33.fi

Aap Я2 , 0 . 62,0 64,3

Cys-SOj H 11,0 22,0 -

Trp 11,0 13,0 12,0

Примечание. Содержание CysSOiH в белке 25К не определялось.

Пслок 25К - апоА-1-ЛВП. Из результатов предварительных экспериментов следовало, что белок 25К по молекулярной массе и аминокислотному составу (редко встречающееся характерное отсутствие изолейцина) очень близок к апоА-I. С целью корректной идентификации этого белка мы разработали радиоиммунологическую систему, включакицую моноспецифическую антисыворотку К апоА-I (Boehringer Mannheim), эталонные образцы апоА-I (Signa), c»««tJanoA-i и раствор полиэти-ленгликоля 6000 в качестве преципитирукхцего агента (19). Эта система использовалась для количественного определения иммунореактивного апоА-I в хроматографических фракциях и для сравнения иммунохимнчес-ких свойств стандартного и выделенного белков (19, 231.

Обработку сыворотки Т<-сефарозой проводили условиях, благоприятствующих максим;! ль ному связыванию белка 25К с аффинным сорбентом (табл. 1). Холат Nв был выбран в качестве ингредиента элкж-ругщого буфера, поскольку он способен с высокой селективность») удалять белок 2 5К с аффшшпй матрицы (табл. 2). В элкаге был обнару-

жен иммунореактивный апоА-l. Сопоставление масс общего белка и нммунохимически подобного апоА-l белка в олыированной фракции показало, что количество белковых примесей и этой фракции не повышает 15*. Такой состав препарата подтверждался данными ОФ в IIAAI' с Ds-Na: белок, имеющий ту же молекулярную массу, что и стандарт апоА-l, составлял -90* окрашенных белков (по результатам деноитометрии). Единственным наблюдаемым на олектрофореграммах примесным компонентом являлся белок с И.-70000, идентифицированный как ЧОА. Применение хроматографии на иммобилизованном цмбакроне голубом ЮЗА, хотя и позволяло полностью удалить ЧСЛ из препарата, элширонанного холатом Ыа с Т< -сефарозы, но приводило к существенным потерли белка 25К. Поэтому бил использован альтернативный способ удаления ЧОА (1», 23].

Мы нашли 119], что ЧОА в присутствии 12 nil холата Na не взаимодействует с сорбентом, полученным путем последовательного присоединения к сефарозе 4В эпихлоргидрина, этилендпампна и холевой кислоты. 1) тех же условиях подобный апоА-l белок 2ЬК прочно связывался с холат-сефарозой.

С целью получения дополнительных данных для идентификации белка 25К мы изучили хроматографическое поведение апоА-l сыворотки крови человека на холат-сефарозе. Концентрация иммобилизованной холевой кислоты в сыворотке составляла 80 мкМ, продолжительность инкубации 4 ч, температура - 22». После удаления балластных белков и промкпки колонки 12 мМ холатом Na целевой продукт элюировали 40 мМ холатом Na (табл. 4) 123).

Таблица 4

Иимунореактивиый апоА-l во фракциях сыворотки крови человека, полученных с помощью аффинной хроматографии

Общий Иммуноре- Степень Выход

Фракция ' белок, активный очистки, х

мг апоА-l, мг

Сыворотка 60 200 1 зоо 1 юо

(30 100) (650) (1) (100)

Олюат (12 ММ холат Na) ' 56 47 39 3,6 с Т«-сефарози

Олюат (40 ХОЛИТ Na) 37 37 46 2,8

о холат-сефарозы (200) (160) (37) (25)

Примечании. Расчеты даны на J л сыворотки■ В скобках приведены дан-ныв, orHociUiUecя к выдояенню шюЛ-Т из 0,5 л сыворотки о одну стадии да холат-сефироэе.

Аффиннне хроматографии на Т« -сефарозе или холат-сефарозе позволяют внделять препараты апоА-l с достаточно высокой степенью чистоты (»о и 80% соответственно), а их комбинация дает гомогенный алоА-1. При этом белог не подвергается денатурирующим воздействиям и, как будет показано далее, сохраняет высокую иммунореактивность и Т« -связывающие свойства. Обе аффинные матрицы химически стабильны и выдерживают длительное интенсивное использование (не менее 20 циклон выделения в течение одного года).

Для корректной идентификации выделенного Ti-связывающего белка были использованы два иммунохимических метода [23]. Двойная радиальная иммунодиффузия показала, что исследуемые препараты белка 25К и стандартные препараты ЛВПз (ВК1Щ РАИН) и опоА-Х взаимодействуют с моноспецифической антисывороткой к апоА-1, давая карт.шы преципитации, указывающие на иммунохимическую идентичность сравниваемых белков. Анализ реакций в радиоиммунологической системе выявил строгий параллелизм прямых конкурентного ингибирования белком 25к и стандартным апоА-Г связывания [11511апоА -1 п антителами, что указывало на совпадение количественных показателей иммунореяктивноети исследуемого и стандартного препаратов.

Поскольку апоА-1 является известным белковым компонентом липо-протеидннх частиц, то мы дополнили исследование препаратов белка zsk методами, традиционно используемыми в анализе липопротеинов (23). Определение с помощью тонкослойной хроматографии качественного состава липидов, экстрагированных органическим растворителем in препарата белка 25К, выделенного на Т«-сефарозе, выявило присутствие эфиров холестерина, триглицеридов■ фосфатидилхолина и сфииго-миелина. После очистки на холат-сефарозе апоА-1 был практически свободен от липидов.

Центрифугирование белка в растворах квг показало, что в пробирке, содержащей раствор КВг с плотностью 1,063 г/мл, 95* белкового компонента находится в донной фракции, а в пробирке с раствором плотностью 1,21 г/л 87% белка присутствует в верхней фракции. Таким образом, по флотационным свойствам белок 25К соответствовал ЛВП.

В экспериментах по осаждению полианионами и катионами белок 25К также вел себя подобно изолированной фракции ЛВГ в растворе гепарина оставалось 91% белка 25К, а в растворе МпСЬ - только 12%.

При 0Ф в агарозе белок 25К окрашивался судаком черным Б и миг-ртхтал в зону альфа-липопротеинов, что характерно для ЛВП 123]. В соответствии с этими результатами белок 25К далее по тексту ни обозначаем anoA-t-ЛВП.

При гель-хроматографии апоА-1-ЛВП на калиброванной по молекулярным массам колонке с ТЗК-гелем 55 HW профиль элюции зависел от концентрации белка. При содержании апоА-l в пробе -2 мг/мл он олюировался в виде пика, который соответствовал Мг- 250000-300000. Однако при концентрации белка менее О,5 мг/мл превалировал пик,* соответствующий Мг-70000. Отметим, что склонность к самоаосоциации за счет амфипатических спиральных областей полипептида является характерной чертой липопротеинов. Мы нашли, что агрегация в концентрированных растворах anoA-l-ЛВП не приводит к исчезновению Т«-свяэывающй активности [23].

Белок 80/27К - 1вн. Чистый белок 80/27К получали из объединенных проб нормальной сыворотки доноров или из ретроплацентарной сыворотки рожениц с помощью двух разработанных нами методик' [10, 13, 21, 25].

Методика 1. Способ включает хроматографии на Т«-сефарозе, окси-апатите и тзк-геле 55 HW. В оптимальных для белка 80/27К условиях хроматографии на Т«-сефарозе (табл. 1) из 1 л сыворотки извлекалось не более 3 мг этого белка, что удовлетворяло потребностям . аналитических экспериментов. Мы поставили задачу разработки альтернативной методики с целью выделения препаративных количеств белка 80/27К для структурно-функциональных исследований и получения дополнительных данных для его идентификации. Очищенный по методике 1 белок 80/27К подвергали окислительному радиойодированию и получали [11 • I]80/27К с удельной активностью 0,7 МБк/мг, который использовали в качестве радиоиндикатора при осуществлении альтернативной методики выделения и очистки.

Методика 2. Этот способ 125] включает тонкое солевое фракционирование сыворотки (NH«)iSO< и очистку выделенного белка 80/27К хроматографией на тзк-геле 55 HW. В предварительном эксперименте найдено, что при 35%-ном насыщении раствора белка 80/27К сульфатом аммония -90Х этого белка остается в растворенном состоянии. Растворимость белка 80/27К существенно уменьшалась, когда степень насыщения его раствора сын«), 30« увеличивалась до 4ох: после центрифугирования в надосадочной жидкости оставалось -15Х белка. Получение из сыворотки, меченой I « »•1180/2ТК> белковой фракции 35-40Х насыщения (NH<)i30a приводило к отделению эндогенного белка 80/27К от основной массы макроглобулинов сыворотки и к концентрированию в этой фракции около 75Х . |>>*1]80/27К. С помощью последующей хроматографии этой фракции на TSK-геле 55НЫ удавалось сравнительно легко получить

очищенный препарат, а рехроматография в тех же условиях давала чистый белок. В табл. 5 представлены основные характеристики стадий очистки белка 80/27К по методике 2 [25].

Колонку для гель-хроматографии была прокалибрована по массам высокомолекулярных белков из стандартного набора. Печенный йодом-125 белок 80/27К, очищенный по методике 1, и белок 80/27К, полученный по методике 2, имели одинаковые объемы выхода, совпадающие с элюционным объемом стандарта IgM (Jackson Immunoresearch Lab.) с сертифицированной молекулярной массой 950 кДа. В условиях аналитической хроматографии на тэк-геле 55 ни препараты, очищенные по методикам 1 и 2 и содержащие меченый Т« , элюировались в виде комплексов с [12Ч]Т«, что указывало на присущую им гормонсвязнвающщую активность [25].

Таблица s

Параметры выделения и очистки белка 80/27К из нормальной сыворотки, содержащей [1 « » 1180/27К в качестве радиоиндикатора

Общий Удельная Степень Выход, Стадия очистки белок, активность, очистки X

мг имп/мин- мг

Сыворотка 650 410 1 100

Фракционирование (NH»)s so«

(35-40Х насыщения) 42 4835 12 75

Гель-хроматография на тзк 55 HW 20 17697 43 65

Рехроматография на тзк 55 HW 8 19180 47 54

Примечание. Расчеты даны на 10 мл сыворотки.

Поскольку белок 80/27К обладал характерным субъединичным составом и по гидродинамическим свойствам соответствовал 1вм, то мы имели все основания считать его 1вМ-подобным белком и в последующих экспериментах целенаправленно осуществлять идентификацию, используя эталонный 1«м для сравнения [25].

При. ЭФ в ПААГ с Бз-Ма и 2-меркаптоэтанолом оба препарата белка 80/27К и стандарт 1вм давали идентичные электрофореграммы. Сравнительный электрофоретический анализ трех указанных проб в градиентной (3-20Х) ПААГ в нативных условиях показал, что каддый белок мигрирует в виде одной полосы с И/ =0,13.

Для идентификации 1яМ-подобного белка 80/27К методом иммуно-пг ципитации мы выбрали коммерческие моноспецифические антисыворотки к-р-, А- и'н.-цепям 1в человека и антисыворотку, полученную

наии и результате иммунизации кроликов очищенным Т<-связывающим белком 80/27К, которой был выделен по методике I. Результаты иммуно-химического анализа показаны в табл. 6 [251.

Таблица е

Иммунохнмическал идентификация белка 80/27К

Белковый препарат Антитела

[¿-цепь ig Л-цели, Ig Х- -цепь Ig Й0/27К

Белок 80/27К (методика 1) t + + +

Белок 80/27К (методика 2) + +

Стандарт IgM человека t t + +

Примечание.Знак * указыает па образование дуги преципитации в агаре.

Дополнительно можно отметить, что полосы преципитации двух препаратов белка 80/2 7К и эталонного IgM плавно переходили одна в другую и не давали "шпор", характерных для частичного иммуноперекреста. Можно сделать вывод о той, mo Т«-связывающий белок В0/27К относится к классу IgM, поскольку имеет характерные для IgM молекулярную массу, субъединичный состав, олектрофоретическую подвижность и антигенные детерминанты.

Очистка ТСГ. Нами выбраны оптимальные значения параметров, определяющих селективность биоспецифической адсорбции ТСГ: концентрация иммобилизованного T«.в объеме инкубационной смеси - около 20 мкМ для сыворотки и 1 мкМ для АЖ, молярное соотношение иммобили-зованого T« и ТСГ в этой смеси - порядка 100:1 для обоих источников, продолжительность инкубации - 1Б-18 ч (13]. При этих условиях эндогенный Т« . в разбавленной сыворотке (-50 нМ) ив интактной АЖ (-3 нМ) [39, 69] не оказывали влияния на эффективность адсорбции ТСГ, что позволяло избежать трудоемкой предварительной стадии удаления эндогенных гормонов. В отличие от опубликованных методик мы ввели протеку аффшшого сорбента раствором холата На для удаления апоЛ-1-ЛЫ1 и ЧСА. Элюция ТСГ осуществлялась слабым раствором щелочи. Оптированный белок очищали далее хроматографией на оксиапатнте [13, 67]. Чистый ТСГ десорбировался с оксиапатита уже 6 иМ Na-фосфатным буфером, рН 6,8.

Ирм хроматографии чистого ТСГ из сыворотки ретроплацентарной кроим на КонА-сефыроэе (3, 16J гликопротеин разделялся на две фракции, одна иэ которых (ТСГ-1), составлявшая около 10Х от общей массы, ив взаимодействовала с иммобилизованным лектином и элюировалась в

свободном объеме, я другая адсорбировалась на аффинной колонке. В аналогичных условиях ТОГ из нормальной сыворотки практически полностью связывался с КонА-сефарозой. В табл. 7 сведены основные характеристики процесса выделения и очистки ТСГ и ТСГ-1 из трех биологических жидкостей 1131.

Таблица 7

11н1>аметры наделения и очистки ТСГ из биологических жидкостей

Ретроплацентарная Нормальная Амниотическая сыворотка сыворотка жидкость

Фракция --------------------------------------------------

ТСГ, Очист- Вы- ТСГ, Очист- Вы- ТСГ, Очист- Пн-мг ка ход,* мг ка ход,Х мг ка ход,*

Биологическая 40 жидкость (3,2) Элюат 1 мМ ЫаОН с Т<-сефарозы 36 Элюат 5 мМ фосфатом N8 32 с оксиапатита ( 2*, 5)

1 100 19 1

(0)

1200 90 16 2380

1500 80 14 3060 (0)

100 2,6 1 100 (0,25)

84 2,0 1100 78

74 1,6 1235 62 (0,15)

Примечание. Расчеты лапы на 1 л биологической хидкости. В скобках указаны количеств» ТСГ-1.

Сравнительная характеристика ТСГ и ТСГ-1. Определение углеводных структур ТСГ нормальной сыворотки доноров и ТСГ-1 (О.А. Стрельченок с соавт., 1984) показало, что ТСГ содержит двух- и трехантенные оли-госахаридные цепи, тогда как ТСГ-1 несет только трехантенные оли-госахариды н-ацетиллактозаминного типа. Проведенное нами [3] сравнительное исследование макромолекулярныч свойств ТСГ-1 и ТОГ нормальной сыворотки должно было дать ответ на вопрос, обусловлены ли различия между ними только изменениями гликозилирования полипептидной цепи ТСГ при беременности или же в этом физиологическом состоянии организма человека появляется новый Т<-связывающий белок, подобный ТСГ.

При ЭФ в 7.5Х-Н0М НААГ (рН 7,0, 8,3 или 9,5) ТСГ-1 и ТСГ мигрировали в виде одной полосы, причем их электрофоретические подвижности совпадали. Молекулярные масон ТСГ-1 и ТСГ, рассчитанные по данным ЭФ в нативных ПДАГ различной концентрации, оказались рапными 55 кЛа. ЭФ в ПААГ в присутствии Ря-Ыа также выявил в обоих случаях

-го-

одну. полосу независимо от того, били ли белки предварительно восстановлены 2-меркаптоэтанолом или нет. Измеренные этим методом значения Mr составили 56000.

При изоэлектрофокусировании в градиенте рН 3-10 ТСГ проявлялся в виде семи полос различной интенсивности в диапазоне рН 4,1-5,1, причем главные полосы имели изоэлектрические точки при рН 4,2, 4,3, 4,5 и 4,65. Полосы ТСГ-1 были расположены в диапазоне рН 3,8-4,8, а наиболее интенсивные из них имели изоэлектрические точки при рН 4,0 и 4,35. По данным авторадиографии во всех полосах ТСГ-1 и ТСГ. присутствовал 11,,11Т«, уравновешенный с белковыми пробами перед изоэлектрофокусированием.

В экспериментах по гель-хроматографии на калиброванных колонках с сефадексом а-100 ТСГ-1 и ТСГ имели одинаковые объемы выхода, соответствующие Иг-54000.

Сравнение аминокислотных составов, рассчитанных на основании шести независимых определений, не выявило достоверных различий между ТСГ-1 и ТСГ (Р>0,05). Определение моносахаридных составов с использованием точной и воспроизводимой методики (21 показало, что ТСГ-1 содержит соответственно на 18, 33 и 38Х больше N-ацетилглюкозамина, N-ацетилнейраминовой кислоты и галактозы, чем ТСГ [31.

Изучение ТСГ и его структурного варианта методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 1111 показало, что они имеют одинаковые параметры теплопоглощения,' характеризующего процесс кооперативного разрушения связей, которые формируют пространственные структуры ТСГ и ТСГ-1: пик с максимумом при 62,5® и полушириной 7,1». Значения калориметрической энтальпии плавления и эффективной энтальпии денатурации составили 218 и 110 ккал/моль соответственно, а их соотношение - 0,505. Для компактных белков, состоящих из одного домена, это соотношение должно Сыть равно 1. Полученное нами значение, близкое к 1/2, позволяет предположить наличие в ТСГ двух • доменов, пространственные структуры которых имеют схожие термодинамические характеристики плавления.

При двойной радиальной иммунодиффузии в геле с использованием моноспецифической антисыворотки кролика к ТСГ из нормальной сыворотки человека [3] получена картина имкунопреципитации, соответствующая ижунохкдо ческой идентичности ТСГ и ТСГ-1.

С целью сравнения биологических свойств ТСГ-1 и ТСГ изучен клиренс этих белков in vivo с использованием самцов крыс линии Вистар, которым вводили внутривенно препараты [11•I1ТСГ-1 и [1»•I1ТСГ, й затем в пробах сыворотки определяли иммунореактивный меченый белок

[12]. Результаты эксперимента представлены на рис. 2. Расчеты показывают, что ТСГ-1 выводится из кровообращения крысы почти в полтора раза медленнее, чем ТСГ: 14,8±1,36 и 10,5^0,53 ч соответ-

ственно. Таким образом, ТСГ-1 является долгоживущим вариантом ТСГ.

10?

с,%

Рис. 2. Кинетика выведения 1">1]ТСГ-1 (1) и [•>Ч1ТСГ (2) из кровообращения крысы

Содержание ТСГ-1 в сыворотке человека в норме и при беременности. В продолжение исследований структурного варианта ТСГ представляло интерес выяснить, является ли ТСГ-1 нормальным компонетом плазмы человека или же он появляется при определенных физиологических и патологических состояниях, характеризующихся повышенным биосинтезом ТСГ, в частности, при беременности. С этой целью была разработана методика количественного определения ТСГ-1 в биологических жидкостях организма человека [6]. Эта методика включала микроколоночную хроматографию проб сыворотки на КонА-сефарозе и последующее радиоиммунологическое определение ТСГ-1 в неадсорбируемой фракции. Радиоиммунологическая система состояла из моноспецифической антисыворотки к ТСГ, калибровочных проб ТСГ-1, ['"«ИТОГ и поли-этиленгликоля 6000 в качестве преципитирующего агента. Минимальная достоверно определяемая концентрация ТСГ-1 составляла о,08 мкг/мл, а рабочий диапазон находился в пределах 0,2-6,0 мкг/мл. Параллельно в тех же пробах с помощью радиоиммуноанализа [42, 70) измерялась концентрация общего ТСГ.

В общей сложности с помощью новой методики "ило обследовано 585 человек. Концентрация ТСГ-1 в сыворотке практически здоровых доноров (n=60) составила 0,214.0,04 мкг/мл 124]. При этом у 20Х доноров содержание ТСГ-1 было ниже предела достоверной детекции. Доля ТСГ-1 в норме составила в среднем 1,! 5Х от уровня общего ТСГ. Получен»!« данные свидетельствуют о том, что появление ТСГ-1 скорее всего не

связано с индивидуальными особенностями организма человека, т.е. T«JF является минорным компонентом ТСГ плазмы в норме. Мы изучили изменение концентрации ТСГ в ходе нормально протекающей беременности (п=223) и послеродового периода (п=123) (8, 14, 15, • 20]. Установлено, что к сроку разрешения от беременности доля ТСГ-1 повышается до 8% в сыворотке и 9,5% в АЖ (п=30). Было обнаружено (п = 8 ) (8), что содержание ТСГ-1 в венозной и ретроплацентарной крови рожениц примерно одинаково, а концентрация этого белка в пуповинной крови новорожденных ниже минимальной определяемой величины. Эти данные указывали на то, что ТСГ-1 не является белком плацентарного или фетального происхождения. Результаты анализа показали 114], что ТСГ в ЛЖ имеет преимущественно материнское происхождение, причем вероятнее всего, ТСГ . проникает в АЖ путем пассивной диффузии через плодовые мембраны. Альтернативный специфический механизм существует, по-видимому, для переноса ТСГ-1 из материнской плазмы в A.Y.. Это соответствует возможной специальной функции ТСГ-1 в фетоплацептарной системе. Учитывая результаты наших-экспериментов in vivo и принимал во внимание известное значение ti/j нормального ТСГ в кровообращении человека (-5 сут), можно было предполагать, что время полужизни ТСГ-1 будет составлять около 7 сут. Однако концентрация ТСГ-1 в сыворотке очень медленно уменьшалась после родов и достигала значения, характерного для нормы, лишь через 5 мес после разрешения от беременности. На протяжении первого месяца после родов доля ТСГ-1 в общем ТСГ оставалась практически постоянной 120].

Можно предположить, что биосинтез структурного варианта ТСГ, содержащего только трехантенные олигосахаридные цепи, представляет собой один из способов физиологической адаптации к увеличению потребностей организма в ТСГ. .Если возникает необходимость в повышении концентрации ТСГ в крови, то отклик синтезирующего органа может состоять в избирательном усилении биосинтеза долгоживущего структурного варианта за счет изменения механизмов посттрансляционного гликозилирования полипептидной цепи.

Мы изучили также содержание ТСГ-1 и общего ТСГ в сыворотках людей с различными заболеваниями (п=141) [24]. Показано, в частности, что при злокачественных новообразованиях различной локализации и нарушениях функции печени доля ТСГ-1 составляет 3-10*.

На нам взгляд, количественное определение ТСГ-1 и общего ТСГ в крови можно использовать не только как один из критериев оценки тиреомдного статуса организма, но и для контроля за протеканием беременности и диагностики некоторых нетиреоияных заболеваний.

Создание для этих целей стандартизованных методик и реагентов I6, 42, 67, 70, 76). можно считать одним из практически? результатов нашей работы.

3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПАРАМЕТР» СВЯЗЫВАНИЯ Т.

Р^|истка _и ха1)актепистика_хир^ид111и ГpJS^«нoI^,_мcчeн!^ыx йoдo^^rJ_25^ С целью существенного повышения (от 95 до 99Х) степени чистоты 112Ч)Т| и 112»1]Т>, предназначенных для экспериментов со связывающими белками, мы разработали методику биоспецифической очистки коммерческих препаратов. Общая технологическая схема разработки включала синтез активированной полисахаридной матрицы для иммобилизации белков [63], получение на ее основе аффинных сорбентов, содержащих ТСГ или антитела к тиреоидным гормонам (64], биоспецифическую адсорбцию интактного меченого гормона из очищаемого препарата и десорбцию очищенных гормонов изменением рН элюирующего буфера и (или) добавлением в него органического растворителя [72]. Для надежного и точного контроля качества меченых Т< и Т> измерялась их иммунореактивность как количественная характеристика взаимодействия со специфическими антителами. Разработанный способ определения иммунореактивности 171] позволял выявлять даже незна"ч-тельные структурные повреждения меченого антигена. Эталоном ЮОХ-ной иммунореактивности служит ('»»ИТ« или (11»I ] Та , который находится в комплексе с антителом. В последующей работе использовались меченые тиреоидные гормоны с иимунореактивностыо 98-Ю0Х.

Условия и результаты кинетических и равновесных экспериментов. Для определения параметров гормон-белкового связывания применяли известный и распространенный метод, основанный на использовании активированного угля, покрытого декстрзном. Необходимо отметить, что кинетические измерения с использованием адсорбции свободного гормона на активированном угле носят оценочный характер, и их результаты мы интерпретируем главным образом в плане качественной характеристики комплексообразопания и сравнения различных Т|-связывающих белков.

В глаие 1 мы уже отметили тот Факт, что 1вм являлся постоянным компонентом белковой смеси, выделяемой из сывог тки на Т, -сефарозе. Поскольку все 1« имеют общие элементы структуры, оставалось неясным, обладают ли Т«-связывающей активностью 1в других классов, являются ли они аутоантителами, т.е. аномальными белками, или же относятся к нормальным белкам плазмы. С целью характеристики ранее не изученных свойств 1л человека мы исследовали взаимодействие Т. с чистыми 1«л,

1вО и 1вм и свободными легкими цепями lg (белки Бене-Джонса). В качестве контрольных препаратов в экспериментах использовали мышиные моноклональные антитела к Т« и Т>.

Данные кинетических и равновесных экспериментов (3, 7, • 11, 14, 22, 26, 28, 29, 37) обобщены в табл. 8 и табл. 9.

Таблица 8

Параметры связывания Т« с очищенными белками плазмы человека

N Белок Время достижения Время полу- К» • 10- • ,

п/п равновесия, диссоциации, М-'

1. ТСГ 45 - 4800—1700

2. TCÍ'-l 45 - 3600±1800

3. ТСГ ИЗ А* . 45 - 3100

4. АпоА-1-ЛВП 40 15 40Í21

5. IgM-пуЛ 90 15 110Í40

6. IgM-l - - 140

7. IgM-2 - - 110

8. IgM-3 . - - 60

9. IgM-4 - - 80

10. IgM-5 - - 160

11. IgM» 90 15 100

12. ItfQ-ПуЛ. 80 20 2,0-0,6

13. IgQ» 80 20 2,4

14. IgA» -90 <25 1,4 16. Белок Бенс-Джонса M)* 75 15 1,2 16. Белок Бенс-Джонса (J.)* 75 15 1,2

17. АНТИ-T.-IgM - 7600

18. Алти-Ti-JgQ - - 32000 (ДЛЯ T.)

Примечания. Звездочкой обозначены коммерческие препараты чистых белков: NN 11, 13, 14 - Jackson Immunoreaearch Lab., NN 15, 16 - Ве-hringwarke ло. Без звездочки - белки очищенные нами из пулов сыворотки (NN 1, г, 4, 5, 12), пула АХ (N 3) и индивидуальных проб сыворотки (NN 6-10) человека и в целях сравнения - из асцитических жидкостей юаш, содержащих моноклональные антитела к Г« IN 17) или Tt (N 18). Статистической обработке подвергнуты результаты, полученные на основании как минимум трех экспериментов по тестированию каждого из пяти образцов манного белка, выделенных в разное время. В остальных случаях даны средние значения результатов минимум трех экспериментов. Прочерк означает, что определение не проводилось.

Таблица 9

Влияние физико-химических факторов на связывание Т« и Т> о белками

Относительное связывание меченого гормона, X

Фактор ТСГ-1 И ТСГ апоА-1-ЛВП I«M- пул IgG- пул анти-Т« IgM анти-Ti IgO

Стандартные

условия 100 100 100 100 100 100

рН 3,0 11* 5« 5 5 - -

pli 4,0 57* - 50 47 65 81

рН 5,0 92 10 - - - -

рН 6,0 100 32 74 . 85 84 100

рН 8,0 100 100 111 105 95 100

pli 10,0 52 58 64 11 72 80

Хлорид натрия:

0,035 M - - 66 35 96 -

0,07 M - - 33 16 92 -

0,14 M 100 100 23 10 86 -

0,21 M - - 15 5 77 -

2,5 M - 5* - - - -

Гуанидинхлорид:

1 H - - 0* 0* - -

3 H - 5* - - - -

Мочевина :

2 И - - 75 37* - -

4 M - 100 - - - -

AHC:

10-6 И 100 65 50 100 100 100

10-5 M 87 38 - - - -

10-4 M 32 8 32 50 60 68

10-3 M 2 - 22 25 54 63

10-2 M - - 20 20 50 60

Нертиолат:

10-6 M 100 30 - - - -

10-5 M 95 17 80 - - -

10-4 M 62 8 30* - - -

10-3 M 40 - 7* 5* - -

Трихлорацетат:

10-3 M 100 100 45* 100 - -

10-2 M 83 72 - 67 - -

10-1 H 13 65 30* - - -

Термообработка :

50» 94 100 56 76 100 100

52® 85 88 - - - -

55 73 - . 51 60 90 93

60® 5« 18 45 49 71 88

80® - 12 25 15 10 15

Примечания. Источники получения белков указаны в примечании к табл. 9. Доли связанного 1"Ч]Ъ с анти-Т, и ["Ч Ш с остальными белками в стандартных условиях (0,05 М Ыа-фосфатниЯ буфер, рН 7,4) приняты за 100Х. Звездочкой обозначены результаты воздействий, которые били полностью или в существенной степени необратимыми. В других случаях наблюдали эффект полной обратимости, или же такой эксперимент не проводился. Прочерк означает, что определение данного параметра не проводилось.

В результате исследования не выявлено достоверных различий в параметрах Т»-связывающих активностей ТСГ', ТСГ-1 и ТОГ из АЖ. Вместе с тем найдено, что ТСГ и каждый из других изученных белков имеют специфический спектр свойств, включающий параметры образования и диссоциации комплексов с Т« , константу сродства к этому гормону, чувствительность реакции связывания к различным химическим и физическим факторам.

Эти характеристики не согласуются с неспецифической адсорбцией Т» на белке или простым включением неполярной молекулы гормона в липидную часть апоА-1-ЛВ11 и указывают на наличие в каждом белке структурно обособленного гормонсвязываклцего центра.

Как следует из табл. 8 и 9, 1йС, 1яА и свободные легкие цепи представляют собой низкоаффинные Т«-связывающими белки. Необходимым и достаточным для связывания Т. компонентом молекулярной структуры 1к является, по-видимому, ь-цепь типах или Л. Присутствие Н-цепи может резко увеличивать сродство к тиреоидному гормону ([¿-цепь в 1йМ) или изменять чувствительность участка связывания к химическим агентам и рН среды (р-цепь в 1вМ,,у"-Цепь в 180).

Полученные нами данные о закономерностях гормон-белкового связывания использованы в комплексных прикладных исследованиях для оптимизации условий протекания иммунохимических реакций Т« и Т> с антителами и выбора способа ингибирования взаимодействий этих гормонов с белкани проб сыворотки человека в радиоиммунологических системах (17, 68, 68, 69]. Кроме того, в ходе этих исследований разработана технологическая форма радиопрепарата для радиоиммуно-анализа Т< [76], предложены способы синтеза новых химических соединений - Н-оксисукцинимидных эфиров ы-ацетилйодтиронинов (65] и икмуногешшх конъюгатов тиреоидных гормонов с белками-носителями 166]. Получены новые производные Т<, содержащие ароматические заместители по карбоксильной и(или) аминогруппе, для синтеза радиоактивных меток без введения йода-125 в ароматические кольца йодтиронина (73]. Применение синтезированных соединений для исследований активного центра ТСГ описано в следующей главе (табл. 10)'.

На основе разработанных и охарактеризованных радиоиммунологических систем [4, 5] созданы и внедрены в производство наборы реактивов рио-Т.-ПГ [40, 701, рио-Т«»»1-М [411, рио-Т«••1-СП [17, 48, "9J и рио-Tj-nr [40, 63] для количественного определения Т« и Ti в сыворотке и сухом пятне крови человека с целью диагностики тиреоидных заболеваний и скрининга гипотиреоза новорожденных.

IgM:_адтоантитело_или нормальный Т4-связывающий белок? По

сродству к тиреоидным гормонам IgM занимает особое место среди Ig сыворотки человека (табл. 8). Измеренное значение К. для комплекса Т.-IgM попадает в известный из литературы диапазон значений сродства аутоантител к Ti. И хотя относительное число случаев (частотность) выявления анти-Т« аутоантител при массовых обследованиях взрослого населения не превышает 5Х, нельзя было исключить вероятность присутствия аутоантител в какой-либо из индивидуальных проб сыворотки, составлявших общий пул, из которого был выделен Т«-связывающий IgM.

В табл. 8 представлены значения К. нескольких образцов чистого IgM, выделенных из индивидуальных проб сыворотки, которые были получены путем случайной выборки от практически здоровых доноров. Важно отметить, что все изученные образцы обладали сродством к Т«, и усредненное значение К. = (0,9Í0,5)• 10' М-' соответствовало характеристикам IgM-пул: К« = (1, lío, 4 )■ 10* И-' [37].

Если зависимости Т«-связывающих активностей IgM и leo от рН (табл. 9) представить в виде графиков, то соответствующие кривые будут иметь типичную для транспортных белков форму колокола с выраженным максимумом при рН 8,0. Аналогичные графические зависимости для антител будут иметь характерную трапециевидную форму и отражать одинаковые или близкие уровни связывания антигенов в широком диапазоне pll.

Тепловая обработка IgM и Igo приводила к достаточно плавному уменьшению их активностей начиная примерно с 50«, причем IgM проявлял несколько более высокую термолабильность, чем igG. Даже после прогревания при 80« эти иммуноглобулины сохраняли 15-20Х исходной связывающей активности. У антител начало термоинактивации было сдвинуто примерно на 5-10® в сторону высоких температур, а сам процесс инактивации протекал в более узком темпера! -рном диапазоне.

Известно, что гидрофобный флуоресцентный зонд АНС способен конкурентно иигибировать взаимодействие Ti и Ti с транспортными белками, что, кстати, можно проследить на примерах ТСГ н апоА-1-ЛВП (табл. 9). Нами выявлены различия в концентрационных зависимостях ингибирующего действия ЛШ на связывание тиреоидных горшков с le

человека и антителами. Повышенная по сравнению с аутоантителами чувствительность T« -связывающих Ig человека к AJ1G, по-видимому, не позволяла до сих пор обнаружить связывание тиреоидных гормонов с IgM и igG в составе сыворотки крови (содержащей и другой ингибитор -С1- ) при исследовании индивидуальных проб по традиционной методике, включающей добавление больших количеств AIIC.- Кстати, С1- очень слабо влиял на комплексообразование T« с анти-T« IgM (табл. 9).

Следующий тест на природу T«-связывающей активности выделенного нами IgM-пул был основан на известном свойстве первого компонента системы комплемента ciq прочно связываться с антителами при условии, что антитело класса IgM имеет заполненные антигеном связывающие центры, а антитело класса Ige к тому же входит в состав иммунного комплекса с выраженной трехмерной структурой или находится в агрегированном состоянии. В экспериментах 127, 37) lllsl]ciq взаимодействовал с агрегатами IgG, но не проявлял сродства к комплексу IgM-T..

Итак, целый рад экспериментальных фактов указывает на то, что изученный IgM (и скорее всего Iga) не принадлежит к классу анти-Т« антител: (в) он имеет типичную для нормальных транспортных белков зависимость T«-связывающей активности от физико-химических воздействий, (б) частотность выявления T«-связывающего IgM в случайно выбранных индивидуальных пробах сыворотки составляет 100%, (в) комплекс IgM-T« структурно отличается от иммунного комплекса антиген-антитело, так как не способен взаимодействовать с elq, (г) активный центр IgM обладает низкой селективностью связывания структурных аналогов T« (глава 4, табл. 10), не характерной для антител.

4. СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СВЯЗЫВАВДИХ ЦЕНТРОВ

Для выявления структурных и топографических характеристик гор-монсиязыванцих центров белков ш использовали в основном следующие пять методов: (а) определение относительного сродства белка к структурным аналогам T« 17, 22,. 38], (б) спектральный анализ изменений молекулярных состояний белка и гормона в результате ком-плексообразованнл [3, 8, 11, 23], (в) аффинное зондирование молекул белка Нодтиронмнамм, конъюгированными с репортерными группами, и соединениями, имитирующими природные лиганди [23, 30, 31, 35, 36], (г) ннгибированне гормон-белковых взаимодействия галогенидами и макромолекулам«, специфичным к.отдельным фрагментам полипептидной

цепи связывающего белка [27, 32, 33, 381, (д) протеолигическая фрагментация белка с последующим исследованием Т»-связывающей активности выделенных фрагментов [27, 381.

Структурные требования связывающих центров к молекуле лиганла. В табл. 10 обобщены данные по сродству к связывающим белкам соединений, которые применялись в методах а - г.

Тяблица I о

Относительное сродство йодтиронинов, их производных и аналогов к связывающим белкам

N К. /Ki

Ii / и Соединение ------------------------------

ТСГ и ГСГ-1 апоА-1-ЛВГ! Г#М

Иодтирончны и их аналоги

1. 3,3,3',5'-тетрайод-Ь-тиронин (I.-T« )

2. 3,3,3',5'-тетрайод-0-тиронин (D-T«)

3. з,з',5-трийод-ь-тиронин (b-Ti>

4. 3,3*.б-трийод-р-тиронин (D-Ti)

5. 3,5-ДИЙОД-L-Iиронии (L-T«) в. 3,3',5-трийодтироуксусная кислота

7. 3,з',5-трийодтиропропионовая кислота

8. з,5-дийод-ь-тирозин

Производные Т,

9. N-ацетил-Т«

10.N-ацетил-Т«-0-гистамин*

11.N-2(п-оксифенил)пропионил-T«

12.N-2(п-оксифенил)пропионил-Т«-0-гистамин*

13.N-ацетил-Т«-0-БСА*

14.N-нитроксил-Т«*(спин-меченый T« ; T«-N0

15.N-родамин Б-T« * Имитаторы йодтиронинов

16.8-анилин-1 -нафталинсульфонат (А11С) 17.1-(4-аминофениламино)нафталин-8-сульфонат (NH, -АЛО

18.1-(4-оксифениламино)нафталин-8-сульфонат (он-АНС)

19.1-(з,5-дийод-4-оксифениламино)нафталин-

8-сульфонат (ди-ИОЩ-АНС) 20.8-1 4-оксифенилазо(нафталин-1-сульфонат

(он-азо-АЯС) 21. з, 5 - д: йодсалицилат

1,0 8,7 30, 4

62, 988 1162 10128 19750

13 24 33 55 816 ) 15 120

1,0 1 > 1 1,2 1,2 10,1 10,2 54 1368

83 100

500

1660

200

91

125 200

1.0 1 , 4 16,0 16,0

2200 275

Примечания. Значения К, рассчитаны на основании данных по конкурентному ингчбчрованию соединениями NN 1-21 связывания [''Ч/Т! с белками. Соотношение К, //0 отражает кратность прпшлиония сродства 7« над сродством соединений NN 2-21 к белку. Для ТСГ и ТСГ-I не чыяп-

лено статистически достоверных р'азличий в Ki и приведены усредненные по двум белкам значения К,/1С, . Для соединений, обозначенных звездочкой (NN 10, 12-15), даны "иллюстративные" названия: N 10 -продукт амндирования карбоксильной группы ы-нцетил-Т, гистамнном; N 12 - продукт ацилирования Nih -группы ?'« N-оксисукцинимндным эфиром 2-(п-оксифепил)пропионовой кислоты и амидирования карбоксильной группы гистомином; N 13 - продукт ацилирования t-групп остатков лизина IVA N-оксисукцинимндным эфиром Н-ацетил-Tt (конъюгат содержал 5 молекул гаптена на молекулу белка); N 14 - продукт алкилирования Nilг -группы Т» 2,3,в,б-тетраметил-4-амино-(2,4-дихлортрчазин¡пиперидин-1-оксилом; N 15 - продукт взаимодействия изотиоцианата родамина Б с NHt -группой 7'» . Прочерк означает, что ощюделение не приводилось .

Из таблицы видно, что D-изомеры тиреоидных гормонов активно конкурируют с природными L-изомерами за центры связывания на апоА-1-ЛШ1 и IgM, тогда как ТСГ способен распознавать энантиомеры йодтиронинов. Удаление одного атома йода из внешнего кольца Т< (переход к Т«) лишь незначительно снижает Ki для anoA-1-ЛЫ! и IgM, а сродство лиганда к ТОГ при этом уменьшается почти на порядок. Полное дейодирование этого кольца (переход к Til в очень сильной степени инактивирует йодтиронин по отношению к IgM и ТСГ и существенно снижает его сродство к апоА-1-ЛВГ1. очень слабыми конкурентными ингибиторами связывания Т« с белками являются трийодтироуксусная и трийодтиропропионовая кислоты, которые отличаются от йодтиронинов строением алифатических цепей молекул (фрагмент аланина в Т« и Ti). Модификации карбоксильной и аминогрупп в этом фрагменте (соединения 9-15), приводящие к изменению величины рК молекулы Т« и увеличению размеров боковой цепи, также уменьшают сродство к белку.

С практической точки зрения оптимальный выбор заместителей по этим положениям (например,, соединение 13), блокирующих связывание модифицированного гормона с белками пробы сыворотки, но не с антителами в аналитической системе, важен для радиоиммуноанализа свободного Т« в сыворотке человека.

Полная утрата лигандом структурных особенностей, характерных для йодтиронинов, практически полностью лишает его сродства к Т«-связывающим белкам, как это видно на примере дийодтирозина.

Таким образом, для каждого из трех изученных белков существует свой ряд выраженной зависимости структура лиганда - сродство к белку. Это подразумевает наличие структурной комплементарности между связывающими центрами и лигандом. Т« имеет строение наиболее предпочтительного лиганда для всех трех белков, что указывает на присутствие в их активных центрах схожих структурных элементов, рас-

познающих природный йодтиронин. По-видимому, эти элементы вовлечены во взаимодействие главным образом с интактной структурой тирони-нового ядра и атомами йода в-его внешнем кольце.

Спектральные эфЬекты комплексообразования Т« с ТСГ и ТСГ-1. Изучение разностных спектров УФ-поглощения эквимолярных комплексов ТСГ и ТСГ-1 с Т« [3, 9) показало, что связывание гормона приводит к возмущению ароматических хромофоров белков и• изменению степени ионизации фенольного гидроксила Т«, что вызывает появление в обоих спектрах положительных полос со слабо выраженными максимумами при 277, 285 и 300 HM.

В спектрах КД I3, 9) комплексообразование приводило к голубому сдвигу максимумов положительных полос на 3-4 нм и значительному увеличению оптической активности электронных переходов в области 250-350 нм за счет возмущенных переходов остатков триптофана, фенилаланина и тирозина, а также ионизированной и неионизированной форм фенольного хромофора Ti. КД амидного хромофора не изменялся при комплексообразовании.

Тушение флуоресценции ТСГ и ТСГ-1 при добавлении к растворам белков аликвот раствора Т» I9, 11] имело насыщаемый характер и достигало максимума (60-62%) при эквимольном соотношении белка и гормона. При этом полуширина полосы в спектре флуоресценции увеличивалась на 7-8 нм, а максимум сдвигался на 3-4 нм в длинноволновую область. Смещение полосы и изменение ее полуширины могут быть связаны с перестройкой в третичной структуре белка и (или) избирательным тушением флуоресценции триптофанилов, излучающих при более коротких длинах волн. В общем случае тушение собственной Флуоресценции ТСГ при связывании Т. может вызываться как прямым взаимодействием его хромофоров с молекулой лиганда, так и индуцированными комплексообразованием конформационными изменениями белка. В рамках теории индуктивно-резонансного переноса энергии Ферстера мы рассчитали критическое расстояние между молекулами в гормон-белковом комплексе, которое оказалось равным 32,8 А (91.

Совпадение спектральных характеристик комплексов ТСГ и ТСГ-1 с Т« говорит о том, что микроокружения хромофорных и флуорофорных групп этих белков претерпевают одинаковые изменения при связывании лиганда.

Можно предположить, что активный центр .ТСГ содержит кластер ароматических иминокислотных остатков, взаимодействуилдий с Hpjivsni-ческой структурой тиронина и обуславливахдций очень высок»! сродство к тиреоидному гормону.

-32В спектрах ЭПР 131] при титровании спинмеченного Т» (соединение 14, табл. 10) раствором ТСГ наблюдали два типа изменений сигнала ЭПР нитроксильного радикала, конъюгированного с гормоном. Во-первых, уменьшалась амплитуда сигнала и увеличивалось, отношение центральной и високопольной компонент триплета. Во-вторых, начиная с мольного соотношения белок:лиганд 1:2, в спектре отчетливо проявлялись широкие компоненты, принадлежащие радикалу с сильно заторможенным типом вращения. При добавлении в систему /мтактиого Т> происходило вытеснение парамагнитного аналога. Это сопровождалось исчезновением широких компонент, а также увеличением амплитуды и симметричности спектра ЭНР. Эффективность вытеснения возрастала при уменьшении концентрации комплекса и соотношения белок: меченый 'Г< в этом комплексе. Кроме того, два типа сигналов ЭПР по разному изменялись в ходе реакции восстановления иммобилизованного в белке нитроксильного радикала аскорбатом Ыа. Амплитуда крайнего низкополыюго экстремума в спектре малоподвижного радикала лишь незначительно уменьшалась в присутствии аскорбат-аниона. Восстановление слабо иммобилизованного зонда протекало интенсивно и практически не экранировалось белком.

Этот результат можно использовать как аргумент в дискуссии, которая на основе противоречивых данных уже давно ведется в литературе, относительно существования в ТСГ одного или двух центров связывания йодтиронинОв. Предлагаемая нами модель основывается на данных, впервые полученных с помощью физического метода, и включает высокоаФФинный "истинный" центр связывания парамагнитного лиганда, локализованный внутри глобулы, и низкоаффинный поверхностный участок связывания или неппецифической адсорбции спиновой метки.

Спектральные исследования Т1-связывающего центра_апоА-1-ЛВП.

Объектами исследования были различающиеся по содержанию липидов формы апоА-1: интактная субфракция ЛВГЬ , апоА-1-ЛВП и делипиди-рованный апоА-1 (23, 30, 31, 35].

Абсорбционные характеристики эквимолярного комплекса Т<-апоА-1-ЛВП 123] отличались от аддитивного спектра УФ-пог..->щения компонентов комплекса, что проявлялось в разностном спектре в виде широкой положительной полосы с максимумом в районе 310 нм и отрицательной полосы с минимумом при 270 нм. Отсутствие выраженных сигналов возмущенных электронных переходов триптофанилов и тирозилов, как это имеет место в комплексе Т<-ТСГ, дало основание предположить, что дазностный спектр комплекса Т«-апоЛ-1-ЛВИ Формируется в основном за счет изменения хромофорных свойств Т< в новом

микроокружении связывающего центра, в частности, из-за изменения степени ионизации Фенолыюго гидроксила. Такие же абсорбционные свойства имели комплексы Т< с апоА-1 И ЛВ1Ь .

Анализ спектров КД эквимолярных комплексов Т< с апоА-1, апоА-1-лвп и лыь в области амидного хромофора и ближнем ультрафиолете [23 1 покапал, что оптическая активность комплексов не зависит от липидного компонента, лиганд не индуцирует изменений во вторичной структуре белка и в микроокружении его ароматических хромофоров. Для сравнения отметим, что в комплексе Т«-ТСГ по данным спектроскопии КД образуется асимметричная оптически активная структура в области контакта боковых цепей аминокислотных остатков и молекулы лиганда. По-видимому, связывающий центр апоА-1 не создает асимметричного окружения для Т«, и образовавшийся комплекс имеет низкую стерео-специФичность.

Добавление Т« к апоА-1-ЛВП, апоА-1 и ЛВП» приводило к тушению триптофановой флуоресценции белка [231, причем в точках экви-молярности флуоресценция тушилась соответственно на 31, 32 и 34%. Только в случае апоА-1 изменение интенсивности флуоресценции сопровождалось сдвигом максимума испускания на 8 нм в длинноволновую область. В рамках механизма индуктивно-резонансного переноса энергии возбуждения от донора (остатки триптофана) к акцептору (молекула лиганда) в комплексе Т«-апоА-1 спектральный сдвиг можно объяснить преимущественным тушением флуоресценции триптофанилов, расположенных в гидрофобном окружении связывающего центра. Кроме того не исключается вклад конформационных изменений белка, индуцированных комплексообразованием и образующих новое микроокружение белковых хромофоров. Эти изменения третичной структуры полипептидной цепи могут ослабляться липидным компонентом в апоА-1-ЛВП и ЛВ1Ь и не проявляться в виде спектрального сдвига.

При взаимодействии спинмеченного Т« с препаратами апоА-1 происходило существенное изменение формы спектра ЭПР [31, 351. С ростом молярного соотношения белок : метка увеличивалось эффективное ьр«:мя вращательной корреляции и падала интенсивность низкопольного сигнала. С целью доказательства локализации аффинного спинового зонда в Т«-связывающем центре апоА-1, расположенном в глубине макромолекулы, были проведены два типа экспериментов: конкурентное вытеснение связанного Т.-N0- немодифированным Т« и восстановление нитроксильного Фрагмента связанной метки аскорбат-анионом.

Прибавление избытка Т« к комплексу Т»-N0- -апоА-1 приводило к восстановлению спектральных параметров, характерных для свободной формы метки в растворе. Обратимый характер изменений сигнала ОИР указывал на то, что наблюдаемые спектральные эффекты вызваны специфическим взаимодействием Т«-N0- с активным центром апоА-1, а не простой иммобилизацией спиновой метки в белковых агрегатах или неспецифических гидрофобных участках полипзптидной цепи.

Реакция восстановления нитроксила протекала для комплекса Т«-ыо-- апоА-1 значительно медленнее, чем для свободного Т<-N0- . Это предполагает наличие в апоА-1 полости, сформированной аминокислотными остатками, в которой молекула меченого лиганда частично экранирована от реакционноспособных компонентов растворителя. Вместе с тем сохраняющаяся активность аскорбат-аниона в отношении Т«-N0- , иммобилизованного в белке, говорит об относительно небольшой глубине залегания Т«-связывающего центра в белковой глобуле.

Д;.п оценки структурно-конформационных взаимодействий между ли-пиднып компонентом и белковым Т<-связывающим участком было проведено сравнительное исследование температурных зависимостей комллексо-образования Т«-N0- с апоА-1 и апоА-1-ЛВП и в том же температурном интервале с использованием парамагнитных доксилстеариновых кислот охарактеризовано поведение липидной части липопротеина (351. Присутствие липидного компонента вызывало низкотемпературный сдвиг на 1° излома на графике Аррениуса для зависимости спектральных параметров связанного Т<-N0- от температуры, обуславливало снижение эффективных значений энтальпии активации гормон-белкового комплекса и приводило к уменьшению подвижности иммобилизованной метки.

С методической точки зрения важно отметить тот факт, что параметры сигнала ЭПР 16-доксилстеариновой кислоты (С16) указывали на характерную для ЛВП интактную лилидную структуру апоА-*1-ЛВП, выделенного аффинной хроматографией. Форма и параметры спектра ЭПР 5-доксилстсариновой кислоты (С5), нитроксильный фрагмент которой должен локализоваться вблизи поверхности фосфолипидього монослоя апоА-1-ЛВП, свидетельствовали о высокой упорядоченности полярных липидов, свойственной всем классам интактных липопротеидных частиц.

Выявлено совпадение температурных режимов структурной перестройки белкового домена, включающего Т«-связывающий центр, 23®, и резкого уменьиения упорядоченности полярного липидного монослоя, 20-25°. В целом конформационные изменения белкового компонента находили больший отклик в полярной фосфолипидной зоне (глубина -8 А), чем в облиотм терминальных углеводородных звеньев фосфолипидов на глубине

лорядка 22 Л, куда способна погружаться парамагнитная группа С16. Поскольку прямое сопряжение между структурными изменениями апо-липопротеина и липидами гидрофобного ядра выявлено не было, можно считать, что наблюдаемые спектральные эффекты взаимодействия парамагнитных лигандов с апоЛ-1 объясняются локализацией Т.-связывающего центра в белковом домене; конформационно увязанным с поверхностным полярным монослоем липидного матрикса.

Использование в качестве репортерной метки флуоресцентного красителя родамина Б, присоединенного тиокарбамилыюй связью к молекулам Т4 и Т» (соединение 15, табл. 10), позволило проводить наблюдения за комплексообразонанием тиреоидных гормонов с апоЛ-1 и апоЛ-1-ЛВН в видимой части спектра [30]. Связывание флуоресцентных коныогатон с апоА-1 практически не изменяло параметры абсорбции и флуоресценции родаминового хромофора. Взаимодействие конъюгатов с апоА-Г-ЛВП вызывало существенное увеличение интенсивности и голубой сдвиг на 3 нм максимума поглощения, а также увеличение в 1,5 раза амплитуды полосы флуоресценции при 586 нм. Спектральные эффекты взаимодействия можно объяснить, исходя из известной модели, предусматривающей переход от свернутой ("Сандвичевой") структуры коньюгата к молекулярному состоянию, в котором обеспечивается свободное вращение фрагментов гормона и красителя без взаимодействия между ними. Нарушение Сандвичевой структуры происходит только при связывании конъюгата с липидсодержащим белковым препаратом. Этот результат согласуется с наблюдениями, сделанными с помощью коротковолновой флуоресцентной спектроскопии и ЭПР о том, что липидный компонент апоА-1-ЛВП вносит собственный вклад в механизм комплексо-образования тиреоидных гормонов с липопротеидными частицами.

Третью группу, соединений, применявшихся для аффинного зондирования области Т«-связывающего центра апоА-Х, составляли флуоресцентные зонды, не содержащие йодтирониновую структуру как таковую, но по своему пространственному строению ийитирующие тиреоидине гормоны. Молекулярные основы этого методического подхода были заложены ранее кристаллографическими исследованиями, которые показали, что молекула АНС обладает конформационной гибкостью и воплощает в ' себе псевдойодтирониновую пространственную структуру и кон-формацию метки-репортера природы белкового микроокружения. В развитие этого методического подхода широкий ряд производных АЛО и салицилата (соединения 16-21, табл. 10) был использованы, нага« для изучения структурных особенностей участка связывания в апоА-1 Г 361,

Относительная интенсивность флуоресценции, индуцированной связыванием зондов с апоА-1, падала в ряду АНС>ди-1(0Н)-АНС>0Н-азо-Анодийодсалицилат>нн1 -АНООН-АНОсалицилат, а величина гипсохром-ного сдвига максимума эмиссии уменьшалась в следующем порядке: AHC=NHa -АНО0Н-аз0-АНС>ди-К0Н)-АНс>0Н-АНС>дий0дсалицилат>салицилат. Ингибирующее действие зондов на комплексообразование между «•»»iJ Т« и апоА-l зависело от природы заместителей г. бензольном кольце (табл. IÓ>. Полученные данные указывают на то, что Т«-связывающий центр апоА-l сформирован в основном гидрофобными боковыми цепями аминокислотных остатков, включает химическую группировку, взаимодействующую с ионизированной ОН-группой и содержит полости, которые способны вместить атош йода, присоединенные к бензольному ядру молекулы лиганда.

Структурные элементы и топография Т»-связывающего участка 1ям. В предыдущей' главе (табл. 9) представлены данные, которые свиде-тельс гвуют о неожиданно сильном ингибирующем действии Nací, взятом в конце.гграциях, близких к физиологическим, на связывание Т« с igM. Чтобы ответить на вопрос о том, является ли ингибиторный эффект Nací уникальным свойством этой соли, а также для выяснения механизма ингибировання, мы изучили 133, 38) влияние натриевых солей неорганических кислот ' на комплексообразование между Т« и Ism. Для сравнения в параллельных экспериментах использовались мышиные моно-клональные антитела класса 1кн. Полученные результаты приведены в табл. II (33).

Как видно из таблицы анионы кислородсодержащих кислот не оказывают влияния на гормон-белковое связывание. Ингибирующее действие галогенид-ионов увеличивается в ряду F-<С1-<Вг-<1- и выражено гораздо более сильно для комплекса Т«-1вМ человека, чем для комплекса Т« с анти-Т< 1вМ одши.

Поскольку одними из главных характеристик, определяющими реакционную способность родственных химических элементов, являются раз-мери атома, в частности, кристаллический радиус по ^¿лову-Бокию и орбитальный радиус по Уоберу-Кромеру, мы провели корреляционный анализ зависимости ингибиторного эффекта галогенидов от их размеров. Рассчитанные нате* коэффициенты корреляции данных, включающих значения кристаллических или орбитальных радиусов, составили в обоих случаях 0,99. Таким образом, ингибиторный потенциал галогенидов в отношении' системы Т«-1*м строго определяется размерами аниона.

ТаОлица 11

Влияние некоторых анионов на связывание Т» с нормальным КМ человека и с моноклоналышм шгги-Т« ни нам

Концентрация аниона, Н

1вМ человека

анти-Т« 1«м мыши

С1-

НРО4»-, 301'-, яо«"-, N0, 0,035-0,5

0,035 0,07 О, И 0,21

0,5

0,035 0,07 0,14 0,21 0,5 '

0,035 0,07 0, 14 0,21 0,5

0,035

0,07

0,14

0,21

0,5

Вг-

I-

100

89 77 60 44

28

67 33 23 15 0

65 28 12 0 0

20 8 0 О О

100

100 100 100 100 100

96 92 86 77

75

92 84

76 66 59

73 59 50 44

35

Примечание. Максимальная величина связывания принята за ЮОХ

На основании высокой положительной корреляции между силой инги-бирующего воздействия галогенид-иона и его размером можно предположить, что ио!ш галогенов взаимодействуют со структурными элементами активного центра 1«м, комплементарными атомам йода Т«, и тем самым препятствуют комллексообразованию гормона с белком. Наиболее активны в этом отношении йодид-ионы - природные компоненты тиреоидных гормонов. В таком случае фторид-ионы из-за сноих малых размеров будут слабо взаимодействовать с йодсвязываюиими участками

I ем, и сила взаимодействия будет возрастать с увеличением размеров галогенида в ряду Р- <С1-<Вг- <I- . Именно такой порядок измг;н«ния силы ингибирумиего действия галогенид-иоиов выявлен в эксперимента.

Далее было изучено связывание Т« с 1км в условиях, когда специфические участки структуры 1вМ заняты другими белками 127, 38]. Результаты показывают, что блокирование тяжелых цепей, легких цепей обоих изотипов и углеводного компонента гцм приводит к уменьшению связывания Т« (табл. 12).

Таблица 12

Влияние макромолекул, блокирующих специфические участки структуры 1вМ, на Т«-связывающую активность 1йМ

Блокируемая Относительная Относительное

Макромолекула структура в 1*М концентрация связывание

макромолекулы (,,,ЦТ« с ^м

100 85 55 32 100 70

55 25 100 80 60 55 100 78 59 53

Примечания. За единицу концентрации приняты 1в расчете на 1 мг ¡ИМ): антитела - по 20 мкл (N11, I, яо, -фракции (ЗЗХ насыщения> коммерческих антисынороток к р-, Л- и х-цепям с титрами 1:1000; Кон А - 80 мкг.

Поскольку прямое участие олмгосахаридов во взаимодействии гликощютеинон с йодтиронинами и другими низкомолекулярными лигандами не описано в литературе, мы пропели кинетический эксперимент с целью выяснения механизма блокирующего действия КонА на связывание Т» с 1кМ.

Найдено, что диссоциация меченого гормона из тройного комплекса (1»• ПТ.-1йМ-КонА протекает значительно медленное, чем из бимолекулярного комплекса 11"1 I ]Т«-1(!М. Так, за 5 мин из бимолекулярного комплекса избытком р^диоинертного Т« било вытеснено 50* (1151]Т«, а из тройного - только 21*. Половина первоначально связанного ("'ПТ«

КонА

Олигосахариды

Анти-Н(р)

Лнти-Ь(Д)

Анти-МХ)

Г

-цепи

Ь-цепи А-типа

Ь-цепи Х-типа

0

1 5

10 0 1 22 4 0 1 2 4

0

1 2 4

диссоциировала в присутствии КонА лишь через 15 мин. Однако после 30 мин инкубации (выход кинетических кривых на плато) степень диссоциации обоих комплексов была одинаковой.

Так как аффинное блокирование IgM показало, что вклад в связывание Т< вносят главные структурные компоненты белка, а олигосаха-ридные цепи присутствуют в нескольких удаленных друг от друга доменах IgM, то вопрос о локализации Т« связывающего участка оставался открытым. Его решение требовало провести фрагментацию молекулы IgM и исследование свойств '■ыделенных фрагментов [27, 38). IgM был обработан трипсином, и после уравновешивания гидролизата с {"«ИТ« гель-хроматографией была выделена пептидная фракция, содержащая связанный меченый гормон. По данным ЭФ в ПААГ с Ds-Na главным (если не единственным) компонентом этой фракции был фрагмент F»»ji..

Мы определили сродство т» к выделенному F.tp по методу Скэтчарда и получили значение К,-7-10' м-1. ■ В параллельном эксперименте по связыванию Т« С коммерческим препаратом F.(Jackson Immunoresearch Lab.) было получено значение К. =2- 10' м-'.

В предыдущей главе мы уже обсуждагли в терминах равновесных параметров связывания вклады Н- и L-цепей в энергию комплексо-образования. Результаты экспериментов по взаимодействию Т« с комплексами IgM-белок также показывают, что 'в формировании гормон-связывающего центра в той или иной мере участвуют как Н-, так и L-цепи. В отношении вклада углеводного компонента IgM можно предположить, что блокирование олигосахаридных цепей не приводит к разрушению активной структуры Т«-связывающего центра, но создает стерические препятствия взаимодействию Т« с IgM за счет присоединения КонА по углеводсодержащему сайту, расположенному вблизи центра связывания тиреоидного гормона.

Выделение из триптического гидролизата IgM фрагмента F.»р , обладающего Т«-связывающей активностью, позволяет предположить, что Т«-связывающий центр локализован именно .в этой части интактной молекулы IgM. скорее всего основные вклады в Формирование области, в которой расположен Т<-связывающий центр, дают домен Ср I и соединенная с ним дисульфидным мостиком константная часть L-цепи. /Io»vîh С (л 1 содержит олигосахаридную цепь, пространственно приближенную к месту связывания Т« . Такое связывание происходит, по-види^му, на поверхности молекулы IgM и может экранироваться антителами к поверхностным эпитопам легкой и тяжелой цепей.

Предполагаемое местонахождение Т« -связывяжмего участка в паггн-нерной молекуле 1«М человека показано на рис. з [381.

Рис. 3. Предполагаемое расположение 7» -связывающего участка в 1Щ (показана одна из пяти идентичных мономерных единиц IgMI. Цифрами обозначены белки, проявляющие сродство к Гмм, а стрелки указывают на структурные компо-нты 1еН, блокирование которых аффинными макромолекулами инги-бирует связывание 1«м с Г« : 1 - анти-Ш/ч), 2 - анти-Ых+А), 3 - КонА

6. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ В СИСТЕМЕ IH VITKO, ВКЛЮЧАЩЕИ ТИРЕОКЦНЫЕ ГОРМОНЫ И ИХ НЕНБРА1ШЫИ РЕЦЕПТОР

Логическим развитием структурно-функциональных исследований многокомпонентной системы белков плазмы человека, связывающих тире-оидные гормоны, нам представлялось выяснение роли этих белков в механизме транспорта Ti и T« в ткани, специфичные для беременности. Известно, что при беременности у человека плацента является важным органом-мишенью тмреоидных гормонов. Ткани плаценты способны связывать и метаболизировать йодтиронины. В качестве биологической модели in vitro нами выбрана система, включающая тиреоидный гормон, связывающий белок крови и плазматические мембраны микроворсинок синцитиотрофобласта. В обоснование выбора объекта исследования важно отметить, что данная ткань представляет собой важнейшую составную часть плацентарного барьера, через который осуществляется обмен различными веществами ( в том числе и тиреоидными гормонами) между кровеносными системами матери и плода. На первом этапе исследований №< определили кинетические и термодинамические характеристики взаимодействия T« и его структурных аналогов с плазматическими мембранами плаценты в отсутствие транспортных белков крови 118].

Процессы связывания при 4 и 22® кинетически отличались весьма незначительно и через 30 мин достигалась максимальная величина специфического связывания 1,'Ч)Т$ мембранами. Рассчитанное значение к» при 22® оказалось равным 1,0-10'• М-»• мин-1. Процесс диссоциации комплекса ('»«ИТ» с мембраной, вызванный введением в систему

избнтка (1 мкМ) немеченого Т>, имел явно выраженный двухфазный характер. Для быстрой фазы (0-15 мин) к-1= 2,4- 10-1 мин-1. На основании полученного значения /с-1 вычислено время полужизни комплекса ti/1=2,9 мин. Анализ специфического связывания Т» с плазматическими мембранами в равновесных условиях показал, что гормон взаимодействует с двумя типами сайтов (табл.14). Т« проявлял на порядок более низкое с х>дство к связывающим сайтам, чем Т>. D-изомерн тиреоидннх гормонов очень слабо конкурировали с природными изомерами за места мембранного - связывания. Утрата молекулой структурных особенностей, характерных для йодтиронинов (3,5-дийодтирозин) полностью лишает ее сродства к плазматической мембране плаценты. Таким образом, связывание тиреоидных гормонов с плазматическими мембранами щеточной окаемки синцитиотрофобласта человека in vitro является насыщаемым, обратимым, чувствительным к температуре процессом, который характеризуется также высокой селективностью и стереоспецифичностью в отношении химического строения и пространственной структуры связываемых соединений. В последующих экспериментах предстояло выяснить, как протекает этот процесс в условиях, более близких к физиологическим, т.е. в присутствии транспортных белкоп плазмы крови 134].

В системе in vitro, включавшей меченый гормон и эндогенный рецептор Ti , иммобилизованный на плазматической мембране синцитиотрофобласта, высоко- и среднеффинные транспортные белки при концентрациях, близких к IU их комплексов с гормоном, оказывали пропорциональное концентрациям ингибирующее действие на связывание i"'I]T. или ['"ПТ. с мембранами (табл. 13) [34). Во избежание неспецифических эффектов концентрации транспортных белков в системе не превышали 10-«-10-' М, что ниже значений К< для низкоаДОмнных белков (120 и альбумин), которые, как видно из табл. 13, при изученных концентрациях не влияли на связывание гормонов с мембранами.

Таким образом, ингибирующее действие транспортных белков основано на распределении гормона между невзаимодействующими сайтами связывания, один из которых локализован в мембранном рецепторе, л другой - в транспортном белке. В соответствии с законом действующих масс доли распределенного гормона должны определяться значениями К« и концентрацией связывающих сайтов. По всей вероятности, 1*0 и 'Х;А проявляли бы ингибирующее действие при высокой содержании в биологической системе.

-иг- '

Таблица 13

Ингибируюцее действие некоторых транспортных белков сыворотки на специфическое связывание тиреоидных гормонов с плазматическими мембранами синцитиотрофобласта

Концентрация ! Связывание меченого гормона,

транспортного белка, ! фмоль на 1 мг мембранного белка

М-'

1"Ч1Т»

I1" 11Т.

ТСГ, ТСГ-1: 10-*>-10->> 10-'» 10-»

ТСПА: 10-'«-10-> ю-« ю-» ю-« АпоА-1-ЛВ11: 10- '«-10->• Ю-* Ю-» Ю-' ю-* 1*0: 10-'»-10-' ЧСА: 10-1 * -10- *

2,6+0,3 2,4+0,2 2,2+0,2 1,2+0,1« 0«

2,5+0,3 2,3+0,2 1,8+0,1» 0,4+0,04«

2,6+0,3 2,4+0,2 « 2,0 + 0,2» 1,0+0,05» 0,5+0,05«

2,5+0,3

2,6+0,3

1,5+0,1 1,2+0,1» '1,0+0,1« 0,7+0,04« 0«

1,6+0,2 1,2+0,1« 1,0+0,04« 0«

1,5+0,1 1,3+0,1 1,0+0,06« 0,7+0,05« 0«

1,5+0,1 1,5+0,1

Примечание. Приведены значения х±0 по результатам пяти независимых экспериментов. Звездочкой обозначены данные, достоверно (р<0,05) отличающиеся от контрольных (2,б±_о,3 и 1,5 ±0,2 фмоль/м1• для мембранного связывания I"' 11Т$ и С"Ч )Т,, соответственно, в присутствии 10-« М яичного альбумина). Все белки получены в чистом виде из ретроплацентарной сыворотки человека. Для очистки ЧСА использовали псевдоаффинную хроматографию на цибакрон г о ЗА-сефарозе С1.-4В, н ТСПА очищали по известной методике с помощью осаждения посторонних ' сывороточных белков фенолом, анионообменной хромато-г/ха</*<и и гель-фильтрации. Измеренные для этих двух белков значения сг*>дства к тиреоидным гормонам соответствовали литературным данным: К, • 7« 10* М-1 и 1-10' М-' для комплексов Т, к Тл с ЧСЛ, 7- 10' М- • и 1,4-10' Н-' для комплексов Г, и Т, с ТСПА.

Зависимооть мембранного связывания Т« от концентрации 1а» носила типичный для всех изученных белков характер (рис. 4, кривая 2). Аналогичная зависимость для Т> включала фазу стимулирующего действия 1вм (10-''-Ю-» М) и фазу ингибирования ПО-»-Ю-' М), причем эффект усиления связывания Т> с плазматическими мембранами был максимальным при концентрации белка 3-10-" Н (рис. 4, кривая 1) [341.

Рис. 4. Влияние различных концентраций 1еМ на специфическое связывание печеных тиреоидных гормонов с плазматическими менбрананами синцитиотрофобла-ста. Количества гормонов, связанных с мембранами в отсутствие ИМ, приняты за 100Х. 1 -[•"1]Т>; 2 - С"1]Т,

1СГ12 1^10 Ю-8 [|д м] ,М

С целью выяснения механизма стимулирующего действия 1«м мы измерили в одинаковых условиях равновесные параметры связывания Т« с мембранами в отсутствие 1*М и в присутствии этого белка в концентрации, обеспечивающей максимальный эффект (табл. 14) [341.

Таблица 14

Влияние 1*Н на равновесные параметры специфического связывания Т» с плазматическими мембранами синцитиотрофоСласта

1 < Система ! 1 К., , > • 10- , М-' В«.I<■> , ! фмоль/мг ! К.(II • 10-» , И" 1 В.•■( 11 ■ пмоль/нг

Т,/мембрана 3,9+0,8 3,5+0,6 4,011,1 27 »4

Т» /1«м/мембрана 1 ,810, 5 6,111.2 3.2*0,8 24*3

(р<0,05) (р<0,05) < р>0,05) (р>0,05)

Примечание. Концентрация 1йМ - 30 пМ. Приведены значения X* б по результатам пяти независима экспериментов.

1еМ практически не влиял на характеристики низкоаФФинного связывания, но вызывал статистически достоверные изменения параметров высокоаффинных мембранных сайтов. Остается сделать вывод о том, что наблюдаемое увеличение количества связанного мембранами (1'* I)Т> в присутствии 1вМ (рис. 4 1 обусловлено индуцированным 1гМ увеличением концентрации высокоаффинных мест.связывания, хотя и при некотором снижении их сродства к Т> (табл. 14).

Исходя из значения Не комплекса 1вМ-Т» (1,4-10-' М [26)), следует исключить возможность предварительного образования этого комплекса в жидкой фазе системы, содержащей 30 пМ 1вМ и 10-100 пМ Т1, с последующей его специфической иммобилизацией на плазматических мембранах синцитиотрофобласта. В таком случае изменение параметров связывания Т> с мембранами должно вызываться или прямым воздействием I«м на компетентные мембранные структуры, или собственной Т1-связывающей активностью иммобилизованного ^м. И тот, и другой механизмы могли действовать только в результате связывания самого 1вМ с плазматическими мембранами.

В наших экспериментах 1341 выявлено зависимое от времени специ-' фическое связывание (»*»I>1вМ с плазматическими мембранами, которое достигало максимума через 2,5 ч инкубации при комнатной температуре. Доля связанного ¡>"l}lgt1 возрастала от 2,5 до 8,ОХ с увеличением концентрации общего мембранного белка в системе в диапазоне 25-300 мг/л, а затем не изменялась с ростом этой концентрации вплоть до 500 иг/л. Денатурация мембран путем кипячения в течение 10 мин, а также в результате многократных циклов замораживания-оттаивания или продолжительного (3-5 сут) хранения при 2-8» в значительной степени или полностью ингибировала связывание [1 *11)1км. Аналогичное инактиви-рующее действие оказывало хранение I>''I) 1йМ в течение 2-4 сут на холоду или его термическая обработка при 80° в течение 30 мин. В этих условиях 1йМ* в существенной степени теряет т«-связывающую активность, и можно было предположить, что тиреоидные гормоны способны регулировать взаимодействие с мембранами. Однако присутствие в системе Т» или Та (Ю-»»-10-' М) не сказывалось на количестве (,,,1Ц«М, связанного с плазматическими мембранами. ТСГ, ТОПА, апоА-1-ЛВИ, 1в0 и ЧСА, взятые в концентрациях вплоть до 10-' М, также не влияли на взаимодействие [11511 1йМ с мембранами.

Инкубация в течение 2,5 ч мембран с возрастающими количествами 1«м показала, что связывание имеет насыщаемый характер. В результате компьютерной обработки экспериментальных данных найдено, что пара-

метры комплексообразования соответствуют модели связывающих сайтов двух классов со значениями Kn( i> =5,0- ю» М-'. Ка<, > =2,7-10' И-' и li...(i>=34 фмоль/мг, В...1 i)=2,0 пмоль/мг мембранного белка.

Специфическое взаимодействие IeM с мембранами могло по неясному пока механизму изменять рецепторнне свойства мембран по отношению к Ti без проявления иммобилизованным IgM сродства к Т>, присутствую--цему в жидкой фазе системы. С другой стороны, известно, что IgM способен выполнять рецепторные функции на поверхности клеток, в частности, В-лимфоцитов. Возможно, IgM в мембранном комплексе с собственным рецептором изменяет свои йодтиронинсвязывающие свойства таким образом, что приобретает способность связывать T» со сродством, менее чем на порядок величины уступающим сродству "истинного" рецептора к Ti. Этим можно объяснить достоверное снижение в присутствии IgM общей К. мембранного связывания Ti (табл. 14), которую трудно разложить на составляющие в результате обработки экспериментальных данных. Вместе с тем при концентрации IgM, обеспечивающей максимальный стимулирующий эффект на связывание Ti с мембранами (30 пМ), менее половины высокоаффинных мембранных сайтов для IeM окажутся заполненными белком (К«=200 пМ). Эксперимент показывает, что из зо фмоль IgM, приходящихся в системе на 1 мг мембранного белка, около 8* специфически связывается с плазматическими мембранами микроворсинок, что составляет около 2,4 фмоль IgM/мг мембранного белка. Интересно отметить, что и содержание высокоаффинных Т>-связывающих сайтов на мембранах в присутствии IgM возрастает почти на такую же величину (табл. 14). , .

Можно сделать вывод о том, что связывание T» и T« с плазматическими мембранами микроворсинок синцитиотрофобласта человека избирательно регулируется концентрацией IgM, присутствующего в системе In vitro. Стимулирующее действие IgM на мембранное связывание Ti обусловлено скорее всего возрастанием числа Ti-связывающих мест на мембранах за счет образования комплекса IgM-рецептор IgM, проявляющего повышенную T«-связывающую активность.

Инертное поведение других изученных белков в процессе гормон-мембранного связывания, может обуславливаться отсутствием их взаимодействия с данным препаратом мембран в конкретных условиях эксперимета. Или же можно сделать вывод о том, что большинство активных в отношении^других тканей T«(Т»)-связывающих белков сыьо-ротки не участвуют в доставке тиреоидных гормонов в плацентарную ткань.

46В недавних работах других авторов стимулирующие эффекты Оылп описаны для некоторых йодтиронинсвязывающих белков. 'Гак, ТОГ усиливал захват Т« периферическими моноядерннми клетками крови человека за счет интернализации тройного комплекса 'Г» - Г01'-мембранный рецептор ТОГ". Транстиретин человека, связываясь со специфическими сайтами на поверхности гепатомных клеток Hep 02, п 1,5 раза увеличивал количество Т«, поглощенного клетками из культуральной среды. Линопротеин низкой плотности за счет взаимодействия с мембранными рецепторами аполипопротеина В-100 на поверхности фибробластов кожи человека обеспечивал дополнительный путь проникновения связанного с ним Т< внутрь клетки.

На основании анализа собственных и литературных можно предположить, что каждый отдельный Т»-связывающий белок выполняет специализированную функцию по доставке одного из двух тиреоидных гормонов в специфическую ткань. В этом и может состоять биологический смысл существования в плазме крови человека многокомпонентной системы Т«-связывающих белков, важные представители которой изучены в настоящей работе. Эти белки не обладают генетическим родством, отличаются по физико-химическим' свойствам и выполняют- различные основные или дополнительные биологические функции. Их объединяет участие в термодинамическом равновесии со свободными гормонами и наличие обособленных активных центров, комплементарных природным йодтирони-нам и, следовательно, содержащих близкие по строению элементы структуры. Разнообразие транспортных белков и компетентных тканей в организме человека дает широкий простор биомедицинским исследованиям, результаты которых должны появиться уже в ближайшем будущем. Кроме того, поскольку многие компоненты системы Т«-связывающих белков участвуют в целом ряде хорошо изученных физиологических процессов, казалось бы, не имеющих прямого отношения к метаболизму йодтиронинов, интересно будет выяснить влияние, связанного тиреоид-ного гормона на эти процессы.

DlffiOJSJ

1. Впервые показано, что аффинная матрица с оптимальной длиной пространственной вставки между иммобилизованном Т< и сефарозой, биоспецифически адсорбирует ранее неидентифицированные белки 25К и 80/27К, а также тироксинсвязывающий глобулин и альбумин из нормальной и ретроплацентарной сывороток крови человека.

2. Найдено, что белок -0/27К является иммуноглобулином И, а белок 2 5К представляет собой липопротеин высокой плотности с молекулярной массой около 70 кДа, содержащим аполипопротеин A-I в качестве единственного белкового компонента.

3. Предложены новые способы очистки ТСГ, апоА-I и IgM.

4. Показано, что ТСГ-1, выделенный лектин-аффинной хроматографией чистого ТСГ ретроплацентарной сыворотки, не отличается от ТСГ нормальной сыворотки по характеристикам полипептидной цепи, но имеет специфические моносахаридный состав и микрогетерогенную структуру и увеличенное время жизни в кровообращении.

5. Найдено, что ТСГ-1 является минорным Т«-связывающим компонентом плазмы в норме, в относительно высоких концентрациях присутствует в организме при беременности и в поздний послеродовый период и содержатся в плазме людей со злокачественными новообразованиями различной локализации и заболеваниями печени.

6. Взаимодействие Т« с апоА-I и иммуноглобулинами различных классов является обратимым, насыщаемым и чувствительным к специфическим ингибиторам и денатурирующим агентам процессом. По сродству к тиреоидному гормону все изученные белки можно условно разделить на три группы: низкоаффинные (led, IgA, белки Бенс-Джонса; 1С,-10» М-'), среднеаффиные (anoA-I-ЛВП и IgM; К.-10'-10« М-») и высокоаФ1>иные (ТСГ и ТСГ-1; К.-10»-10" М->).

7. Одинаковые по строению активные центры ТСГ и ТСГ-1 обладают стереоспецифичностью, локализованы внутри белковой глобулы и включают кластер ароматических аминокислотных остатков, взаимодействующий с ароматическими кольцами тиронина.

8. Тироксинсвязывающий центр апоА-1-ЛВП содержит химическую группировку, взаимодействующую с ионизированной ОН-группой Феноль-ного кольца Т<, включает полости, способные вместить атомы йода молекулы лиганда, имеет гидрофобную природу и низкую стерео-специфичность, расположен у поверхности белковой глобулы в дотнв, конформационно связанном с поверхностным полярным МОНОСДО«!М дипид-ного компонента.

-489. Показано, что T«-связывающий IgM не является анти-T« ауто-антителом, а принадлежит к нормальным транспортным белкам плазмы. В IBM участок связывания T« находится вне вариабельных областей фрагмента Fakjt, в его формировании участвует домен Ср1 тяжелой цепи и соединенная с ним дисульфидным мостиком константная часть легкой цепи. Ti-связывающий центр, расположенный в этой области, не обладает стереоспецифичностыо и содержит структурные элементы, комплементарные атомам йода внешнего кольца и алифатической цепи молекулы йодтиронина.

И. Найдено, что T«-связывающие белки при концентрациях, близких к К< их комплексов с тиреоидными гормонами, оказывают ингибирукхцее действие на рецепцию обоих гормонов плазматическими мембранами микроворсинок синцитиотрофобласта человека. В отличие от других белков IgM при низких концентрациях стимулирует мембранное связывание Т». сам IgM специфически взаимодействует с мембранами, что приводит к увеличению числа T«-связывающих мест в плацентарной ткани.

12. Изучено поведение тиреондных гормонов и связывающих белков сыворотки человека в радиоиммунологических системах. Осуществлена стандартизация реагентов и методик и на этой основе созданы и внедрены в производство наборы реактивов, предназначенные для комплексной диагностики тиреоидных заболеваний и скриннинга гипотиреоза новорожденных.

Все результаты диссертационного исследования опубликованы в следующих обзорной и оригинальных статьях (38), брошюрах (4), тезисах докладов (20) и описаниях к авторским свидетельствам (14)-.

1. Свиридов О. В. Новое свойство известных белков - специфическое связывание тиреоидных гормонов аполипопротеинами плазмы человека (обзор(//Биохимия.-1994.-Т. 59, N 5.-С. 625-638.

2. Акh Гош A.A., Avvakuaov O.V., Sviridov О. V. , Strel'chyonok O.A. Analyste of Bethyl glycosides as their trinethylsilyI ethere: on column re-N-acetylation and improved gas-liquid chromatographic afparat ion//J. Chromatogr.-1978.-V. 166.-P. 123-131.

3. Ермоленко ti.II., Свиридов O.B., Стрельченок O.A. Сравнительная характеристика молекулярных разновидностей тироксинсвязывающего глобулина человека//Биохимия.-1985.-Т. 50, N 12.-С. 1997-2002.

♦ . Крупснко С. А., Бабынина Н.Д., Свиридов О.В., Стрельченок O.A. Радиоиммунологическая система для количественного определения тироксина в сыворотке крови человека//Антибиотики и мед. биотехмол.-1986.-N 1.-С. 31-37.

-495. Крупенко С.А., Деркач Т.Л., Свиридов О.В.. Стрельченок O.A. Радиоиммунологическая система для количественного определения триПодтиронина в сыворотке крови человека//Нед. радиол.-1986.-N 2.-С. 56-60.

6. Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Радиоиммунологическое определение молекулярной разновидности тироксинсвязывающего глобулина//Мед. радиология.-1986.-N 6.-С. 50-54.

7. Будникова J1.П., Еркс -,енко H.H., Свиридов О.В. Взаимодействие тиреоидных гормонов и их структурных аналогов с молекулярной разновидностью тироксинсвязывающего глобулина//Ред. журн. Весц1 АН БССР, сер. xiM. н. -Минск, 1986.-11 с.-Деп. в ВИНИТИ 24.11.86, N

7998-В 86.

8. Ермоленко H.H., Карпыэа E.H., Свиридов О.В. Содержание молекулярной разновидности тироксинсвязывающего глобулина в крови челове-ка//Пробл. эндокринол.-1987.-Т. 33, N 4.-С. 31-34.

9. Свиридов 0.В., Ермоленко 'H.H. Спектральные характеристики тироксинсвязывающего глобулина человека и его комплексов с тирок-сином//ВесЩ АН БССР, сер. XiM. H.-1987.-N 5.-С. 59-64.

10. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Карпыза Е.И., Стрельченок O.A. Новый тироксинсвязывающий белок в крови человека//Ред. журн. Весц! АН БССР, сер. 61ЯЛ. il.-Минск, 1987.-11 с.-Деп. в ВИНИТИ 02- 10.87, N 7106-В 87.

11. Свиридов 0.В., Ермоленко H.H., Чейкина A.B., Марцев С.П. Влияние структурных изменений тироксинсвязывающего глобулина на его биологическую активность и иммунохимические свойства//Биохимия.-

1988.-Т. 53, N 1.-С. 61-68.

12. Свиридов 0.В., Киселева Э.Э., Карпыза Е.И., Ермоленко H.H. Различные скорости катаболизма нормального и связанного с беременностью вариантов тироксинсвязывающего глобулина человека//Докл. АН БССР.-1989.-Т. 33, H 1.-С. 89-91.

13. Свиридов 0.В., Ермоленко H.H., Стрельченок O.A. Новые аспекты выделения и очистки тироксинсвязывающего глобулина из биологических жидкостей человека//Биохимия.-1989.-Т. 54, N З.-С. 496-502.

14. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Будникова Л.П., Карпыза Е.И. Тироксинсвязывающий глобулин и его молекулярная разновидность в амниотической жидкости человека//Пробл. эндокринол.-1989.-Т. 35, н 2.-С. 48-52.

15. Свиридов О.В., Киселева Э.Э., Ермоленко H.H. Обнаружение связанного с беременностью молекулярного варианта тироксинсвязывяюцего глобулина в позднем послеродовом периоде у человека//Докл. All FiCCP.-

1989.-T. 33, N 10. С. 940-943.

16. Свиридов O.B., Ермоленко H.H., Вашкевич И.И., Аввакумов Г.В. Применение иммобилизованного конканавалина А для разделения ' и количественного определения молекулярных разновидностей гор^нсвя-зывающих гликопротеинов крови человека/Изучение и применение лек-тинов. Т. 1. Тарту, 1989.-С. 192-196.

-5017. Устинович A.K., Зубович B.K., Колб В.Г., Данильчик B.C., Домбровский В.Ю., Панферов В.¡1., Воскресенская Т.В., НазурВ.А., Черевко А.И., Свиридов О.В., Стрельченок O.A. Опит использования лабораторных методов комплексной оценки состояния здоровья новорожденных//Лаб. дело.-1990.-N З.-С. 74-76.

18. Карниза Е.И., Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Характеристика специфического связывания тиреоидных горюнов с плазматическими мембранами синцитиотрофобласта плаценты человека//Вопр. мед. химии.-

1990.- Т. 36, N З.-С. 45-48.

19. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Стрельченок O.A. Новый метод выделения и очистки аполипопротеина A-I плазмы крови человека//Докл. АН БССР.-1990.-Т. 34, N 10.-С. 947-950.

20. Свиридов О.В., Киселева Э.Э., Ермоленко H.H., ШилкоА.Н., Бородина Е.И. Молекулярные варианты тироксинсвязывающего глобулина и концентрации ряда гормонов в крови в послеродовом периоде//Пробл. эндокринол.-1990.-Т. 36, N 5.-С. 28-32.

21. Свиридов О.В., Ермоленко М.Н., Пышко Е.С., Карпова Т.В., Стрельченок O.A. Аффинная хроматография тироксинсвязывающих белков сыворотки крови человека//Биохимия.-1990.-Т. 55, N 2.-С. 329-337.

22. Свиридов О.В., Пышко Е.С., Ермоленко H.H., Стрельченок O.A. Специфическое ввязывание йодтиронинов с аполипопротеином A-I в составе липопротеидных частиц высокой плотности, выделенных из сыворотки человека аффинной хроматографией на тироксин-сефарозе// Биохимия.-1990.-Т. 55, N И.-С. 2002-2010.

23. Свиридов 0.В., Ермоленко H.H., Пышко Е.С., Халимончик C.B., Гуринович H.A., 1Романов С.Л,, Киселев П.А., Стрельченок O.A. Выделение, идентификация и свойства нового тироксинсвязывающего белка - аполипопротеина A-I сыворотки крови человека//Биохимия.-

1991.-Т. 56, N 12.-С. 2281-2296.

24. Киселева Э.Э., Ермоленко H.H., Шитиков Б. Д., Кошелева H.H., Свиридов О.В., Стрельченок O.A. Связанная с беременностью молекулярная разновидность тироксинсвязывающего глобулина в норме и при некоторых заболеваниях у человека//Пробл. эндокринол.-1991.-Т. 37,

N З.-С. 20-22.

25. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Халимончик C.B., Стрельченок O.A. Тироксинсвязываххций белок 80/27К идентичен иммуноглобулину M плазмы крови человека//Докл. АН Беларуси.-1992.-Т. 36, N 2.-С. 176-180.

26. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Карпыза Е.И., Стрельченок O.A.

О ранее не известном свойстве нормального иммуноглобулина M человека - способности специфически связывать тиреоидине гормоны//Докл. АН Беларуси.-1992.-Т. 36, N 3-4.-С. 274-277.

27. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Халимончик C.B., Карпыза Е.И., Стрельченок O.A. О локализации тироксинсвязывающего участка в молекуле нормального иммуноглобулина M человека//Докл. АН Беларуси.-

1992.-Т. 36, N 9-10.-С. 846-850.

28. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Карпыза Е.И. Тироксинсвязывающий иммуноглобулин М, выделенный из сыворотки крови человека: ауто-пнтитело или нормальный транспортный белок?//Иммунология.-1992.-N 4. -С. 15-17.

-5129. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Карниза Е.И. О роли легких и тяжелых цепей нормальных иммуноглобулинов человека в связывании тире-оидных гормонов//Иммунология.-1992.-Ы 5.-С. 14-17.

30. Ермоленко H.H., Фильченков H.A., Свиридов О.В. Конъюгаты тире-оидных гормонов с • родамином Б как флуоресцентные лиганды транспортных белков плазмы крови человека//Биохимия.-1992.-Т. 57, N 8.-С. 1271-1277.

31. БовдеП H.A., Свиридов О.В., Киселев П.А. Сравнительное исследование свойств тироксинсвязывающих центров ТСГ и аполипопротеина А-1 человека методом спинового зонда//Журн. прикл. спектроскопии.-1992.-Т. 57, N 3-4.-С. 315-321.

32. Бокун А.И., Карниза E.H., Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Ингиби-рующее действие галогенидов на связывание тироксина нормальным иммуноглобулином М человека//Ред. журн. Иммунология.-М., 1993.-8 с,-Деп. в ВИНИТИ 7.06.93, N 1543-В.

33. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Бокун А.И., Карниза Е.И. Влияние солей неорганических кислот на комплексообразование между тироксином и нормальным иммуноглобулином М человека//Весц! ЛИ Беларуси, сер. XiМ. H.-1993.-N 4.-С. 53-57.

34. Карниза Е.И., Киклевич И.Е., Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Стимулирующее и ингибирующее действие индивидуальных транспортных белков сыворотки крови на связывание тиреоидных гормонов с плазматическими мембранами плаценты человека//Биохимия.-1993.-Т. 58, N 2. -С. 285-29 J.

35. Бовдей H.A., Свиридов О.В., Киселев H.A. Структурные изменения липидной и тироксинсвязывающей белковой зон липопротеиновых частиц, содержащих аполипопротеин А-1 человека//Биохимия.-1993.-Т. 58, N 5,-С. 707-715.

36. Нышко Е.С., Фильченков H.A., Свиридов О.В. Исследование свойств тироксннсвязывающего центра в аполипопротеине А-1 человека с помощью флуоресцентных зондов, имитирующих природные лиганды//Журн. прикл. спектроскопии.-1993.-Т. 59, N 3-4.- С. 305-311.

37. Свиридов О.В., Ермоленко H.H. Взаимодействие тиреоидных гормонов .с иммуноглобулинами, выделенными из сыворотки крови человека. I. Параметры комплексообразоввания и природа реакции связывания//Био-ХИМИЯ.-1994.-Т. 59, N 1.-С. 78-87.

38. Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Взаимодействие тиреоидных гормонов с иммуноглобулинами, выделенными из сыворотки крови человека. II. Структурные элементы и локализация тироксннсвязывающего участка в молекуле иммуноглобулина М//Биохимия.-1994.-Т. 59, н 1.-С. 88-95.

39. Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Круненко С.А., Бабыиина Н.Д., Касаткин Ю.Н., Аметов A.C. Набор реактивов для радиоиммунологического определения тироксина в сыворотке крови челоел-ка//Инструкция по применению.- Ин: Полымя, 1985.-6 с.

40. Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Крупенко С.А., Деркач Т.А., Аметов A.C. Касаткин Ю.Н. Набор реактивов для радиоинмунологического определения трийодтиронина в сыворотке крови человека//Инструкция по применению.-Ин: Полымя, 1985-.-6с.

«1. Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Сельскова E.H., Пышко Е.С., Аметов A.C., Касаткин ЮЛ. Набор реактивов для радиоиммунологического определения тироксина в сыворотке крови человека, рио-Т«» » 1-М //Инструкция по применению".-Мн: Полымя, 1988.-бс.

42. Чаш<н В.Л., Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Марцев С.П., Ермоленко H.H., ЧеЯкина A.B., Цапелик Г.З., Новик Н.Г., Касаткин Ю.Н., Аметов A.C. Набор реактивов для радиоиммунологического определения тироксинсвязывающего глобулина в сгаоротке крови человека с использованием ТСГ, меченного йодом-125 и преципитирующего реагента, рио-ТСГ-М//Инструкция по применению.-Мн: Полымя, 1990.-6 с.

43. Свиридов О.В., Крупенко С.А., Прядко А.Г., Вашкевич И.И. Иммуно-химический анализ стероидных и тиреоидных гормонов, меченых радиоактивными изотопами//В сб.: I Всесоюзное совещание по проблеме "Биологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами", тезисы докладов, М., 1985.-С. 13.

44. Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Стрельченок O.A. Молекулярные разновидности тироксинсвязывающего глобулина человека//В сб.: v Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов, М.: Наука, 1986.-С. 119-ПО.

45. К>упенко С.А., Свиридов О.В. Радиоиммуунологические системы для определения тиреоидных гормонов//В сб.: XV Международный симпозиум стран-членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам и наборам для радиоиммунологического анализа. Тезисы докладов, Обнинск, 1986.-

С. 100.

46. Марцев С.П., ЧеЯкина A.B., Свиридов О.В., Ермоленко H.H. Набор реактивов для радиоиммунологического определения тироксинсвязывающего глобулина в сыворотке крови человека//Там же [45].-С. 101.

47. Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Аввакумов Г.В., Сурвило Л.И., Ермоленко H.H., Вашкевич И.И. Хроматографическое разделение трех специфических гормонсвязывающих белков крови человека//В сб.: Международный симпозиум "Хроматография в биологии и медицине". Тезисы докладов, М., 1986.-С. 65-66.

48. ЗубовичВ.К., Устинович А.К., Мазур В.А., Стрельченок O.A., Свиридов О.В., Черевко А.Н. Использование тест-систем для исследования функции дотовидной железы у детей раннего возраста//

В сб.: v Съезд педиатров БССР " Медицинские аспекты воспитания здорового ребенка, специфическая и неспецифическая профилактика и лечение заболеваний у детей". Тезисы докладов, Гродно, 1987,-С. 33-34.

49. Зубович В.К., Мазур В.А., Свиридов О.В., Черевко А.Н. Дигности-ческая тест-система для определения тироксина в сухом пятне крови// В сб.: Международный симпозиум " Проблемы развития работ по лабора-торно-диагностической технике". Тезисы докладов, Смоленск, 1988.-С. 50-51.

50. Ермоленко H.H., Пышко Е.С.,' Свиридов О.В. Спектральные эффекты комплексообразования тиреоидных гормонов с белками плазмы крови человека//В сб.: VI Конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов, Харьков, 1988.-С. 121-122.

51. Свиридов О.В., Стрельченок O.A. Многокомпонентная система белков плязмн кропи человека, связывающих тиреоидные гормоны//В сб.: III Всесоюзный съезд эндокринологов.Тезисы докладов,Ташкент,1989.-С. 13.

-5352. Карпыза Е.И., Метелица Е.А., Ермоленко H.H., Свиридов О.В. О роли связывающих белков плазмы крови человека в процессах взаимодействия тиреоидных гормонов с клетками и субклеточными структурами //В Сб.: Всесоюзный симпозиум "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторнне клетки".Тезисы докладов.Суздаль,1989.-С. 75.

53. Ермоленко H.H., Карпыза Е.И., Будникова Л.П., Киселева Э.Э., Свиридов О.В. Молекулярная разновидность тироксинсвязывающего глобулина человека: стр-'ктурные, физиологические и медицинские аспекты//В сб.: Всесоюзны», симпозиум "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии". Тезисы докладов, М., 1989.-С. 19-20.

54. Свиридов 0.В., Ермоленко H.H., Стрельченок O.A. Новые тироксин-связывающие белки крови человека//Там же 1531.-е. 57.

55. Свиридов 0. В., Ермоленко H.H., Пышо Е.С., Стрельченок O.A. Связывание тиреоидных гормонов - новая биологическая функция аполи-попротеина A-I//B сб.: Всесоюзный симпозиум "Химия белков". Тезисы докладов, Пущино, 1990.-С. 7.

56. Ермоленко H.H., Карпыза E.H., Киселева Э.Э., Халимончик C.B., Свиридов О.В. Тироксинспязывающий иммуноглобулин M человека: выделение, идентификация и биологическое действие//Там же [55).-С. 55.

57. Свиридов 0.В., Ермоленко H.H., Карпыза E.H., Киселева Э.Э., Стрельченок O.A. Тироксинсвязывающий иммуноглобулин И человека как возможный модулятор рецепции тиреоидных гормонов//В сб.: Всесоюзный симпозиум "Биохимия рецепторных систем". Тезисы докладов, Таллинн, 1990.-С. 58-59.

58. Ермоленко H.H., Пышо Е.С., Халимончик C.B. Электрофоретическое радиотестирование иммунизированных мышей как аналитический этап биотехнологии получения моноклоналышх антител к гаптенам//В сб.: Всесоюзная конференция "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Тезисы докладов, М., 1990.-е. 24.

69. Svjridov О.V., Rrmolenko M.N., Karpyza В.I., StrnI'chyonok O.A. Human thyroid hormone- binding IgM: isolation from human eerua, binding properties and effects on thyroid hornone interaction with plasma metabranes of huraan placenta//In: 73rd Annual Meeting of Aaerican Endocrine Society. Abstracta, Washington, 1991.-P. 337.

60. Гуринович H.A., Свиридов O.B., Киселев П.А. Молекулярные аспекты комплексообразования тироксина с аполипопротеином A-I человека и конформационная динамика белка по данным спектроскопии 0ПР//В сб.: vu Конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов, Харьков, 1991.-С. 76-77.

61. Романов С.Л., IIwíko Е.С., Ермоленко H.H., Свиридов О.В. Исследование молекулярных механизмов взаимодействия аполипопротеина A-I человека с тиреоидными гормонами методами Флуоресцентной спектроскопии/Там же [60].-С. 205-206.

62. Sviridov О.V., Strel'chyonok O.A. Huían iaaunoglobulin M а» a novel iodothyronine-binding protein and » sodulator of the o«ll receptor binding of thyroid horeonea//In : II Russian-Israel » y tipos iua on peptides and proteins. Abstracts, Moscow, 1992.-P. 16.

-5463. A.c. СССР N 1280834, МКИ о Ol N 33/50 // с 07 G 7/02. Активированная матрица для иммобилизации белков/Зе/шк A.A., Свиридов О.В., Стрельченок O.A., Ахрем A.A. (1981 г.).

64. A.c. СССР N 1281005, МКИ О 01 N 33/50. Сорбент для связывания тироксина/Аягрем A.A., Стрельченок O.A. .Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Аввакумов Г.В. (1981 г.).

65. A.C. СССР N 1100846, МКИ С 07 D 207/404. N-оксисукцинимидные эфиры N-ацетилгирониноп в качестве полупродуктов для синтеза конъюгатов тиреоидных гормонов с алъбумином/Мэгвееш/ев В. Д., Свиридов 0.В., Стрельченок O.A., Ахрем A.A. (1983 г.).

66. A.C. СССР N 1121931, МКИ С 07 С 103/52 // А 61 К 37/02. Конъюгаты тиреоидных гормонов с альбумином для выработки антител к тиреоидным гормонам у животных/Иагвее/щев В.Д., Свиридов О.В., Стрельченок O.A., Ахрем A.A. (1983 г.).

67. A.c. СССР N 1128569, МКИ С 07 0 07/00. Способ выделения тироксинсвязывающего глобулина/Ермоленко H.H., Свиридов О.В., Чащин В.Л., Ахрем A.A., Стрельченок O.A. (1983 г.).

68. A.c. СССР N 1256749, МКИ А 61 К 39/00 // G 01 N 33/534. Состав для радиоиммунологического определения трийодтиронина в сыворотке кроги человека/Крупенко С.А., Деркач Т.А., Свиридов О.В., Пивень H.A., Стрельченок O.A. (1984 г.).

69. A.c. СССР n 1256750, МКИ а 61 к 39/00. Состав для радиоиммунологического определения тироксина в сыворотке крови человека/ Крупенко С.А., Пивень Н.В., ■Бабынина Н.Д., Свиридов О.В., Стрельченок O.A. (1.984 г.).

70. A.c. СССР N 1338603, МКИ о 0! N 33/53. Состав для радиоиммунологического определения тироксинсвязывающего глобулина в сыворотке крови человека/Свиридов О.В., Ермоленко H.H., Нарцев С.П., Чейкина A.B., Пивень Н.В. (1986 г.).

71. A.c. СССР N 1374934, МКИ G 01 N 33/50. Способ определения имму-нореактивности соединений, меченных радиоизотопами/Кдулеяко С.А., Прядко А.Г., Свиридов 0.В., Стрельченок O.A. (1985 г.).

72. a.c. СССР n 1448894, мки о 01 n 33/74. Способ очистки тиреоидных гормонов, меченных йодом-1 гь/Ермоленко H.H., ПышоЕ.С., Свиридов 0.В., Стрельченок O.A. (1987 г.).

73. A.c. СССР N 1459185, МКИ С 07 В 59/00 // С 07 С 103/76. Меченные йодом-125 производные тироксина в качестве реагентов для радиоиммунного анализа и производные тироксина в качестве промежуточных соединений .для получения меченых производных тирогпина/Бабынина Н.Д., Ермоленко H.H., Колесникова И. Н., Крупенко С.А., Натвеенцев В.Д., Нншш В.И.. Свиридов О.В. ( 1987 г.).

74. A.c. СССР N 1484094, МКИ 0 01 N 33/5*3. Способ очистки.антител к тиреоидным гормонам/Ермоленко H.H., .Пышко Е.С., Свиридов О.В., Стрельченок O.A. (1987 г.).

75. A.c. СССР N 1607578, МКИ G 01 N 33/531. Способ получения радиопрепарата для радиоиммуноанализа тироксина/Лыико Е.С., Лковец В.И., Свиридов О.В., Стрельченок 0./1. (1988 г.).

76. A.c. СССР N 1614658, МКИ G 01 N 33/531. Способ получения радио-преплрата для радиоиммуноанализа тироксинсвязывающего глобули-. ш/Бессараб И-Н-, Новик Н.Г., Свиридов О.В. ( 1988 г.).

Я благодарю академика АНБ Стрельченка O.A. за интерес к этой работе и полезные для меня критические замечания. Выражаю глубокую признательность доктору химических наук Киселеву П.А., кандидатам химических наук Ермоленко H.H. и Матвеенцеву В.Д., научному сотруднику Бовдей H.A., младшим научным сотрудникам Карпызе Е.И., Пышко Е.О., Халимончику C.B., Фильченкову H.A. и другим сотрудникам ИБОХ АНБ за участие в совместных исследованиях, без проведения которых автор не смог c.i выполнить данную работу в полном объеме и на необходимом уровне. Я очень благодарен профессору Джекобу Робинсу из Национальных институтов здоровья США за помощь в планировании некоторых экспериментов и предоставленную мне возможность ознакомиться с его огромным опытом исследований в области тиреоидных гормонов и связывающих белков.