Перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами в определении структурной перестройки белков

Мельников, Андрей Геннадьевич

Перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами в определении структурной перестройки белков тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Мельников, Андрей Геннадьевич АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Саратов МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.05 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами в определении структурной перестройки белков»

Автореферат диссертации на тему "Перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами в определении структурной перестройки белков"

4844219

МЕЛЬНИКОВ Андрей Геннадьевич

ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ МЕЖДУ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ ЗОНДАМИ В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТРУКТУРНОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ БЕЛКОВ

01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов-2011 2 1 ДПР 2011

4844219

Работа выполнена на кафедре оптики и биофотоники физического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Кочубей Вячеслав Иванович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Летута Сергей Николаевич

доктор физико-математических наук, профессор Мельников Леонид Аркадьевич

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « 12 » мая 2011 г. в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д212.243.01 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Университетская, 42, III корпус, ауд. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского».

Автореферат разослан « 7 » апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Методы абсорбционной и люминесцентной спектроскопии находят широкое применение в биофизике [1]. Оптические методы, являющиеся неразрушающими методами исследования биосистем, позволяют получить сведения, как о структурной организации биологических объектов, так и о процессах, происходящих в них. Значительно расширить круг задач, решаемых оптическими методами, и получить дополнительные данные о биосистемах позволяет применение люминесцентно-кинетических методов исследования.

Для определения структурных изменений в белках с успехом применяются люминесцентные методы, основанные на наблюдении флуоресценции [2] и фосфоресценции [3] хромофоров белков. Однако число люминесцирующих хромофоров белков ограничено и квантовый выход люминесценции незначителен, поэтому для исследования структурных перестроек в белках применяются флуоресцентные зонды [4, 5], обладающие высоким квантовым выходом свечения и способностью сорбироваться в определенных местах глобулы белка.

Перспективным является метод, основанный на флуоресцентном синглет-синглетном переносе энергии электронного возбуждения между хромофорами белка. Флуоресцентный перенос энергии, протекающий по индуктивно-резонансному механизму, осуществляется на расстоянии до 100 А. Применение метода флуоресцентного переноса энергии электронного возбуждения между хромофорами белка и люминесцентными зондами [6, 7] позволяет получить информацию о локализации и взаимодействии молекул люминесцентных зондов с белками, а также применяется для изучения трансмембранного движения белков. Внутримолекулярные структурные изменения регистрировать этим методом затруднительно, так как расстояние переноса энергии соизмеримо с размерами белка, поэтому незначительные смещения участков полипептидной цепи в глобуле белка могут быть не обнаружены. Кроме того, время жизни флуоресцентных состояний хромофоров и люминесцентных зондов составляет несколько наносекунд. Вследствие этого изучение медленных внутримолекулярных перестроек в белках становится невозможным.

Уникальные возможности исследования медленной внутримолекулярной структурной динамики белка представляет рассмотренный в данной работе метод триплет-триплетного (Т-Т) переноса энергии электронного фотовозбуждения между люминесцентными зондами, связанными с белками. Преимущество Т-Т переноса энергии по сравнению с сннглет-сннглетным состоит в том, что перенос энергии по обменно-резонансному механизму осуществляется на незначительном расстоянии порядка несколько ангстрем. Вероятность Т-Т переноса энергии экспоненциально убывает с увеличением расстояния между партнерами, вследствие этого возможно определение незначительных внутримолекулярных структурных изменений в белках.

Цель работы заключается в установлении закономерностей изменений спектрально-кинетических характеристик излучательных внутримолекулярных переходов в люминесцентных зондах и параметров межмолекулярного безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения между зондами, связанными с белками, при переходе от нативных белков к денатурированным.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать процессы взаимодействия полярных и неполярных люминесцентных зондов с белками люминесцентно-кинетическими методами, а также методами абсорбционной и люминесцентной спектроскопии.

2. Методами флуоресцентной спектроскопии, по перераспределению интенсивности первого и третьего максимума флуоресценции пирена, определить чувствительность колебательной структуры спектров флуоресценции пирена к структурной перестройки белков.

3. Методом фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) люминесцентного зонда - эозина, относящегося к красителям ксантенового ряда, определить влияние структурных перестроек в белках на излучательные и безызлучательные процессы дезактивации энергии электронного возбуждения триплетных состояний люминесцентного зонда.

4. Определить радиус синглет-синглетного переноса энергии между хромофором белка - триптофанилом и люминесцентным зондом эозином.

5. Доказать возможность существования межглобулярной диффузии молекул донора энергии - эозина в процессе триплет-триплетного переноса энергии между полярным и неполярным зондами, связанными с белками.

6. Определить константу скорости триплет-триплетного переноса энергии между полярными и неполярным люминесцентными зондами, связанными с белками: сывороточным альбумином человека (САЧ) и бычьим сывороточным альбумином (БСА).

7. Определить зависимость константы скорости триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения от концентрации поверхностно-активных веществ в белках.

8. Установить особенности моно- и бимолекулярных процессов деактивации энергии электронного возбуждения люминесцентных зондов в системе БСА-глюкоза.

Научная новизна работы состоит в следующем:

• Детально изучены процессы триплет-триплетного переноса энергии между связанными с белками полярным донором энергии электронного возбуждения - эозином и неполярным зондом - антраценом. Определены радиусы триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения для исследованной системы. Обнаружена чувствительность константы скорости триплет-триплетного переноса энергии и радиусов переноса к структурным изменениям в белках.

• По результатам исследования сииглет-сииглетиого переноса энергии между остатками триптофана САЧ и связанным с САЧ эозином, установлено, что эозин сорбируется на белок вблизи триптофанила белка.

• Обнаружена чувствительность спектров поглощения и флуоресценции эозина и пирена к структурным изменениям белков. Определены коэффициенты экстинкции и сила осциллятора синглет-синглетиого поглощения молекул люминесцентных зондов (эозин и антрацен), связанных с САЧ.

• Определено влияние структурной перестройки белков на колебательную структуру спектров флуоресценции связанных с белками молекул пирена. Показана возможность применения спектрального параметра «индекс полярности микроокружения пирена» для определения изменения микроокружения неполярного люминесцентного зонда в процессе структурной перестройки белков.

• Установлено существование межглобулярной диффузии молекул эозина донора энергии в процессе Т-Т переноса энергии между связанными с САЧ эозином и антраценом.

• Предложен метод определения наличия структурных изменений белков плазмы крови человека и гликированных белков, основанный на применении триплет-триплетного переноса энергии между люминесцентными зондами, связанными с белками.

Научно-практическая значимость работы заключается в следующем:

Показано, что интенсивность фосфоресценции и время жизни триплетных состояний люминесцентного зонда эозина, колебательная структура спектра флуоресценции пирена, а также константа скорости Т-Т переноса энергии могут быть использованы для регистрации структурных изменений в белках.

Результаты исследований переноса энергии между люминесцентными зондами могут найти применение в медицине при определении белковых молекул с измененной структурой, а также для аналитического определения полициклическпх ароматических углеводородов в плазме крови.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментально наблюдаемый процесс Т-Т переноса энергии между донором энергии эозином и акцептором антраценом свидетельствует о том, что полярный эозин может приближаться к молекуле неполярного антрацена в глобуле белка на расстояние перекрывания электронных облаков этих молекул. Уменьшение радиуса сферы тушения фосфоресценции донора, в результате триплет-триплетного переноса энергии, от 10 А до 7 А, при незначительных добавках додецилсульфата натрия (ДСН), концентрацией 0,4-10"3 М, связано с увеличением расстояния между донором и акцептором вследствие структурных изменений белка под действием ДСН.

2. Возрастание силы осциллятора синглет-синглетного поглощения зонда -эозина при переходе от водных растворов (е =(14820 ± 270) М_1см"', Х= 514 нм) к САЧ (ем = (19410 ± 2020)М'1см"1, /.=530 нм), свидетельствует об эффективном связывании эозина с глобулой белка. Уменьшение интенсивности свечения

САЧ на длине волны 360 нм и возрастание максимума флуоресценции эозина в области 530-545 нм обусловлено синглет-синглетным переносом энергии с донора - триптофанил белка на акцептор - эозин, находящийся в глобуле белка. Полученное значение радиуса переноса энергии (Ro ~ (9 ± 2) А) меньше размера глобулы белка (~100А), следовательно, синглет-синглетный перенос энергии между триптофанилом и эозином осуществляется в условиях локализации гидрофильного эозина вблизи гидрофобного триптофанила.

3. Уменьшение индекса полярности микроокружения пирена, которое определялось по отношению интенсивностей первого максимума флуоресценции (Ii) к интенсивности третьего максимума (13), при переходе от водного раствора (^/¡з =1,74) к плазме крови человека (Ii/I3=l ,03) свидетельствует о связывании гидрофобных люминесцентных зондов с белками плазмы. Возрастание интенсивности флуоресценции пирена и увеличение индекса полярности микроокружения пирена, при добавлении в плазму крови человека ДСН концентрацией от С=0,2-10~3М до 0,6-10"3М обусловлено локализацией молекул пирена на границе раздела гидрофобной и гидрофильной области глобулы белка плазмы вследствие изменения структуры белка под действием ДСН, встраивающегося в глобулу белка.

4. Возрастание интенсивности фосфоресценции зонда эозина в 1,24 раза, при переходе от БСА, содержащего глюкозу к БСА гликированному в течение 90 мин и неизменность константы скорости затухания фосфоресценции (430с"1) после импульсного возбуждения, связано с проникновением люминесцентного зонда в гидрофобные области белка. В этом случае глюкоза не подавляет связывания зонда с этими новыми областями. Подтверждением этого является длинноволновое смещение максимума флуоресценции эозина на 8 нм при переходе к гликированным белкам, что указывает на уменьшение полярности микроокружения молекул эозина, в глобулах белка с большей степенью гликирования.

5. Возрастание константы скорости переноса энергии от 3,1 -106 М''с"' до 15,МО6 М-'с"1 при уменьшении концентрации САЧ от 10 мг/мл до 1 мг/мл, связано с увеличением вероятности встреч молекул донора и акцептора вследствие выхода гидрофильных молекул донора энергии эозина из глобулы белка и проникновением их в другую глобулу, содержащую молекулу акцептора - антрацена, где и осуществляется перенос энергии. Подтверждением межглобулярной диффузии эозина является уменьшение интенсивности фосфоресценции эозина, а также возрастание константы скорости затухания фосфоресценции эозина от 260 с"1 (ССач=10мг/мл) до 340 с"1 (Ссач=1 мг/мл), вследствие увеличения вероятности тушения триплетных состояний молекул эозина, вышедших из глобул белка в водную макрофазу раствора белка, остаточным кислородом, растворенным в воде.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на International School for Young Scientists and Students on Optics. Laser Physics and Biophysics. (Saratov, 2004-2010 г.г.); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов». (Москва. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический

факультет. 2004-2009 г.г.); Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". (Минск, Беларусь. 2004); XXIII Съезде по спектроскопии, (Звенигород, Московская обл. 2005); IV съезд фотобиологов России (Саратов, 2005); International Memorial Symposium «Molecular Photonics» dedicated to academician A.N. Terenin. (St. Petersburg, 2006); VII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. (Минск, Беларусь. 2006); VII International Young Scientists Conference. Optics and High Technology Material. Science SPO. Scientific Works. (Kyiv, Ukraine. 2006); Симпозиум "Нанофотоника". (Черноголовка. 2007); XXI Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях», (Саратов. 2008); V съезде Российского фотобиологического общества, (Пущино. 2008); XXII Международной научной конференции Математические методы в технике и технологиях, (Псков. 2009); International conference "Organic nanophotonics" (ICON - RUSSIA 2009), (Санкт-Петербург. 2009); Международном Форуме по Нанотехнологиям. «Сенсорные наноматериалы», (Москва, 2009); International conference «Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics», (San-Francisco. 2010).

Достоверность результатов обеспечивается:

1. Использованием в экспериментах стандартной современной научной аппаратуры;

2. Воспроизводимостью полученных экспериментальных результатов;

3. Применением современных методов компьютерной обработки экспериментальных данных;

4. Совпадением результатов, полученных на специально созданном импульсном флуориметре, с известными литературными данными.

Личный вклад автора заключается в том, что автор совместно с научным руководителем участвовал в постановке задач исследований, анализе и обсуждении полученных результатов, теоретических моделей, а также подготовке к опубликованию печатных работ. Автором самостоятельно проведены экспериментальные исследования. Для определения времени жизни люминесцентных зондов в возбужденном состоянии им создана экспериментальная установка - импульсный флуорнметр.

Участие в научных проектах. Научная работа автора по теме диссертации выполнена при финансовой поддержке американского фонда гражданских исследований и развития, тема проекта: «Кинетика фосфоресценции люминесцентных зондов в исследовании структурной динамики белков в плазме крови человека» (персональный грант N REC-006, 2005 год), и Фонда содействия развитию малого бизнеса и предпринимательства в науке и технике госконтракт № 6232р/8706 от 19.09.2008 в рамках Программы У.М.Н.И.К. 2009-20 Юг.г. Наименование НИОКР «Моделирование процессов тушения фотовозбужденных состояний люминесцентных зондов в белках».

Автор являлся исполнителем следующих научных проектов, результаты которых частично вошли в материалы диссертации: «Исследование структурно-динамического состояния сывороточного альбумина человека в буферном растворе и в составе плазмы крови методами собственной и зондовой фосфоресценции при комнатной температуре» (РФФИ проект №06-04-810067

Бел_а, 2006-2007г.г.); «Исследование триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с биополимерами» (РФФИ проект №10 - 02 - 00159_а, 2010-2011г.г.); "Разработка оптических методов исследования и мониторинга изменений параметров биологических тканей и цельной крови при изменении содержания глюкозы в тканях организма человека и животных" ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг., госконтракт 02.740.11.0770.

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 24 печатных работах, включающих в себя 17 тезисов докладов, 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 164 страницы, включая 52 рисунка и 6 таблиц. Список литературы включает 171 наименование.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследований, показана новизна работы, ее практическая и научная значимость, поставлены цели и задачи исследования и определены выносимые на защиту положения.

В первой главе приведен краткий литературный обзор исследований процессов переноса энергии по индуктивно-резонансному и обменно-резонансному механизмам. Основное внимание уделено анализу результатов теоретических и экспериментальных исследований процессов трансформации энергии электронного возбуждения в микрогетерогенных средах биологического происхождения. Подробно рассмотрены теории Ферстера, Декстера, Ермолаева переноса энергии между люминофорами в жидких средах. Отмечены особенности протекания этих процессов в микрогетерогенных средах при их структурной перестройке.

Во второй главе описаны люминесцентно-кинетические способы определения структурных изменений в белках с использованием сывороточного альбумина человека (САЧ), бычьего сывороточного альбумина (БСА), с которыми нековалентно связаны люминесцентные зонды, в качестве которых были выбран люминофор ксантенового ряда-эозин и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) антрацен и пирен. Выбор эозина обусловлен применением его в фотодинамической терапии онкологических заболеваний, а выбор ПАУ определяется тем, что некоторые из этих соединений проявляют канцерогенные и мутагенные свойства, поэтому исследования взаимодействия ПАУ с транспортными белками являются актуальными для медицины. Даны способы определения коэффициента экстинкции синглет-синглетного поглощения молекул полярного зонда эозина и неполярного - антрацена связанных с САЧ. Полученные значения коэффициентов экстинкции для эозина в воде и САЧ даны в таблице. В работе представлено описание специально созданного импульсного флуориметра,

позволяющего получать спектры, а также кинетические зависимости, характеризующие затухание замедленной флуоресценции (ЗФ) и фосфоресценции зондов.

В третьей главе приведены результаты исследований взаимодействия люминесцентного зонда эозина с САЧ. Люминесцентные зонды, введенные в водный раствор белка, который является микрогетерогенной средой, могут находиться как в связанном с белком состоянии, так и в водной среде, поэтому были получены спектрально-кинетические характеристики люминесцентного зонда эозина отдельно в водной среде и в САЧ, результаты представлены в таблице.

Таблица. Спектрально-кинетические характеристики эозина в 0.15 М фосфатном буфере рН 7.4. Х1Ю1Л, Аф., - длина волны максимума в спектре поглощения и флуоресценции эозина соответственно; е - коэффициент экстинкции синглет-синглетного поглощения; к, х - константа скорости дезактивации и время жизни (х = 1/к) триплетных состояний эозина

Среда ИМ е, М"'-см"' Хфл, НМ к, с"1 X, мс

0.15 М фосфатный буфер рН 7.4 514 14820± 270 535 1300 0.77

САЧ в 0.15 М фосфатном буфере рН 7.4 530 19410 ± 2020 542 320 3.1

При возбуждении обескислороженных растворов эозина в САЧ были получены спектры ЗФ и фосфоресценции эозина (рис. 1). Значительное возрастание интенсивности ЗФ и фосфоресценции эозина в САЧ по сравнению с водными растворами, а также возрастание времени жизни (х) свидетельствует о том, что вероятности излучательных и безызлучательных переходов в молекуле эозина перераспределяются при связывании его с белком. Возрастание интенсивности люминесценции эозина при увеличении концентрации САЧ (рис. 1) свидетельствует о том, что эозин из водной среды переходит в белковую микрофазу и с увеличением объема белковой микрофазы большую часть своего времени жизни в возбужденном триплетном состоянии проводит в глобулах белка. Возрастание коэффициента экстинкции эозина, длинноволновое смещение максимумов спектров поглощения и флуоресценции, а также увеличение интенсивности фосфоресценции эозина и времени жизни триплетных состояний эозина при переходе от водного раствора к САЧ (таблица) можно объяснить сорбцией эозина на глобулах белка. В работе приведены результаты исследований взаимодействия

полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) антрацена и пирена с белками.

ад -,-,-----.

.500 т 71К»

/,. нм

Рис. 1. Спектры замедленной флуоресценции = 560 нм) и фосфоресценции (Атпах=690 нм) эозина (С = 410"6 М) в растворе фосфатного буфера рН 7.4 САЧ концентрацией: 1-10 мг/мл; 2-1 мг/мл

о.гк>4-.-,-.-.---,---,-

350 .го у*<| т

нм

Рис. 2. Спектры поглощения антрацена в САЧ (Сслч~ Ю мг/мл). Концентрация антрацена: 1- 1-10"5М; 2-4,7-10"5 М

Увеличение оптической плотности с увеличением концентрации антрацена (рис.2) свидетельствует о том, что антрацен эффективно связывается с САЧ. По линейной зависимости оптической плотности антрацена от концентрации антрацена в растворе САЧ был определен коэффициент экстинкции антрацена равный (2355±132) М^см"1 на длине волны X = 360 нм. Таким образом, и полярный зонд - эозин и неполярный - антрацен преимущественно связаны с глобулой белка, что позволяет осуществить процесс переноса энергии между этими зондами.

В четвертой главе приведены результаты исследований процессов переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с белками. Триплет-триплетный перенос энергии исследован между полярными молекулами люминесцентного зонда эозина - донора энергии и неполярными молекулами акцептора - антрацена, связанными нековалентными связями с альбуминами сыворотки крови человека. С увеличением концентрации антрацена наблюдалось линейное возрастание константы скорости затухания фосфоресценции донора - эозина (рис. 3 зависимости 1 и 2). Эти зависимости позволили определить эффективную константу скорости Т-Т переноса энергии (*г-г) в САЧ согласно уравнению Штерна-Фольмера, примененного для константы скорости затухания фосфоресценции донора эозина [8]

* + (1) где к и (к)0 - константы скорости затухания фосфоресценции эозина при наличии акцептора - антрацена и в его отсутствии, соответственно; [СШ1тр]-концентрация антрацена в САЧ.

«ю

к, с1

400

Для концентрации САЧ равной 1 мг/мл (рис. 3, зависимость 1) значение константы скорости Т* Т переноса (^г'-г) составило

15,МО6 М-'с-1, для

концентрации 10 мг/мл, \ ....-■-'"""""* к?-т= 3,1 ■ 10б М-'с"1. Введение

эффективной константы

скорости Т-Т переноса энергии

46 8 обусловлено неоднородным

с*'° <м распределением молекул донора

Рис. 3. Зависимости константы скорости и акцептора по объему

раствора, вследствие того, что и эозин и антрацен локализованы

затухания фосфоресценции эозина (С=410 М) от концентрации антрацена. Концентрация

САЧ:1-1мг/мл; 2-10 мг/мл и белковой микрофазе. С

увеличением концентрации САЧ константа скорости затухания фосфоресценции уменьшается, то есть уменьшается вероятность встреч молекул эозина и антрацена в одной глобуле белка, вследствие распределения молекул антрацена по большему числу глобул САЧ.

Процессы дезактивации энергии триплетных состояний донора эозина были представлены следующими уравнениями:

а) для молекул эозина связанных с глобулой белка

= (2)

б) для молекул эозина в водной макрофазе

где

- концентрации донора в триплетном состоянии в белковой микрофазе и водной макрофазе, а также акцептора в основном синглетном состоянии в белковой микрофазе соответственно; - константы скорости

входа и выхода молекул донора из глобул белка; ^2' ^3 - константы скорости дезактивации энергии триплетных состояний донора в белках и водной

макрофазе соответственно; * г - г - константа скорости триплет-триплетного переноса энергии в белковой микрофазе. Для наблюдаемой константы скорости затухания фосфоресценции донора - эозина (к) из (2) и (3) было получено выражение:

2 к,[М] [М] ' К }

Отрезок, отсекаемый прямой (1) и (2) рис. 3 на оси ординат, представляет собой значение константы скорости затухания фосфоресценции (суммарная

исевдомономолекулярная константа скорости дезактивации триплетных состояний) в отсутствии акцептора энергии - (к)„ и определяется из (4)

Из (5) следует, что значения суммарной псевдомономолекулярной константы скорости дезактивации триплетных состояний должны зависеть от концентрации глобул белка [М] в растворе САЧ, что и наблюдается в эксперименте (рис. 3, зависимости 1 и 2). Из уравнения (4) следует, что угловой

коэффициент (^" ) этой линейной зависимости, определяемый соотношением:

также должен зависеть от концентрации глобул белка. Полученные результаты (рис. 3, зависимости 1 и 2) подтверждают это. Сравнивая (1) и (4) можно

заключить, что ^" в формуле (6) является константой скорости Т-Т переноса энергии. При подстановки в (6) определенных в работе значений константы скорости выхода молекул донора - эозина из глобул белка (¿.1=430 с"1) и значений константы скорости дезактивации энергии триплетных состояний донора

(¿2=320 с"1)

при концентрации глобул белка [М] = 25 мкМ получена

константа скорости Т-Т переноса энергии равная = ЗО Ю6 М"'с_1, то есть одного порядка с константой скорости переноса энергии, определенной из эксперимента по формуле (1). Следовательно, константа скорости Т-Т переноса лимитируется не только константой скорости дезактивации триплетных состояний эозина, но и константой скорости выхода молекул донора эозина из глобулы белка. Это подтверждает предположение о межглобулярной диффузии донора - эозина за время жизни его в триплетном состоянии, и в итоге можно предположить возможность реализации межглобулярного Т-Т переноса энергии.

При добавлении акцептора энергии - антрацена в раствор донора - эозина в САЧ наблюдалось уменьшение интенсивности ЗФ и фосфоресценции эозина. Уменьшение интенсивности фосфоресценции эозина, измеренной спустя 0,2 мс после вспышки импульсной лампы также несет информацию о диффузионном характере тушения триплетных состояний донора в результате Т-Т переноса энергии на акцептор - антрацен. Для описания тушения люминесценции донора в результате переноса энергии по обменно-резонансному механизму [9], можно использовать модель Ф. Перрена [10]. Автором диссертационной работы показано, что для малых концентраций донора энергии (4-10"6 М) можно заменить отношения квантовых выходов свечения донора в формуле Ф. Перрена на отношение интенсивностей фосфоресценции донора - эозина в процессе Т-Т переноса на акцептор - антрацен. В этом случае для отношения интенсивностей фосфоресценции донора - эозина получено:

10 /I = ехр(и^ А -С А) ^ гд£ х ; I о -интенсивность фосфоресценции донора в присутствии акцептора - антрацена и без него соответственно; Ыд - постоянная

1,00

1п(уо

Авогадро; * - концентрация акцептора, выраженная в моль/л; объем сферы действия тушения в литрах. Зависимость логарифма отношения интенсивности фосфоресценции эозина (1п 1о/1) от концентрации антрацена в диапазоне от 2' 10-5 М до 6'10"5 М (рис.4, зависимость 1) представляет прямую линию, которая не проходит через начало координат. Последнее может быть связано как с нелинейностью шкалы концентраций акцептора в области менее

Ю"5 М, так и проявлением микрогетерогенности среды, проявляющееся в неоднородном распределении молекул донора и акцептора по объему раствора. Угловой коэффициент

зависимости Ь^о^от С А (рис. 4) позволяет определить объем и радиус сферы тушения. С учетом локализации антрацена в белковой мнкрофазе, радиус сферы тушения равен 10 А (рис. 4, зависимость 1). При добавлении ДСН радиус тушения уменьшился до 7 А (рис. 4, зависимость 2). Наблюдаемое коэффициента зависимости 2, рис. 4 и

ОЮ\М

Рис.4. Зависимость логарифма отношения интенсивности фосфоресценции эозина без акцептора (10) к интенсивности фосфоресценции с акцептором (I) от концентрации антрацена в САЧ (С=1 мг/мл) без ДСН (1) и в САЧ, содержащим 0.4'Ю"3М ДСН (2)

уменьшение значения углового рассчитанного значения объема сферы тушения триплетных состояний донора при добавлении ДСН свидетельствует о том, что уменьшается вероятность переноса энергии между эозином и антраценом в глобуле белка. Это возможно при внутримолекулярной структурной перестройке белков. С дальнейшим увеличением содержания ДСН наблюдается разрушение гидрофобных связей в белках под действием ДСН, белок денатурирует, увеличивается расстояние между донором и акцептором и Т-Т перенос не наблюдается.

Для изучения процесса синглет-синглетного переноса энергии между хромофорами белка и люминесцентными зондамн нековалентно связанными с белками автором был выбран сывороточный альбумин человека и акцептор энергии эозин. Донором энергии в системе САЧ-эозин являлся триптофанил белка. Спектр флуоресценции САЧ (рис.5, спектр 2) обусловлен преимущественно свечением триптофанила. Уменьшение интенсивности свечения САЧ на длине волны 350 им и возрастание максимума флуоресценции эозина в области 530-545 нм (рис. 5, спектр 3) обусловлено синглет-синглетным переносом энергии с донора (триптофанил) на акцептор эозин, находящийся в глобуле белка.

л / '■У

Рис. 5. Спектр флуоресценции эозина в воде (1), флуоресценция САЧ в буфере рН 7.4 (2) и комплекса САЧ-эозии (3).

^-возбужления ~ 280 НМ

близости триптофанила, локализуется гидрофобный

Согласно теории Фёрстера, в работе определен радиус синглет-синглетного переноса энергии, с триптофанила на эозин, значение которого составило ~ 9А. Это свидетельствует, о том, что полярный эозин может

располагаться в непосредственной от неполярного в области которого, неполярный антрацен. Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность

сближения донора с акцептором и осуществления перекрывания

электронных облаков между эозином и антраценом необходимого для осуществления Т-Т переноса в белках.

В пятой главе предложена люминесцентно-кинетическая методика контроля изменений структуры альбуминов плазмы крови человека,

основанная на использовании I'' • люминесцентных зондов -

пирена и эозина. Для определения места

локализации полициклических ароматических углеводородов (ГТАУ) в плазме крови в работе получены спектры флуоресценции пирена,

растворенного в САЧ (рис. 6, спектр а) и плазме крови (спектр б).

Согласно рис. 6 индекс полярности мнкроокружения пирена в плазме крови (11/1з=1,03) меньше, чем в буферном растворе САЧ (11/1з=1,25). Вероятно, это связано с тем, что в плазме крови пирен может содержаться, как в белках, так и в липидах. Для ряда растворителей по полученным в работе спектрам флуоресценции пирена были определены индексы полярности, которые хорошо согласуются с литературными данными для этанола, гексана, гептана и ДСП. По этим данным было получено следующее соотношение между диэлектрической проницаемостью

I»

а)

нм

X, нм

Рис. 6. Спектры флуоресценции пирена в САЧ (а) и плазме крови человека (б). Спектры нормированы к первому максимуму флуоресценции (10

микроокружения (сч) и индексом полярности (1[/'Ь) микроокружения молекул пирена е„ = 78,1 (^/Ь) - 56,3.

Из этого соотношения определена диэлектрическая

ко проницаемость микроокружения молекул пирена в САЧ (см = 41) и плазме (ем =24) кровиБольшее "А значение ем в белках САЧ по „/"" сравнению с плазмой крови можно объяснить проникновением воды (е=81) в белки САЧ, а также тем, что о.о в плазме крови пирен может связываться с гидрофобными

■V "

0.U t!.2 П.! 0,r, U.Si 1,1)

c„„.ni'M

Рис. 7. Зависимость интенсивностн липидами. флуоресценции Х = 395 нм (1) и индекса Изменение структуры белков

полярности (2) микроокружения пирена в достигалось введением в плазму плазме крови от концентрации ДСН крови ДСН. Полученные

зависимости оптических

характеристик зонда - пирена от концентрации ДСН представлены на рис. 7. Возрастание интенсивности флуоресценции и индекса полярности микроокружения пирена с увеличением содержания ДСН до 0,6-10"3 М можно объяснить тем, что в белках содержащих ДСН, пирен локализуется на границе раздела гидрофильной и гидрофобной фаз глобулы. Это приводит к потере подвижности молекул пирена и увеличению интенсивности его флуоресценции. На границе раздела фаз в микроокружении пирена увеличивается содержание молекул воды, что и приводит к увеличению индекса полярности.

Уменьшение интенсивности флуоресценции и индекса полярности микроокружения пирена при увеличении содержания ДСН выше 0,6-10"э М можно объяснить денатурацией белка под действием ДСН и солюбилизацией молекул пирена в гидрофобном ядре мицелл ДСН окружающих глобулу белка. В результате индекс полярности микроокружения пирена уменьшается до значения 1,15, которое незначительно отличается от индекса полярности микроокружения пирена в водно-мицеллярном растворе ДСН (Ii/l3=l,12).

В работе были проведены исследования влияния структурных изменений в белках под действием глюкозы на люминесцентно-кинетические характеристики зонда эозина и на триплет-триплетный перенос энергии между эозином и антраценом, сорбированными глобулой бычьего сывороточного альбумина (БСА).

При переходе от водных растворов эозина к растворам БСА, гликированного в течение 60 минут, наблюдалось длинноволновое смещение положения максимума спектров флуоресценции эозина от 542 нм до 550 нм. Также возрастала интенсивность ЗФ (А,макс=550 нм) и фосфоресценции (/.чакс=680 нм) эозина, и увеличивалось время жизни триплетных состояний эозина от 0,77 мс до 2,4 мс по сравнению с водными растворами. Эти

результаты свидетельствуют о том, что люминесцентный зонд эозин связывается с глобулами БСА. С увеличением времени гликирования до 90 мин наблюдалось уменьшение интенсивности и длинноволновое смещение максимума флуоресценции эозина на 8 нм, при этом фосфоресценция эозина возросла в 1,24 раза. Длинноволновое смещение максимума флуоресценции эозина указывает на уменьшение полярности микроокружения молекул эозина, в глобулах белка с большей степенью гликирования. Это может быть связано с тем, что по мере ковалентного присоединения глюкозы к полипептидной нити конформация глобулы в растворе изменяется таким образом, что для эозина становятся доступными гидрофобные области, скрытые внутри нативной глобулы, при этом глюкоза не подавляет связывания зонда с этими новыми областями. Этим объясняется возрастание интенсивности фосфоресценции. Структурные изменения в белковых глобулах, связанные с гликированием, детектировались в работе путем исследования процессов переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами: эозином и антраценом, связанными с белками. Значение эффективной константы скорости Т-Т переноса энергии в растворе БСА без гликирования составило

ктф-т =(25±2)-105 М"'-с"1. В случае гликирования в течение 90 мин константа скорости переноса энергии уменьшилась до (8±2)-105 М"''С*'. Предположено, что уменьшение константы скорости Т-Т переноса энергии связано с увеличением расстояния между донором и акцептором энергии вследствие изменения геометрии самой гидрофобной области белка.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. В результате аиализа полученных спектров поглощения и флуоресценции люминесцентного зонда эозина, а также, определяемого в работе, времени жизни триплетных состояний молекул эозина в воде, буфере сывороточного альбумина человека (САЧ) и плазме крови человека можно сделать вывод о том, что в плазме крови человека полярный эозин преимущественно связан нековалентными связями с белками плазмы крови. Установлено, что интенсивность и время жизни фосфоресценции люминесцентного зонда - эозина чувствительны к структурной перестройке альбуминов плазмы крови под действием поверхностно-активного вещества (ПАВ) додецилсульфата натрия (ДСН).

2. Анализ изменений колебательной структуры спектров флуоресценции пирена в воде, плазме кровн человека и в буферном растворе САЧ позволил установить, что полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие как пирен, а, следовательно, и антрацен в плазме крови локализованы в гидрофобной микрофазе белков и липидах плазмы. Денатурация белков плазмы крови под действием ДСН отслеживается по зависимости индекса полярности микроокружения пирена от концентрации ДСН. Установлено, что ДСН способствует выведению ПАУ из глобулы белка.

3. В работе обнаружен и детально исследован процесс триплет-триплетного (Т-Т) переноса энергии электронного возбуждения между

полярным эозином - донором энергии н неполярным антраценом - акцептором связанными нековалентными связями с глобулами альбумина сыворотки и плазмы крови. Определены радиусы переноса энергии и объем сферы тушения триплетных состояний донора в результате переноса энергии. Установлено, что при добавлении ДСН наблюдается уменьшение радиуса переноса и объема сферы тушения триплетных состояний донора. Предположено, что это связано с увеличением расстояния между донором и акцептором вследствие изменения структуры белков под действием ДСН. Таким образом, Т-Т перенос энергии является чувствительным индикатором структурных перестроек в белках под действием ПАВ - додецилсульфата натрия.

4. Обнаружен синглет-синглетный перенос энергии между трнптофановым остатком САЧ и эозином. Согласно теории Фёрстера определен радиус синглет-синглетного переноса, который составил -9Ä. Это позволило предположить, что гидрофильный эозин может локализоваться вблизи гидрофобного триптофанила белка.

5. Исследования процесса Т-Т переноса энергии в системе эозин-антрацен при разных концентрациях САЧ позволили обнаружить Т-Т перенос, который может осуществляться в результате межглобулярной диффузии донора энергии эозина за время жизни его в трнплетном состоянии. Установлено, что Т-Т перенос энергии между эозином и антраценом осуществляется в белковой микрофазе.

6. Исследованиями воздействия гликирования белков на процессы дезактивации энергии электронного возбуждения молекул зонда - эозина установлено, что характеристики флуоресценции и фосфоресценции эозина, а также константа скорости Т-Т переноса энергии между люминесцентными зондами эозином и антраценом, связанными с БСА, чувствительны к структурным изменениям БСА на ранних стадиях неферментативного термического гликирования.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ОСНОВНЫХ РАБОТАХ (из общего количества 24 публикации):

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Салецкий A.M., Мельников А.Т., Правдин А.Б., Кочубей В.И., Мельников Г.В. Кинетика фосфоресценции люминесцентных зондов при комнатной температуре в изучении структурных изменений в белках под действием додецилсульфата натрия//Журнал Прикладной Спектроскопии. 2005. Т. 72., № 5. С.660-663.

2. Салецкий A.M., Мельников А.Г., Правдин А.Б., Кочубей В.И. Комплексообразование пирена и антрацена с плазмой крови человека// Журнал Прикладной Спектроскопии. 2008. Т. 75, № 3. С.379-382.

3. Мельников А.Г., Салецкий A.M., Кочубей В.П., Правдин А.Б., Курчатов И.С., Мельников Г.В. Триплет-триплетный перенос энергии между люминесцентными зондами, связанными с альбуминами/Юптика и спектроскопия. Биомедицинская оптика и спектроскопия. 2010. Т. 109, № 2. С.1272-1277.

4. Правдив А.Б., Кочубей В.П., Мельников А.Г. Фосфоресцентный зонд -эозин в исследовании структурных изменений в гликированных белках// Оптика и спектроскопия. Биомедицинская оптика и спектроскопия. 2010. Т. 109, № 2. С.1278-1281.

5. Prawdin А. В., Kochubeiy W. I., Melnikov A.G. Room temperature phosphorescence of eosine in study of structural dynamics of proteins// Proceedings of SPIE. 2004. Vol. 5474. P.348-351.

6. Melnikov A.G., Pravdin A.B., Kochubey V.I. Luminescent probe in the study of surfactant-induced structural changes in serum albumin in human blood plasma/ZProceedings of SPIE. 2005. Vol. 5771. P.332-335.

7. Melnikov A.G., Prawdin А. В., Kochubey V. I. Spectral studies of polycyclic aromatic hydrocarbons interaction with human blood plasma//Proceedings of SPIE. 2006. Vol. 6163. P. 1H-1 -1H-5.

Публикации в других изданиях

8. Мажуль В.М., Мельников А.Г. Анализ структурно-динамического состояния белков методом зондовой фосфоресценции при комнатной температуре//Тезисы докладов Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". Минск, Беларусь, 2004. С. 27-29.

9. Салецкий A.M., Мельников А.Г., Правдин А.Б., Кочубей В.И. Триплет-трнплетный перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с белками// XXIII Съезд по спектроскопии. Звенигород, Московская обл., 2005. С. 214.

10. Melnikov A.G. Triplet-triplet energy transfer of the electronic excitation between the hydrophobic and hydrophilic luminescent probes, connected with the proteins//Book of abstracts International Memorial Symposium «Molecular Photonics» dedicated to academician A.N. Terenin St. Petersburg, Russia, 2006. P. 138-139.

11. Melnikov A.G. Transfer of electronic photoexcitation energy in the study of protein structural dynamics//VII International Young Scientists Conference. Optics and High Technology Material. Science SPO 2006. Scientific Works. Kyiv, Ukraine, 2006. P. 184.

12. Мельников А.Г. Перенос энергии между триплетными состояниями люминесцентных зондов, сорбированных на организованные супрамолекулярные наносистемы// Сборник тезисов докладов Симпозиума "Нанофотоника". Черноголовка, Московская область, Россия, 2007. С. 125.

13. Melnikov A.G., Kochubey V.I., Pravdin А.В. Probe phosphorescence and triplet-triplet energy transfer in the study of confomiation changes in the proteins//Book of abstract International conference "Organic nanophotonics" (ICON - RUSSIA 2009) Санкт-Петербург, 2009. С. 143.

14. Мельников А.Г., Наумова Е.В. Сенсор для определения внутримолекулярных структурных изменений в белках//Сборник тезисов докладов Международного Форума по Нанотехнологиям. Секция Сенсорные наноматериалы. Москва, 2009. С. 560-561.

15. Melnikov A.G. Study of the structural dynamics of proteins by the method of energy transfer//Proceedings of SPIE. Vol. 7563. Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics VII, edited by Valery V. Tuchin, (SPIE, Bellingham, WA, 2010). San Francisco, California, USA, 2010. Vol. 7563. P. 24.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М. : Мир, 1986. 496 с.

2. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. : Наукова думка, 1988. 280 с.

3. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Щербин Д.Г. Внутримолекулярная динамика и функциональная активность белков // Биофизика. 2000. Т. 45, № 6. С. 965-989.

4. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М. : Наука, 1989. 277 с.

5. Баранов А.Н., Власова И.М., Микрнн В.Е., и Салецкий A.M. Лазерная корреляционная спектроскопия процессов денатурации сывороточного альбумина // Журнал Прикладной Спектроскопии. 2004. Т. 71, № 6. С. 831-835.

6. Алфимова Е.Я., Лихтенштейн Г.И. Флуоресцентное исследование переноса энергии, как метод изучения структуры белков // Итоги науки и техники.Молекулярная биология. М.: ВИНИТИ. 1976. Т. 8, ч. 2. С. 127-179.

7. Miller J.N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis // Analyst. 2005. Vol. 130, P. 265-270.

8. Ермолаев В.Л., Бодунов E.H., Свешникова Е.Б., и Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. М. : Наука, 1977. 311 с.

9. Inokuti М., Hirayama F. Influence of Energy Transfer by the Exchange Mechanism on Donor Luminescence // Journal of Chemical Physics. 1965. Vol. 43(6), P. 1978-1989.

10. Perrin F. Radiationless intermolecular energy transfer // Comptes Rendus De L'academie Des Sciences. 1924. Vol. 178, P. 1978-1980.

Подписано в печать 05.04.2011. Формат 60x84 '/¡б. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать цифровая Объем 1.25 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 65-Т

Типография СГУ г. Саратов, ул. Б. Казачья 112а тел.: (845-2) 27-33-85

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Мельников, Андрей Геннадьевич

Введение.

1 Процессы переноса энергии электронного возбуждения в исследовании биологических систем.

1.1 Излучательные и безызлучательные процессы дезактивации энергии электронного возбуждения молекул люминесцентных зондов.

1.1.1 Теория безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения.

1.1.1.1 Механизм индуктивно-резонансного переноса энергии.

1.1.1.2 Обменно-резонансный триплет-триплетный перенос энергии.

1.2 Методы исследования структурных изменений в белках.

1.2.1 Взаимодействия люминесцентных зондов с белками.

1.2.2 Связывание неполярных люминесцентных зондов с белками.

1.3 Использование переноса энергии для исследования структуры и состояния белков.

1.3.1 Синглет-синглетный перенос энергии в исследовании структурных изменений в белках.

1.3.2 Триплет-триплетный перенос энергии как метод определения медленных флуктуаций структуры белков.

1.4 Структурная организация белков.

2 Методы исследования взаимодействия люминесцентных зондов с белками.

2.1 Выбор люминесцентных зондов и пробоподготовка исследуемых биологических систем.

2.1.1 Полярный люминесцентный зонд.

2.1.3 Белки, используемые в работе.

2.1.4 Пробоподготовка.

2.2 Спектрофотометрические и флуоресцентные методы исследования сорбции люминесцентных зондов на белки.

2.2.1 Метод определения коэффициента синглет-синглетного поглощения люминесцентных зондов эозина и антрацена, связанных с САЧ.

2.2.2 Метод определения концентрации полициклических ароматических углеводородов в САЧ.

2.3 Импульсный флуориметр. Метод импульсной флуориметрии.

3 Исследование взаимодействия люминесцентного зонда ксантенового ряда - эозина и полициклических ароматических углеводородов с САЧ.

3.1 Влияние процессов взаимодействия эозина с САЧ на флуоресцентные и фосфоресцентные характеристики эозина.

3.1.1 Определение силы осциллятора синглет-синглетного перехода с поглощением молекул эозина в воде, САЧ и САЧ с добавлением ДСН

3.1.2 Спектрально-кинетические характеристики люминесцентного зонда эозина сорбированного белками.

3.2 Применение люминесцентных зондов для регистрации изменения взаимодействий зондов с белками в процессе структурных преобразований в белках под действием денатурантов.

3.2.1 Проявление гидрофобных взаимодействий в системе эозин-белок-ПАВ.

3.2.2 Исследование взаимодействия люминесцентных зондов с белками в процессе их структурной перестройки при изменении рН раствора.

3.2.3 Изменение люминесцентно-кинетических характеристик эозина в процессе структурной перестройки белков под действием мочевины

3.3 Исследование взаимодействия полициклических ароматических углеводородов с САЧ.

3.3.1 Исследование взаимодействия антрацена с САЧ.

3.3.2 Колебательная структура спектров флуоресценции пирена -индикатор полярности микр о окружения зонда.

3.3.3 Колебательная структура спектров флуоресценции пирена в исследовании структурных изменений в белках.

3.4 Выводы к главе 3.

4 Перенос энергии электронного возбуждения в белках.

4.1 Синглет-синглетный перенос энергии между хромофором белка и люминесцентным зондом ксантенового ряда в определении места локализации зонда в глобуле белка.

4.2 Межглобулярная диффузия донора энергии в процессе триплет-триплетного переноса между люминесцентными зондами в белках.

4.3 Триплет-триплетный перенос энергии между люминесцентными зондами, связанными с альбуминами, как метод определения структурных изменений в белках.

4.4 Выводы к четвертой главе.

5 Люминесцентные зонды в исследовании белков плазмы крови и гликированных белков.

5.1 Триплетные состояния люминесцентного зонда - эозина в исследовании структурных изменений белков плазмы крови человека под действием ДСН.

5.2 Спектральные исследования процессов взаимодействия полициклических ароматических углеводородов с плазмой крови человека

5.3 Фосфоресцентный зонд - эозин в исследовании структурных изменений в гликированных белках.,.

5.4 Выводы к пятой главе.

Введение диссертация по физике, на тему "Перенос энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами в определении структурной перестройки белков"

Актуальность исследований. Методы абсорбционной и люминесцентной спектроскопии находят широкое применение в биофизике. Оптические методы, являющиеся неразрушающими методами исследования биосистем, позволяют получить сведения, как о структурной организации биологических объектов, так и о процессах, происходящих в них. Значительно расширить круг задач, решаемых оптическими методами, и получить дополнительные данные о биосистемах позволяет применение люминесцентно-кинетических методов исследования.

Для определения структурных изменений в белках с успехом применяются люминесцентные методы, основанные на наблюдении флуоресценции и фосфоресценции хромофоров белков. Однако число люминесцирующих хромофоров белков ограничено и квантовый выход люминесценции незначителен, поэтому для исследования структурных перестроек в белках применяются флуоресцентные зонды, обладающие высоким квантовым выходом свечения и способностью сорбироваться в определенных местах глобулы белка.

Перспективным является метод, основанный на флуоресцентном синглет-синглетном переносе энергии электронного возбуждения между хромофорами белка. Флуоресцентный перенос энергии, протекающий по индуктивно-резонансному механизму, осуществляется на расстоянии до 100 А. Применение метода флуоресцентного переноса энергии электронного возбуждения между хромофорами белка и люминесцентными зондами позволяет получить информацию о локализации и взаимодействии молекул люминесцентных зондов с белками, а также применяется для изучения трансмембранного движения белков. Внутримолекулярные структурные изменения регистрировать этим методом затруднительно, так как расстояние переноса энергии соизмеримо с размерами белка, поэтому незначительные смещения участков полипептидной цепи в глобуле белка могут быть не обнаружены.

Кроме того, время жизни флуоресцентных состояний хромофоров и люминесцентных зондов составляет несколько наносекунд. Вследствие этого изучение медленных внутримолекулярных перестроек в белках становится невозможным.

Уникальные возможности исследования медленной внутримолекулярной структурной динамики белка представляет рассмотренный в данной работе метод триплет-триплетного (Т-Т) переноса энергии электронного фотовозбуждения между люминесцентными зондами, связанными с белками. Преимущество Т-Т переноса энергии по сравнению с синглет-синглетным состоит в том, что перенос энергии по обменно-резонансному механизму осуществляется на незначительном расстоянии порядка несколько ангстрем. Вероятность Т-Т переноса энергии экспоненциально убывает с увеличением расстояния между партнерами, вследствие этого возможно определение незначительных внутримолекулярных структурных изменений в белках.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

3. Методом фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) люминесцентного зонда — эозина, относящегося к красителям ксантенового ряда, определить влияние структурных перестроек в белках на излучательные и безызлучательные процессы- дезактивации энергии электронного возбуждения триплетных состояний люминесцентного зонда.

Научная новизна работы состоит в следующем:

• По результатам исследования синглет-синглетного переноса энергии между остатками триптофана САЧ и связанным с САЧ эозином, установлено, что эозин сорбируется на белок вблизи триптофанила белка.

• Обнаружена чувствительность спектров поглощения и флуоресценции эозина и пирена к структурным изменениям белков. Определены коэффициенты экстинкции и сила осциллятора синглет-синглетного поглощения молекул люминесцентных зондов (эозин и антрацен), связанных с САЧ.

Научно-практическая значимость работы заключается в следующем:

Результаты исследований переноса энергии между люминесцентными зондами могут найти применение в медицине при определении белковых молекул с измененной структурой, а также для аналитического определения полициклических ароматических углеводородов в плазме крови.

На защиту выносятся следующие положения:

-э

0,4П10 М, связано с увеличением расстояния между донором и акцептором вследствие структурных изменений белка под действием ДСН.

2. Возрастание силы осциллятора синглет-синглетного поглощения зонда - эозина при переходе от водных растворов (е =(14820 ± 270) М^см"1, Х= 514 нм) к САЧ (ем = (19410 ± 2020)М"1см"1, А,=530 нм), свидетельствует об эффективном связывании эозина с глобулой белка. Уменьшение интенсивности т свечения САЧ на длине волны 360 нм и возрастание максимума флуоресценции эозина в области 530-545 нм обусловлено синглет-синглетным переносом энергии с донора - триптофанил белка на акцептор - эозин, находящийся в глобуле белка. Полученное значение радиуса переноса энергии (110 ~ (9 ± 2) А) меньше размера глобулы белка (~100А), следовательно, синглет-синглетный перенос энергии между триптофанилом и эозином осуществляется в условиях локализации гидрофильного эозина вблизи гидрофобного триптофанила.

3. Уменьшение индекса полярности микроокружения пирена, которое определялось по отношению интенсивностей первого максимума флуоресценции (1х) к интенсивности третьего максимума (13), при переходе от водного раствора (¡¡Лз =1,74) к плазме крови человека (11/13=1,03) свидетельствует о связывании гидрофобных люминесцентных зондов с белками плазмы. Возрастание интенсивности флуоресценции пирена и увеличение индекса полярности микроокружения пирена, при добавлении в плазму крови человека ДСН концентрацией от С=0,2'10~3М до 0,6'10"3М обусловлено локализацией молекул пирена на границе раздела гидрофобной и гидрофильной области глобулы белка плазмы вследствие изменения структуры белка под действием ДСН, встраивающегося в глобулу белка.

4. Возрастание интенсивности фосфоресценции зонда эозина в 1,24 раза, при переходе от БСА, содержащего глюкозу к БСА гликированному в течение 90 мин и неизменность константы скорости затухания фосфоресценции (430с1) после импульсного возбуждения, связано с проникновением люминесцентного зонда в гидрофобные области белка. В этом случае глюкоза не подавляет связывания зонда с этими новыми областями. Подтверждением этого является длинноволновое смещение максимума флуоресценции эозина на 8 нм при переходе к гликированным белкам, что указывает на уменьшение полярности, микроокружения молекул эозина, в глобулах белка с большей, степенью гликирования.

5. Возрастание константы скорости переноса энергии от 3, 1-Ю6 MV1 до 15Д-106 IvT'c"1 при уменьшении концентрации САЧ от 10 мг/мл до 1 мг/мл, связано с увеличением вероятности встреч молекул донора и акцептора вследствие выхода гидрофильных молекул донора-энергии эозина из глобулы белка и проникновением их в другую глобулу, содержащую молекулу акцептора — антрацена, где и осуществляется перенос энергии. Подтверждением межглобулярной диффузии эозина является уменьшение интенсивности фосфоресценции эозина, а также возрастание константы скорости затухания фосфоресценции эозина от 260. с"1 (Ссач=Юмг/мл) до 340 с"1 (Ссач^ 1 мг/мл), вследствие увеличения вероятности тушения триплетных состояний молекул эозина, вышедших из глобул белка в водную макрофазу раствора белка, остаточным кислородом, растворенным в воде.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на International School for Young Scientists and Students on Optics. Laser Physics and

Biophysics. (Saratov, 2004-2010 г.г.); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов». (Москва. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет. 2004-2009 г.г.); Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". (Минск, Беларусь. 2004); XXIII Съезде по спектроскопии, (Звенигород, Московская обл. 2005); IV съезд фотобиологов России (Саратов,

2005); International Memorial Symposium «Molecular Photonics» dedicated to academician A.N. Terenin. (St. Petersburg, 2006); VII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. (Минск, Беларусь.

2006); VII International Young Scientists Conference. Optics and High Technology Material. Science SPO. Scientific Works. (Kyiv, Ukraine. 2006); Симпозиум "Нанофотоника". (Черноголовка. 2007); XXI Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях», (Саратов. 2008); V съезде Российского фотобиологического общества, (Пущино. 2008); XXII Международной научной конференции Математические методы в технике и технологиях, (Псков. 2009); International conference "Organic nanophotonics" (ICON - RUSSIA 2009), (Санкт-Петербург. 2009); Международном Форуме по Нанотехнологиям. «Сенсорные наноматериалы», (Москва, 2009); International conference «Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics», (San-Francisco. 2010).

Достоверность результатов обеспечивается: использованием в экспериментах стандартной современной научной аппаратуры; воспроизводимостью полученных экспериментальных результатов; применением современных методов компьютерной обработки экспериментальных данных; совпадением результатов, полученных на специально созданном импульсном флуориметре, с известными литературными данными.

Заключение диссертации по теме "Оптика"

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В результате анализа полученных спектров поглощения и флуоресценции люминесцентного зонда эозина; а также, определяемого в работе, времени жизни триплетных состояний молекул эозина в воде, буфере сывороточного альбумина человека (САЧ) и плазме крови человека можно сделать вывод о том, что в плазме крови человека полярный эозин преимущественно связан нековалентными связями с белками плазмы крови. Установлено, что интенсивность и время жизни фосфоресценции люминесцентного зонда - эозина чувствительны к структурной перестройке альбуминов плазмы крови под действием поверхностно-активного вещества (ПАВ) додецилсульфата натрия (ДСН).

2. Анализ изменений колебательной структуры спектров флуоресценции пирена в воде, плазме крови человека и в буферном растворе САЧ позволил установить, что полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие как пирен, а, следовательно, и антрацен в плазме крови локализованы в гидрофобной микрофазе белков и липидах плазмы. Денатурация белков плазмы крови под действием ДСН отслеживается по зависимости индекса полярности микроокружения пирена от концентрации ДСН. Установлено, что ДСН способствует выведению ПАУ из глобулы белка.

3. В работе обнаружен и детально исследован процесс триплет-триплетного переноса (Т-Т) энергии электронного возбуждения между полярным эозином - донором энергии и неполярным антраценом - акцептором связанными нековалентными связями с глобулами альбумина сыворотки и плазмы крови. Определены радиусы переноса энергии и объем сферы тушения триплетных состояний донора в результате переноса энергии. Установлено, что при добавлении ДСН наблюдается уменьшение радиуса переноса и объема сферы тушения триплетных состояний донора. Предположено, что это связано с увеличением расстояния между донором и акцептором вследствие изменения структуры белков под действием ДСН. Таким образом, Т-Т перенос энергии является чувствительным индикатором структурных перестроек в белках под действием ПАВ - додецилсульфата натрия

4. Обнаружен синглет-синглетный перенос энергии между триптофановым остатком САЧ и эозином. Согласно теории Фёрстера определен радиус синглет-синглетного переноса, который составил ~9А. Это позволило предположить, что гидрофильный эозин может локализоваться вблизи гидрофобного триптофанила белка.

5. Исследования процесса Т-Т переноса энергии в системе эозин-антрацен при разных концентрациях САЧ позволили обнаружить Т-Т перенос, который может осуществляться в результате межглобулярной диффузии донора энергии эозина за время жизни его в триплетном состоянии. Установлено, что Т-Т перенос энергии между эозином и антраценом осуществляется в белковой микрофазе.

Заключение

Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю доктору физико-математических наук, профессору кафедры оптики и биофотоники физического факультета Саратовского государственного университета Кочубею Вячеславу Ивановичу, оказавшему мне неоценимую помощь на всех этапах выполнения работы. Я благодарен доценту кафедры оптики и биофотоники, кандидату химических наук Правдину Александру Борисовичу, за внимание к работе и помощь в процессе подготовки к эксперименту и за многочисленные плодотворные дискуссии при обсуждении полученных результатов.

Я глубоко признателен заведующему кафедрой общей физики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктору физико-математических наук, профессору Салецкому Александру Михайловичу за постоянное внимание к работе и обсуждение полученных результатов.

Выражаю благодарность заведующему кафедрой оптики и биофотоники Саратовского государственного университета им Н.Г. Чернышевского доктору физико-математических наук, профессору Тучину Валерию Викторовичу за творческий интерес к моей научной работе и поддержку.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Мельников, Андрей Геннадьевич, Саратов

1. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М. : Наука, 1989. 277 с.

2. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М. : Высш.шк., 1989. 199 с.

3. Вавилов С.И. Микроструктура света. Собр. соч. М. : Изд-во АН СССР, 1952. 544 с.

4. Галанин М.Д., Франк И.М. Тушение флуоресценции средой, поглощающей свет // Журнал экспериментальной и теоретической физики. 1951. Т. 21, №2. С. 114-120.

5. Галанин М.Д. Тушение флуоресценции растворов поглощающими веществами // Журнал экспериментальной и теоретической физики. 1951. Т. 21, №2. С. 126-132.

6. Ермолаев В.Л., Бодунов E.H., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. М. : Наука, 1977. 311 с.

7. Forster Т. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluorescens // Annalen der Physik. 1948. Vol. 437, N 1-2. P. 55-75.

8. Forster T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolecularen Uebergangs von Electronenanregungsenergie // Zeitschrift für Naturforschung. 1949. Vol. 4a, P. 321

9. Forster T. Transfer Mechanisms of Electronic Excitation // Discussion of the Faraday Society. 1959. Vol. 27, P. 7

10. Ландау Л.Д., Лившиц Е.М. Квантовая механика. М. : Наука, 1973. 502 с.

11. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М. : Мир, 1986. 496 с.

12. Dexter D.L. A theory of sensitized luminescence in solids // Journal of Chemical Physics. 1953. Vol. 21, N 5. P. 836-850.

13. Теренин A.H., Ермолаев В.JI. Сенсибилизированная фосфоресценция органических молекул при низкой температуре // ДАН СССР. 1952. Т. 85, № 3. С. 547-550.

14. Теренин А.Н., Ермолаев В.Л. Межмолекулярный перенос энергии в явлении сенсибилированной люминесценции органических систем // Успехи физических наук. 1956. Т. 58, № 1. С. 37-68.

15. Sugio S., Kashima A., Mochizuki S., Noda M., Kobayashi К. Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution // Protein Engineering. 1999. Vol. 12, P. 439-446.

16. Степанов B.M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М. : 2009. 326 с.

17. Баранов А.Н., Власова И.М., Микрин В.Е., Салецкий A.M. Лазерная корреляционная спектроскопия процессов денатурации сывороточного альбумина // Журнал прикладной спектроскопии. 2004. Т. 71, № 6. С. 831-835.

18. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. : Наукова думка, 1988. 280 с.

19. Векшин Н.Л. Перенос возбуждения в макромолекулах. М. : 2007. 174 с.

20. Gruenwald D., Cardoso М.С., Leonhard Н., Buschmann V. Diffusion and binding properties investigated by fluorescence correlation spectroscopy // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2005. Vol. 6, N 5. P. 381-386.

21. Vukojevic V., Pramanik A., Yakovleva Т., Rigler R., Terenius L., Bakalkin G. Study of molecular events in cells by fluorescence correlation spectroscopy // Cellular and molecular life sciences. 2005. Vol. 62, N 5. P. 535-550.

22. Мажуль B.M., Ермолаев В.Л., Бобров B.A., Никольская В.П., Конев С.В. //ВесщАНБССР.Сер.б1ял.навук. 1976. Т. 6, С. 52-56.

23. Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Щербин Д.Г. Внутримолекулярная динамика и функциональная активность белков // Биофизика. 2000. Т. 45, № б. С. 965-989.

24. Фогель В.Р., Пастухов А.В., Котельников А.И., Психа Б.Л. Влияние молекулярной динамики на фотоиндуцированный перенос электрона в комплексе эозин-миоглобин // Биофизика. 1997. Т. 42, № 5. С. 1008-1014.

25. Векшин H.JI. Об использовании пирена в качестве люминесцентного индикатора вязкости модельных и биологических мембран // Биологические науки. 1987. Т. 11, С. 59-66.

26. Garland Р.В., Moore С.Н. Phosphorescence of Protein-Bound Erythrosin and Eosin//Biochemical Journal. 1979. Vol. 183, P. 561-572.

27. Мажуль B.M., Зайцева E.M., Шавловский M.M., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре нативного и инактивированного актина // Биофизика. 2001. Т. 46, № 3. С. 988996.

28. Летута С.Н., Кецле ГЛ., Лантух Ю.Д., Пашкевич С.Н. Фотохромные превращения в окрашенных полимерах при двухквантовом возбуждении // Квантовая электроника. 2001. Т. 31, № 10. С. 925-928.

29. Котельников А.И., Кузнецов С.Н., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И. Исследование микроструктуры биологических систем методом триплетных меток // Молекулярная Биология. 1979. Т. 13, № 1. С. 152-159.

30. Horie T., Mizuma T., Kasai S., Awazu S. Conformational change in plasma albumin due to interaction with isolated rat hepatocyte // AJP Gastrointestinal and Liver Physiology. 1988. Vol. 254, N 4. P. 465-470.

31. Фогель В.Р., Рубцова Е.Т., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Исследование структуры и внутримолекулярной динамики фотореактивного пигмент-белкового комплекса эозин-казеин // Биофизика. 1986. Т. 31, № 5. С. 152-154.

32. Дружинин С.Ю., Фогель В.Р., Сырцова Л.А., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Изучение локализации кофактор-связывающего в Mo-Fe-белке нитрогеназы методом триплетных зондов // Биофизика. 1986. Т. 31, № 1. С. 17-20.

33. Меклер В.М., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И., Беркович М.А. Применение фосфоресцентных зондов для исследования модельных и биологических мембран // Биофизика. 1982. Т. 27, № 4. С. 641-645.

34. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М. : Мир, 1972. 512 с.

35. Полянский, Д. В. and Власова, И. М. Исследование связывания зонда эозина с сывороточным альбумином человека методами КР спектроскопии // Материалы Международного молодежного научного форума "Ломоносов 2007" секция "Физика". Саратов. 2007. С. 157-158.

36. Yazhou Z., Helmut G. Photoprocesses of Xanthene Dyes Bound to Lysozyme or Serum Albumin // Photochemistry and Photobiology. 2009. P. 677-685.

37. Waheed A.A., Rao K.S., Gupta P.D. Mechanism of dye binding in the proteins assay using eosin dyes // Analytical Biochemistry. 2000. Vol. 287, N 1. P. 73-79.

38. Kalyanasundaram K., Thomas J.K. Environmental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems // Journal of the American Chemical Society. 1977. Vol. 99, N 7. P. 2039-2044.

39. Векшин Н.Л., Литвинов И.С. //Молекулярная Биология. 1981. Т. 15, С. 1188-1193.

40. Glushko V., Thaler M.S.R., Karp C.D. Pyrene Fluorescence Fine Structure as a Polarity Probe of Hydrophobic Regions: Behavior in Vodel Solvents // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1981. Vol. 210, N 1. P. 33-42.

41. Векшин H.JI. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино. : "Фотон-век", 2006. 168 с.

42. Skupinska К., Zylm М., Misiewicz I., Kasprzycka-Guttman Т. Interaction of anthracene and its oxidative derivatives with human serum albumin // Acta Biochimica Polonica. 2006. Vol. 53, N 1. P. 102-112.

43. Grainger D.A., Nishimura A.M. Triplet state energy transfer in several proteins //Biophysical Journal. 1977. Vol. 20,N 3. P. 383-386.

44. Ghiron C.A., Longworth J.W., Ramachandran N. Triplet-triplet energy transfer in a-trypsin // The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1973. Vol. 70, N 12. P. 3703-3706.

45. Galley W.C., Stryer L. Trip let-trip let energy transfer in proteins as a criterion of proximity // The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1968. Vol. 60, N 1. P. 108-114.

46. McCarville M., Hauxwell R. Studies of phosphorescent probes for proteins // Biochimica et Biophysica Acta. 1971. Vol. 251, N 8. P. 285-2911

47. Bieri O., Wirz J., Hellrung В., Schutkowski M., Drewello M., Kiefhaber T. The speed limit for protein folding measured by triplet-triplet energy transfer // The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1999. Vol. 96, N 17. P. 9597-9601.

48. Fierz В., Joder K., Krieger F., Kiefhaber T. Protein Folding Protocols. Humana Press, 2007. 187 p.

49. Wagner P.J., Klan P. Intramolecular Triplet Energy Transfer in Flexible Molecules: Electronic, Dynamic, and Structural Aspects // Journal of American Chemical Society. 1999. Vol. 121, N 41. P. 9626-9635.

50. Hiroaki О., Naho I., Hiroaki S., Takashi K., Yoshimasa K. Detection of DNA bending in DNA-PAP1 protein complex by fluorescence resonance energy transfer // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1997. Vol. 231, N 3. P. 553-556.

51. Алфимова Е.Я., Лихтенштейн Г.И. Флуоресцентное исследование переноса энергии, как метод изучения структуры белков // Итоги науки и техники.Молекулярная биология.М.: ВИНИТИ. 1976. Т. 8. ч. 2, С. 127-179.

52. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М. : Наука, 1965. 232 с.

53. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., Карманский И.М. Оценка глубины погружения остатков триптофана в липидную фазу сывороточных липопротеидов низкой плотности // Биохимия. 1980. Т. 45, № 4. С. 622-628.

54. Добрецов Г.Е., Чекрыгин О.В. Анализ синглет-синглетного переноса энергии в мембранах. II. Перенос с точечного белка на- флуоресцентный зонд, расположенный на двух поверхностях липидного бислоя // Биофизика-. 1981. Т. 26, С. 375-376.

55. Brdiczka D. Contact sites between mitochondrial envelope membranes. Structure and function in energy- and protein- transfer // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. Vol: 1071, N 3. P. 291-312.

56. Miller J.N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis // Analyst. 2005. Vol. 130, P. 265-270.

57. Brynda E. J., Hlady V., Andrade J.D. Protein packing in adsorbed layers studied by excitation energy transfer // Colloid and Interface Sci. 1990. Vol. 139, N 2. P. 374-380.

58. O'Hara P.B., Gorski K.M., Rosen M.A. Energy transfer as a probe of protein dynamics in the proteins transferrin and calmodulin // Biophysical Journal. 1988. Vol. 53, P. 1007-1013.

59. Tian J., Liu X., Zhao Y., Zhao S. Studies on the interaction between tetraphenylporphyrin compounds and bovine serum albumin // Luminescence. 2007. Vol. 22, N 5. P. 446-454.

60. Wang F., Yang J., Wu X., Wang X., Guo C., Jia Z. Improvement of the acridine orange-protein-surfactant system for protein estimation based on aromatic ring stacking effect of sodium dodecyl benzene sulphonate // Luminescence. 2006. Vol. 21, P. 186-194.

61. Cao Z., Tan W. Molecular aptamers for real-time protein-protein interaction study//Chemistry. 2005. Vol. 11, N 15. P. 4502-4508.

62. Raicu V., Jansma D.B., Miller R.J.D., Friesen J.D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer // Biochemical Journal. 2005. Vol. 385, N 1. P. 265-277.

63. Green H., Alberola-Ila J. Development of ERK Activity Sensor, an in vitro, FRET-based sensor of Extracellular Regulated Kinase activity // BMC Chemical Biology. 2005. Vol. 5,N 1. P. 1

64. Lopukhin Y.M., Dobretsov G.E., Gryzunov Y-.A. Conformational changes in albumin molecule: A new response to pathological process // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. Vol. 130, N 1. P. 615-619.

65. Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. М. : ИРИУС, 1994. 226 с.

66. Черницкий Е.А. Люминесценция и динамика структуры белков. Минск. : 1978.

67. Strambini G.B. Tryptophan phosphorescence as a monitor of protein flexibility //Journal of Molecular Liquids. 1989. Vol. 42, P. 155-165.

68. Мажуль B.M., Зайцева E.M., Щербин Д.Г. Фосфоресценция при комнатной температуре триптофановых остатков белков // Журнал прикладной спектроскопии. 2002. Т. 69, № 2. С. 186-191.

69. Laible P.D., Chynwat V., Thurnauer М.С., Schiffer M., Hanson D.K., Frank H.A. Protein modifications affecting triplet energy transfer in bacterial photosynthetic reaction centers // Biophysical Journal. 1998. Vol. 74, N 5. P. 26232637.

70. Zemel H., Hoffman B.M. Long-range triplet-triplet energy transfer within metal-substituted hemoglobins // Journal of the American Chemical Society. 2010. Vol. 103, N5. P. 1192-1201.

71. Hammes-Shiffer S. Impact of enzyme motion on activity // Biochemistry.2002. Vol. 41, N 45. P. 13335-13343.

72. Linderstrom-Lang, Shellman Protein structure and enzyme activity. // The Enzymes. 1959. Vol. 1, P. 443-510.

73. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. М.: Книжный дом. "Университет", 2002. 376 с.

74. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии . М. : Агар, 1999. 512 с.

75. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М. : Высшая школа,2003. 75 с.

76. Kragh-Hansen U. Effects of aliphatic fatty acids on the binding of Phenol Red to human serum albumin // Biochemical Journal. 2010. Vol. 195, P. 603-613.

77. Peters T.Jr. Serum Albumin // Advances in Protein Chemistry. 1985. Vol. 37, P. 161-245.

78. Sakamoto Y., Davis E., Madison J., Watkins S., McLaughlin H., Leahy T.D., Putman F.W. Purification and structural study of two albumin variants in an Irish population // Clinica Chimica Acta. 1991. Vol. 204, N 1-3. P. 179-187.

79. Fiume L., Busi C., Mattioli A. Lactosaminated human serum albumin as hepatotropic drug carrier: Rate of uptake by mouse liver // FEBS Letters. 1982. Vol. 146, N l.P. 42-46.

80. Yapel A.F.Jr. 1. Albumin microspheres: Heat and chemical stabilization // Methods in Enzymology. 1985. Vol. 112, P. 3-18.

81. Dugaiczyk A., Law S.W., Dennison O.E. Nucleotide sequence and the encoded amino acids of human serum albumin mRNA // The Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1982. Vol. 79, N 1. P. 71-75.

82. Brown R.J. Structural Origins of Mammalian Albumin // Federation Proceedings. 1976. Vol. 35, N 10. P. 2141-2144.

83. Takeda K. A Kinetic Study on the Conformational Change of Bovine Serum Albumin Induced by Sodium Dodecyl Sulfate // Bulletin.of the Chemical Society of Japan. 1983. Vol. 56, N 4. P. 1037-1040.

84. Seybold P.G., Gouterman M., Callis J. Calorimetric, photometric andiifetime determinations of fluorescence yields of fluorescein dyes // Photochemistry and Photobiology. 1969. Vol. 9, N 3. P. 229-242.•j

85. Cherry R.J., Cogoli A., Oppliger M., Schneider G., Semenza G. A spectroscopic technique for measuring slow rotational diffusion of macromolecules. 1: Preparation and properties of a triplet probe // Bio.chemistry. 1976. Vol. 15, N 17. P. 3653-3656.

86. Кецле Г.А., Левшин Л.В., Мельников Г.В., Минаев Б.Ф. Исследование механизма влияния магнитного поля на триплет-триплетную аннигиляцию смешанного типа // Оптика и спектроскопия. 1981. Т. 51, № 4. С. 665-668.

87. Trojan J., Raedle J., Herrmann G., Brieger A., Zeuzem S. Detection of microsatellite instability from archival, hematoxylin-eosin-stained colorectal cancer specimen // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2002. Vol. 126, N 2. P. 202-204.

88. Giordano G., Gabrielli M., Gnetti L., Ferri T. Oncocytic carcinoma of parotid gland: a case report with clinical, immunohistochemical and ultrastructural features // World Journal of Surgical Oncology. 2006. Vol. 4yP. 54

89. Кочубей В.И., Конюшкова Ю.Г. Методы спектральных исследований крови и костного мозга. Саратов. : Издательство Саратовского университета, 2000. 71 с.

90. Vlasova I.M., Saletsky A.M. Fluorescence of an eosine probe in solutions of human serum albumin with organic and inorganic ligands // Russian Journal of Physical Chemistry B, Focus on Physics. 2008. Vol. 2, N 2. P. 298-301.

91. Vlasova I.M., Saletsky A.M. Spectroscopic investigation of binding of three fluorescent nanomarkers to bionanomolecules of human serum albumin in^ dependence on pH // Current Applied Physics. 2009. Vol. 9, N 5. P. 1027-1031.

92. ГордонА., Форд.Ф. Спутник химика. M. : Мир, 1976. 541 с.

93. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М. : Наука, 1989.

94. Ledesma-Osuna A.I., Ramos-Clamont G., Vazquez-Moreno L. Characterization of bovine serum albumin glycated with glucose, galactose and lactose // Acta Biochimica Polonica. 2008. Vol. 55, N 3. P. 491-497.

95. Mazhul V.M., Scharbin D.G. Tryptophan phosphorescence as a monitor of flexibility of membrane proteins in cells // Proceedings SPIE. 1997. Vol. 2980, P. 487-495.

96. Perez-Ruiz T., Martinez-Lozano C., Tomas V., Martin J. Determination of allopurinol by micelle-stabilised room-temperature phosphorescence in real samples // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. Vol. 32, N 2. P. 225231.

97. Кананович С.Ж., Мажуль В.М. Люминесцентный анализ структурно-динамического состояний щелочной фосфатазы // Журнал прикладной спектроскопии. 2003. Т. 70, № 5. С. 673-677.

98. Мельников Г.В., Лобачев М.И., Мельников А.Г. Высокочувствительный импульсный флуориметр для экологического мониторинга окружающей среды //Вестник СГТУ. 2003. № 1. С. 121-127.

99. Перри Д.Г. Справочник инженера-химика. М. : Химия, 1969. 660 с.

100. Berlman I.B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. New York. : Academic Press, 1971. 473 p.

101. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок. М. : Мир, 1985. 272 с.

102. Бахшиев Н.Г. Спектроскопия межмолекулярных взаимодействий. JI. : Наука, 1972. 262 с.

103. Hirano К. Electronic Structure and Spectra of Organic Dye Anions of Uranine and Eosin Y // Bulletin of the Chemical Society of Japan. 1983. Vol. 56, N 3. P. 850-854.

104. Бухарова E.M., Власова И.М., Салецкий A.M. Структура молекулярных ассоциатов флуоресцентных зондов в растворах сывороточного альбумина человека // Журнал прикладной спектроскопии. 2008. Т. 75, № 6. С. 782-788.

105. Husain A., Ovadia J., Grossweiner L.I. Pulse radiolysis of the eosin-human serum albumin complex // Transactions of the Faraday Society. 1970. Vol. 66, P. 1472-1484.

106. Иванов И.И., Зарембский P.A. Введение в клиническую биохимию. Ленинград. : Здоровье, 1969. 278 с.

107. Власова И.М., Салецкий A.M. Исследование денатурации сывороточного альбумина человека под действием додецилсульфата натрия по собственной флуоресценции белка // Журнал прикладной спектроскопии. 2009. Т. 76, № 4. С. 564-570.

108. Johnson N.L. In "Modern Physical Methods in Biochemistry". Amsterdam. : Elsever Science Publishers, 1985. 347 p.

109. Seret A., Van de Vorst A. Solubility properties of Eosin Y and Rose Bengal triplet state in sodium dodecyl sulfate micellar solutions // The Journal of Physical Chemistry A. 1990. Vol. 94, N 13. P. 5293-5299.

110. McKenzie M., McLemore Т., Rankin P., Martin R.R., Wray N., Cantrell E., Busbee D. A human plasma component that binds benzo(a)pyrene // Cancer. 1978. Vol. 42, P. 2733-2737.

111. Tannheimer S.L., Barton S.L., Ethier S.P., Burchiel S.W. Carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons increase intracellular Ca2+ and cell proliferation in primary human mammary epithelial cells // Carcinogenesis. 1997. Vol." 18, N 6. P. 1177-1182.

112. Yu D., Kazanietz M.G., Harvey R.G., Penning T.M. Polycyclic Aromatic Hydrocarbon o-Quinones Inhibit the Activity of the Catalytic Fragment of Protein Kinase С // Biochemistry. 2002. Vol. 41, P. 11888-11894.

113. Деев А.И., Осис Ю.Г., Формазюк B.E. Увеличение содержания воды в липидной фазе липопротеидов при перекисном окислении // Биофизика. 1983. Т. 28, С. 629-631.

114. Nakajima A. Fluorescence spectra of anthracene and pyrene in water and in aqueous surfactant solution // Journal of Luminescence. 1977. Vol. 15, P. 277-282.

115. Wan Y.S. Aqueous Solubility of Polynuclear Aromatic Hydrocarbons // J.Chem.Eng.Data. 1977. Vol. 22, N 2. P. 399-402.

116. Баранов A.H., Власова И.М., Салецкий A.M. Исследование процессов агрегации сывороточного альбумина // Журнал прикладной спектроскопии. 2004. Т. 71, №2. С. 204-207.

117. Добрецов Г.Е., Курек Н.К., Махов В.Н., Сырейщикова Т.И., Якименко М.Н. Ферстеровский перенос энергии между флуоресцентными зондами в моделях биологических мембран // Препринты ФИАН СССР. 1987. № 11. С. 56

118. Салецкий A.M., Мельников А.Г., Правдин А.Б., Кочубей В.И. Комплексообразование пирена и антрацена с плазмой крови человека // Журнал прикладной спектроскопии. 2008. Т. 75, № 3. С. 379-382.

119. Janatova J., Fuller J.K., Hunter M.J. The heterogeneity of bovine albumin with respect to sulfhydryl and dimer content // The Jolirnal of Biologicab Chemistry. 1968. Vol. 243, N 13. P. 3612-3622.

120. Миттел К. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии . М. : Мир, 1980. 597 с.

121. Турро Н. Молекулярная фотохимия. М. : Мир, 1967. 328 с.

122. Turro N.J., Gratzel M., Braun A.M. Photophysikalische und photochemische Prozesse in micellaren Systemen // Angewandte Chemie. 1980. Vol. 92, N 9. P. 712-734.

123. Кузьмин М.Г., Зайцев Н.К. Кинетика фотохимических реакций разделения зарядов в мицеллярных растворах // Итоги науки и техники.ВИНИТИ.Электрохимия. 1988. Т. 28, С. 248-304.

124. Lachish U., Ottolenghi М., Rabani J. Triplet-triplet annihilation of tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(2+) in micelle solutions // Journal of American Chemical Society. 1977. Vol. 99, N 24. P. 8062-8063.

125. Багнич С.А. Миграция триплетных возбуждений сложных молекул в неупорядоченных средах и в системах с ограниченной геометрией // Физика твердого тела. 2000. Vol. 42, N 10. Р. 1729-1756.

126. Кучеренко М.Г., Игнатьев А.А., Жолудь А.А. Учет конформационной подвижности макромолекул при анализе сигналов люминесцентных зондов // Биофизика. 2006. Т. 51, № 1. С. 44-56.

127. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М. : Наука, 1972. 448 с.ч

128. Меклер В.М., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Применение зондов, испускающих аннигиляционную замедленную флуоресценцию, для исследования модельных и биологических мембран // Биофизика. 1983. Т. 28, С. 503-504.

129. Bai Y., Nussinov R. Protein folding protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2006. 344 p.

130. Krieger F., Fierz В., Bieri O., Drewello M., Kiefhaber T. Dynamics of unfolded polypeptide chains as model for the earliest steps in protein folding // Journal of Molecular Biology. 2003. Vol. 332, P. 265-274.

131. Krieger F., Fierz В., Axthelm F.s Joder K., Meyer D., Kiefhaber T. Intrachain diffusion in a protein loop fragement from carp parvalbumin // Chemical Physics. 2004. Vol. 307, P. 209-215.

132. Forkert G.P., Barton Н.А., Costatini M.G., Marietta M.A. The 4S poly cyclic aromatic hydrocarbon-binding protein: immunohistochemical localization in mice // Carcinogenesis. 2009. Vol. 11, N 10. P. 1831-1835.

133. Page T.J., Brien S.O., Karrie H., Mac Williams P.S., Jefcoate C.R., Czuprynski C.J. 7,12-Dimethylbenza.anthracene-Induced Bone Marrow Toxicity Is p53-Dependent // Toxicological sciences. 2003. Vol. 74, P. 85-92.

134. Hasenhuettl G.L., Hartel R.W. Food emulsifiers and their applications. Springer, 2008. 145 p.

135. Nail S.L., Akers M.J. Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Springer, 2002. 175 p.

136. Yoshiura H., Hashida M., Kamiya N., Goto M. Factors affecting protein release behavior from surfactant-protein complexes under physiological' conditions // International journal of pharmaceutics. 2007. Vol. 338, N 1-2. P. 174-179.

137. Gelamo E.L., Tabak M. Spectroscopic studies on the interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2000. Vol. 56, N 11. P. 2255-2271.

138. Perrin F. Radiationless intermolecular energy transfer // C.r.Acad.Sci. 1924. Vol. 178, N 1978. P. 1980

139. Dong D.C., Winnik М.А. The Ру scale of solvent polarities. Solvent effects on the vibronic fine structure of pyrene fluorescence and empirical correlations with ET and g values // Photochemistry and Photobiology. 1982. Vol. 35, N 1. P. 17-21.

140. Мельников Г.В., Губина Т.И., Дячук О.А. Влияние полярности микроокружения пирена на интенсивность его твердофазной люминесценции при комнатной температуре // Журнал физической химии. 2006. Т. 80, № 7. С. 1319-1323.

141. Almgren М., Grieser F., Thomas J.K. Dynamic and static aspects of solubilization of neutral arenes in ionic micellar solutions // Journal of the American Chemical Society. 1979. Vol. 101, N 2. P. 279-291.

142. Zhang Q., Tang N., Schepmoes A.A., Phillips L.S., Smith R.D., Metz Т.О. Proteomic Profiling of Nonenzymatically Glycated Proteins in

143. Human Plasma and Erythrocyte Membranes // Journal of Proteome Research. 2008. Vol. 7, N 5. P. 2025-2032.

144. Baynes J.W, Watkins N.G., Fisher C.I., Hull C.J., Patrick J.S., Ahmed-M.U., Dunn J.A., Thorpe S.R. The Amadori product on protein: structure and reactions // Progress in Clinical Biological Research. 1989. Vol. 304, P. 43-67.

145. Baynes J.W. The role of AGEs in aging: causation or correlation // Experimental Gerontology. 2001. Vol. 36, N 9. P. 1527-1537.

146. Bouma В., Kroon-Batenburg L.M.J., Wu Y.-P., Brunjes В., Posthuma G., Kranenburg O., de Groot P.G., Voest E.E., Gebbink M.F.B.G. Glycation Induces

147. Formation of Amyloid Cross-b Structure in Albumin // The Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278, P. 41810-41819.

148. Mendez D.L., Jensen R.A., McElroy L.A., Pena J.M., Esquerra R.M. The effect of non-enzymatic glycation on the unfolding of human serum albumin // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2005. Vol. 444, N 2. P. 92-99.

149. Shaklai N., Garlick R.L., Bunn H.F. Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin alters its conformation and function // The Journal of Biological Chemistry. 1984. Vol. 259, N 6. P. 3812-3817.

150. Правдин А.Б., Кочубей В.И., Мельников A.T. Фосфоресцентный зонд -эозин в исследовании структурных изменений в гликированных белках. // Оптика и спектроскопия.Биомедицинская оптика и спектроскопия. 2010. Т. 109, №2. С. 1278-1281.