Селективная кинетическая спектроскопия растворов и модельных биомембран тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

РГ6 од

О ') '

£ . Национальная академия наук Беларуси

Институт физики им. Б.И.Степанова

УДК 535.37:576.3

НЕМКОВИЧ Николай Алексеевич

СЕЛЕКТИВНАЯ КИНЕТИЧЕСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ РАСТВОРОВ И МОДЕЛЬНЫХ БИОМЕМБРАН

01.04.05-оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических паук

МИНСК 1998

Работа выполнена в Институте физики им. Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси

Официальные оппоненты:

Оппонирующая организация -

доктор физ.-мат. наук профессор Джагаров Б.М.

доктор физ.-мат. наук профессор Орлович В. А.

доктор физ.-мат. наук профессор Симонов А.П.

Международный лазерный центр при БГГТА

Защита состоится _1998 года в ^ часов на заседании совета по защите

диссертаций Д 01.05.01 при Институте физики НАНБ (220072, г.Минск, пр. Ф. Скорины, 68, тел. 284 17 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физики НАНБ.

Автореферат разослан 1998 г.

Учёный секретарь совета по защите диссертаций доктор физ.-мат. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время в лазерной физике наблюдается все большее смещение интересов и концентрация усилий больших групп исследователей на изучении сложных молекулярных систем, в том числе растворов органических молекул и биологических объектов. С одной стороны, указанная тенденция обусловлена прогрессом, достигнутым в разработке совершенно новых методов лазерного детектирования различных физико-химических превращений и изменений, протекающих в жидкостях и биологических системах, а с другой - это вызвано исключительной научной и практической важностью разрабатываемых проблем. В качестве примера одного из новых научных направлений, возникшего совсем недавно и связанного с изучением сложных молекулярных и биологических систем, достаточно назвать биомедицинскую оптику.

Характерной особенностью жидких молекулярных систем являются флуктуации микроплотности, микрополярности и других микрохарактеристик среды, вызванные тепловым движением молекул и их сегментов. В биологических объектах наряду с тепловыми флуктуациями существуют также градиенты полярности, плотности, вязкости и т.д., обусловленные значительной пространственной гетерогенностью указанных структур. Пространственно-тепловые флуктуации и структурная гетерогенность в жидких молекулярных системах приводит к спектральной гетерогенности флуоресцентных проб в растворах и биологических объектах.

Актуальность исследования этого явления в растворах связана с их широким распространением в физике, химии, биологии и медицине. В квантовой электронике растворы красителей используются в качестве активных лазерных сред, затворов, нелинейных преобразователей света, фоторефрактивных материалов. В химии растворы сложных органических молекул являются базовыми объектами для изучения многих реакций, и в первую очередь, переноса заряда в различных электронных состояниях. Здесь учет флуктуационной природы электронных спектров сложных органических молекул может в будущем сыграть

решающую роль в целенаправленном управлении химическими реакциями, так как известно, что сольвагациошше условна сильно влияют на их скорость и механизм.

В последнее время стала ясна исключительная важность изучения эффектов пространственно-флуктациошюй природы в биофизике, ввиду широкого распространения метода флуоресцентного зонда и значительного изменения структуры и характеристик биологических систем на расстояниях сравнимых с размерами молекулы флуорофора. Как показано в данной работе, последнее обстоятельство представляет уникальную возможность селективного возбуждения путем перестройки частоты света отдельных групп флуоресцирующих центров с пространственным разрешением в несколько ангстрем, т.е. на молекулярном уровне этот подход может послужить основой ранней диагностики патологических изменений клеток, вызванных различными причинами, в том числе, облучением людей низкошггенсивной радиацией.

Связь работы с крупными научными программами и темами. Отдельные этапы работы выполнялись в рамках различных программ и проектов:

- Республиканская комплексная программа "Исследование сверхбыстрых процессов релаксации и обмена в сложных органических соединениях методами лазерной кинетической спектроскопии", 1986-1990 гг. (тема "Спектроскопия 2.206");

- Государственная программа по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, 19911995 гг. (раздел 9.1.П., тема "Мембрана");

- Республиканская комплексная программа "Разработка методов кинетической спектроскопии высокого временного разрешения", 1991-1995 лг. (тема "Спектроскопия 3.01в");

- Республиканская комплексная программа "Закономерности взаимодействия света с веществом и физические основы использования генерации света", 1996-2000 гг.(тема "Квант 17");

- Проект Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Лазерная селективная спектроскопия с высоким временным разрешением различных природных объектов", 1992-1994 гг;

- Проект Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Пико- и фемтосекундная спектроскопия органических систем с динамическим неоднородным упшрением электронных спектров", 1995-1997 гг.

- Проект Международного научно-технического центра "Лазеры с синхронизацией мод и их применение", 1997-2000 гг.

Лель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в обнаружении, всестороннем доказательстве и использовании для исследования различных процессов нового и важного эффекта, динамического неоднородого упшрения электронных спектров сложных органических молекул в жидких растворах и модельных биологических мембранах.

Основные задачи работы, вытекающие из поставленной цели, можно сформулировать следующим образом:

- построение физической модели, экспериментальное обнаружение и исследовашге динамического неоднородного упшрения электронных спектров красителей в жидких растворах;

- выяснение механизмов спектральной релаксации в двух- и трехкомпонентных растворах красителей при стоксовом и антистоксовом возбуждении;

- исследование особенностей вращения электродипольных молекул флуорофоров в полярных растворах и модельных мембранах;

- изучение направленного (дисперсного) переноса энергии в полимерных пленках, активированных красителями и фотосинтетическими пигментами;

- исследование характера неоднородного уширения электронных спектров и разработка спектроскопической модели флуоресцентных зондов в модельных биологических мембранах;

- использование спектроскопии красного краевого возбуждения для изучения микрохарактеристик модельных биологических мембран;

- разработка и создание лазерной аппаратуры, а также методов регистрации спектрально-кинетических характеристик флуоресценции с высоким (1О"10-Ю"9 сек) временным разрешением.

Методы проведённого исследования. При выполнении данной работы были разработаны и использовались на различных стадиях исследований несколько лазерных спсктрофлуориметров. Все они включали в качестве источников возбуждения ТЕА-азотные лазеры оригинальной конструкции и накачиваемые ими РОС-лазеры на красителях. Основу регистрирующей системы составляли стробоскопические осциллографы или вольтметры, а также скоростные фотоумножители. Спектрофлуориметры позволяли регистрировать мгновенные спектры флуоресценции и анизотропии испускания (предельное разрешение 200 псек) и кинетику послесвечения с деконволюцией импульса флуоресценции и разложением на экспоненты при широком варьировании частоты возбуждения (337 нм, 365-750 им). Различные способы измерений на лазерных спекгрофлуориметрах защищены 6 авторскими свидетельствами на изобретения.

Научная новизна полученных результатов. В диссертации обнаружено новое явление - динамическое неоднородное упшрение электронных спектров двух- и трехкомпонентных растворов красителей. Впервые измерены мгновенные спектры флуоресценции и спектры длительности послесвечения жидких растворов при стоксовом и антистоксовом возбуждении. Впервые установлено, что вследствие дополнительного (по отношению к чисто тепловому) вращению молекулы флуорофора в процессе межмолекулярной конфигурационной релаксации скорость деполяризации флуоресценции растворов сложных молекул зависит от частоты регистрации и возбуждения. Развиты представления о направленном характере безызлучательиого индуктивно-резонансного переноса энергии электронного возбуждения в системах с неоднородно-уширенными спектрами. Впервые показано, что направленный (дисперсный) перенос энергии приводит к длинноволновому сдвигу спектров концентрированных растворов красителей и фотосинтетических пигментов во времени.

В диссертации впервые дано физическое обоснование и получены доказательства спектральной гетерогенности мономерных молекул флуоресцентных зондов в модельных биологических мембранах - лецитиновых липосомах и тенях эршроцитов человека. Впервые, с помощью специальных экспериментов по переносу энергии, доказано, что пространственное разрешение

метода флуоресцентного зонда при сканировашш частоты возбуждения на красном склоне спектра поглощения флуорофора составляет менее нанометра. Впервые, с помощью модифицированного электрооптического абсорбциошюго и эмиссионного методов измерены дипольные моменты в различных электронных состояниях амфифилыгых флуоресцентных зондов и на этой основе с использованием спектроскопии красного краевого возбуждения получены количествегтые данные о локальной диэлектрической константе модельных биологических мембран, включая тени эритроцитов крови человека.

В процессе выполнения диссертации разработан типоряд ТЕА-азотных лазеров с коротким (<10'9 сек) импульсом генерации, которые не имеют аналогов в СНГ и предназначены для накачки перестраиваемых субнано- и пикосекундных РОС-лазеров на красителях. Создан полностью автоматизированный лазерный спектроф луориметр.

Практическая значимость полученных результатов. Результаты работ автора по динамике формирования спектров испускания и вращению зондов в растворах и мембранах, а также результаты развития этих работ другими исследователями нашли отражение в ряде монографий и учебных пособий, относящихся к различным областям физики, химии, биофизике, в том числе:

- Nemkovich N.A., Rubinov A.N., Tomin V.l. Inhomogeneous broadening of electronic spectra of dye molecules / Topics in fluorescence spectroscopy: Ed. Lakowicz J R.- New York: Plenum Press, 1991,- Vol. 2: Principles.- P. 367-428.

- Topics in fluorescence spectroscopy: Biochemical Applications / Ed. Lakowicz J.R.New York: Plenum Press, 1991,- Vol. 3.

- Сольватохромия: Проблемы и методы./ Под. ред. Н. Г. Бахшиева. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1989. - 320 с.

- Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. - Киев: Наукова думка, 1988. - 280С.

- Demchenko А. P. Ultraviolet spectroscopy of proteins. - Berlin: Springer, 1986. - 320 p.

- Гайсенок В. А., Саржевский A. M. Анизотропия поглощения и люминесценции многоатомных молекул. - Минск: Университетское, 1986. - 315 с.

- Левшин JI. В., Салецкий А. М. Люминесценция и ее измерения: Молекулярная люминесценция. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 272 с.

Разработанный автором метод исследования распределения физических характеристик мембран клеток с высоким пространственным разрешением планируется адаптировать к применению в клинической практике с целью ранней диагностики патологий щитовидной железы у детей и подростков.

В практическом плане значительный интерес представляют разработанные азотные лазеры с поперечным разрядом низкого и высокого давления, которые используются в таких организациях как НИИ Прикладных физических проблем им. А.Н. Севченко при БГУ (г. Минск). Институт тепло- и массообмена им. A.B. Лыкова HAH Б (г. Минск), НИИ ядерных проблем при БГУ (г. Минск), Объединенный институт ядерных исследований РАН (г. Дубна), Институт химии поверхности HAH Украины (г. Киев) и др. Созданный в процессе выполнения работы автоматизированный лазерный спектрофлуориметр внедрен в НИИ ядерных проблем при БГУ (г. Минск).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Электронные спектры сложных органических молекул в двух- и трехкомпонентных жидких растворах характеризуются динамическим неоднородным уш прением.

2. Выделение избытка энергии межмолекулярных взаимодействий в процессе конфигурационной релаксации приводит к дополнительному (по отношению к чисто тепловому) вращению молекул флуоресцентных зондов в полярных растворах и модельных биологических мембранах.

3. Безызлучательный индуктивно-резонанашй перенос энергии электронного возбуждения между химически идентичными молекулами сложных органических соединений в твердых концентрированных растворах вызывает сдвиг спектра флуоресценции во времени, диапазон которого зависит от частоты возбуждающего света.

4. Для молекул флуоресцентных зондов в фосфолшщщшх бислойных мембранах характерна спектральная неоднородность. В отличие от растворов она

одновременно носит статический и динамический характер, что обусловлено, с одной стороны, распределением флуорофоров по глубине мембраны, а с другой -флухтуациями энергии межмолекулярных взаимодействий для каждой глубины локализации зонда.

5. Исследование характеристик флуоресценции при сканировании частоты возбуждения по красному склону спектра поглощения зонда позволяет получать информацию о распределении микрохарактеристик внутри мембраны с пространственным разрешением, сравнимым с размерами молекулы флуорофора.

Личный вклад соискателя. Содержание диссертации отражает персональный вклад автора в опубликованные работы. Постановка некоторых проблем, а также обсуждение их результатов осуществлялись совместно с академиком А.Н. Рубиновым и профессором В.И. Томиным. Автором осуществлен выбор направлений исследований, сформулирована и обоснована постановка всех экспериментальных и теоретических исследований, проведашых в период с 1980 по 1998 гг., разработана методика эксперимента и выполнены первые исследования спектральной релаксации в растворах с наносекундным временным разрешением при широком варьировании частоты возбуждения. Работы за период с 1985 по 1998 гг. выполнялись автором совместно с руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В данной работе частично использованы результаты, вошедшие в кандидатские диссертации Д.М. Гакамского и Ю.В. Звиневича, которые выполнены под научным руководством автора и успешно защищены. Обобщение научных результатов, представленных к защите сделано лично автором.

Аппробация результатов диссертации» Результаты диссертации представлялись в 62 докладах (в т. ч. - 23 с зачтением, из них 11 приглашешгых и/или пленарных) на следующих конференциях:

• Лазеры на основе сложных органических соединений и их применение (Душанбе, 1977г.,.Ужгород, 1980 г.);

• Международная конференция по люминесценции (Сегед, 1979 г.);

• Сибирское совещание по спектроскопии (Томск, 1981 г.);

• Всесоюзное совещание по люминесценции (Самарканд, 1979 г., Харьков , 1982

г.);

• Республиканская школа-семинар по лазерному, оптическому и спектральному приборостроению (Минск, 1983 и 1985 гг.);

• Международная конференция «Оптическая спектроскопия» (Райнхардсбрун, 1984 г., Айзенах, 1988 г.);

• Всесоюзное совещание «Люминесценция молекул и кристаллов» (Таллин, 1987

г.);

• Всесоюзное совещание «Органические люминофоры и их применение в народном хозяйстве» (Харьков, 1987 г.);

• Семинар «Лазерная спектроскопия сложных молекул» (Лохусалу, 1988 г.);

• Международная конференция по когерентной и нелинейной оптике (Минск, 1988 г.);

• Всесоюзный съезд по спектроскопии (Киев, 1988 г.);

• Международный симпозиум «Сверхбыстрые процессы в спектроскопии» (Нойбрадденбург, 1989 г., Байроут, 1991 г., Вильнюс, 1993 г.);

• Международная конференция «Статистическая механика химических реакций в жидкости» (Новосибирск, 1989 г.);

• Международная конференция « Применение лазеров в науках о жизни » (Москва, 1990 г., Ювяскула, 1992 г., Минск, 1994 г., Йена, 1996 г.);

• Всесоюзное совещание по фотохимии (Новосибирск, 1989 г.);

• Европейский конгресс по молекулярной спектроскопии (Дрезден, 1989 г., Вена, 1992 г.);

• Международная конференция по лазерной спектроскопии (Печ, 1989 г.);

• Конгресс международной комиссии по оптике (Будапешт, 1993 г.);

• IUP АС симпозиум по фотохимии (Прага, 1994 г.);

• Северный симпозиум по компьютерным расчетам (Эспоо, 1993 г.);

• Международный симпозиум по биомедицинской оптике (Будапешт, 1993 г., Лос-Анжелес, 1994 г., Сан Хосе 1995 г. ,1998 г.);

• Международная конференция по люминесценции (Москва, 1994 г.);

• Симпозиум по биомедицинской оптике «Европа'94» (Лилль, 1994 г.);

• Международная конференция по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1995 и 1997 гг.);

• Международный симпозиум по фотофизике и фотохимии молекул и ионов (Санкт-Петербург, 1996 г.);

• Европейская конференция по лазерам и электрооптике (Гамбург, 1996 г.);

• Международная конференция «Свет и биологические системы» (Вроцлав, 1995

г.);

• Русско-немецкий семинар по лазерной физике (Бонн, 1996 г.);

• Международная конференция но методам и применениям флуоресцентной спектроскопии (Берлин, 1997 г.);

• Европейская конференция по спектроскопии биологических молекул (Сан Лоренцо, 1997 г.).

Опубликованность результатов. Результаты диссертации опубликованы в 1 монографии и 5 препринтах, 53 статьях (в том числе 3 обзорные статьи, 12 статей в международных журналах, 24 статьи в журналах СНГ, 14 статей в сборниках трудов международных конференций), в шести описаниях изобретений к авторским свидетельствам, а также в 62 тезисах конференций. Общий объём опубликованных материалов составляет 637 страниц.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 7 глав, основных выводов, приложения, списка использованных источников и содержит 205 страниц текста, включая 49 рисунков, 13 таблиц и список литературы из 314 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

I глава посвящена обнаружению и исследованию динамического неоднородного уширения спектров красителей в жидких растворителях. При анализе спектральных свойств полярных растворов следует рассматривать физические процессы, происходящие в элементарной ячейке (сольвате) раствора, состоящей из сложной молекулы и молекул растворителя, непосредственно

взаимодействующих с ней. При ненулевых температурах раствора разные сольваты статистически обладают различной свободной энергией и, поэтому имеют отличающиеся по энергии системы электронно-колебательных уровней. В общем случае уш ирепие электронных спектров молекул имеет ориентационно-трансляционную природу, поэтому его принято считать конфигурационным.

Элементарные ячейки полярного раствора в результате акта оптического возбуждения оказываются в неравновесных Франк-Кондоновских состояниях. Поэтому в жидких растворах сразу же после возбуждения начинается процесс конфигурационной релаксации. Этот процесс сопровождается изменением энергии испускаемых квантов света со временем и смещением спектра флуоресценции в процессе релаксации. На начальном этапе эксперименты по изучению спектральной релаксации в растворах проводились лишь при стоксовом возбуждении излучением с фиксированной частотой. Они надежно установили факт длинноволновой кинетики спектра флуоресценции.

В нашей работе с помощью наносекундного лазерного спекгрофлуориметра впервые были проведены исследования спектральной кинетики флуоресценции в вязких растворах 3-амино- и 4-амшго-№метилфталимида при возбуждении перестраиваемым по частоте в широком диапазоне лазером на красителях. Проведенные исследования показали, что характер поведения мгновенных спектров флуоресценции, а также спектр длительности послесвечения красителей в вязких растворах существенно зависят от частоты возбуждающего света. Из полученных дашшх следует, что положение мгновенных спектров флуоресценции в первые моменты зависит от длины волны возбуждающего света, что свидетельствует о спектральной неоднородности лгоминесцирующих центров. По мере завершения релаксации этот эффект исчезает. Антистоксовое возбуждение вызывает изменение знака и направления релаксационного смещения спектра, т.е. со временем происходит его смещение в коротковолновую сторону. Следует отметить, что в ходе исследований не было обнаружено существенного изменения формы контуров мгновенных спектров флуоресценции, что подтверждает обусловленность наблюдаемых эффектов универсальными взаимодействиями в растворах.

Описатшые выше экспериментальные данные являются первым наблюдением зависимости положения мгновенных спектров флуоресценции растворов от частоты возбуждающего света. Впоследствии указанное явление в научной литературе получило название динамическое неоднородное уширение спектров. Термин "спектральная диффузия" также часто используется для описания неоднородного уширения спектров, которое проявляется при измерениях с высоким временным разрешением но не может быть зарегистрировано с помощью стационарной спектроскопии.

Анализ спектрально-люминесцентных свойств растворов сложных молекул удобно проводить с помощью схем электрошшгх уровней энергии. По мере развития спектроскопии межмолекулярных взаимодействий различные авторы ввели в рассмотрение значительное число схем уровней энергии, большинство из которых носит качественный характер. В наших работах введена диаграмма энергетических уровней раствора показанная на рисунке

Локальное электрическое поле, Н

Рис.1 Полевая диаграмма раствора.

Она описывает зависимость свободной энергии сольвата, от напряжённости локального электрического поля. Каждая точка на кривых, описывающих Рг(Я) и Рг(К), соответствует определенному типу сольвата. Электронные переходы изображаюся на этой диаграмме вертикальными стрелками (межмолекулярная трактовка принципа Франка-Кондона).

С помощью диаграммы легко можно объяснить все основные спектрально-люминесцентные эффекты имеющие место в полярных растворах. Например, если частота возбуждения равна у^, то в процессе релаксации энергия сольвата уменьшается (спектр сдвигается в красную область). Если частота возбуждения равна у^, то энергия сольвата в ходе релаксации возрастает (спектр сдвигается в синюю область). Между у^, и у^ имеется определенная частота у*, при возбуждении на которой сольваты сразу оказываются равновесными, а, следовательно, релаксация спектра отсутствует. Следует отметить, что полевая диаграмма позволяет анализировать свойства растворов не только качественно, но и аналитически, так-как были получены соотношения, связывающие ¥е(К) и с характеристиками растворителя и расгворёшюго вещества, что и было использовано в настоящей работе.

Важным вопросом является вид функции неоднородного уширения (ФНУ), которая описывает распределение частоты чисто электронного перехода ансамбля флуоресцентных центров, вызванное флуктуациями локального электрическогс поля Я. Если предположить, что равновесное распределение сольватов пс конфигурационным подуровням является больцмановским, то можно показать, чте функция неоднородного уширения имеет гауссов вид. Её параметры можне рассчитать из реальных спектров поглощения и флуоресценции, которьн описываются свёрткой функции неоднородного уширения и однородного спектра.

Пример подобного расчета для основного состояния ЗАКМФ в глицерин« приведен в параграфе 1.3. В качестве однородных спектров брались спектрь поглощения в неполярном растворителе (гексане). В итоге мы получили гауссов; функцию неоднородного уширения для основного состояния с полушириной 70( см"1. Теперь, зная ФНУ для основного состояния, можно легко рассчитать её да возбуждённого состояния в нулевой момент времени. Действительно, чисш

сольватов (p„(v,0) равно пронзведешпо количества этих сольватов <pg(v) в основном состоянии на коэффициент поглощения Sg(v - vcx):

t?e(v,0) = CPe(v)Sg(v-VeJ[). (1)

Расчёты по формуле (1) показывают, что в возбужденном состоянии в нулевой момент времени всегда существует достаточно широкое распределение сольватов по частотам 0-0 перехода. Однако на красном склоне спектра поглощения, имеется область, где функция неоднородного уширения имеет минимальную полуширину и, следовательно, где достигается максимально возможная селективность возбуждения. Это связано с тем, что форма спектра поглощения имеет в этой области максимальную крутизну.

Функцию неоднородного уширения для возбужденного состояния в произвольный момент времени можно определить из мгновенных спектров флуоресценции с помощью интегрального уравнения с ядром типа свёртки. Оказалось, что в процессе релаксации происходит не только смещение центра тяжести распределения, но и изменяется его полуширина. Изменение функции распределения со временем свидетельствует, что в процессе конфигурационной релаксации испускание происходит из большого числа промежуточных состояний. По мере завершения релаксации испускание происходит из состояний, все более приближешсых к равновесному, вследствие чего распределение сужается.

Определив параметры функции неоднородного уширения можно рассчитать спекгрохронограмму раствора, т.е. зависимость интенсивности флуоресценции от двух переменных - времени и частоты. Численное моделирование, проведенное в параграфе 1.3 для З-амино-К-метилфталилимида (З/ШМФ) в глицерине, показывает, что учет распределения сольватов по частотам чисто электронного перехода необходим для корректного описания спектрохронограммы полярного раствора.

II глава посвящена изучению динамики формирования спектров красителей в бинарных растворителях, состоящих из смеси нейтральной неполярной компоненты и незначительных добавок полярного растворителя.

Изучение состава сольватных оболочек флуорофоров в смешанных растворителях показывает, что в трехкомпонентных растворах происходит селективная сольватация диполышх молекул растворителя вблизи молекулы красителя. В работе проведены исследования кинетики спек1ров флуоресценции трехкомпонентных растворов З-амино-К-метилфталшшмида в декалине с незначительными добавками этанола, дейтерированного этанола и диметилформамида при различных частотах возбуждения с целью выяснения механизмов селективной сольватации, а также роли эффектов неоднородного уширения спектров.

Введение в нейтральный раствор 3ANM№ в декалине малых добавок полярной компоненты приводит к возникновению плавного длинноволнового смещения спектров люминесценции во времени. Корреляционная функция спектрального сдвига C(t) трехкомпонентных растворов 3ANMO состоит из двух ярко выражещгых участков: быстрого в области времен регистрации 0-3 не и медленного при больших временах. Наиболее отчетливо это проявляется в полулогарифмических зависимостях корреляционной функции спектрального сдвига:

c(o = (vf-v:)/(>;-v;) (2)

где v™, v™ и v™ - положение максимумов спектров флуоресценции в момент t, со и 0 соответственно. Значения начальных амплитуд Ai 2 и временных констант Tj.2, полученные из аппроксимации двухэкспоненциалыюй зависимостью экспериментальных корреляционных функций спектрального сдвига C(t) для растворов ЗАММФ в декалине с различной объемной концентрацией этанола (Vp), а также значения среднего времени сольватации Ts, рассчитанные по формуле

оо

is = Jc(t)dt, даны в Таблице 1. Из таблицы видно, что по мере роста в растворе

о

добавки этанола увеличивается вклад в C(t) быстрой субнаносекундной компоненты релаксации. Это приводит к сокращению среднего времени сольватации.

Таблица 1

Уг 0.1% 0.2% 0.4% 0.6% 0.8% 1.0%

т8, НС 7.91 6.83 6.07 5.46 4.41 3.63

а! 0.25 0.38 0.49 0.58 0.69 0.77

а2 0.75 0.62 0.51 0.42 0.31 0.23

Ть не 1.02 1.00 0.97 0.96 0.95 0.94

Ъ, НС 10.20 10.41 10.98 11.67 12.14 12.65

Коэффициент взаимной диффузии для бинарных смесей в зависимости от мольного объема жидкостей задается эмпирической формулой Шайбеля. Расчеты по этой формуле дают для коэффициента диффузии этанола в декалине значения близкие к медленной (наносекундной) составляющей спектральной кинетики. В тоже время, быстрая (субнаносекундиая) составляющая спектрального сдвига коррелирует с временем ориентационного вращения этанола в декалине, рассчитанного по формуле Дебая. Таким образом, межмолекулярная релаксация в бинарных смесях носит ориентационно-трансладионный характер. Этот вывод позволяет использовать для описания динамики сольватации в 3-х компонентных растворах теорию обобгцешюго уравнения Смолуховского-Власова, в наиболее современной модификации Багчи.

Сравнение экспериментально измеренных и рассчитанных с помощью уравнения Смолуховского-Власова функций СО) показывает, что спектральная релаксация в 3-х компонентном растворе происходит значительно медленнее, чем это предсказывает молекулярная теория. Это обнаруженное несоответствие эксперимента и теории значительно больше чем в случае 2-х компонентных растворов и подтверждает существенный вклад в спектральную кинетику релаксации в дальних координационных сферах. Действительно, поскольку молекулы полярной добавки концентрируются вблизи красителя, то в трехкомпонентном растворе удаленные от флуорофора части растворителя неполярны и, следовательно, не оказывают влияния на динамику неравновесной сольватации после возбуждения. Отсутствие вклада в релаксацию переориентации

молекул в удаленных координационных сферах, в свою очередь, заметно уменьшает амплитуду и скорость спектральной релаксации в бинарных растворителях, по сравнению с чистыми полярными растворителями.

Как показали проведенные исследования, длинноволновая кинетика спектра флуоресценции грехкомпонентных растворов существенным образом зависит от частоты возбуждения. Положение мгновенных спектров определяется частотой возбуждения, что свидетельствует о спектральной неоднородности люминесцирующих центров. При возбуждении раствора на длинноволновом склоне спектра поглощения происходит уменьшение диапазона временного сдвига мгновенных спектров испускания в низкочастотную область. Полученные результаты подтверждают существование динамического неоднородного уширешга электронных спектров трехкомпонентных растворов.

В III главе показано, что межмолекулярная релаксация в растворах влияет на характер и скорость вращения молекул в полярной среде. Поскольку энергия диполь-дщюльных взаимодействий, обуславливающая отклоните сольвата от равновесия, может быть сравнимой или превышать энергию теплового движения молекул (например, для ЗАЫМФ в глицерине Д/%, да 4000 см"1), то для таких систем нельзя предполагать, что вращательная броуновская диффузия является стационарным процессом, описываемым независящей от времени константой. Для получения непосредственных доказательств влияния межмолекулярной релаксации на характер вращения флуорофора кинетика анизотропии флуоресценции изучена в работе для различных длин волн возбуждения и регистрации.

Экспериментальные данные показывают, что при стоксовом возбуждении деполяризация флуоресценции ЗАЫМФ в глицерине происходит быстрее на красном склоне. Это же подтверждают и мгновенные спектры анизотропии испускания. Логарифмирование показало, что в первые моменты времени в кинетике анизотропии флуоресценции отчетливо прослеживается быстрый участок. В случае антистоксового возбуждения эксперимент дает противоположную картину, "затухание" анизотропии испускания происходит

быстрее на синем склоне спектра флуоресценции. Наконец, при возбуждении в районе 0-0 частоты, когда спектральная релаксация отсутствует, зависимость скорости деполяризации от длины волны регистрации исчезает. Подобная корреляция направления и величины сдвига мгновенных спектров и характера деполяризации испускания позволяет сделать вывод, что в процессе межмолекулярной релаксации флуорофор испытывает дополнительное (к чисто тепловому) вращение.

Выделение избытка свободной энергии ЛРе в процессе релаксации можно рассматривать как наличие в сольвате источника тепла. Если возбуждать раствор в максимуме спектра поглощения (иех то как видно из полевой диаграммы,

максимальная величина теплоты, выделенная в возбужденном сольвате, равна

АС) — А/^, = —---. Так как вешгпша пропорциональна сдвигу спектра в

процессе релаксации, то из уравнения теплового баланса, описывающего изменение количества теплоты в сольвате, можно найти закон изменения температуры и рассчитать кинетику анизотропии испускания для случая зависящей от времени константы вращательной диффузии. Расчет кинетики анизотропии испускания для разных величин изменения температуры сольвата АТ показывает, что дополнительное к чисто тепловому вращение флуорофора определяется не только величиной диапазона спектральной релаксации но и скоростью её протекания, а также радиусом сольвата и теплопроводностью растворителя.

IV глава посвящена исследованию направленного (дисперсного) безызлучательного переноса энергии между химически идентичными молекулами красителей в полимерных пленках. Направленный (дисперсный) перенос энергии должен сопровождаться понижением уровней энергии с которых происходит испускание и, как следствие, мгновенные спектры флуоресценции со временем будут смещаться в длинноволновую сторону. Эксперименты подтвердили указанное предположение. В работе обнаружен монотонный сдвиг спектра испускания с течением времени в полимерных плёнках активированных аминофталимидами. Как следует из полученных данных, диапазон

длинноволнового временного сдвига спектра тем значительнее, чем выше концентрация красителя.

Кинетические характеристики спонтанного испускания твердых концентрированных растворов сложных молекул определяются эффективностью направленного переноса энергии и должны существенно зависеть от частоты возбуждающего света. В работе обнаружено, что спектральный диапазон смещения полосы флуоресценции во времени З-амшгофталимида и 4АЫМФ в полимерных пленках монотонно уменьшается практически до нуля по мере снижения частоты возбуждения уех. Характерно также, что по мере уменьшения угх постепенно исчезают различия в положениях мгновенных спектров для образцов с высокой и низкой концентрациями молекул.

Длинноволновое временное смещение спектра люминесценции, вызванное направленным переносом энергии, обуславливает существенное различие длительности послесвечения те по спектру спонтанного испускания. В силу зависимости спектралыюй кинетики от частоты возбуждения уех спектры те (Уг) также зависят от уех. Указанные особенности связаны с тем, что постепенный переход к возбуждению твердых растворов на низкочастотном склоне спектра поглощения вызывает селективный переход в первое синглетное состояние сольватов, заселяющих подуровни, расположенные ниже, чем Франк-Кондоиовский (вплоть до равновесного подуровня , см. рис.1). Эффективность безызлучательного переноса энергии при этом падает, так как ее миграция на еще более "красные" центры не происходит из-за их незначительной доли5 в растворе, а обратный перенос энергии маловероятен.

Безызлучательный перенос энергии играет важную роль в механизме фотосинтеза, т.к. благодаря ему обеспечивается доставка энергии электронного возбуждения в окрестности реакционного центра. В работе направленный перенос энергии между мономерными молекулами фотосшпетических пигментов, хлорофилла а и феофитина а, обнаружен при комнатных температурах при их внедрении в полимерную плёнку из поливинилбутираля. Кроме того установлено существование направленного переноса энергии в высоко ассоциированных агрегатах аминофталимидов в нсполярных растворителях. Таким образом,

. показано, что это явление (направленный перенос энергии) является общим и его нужно учитывать при анализе спектрально-кинетических характеристик люминесценции растворов.

В V главе рассмотрена проблема спектральной гетерогенности флуоресцентных зондов в фосфолигщдцых бислойных мембранах. Биохимическая активность всех клеток высших организмов значительным образом зависит от функций, обеспечиваемых биологическими мембранами. Липосомы (везикулы) являются ближайшим аналогом биомембран. До постановки настоящей работы имеющиеся результаты исследования динамических свойств мембран были получены без учета сольватационной гетерогенности зондов. В V главе показано, что внедрение молекул флуоресцентного зонда в мембрану приводит к неоднородному ушнрению их электронных спектров. Кроме того, с помощью лазерной кинетической спектроскопии изучена динамика вращения молекул зондов и временной сдвет спектра флуоресценции. Впервые установлено, что выделите избытка свободной энергии в процессе релаксации системы "зонд плюс ближайшее окружение " приводит к зависящему от длины волны вращению молекулы флуорофора.

Основные исследования проводились с зондом 1-

(Фениламшю)нафталин (1-Ф11А) в лецитиновых липосомах. Везикулы (липосомы) формировали из яичного фосфатядилхолина. Результаты исследования 1-ФВА в жидких и твердых растворах демонстрируют существенный сдвиг стационарных спектров флуоресценции при переходе к красному краевому возбуждению. Как и ожидалось, этот эффект отсутствует в ясидком растворе. Длинноволновый сдвиг стационарных спектров испускания не сопровождается заметным изменением их формы, отсутствует также изобестическая точка. В экспериментах с 1-ФНА в везикулах "красный сдвиг" спектра проявляется отчетливо и, кроме того, демонстрирует значительную температурную зависимость. Совместный анализ полученных результатов для 1-ФНА в растворителях и мембранах позволяет утверждать, что в обоих случаях мы имеем дело со сходными явлениями. Как в вязких полярных растворителях так и в липосомах при красном краевом возбуждении наблюдается батохромный сдвиг спектров флуоресценции. В обоих

случаях он происходит плавно, без заметного изменения формы спектров. Указанное явление является типичным следствием неоднородного уширения электронных спектров флуорофора.

Своеобразные эффекты обнаружены при исследовании спектральной кинетики 1-ФНА в глицерине и лецигановых липосомах. При красном краевом возбуждении диапазон временного смещения мгновенных спектров уменьшается для обеих систем, однако в глицерине со временем все мгновенные спектры смещаются примерно к одному конечному положению независимо от частоты возбуждения, в то время как для; 1-ФНА в липосомах конечное положение мгновенных спектров для разных частот возбуждения сильно различается. Кроме того, имеют место и другие отличия В глицерине спектральная кинетика исчезает при смещении частоты возбуждения на длинноволновый край полосы поглощения, а в липосомах ярко выраженный временной сдвиг спектра испускания наблюдается и при длинноволновом возбуждении. Указанные особенности обусловлены различной природой неоднородного уширения электронных спектров зонда в фосфолипидной бислойной мембране, которое одновременно носит статический и динамический характер. Статическое уширение связано с распределением зонда по глубине мембраны, а динамическое - с флуктуацииями энергии межмолекулярных взаимодействий флуорофора с окружением на каждой глубине локализации.

По аналогии с растворами можно построить диаграмму энергетических состояний для элекгродиполышх флуоресцентных зодцов в мембранах. Отличие от диаграммы для растворов заключается в том, что необходимо вводить континуум потенциальных кривых в основном и возбужденном состоянии для каждой глубины локализации зонда. Как уже указывалось выше, мгновенные спектры зондов в липосомах в зависимости от частоты возбуждения релаксируют к различным конечным положениям. Чтобы объяснить этот эффект с помощью диаграммы энергетических состояний, следует предположить, что полуширина ФНУ, описывающей статическое неоднородное уширение, больше, чем полуширина ФНУ, отвечающей за динамическое неоднородное уширение. При таком условии независимо от

частоты возбуждающего света в верхнем синглетном состоянии всегда находится набор неравновесных зондов, имеющих различную конфигурацию окружения.

Кинетика анизотропии флуоресценции 1-ФНА в липосомах обнаруживает зависимость как от длины волны возбуждения, так и от длтгы волны регистрации при этом она носит неэкспонешшальный характер. При возбуждении длиной волны 337 нм в кинетике анизотропии обнаруживается субнаносекундный участок затухания. Величина субнаносекундной деполяризации более значительна на красном склоне спектра испускания. При возбуждении Хех = 395 нм, как и в случае возбуждения 337 нм, вклад быстрого процесса в деполяризацию оказался большим на красном склоне спектра флуоресценции. Начальное же значение анизотропии испускания, зарегистрированной на синем склоне спектра свечения при возбуждении Хех = 395 нм практически совпадает с предельным значением. Полученные данные свидетельствуют о том, что для молекул 1-ФНА в фосфолипидных мембранах процесс конфигурационной релаксации, следующий за актом электронного возбуждения молекулы зонда, приводит к дополнительной деполяризации флуоресценции. Это явление можно рассматривать как индуцированное оптическим возбуждением вращение молекул зонда.

В VI главе приведены данные изучения глубины локализации зондов в бислойных мембранах с помощью безызлучательного переноса энергии. Для того чтобы уточнять механизм неоднородного уширмшя спектров была измерена глубина локализации зонда 1-ФНА в фосфолипидном двойном слое с помощью переноса энергии. При этом мы использовали эффект насыщения эффективности переноса энергии от донора (зонда) в мембране к акцептору (тушителю) у поверхности мембраны, который имеет место при определённых концентрациях акцептора. При эффекте насыщения расстояние г между донором и акцептором можно считать фиксированным в процессе переноса энергии и его можно найти из уравнения Фёрстера. Вначале, чтобы удостоверится в

правильности выбранного подхода была измерена глубина локализации 3-х известных зондов: перилена, 1- ФНА и 1-(Феш1ламино)-8-суяьфонафташша (1,8-АНС). В качестве акцептора (тушителя) был выбран краситель родамин 700 (Р700).

Результаты измерения показали, что получешгые значения г имеют реальный физико-химический смысл. Например, перилен является неполярным зондом и локализуется в средней части бислоя. 1,8-АНС представляет собой ион и располагается к заряженным головкам фосфолипидов ближе чем электрически нейтральный зонд 1-ФНА.

После этих экспериментов было исследовано распределение молекул 1-ФНА по глубине двойного бислоя при использовании селективного возбуждения на красном склоне спектра поглощения зонда. В Таблице 2 приведены результаты определения г для различных частот возбуждения.

Таблица 2

Глубина локализации (г) зонда 1-ФНА в везикулах, ферстеровский радиус (Я0) и положение максимума спектра флуоресценции (уц) при различных частотах возбуждения (у«)

уех 103 см"1 шах 1лЗ -I Уд 10 см г, нм Ио, нм

30,3 24,0 2,3 1,8

29,4 23,8 2,1 1,8

28,6 23,8 2,1 1,8

27,8 23,8 2,1 1,8

26,7 23,7 1,9 1,8

26,3 23,5 1,7 . 2,1

25,6 23,1 0,57 2,4

Как следует из приведенных данных глубина локализации 1-ФНА при возбуждении вблизи максимума поглощения составляет 2,1 нм. При красном

краевом возбуждении - 25600 см"1) значение г уменьшается до 0,57 нм. Изменение частоты возбуждения приводит также к длинноволновому (батохромиому) сдвигу максимума стационарного спектра флуоресценции от значения уптах = 24000 см"1 до у£тах = 23100 см"1.

Результаты исследования глубины локализации зонда с помощью переноса энергии показывают, что молекулы 1-ФНА распределены по бислого в радиальном направлении мембраны. Это и является причиной статического неоднородного уширения спектров. Последний эффект- позволяет возбуждать на длинноволновом склоне спектра поглощения "красные" зонды, локализоватшые вблизи полярных головок фосфолипидов. Как следует из Табл.2 при возбуждении зондов на длинноволновом склоне спектра поглощения удается селективно переводить в верхенее синглетное состояние молекулы флуорофора, расстояние между которыми сравнимо с та размерами. Это даёт возможность с высоким (менее 1 нм) пространственным разрешением исследовать микрохарактсристики мембраны, в частности локальную диэлектрическую константу.

VII глава посвящена исследованию мнкрополярности мембран эритроцитов человека с использованием эффекта красного краевого возбуждения. В ней также представлены результаты измерений дипольных моментов флуоресцентных зондов 1-ФНА и 1,8-АНС электрооптическим методом. Для корректного определения диэлектрической постоянной я необходимо знание точных значений дипольных моментов в различных электронных состояниях. Электрооптические абсорбционный и эмиссионный методы дают возможность получить непосредственную информацию о величине и направлении дипольных моментов, а также о поляризуемости молекул в различных электронных состояниях. В данной работе с помощью электрооптических абсорбционного и эмиссионного методов исследованы три класса флуоресцентных зондов: амшгофталимиды, кумарины и аминонафталины

Установлено, что диполышй момент 1-ФНА в основном равновесном состоянии практически равен нулю. Значения изменения диполыюго момента при переходе в возбужденное Франк-Кондоновское состояние Аац и дипольный

момент в равновесном возбуждённом состоянии р«, измеренные для 1-ФНА в циклогексане и диоксане представлепы в Таблице 3.

Таблица 3

Дипольные моменты ЮНА в циклогексане и диоксане при Т=298К

Растворитель ДУЮ"30 Кл-м IV10"30 Кл-м

Циклогексан Диоксан 16.0 ± 1.0 18.810.9 16.4 ±1.1 24.6 ±1.0

Исследования; показали, что распределение зарядов и дипольные моменты 1,8-АНС значительно отличаются от аналогичных характеристик 1-ФНА. Диполышй момент перехода 1,8-АНС ш, перпендикулярен р.8, а углы между различными дипольными моментами лежат в диапазоне 18°-108°. Наши результаты свидетельствуют о существовании двух близко расположенных возбужденных Франх-Кондоновских состояний для 1,8-АНС.

Полученные данные по значениям днполышх моментов явились основой для исследования диэлектрических взаимодействий в тенях эритроцитов человека. При этом для изучения распределения диэлектрической проницаемости по мембране использован эффект красного краевого возбуждения, так как наши исследования показали наличие спектральной неоднородности 1-ФНА в тенях эритроцитов человека. Значение локальной диэлектрической константы е рассчитывалось с помощью специально полученного для этого уравнения

6-1

Ьсу„ = СОПБЦ-"

" 27ее0а i

п -1 | I, е-1 ( \

(3)

где ц1 - средняя частота на полувысоте нормированного квантового спектра флуоресценции Р5(у)/у3; цс - дипольный момент в равновесном возбужденном состоянии; А*ц - изменение дипольного момента при переходе из равновесного возбужденного состояния в основное Франк-Кондоновское состояние; п -показатель преломления; ссо - радиус сферы Онзагера; Ь - постоянная планка; с -

скорость света; ео - диэлектрическая проницаемость вакуума. Расчет диэлектрической константы с помощью формулы (3) является наиболее приемлемым в нашем случае, потому что с достаточной точностью можно измерить только положение спектра флуоресценции молекул зонда, локализованных в отдельных центрах связывания.

В Таблице 4 приведены значения диэлектрической константы е теней эритроцитов, рассчитанные с помощью уравнения (3) для различных частот возбуждения vex. Из таблицы видно, что диэлектрическая константа в зависимости от частоты возбуждения увеличивается от е = 6.7+0,8 при vex= 32300 см"1 до s = 17.6+3,5 при vex= 27000 см"1. Эти результаты подтверждают, что в мембранах эритроцитов существует распределение молекул зонда по центрам связывания с различной микрополярностью.

Таблица 4

Диэлектрическая константа е теней эритроцитов человека, рассчитанная с помощью уравнения (3) из нормированного квантового спектра флуоресценции 1-ФНА для различных частот возбуждения vex Каждое значение е представляет усредненную величину по пяти независимым экспериментам с различными пробами крови.

V„, CM"1 е

323001100 6.7±0.8

31300±100 6.9±1.0

30300+100 7.3+1.8

29400+100 8.1±1.4

28600±100 8.5+0.9

278001100 10.8+1.4

27000+100 17.6±3.5

В Приложении описана методика спектрально-кинетических измерений флуоресценции. При выполнении дахшой работы были разработаны и использовались на различных стадиях исследований несколько лазерных спектрофлуориметров. Последний, наиболее автоматизированный лазерный спектрофлуориметр, который использовался при изучении теней эритроцитов, позволяет измерять время жизни возбужденного состояния с разрешением 50 псек, а также регистрировать мгновенные спектры флуоресценции и анизотропии испускания (предельное разрешение 200 псек) и кинетику послесвечения с разложением на экспоненты при широком варьировании частоты возбуждения (337, 360-750 нм). Прибор снабжен пакетом программы для обработки результатов измерений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные выводы работы можно сформулировать в следующем виде: . 1. Спектры флуоресценции сложных органических молекул в чистых и бинарных растворителях с низкой вязкостью - динамически неоднородно уширены. Это явление обусловлено статистическими флуктуациями структуры и состава сольватов флуорофоров в жидкости и проявляется в зависимости положения мгновенных спектров флуоресценции, диапазона и направления релаксационного смещения спектра испускания, а также характера и длительности послесвечения от частоты возбуждающего света. Учет динамического неоднородного уширения спектров необходим при анализе всех основных спектрально-люминесцентных свойств растворов, в частности, при описавши спекгрохронограммы флуоресценции [1-4, 8, 9,28, 34, 43].

2. Корреляционная функция спектрального сдвига 3-х компонентного раствора носит ярко выраженный неэкспоненциальный характер, что обусловлено ориентационно-трансляционным механизмом межмолекулярной релаксации. Временной сдвиг спектра флуоресценции красителя в бинарных растворителях происходит намного медленнее, чем это предсказывает теория обобщенного уравнения Смолуховского-Власова. Указанный факт свидетельствует о

значительном вкладе в спектральную кинетику в растворах релаксации в дальних координационных сферах [4,28, 29, 34,43].

3. Выделение в процессе конфигурационной релаксации избытка свободной энергии сольватов в растворах и мембранах приводит к дополнительно (по отношению к чисто тепловому) вращению сложных органических молекул. Указанный эффект является причиной неэкспоненциального характера кинетики анизотропии испускания, зарегистрированной на синем и красном склонах спектра флуоресценции. Скорость деполяризации свечения существенно зависит от длин волн регистрации и возбуждения [1, 3, 5, 23-27, 30, 31, 33].

4. В твердых концентрированных растворах красителей и фотосинтетичсских пигментов, а также в высокоассоциированных агрегатах и порошках сложных органических молекул возникает субнаносекундная длинноволновая кинетика спектра флуоресценции, вызванная безызлучательным переносом энергии по химически идентичным молекулам. Причиной направленного (дисперсного) переноса энергии является неоднородное уширешге электронных спектров молекул вследствие статистических флуктуации энергии ориентациошю-индукционных взаимодействий в неупорядоченных молекулярных системах. При возбуждении концентрированных растворов вблизи частоты 0-0 перехода эффективность направлешюго переноса энергии уменьшается, что приводит к исчезновению временного сдвига спектра флуоресценции [1, 2, 6, 1015, 20].

5. Для диполышх флуоресцентных зондов в модельных биологических мембранах характерна спектральная гетерогенность, вызванная градиентами полярности и флуктуациями структуры. Неоднородное уширение спектров зондов в фосфолипидных мембранах одновременно носит статический и динамический характер. Статическое уширение вызвано распределением зонда по глубине мембраны, а динамическое уширение обусловлено тепловыми флуктуациями микроструктуры различных центров связывания. Спектральная неоднородность флуоресцентных зондов в мембранах существенным образом влияет на длинноволновую кинетику спектра флуоресценции [1, 5, 31,45].

6. При сканировании частоты возбуждения на красном склоне спектра поглощения зонда можно селективно переводить в верхнее синглетное состояние отдельные группы центров связывания с пространственным разрешением менее нанометра, которое сравнимо с размерами молекулы флуорофора. Указанное обстоятельство позволяет исследовать пространственные распределения физических характеристик мембраны, например, их мшфополярность [32, 38, 44, 45, 48].

7.Исследования, проведённые с помощью модифицированного электрооптического метода, показывают, что дипольные моменты и распределение зарядов в широко известных зондах 1-ФНА и 1,8-АНС существенно различаются. Дипольный момент 1-ФНА в равновесном основном состоянии практически равен нулю. Для 1,8-АНС обнаружена скрытая полоса поглощения, которая связана с существованием нефлуоресцирующего возбуждмшого состояния [40-42,46-48].

8. Изучение диэлектрических взаимодействий в модельных биологических мембранах с помощью метода красного краевого возбуждения показывает, что в подобных системах существуют значительные градиенты полярности. Диэлектрическая коне такта фосфолипидных бислойных мембран и теней эритроцитов крови человека в зависимости от локализации зонда изменяется от единиц до нескольких десяпсов [44, 45, 48].

9. Стробоскопические спектрофлуориметры на основе ТЕА-азотных лазеров и РОС-лазеров на красителях позволяют эффективно исследовать спектрально-кинетические характеристики флуоресцентных зондов в растворах и мембранах, так как наряду с высоким временным разрешением (до 200пс), узкой линией возбуждения (0,3-0,6 нм), широким диапазоном перестройки возбуждающего излучения (337, 360-750 нм) они позволяют исследовать объекты с очень низкой концентрацией флуорофоров (до 10"8 - 10~9 моль/л в растворах) [7, 16, 17, 19, 21, 22, 35-37, 39].

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. NemkovichN.A., Rubinov A.N., Tomin V.l. foihomogeneous Broadening of Electronic Spectra of Dye Molecules // J.R.Lakowicz (ed.) Topics in Fluorescence Spectroscopy. Volume 2: Principles (monograph).- New York: Plenum Press, 1991,- Ch.8.- P. 367428.

2. Nemkovicli N.A., Rubinov A.N., Tomin V.l. Time-Resolved Selective Laser Spectroscopy of Dyes in a Polar Medium (review) / Optical Spectroscopy in Chemistry and Biology - Progress and Trends: Ed. Fa pier D..- Berlin: VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 1989,- Vol. 21.- P. 31-55.

3. Гакамский Д.М., Немкович H.A., Рубинов А.Н. Межмолекулярная релаксация и вращение молекул в полярном растворе (обзор) // ЖПС, -1991.-Т.54.-№ 2.- С. 183-197.

4. Звиневич Ю.В., Немкович H.A., Рубинов А.Н. Динамика сольватации в бинарных растворителях (обзор) // ЖПС.- 1993,- Т. 58, № 3-4,- С. 237-255.

5. Nemkovich N.A. Selective Laser Spectrofluorometry of Probe in Phosphlipid Membranes //Proc. SPIE - 1992. - V.1922. - P. 209-218.

6. Немкович H.A., Рубинов A.H., Томин В.И. Наносекундая лазерная спектрофлуоримегрия с использованием перестраиваемого по частоте излучения ОКГ на красителях //ActaPhys. etChem.- 1979,-Vol. 1,-Р. 99-106.

7. Немкович H.A., Мацейко В.И., Томин В.И. Наносекундная лазерная флуориметрия и ее использование для исследования кинетики люминесценции // Квант, электр,- 1980,- Т. 7, № 3,- С. 566-571.

8. Немкович H.A., Мацейко В.И., Рубинов А.Н., Томин В.И. Межмолекулярная ориентационная релаксация "вверх" в вязких растворах органических соединений//Письма в ЖЭТФ.- 1979,-Т. 12, № 12,-С. 780-783.

9. Немкович H.A., Мацейко В.И., Томин В.И. Межмолекулярная ориентационная релаксация "вверх" в растворах производных фталимида при возбуждении перестраиваемым но частоте лазером на красителе // Опт.и спектр,- 1980,- Т. 49, № 2,- С. 274-283.

10.Немкович H.A., Рубинов А.Н., Томин В.И. Направленный перенос энергии в одоюкошюнентных растворах красителей // Письма в ЖТФ - 1980. - Т. 6, № 5. - С.270-273.

11.Rubinov A.N., NemkovichN.A., Tomin V.l. Kinetics of Luminescence Spectra of Rigid Dye Solutions Due to Directed Electronic Energy Transfer // J. Luminescence. - 1981. - V.23. - P. 349-361.

12.Немкович H.A., Гулис И.М., Томин В.И. Влияние направленного переноса энергии на кинетику спектров испускания твердых растворов сложных молекул // ЖПС -1981. - Т. 33, № 6. - С. 1080-1084.

13.Немкович H.A., Гулис И.М., Томил В.И. Зависимость эффективности направленного безызлучателыюго переноса энергии в двухкомпонешных твердых растворах органических соединений от частоты возбуждения // Опт. и спектр. - 1982. - Т. 53, № 2. - С. 239-244.

14.Направленный перенос энергии в растворах фотосинтетических пигментов, вызванный ориентационным уширением уровней энергии / А.Н.Рубинов, Э.И.Зенькевич, Н.А.Немкович, В.И.Томии // Оггг. и спектр. -1981. - Т.51, №5. - С. 848-854.

15.Diiected Energy Transfer Due to Orientational Broadening of Energy Levels in Photosynthetic Pigment Solutions / A.N.Rubinov, E.I.Zenkevich, N.A.Nemkovich, V.I.Tomin // J. Luminescence. - 1982. - V.26. - P. 367-376.

16. Немкович A.H., Рубинов A.H., Томин В.И. Разностный способ измерения времени жизни возбужденного состояния // Квант, электр. -1981.- Т. 8, № 6. - С. 1278- 1283.

17. Звиневич Ю.В., Мышалов П.И., Немкович H.A., Азотный лазер высокого давления с поперечным разрядом // ЖПС. - 1983. -Т.38, № 4. - С. 688-691.

18.Неэкспоненциальная кинетика поляризации жидких полярных растворов производных фталнмида / Д.М.Гакамский, Н.А.Немкович, А.Н.Рубинов и др. // Опт. и спектр. - 1983. - Т.54, №з.. с. 567-568.

19.Наносекундный лазерный спектрофлуориметр с автоматизированной обработкой данных / Д.М.Гакамский, Н.А.Немкович, А.Н.Рубинов и др. // Квант, элеюр. - 1986. - Т.13, № 11. - С. 2271-2276.

20.Неоднородное утпирение электронных спектров сложных молекул в неполярных растворителях и в порошках / Д.М.Гакамский, Н.А.Немкович, А.Н.Рубинов, В.И.Томин // Опт. и спектр. - 1987. - Т.63, №3. - С. 507-510.

21.ТЕА-ТЕ мощная лазерная система на азоте / Ю.В.Звиневич, Н.А.Немкович, И.ШСазимирчук и др. // ЖПС.-1986,- Т.44, № 3. - С. 509-511.

22. Звнневич Ю.В., Немкович Н.А., Томин В.И. Субнаносекундный лазер (0,5 Мвт) на молекулярном азоте с предионизацией // ПТЭ.-1988.-№ 4. - С. 232.

23 .Inhomogeneous Broadening and Light-Induced Rotation of a Luminescent Probe in Biological Membranes / Gakamsky D.M., Demchenko A.P., Nemkovich N.A. et all. // Fifth Symp. Opt. Sp., Sept. 26-28, 1988, SOS, Eisenach, 1988. - P. 105.

24.Светоиндуцированное вращение молекул красителя в растворе / Д.М. Гакамский, Н.А.Немкович, А.Н.Рубинов, В.И.Томин // Опт. и спектр. -1988,-Т.64, №3. - С. 678-681.

25.Гакамский Д.М., Немкович Н.А., Рубинов А.Н. Конфигурационная релаксация в системах с динамическим неоднородным уширением электронных спектров // Известия АН СССР, серия физ. -1989.-№ 6.-С. 135-138.

26.Gakamsky D.M., Nemkovich N. A., Rubinov A.N. Rotation of Dye Molecules Induced by Optical Excitation // Springer Proceedings.in Physics.-1990.-V.49.-P. 270-275.

27.Laser-Induced Rotation of Dyes in a Liquid / Д.М. Гакамский, А.Н. Немкович, А.Н. Рубинов и др. // J. Molecular Liquids.-1990. -V.45.-P. 33-38.

28.Спектроскопическое наблюдение индивидуального движения дшголышх молекул в сольватпой оболочке люминофора / Ю.В.Звиневич, Н.А.Немкович, А.Н.Рубинов, В.И.Томин//Хим. физ,- 1990,- Т. 9, № 11,- С. 1497- 1501.

29.Time-Resolved Laser Spectroscopy of Three-Component Solutions of Phthalimides / Yu.V.Zvinevich, N.A.Nemkovich, AlN.Rubinov, V.I.Tomin // J. Molecular Liquids. 1990,- Vol. 45,- P. 1-6.

30.Gakamsky D.M., Nemkovich N.A;, Rubinov A.N. Wavelength-Dependent Rotation of Dye Molecules in a Polar Solution // J. Fluorescence, 1992. - V.2, №2. - P. 81-92.

31.Selective Laser Spectroscopy of l-Phenylnaphthylamine in Phspholipid Membranes / D.M.Gakamsky, A.P.Demchenko, N.A.Nemkovich et all. // Biophys. Chem. - 1992. -V.42. - P. 49-51.

32. Time-Resolved Fluorometry of Red Blood Cell Membrane Conformational Changes in a Population Exposed to Low-Dose Radiation / N.A.Nemkovich, A.S.Kozlovsky, A.N.Rubinov, V. A.Neumerzhicky // Proc. SPIE - 1993. - V.2081 - P. 219-229.

33.Nemkovich N.A., Rubinov A.N. Spectral Inhornogenciiy and Wavelength Dependent Rotation of Probe Molecules in Membranes // J. Fluorescence - 1994. - V.5. - P. 285294.

34.Nemkovich N.A., Rubinov A.N., Zvinevich Yu.V. Spectral Diffusion of Electronic Transitions of Dyes in Binary Solvents // Lietuvos Fiz. Zurn.- 1994.- Vol. 43, № 1-2.-P. 41-46.

35. Automated Laser Spectrofluorimeter for Biophysics and Biomedicine / A.S.Kozlovsky, N.A.Nemkovich, A.N.Rubinov, Yu.V.Zvmevich // Proc. SPIE - 1994.

- V.2370. - P. 572-576.

36. Conformational Transformation of Humic Substances in Water / N.A.Nemkovich, A.P.Golovach, A.S.Kozlovsky et al. // Proc. SPIE - 1994. - V.2370 - P. 711-714.

37. Laser Spectrofhiorimetry of Humic Substances Conformational Transformation in Water / N.A.Nemkovich, A.P.Golovach, A.S.Kozlovsky et al. // Proc.SPlE - 1995. -V.2503 - P. 131-139.

38. Nemkovich N.A., Kozlovsky A.S., Rubinov A.N. Spectral Inhomogeneity and Inteimolecular Relaxation in Erythrocyte Ghosts and Phospholipid Bilayer Membranes // Proc. SPIE - 1995. - V.2388 - P. 389-399.

39. Automated Laser Spectrofluorimeter for Biology and Medicine / N.A.Nemkovich, A.S.Kozlovsky, A.N.Rubinov, Yu.V.Zvinevich // Proc.SPlE - 1995. - V.2388.-P.347-355.

40.Electro-Optical and Fluorescence Lifetimes Studies of Aminophtalimide Probes in Liquids / N.A.Nemkovich, W.Baumann, H.Reis, A.S.Kozlovsky // Proc. SPIE - 1995. -V.2388. - P. 335-346.

41.Немкович H.A., Бауманн В., Райе Г. Исследование дипольных моментов аминофталимидов в основном и возбужденном электронных состояниях // ЖПС

- 1995. - Т.62, № 2. - С. 229-239.

42.Dipole Moments of Aminophtalimides Determined by Modified Electro-Optical Absorption and Emission Measurements / N.A.Nemkovich, W.Baumann, H.Reis, N.Detzer //J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. - 1995. - V.89. - P. 127-133.

43. Nemkovich N.A., Rubinov A.N., Zvinevich Yu.V. Conflgurational Relaxation of "Van der Waals Complexes" in Solution // J. Fluorescence.- 1995,- Vol. 5, № 1,-P. 85-89.

44.Nemkovich N.A., Rubinov A.N. Spectral Inhomogeneity and Wavelength-Dependent Rotation of Probe Molecules in Membranes // J. Fluorescence - 1995. - V.5, №3. - P. 285-294.

45.Немкович H.A., Рубинов A.H. Спектральная и пространственная гетерогенность флуоресцентных зондов в мембранах // ЖПС,- 1996,- Т.бЗ, №4. - С. 622-630.

46.Study of Coumarin Fluorescent Probes by Elctro-Optical and Laser Spectrofluorimetry Methods / N.A.Nemkovich, W.Baumann, H.Reis, Yu.V.Zvinevich // Proc. SPIE -1997. - V.2980. - P. 390-399.

47.Electro-Optical and laser Spectrofluorimetry Study of Couraarins 7 and 30: Evidence for the Existence of the Close-Lying Electronic States and Conformers / N.A.Nemkovich, W.Baumann, H.Reis, Yu.V.Zvinevich // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. - 1997,-V. 109,-P. 287-292.

48.Nemkovich N.A., Reis H., Baumann W. Ground and Excited State Dipole Moments of Coumarin Laser Dyes: Investigation by Electro-Optical Absorption and Emission Methods // J. Luminescence - 1997. - V.71. -P. 255-263.

49.Dipole Moments of Phenylnaphtylamine Fluorescence Probes and Study of Dielectric Interactions in Eiythrocyte Ghosts / N.A.Nemkovich, W.Baumann, Yu.V.Kruchenok, et. al. //J. Fluorescence. - 1998. - V.7, №4,- P. 363-370.

РЭЗЮМЭ

Нямков1ч Мшалай Аляксесшч СЭЛЕКТЫУНАЯ ЮНЭТЫЧНАЯ СПЕКТРАСКАП1Я РАСТВОРА^ IМАДЭЛЬНЫХ Б [Я МЕМБРАН

Ключавыя словы: неаднароднае пашырэнне спектрау, кшетычная спектраскапш, раствор фарбавальншау, флюарэсцэнтны зонд бшлапчная мембрана, дашольны момант

Метадам сэлекхыунай кшетычнай лазернай спектраскапп даследавана спектральная неаднароднасць аргашчных малекул у растворах 1 мадэльных мембранах. Выжулена дьшамгшае пашырэнне электронных спектрау фарбавалынкау у чыстых 1 бшарных вадюх растваральваках. Зарэпстраваны рад новых спектраскашчных эфектау \ асаблтвасдей, таюх як залежнае ад даужыш хвалг кручэнне малекул зонда у растворах 1 б1ялапчных мембранах, спяктральная кшстыка у пашмсрных плёнках, выюнканая наираваным безвьшраменьванным пераносам энерш лам ¡ж манамерньтп малекулам1 флюарафора 14ншыя.

3 дапамоган специяльных эксперыментау па безвыпраменьвальнаму нераносу. энергп прадэманстравана, што прасторавая распазнавалыгасць сайт-сэлектыунай слектраскагш у мембранах параунальна з памерам] малекул зонда (гэта значыць ~ 10" см). Для вымярэння электрычных дьшольных момантау розных флюарэсцэнгаых зондау вьпсарыстаны элекгра-апгычныя абсарбдыйны 1 эмшйлы метады. 3 дапамогай эфекта чырвонага краявога узбуджэння даследавана лакальная дыэлектрычная прашкальнасць вязшул 1 ценяу эрытрацытау чалавека.

РЕЗЮМЕ Немкович Николай Алексеевич

СЕЛЕКТИВНАЯ КИНЕТИЧЕСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ РАСТВОРОВ И МОДЕЛЬНЫХ БИОМЕМБРАН

Ключевые слова: неоднородное уширение спектров, кинетическая спектроскопия, раствор красителя, флуоресцентный зонд, биологическая мембрана, дшюльный момент

Методом лазерной селективной кинетической спектроскопии исследована спектральная неоднородность сложных органических молекул в растворах и модельных биологических мембранах. Обнаружено динамическое неоднородное уширение спектров красителей в чистых и бинарных жидких растворителях. Зарегистрирован ряд новых спектроскопических эффектов и особенностей, таких как зависящее от длины волны вращение молекул зондов в растворах и модельных биологических мембранах, спектральная кинетика в полимерных плёнках, вызванная направленным безызлучательным переносом энергии между мономерными молекулами флуорофора и другие.

С помощью специальных экспериментов с использованием безызлучателъного переноса энергии показано, что пространственное разрешение сайт-селективной спектроскопии в мембранах сравнимо с размерами молекулы

зонда (т.е. ~ 10"9 см). Электро-оцтическими абсорбционным и эмиссионным методами измерены дигтольные моменты ряда флуоресцентных зондов. С использованием эффекта красного краевого возбуждения исследована локальная диэлектрическая проницаемость везикул и теней эритроцитов человека.

ABSTRACT

Nemkovich Nicolai AIckscevich SELECTIVE KINETIC SPEKTROSCOPY IN SOLUTIONS AND MODEL BIOMEMBRANES

Key words: inhomogeneous broadening of spectra, kinetic spectroscopy, dye solution, fluorescent probe, biological membrane, dipole moment

Spectral inhomogeneity of complex organic molecules in solutions and model biological membranes has been investigated using a time-resolved selective laser spectroscopy. It was discovered the dynamic inhomogeneous broadening of the electronic spectra of dyes in pure and binary liquid solvents. New spectroscopic effects and features have been obtained for the first time, such as wavelength-dependent rotation of the probe molecules in solutions and model biological membranes, spectral kinetics in polymer films caused by the directed nonradiative energy transfer between monomelic fluorophore molecules, etc.

It has also been shown by special experiments using fluorescence energy transfer that the spatial resolution of the site-selective spectroscopy in membranes is comparable with the size of probe molecules (e.g. ~ 10"' cm). Electro-optical absorption and emission methods were used to measure the electric dipole moments a number of fluorescent probes. The local dielectric constant of vesicles and human erythrocyte ghosts has been studied by red-edge excitation spectroscopy.

НЕМКОВИЧ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

СЕЛЕКТИВНАЯ КИНЕТИЧЕСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ РАСТВОРОВ И МОДЕЛЬНЫХ БИОМЕМБРАН

Подписано к печати-Z2.il998 г. Формат 60x90 1/16 Тип бумага - типографская. Печать офсетная. Печ. л. 2,5

_Уч. изд. л.{. 6 Тираж 100 экз. Заказ j"/. Бесплатно_

Институт физики им. Б.И.Степанова HAH Беларуси, 220072 Минск, пр.

Ф.Скорины 68

Отпечатано на ризографе Института физики им. Б.И.Степанова HAH

Беларуси Лицензия ЛП №20