Спектроскопические исследования физико-химических свойств церулоплазмина тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

Яковлева, Татьяна Юрьевна АВТОР
кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ
1999 ГОД ЗАЩИТЫ
   
01.04.14 КОД ВАК РФ
Диссертация по физике на тему «Спектроскопические исследования физико-химических свойств церулоплазмина»
 
 
Текст научной работы диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Яковлева, Татьяна Юрьевна, Санкт-Петербург

___. ' / ¿у / ',/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Татьяна Юрьевна

УДК 577.152.1

СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

01.04.14 - теплофизика и молекулярная физика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор физ.-мат. наук, профессор В.Е.Холмогоров

Санкт-Петербург 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Некоторые применяемые в диссертации сокращения.....5

ВВЕДЕНИЕ........................б

1. ПАРАМАГНИТНЫЕ И СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕДЬСОДЕРЖАЩЕЙ ГОЛУБОЙ ОКСИДАЗЫ - ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА ... .9

1.1. Основные физико-химические свойства церулоплазмина 9

1.2. Оптические свойства церулоплазмина........11

1.3. Флюоресценция церулоплазмина...........14

1.4. Спектры ЭПР церулоплазмина............18

1.5. Окислительно-восстановительные потенциалы медьсодержащих центров церулоплазмина .........28

1.6. Структура медьсодержащих центров 1, 2 и 3 типов

в церулоплазмине ................... 30

1.7. Антиоксидантные свойства медьсодержащих белков . .33

1.7.1. Связь между каталитической активностью белка

и присутствием в нем иона меди .. .......... 33

1.7.2. Восстановительные реакции медьсодержащих белков 36

1.7.3. Окислительные реакции медьсодержащих белков . . 38

1.7.4. Феррооксидазная активность церулоплазмина . . .39

1.7.5. Антиоксидантная активность церулоплазмина . . . 41

1.7.6. Внутримолекулярная цепь переноса электронов

в церулоплазмине ............ ....... 43

1.8. Действие лазерного излучения на кровь in vitro,

СОД и церулоплазмин................. .44

2. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА .......... 47

2.1. Характеристики использованных препаратов церулоплазмина .................... 4 7

2.2. Материалы, использованные для моделирования

цепи переноса электронов в церулоплазмине.......4 8

2.2.1. Доноры электронов ............... 4 8

2.2.2. Акцепторы электронов..............4 8

2.2.3. Ингибиторы ионов меди 2 типа . .........48

2.3. Моделирование цепи переноса электронов ..... 4 9

2.4. ЭПР-спектроскопия ................ 4 9

2.4.1. ЭПР-спектрометры................4 9

2.4.2. Методика приготовления образцов для ЭПР-спектроскопии ...................50

2.5. Оптическая спектроскопия.............52

2.6. Флуоресценция..................52

2.7. Материалы и методы, используемые для изучения действия гелий-неонового лазера на кровь in vitro . . .52

2.8. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов . .....................56

2.9. Определение антиоксидантной активности плазмы . .57

2.10. Определение оксидазной активности церулоплазмина, супероксиддисмутазной активности плазмы, активности супероксиддисмутазы в эритроцитах ........... 59

3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА...............61

3.1. Механизм внутримолекулярного переноса электронов

в лакказе ....... ..... ...... . . . . .61

3.2. Существование внутримолекулярного переноса электронов в ЦП ................... .63

3.3. Спектры поглощения ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона............63

3.4. Спектры ЭПР ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона................65

3.5. Флуоресценция белкового лиганда ......... 69

3.6. Спектры флуоресценции ЦП при моделировании внутримолекулярной цепи переноса электрона .......... 71

3.7. Обсуждение результатов..............74

4. ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГЕЛИЙ-НЕОНОВОГО ЛАЗЕРА

НА КРОВЬ IN VITRO...................7 8

4.1. Применение облучения крови Не-Ые лазером.....7 8

4.2. Регистрация влияния облучения крови Не-Ые

лазером . .......................79

4.3. Изучение влияния различных доз облучения

на процессы перекисного окисления липидов ...... .81

4.4. Изучение влияния различных доз облучения на оксидазную активность ЦП и супероксиддисмутазную активность плазмы крови................84

4.5. Роль повышения уровня меди в плазме после облучения крови в повышение общего антиоксидантного

статуса плазмы крови.................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................90

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ .... ...... .92

ПРИЛОЖЕНИЕ......................106

Некоторые применяемые в диссертации сокращения:

ЦП - стр. 6 - церулоплазмин;

ЭПР - стр. б - электронный парамагнитный резонанс; ПОЛ - стр. 7 - перекисное окисление липидов; СОД-ная активность - стр. 7 - супероксиддисмутазная активность ;

СТР - стр.19 - сверхтонкое расщепление СОД - стр. 28 - супероксиддисмутаза;

ЫАБРН - стр. 43 - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) (восстановленная форма);

АОР-Ее3+ - стр. 43- аденозиндифосфат (АДФ) в комплексе с Ее3+;

АОС - стр. 47 - антиоксидантная система; п-ФДА - стр. 4 9 - парафенилендиамин; ДК - стр. 58 - диеновые конъюгаты; МДА - стр. 58 - малоновый диальдегид; ТБК - стр. 58 - тиобарбитуровая кислота; НТС - стр. 61 - нитротетразолий синий; ЫАБН - стр. 61 - никотинамидадениндинуклеотид (НАД) (восстановленная форма)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы данной диссертационной работы обусловлена тем, что изучение церулоплазмина (ЦП) , медьсодержащего белка плазмы крови, имеет большое практическое значение. Функциональный дефицит ЦП, определяемый как снижение его ферментативной оксидазной активности в крови, является основным моментом, по крайней мере, в большинстве случаев, в развитии тяжелого наследственного заболевания - гепатолентикулярной дегенерации (болезни Вильсона-Коновалова). Для диагностики многих заболеваний и наблюдения за ходом их развития, используют различный характер изменения относительного содержания в крови ЦП и трансферрина. Кроме того, в последнее время для лечения некоторых заболеваний используется метод облучения крови излучением Не-Ые лазера {X = 632, 8 нм) , соответствующим поглощению голубых оксидаз: ЦП и супероксиддисмутазы. В связи с этим представляет научный интерес изучение физико-химических свойств фотовозбужденного ЦП. Таким образом, изучение ЦП, помимо чисто практического значения, имеет и академический интерес.

Цель исследования:

- рассмотреть особенности поведения ионов Си2+ в молекуле ЦП в ходе окислительно-восстановительного процесса;

- изучить влияние различных доз облучения Не-Ые лазером на процессы перекисного окисления липидов;

- изучить влияние различных доз облучения на оксидазную активность ЦП и супероксиддисмутазную активность плазмы крови.

Основные методы исследования: ЭПР-спектроскопия, оптическая спектроскопия, флуоресценция, облучение Не-Ые лазером.

Объекты исследования: интактный ЦП; ЦП, ингибирован-

ный азидом натрия; плазма крови; кровь.

Научная новизна результатов заключается в том, что

- получены экспериментальные данные в пользу кооперативного взаимодействия ионов меди в молекуле ЦП при осуществлении этим ферментом оксидазной реакции, подтверждена возможность переноса электрона с "голубого" иона 1 типа на ионы 3 типа, цепь переносчиков электронов в ЦП может работать в полном составе и в "редуцированном" виде;

- обнаружено в результате облучения крови He-Ne лазером достоверное снижение в плазме крови стационарного уровня как первичных метаболитов ПОЛ - диеновых конъюгатов, так и одного из конечных продуктов - малонового диаль-дегида в плазме крови;

- таким образом, облучение крови in vitro излучением гелий-неонового лазера в использованных дозах снижает интенсивность протекания процессов ПОЛ и увеличивает устойчивость липидов плазмы к индуцированному окислению;

- показано увеличение устойчивости плазменной липидной фракции к окислению после лазерного облучения при активировании ионами Fe2+ плазмы облученной крови;

- установлена отрицательная корреляция между оксидазной активностью ЦП и интенсивностью протекания процессов ПОЛ после активирования плазмы ионами Fe2+, а также между СОД-ной активностью плазмы и интенсивностью протекания процессов ПОЛ после активирования при дозах облучения от 0,9 до 1,8 Дж;

- показано, что облучение He-Ne лазером крови in vitro в дозах от 0,9 до 1,8 Дж активирует систему антиоксидант-ной защиты крови, отражением чего является снижение интенсивности протекания процессов ПОЛ.

Практическая значимость работы состоит в том, что полученные в работе данные расширяют существующие представления об особенностях поведения ионов Си2+ в молекуле ЦП в ходе окислительно-восстановительного процесса; о кооперативном взаимодействии ионов меди в молекуле ЦП при осуществлении этим ферментом оксидазной реакции; облучение Не-Ые лазером крови активирует систему антиоксидантной защиты крови, что позволяет расценивать биоантиоксидантный эффект как один из положительных моментов фотобиологического действия на кровь лазерного излучения с длиной волны X = 632,8 нм.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения (выводов) и списка цитируемой литературы.

1. ПАРАМАГНИТНЫЕ И СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

МЕДЬСОДЕРЖАЩЕЙ ГОЛУБОЙ ОКСИДАЗЫ - ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

1.1. Основные физико-химические свойства церулоплазмина

Церулоплазмин (ЦП, феррооксидаза КФ 1.16.3.1) - медьсодержащий белок плазмы крови млекопитающих, относящийся, как и два растительных белка - лакказа и аскорбатоксида-за, к семейству голубых оксидаз /1,2/. Являясь мульти-функциональным белком плазмы крови, ЦП катализирует окисление кислородом Ге2+ до Ее3+, что жизненно необходимо для встраивания ионов железа в апотрансферрин и, далее, в гемоглобин. ЦП также катализирует окисление биологически активных аминов в мозге (норадреналина, серотонина). Кроме того, ЦП осуществляет транспорт ионов меди из печени к другим медьсодержащим белкам тканей.

ЦП содержит 0, 28 - 0,34 % меди /3-8/ и 7 - 8 % угле-родов /9,10/. Молекула ЦП представляет собой полипептидную цепь /11/. Молекулярный вес ЦП долгое время определялся от 122000 до 161000 /1,3,9/, а количество остатков аминокислот от 1002 до 1276 /12,13/. Недавно была определена полная первичная структура ЦП человека: молекула ЦП содержит 104 6 аминокислотных остатков, их молекулярный вес 120085. ЦП, по сравнению с другими медьсодержащими белками, характеризуется необычно большим содержанием триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков /14/. Четыре аминокислотных остатка связаны с полисахаридами (61СЫ) ; с их учетом молекулярный вес ЦП составляет 132000 /8,15,16/. ЦП, вероятно, имеет 5 дисульфидных связей и 4 свободные ЭН-группы на молекулу. Цепь белка состоит из трех высокогомологичных участков, каждый из ко-

торых состоит из 350 остатков /17/. В положениях 79 и 449 обнаружены по две аминокислотные замены глицина 20 %) на лизин. Полагают, что это может объяснить существование двух типов ЦП, отличающихся между собой хроматографиче-скими свойствами и подвижностью при электрофорезе. Вторичная структура ЦП имеет р-конфигурацию и беспорядочную

укладку с небольшой примесью а-спиралей или при их отсутствии. Третичная структура его молекулы представляет собой очень плотную упаковку с незначительной степенью асимметрии /18/. Форма молекулы ЦП может быть апроксимирова-на вытянутым эллипсоидом вращения размером 6,5x6,5x13 нм. Объем молекулы составляет (0,26 - 0,28)'105 нм3 /18/.

Атомы меди являются неотъемлемой частью молекулы ЦП и в ходе всех процессов с ее участием они постоянно соединены с белком. Большая прочность связывания меди белком в ЦП обусловлена строением всей молекулы белка. Число атомов меди в ЦП до сих пор точно не определено. Первоначально предполагалось наличие 5-8 атомов меди на молекулу ЦП /1,3,4/. Но, поскольку в последние годы была уточнена молекулярная масса ЦП, то сейчас считается, что ЦП содержит 6 /8,13,19/ или 7 атомов меди на молекулу ЦП /7,9/.

Активные центры ЦП, в состав которых входят атомы меди, связывают с такими жизненно важными биологическими функциями, как электронный транспорт, метаболизм железа и другие. Одной из главных целей изучения активных центров в медьсодержащих белках, в том числе в ЦП, является понимание связи спектроскопических характеристик белков со строением активных центров. Это привело к классификации медьсодержащих активных центров в белках на три /20-22/

или, возможно, четыре /13/ основных типа на основе их различных спектральных свойств:

- центр Си2+ 1 типа ("голубая" медь) характеризуется оптическим поглощением в области 600 - 610 нм и спектром электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с необычной по сравнению с низкомолекулярными комплексами меди структурой сверхтонкого расщепления;

- центр Си2+ 2 типа ("не голубая" медь) обладает обычными для низкомолекулярных комплексов меди параметрами ЭПР и очень слабым поглощением в ближней УФ- и видимой областях. Ион меди этого центра очень сильно связывается с некоторыми ингибирующими анионами, такими как

N3", СЫ", N03";

- центр ионов Си2+ 3 типа обычно не детектируется методом ЭПР, так как представляет собой два сильно антиферро-магнитно спаренных иона меди. Этот центр имеет сильную полосу поглощения при 330 нм, пропадающую при восстановлении центра.

В молекуле ЦП к центру 1 типа относят два иона Си2+, к центру 2 типа - один ион Си2+, к центру 3 типа - два спаренных иона Си2+. Следовательно, если в ЦП находятся 6 ионов меди, то требуется еще один ЭПР-недетектируемый ион меди, который не может быть включен в такую модель и поэтому отнесен к центру 4 типа, - Си+ /13/. Если в ЦП находятся 7 ионов меди, то к центру 3 типа относят две пары диамагнитных ионов меди.

Недавно была определена кристаллическая структура ЦП человека с разрешением 3,0 А /19/.

1.2. Оптические свойства церулоплазмина

Наличие в ЦП большого количества остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана)

обусловливает его сильное оптическое поглощение в ультрафиолетовой области (максимумы полос поглощения находятся около 230 и 280 нм) . Для получения спектра поглощения, обусловленного медными хромофорами белка/ наблюдают разностный спектр нативного и апо-ЦП, из которого удалены ионы меди. В полученном таким образом спектре полосу 330 нм относят к медьсодержащему центру 3 типа, а все остальные полосы - к центру 1 типа (Таблица 1.1).

Точное определение положения и интенсивности полос поглощения иона меди 2 типа в ЦП затруднительно вследствие наличия интенсивных полос поглощения других хромофорных групп. В тех белках, где нет других хромофоров, кроме ионов Си 2 типа, интенсивность полос поглощения настолько мала, что при доступных концентрациях очищенных препаратов эти полосы не наблюдаются /27/.

Для ионов меди 1 типа как в ЦП, так и в других "голубых" белках, характерны необычно высокие коэффициенты молярного поглощения по сравнению с обычными низкомолекулярными комплексами Си2+. Коэффициент молярного поглощения полосы 610 нм для ЦП около 11300 л'моль^'см-1 (в расчете на грамм-молекулу белка). Если учесть, что в молекуле ЦП содержится два "голубых" иона Си2+ , то его коэффициент молярного поглощения в расчете на один грамм-атом меди составит 5650 л"моль~1"см~1 /1,20/, в то время как для d-d перехода в низкомолекулярных тетрагональных

О I

комплексах Си эта величина обычно меньше, чем 100 л'моль-1'см-1. Правда, иногда и низкомолекулярные комплексы меди обладают довольно интенсивными полосами поглощения. В этих случаях предполагается, что они носят характер полос переноса заряда, хотя причиной увеличения интенсивности d-d полос может быть также искажение симметрии /27, 28/.

Таблица 1.1 Электронные спектроскопические свойства ЦП и анион-связанных производных ЦП /23-2 6/

Поглощение Круговой дихроизм Переходы

Белок см 1 нм см 1 нм Ае

1 2 3 4 5 6 7

Натив- 6100 1640 + 2,0 2в2-*2е

ный ЦП 10000 1000 10000 1000 -0, 9 2в2->2в!

11500 870 2в2->2а!

13000 770 13750 730 -9, 0 ТСБ—К1Х2-у2

16400 610 16400 610 +3,4 аЗ—>с!х2-у2

18350 545 + 5,0 СТБ*—»С1х2-у2

23000 435 22000 450 -4,8 7ГЫ->с1Х2-у2

28000 355 + 0,8

30750 325 -0,5

ЦП, 8940 1120 + 1, 4 2в2->2е

инги- 12000 835 -1,6 2в2->2в!

биро- (14000) (710) 15300 655 -6, 0 тсэ—»(Зх2-у2

ванный 16500 605 15300 655 -6,0 сб—>с!Х2-у2

n3" 19250 520 +2,6 стб*—х1х2-у2

22500 445 "6,7 7гы^с1Х2-у2

26000 385 27000 370 + 8,0 Ыз~—>Си2+

ЦП, (13000) (770) 13000 770 "7,8 7СЗ-»(1Х2-у2

инги- 16400 610 16400 610 -2,1 аЗ->с!Х2-у2

биро- 18750 530 + 0,4 СТЗ*->с1х2-у2

ванный 23500 430 22000 455 -10, 6 7Ш->с1х2-у2

ЫСБ" 26650 375 25600 390 + 8,4 ЫСЗ~->Си2+

Спектры поглощения измерялись при температуре 20 К.

Совместный анализ спектров поглощения при комнатной температуре и спектров кругового дихроизма позволил заключить, что медные хромофоры ЦП обусловливают, по крайней мере, шесть электронных переходов в области 300 - 900 нм (323, 455, 545, 615, 714, 816 нм) (рис .1.1) /2326,29/. Низкотемпературные спектры поглощения впервые позволили получить данные о полосах поглощения ЦП в области 1000 и 870 нм /23/. Теоретическое представление длинноволновых полос поглощения ЦП в виде гауссианов действительно предполагает серию полос электронного поглощения в области 375-870 (Рис.1.1). Тем не менее самой интенсивной полосой в ЦП, наблюдаемой экспериментально, является полоса с А, = 610 нм, соответствующая переходу стЗ—>с!Х2-у2 • Инфракрасный спектр поглощения ЦП состоит из двух полос 1632 и 1530 см"1 (6127 и 6536 нм) (рис.1.2) /26/.

1.3. Флюоресценция церулоплазмина

Нативный и апо-ЦП обладает собственной УФ-флуоресцен-цией /26,30-32/, достаточно сложной из-за большого числа триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков в молекуле белка. Применение метода собственной УФ-флуорес-ценции позволило впервые получить данные о пространственной близости части триптофановых остатков к остаткам гис-тидина и к ионам меди, ответственным за оксидазную а�