Химический синтез пептидов в N-C направлении в растворе с использованием свободных аминокислот в качестве аминокомпонентов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

О Я .. 9 / Л У • '/ - ¿/

^ -7 ; Л - л: / а7 Л- / ' /

/ - г / / г ^ '

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЕЛКА

На правах рукописи

РЯДНОВ Максим Геннадьевич

УДК 577.466.55

Химический синтез пептидов в N->0 направлении в растворе с использованием свободных аминокислот в качестве

амниокомпонентов

.02.00.10 — биоорганическая химия, химия физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор МИТИН Ю.8.

Пущине 1999

/

/

ОГЛАВЛЕНИЕ

• Стх

Список принятых сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ............................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...,.....;..............................10

2.1. Инверсный синтез пептидов...............................................10

2.2. Рацемизация в пептидном синтезе.......................................17

2.2.1. Основные механизмы рацемизации...................................17

2.2.1.1. 5(4Н)-Оксазолоновый механизм ...................................20

2.2.1.2. Рацемизация при прямом а-депротонировании.................23

' 2.2.2. Ы-защитные группы уретанового типа................................24

2.2.3. Стратегия сведения рацемизации к минимуму

на стадиях образования пептидной связи............................29

2.2.3.1. Использование реагентов-"ловушек".

Карбодиимидный метод синтеза пептидов..........................32

2.2.3.2. Влияние солей переходных металлов на рацемизацию Уникальная роль О.Г* ионов в подавлении рацемизации.......36

2.2.3.3. Использование изоксазолиевых солей.............................40

2.2.3.4. "Обходные" методы синтеза пептидов.............................42

2.2.4. Определение степени рацемизации. Типы тестов .................43

2.3. Растворимость свободных аминокислот

в апротонных растворителях............................................. .49

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................................52

3.1. Проблема растворимости свободных аминокислот

в апротонных растворителях..............................................52

3.2. Подавление рацемизации..................................................63

3.3. Инверсный синтез биологически активных пептидов...............74

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ............................................80

4.1. Реагенты и оборудование ..................................................80

4.2. Методика эксперимента .....................................................81

4.2.1. Определение растворимости аминокислот...........................81

4.2.2. Типовая методика получения комплексов

\BF3-Py, Э^и-Ру, БЬСз-Ру................................................82

4.2.3. Типовая методика синтеза пептидов в системе апротонный растворитель - неорганическая добавка - третичный амин.......82

' 4.2.4. Типовая методика синтеза Вое-, Ъ-, Етос-производных

аминокислот в системе диметилформамид - неорганическая . добавка - третичный амин -...,...........................................83

4.2.5. Определение кинетики реакций конденсации 7-А1а-ОРГр с ■ фенилаланином, 2-Уа1-0РГр с изолейцином и 2-Уа1-ОН с

изолейцином...............................................................84

4.2.6. Типовая методика определения стенени эпимеризации...........35

4.2.7. Типовая методика синтеза пептидов в М—>С направлении.......37

4.2.8. Инверсный синтез Ьеи'-энкефалина..................................91

5. ВЫВОДЫ............................................................................92

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................94

/

Список сокращений

Aib - аминоизомаслянная кислота; Вое - отреяг-бутилоксикарбонил-;

ВОР - бензотриазол-К-окситрисдиметиламинофосфониум

гексафторфосфат; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

CBMIT - трифлат1,1-карбоншг бмс-(З-имидазолия); CDI - карбонилдиимидазол;

г

CMC - Ы-циютогексил-К -(2-морфолинил-(4)-этил карбодиимид;

DCC - дициклогексилкарбодиимид;

DCM - дихлорметан;

DCU - дициклогексилмочевина;

DIC - диизопропилкарбодиимид;

DIEA - диизопропилэтиламин;

DMF - диметилформамид;

DMSO - диметилсульфоксид; ;

DPPC - дипентафторфенилкарбонат;

/

EDC - К-(диметиламинопропил)-К -этил карбодиимид; EEDQ - К-карбоэтокси-2-этокси-1,2-дигидрохинолин; EtOAc - этилацетат; Fmoc - 9-флуоренштметилоксикарбонил-;

HATU - гексафторфосфат 2-(1-окси-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-

тетраметилурония; HBTU - гексафторфосфат 2-(1-окси-бензотриазол-1-ш1)-1,1,3,3-тетраметилурония;

НМРА - гексаметиламид фосфорной кислоты; HOAt - 1-окси-7-азабензотриазол; HOBt - 1-оксибензотриазол;

HONB - Ы-гидрокси-5-норборнен-эндо-2,3-дикарбок'самид; HOPfp - пентафторфенол; HOSu - N-оксисукцинимид; IBCF - изобутилхлорформиат;

Mbh - 4,4-диметоксибензгидрил-;

Mbzl - 4-метилбензил-;

NCA - N-карбоксиангидрид;

NMM - N-метилморфолин;

-OBt - 1-оксибензотриазолиловый эфир;

-ОВи1 - трет-оутиловый эфир;

-OBzl - бензиловый эфир;

-ОМе - метиловый эфир;

-ONp - л-нитрофениловый эфир;

-OPfp - пентафторфениловый эфир;

-OSu - N-оксисукцинимидный эфир;

Рат - фенилацетамидометил;

Pht - фталоил;

Ру - пиридин;

РуВОР - (бензотриазолил)-К-оксипирролидинфосфониум

гексафторфосфат; Реагент К Вудворда - М-этил-5-фенш1изоксазолий-3-сульфонат; Sar - N-метилглипин (саркозин);

TBTU тетрафторборат 2-(1-окси-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония;

ТЕА - триэтиламин;

ТРА - трифторуксусная кислота;

ТНР - тетрагидрофуран;

То8 - л-толуолсульфонил (тозил);

Ъ - бензилоксикарбонил;

Остальные сокращения даны в соответствии с правилами ШРАС-1ЦВ /118/.

1. ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на успешный синтез небольших белковых молекул уже имеющимися методами пептидной химии, пептидный синтез продолжает совершенствоваться, что и позволяет ему оставаться одним из приоритетных направлений развития биоорганической химии. Большое разнообразие химических методов синтеза пептидов можно уместить в две принципиально отличные по направлению схемы наращивания пептидной цепи. Строго говоря, с точки зрения практической ценности, сегодня можно говорить только об одной из них; а именно о классической схеме синтеза.

• Классической схемой синтеза является наращивание пептидной цепи от ее карбоксильного конца к амикиому концу, т. е. в С->К направлении. Одна из основных проблем химического синтеза пептидов - рацемизация в данном случае решается благодаря наличию временных а-амино защитных групп уретанового типа, исключающих рацемизацию на каждой стадии синтеза. Основной лее недостаток данной схемы состоит в обязательном снятии этих защитных групп на каждой стадии после присоединения очередной аминокислоты. Это сопряжено с использованием сильных кислот (например для Вос-группы) или большого избытка оснований (для Ртос-группы) и может привести к побочным реакциям, а значит уменьшению выходов целевых продуктов реакции и загрязнению основного продукта, что требует в свою очередь дополнительной очистки (рис. 1а).

Синтез пептидов в N<—0 направлении

Z-.AAn.pOH Н-ААП-(Ж г-ААп.рААп-ОК

2-ААп.2-ОН Н-ААп.1-ААп-ОК . 4

2-ААп.2-АЛ1.гААП-0К

г-ААрААгААз-......-АА„-(Ж

Синтез пептидов в N->0 направлении (инверсный синтез пептидов)

г-ААрОН Н-АА2-ОН г-ААгАА2-ОН Н-ААз-ОН

2-ААгАА2-АА3-ОН

4-

г-ААгААз-ААз-......-АДгОН

Три основные стадии:

1. Активация а-карбоксильной группы

2. Конденсация

3. Деблокирование

Рис. 1а

Две основныестадии:

1. Активация а-карбоксильной группы

2. Конденсация

Рис. 16

Так называемый "инверсный синтез пептидов" представляет собой обратную классической схему синтеза, а, именно, наращивание пептидной цепи в N->0 направлении. При этом в случае использования свободных аминокислот в качестве аминокомпонентов исключается необходимость по-стадийногЪ деблокирования а-амино группы, что значительно упрощает синтез (рис. 16).

Однако, инверсный синтез невозможно осуществить без решения двух важных проблем. Во-первых, необходимо найти условия растворения свободных аминокислот в апротонных растворителях, так как свободные аминокислоты отличаются крайне слабой растворимостью даже в таких апротонных растворителях, как диметилформамид, тетраметилмочевина.

гексаметиламид фосфорной кислоты и т.п. Во-вторых, необходимо найти условия, при которых полностью исключается рацемизация на каждой стадии синтеза.

Таким образом, при предпочтении инверсного синтеза классическому варианту (или для решения основного недостатка классического пептидного синтеза) необходимо решить две, не считая достижения высоких выходов на каждой стадии конденсации, серьезные проблемы в инверсном синтезе пептидов: подавит рацемизацию и значительно увеличить растворимость свободных аминокислот в апротонных растворителях.

Настоящая работа посвящена поиску условий проведения свободного от рацемизации химического синтеза пептидов в N->0 направлении с использованием свободных аминокислот в качестве аминокомпонентов (незащищенные по карбоксильной и аминной группам аминокислоты,

далее обозначаются как свободные аминокислоты).

Работа состоит из трех частей. Первая посвящена поиску оптимальной безводной апротонной системы растворителей, способствующей растворению свободных аминокислот с целью их дальнейшего использования в пептидном синтезе.

Вторая часть заключается в поиске необходимого решения

первоочередных проблем при проведении инверсного синтеза, а именно;

I -

подавление рацемизации при конденсации и достижение максимальных

выходов (близких к количественным) на каждой стадии синтеза. Поиск

условий синтеза без рацемизации (метод конденсации, соотношение

реагентов, подавляющие рацемизацию добавки) проводился на тестовых

трипептидах со свободной СООН группой.

Третьей частью работы является апробация найденных в первой и второй частях условий в синтезе отдельных пептидов в растворе.

2.1. Инверсный синтез пептидов

Крайне скудные литературные данные по инверсному синтезу можно объяснить строгой зависимостью собственно проблемы синтеза в N->0 направлении с проблемами рапемизапиии и растворимостью Свободных аминокислот в апротонных растворителях.

Второй фактор может быть не столь значимым при проведении синтеза в водно-органических средах, однако, в этом случае выходы на каждой стадии составляют не более 60-70% /1-3/; при использовании вместо свободных аминокислот их сложных эфиров (алкиловых, ариловых) проблема растворимости также исчезает, но . появляется новая -необходимость снятия защиты с карбоксильной группы вновь присоединенной аминокислоты на каждой стадии синтеза. При этом теряется очевидное преимущество инверсного синтеза. Известны единичные случаи попыток синтеза пептидов в инверсном направлении/4-9,11-14/. *

4 I

Интерес к инверсному синтезу пептидов впервые возник еще в 60-70

года^ и был ознаменован независимыми работами групп Летсингера /4/,

I .

Меррифилда /5/, Мукаиямы /6, 7/ и Матсуеды /8,9/. Однако, полученные

результаты не имели практического значения и представляли чисто

академический интерес.

Первым и наипростейшим примером инверсного синтеза пептидов принято считать синтез дипептида Ьеи-С1у /15/, осуществленный Летсингером с соавт. по схеме:

1_еи-ОН

ОСО-Ьеи-ОЕ!

1. ОН/МеОН 2. СЮОСМВи

ОСО-1_еи-ОСОО[В1

61у-0Вг|ДЕА

\ /

ОСО-!_еи-С1у-ОВг1

НВг/АсОН

> 1_еи-01у + 1_еи + С1у 89% 3.6% 7.2%

Меррифилд с сотр. /5/ осуществил синтез трипептида (Хеи-А1а-С1у) способом, являющимся классическим примером одного из вариантов "обходного" хметода в синтезе пептидов, основанном на превращении концевой карбоксильной защитной группы в активированную ацильную функцию без рацехмизации и без промежуточного получения карбоновой

I

кислоты:

I ■ V.. • ■

^ ОСОС1

!_еи-МНЫН-Вос

->

ч //

ОСО-Ьеи-ЫНМИ-Вос

НС!/с1юхап

>

ОСО-1_еи-Ж1\1Н-НС1

осснеи-м

А!а-МН[\'НВсс

ехс.

попыткам вести синтез пептидов в N->0 направлении методом

восстановительно-окислительной конденсации с помощью

/

трифенилфосфина и 2, 2 -дипиридилдисульфида по схеме:

V. Р= ¿-А)а-С(у-ОН

Н-1еи-01у-С1у-С1у-1еи-С1у-ЖШ-Вос

2: Р=г-А!а-ОИ 1*'= Н-Фу-ОМе

Несмотря на то, что ранние работы Летсингера /4/ и Меррифилда /5/ нельзя строго считать работами в области инверсного синтеза, они все же являются точкой отсчета развития и разработки пептидного синтеза в N-»0

I

направлении благодаря идее присоединения аминокислот к полимеру через их аминную функцию.

К серьезным исследованиям условий проведения инверсного синтеза пептидов следует отнести недавние работы групп Байера и Шарма,

I.

являющиеся своего рода продолжением после (тридцатилетнего забвения) начатых ранее упомянутыми коллективами /11-14/.

В исследовании Шарма с сотр. в качестве аминокомпонентов использовались три-яфеш-бутилокси силильные эфиры аминокислот стабильные при рН 4-8, что позволяет вести синтез в инверсном направлении без дополнительной деблокировки на каждой стадии синтеза в жестких условиях. Связь полимер - аминокислота была осуществлена через бензилоксикарбонил.

Были синтезированы модельный (Ъеи-А1а-С1у-Уа1) и биологически активный пептиды (лейцин - энкефалин, Туг-01у-С1у-Р11е-Ьеи) с хорошими выходами. Характеристики пептидов были сопоставлены с таковыми этих пептидов, синтезированных в С—направлении.

Синтез велся Э1С-НОВ1 методом с временем на каждом цикле конденсации 2 ч. Полученные условия были опробированы на синтезе других пептидных модельных последовательностей: А1а-С1у-А1а-01у, А1а-Рго-А1а-Уа1-С1п и А1а-Рго-А1а-Уа1-01п-5ег-ТЬг-С1и-ТЬг-Ьуэ. Эти синтезы были повторены для ВОР метода конденсации, дав идентичные результаты.

Однако, отсутствие решения проблемы рацемизации в ходе синтеза в данной работе не позволяет делать вывод о достаточности полученных результатов для инверсного синтеза пептидов.

Вторым и последним на сегодняшний день исследованием по синтезу пептидов в N->0 направлении является работа группы Байера /13,

; I

14/. 1

Фактически, данное исследование не имеет принципиального отличия от упомянутой выше работы. Синтез велся на твердой фазе (связь полимера с аминогруппой аминокислоты через тритилоксикарбонил). В качестве аминокоммпонентов также использовались эфиры аминокислот; в данном случае гидроксибензотриазолиловые соли 9-ф л у о ре н ил м ето кс и

эфиров аминокислот (рис. 2). Методами конденсации служйли тот же ШС-

Были синтезированы 4 пептида:, лейцин - энкефалйн, его метиловый

Су507МеВ21)-О!у-Н18(Г)пр)-Ьу5(2-С1к)-А1а-ОН. ^

I

Выходы пептидов на каждой стадии составили от 50 до 70%, в ходе синтеза был получен набор продуктов. ,,•

В данной работе в отличие от работы Шарма с сотр. имеются данные по рацемизации. Так, для фенилаланина лейцин - энкефалина доля 0-эпимера составила 8.2% для 01С-Н0В1 метода: и 40% для ТВШ-НОВ! метода. Впервые для данного типа работ здесь была предпринята попытка подавления рацемизации. ; Основная идея состояла в дополнительной блокировки аминной функции аминокислоты стерически громоздкой группой - ТтоЬ (2,4,6-триметоксибензил), иЗ предположения, что такая группа будет препятствовать образованию 5(4Н)-оксазолона, а значит и рацемизации (рис. 3).

Действительно, доля Б-эпимеров аминокислот в синтезируемых пептидах с дополнительно защищенными таким образом аминогруппами уменьшается по сравнению с обычными пептидами, но, по-прежнему,

НОВ! и ТВТи-НОВ! методы.

Рис. 2

эфир и амид, а также 64-71 фрагмент Н1У-1 .протеазы: Уа1-С1и(0В21)-11е-

уровень рацемизации остается недопустимым (порядка 20% D-эпимера аланина [Ala4, Ьеи^-энкефалина против 44.4% без Tmob)

-о

В целом, работа группы Байера является на сегодня единственным комплексным исследованием по инверсному синтезу, пептидов на твердой фазе, включающем мониторинг выхода пептида, оценку степени рацемизации и попытку подавления рацемизации на каждой стадии активации - конденсации. Но, тем не менее, две главные проблемы инверсного синтез: подавление рацемизации и постадийный выход близкий к количественному не были решены.

! Во всех описанных попытках синтез велся с использованием либо зфиров аминокислот, либо солей этих эфиров (например: НОВ! соли 9- ;

флуоренилметиловых эфиров аминокислот в работе группы Байера или

| -

три-я?ре/?2-бутилокси силильные эфиры в работе Шарма /10, 11/'). И,

I

поскольку, основное преимущество инверсного синтеза с использованием

I

свободных аминокислот в; качестве аминокомпонентов по сравнению с обычным (в С->Ы направлении) состоит в отсутствии одной из стадий синтеза; а именно снятия временных защитных групп на каждой стадии синтеза, то все упомянутые попытки с использованием эфиров аминокислот можно считать лишь попытками моделирования неконкурентноспособного инверсного пептидного синтеза. В этих работах

ОС

ос

заменялась на стадию снятия временных СООН -защитных групп. Проблема же рацемизации во всех этих работах не была однозначно решена.

Попытки инверсного синтеза пептидов в растворе вообще не описаны.

1 2.2. Рацемизация в пептидном синтезе 2.2.1. Основные механизмы рацемизации

При рассмотрении вопроса рацемизации целесообразно делать терминологические различия между специфическими веществами или их реакциями и общими реакциями:

-Необходимо четко определять тип рассматриваемой молекулы. Алании рацемизуется так же, как и любая другая аминокислота или пептид, имеющие один хиральный центр. Изолейцин эпимеризуется так же, как и любой пептид, имеющий несколько хиральных центров, но при этом потеря хиральной чистоты происходит только в одном из этих центров.

При сопоставлении экспериментов по определению хиральной чистоты

I

полезно помнить, что степень рацемизации характеризует долю

I

образовавшегося рацемата, в то время как степень эпимеризации - только долю Б-эпимера.

- Термин "рацемизация" относится �