Новые аминозащитные группы на основе 2-(арилсульфонил)этанолов для синтеза пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РФ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

г* ? 1 л г; , „ На правах рукописи

|

САБИРОВ АЙДАР НАДЖАТОВИЧ

НОВЫЕ АМИНОЗАЩИТНЫЕ ГРУППЫ НА ОСНОВЕ 2-(АРНЛСУЛЬФОНИЛ)ЭТАНОЛОВ ДЛЯ СИНТЕЗА ПЕНТОДОВ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и фтиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск -1997

Работа выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Научный руководитель: кандидат химических наук Самуков В В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Зарытова В.Ф.

доктор химических наук Толстиков А.Г.

Ведущая организация ГосНИИ особо чистых препаратов,

г. Санкт-Петербург.

Защита состоится "19, " а^^рсО^ 1997 г. в 5 ' часов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганическоб химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак.Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " Мй'рч*) 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук О.С. Федорова

ч,7

Актуальность проблемы. Основой любой тактической схемы химического синтеза пептидов является способ временной защиты а-аминогрутш аминокислот в процессе сборки пептидной цепи. Из многих десятков амино-зашитных групп, предложенных в разные годы, лишь несколько группировок уретанового типа используются в настоящее время в практическом синтезе пептидов. Наиболее эффективной а часто применяемой К,-зашитной группой является 9-флуоренилметоксикарбонильная (Ртос) группа, расщепляемая органическими основаниями в апротонных условиях по механизму Р-элиминирования. Благодаря мягким условиям расщепления и прекрасной совместимости с постоянными защитными группами трет-бутпльного типа, в автоматическом твердофазном синтезе пептидов Ршос-группа фактически вытеснила традиционные ^-защитные группы, расщепляемые кислотными реагентами. В ходе интенсивного использования и изучения Ртос-защиты выявились и ее недостатки, в частности, недостаточная стабильность в слабоосновных и даже нейтральных средах, в том числе, в условиях образования пептидной связи. Однако пользователи автоматических синтезаторов не имеют выбора, поскольку до сих пор Итос-группа является единственной щелочелабильной защитой, пригодной для практического синтеза пептидов. Поэтому поиск и изучение новых уретановых амино-защитных групп, расщепляемых основаниями, является актуальной задачей.

Цель работы. Целью работы являлся поиск расщепляемых основаниями амино-зашитных групп в ряду 2-алкил(арил)сульфонилэтил-уретанов, а именно, количественная оценка скоростей расщепления 2-алкил(арил)сульфонилэтил-уретанов сильными органическими основаниями в апротонных условиях для получения ответов на два основных вопроса:

1) В каких пределах изменение структуры заместителя при сульфонильной группе влияет на скорость расщепления уретана?

2) Можно ли в ряду 2-алкил(арил)сульфоннлэтил-уретанов подобрать группы, подходящие в качестве временных Ид-защит для синтеза пептидов в растворе и на твердой фазе?

Научная новизна. Впервые показано, что 2-алкил(арил)сульфонилэтил-уретаны расщепляются сильными органическими основаниями в апротонных растворителях по механизму Р-элиминирования. Получены доказательства в пользу механизма элиминирования Е1сВ. Измерены скорости расщепления 2-арил(алкил)сульфонилэтил-карбанилатов сильными органическими основаниями в диметилформамиде и установлено, что путем изменения структуры заместителя при сульфонильной группе м> кно изменять скорость расшепления уретана в пределах трех порядков величины. Показано, что константы скорости второго порядка реакции расшепления замещенных 2-арил- и 2-бензилсульфонилэтил-карбанилатов

подчиняются уравнению Гаммета, определены реакционные параметры р для фенильной и бензильной серий. Получены данные о стабильности 2-[арил(алкил)сульфонил]зтил-уретанов в модельных условиях пептидного синтеза.

Практическая ценность работы. Предложены новые защитные группы для синтеза пептидов в растворе и на полимерных носителях - 2-(4-хлорфенилсульфонил)этоксикарбо-нильная (Ср$) и 2-{4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонильная (№с), соответственно. Разработаны методы получения ацилируюишх реагентов для введения новых защитных групп. Синтезирован ряд ^-Срв-аминокислот и полный набор Ыа-№с-защищенных протео-генных аминокислот. С использованием Ма-Срз-захцитной группы, отщепляемой 2 экв. 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундецена-7 (ОВ1Г), и новой хромогенной 4-(4-фенилазо)бензилокси-бензильной (АЬг) карбокси-защитной группы синтезированы Ьеи-энкефалин и его [О-А1а2]аналог. Разработан реагент для эффективного отщепления №с-защиты - 20% пиперидин/1% БВиЮМ]:. С использованием новой Ма-№с-защитной группы шприцевым и автоматическим методами твердофазного синтеза синтезировано свыше 100 пептидов длиной от 5 до 32 аминокислотных остатков. Показано, что №с-аминокислоты могут применяться при работе на автоматических синтезаторах почти без изменения стандартных протоколов, разработанных для Ртос-ами нокислот.

Апробация работы. Основные научные положения, выводы диссертационной работы докладывались на научных конференциях ГНЦ ВБ "Вектор", на V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов (Рига, 1987), на XIV Американском пептидном симпозиуме (Колумбус, Огайо, США, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем работы и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на &9 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, экспериментальной части, списка цитируемой литературы из 89 наименований и содержит 8 таблиц и 8 рисунков.

Содержание работы

I. Расщепление 2-алкип(арил)сульфонилзтил-уретанов органическими основаниями в апротонных растворителях

В качестве модельных соединений для кинетических экспериментов были выбраны И-фенилуретаны (карбанилаты), которые легко можно получить из соответствующих спиртов и фенилизоцианата.

1.1. Синтез 21алк1а(ари.усульфонил1отанолов и их карбанилатов.

Для синтеза замешенных 2-алкил(арил)тиозтанолов из различных предшественников использовали два метода: взамодействие 2-меркаптоэтанола с галотенарилами или алкилами и алкилирование замешенных таофенолов 2-хлортганолом. Полученные тиоэфиры окисляли до сульфонов (1) перекисью водорода в ацетоне в присутствии солей молибденовой или вольфрамовой кислоты в качестве катализатора и далее превращали в карбанилаты (2) обработкой небольшим избытком фенилизоцианата в пиридине в присутствии каталитических количеств 4-диметиламннопирвдина. Таким же образом был получен 9-флуо-ренилметилкарбанилат.

Нг02 9 PUNCO ? ?

R-S-CH2CH2OH -► R-S-CHjCHjOH -- R-S-CHjCHjO-C-NHPh

ь ь

(1) (2)

Строение полученных соединений было подтверждено масс-спектрами высокого разрешения, данными элементного анализа и ИК спектрами.

1.2. Методы кинетических измерений и скорости реакции.

Были изучены скорости расшепления модельных карбанилатов 1,8-диазабицикло-[5А0)унзец-7-еном (DBU) и 1,13,3-тетраметилгуанидином (TMG) в DMF, примем основное внимание уделялось использованию точно рассчитанных количеств оснований. В растворном варианте пептидного синтеза это дает возможность после удаления амино-защитной группы и нейтрализации основания избытком слабой кислоты, например 1-гидроксибензо-триазола или пентахлорфенола, проводить наращивание пептидной цепи не выделяя деблокированный пептид.

Степени превращения карбанилатов в реакциях с основаниями определяли по количеству образовавшегося анилина, концентрацию которого измеряли спектрофотометрически в визе N-9-акридильного производного.

Кинетические исследования показали, что все карбанилаты гладко расщепляются двумя эквивалентами DBU или TMG г DMF, причем скорости их расщепления несколько отклоняются от обычной кинетики второго порядка. Наблюдаемые константы скорости второго порядка кш6, уменьшаются с увеличением глубины превращения. Во всех случаях это уменьшение невелико, однако оно превосходит ошибку эксперимента. Эти отклонения обусловлены, по-видимому, тем, что равновесная стадия образования карбаниона из (2) (характерная для механизма ElcB) ингибируется возрастающей концентрацией сопряженной

кислоты ВН*. Подобный механизм, как известно, реализуется и при расщеплении Fmoc-производных.

RSOjCHjCHjOCONHCgHj + В - RSOjCHCHJOCONHCJH, + ен* -(2)

-- rso2ch=ch2 + "OCONHC8H5 * вн*

В * основание

Для сравнения реакционных способностей модельных карбанилатов использовались усредненные константы скоростей второго порядка к'ш6л , которые были получены путем линеаризации кинетических кривых в полулогарифмических координатах в интервале степеней превращения от 0.3 до 0.8 (Рис. 1). юо т

во- •

!

30- .

«Ме

а<-ншро-ая

д4-Хлор-РИ

04-Me-Ph

Ж*-Нитро-РИ

ОРИ

□ва

Х4-Фенилазо-РЬ

ЖЗ-Нитро*Вг1

ОЧ-Фенилазо-Bzl

Ду31,025х

у « 24,527*

у » 0,8287*

Рис. 1. Кинетические кривые реакции карбанилатов (2) с 2 зкв. DBU в DMF в полулогарифмических координатах.

Константы скоростей определялись по формуле:

где х - текущая концентрация анилина, Ао - начальная концентрация основания, В0 -начальная концентрация карбанилата, I - время реакции. Обработку результатов проводили по методу наименьших квадратов.

Таблица 1

Кинетические параметры реакций расщепления кзрбанилатоа (2) и (3) 2 эи. ОВи а ОМИ при

№ а к* - * <; л ШЮЯ. ^ Т5оч(мин) Т99»/,(МИН)

(л/мол* мин)

2а Метил 0.83 ±0.11 32.4 368

26 Бензил 2.25 ± 0.3 11.6 131

2в 4-Толил 3.02 ± 0.3 9 102

2к 4-Фенилазобензил 5.22 ± 0.3 5.2 58

2г Фенил 6.08 ±0.2 4.3 49

2д З-Нитробензил 12.7з:0.8 2.1 24

2е 4-Нитробензил 17.6 ±1.8 1.7 19

2л 4-Фенилазофенил 24.5 ± 3.2 1.3 15

2ж 4-Хлорфенил 31.1 ±3.5 1 11

2з 4-Нитрофенил 650 ± 80 0.05 0.6

2и 2,4-Динитрофенил >700* - -

3 Флуоренилметил-М- >700* - -

фенилуретак

•Точные измерения провести ие удалось из-за большой скорости реакции

Табл!

Кинетические параметры реакций расщепления карбанилатс а (2) и (3) 2 экв. ТМО в ОМР при

20°С (б - стандартная ошибка регрессии)

№ Я ^ идол, ~ 5 Т50%(мин) 1 Т99%(мин)

(л/мол«мин) [

2е 4-Нитробензил 17.6 ± 1.8 1.7 19

2ж 4-Хлорфенил 7.1 ±0.7 2.3 26

2з 4-Нитрофенил 74 ±5 0.22 2.5

3 Флуоренилметил-Ы- 5.8 ±0.2 2.8 32

фенилуретан

Из представленных данных видно, что скорости расщепления карбанилзтов (2) существенно зависят от строения заместителя (I при сульфонильной группе, причем а реакции с ОВи скорости заметно выше, чем с ТМО (Табл 1 и 2). Вычисленные значения к',.™ для замещенных фенилсульфонильных и бензилсульфонильных производных хорошо коррелируют с константами с° заместителей и подчиняются уравнению Гаммета (Рис. 2):

18- = ро°

Как и следовало ожидать, реакционный параметр фенильной серии (р = 2.47) выше, чем для бензильной серии (р = 1.10). Столь высокие значения р говорят о возникновении значительного отрицательного заряда в переходном состоянии, «то также свидетельствует в пользу механизма ß-элиминирования ElcB.

Рис. 2. Зависимости tg(k'„gVk'o) от констант заместителей о0 для реакции расщепления карбанилатов (2) DBU в DMF.

Необходимо отметить, что при использовании для 4-фенилазо-замес-тителя табличного значения с" = а = 0.64 точки, соответствующие кщ^я для соединений в фенильной серии и в бензильной серии, выпадают. Хорошая корреляция в обеих сериях достигается, если для 4-фенилазогруппы принять значение а° = 0.25 (Рис. 2). Обращает ка себя внимание аномально низкая скорость расщепления 9-флуоренилметилкарбанилата TMG, которая примерно в 100 раз ниже, чем скорость его расщепления DBU (см. табл 1 и 2), в то время как для остальных исследованных карбанилатов скорости реакций с этими основаниями различались в 5-8 раз. Вероятно, это связано со стерическими препятствиями, возникающими при взаимодействии объемистого 9-флуоренилметоксикарбонильного радикала с TMG.

1.3. Стабильность карбанилатов в модельных условиях пептидного синтеза.

Для оценки устойчивости различных 2-арил(алкил)сульфонилэтоксикарбонильных групп в условиях образования пептидной связи растворы соответствующих карбанилатов в DMF были подвергнуты действию следующих реагентов: а) смесн 2 экв. DBU и 4 экв. HOBt; б) смеси 2 экв TMG и 4 экв HOBt; в) 1 экв. триэтиламина. Первые две системы моделируют условия, возникающие после удаления защитной группы DBU и TMG и нейтрализации основания избытком 1-гидроксибензотриазола. Третья система имитирует воздействие непрореагировавщего аминокомпонента на защитную группу во время конденсации.

Установлено, что степени распада карбанилатов в этих системах соответствуют скоростям их расщепления основаниями. Наименее устойчивым в системах, содержащих DBU и триэтиламин, оказался 9-флуоренилметилкарбанилат. При концентрациях реагентов,

Ig k'/кмбл

«IgWMBztl

О Igk/ko (PI)

4-Нитро у = 2.4711* R2 = 0,998

близких к применяемым обычно в пептидном синтезе, его распал за 24 ч при 20 С превышает 40%. Интересно отметать, что степень распада 2-(4-нитрофе!шлсульфонил)этил-карбанилата в этих условиях не превышает 10%, а его 4-хлор-аналога - У/о.

Проведённые кинетические исследования показали, что, изменяя заместитель при 2-сульфонилэтоксикарбонильной группе, можно получать защитные группы с самой разной чувствительностью к основным реагентам - скорости их расщепления могут различаться более, чем на три порядка, причем наиболее лабильные по реакционной способности близки к 9-флуоренилметоксикарбонильной группе. Вычисленные реакционные параметры для фенильной и бензильной серий позволяют предсказывать реакционную способность защитных групп на основе замешенных 2-бензил- и 2-фенилсульфонилэтанолов и подбирать наиболее подходящие для решения конкретных задач.

2.2-(4-Хлорфенил)сульфонилзтоксикарбонильная (Cps) амино-шщитная группа для синтеза пептидов в растворе.

Для ступенчатой сборки пептидной цепи в растворе желательно было подобрать временную N,,-защитную группировку, которая, будучи вполне устойчивой в условиях образования пептидной связи, в тоже время количественно отщеплялась бы за 15-20 мин при действии 2 зкв. DBU в реально используемом диапазоне концентраций реагентов.

На основании имеющихся кинетических данных мы предположили, что необходимым сочетанием свойств может обладать 2-(4-хлорфенилсульфонил)этоксикарбонильная (Cps) группа. Время расщепления модельного 2-(4-хлорфенилсульфоиил)этил-карбанилата на 99% при обработке 2 экв. DBU в DMF не превышает 12 мин при начальной концентрации карбанилата 0.025 мол/л. Распад карбанилата в модельных условиях пептидного синтеза во всех изученных системах был не более 3% за 24 ч, что вполне приемлемо, так как реальное время конденсации в ступенчатом синтезе не превышает, как правило, 3-4 ч. Константа скорости расщепления синтезированного метилового эфира Na-Cps-L-лейцина DBU в DMF незначительно отличалась от константы скорости, определенной для модельного карбанилата. Это подтверждает возможность перенесения данных, полученных для модельных соединений типа (2), на производные аминокислот и пептидов.

Из 2-(4-хлорфенилсульфонил)этанола были получены ацилирующие реагенты, пригодные для введения Cps-группы в аминокислоты - 2-С4-хлорфенилсульфонил)этилхлорфор-миат (Cps-Cl) и 2-(4-хлорфенилсульфонил)этил-4-нитрофеннлкарбонат, твердые кристаллические вещества, стабильные без доступа влаги в течение длительного времени. С помощью хлорформиата синтезированы Nc-Cps-производные Leu, Phe, Gly и D-AIa, которые бьии

выделены в виде свободных кислот или солей с дицихлогексиламином. Эти защищенные аминокислоты использовались для синтеза двух пентапаптидов, выбранных в качестве простых моделей для испытания новых синтетических методов - Ьеи'-энкефалина Туг-Иу-йу-РЬе-Ьеи и его [1>-А1а:]-аналога Туг-0-А!а-С1у-РЬе-Ьеи.

Для совместного использования с Ыа-Ср5-группой в ступенчатом синтезе пептидов была специально разработана новая кислотолабильная защитная группировка для постоянного блокирования С-терминальной карбоксильной группы. Эта группировка - 4-(4-фенилазо)бензилоксибензильная (АЬг) - является функциональным аналогом известной п-метоксибензильной группы. АЬг-группа окрашивает пептиды в оранжевый цвет, позволяя легко детектировать их при тонкослойной хроматографии, и может быть количественно удалена безводной ТТА (О С, 30 мин) аналогично л-метоксибензильной группе. АЬг-Эфиры защищенных аминокислот получали двумя способами: конденсацией Срэ-аминокислоты с 4-(4-фенилазо)бензилоксибензиловым спиртом (3) при действии ОССЯЗМАР или алкили-рованием ИСНА-соли Срз-аминокислоты 4-(4-фенилазо)бензилоксибензилхлоридом (4). Необходимые для введения АЬг-группы реагенты синтезировали из 4-бромметилазобензола и 4-гидроксибензальдегида:

(3) (4)

Цикл наращивания пептидной цепи начинали с обработки АЬг-эфира Срз-аминокислоты (пептида) 2 экв. БВи в БМР. Через 10-20 мин добавляли к раствору 4 экв. НОВ^ который нейтрализовал БВи и одновременно служил катализатором последующей конденсации. Прибавление НОВ1 вызьгеало мгновенное выделение СО: из-за разложения ЭВи-соли карбаминовой кислоты, при этом аминокомпонент освобождался для реакции ацилирования. Возможность не выделять продукт после удаления Срэ-защиты дает существенный выигрыш по времени и снижает механические потери материала в процессе синтеза.

При синтезе Ьеи5-энкефалина ацилирование проводили небольшими избытками (1020%) пентахлорфениловых эфиров Срэ-аминокислот. Реакция обычно доходила до конца за 1-2 ч, продукт реакции выделяли экстракцией, промыванием и упариванием органической

фазы, остаток затем растирали с эфиром для удаления пентахлорфенола. Выходы промежуточных пептидов составляли 76-91 %.

При синтезе [D-Ala2, Ьеи5]-энкефалина в реакцию ацилирования вводили непосредственно DCHA-соли Cps-аминокислот, а в качестве конденсирующего агента использовали перхлорат трис(диметиламино)хлорфосфонкя ТСРР, продукты превращения которого растворимы в воде. В этом случае промежуточные пептиды выделяли осаждением из реакционной смеси водой и промыванием осадков водными растворами бикарбоната натрия и лимонной кислоты. Выходы и чистота пептидов при этом были, как минимум, не хуже, чем в синтезе 1хи'-энкефалина.

N-Кояпгная аминокислота (тирозин) вводилась в данных синтезах в виде N„-Boc-производного для того, чтобы все защитные группы с целевых пептидов можно было удалить в одну стадию. Защищенный пентапептид Boc-Tyr-Gly-GIy-Phe-Leu-OAbz обрабатывали смесью TFA и .и-крезола, осаждали деблокированный пептид эфиром и очишали хроматографией на колонке с сефадексом G-15 в 1 М уксусной кислоте. По хромато-графическим характеристикам в ТСХ и обращенно-фазовой ВЭЖХ полученный продукт не отличался от аутентичного биологически активного Ьеи'-энкефалина. [Т)-А1а2]-Аналог получили таким же образом из защищенного пептида Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OAbz. Строение синтезированных пептидов было подтверждено данными аминокислотного анализа и масс-спектрами в режиме бомбардировки быстрыми атомами (FAB).

Проведенные синтезы показали, что Cps-rpynny можно эффективно использовать для ступенчатого синтеза пептидов в растворе в сочетании с С-концевыми и боковыми защитными группами, устойчивыми к действию сильных органических оснований в безводных растворителях. Мы также обнаружь!, что Cps-защита количественно отщепляется за 30 мин 40% пиперидином в DMF. Этот факт может существенно расширить тактические возможности применения Cps-группы в растворном синтезе пептидов.

J. 2-(4-Нитрофенил)сулъфонилзтоксикорбонилъная (Nsc) амино-шщитная группа для твердофазного пептидного синтеза.

Анализ полученных данных о скоростях расщепления основаниями и устойчивости модельных 2-арил(алкил)сульфоннлэтил-карбанилатов) привел нас к мысли, что 2-(4-шпро-фенилсульфонил)этоксикароонильяая (Nsc)группа могла бы быть интересной альтернативой Fmoc-фуппе в качестве временной Ма-защиты для твердофазного пептидного синтеза. 244-Нитрофенилсульфонил)этнл-карбанилат очень быстро расщепляется 2 экв. DBU в DMF, но в то же время заметно более стабилен в слабоосновных средах. Применение подобной

защитной группировки позволило бы преодолеть или, по меньшей мере, смягчить некоторые недостатки Ртос-группы, связанные с ее слишком высокой лабильностью. Более детальные исследования, проведенные на карбанилатах и модельных пептидах, выявили ряд различий между Ртос- и №с-группировками, многие из которых можно рассматривать как преимущества №с (Таблица 3). Весьма важным свойством №с-группы представляется ее повышенная устойчивость в растворе. При выдерживании Ртос-РЬе-ОН и №с-РЬе-ОН в ИМР в течение месяца при комнатной температуре методом ВЭЖХ обнаружено, что в растворе осталось меньше 40% Ртос-РЬе-ОН и образовалось большое количество полимерного осадка. В случае №с-Р11е-ОН около 90% защищенной аминокислоты осталось интакгаой, при этом раствор был прозрачным.

№с-Группа заметно медленнее, чем Ртос, расщепляется стандарным деблокирующим реагентом, применяемым в автоматических синтезаторах (пиперидинЛЭМР, 1:2). Мы разработали более эффективный реагент для отщепления №с-группы в твердофазном синтезе -1% 0ви/20% пиперидин/ЮМЕ Винилсульфон, образующийся при расщеплении №с-группы, быстро и необратимо реагирует с пиперидином, и единственным продуктом, который можно зафиксировать в среде методом ВЭЖХ, является М-[2-(4-нитрофенилсульфонил)этил]пи-перидин.

Таблица 3

Ртос №с

Скорость расщепления,

ПиперидишЮМР (1:2) 10-15 с 60-80 с

1%Ши/20%Пиперидин'1>МР < 5 с 12-15 с

Разложение защищенных аминокислот в

растворе ОМР, %

7 дней 10 0

20 дней 40 <2

Образование аддукта винил-амин (с пипери- Быстро, обратимо Очень быстро,

дином) необратимо

Образование полимерных осадков при Да Нет

выдерживании растворов защищенных

аминокислот в ВМР

^•юм Для ЦУ-мониториига удаления защитных 308-312 нм 345 нм

групп

При отщеплении №с-группы деблокирующий раствор окрашивается в светло-желтый цвет, что позволяет визуально контролировать ход синтеза и легко замечать сбои или "труднопроходимые" аминокислотные остатки. В УФ-спектре продукта отщепления №с-группы имеется плечо в районе 310-390 нм которое можно использовать для надежного

мониторинга деблокирования при автоматическом синтезе, поскольку растворители и реагенты, применяемые в синтезе, не поглощают в этой области (Рис. 3). - ~

А '

—СМРПиперидин [211) - Гтос "Мае

230 250 270 290 310 330 350 370 390 410 «30 450

X, ИМ

Рис 3, УФ-слектры реакционных смесей при деблокировании Гтсс-РЬе-ОН и Км-РИе-ОН 33% пиперидином в ОМ? в кювете 1 мм Исходные концентрации защищенных аминокислот 0,028 мол/л

В отличие от Ртос, №с является активируемой защитной группой. Ее восстановленная тиозфирная форма, 2-(4-нитро-фенилтио)этоксикарбонильная (№с), весьма устойчива как к водным щелочам, так и к безводным органическим основаниям. Активация №с-группы легко достигается окислением тиоэфира в сульфон (№с Ым) перекисью водорода в присутствии солей молибденовой или вольфрамовой кислота. Это открывает дополнительные возможности для синтетических манипуляций, например, при введении постоянных защитных групп в боковые радикалы трифукциональных аминокислот. Мы использовали эти возможности для эффективного синтеза №с-защишенных трифункциональных аминокислот.

3.1. Синтез 2-(4-нитрофенюгтюи2-(4-1ттрофенилсумронил)этихаор-формиитов

Для практического использования №с-защитной группы были разработаны препаративные методы получения исходных соединений и ацидирующих агентов хтя синтеза №с-аминокислот. Ключевыми соединения для этого являются 2-(4-нитрофенилтио):>танол и 2-(4-нитрофенилсульфонил)этанол. Для синтеза 2-(4-шпрофенилтио)этгнола были отработаны два варианта:

+ нзснгсн2он о2,

.м-^^-эсн^он

ЫаВН.

КОН

Оба варианта просты в исполнении в 1-2 мольном масштабе и могут быть использованы с равной эффективностью в зависимости от наличия того или иного сырья. 2-{4-Нит-

рофенилсульфокил)этилхлорформиат (№с-С1) и 2-(4-нитрофенилтио)этилхлорформиат (№с-С1) получали фосгенированием соответствующих спиртов.

"А

Моо.'лто;')

ьчс-а

? СОа2 /Г^ ^ У

о о

Кэс-С!

Хлорформиаты №с-С1 и №с-С1 представляют собой твердые кристаллические вещества, которые неограниченно долго могут храниться без доступа света и влаги.

3.2. Синтез №с-аминокисяот.

Синтезы №с-аминокислот осуществляли в условиях Шоттен-Баумана - ацилированием аминокислот N80-01 в водно-органических смесях, или в безводных условиях по методу Болина - путем ацилирования триметилсилильных производных аминокислот. Метод Болина давал более высокие выходы (70-90%) чистых №с-аминокислот, свободных от примесей олигопегггидов.

Для синтеза защищенных производных некоторых трифункционалъных аминокислот очевидные преимущества дало использование устойчивой к основаниям тиоэфирной формы Нзгзащитной группы (№с). Например, синтетический путь к М0-арилсульфонильным производным Ы0-№с-аргинина оказался на две стадии короче, чем для аналогичных К„-Ртос-производных. Поскольку сульфонилирование гуанидиновой группы аргинина проводится в щелочной среде (рН 12), в последнем случае в реакцию приходится вводить устойчивое к щелочам Нх-карбобензокси-производное. После этого карбобензокси-группу удаляют гидрированием и по методу Болина вводят Ы^-Ртос-защиту. Использование в реакции Ыо-суль-фонилирования Ма-№с-аргинина существенно упрощает синтез.

В настоящей работе осуществлен синтез полного набора №с-производных про-теогенных аминокислот, необходимых для твердофазного синтеза пептидов (Табл. 4).

Таблица 4

Сии тезированные №с-аминокислоты

Соединение

[«],, (с 1, ОМС)

т °с

' Н-П у

Я,(А)

Кг(Н)

Масса молгкулярног о иона (ТОГ), (М+11)*

Вычислено

11айдеио

Ыю-Оу-ОН - 104-105 0.40 0.21 333.30 333.4

ЬЧс-АЬ-О! I -25 6° 134-136 0.53 0.35 347.32 347.4

1 -120° 72-74 0.62 0.50 375.38 375.4

N80-116-011 -13.0° 120-121 0.62 0.52 389.41 389.6

№с-1хи-0П -33.0^ 160-162 0.68 0.42 389.41 389.7

Мм>5ег(1Ви)-ОН +3,3° 109-111 0.68 0.46 419.43 4189

Ы$с-Пи<1Ви)-ОН -9.0° 64-66 0.68 0.50 433.46 433.2

Ы$с-Ме1-ОИ -28.7° 88-90 0.65 0.37 407.47 406.9

№с-РЬе-ОН -23.0" 160-163 0.66 0.40 423.42 423.3

Ызс-Аап-ОН -1.3° 205-207 0.05 0.05 390.35 390 2

-9.7° 192-194 0.10 0.03 404.38 404.3

Кзс-А5р(01Ви)-011 -12.7" 72-75 0.64 0.38 447.44 447,2

Ы5С-<51и(0|Ви)-011 -17.0° 94-96 0.67 0.38 461.47 461.4

Ыяс-1_у5(Вос)-ОН -П.8° 110-112 0.62 0.35 504.54 505 9

№с-Туг(|Ви)-ОН -6.3° 82-84 0.68 0.44 495.53 495 2

КЧс-Тф-ОН -14.7° 188-190 0.53 0.33 462.46 461.7

^5С-Су^(Тг1)-(111 +22.3° 108-110 0 75 0.52 621.71 619,3

^ 5.0° 112-1)5 0.42 0.1 655.71 656 8

-4.0° 115-120 0.25 0.05 615.68 614 4

№с-А8п(Хап)-ОН 198-200 0.43 0.25 570.56 568,8

№с-01п(Хап)-0Н -13.7° 155-158 0.58 0.23 584.58 582.9

№с-Суя(А01П)-ОН -31.0° 124-126 0.17 0.05 450.47 451.2

Кьс-Рю-ОН -31,5° 115-117 0 53 0.37 371.35 371.3

Значение К^ приведены для ТСХ на К'к-.ч^уь! А1иЫй;п 60р2}1 в системах растворителей: А - СНОз/МсОН/АсОН (95 5:1), Е -беншл/ацетон/АсОН (100,50:3)

3.3. Твердофазный синтез пептидов с использованием Nsc-aMUHOmaom.

Несмотря на различие ряда характеристик Nsc- и Fmoc-группировок, отмеченное выше, между ними имеется фундаментальное сходство, основанное на одинаковом механизме расщепления. Это дало возможность при разработке Nsc-технологии твердофазного синтеза пептидов использовать практически весь богатейший тактический и методический арсенал, созданный в процессе многолетнего развитая Fmoc-технологии - полимерные носители, якорные группы, конденсирующие агенты, боковые защитные группы.

Синтез большинства пептидов проводили в ручном синтезаторе, изготовленном из полипропиленового шприца, снабженного полипропиленовым фильтром и иглой большого диаметра, используя представленный ниже синтетический протокол.

1. Промывание: 20% пиперидин/1% DBU/DMF, 0.5 мин.

2. Деблокирование: 20% пиперидин/1% DBU/DMF, 3 х 1.5 мин.

3. Промывание: DMF, 6x1 мин.

4. Ацилирование: Na-Nsc-аминокислота, 3 экв; ТСРР, 3 экв; HOBt,

6 экв.; N-этилморфолин, 8 экв; DMF, 60 мин.

5. Промывание: DMF, 5x1 мин.

Отработанные растворы желтого цвета собирали для визуального или спектро-фотометрического контроля процесса деблокирования. Для наращивания пептидной цепи использовали в качестве конденсирующих агентов гексафторфосфат бензотрназолилокси-1-трис-(диметиламино)фосфокия (ВОР-реагент Кастро) или перхлорат трис-(диметиламино)-хлорфосфония (ТСРР) с HOBt, введенный в практику твердофазного синтеза нами, ацили-ровали пептиднл-полимер пентафторфениловыми эфирами №с-аминокислот. Ашишруюшие агенты использовались в 2-5-кратном мольном избытке, время конденсашш составляло 60-90 мин в зависимости от структуры растущей полипептидной цепи. В большинстве случаев растворителем служил DMF, иногда реакции проводили в N.N-диметилацетамиде, N-метиллирролидоне или DMSO. После сборки полипептидных цепей отщепление от носителя и полное деблокирование пептидов проводили известными деблокирующими реагентами на основе TFA, для очистки применяли стандартные хроматографические методы.

В настоящее время твердофазный синтез пептидов, как правило, осуществляют на автоматических пептидных синтезаторах. Весьма интересно было выяснить, можно ли использовать Nsc-аминокислоты на стандартном оборудовании для твердофазного пептидного синтеза, а также сравнить Nsc- и Vmoc-заишты в реальных условиях рутинного

синтеза. Сравнительные эксперименты проводили на автоматическом пептидном синтезаторе МШшеп-9050+ РерБумЬез^гег. с применением рекомендуемых фирмой-изготовителем синтетических протоколов, растворителей и носителей, за исключением деблокирующего раствора (20% пиперидин в ОМР), в состав которого ввели 1% ОВи. Синтезы пептидов осуществляли в идентичных условиях, используя 4-кратные избытки Итос- и №с-амино-кислот с боковыми защитами трет-бутильного типа, в качестве конденсирующего агента -ВОР-реагент Кастро. Первым модельным пептидом был фрагмент интерферона а2 (130-137) YLK.EKK.YS. После сборки аминокислотной последовательности и удаления защитных групп реакционные смеси анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Профили элюции пептидов, синтезированных с использованием Ртос- и Ывс-аминокислот, практически идентичны.

А» Ая|

Рис 4 Г;рофп.1п ВЭЖХ реакционных смесей после синтеза и деблокирования пептида (130-137),

слева - Ртос-синтея, справа - Мэс-синтез.

В качестве другого тест-пептида мы выбрали фрагмент АСР (65-74). Этот декапептид известен в литературе, как имеющий трудную для синтеза последовательность. Анализ ВЭЖХ реакционных смесей, полученных после снятия пептидов с полимерной подложки и удаления боковых защитных групп, показал, что продукт №с-синтеза выглядит заметно хуже, чем продукт Ртос-синтеза. Кроме Ы^-зашит, единственным различием этих синтезов было использование А5п(Тп) и 01п(Тп) в синтезе с Ртос-зашитой и А5п(Хап) к 0!п(Хап) з №с-синтезе. Мы осуществили синтез новых защищенных производных аспарагина и гдутамина - №с-А5п(Тп)-ОН и №с-01п(Тгс)-0Н, и провели повторный N50-синтез АСР (6574) с использованием этих соединений.

Ав$

аба

Tim* Tbrm Time

Рис 5. Профили ВЭЖХ реакционных смесей после синтеза и деблокирования пептида АСР (65-74); а - Fmoc-сикгез с Тп-зашитон Asn н Gin; 6 - Nsc-синтез с Хап-защитой Asn и Gin, а - Nse-синтта с Tit-защятой Asn и Gin.

В результате качество полученного продукта существенно улучшилось (рис 5в) и не уступало качеству продукта Fmoc-синтеза. Вероятно, объемный тритильный радикал препятствует образованию (3-складок, улучшая доступ реагентов к аминогруппе растущей полипептидной цепи. По-видимому, тритильная защита для амидных групп аспарагина и глутамина является лучшим выбором по сравнению с ксантенильной.

Таким образом, Nsc-аминокислоты можно эффективно использовать в твердофазном пептидном синтезе. В процессе разработки Nsc/tBu-технологии синтезировано более ста пептидов различного аминокислотного состава длиной до 32 остатков. Можно утверждать, что Nsc-защита по своим эксплуатационным характеристикам, по меньшей мере, не уступает Fmoc. Кроме того, в автоматическом синтезе на серийном оборудовании Nsc-аминокиелоты могут применяться почти без изменения стандартных протоколов, разработанных для Fmoc-аминокислот.

Выводы

1. Синтезирован ряд 2-арил(алкил)сульфонилэтил-карбанилатов и впервые показано, что эти соединения расщепляются сильными органическими основаниями в апротонных растворителях по механизму р-элиминирования.

2. Измерены скорости расщепления 2-арил(алкил)сульфонилэт1ш-1сарбанилатов сильными органическими основаниями в диметилформамиде и показано, что путем изменения структуры заместителя при сульфонильной группе можно изменять скорость расщепления в пределах трех порядков величины. Показано, что константы скорости второ-

го порядка реакции расщепления замещенных 2-арил- и 2-бензилсульфонилэтап-карб-анилатов подчиняются уравнению Гаммета. Определены реакционные параметры р для фенильной и бензильной серий. Получены доказательства в пользу механизма Р-элиминирования Е1сВ.

3. На основании кинетических данных и данных о стабильности 2-арил(алкил)сульфо-нилэтил-карбанилатов в модельных условиях пептидного синтеза предложены новые Ма-зашитные группы - 2-(4-хлорфенилсульфонил)этоксикарбонильная (Срэ) для синтеза пептидов в растворе и 2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонильная (Ым) для твердофазного синтеза.

4. Разработаны методы полугения ацилирующих агентов для введения Срэ- и №с-зашит в аминокислоты. Получен ряд Ма-Ср5-аминокислот для синтеза пептидов в растворе и полный набор Ма-№с-аминокислот для твердофазного пептидного синтеза.

5. С использованием Ыа-Срмашитной группы, отщепляемой 2 зкв. 1,8-диазабишкло-[5,4,0]ундецена-7, и новой хромогенной 4-{4-фенилазо)бензилоксибензильной (АЬг) карбокси-защитной группы синтезированы Ьеи-эикефалин и его [2>А1а:]аналог.

6. Разработан реагент для эффективного отщепления №с-зашиты - 20% пиперидин/1% ОВШЭМР С использованием новой На-№с-защитной группы шпрнцевым и автоматическим методами твердофазного синтеза синтезировано свыше 100 пептидов длиной от 5 до 32 аминокислотных остатков.

7. Показано, что №с-аминокислоты могут применяться при работе на автоматических синтезаторах почти без изменения протоколов, разработанных для Итос-аминокислот.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1.Сабиров А.Н.. Самуков ВВ. Удаляемая основаниями 2-(4-хлорфенклсульфонил)эток-сикарбонильная (Ср5) группа для защиты аминоф\-нкиий в пептидном синтезе.// V Всес. конф. по мет. получ. и анал. биохим. препар.: Сборник тезисов.-Рига,-1987.-С. 302.

2.Сабиров А.Н., Офицеров В.И., Швалье А.Ф., Самуков В.В. 2-(4-хлорфенил)сульфо-нилэтоксикарбонильная (Ср$-) аминозаиштная группа для синтеза пептидов в растворе. Синтез [1_еи]энкефалина и его [Т>-А1а2]аналога.// Биоорган, химия.-1987,- Т. 13. - N0. 6-С. 754-759.

3.Самуков В.В., Сабиров А.Н., Трошков М Л. Исследование некоторых 2-алкил- и2-арил-сульфонилэтоксикарбонильных аминозащитных групп для пептидного синтеза.// Ж. общ. химии. - 1988,- Т. 58,- Вып. 6,- С. 1432-1439.

4.Samukov V.V., Sabirov A.N., Pozdnyakov P.I. 2-{4-Nitrophenyl)su]fonylethoxycarbonyl (Nsc) group as a base-labile a-amino protection for solid phase peptide synthesis. // Tetrahedron Lett.-1994. - v. 35. - No. 42. - P. 7821-7824.

5.Sabirov A.N., Samukov V.V. A continuous flow solid phase synthesis of protected peptide fragments with recycling trityl-type support. // Peptides: Chemistry, Structure & Biology. Proceedings of 14th APS (P.T.P. Kaumaya and R.S. Hodges, Eds.) Mayflower Scientific Ltd.-1995.-P. 117-118.

6.Samukov V.V., Sabirov A.N. Tris(dimethy!amino)chlorophosphonium Perchlorate (TCPP) as a coupling agent in solid phase peptide synthesis. // XIV APS Abstracts, Columbus, Ohio, USA, -1995.-P. 2-52.

7.Самуков В В., Сабиров A.H., Поздняков П.И. 2-(4-Нитрофенил)сульфонилэтоксикарбо-нил-аминокислоты. // Патентная заявка РФ 95102102 от 15.02.1995; положительное решение от 24.01.1996.

8.Samukov V.V., Sabirov A.N., Pozdnyakov P.I. 2-{4-Nitrophenyl)sulfonylethoxycarbonyl amino acids. // Заявка PCT WO 96/25394, IPC C07C 317/18, СОЖ 1/06,22.08.1996.