Роль углеводов в функционировании и структурной организации ангиотензин-превращающего фермента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В.Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

УДК: 577.152.3 ОРТ ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

РОЛЬ УГЛЕВОДОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ И СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности химическая кинетика и катализ

(02. 00. 15)

Научный руководитель: к.х.н., с.н.с. Кост О. А.

Москва -1998

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АИФ - ангиотензин-превращающий фермент (дипептидилкарбоксипептидаза, К.Ф. 3.4.15.1).

д-АПФ - дегликозилированный ангиотензин-превращающий фермент. а-АПФ - десиалированный ангиотензин-превращающий фермент. д-ГЧ-домен - дегликозилированная однодоменная форма ангиотензин-превращающего фермента. PNGase F - дегликозидаза F (К.Ф. 3.5.1.52).

АОТ - натриевая соль ди-(2-этил)гексилового эфира сульфоянтарной кислоты (аэрозоль ОТ).

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота. ДСН - додецилсульфат натрия. Tris - трисоксиметиламинометан.

HEPES - Гч1-2-гидрокси-этилпиперазин-]Ч[-2-этансульфокислота. PMSF - фенилметилсульфонилфторид.

FA-Phe-Gly-Gly - фурилакрилоил-Ь-фенилаланил-Ь-глицил-глицин. Hip-His-Leu - гиппурил-Ь-гистидил-L-лейцин.

Cbz-Phe-His-Leu - карбобензокси-Ь-фенилаланил-Ь-гистидил-Ь-лейцин. FA-Phe-Phe-Arg - фурилакрилоил-Ь-фенилаланил-Ь-фенилаланил-Ь-аргинин.

FA-Phe-Ala-Arg - фурилакрилоил-Ь-фенилаланил-Ь-аланил- L-аргинин. ПАА-углевод - гликонъюгаты на основе полиакриламидной матрицы. FITC-SiaLac - сиалиллактоза, меченная флуоресцеином. W0 - [Н20]/[А0Т], степень гидратации обращенных мицелл.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

стр. 5

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7

Глава 1. УГЛЕВОДНАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ

ГЛИКОПРОТЕИНОВ И ЕЕ ФУНКЦИИ. 7

1.1. Биосинтез 1Ч-гликопротеинов. 9

1.2. Регуляция процесса гликозилирования. 11

1.3. Функции олигосахаридов. 15

1.3.1. Модуляция активности и физико-химических

свойств ферментов-гликопротеинов. 18

1.3.2. Олигосахариды как детерминанты узнавания

в различных биологических процессах. 22

Глава 2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С УЧАСТИЕМ УГЛЕВОДОВ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЕ УЗНАВАНИЕ. 24

2.1. Белок-углеводные взаимодействия. 25

2.1.1. Молекулярные основы лектин-углеводного узнавания. 26

2.1.2. Протяженные центры лектинов и мультивалентное связывание. 30

2.1.3. Бифункциональные свойства лектинов. 31

2.2. Углевод-углеводные взаимодействия. 32

Глава 3. АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ. 35

3.1. Функции фермента в организме. 36

3.2. Мембранная организация ангиотензин-превращающего фермента. 38

3.3. Модель активного центра ангиотензин-превращающего фермента. 40

3.4.

Состав и функции углеводной составляющей ангиотензин-превращающего фермента. 43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 51

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 51

4.1. Материалы. 51

4.2. Методы исследования. 54

4.2.1. Получение ангиотензин-превращающего фермента. 54

4.2.2. Модификация ангиотензин-превращающего фермента. 58

4.2.3. Кинетические измерения. 62

4.2.4. Спектральные измерения. 68

4.2.5. Детекция олигомерного состояния АПФ. 68

4.2.6. Изучение связывания углеводов с АПФ в водных условиях. 69

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 72

Глава 5. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОТЕНЗИН-

ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА. 72

5.1. Гомогенность и молекулярная масса. 72

5.2. Углеводный состав. 76

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НА СВОЙСТВА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО

ФЕРМЕНТА. 79

6.1. Дегликозилирование ангиотензин-превращающего фермента. 79

6.2. Влияние дегликозилирования на стабильность ангиотензин-превращающего фермента. 84

6.3. Влияние дегликозилирования на каталитические свойства

ангиотензин-превращающего фермента. 87

6.4. Влияние десиалирования на каталитические свойства ангиотензин-превращающего фермента. 92

6.5. Влияние дегликозилирования на каталитические свойства N-домена ангиотензин-превращающего фермента. 95

Глава 7. АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ В

ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛАХ ТРОЙНОЙ СИСТЕМЫ АОТ-ВОДА-ОКТАН. 99

7.1. Надмолекулярная структура ангиотензин-превращающего фермента в системе обращенных мицелл. 101

7.2. Особенности функционирования ангиотензин-превращающего фермента в системе обращенных мицелл. 109

7.2.1. Кинетические свойства мономера и димера ангиотензин-превращающего фермента. 109

7.2.2. Влияние эффекторов (анионов хлора и катионов цинка) на активность ангиотензин-превращающего фермента. 112

7.3. Мембранотропность ангиотензин-превращающего фермента. 121

7.3.1. Зависимость активности ангиотензин-превращающего фермента от концентрации АОТ при постоянной степени гидратации. 122

7.3.2. Свойства ангиотензин-превращающего фермента, модифицированного остатками стеариновой кислоты. 125

7.4. Роль углеводных цепей ангиотензин-превращающего ферментав димеризации фермента в обращенных мицеллах. 127

Глава 8. ВЛИЯНИЕ УГЛЕВОДОВ НА ДИМЕРИЗАЦИЮ

АНГИОТЕЗИН-ПРЕВРАЩАЮГЦЕГО ФЕРМЕНТА. 130

8.1. Специфическое влияние углеводов на димеризацию

ангиотензин-превращающего фермента 130

8.2. Попытка обнаружения взаимодействия фермент-углевод

в водной среде. 148

ВЫВОДЫ 154

ЛИТЕРАТУРА 155

ВВЕДЕНИЕ.

Изучение ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) интересно не только с практической, но и с фундаментальной точек зрения. Участие фермента в регуляции кровяного давления и различных сердечно-сосудистых патологиях определяет интерес к этому ферменту со стороны медиков [1 - 3], а необычное, скорее резко индивидуальное, сочетание различных свойств, таких как ион металла в активном центре, высокое содержание углеводов, двухдоменная структура с двумя активными центрами, активация анионами, и ряд других свойств, делает АПФ сложным, однако очень интересным и перспективным объектом исследования для биохимиков [3,4].

Сравнительно недавно показано, что гликозилирование играет существенную роль в физико-химических и биологических свойствах гликопротеинов, в том числе и гликопротеинов-ферментов [5, 6]. АПФ из любой ткани сильно гликозилирован, причем состав и содержание углеводов зависят от источника получения фермента [7 - 9]. В одном организме может существовать целый набор форм АПФ, различающийся по степени и характеру гликозилирования (углеводная гетерогенность). Каким образом гликановая компонента может влиять на функционирование фермента, до сих пор неизвестно. Кроме того, АПФ функционирует в организме как в растворимом (плазма, спинномозговая жидкость), так и мембраносвязанном состоянии (например, эндотелиальные клетки легких и сосудов и эпителиальные клетки почек ), то есть в абсолютно разных условиях [4]. Одним из «тонких» мест в биохимии ангиотензин-превращающего фермента является то, что его физико-химические и кинетические свойства изучались в водных условиях, в то время как свойства фермента в мембранном окружении могут существенно отличаться от проявляемых им свойств в водной гомогенной среде.

Таким образом, целью настоящей работы явилось исследование роли углеводной составляющей в функционировании АПФ в водных условиях и в условиях, моделирующих мембранное окружение фермента

с использованием хорошо изученной системы обращенных мицелл АОТ-вода-октан.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1.

УГЛЕВОДНАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ГЛИКОПРОТЕИНОВ И ЕЕ

ФУНКЦИИ.

Многие белки животного происхождения содержат ковалентно связанные углеводы, например, известно, что 91,7% всех мембранных протеинов человека гликозилированы [10]. И хотя о существовании в природе гликопротеинов стало известно еще во второй половине XIX века (открытие первого гликопротеина осуществил Клод Бернард), роль углеводной составляющей в организации и функционировании гликопротеинов долгое время игнорировалась, вероятно, в силу трудностей в изучении структуры олигосахаридных цепей. Секвенирование олигосахаридов выявило сложность, а главное, необычайную гетерогенность гликанов в гликопротеинах. Можно назвать две основные причины такой гетерогенности: химическую и биологическую. Химическая обусловлена полифункциональностью углеводных остатков. Так, например, если мы будем составлять дисахариды из М-ацетилглюкозы и маннозы, то обнаружим наличие четырех потенциальных гидроксильных групп на маннозном остатке для связывания с 1Ч-ацетшш1юкозамином, который, в свою очередь, может образовать две аномерные связи (а и Р), да вдобавок существовать как в фуранозной, так и в пиранозной форме, - итого 16 различных структур. Естественно, удлинение олигосахаридной цепи приводит к возрастанию возможных вариаций структуры гликанов при постоянстве состава. Кроме того, структурное разнообразие олигосахаридов может возникать из-за ковалентного присоединения к углеводным остаткам различных модифицирующих групп, таких как сульфатные, фосфатные, метальные и ацетильные группы [11].

Биологическая гетерогенность происходит из-за того, что в то время как полипептидная часть гликопротеина представляет собой первичный продукт гена, гликановая - вторичный, зависимый от типа и

физиологического состояния клетки. В результате этого при гликозилировании полипептида обычно генерируется набор гликоформ, которые идентичны по пептидному составу, но различаются по структуре и/или расположению углеводных цепей. Такие гликоформы, как правило, отличаются друг от друга по физическим и биохимическим свойствам, что, в свою очередь, может влиять на биологические свойства гликопротеинов и приводить к функциональной гетерогенности. Способность варьировать углеводный состав, а также количество и расположение сайтов гликозилирования считается одним из механизмов клетки, благодаря которым может создаваться огромное разнообразие функциональных веществ, необходимых в процессе роста и эволюции организма [5].

Известны два основных способа ковалентного присоединения олигосахаридов к белкам, в соответствии с которыми все гликопротеины принято делить на О- и N-гликопротеины [5]. В О-гликопротеинах углеводный компонент присоединяется О-гликозидной связью к оксигруппе остатка серина или треонина, причем "узловое" положение всегда занимает остаток 1М-ацетилгалактозамина [5]:

СН20Н

хс/

а)

Н

О—СН2—СН

Ш

В ЬГ-гликопротеинах углеводный компонент присоединяется ]М-гликозидной связью к амидному азоту остатка аспарагина. В этом

случае первым моносахаридным звеном всегда оказывается N-ацетилглюкозамин [5]:

В данном обзоре в основном будут рассмотрены структура и функции N-гликопротеинов, так как исследованный в работе соматический ангиотензин-превращающий фермент относится именно к N-гликопротеинам [7-9].

1.1. Биосинтез N-гликопротеинов.

Главными структурами клетки, участвующими в процессах гликозилирования, являются эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи [12]. Процесс биосинтеза N-гликопротеинов начинается со сборки сложного олигосахарида, имеющего общую структурную формулу Glc3Man9GlcNAc2, на пирофосфорил-долихоловом остове. Этот олигосахарид затем переносится целиком к соответствующим Asn-остаткам акцепторных апогликопротеинов в ходе их синтеза на мембраносвязанных полирибосомах, причем гликозилируются только остатки Asn, включенные в последовательность Asn-Xaa-Ser(Thr), где Хаа любая аминокислота кроме Pro [5]. Далее присоединенный олигосахарид подвергается более или менее сложному процессингу. Сначала под действием различных ферментов процессинга олигосахарид подвергается частичной деградации, при которой от первоначальной структуры практически остается только пентасахарид Man3GlcNAc2, названный триманнозным ядром (кором) и представляющий собой неизменную часть всех известных N-гликанов (Рис. 1). Далее под действием индивидуальных гликозилтрансфераз происходит включение отдельных моносахаридных звеньев, в результате производятся

СНз

Мапа! — 2МапаЬ

' 5Мапа1

Мапа1—-2Мапа1-

(Мапа!—-2)0,Ж1ап аГ

^Мап р1— ¿юШАср 1—ДОШАс —Азп

(IV)

(81аа2—-ЗОа1р1— 40ШАср1)

+01сМАср1

ТБиса!

апа , 4

6 Мап р! —401сНАср1— 4С1сЫАс-

511

апа1

•Авп

(V)

Мапа1-Мапа1'

(81аа2—ЗОа1р1 —4СШАср1)

+С1сМАср1

Г

+Риса1

1-2

Мапа 4 6

^Мапр1—* 40ШАс р1—- 4С1сМАс-

Мапа!"^

-Аэп

Рис. 1. Примеры структур олигосахаридов высокоманнозного (III), комплексного (IV) и гибридного (V) типа [5]. «Триманнозный кор», общая часть всех И-олигосахаридов, обведен рамкой.

"внешние" гликановые цепи, дополняющие триманнозный кор. В соответствии со структурой последних N-олигосахариды делятся на три подкласса - олигосахариды высокоманнозного, комплексного и гибридного типов (Рис. 1).

Среди трех подклассов углеводные цепи комплексного типа являются структурно наиболее вариабельными [5,11] из-за возможности присоединения разными способами от одной до пяти внешних цепей к триманнозному кору, в результате чего образуется moho-, би-, три-, тетра- и пента-антенные структуры, а также из-за большого структурного разнообразия внешних цепей (Рис. 2).

1.2. Регуляция процесса гликозилирования.

Гликозилирование гликопротеинов - это сложный процесс, в регуляции которого участвуют многие факторы. Гликозилирование считают как полипептид-, так и ткане- или клеточноспецифичным процессом [5]. То есть конечная структура олигосахаридов, а также расположение и количество сайтов гликозилирования определяется, во-первых, конформацией полипептидной цепи в целом и локальной конформацией участка белка, близлежащего к сайту гликозилирования (полипептидспецифичный процесс), а во-вторых, уровнем экспрессии различных гликозилтрансфераз, который зависит от типа и физиологического состояния клетки (тканеспецифичный процесс). Полипептид-специфическое гликозилирование. Тот факт, что часто только треть всех потенциальных сайтов в гликопротеинах действительно гликозилирована [И], свидетельствует о способности третичной структуры белковой части стерически ограничивать доступность потенциальных сайтов для действия модифицирующих ферментов. Считают, что сильно разветвленные углеводные цепи, которые подверглись сложному процессингу, могут указывать на отсутствие сильного взаимодействия между углеводной и полипептидной частью [13]. Например, углеводные цепи в Fc-фрагменте иммуноглобулина G, которые сильно взаимодействуют с полипептидной

(VI) ManaK^Man p1__4GlcNAcp1__4GlcNAc__Asn

R—>3(4)GlcNAc(3Mana

R—"3(4)GlcNAcR 1 " ManaK^,- , XTA , (УП) И «Manpl—*4GlcNAcpl—>4GlcNAc^Asn

R—3(4)GlcNAcp 1— María

R—-3(4)G1CNACR 1—ManaK. „ 1 , ,

p 6ManRl—-4GlcNAcBl—-4GlcNAc—-Asn

(VID) R-3(4)GlcNAcPl^4ManaK3 P

R—3(4) GlcNAcp l-^ 2

R^3(4)GlcNAcpl^6

R— 3(4)GlcNAcpl^2 ( j R—-3(4) GlcNAcp l— Mana i

Manáis

r—-3(4)GlcNAcp 2 ^Manpl—-4GlcNAcpl—-4GlcNAc—-Asn

R—-3(4) GlcNAcp 1— g

R—3(4) GlcNAcp 2Maml^6ManRl—.4GlcNAcpl—4GlcNAc^Asn

(X) R '3(4) GlcNAcp K~4Mam R—-3(4)GlcNAcp Y^ 2

R—3(4)GlcNAcpl^6 R—-3(4)GlcNAcp 1— 4Manal

(XI) R—3(4)GlcNAcpl^2 ^Mannl—4GlcNAcpl—4GlcNAc^Asn R_3(4)GlcNAcp 4Manal/-3

R—3(4)GlcNAcpl^2

R = lGalpl

1 Gal p3 (6) —- S ia«2

lGalp2 —-Fue al

lGalp3 — Galal

lGaINAcpl-4S04"

lGalNAcpl—-Siaa2

(Fucal/Siaa2)lGalp3(6)—Siaa2

Рис. 2. Вариации в структуре, числе и локализации внешних цепей N-гликанов комплексного типа: (VI) - моноантенные, (VII) - биантенные, (VIII), (IX) - триантенные, (X) - тетраантенные, (XI) - пентаантенные структуры [5].

частью и как бы включены в пространственную структуру белка, подвержены менее сложному процессингу, чем углеводные цепочки в Fab-фрагменте, для которых взаимодействия с полипептидной частью не отмечены [13].

С другой стороны, специфические пептидные последовательности в белке могут «управлять» присоединением олигосахаридных последовательностей, характерных либо для единичного белка, либо для класса белков [11]. Один из наиболее известных примеров - включение маннозо-6-фосфата в высокоманнозные гликановые цепи лизосомальных ферментов. Перенос фосфата к маннозному остатку осуществляется ферментом, специфически распознающим специальную полипептидную детерминанту лизосомальных ферментов, которая не присутствует в структуре других гликопротеинов с высокоманнозными цепями [11].

Тканеспецифичное гликозилирование. Хорошо известно, что конечная структура и уровень экспрессии тех или иных гликановых цепей зависят от ткани, клетки, в которой они производятся [5]. Так, например, если рекомбинантный интерферон-ßl продуцировать в клетках яичников китайских хомячков, то N-гликаны будут иметь внешнюю цепь следующего строения: NeuAca2,3Galßl,4GlcNAc-R; однако, если производить такой гликопротеин в раковых клетках молочной железы, то гликопротеин будет состоять из двух гликоформ, одна из которых содержит углеводные цепи указанного выше строения, и другая - углеводные цепи Galal,3Galßl,4GlcNAc-R [11]. Олигосахариды вируса Sindbis варьируют (от высокоманнозных до сложных) в зависимости от типа клетки хозяина, в которой растет этот вирус [11].

Проиллюстрировать «нативную» видовую и органную специфичность углеводного состава гликопротеина удобно на примере N-гликановых цепей у-глутамилтранспептидазы [14]. Оказалось, что почечный фермент человека содержит в основном триантенные структуры, фермент мыши - биантенные, а фермент быка -

тетраантенные 1Ч-олигосахаридные цепи комплексного типа. Кроме того, у-глутамилтранспептидаза из одного организма (мыши), но из разных органов (почек и печени) содержит биантенные 14-олигосахариды со структурно различными внешними цепями. Данные по вариабельности структуры олигосахаридов для АПФ будут приведены ниже в главе 3.4.

Структура и уровень экспрессии гликановых структур може�