Роль хлорид-анионов в функционировании ангиотензин-превращающего фермента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
|
Моисеева, Наталья Анатольевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2006
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.15
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
МОИСЕЕВА НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА
РОЛЬ ХЛОРИД-АНИОНОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА
02.00.15-катализ 03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Щ-
МОСКВА-2006
Работа выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета им М.В. Ломоносова
Научный руководитель:
к.х.н., в.н.с. Кост О.А.
Официальные оппоненты:
д.х.н., профессор Байков А.А. к.х.н. Роганова Т.В.
Ведущая организация:
Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, РАМН
Защита состоится « 6 » июня 2006 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. МВ. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.
Автореферат разослан « 5 » мая 2006 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Кандидат химических наук
И.К. Сакодыяская
Л0£>6Й:
~тг
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, ЕС 3 4 15 1), широко распространенный в организме человека и животных, является ключевым ферментом регуляции сосудистого тонуса Огромный интерес к этому ферменту во всем мире связан с тем, что синтезированные ингибиторы АПФ оказались очень эффективными при терапии различных видов гипертонии, сердечно-сосудистой недостаточности и инфаркте миокарда.
АПФ является привлекательным объектом исследования, поскольку сочетает в себе ряд уникальных свойств, таких как наличие двух гомологичных каталитически активных доменов с различными свойствами в составе одной полипептидной цепи (по положению в полипептидной цепи эти домены принято называть 14- и С-доменами), существование в составе фермента углевод-связывающего центра, активация фермента анионами
В настоящее время остаются невыясненными вопросы о взаимодействии доменов в составе АПФ, о причинах существования отрицательной кооперативности активных центров фермента, о механизме активации АПФ анионами, о механизме шеддинга АПФ с клеточной мембраны и т.д.
Особый интерес вызывает активация АПФ анионами, прежде всего, хлорид-анионами. Активные центры, расположенные на разных доменах, обладают разным сродством к хлорид-анионам Кроме того, в зависимости от гидролизуемого субстрата профили активации фермента анионами сильно различаются. В тканях организма концентрация хлорид-анионов может быть различной, поэтому, в зависимости от локализации АПФ, в ферменте может предпочтительно "работать" тот или иной домен и, соответственно, может меняться эффективность гидролиза субстратов В 2003 году была расшифрована кристаллическая структура С-домена АПФ человека, продемонстрировавшая наличие двух центров связывания хлорид-анионов даже в однодоменной форме фермента Все эти данные ставят вопрос о выявлении роли хлорид-анионов и описании механизма их действия в реакциях, катализируемых АПФ.
Целью работы явилось комплексное исследование взаимодействия хлорид-анионов с однодоменными формами АПФ и двудоменным соматическим ферментом, что включает в себя изучение влияния хлорид-анионов на кинетику реакций, катализируемых различными формами АПФ, и структурное обоснование особенностей влияния хлорид-анионов иа различные формы фермента. В качестве объекта исследования был выбран фермент быка.
Научная новизна и практическая значимость. Разработана методика получения 14-домена АПФ, основанная на продемонстрированной ранее различной термостабильности 14-
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург
и С-домеиов АПФ и заключающаяся в селективной термоденатурации С-домена в составе соматического АПФ с последующим протеолизом денатурированного белка трипсином.
Кинетическое исследование влияния хлорид-анионов на активность однодоменных форм АПФ в реакциях гидролиза субстратов Cbz-Phe-His-Leu и Fa-Phe-GIy-GIy продемонстрировало наличие в молекулах обоих доменов двух центров связывания хлорид-анионов: один - отвечающий за связывание активирующего хлорид-аниона, второй -отвечающий за связывание ингибирующего аниона На основании полученных кинетических зависимостей предложена общая схема действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых однодоменными формами АПФ. Совпадение как констант активации, так и констант ингибирования однодоменных форм АПФ под действием хлорид-анионов при гидролизе субстратов различной структуры свидетельствует о правильности предложенной схемы Величина константы К,\, определяющей сродство активирующего хлорид-аниона к ферменту, для N-домена оказалась на два порядка ниже, чем для С-домена. Продемонстрированы различия в связывании ингибирующего хлорид-аниона с разными доменами АПФ: данный хлорид-анион имеет одинаковое сродство к свободному ферменту и фермент-субстратному комплексу в случае N-домена, но практически не связывается со свободным ферментом в случае С-домена.
Анализ кинетических данных по влиянию хлорид-анионов на активность соматического двудоменного АПФ в сравнении с данными, полученными для однодоменных форм фермента, выявил влияние доменов в составе соматического АПФ на каталитические свойства друг друга.
Сравнение аминокислотных последовательностей доменов АПФ быка и человека, а также моделирование пространственных структур N- и С-доменов АПФ быка на основе кристаллической структуры С-домена АПФ человека в качестве матрицы показали наличие двух потенциальных центров связывания хлорид-анионов в структурах обоих доменов АПФ быка. Сравнение кинетических данных с результатами компьютерного моделирования показало, что С12-связывающий центр в обоих доменах (ближний к иону цинка активного центра), по-видимому, отвечает за связывание активирующего хлорид-аниона, в то время как СП-связывающий центр (удаленный от иона цинка активного центра) может рассматриваться как центр, связывающий ингибирующий хлорид-анион.
Как кинетические данные, так и расчет энергии связывания хлорид-анионов в CI2-связывающих центрах, расположенных на N- и С-доменах фермента, показали лучшее связывание хлорид-анионов с N-доменом АПФ, в частности, за счет замены остатка Met в С-домене на Тгр в N-домене. Предложено структурное обоснование влияния субстрата на связывание хлорид-анионов с СП-связывающим центром. Так, доступность СИ-
связывающего центра для хлорид-аниона в свободном С-домене и его комплексе с субстратом различна, в то время как в N-домене доступность СИ-связывающего центра в свободном ферменте и фермент-субстратном комплексе одинакова.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS) (Lisbon, 2001), V Всероссийском симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2002), International Conference "Biocatalysis-2002: fundamentals & applications" (Moscow, 2002) и 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (FEBS) (Warsaw, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-2), экспериментальной части (Глава 3), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Глава 4-6), выводов и списка литературы. Работа изложена настраницах, содержит I ^таблиц и Vf рисунков. Список литературы включает^есылок.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.
1. ПОЛУЧЕНИЕ ТРЕХ ФОРМ АНПЮТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.
Соматическую двудоменную и тестикулярную (соответствующую С-домену соматической) формы АПФ (рис. 1), не содержащие трансмембранный якорь, получали экстракцией из легких и семенников быка, соответственно, с последующим осаждением фермента сульфатом аммония и аффинной хроматографией на лизиноприл-агарозе.
Для выделения формы, соответствующей N-домену АПФ (рис. 1), было использовано две методики. Одна, ранее разработанная в нашей лаборатории, заключается в частичной денатурации исходного соматического АПФ в растворе аммиака при рН 10,8 с последующим протеолизом фермента трипсином. Недостатком данной методики является наличие примеси соматического фермента в конечном продукте, что требует трудоемкого отделения этой примеси от N-домена. Вторая методика получения N-домена, разработанная в рамках данной работы, основывалась на продемонстрированной ранее различной термостабильности N- и С-доменов АПФ, что позволяет произвести селективную денатурацию С-домена в составе соматического фермента Нами были подобраны температура, рН и время термоденатурации. Оказалось, что одного часа при 55°С, рН 6,5 достаточно для практически полной денатурации С-домена в составе соматического АПФ, в то время как N-домен в этих условиях остается практически интактным Обработка полученного препарата АПФ
трипсином в соотношении АПФ.трипсин = 1:1 в течение 16 часов приводила к получению индивидуального N-домена фермента без примесей соматического АПФ.
N-домен
С-домвн
Рис. 1. Схематическое изображение различных форм ангиотензин-превра-щающего фермента, использованных в работе: а - растворимая соматическая форма, б - растворимая тестикулярная форма, в - Ы-домен.
а
HEMGH
HEMGH
б
С-доман
HEMGH
N-домен
в
HEMGH
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ХЛОРИД-АНИОНОВ НА КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ГИДРОЛИЗА ТРИПЕГГЩЦНЫХ СУБСТРАТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОДНОДОМЕННЫХ
Для изучения влияния хлорид-анионов на каталитические функции однодоменных форм АПФ мы выбрали два синтетических трипептидных субстрата Cbz-Phe-His-Leu и Fa-Phe-Gly-Gly.
Оказалось, что в случае N-домена с увеличением в среде концентрации хлорид-анионов наблюдаемые величины констант Михаэлиса гидролиза обоих субстратов уменьшались и затем, при высоких концентрациях KCl, принимали постоянные значения (рис. 2). Величины наблюдаемых каталитических констант гидролиза Cbz-Phc-His-Leu и Fa-Phe-Gly-Gly под действием N-домена увеличивались с ростом концентрации хлорид-анионов, а затем, с дальнейшим ростом концентрации соли, начинали уменьшаться (рис. 2). Максимальные значения каталитических констант наблюдались в обоих случаях в области 10-30 мМ KCl.
При гидролизе Cbz-Phe-His-Leu и Fa-Phe-Gly-Gly под действием С-домена наблюдаемые величины констант Михаэлиса уменьшались с увеличением в среде концентрации хлорид-анионов, причем уменьшение происходило во всей исследованной нами области концентраций KCl 0-700 мМ (рис. 3) Зависимости наблюдаемых каталитических констант гидролиза субстратов от концентрации KCl под действием С-домена имели разную форму Так, при гидролизе Cbz-Phc-His-Leu под действием С-домена, так же как и в случае N-домена, с ростом концентрации хлорид-анионов величина кат мвл сначала увеличивалась, а затем начинала уменьшаться (рис. 3). Однако, в отличие от N-
ФОРМ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.
домена, максимальное значение Лкат.иабл для С-домена достигалось лишь в области 200 мМ КС1 (рис. 3). При гидролизе Га-Р11е-С1у-01у под действием С-домена не наблюдалось уменьшения величины 6Л в области высоких концентраций КС1 (рис. 3).
2 £
| 0,4
100 200 300 400 [КС1], мМ
200 300 400 [КС1], мМ
600
Рис. 2. Зависимости кинетических параметров ЛГт>н,б„ (а, в) и £каТ,набл (6, г) гидролиза субстратов СЬг-РЬе-ЬКв-Ьеи (а, б) и Га-Р(1е-01у-01у (в, г) под действием Ы-домена АПФ быка от концентрации КС!. На вставках представлены начальные участки этих зависимостей Точками представлены экспериментальные данные, а линии соответствуют теоретическим зависимостям, построенным в соответствии с общей схемой, представленной на рисунке 4
Таким образом, можно заключить, что при относительно низких концентрациях хлорид-анионы являлись активаторами доменов АПФ быка, а при высоких концентрациях эти же анионы во всех случаях, кроме гидролиза Еа-РЬе-01у-01у под действием С-домена, становились ингибиторами активности фермента.
200 400
[К.С1], ММ
200 400
[КС1], мМ
200 400 600 [КС1], мМ
200 400 [КС1], мМ
Рис. 3. Зависимости кинетических параметров Кт^в» (а, в) и А^да®, (б, г) гидролиза субстратов СЬг-РЬе-Шв-Ьеи (а, б) и Ра-РЬс-01у-01у (в, г) под действием С-домена АПФ бьпса от концентрации КС1. На вставках представлены начальные участки этих зависимостей. Точками представлены экспериментальные данные, а линии соответствуют теоретическим зависимостям, построенным в соответствии с общей схемой, представленной на рисунке 4.
Для того, чтобы исключить возможность того, что ингибирование активности АПФ при высоких концентрациях К.С1 связано с действием ионной силы раствора, мы проверили влияние солей различного состава на активность >1- и С-доменов фермента. Оказалось, что замена катиона не влияла на активность одно доменных форм АПФ (табл. 1) Однако, природа аниона в растворах, имеющих одинаковую ионную силу, существенно влияла на определяемую активность К- и С-доменов фермента (табл. 1). Таким образом, ингибирование активности доменов АПФ анионами (как и активация) является специфическим воздействием, определяющимся природой аниона.
Таблица 1. Влияние солей различного состава на активность К- и С-доменов АПФ быка.
Ионная сила, мМ Соль Активность С-домена, %
150 150 мМК.С1 100
150 MMNaCl 100
600 мМ NaCl 88
600 600мМКС1 88
150 мМ КС1 + 450 мМ KN03 64
150 мМ КС1 + 150 мМ Na2S04 116
Ионная сила, мМ Соль Активность N-домена, %
49,5 49,5 мМ К.С1 100
49,5 мМ NaCl 100
270 мМ NaCl 81
270 270 мМ КС1 81
49,5 мМ КС1 + 220,5 мМ KN03 36
49,5 мМ КС1 + 73,5 мМ Na2S04 95,5
Итак, проведенный нами анализ полученных кинетических зависимостей активности АПФ от концентрации К.С1 показал, что на ферментативную активность однодоменных форм АПФ быка оказывает влияние связывание более чем одного хлорид-аннона, что согласуется с данными рентгеносгруктурного анализа, продемонстрировавшими наличие двух хлорид-анионов в структуре С-домена АПФ человека [Natesh R. et.al., Nature, 2003]. Можно полагать, что один центр в молекуле фермента отвечает за связывание активирующего хлорид-аниона, а второй - за связывание ингибирующего.
В этом случае кинетика гидролиза трипептидных субстратов под действием однодоменных форм АПФ в присутствии хлорид-анионов может быть описана схемой, представленной на рисунке 4 С учетом равновесного приближения скорость ферментативной реакции описывается уравнением-
| [СГ] | а[СГ] | ¿[СГ]2 , 7 аКл J3K, арКлК,
v [Ё\
[С1_ аК
Я-
1 +
Л Ki )
(1)
к.
~Д
+i
аКл Л РК,.
где К5, КА и К] являются константами диссоциации комплексов фермент-субстрат, фермент-хлорид-анион (активирующий), фермент-хлорид-анион (ингибирующнй), соответственно. Параметры аир характеризуют изменение сродства субстрата к ферменту при связывании с ферментом активирующего и ингибирующего хлорид-анионов, соответственно. Поскольку
было использовано равновесное приближение, те же параметры аир характеризуют изменение сродства хлорид-анионов к ферменту при связывании с ферментом субстрата
Константа кж - каталитическая константа распада тройного комплекса ECUS с образованием продуктов
реакции. Параметры у, со и 5 характеризуют каталитическую способность остальных потенциально реакционноспособных комплексов (ES, CliES, C1iEC1aS) по отношению к каталитической способности комплекса ECUS.
Предварительная обработка данных методами нелинейной регрессии показала, что при гидролизе Cbz-Phe-His-Leu и Fa-Phe-Gly-Gly под действием N-домена и при гидролизе Cbz-Phe-His-Leu под действием С-домена параметры у, т и 8 стремятся к нулю, т е. реакционной способностью комплексов ES, CliES и CliECUS можно пренебречь, приняв у=ю=5=0. В случае гидролиза Fa-Phe-Gly-Gly под действием С-домена можно пренебречь лишь параметрами у и га, приняв у=ю=0, в то время как 5=1, т.е. комплексы ECUS и CliECUS имеют одинаковую каталитическую активность. Для определения значений других параметров, входящих в общую схему (рис 4), мы отдельно рассматривали области низких и высоких концентраций KCl, при которых можно пренебречь ингибированием или, соответственно, активацией фермента.
В областях низких концентраций KCl, при которых ингибирующим действием анионов можно пренебречь, кинетическая схема действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых отдельными доменами АПФ, может быть упрощена (рис. S).
Рис. 4. Общая схема действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых однодоменными формами АПФ.
Рис. 5. Схема действия низких концентраций хлорид-анионов на активности N- и С-доменов АПФ.
0,05
[KCl]
500 1000 1500 1/[KC1], M1
В этом случае построение экспериментальных данных в двойных обратных координатах ([Е]/у - 1/[Э]) и ([Е]/у - 1/[КС1]) позволяет получить значение параметров и Л"А. На рисунке 6 в качестве примера приведены соответствующие графики,
полученные для >1-домена при гидролизе субстрата СЬг-РИе-Шз-Ьси. Дальнейшее преобразование графиков [Е]/у - 1/[в] в координатах ("отрезки, отсекаемые на оси ординат" - 1/[КС1]) и графиков [Е]/у - 1/[КС1] в координатах ("отрезки, отсекаемые на оси ординат" - 1/[8]) позволило вычислить остальные параметры активационной части схемы, а именно а и (табл. 2).
В областях высоких концентраций КС1, при которых произошло уже насыщение фермента активирующим анионом,
Рис. 6 Зависимости скорости гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием N-домена АПФ в области низких концентраций KCl от концентрации субстрата (а) и от концентрации KCl (б), представленные в двойных можно пренебречь активирующим обратных координатах. действием и рассматривать лишь
ингибирующее действие хлорид-анионов. Нам удалось пренебречь активирующим действием хлорид-анионов в случае N-домена АПФ, при этом схема действия хлорид-анионов на активность фермента принимает вид, представленный на рисунке 7 В этом случае построение экспериментальных данных в координатах Диксона ([E]/v - [KCl]) позволяет определить константу ингибирования К\ и параметр ß, являющиеся характеристиками ингибирующего хлорид-аниона Для гидролиза обоих субстратов под действием N-домена в координатах Диксона получились серии прямых, пресекающихся на оси абсцисс, те параметр ß для N-домена равен 1 (рис 8, табл 2) В случае С-домена обработка данных в координатах Диксона не дала полезной информации,
ЕС1Л=
aKs
ßAT,
- СЬЕОд -CIjECIAS
поскольку в исследованной нами области fCj
концентраций KCl мы не достигли участка, где С-домен был насыщен активирующим анионом, и его действием можно пренебречь. Для расчета К\ и ß в данном случае воспользовались методом ECIaS;
нелинейной регрессии. Данные представлены в таблице 2.
Величины параметров АГа и К\ не должны
зависеть от природы гидролизуемого субстрата, Рис ? Схема действия высоких
поэтому совпадение значений этих параметров (табл концентраций хлорид-анионов на
™ т.. , активность N-домена АПФ.
2), полученных при гидролизе Cbz-Phe-His-Leu и
Fa-Phe-Gly-Gly под действием как N-, так и С-домена, свидетельствует о правильности предложенной нами схемы действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых
однодоменными формами АПФ. На основе общей схемы (рис. 4) и всех полученных значений параметров (Ks, К\, Ki, а, ß, £мт) мы построили теоретические кривые, представленные на рисунках 2 и 3, которые хорошо описывали экспериментальные данные во всем выбранном интервале концентраций KCl.
Величина константы активации АПФ под действием хлорид-анионов АГд, полученная для N-домена, оказалась на 2 порядка ниже, чем величина А"л, полученная для С-домена. Эти данные хорошо соотносятся с литературными сведениями о том, что для проявления максимальной актив-
°'5 ности С-домену требуется большая
[KCl], М
Рис. 8. Зависимости скорости гидролиза Cbz-Phe- концентрация хлорид-анионов.
His-Leu (а) и Fa-Phe-Gly-Gly (б) под действием N- Величины а в обоих случаях меньше домена АПФ от концентрации KCl, представленные
в координатах Диксона. Ь 410 говорит об усилении
связывания субстрата с ферментом в присутствии активирующего хлорид-аниона. Величины константы ингибирования АПФ под действием хлорид-анионов Ки полученные для Ы- и С-доменов, так же как и различны. Если для N-домена величина К\ составляла около 1 М, то для С-домена величина этого параметра превысила 10 М и не могла бьпь точно определена (табл. 2). В тоже время параметры р/и, характеризующие связывание ингибирующего хлорид-аниона с фермент-субстратным комплексом, для Ы- и С-доменов близки по значениям (табл 2) Отметим, что для 1<-домена величины и К\ совпадают, а для С-домена Это говорит о том, что в случае Ы-домена ингибирующий хлорид-
анион имеет одинаковое сродство к свободному ферменту и фермент-субстратному комплексу, в то время как в случае С-домена данный анион практически не связывается со свободным ферментом, но связывается с фермент-субстратным комплексом Эта разница при связывании со свободным ферментом и фермент-субстратным комплексом отразилась в том, что в области высоких концентраций КС1 величина Ктл&л У И-домена принимает постоянное значение, а у С-домена этот параметр продолжает уменьшаться (рис. 2, 3).
Таблица 2 Кинетические параметры реакции гидролиза СЬг-РЬе-Шя-Ьеи и Ра-РЬе-01у-СНу под действием № и С-доменов АПФ в присутствии хлорид-анионов.
1У-домен С-домен
СЬг-РЬе-Шв-Ьеи Ра-РЬе-01у-01у СЬг-РЬе-Шв-Ьеи Ра-РЬе-01у-01у
мМ 4,5 ± 2,5 4 ±1,5 0,44 ±0,08 1,2 ±0,2
Ад, мМ 2,5 ±1,5 4± 2 250 ±150 300 ±150
а 0,027 ±0,017 0,25 ±0,1 0,065 ±0,035 0,16 ±0,06
А,,М 1,1 ± 0,3 0,8 ±0,2 £10 ¿10
Р-АГ,, М 2,4 ± 1 2,4 ± 1
кци» с 138 ± 8 364± 16 22 ±2 345 ± 20
У «1 «1 «1 «1
5 «1 «1 «1 1
(0 «1 «1 «1 «1
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ХЛОРИД-АНИОНОВ НА КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТА СВг-РНЕ-НВ-ЬЕи ПОД ДЕЙСТВИЕМ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.
Мы попытались применить данные, полученные для однодоменных форм фермента, для описания действия хлорид-анионов на активность соматического двудоменного АПФ в реакции гидролиза СЬг-РЬе-Шз-Ьси.
Рассмотренная нами кинетическая схема действия хлорид-анионов на активность соматического фермента включала возможное связывание четырех хлорид-анионов с молекулой АПФ и учитывала
взаимозависимый характер
функционирования С- и N-доменов в составе соматического АПФ при гидролизе трипептвдного
субстрата. Реализация этого механизма означает, что в двудоменном соматическом АПФ в каждый момент времени "работает" только один из двух активных центров фермента, то есть связывание и каталитический гидролиз субстрата на одном центре АПФ делают невозможным связывание и каталитический гидролиз субстрата на втором центре [Binevski P.V. et.al., FEBS Lett., 2003.]. Полученная в итоге схема действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых
соматическим АПФ (ECEN), оказалась достаточно громоздкой, поэтому здесь мы ее не приводим В схему входят 48 различных ферментативных комплексов, 8 из которых являются
0,5 0,4 0,3
Г 0,2 0,1
0,0
0,4 а ; \ w 1 0,2 ^ о,; о,о \ ' ----f
10 20 30 40 50 [KCl], мМ
\ * -4-i-i-- v___ з
200 400 [KCl], мМ
600
800
200 400 600 800 [KCl], мМ
Рис 9 Зависимости кинетических параметров Кт,иябл (а) и ¿к,т,набл (б) гидролиза субстрата Cbz-Phe-His-Leu под действием соматического АПФ от концентрации KCl. Пунктиром обозначены теоретические зависимости, рассчитанные с использованием параметров, полученных для однодоменных форм АПФ. Сплошные линии - теоретические зависимости с измененными кинетическими параметрами доменов.
реакционноспособными В число реакционноспособных входят четыре комплекса, где субстрат связан с комплексом К-домена с активирующим хлоридом (С1А): ЕсСЕмСЦБ); ЕсС1а(ЕмС1а8); С1[Ес(ЕмС1а8); С11ЕсС1л(ЕмС1л5), и другие четыре, где субстрат связан с комплексом С-домена с активирующим хлоридом (С1д)- (ЕсС1д8)Ем; (ЕсС1А8)ЕцС1А; (ЕсС1а8)С11Ем; (ЕсС1а8)С11ЕмС1а. Уравнение скорости гидролиза для этой схемы, с учетом равновесного приближения, имеет следующий вид'
где параметры с индексом N относятся к N-домену, а параметры с индексом С - к С-домену.
Теоретические зависимости величин и ¿««jati гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под
действием соматического АПФ от концентрации KCl, построенные на основании выведенного уравнения (2) с использованием параметров, полученных для однодоменных форм фермента, значительно отличались от экспериментальных данных (рис. 9). Экспериментальные величины каталитических констант лежали даже ниже теоретических значений, учитывающих взаимозависимый характер функционирования доменов АПФ Мы попытались оценить, изменение каких именно параметров для обоих доменов может приводить к полученному эффекту Оказалось, что небольшого увеличения значения константы связывания субстрата с N-доменом (примерно в 2 раза) и увеличения параметра а, характеризующего влияние активирующего хлорид-аниона на связывание субстрата с С-доменом (примерно в 3 раза), достаточно для того, чтобы теоретические зависимости хорошо согласовывались с экспериментальными данными (рис. 9, табл. 3).
Полученные результаты говорят о взаимном влиянии доменов в составе соматического АПФ на каталитические свойства друг друга Наличие такого взаимного влияния доменов отмечалось и ранее при исследовании связывания меченого ингибитора с отдельными доменами и двудоменным АПФ [Воронов С В и др , Биохимия, 2001 ]
Таблица 3. Кинетические параметры гидролиза СЬ2-РЬе-Н1й-Ьеи под действием отдельных 1*1- и С-доменов и доменов в составе соматического АПФ в присутствии хлорид-анионов.
N-домен С-домен
отдельный в составе соматического АПФ отдельный в составе соматического АПФ
Ks, мМ 4,5 ± 2,5 9 0,44 ± 0,08 0,44
А"л, мМ 2,5 ±1,5 2,5- 250 ±150 250
а 0,027 ±0,017 0,04 0,065 ± 0,035 0,2
Ки М 1,1 ±0,3 1,1 >10 >10
ß-ЛГг, М 2,4 ±1 2,4
kjatt, С 138 ±8 138 22 ±2 24
4 ПОСТРОЕНИЕ МОДЕЛЕЙ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУР N- И С-ДОМЕНОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА БЫКА.
Пространственная структура С-домена АПФ человека, полученная в 2003 году, положила начало в изучении ангиотензин-превращающего фермента на молекулярном уровне Как мы уже упоминали, в данной структуре было обнаружено два хлорид-аниона, один из которых (C11) находится на расстоянии около 20Ä от иона цинка активного центра, а второй (С12) - на расстоянии около 10Ä от иона цинка (рис. 10) Мы использовали структуру С-домена АПФ человека в качестве шаблона для построения пространственных моделей доменов АПФ быка. Построенные нами модели позволили определить потенциальные центры связывания хлорид-анионов в N- и С-доменах фермента быка.
Прежде всего мы сравнили аминокислотные последовательности N- и С-доменов АПФ быка и человека. Оказалось, что аминокислоты, образующие микроокружение двух хлорид-анионов, консервативны в последовательностях С-домена АПФ человека и С-домена АПФ быка (табл. 4), однако, в обоих N-доменах наблюдаются следующие отличия: в С11-связывающем центре остаток Arg заменен на His, а в С12-связывающем центре Met заменен на Тгр (табл. 4).
Таким образом, на основании анализа аминокислотных последовательностей мы могли заключить, что С-домен АПФ быка, так же как и С-домен фермента человека, может содержать два центра связывания хлорид-анионов Для N-домена на основании проведенного
анализа нельзя было сделать однозначный вывод о количестве центров связывания хлорид-анионов.
Моделирование пространствен- Таблица 4. Аминокислотные остатки,
„, „ 4ТТЛЧ, составляющие центры связывания хлорид-
ных структур N-и С-доменов АПФ быка ._„ r_ 4ТТ. г
анионов (СИ и С12), в С-домене АПФ человека и
было проведено в рамках совместной соответствующие аминокислоты в С- и N, _ _ _ . доменах АПФ быка и N-домене АПФ человека, работы с группой Палюлина В.А.
(Химический факультет МГУ им. М.В.
Ломоносова). С помощью программы
Sybyl 6.9 было проведено
моделирование по гомологии, где в
качестве шаблона была использована
кристаллическая структура С-домена
АПФ человека. Для уточнения
положения боковых цепей и петель в
полученных моделях проведена
молекулярная динамика (с помощью
программы SANDER программного
пакета AMBER 8) со временем
моделирования 15 пс, чего достаточно
для установления в системе
термодинамического равновесия.
Корректность построенных моделей
была оценена с помощью проверки
стереохимических параметров моделей в
программе PROCHECK. Было показано,
что в полученных моделях нет
аминокислот в запрещенных зонах, и большинство аминокислот находятся в наиболее благоприятных областях.
Анализ полученных структурных моделей показал, что пространственное расположение аминокислот, составляющих потенциальные центры связывания хлорид-анионов в моделях С- и N-доменов АПФ быка, не опровергает возможность существования двух хлорид-связывающих центров в обоих доменах фермента быка (рис. 10), что хорошо согласуется с кинетическими данными, продемонстрировавшими участие двух хлорид-анионов в функционировании как С-, так и N-домена АПФ.
С-домен человека С-домен быка N-домен быка N-домен человека
СИ
Arg 762 Aig763 His 165 His 164
Arg 1065 Arg 1066 Arg 468 Arg 467
Tip 758 Tip 759 Trp 161 Trp 160
Tip 1062 Tip 1063 Trp 465 Trp 464
Trp 1061 Trp 1062 Trp 464 Trp 463
Tip 855 Tip 856 Tip 258 Trp 257
Asp 1083 Asp 1084 Asp 486 Asp 485
C12
Туг 800 Tyr 801 Tyr203 Tyr202
Arg 1098 Arg 1099 Arg 501 Arg 500
Pro 1095 Pro 1096 Pro 498 Pro 497
Pro 983 Pro 984 Pro 386 Pro 385
Met 799 Met 800 Trp 202 Tip 201
С-АПФ человека
(кристаллическая С-домен АПФ быка N. домен АПФ быка
структура) (модель) (модель)
Рис. 10. Пространственная структура С-домена человека и пространственные модели С- и N-доменов АПФ быка Ион Zn2+ изображен сферой малинового цвета, а хлорид-анионы показаны сферами зеленого цвета.
В литературе уже обсуждалось возможное активирующее действие найденных в структуре С-домена АПФ человека хлорид-анионов на активность фермента, прежде всего ближнего к иону цинка активного центра хлорид-аниона С12. Известно, что замена Arg, участвующего в координации С12 в С-домене АПФ человека, на Gin приводит к активному мутанту, который не активируется хлорид-анионами [Liu X. et.al., J. Biol. Chem., 2001.]. Механизм активирующего действия этого аниона, как полагают, может заключаться в переносе остатка Туг к активному центру, где данный остаток принимает участие в стабилизации переходного состояния при катализе [Tzalcos AG et al, Prot Eng , 2003 ]
Мы предположили, что С12 может соответствовать СЦ в общей схеме действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых однодоменными формами АПФ.
По кинетическим данным величины констант связывания активирующего хлорид-аниона (С1д) с фермент-субстратными комплексами, образованными N- и С-доменами АПФ, различались более чем на 2 порядка (табл. 2, аКА), в то время как константы связывания ингибирующего хлорид-аниона с теми же комплексами были практически одинаковыми (табл. 2, pA"[). Мы рассчитали энергии связывания анионов С1д и Cli с фермент-субстратными
комплексами, образованными С- и N-доменами с субстратом Cbz-Phe-His-Leu, на основании кинетических результатов:
(3)
Д£С1л = ЯТ 1п(^СГ(С-лпф)) = кт 1п(^л,ы-лпФ))
^сляз сг (и-апф) "^с-апф)
АЯС1[ = ) = КТ1п(^-АПФ»)
^сшпсг(и-апф) /^кс-апф)
Согласно уравнениям (3) разница в энергии связывания активирующего хлорид-аниона с комплексом Ы-домен - СЬг-РЬе-Шв-Ьеи по сравнению с комплексом С-домен - СЬг-РЬе-Шв-Ьеи составляет -3,3 ккал/моль, в то время как для ингибирующего аниона эта разница составляет всего -0,5 ккал/моль. Эти величины мы сравнили с величиной разницы в энергиях связывания аниона С12 с комплексами Л-домен - СЬг-РЬе-Шв-Ьеи и С-домен - СЬг-РЬе-Н^Б-Ьеи. Расчет, проведенный с использованием пространственных моделей комплексов доменов АПФ с субстратом, был произведен в соответствии со следующей схемой:
Ы-домен - СЬг-РЬе-Н15-Ьеи-Ес»яз. С12, К-АПФ ^ к_домен. сЬг-РЬе-№8-Ьеи - С12
С-домен - СЬг-РЬе-Шз-Ьеи-Есвд. С12, С-АПФ ^ с_домен. СЬг-РЬе-Н1$-Ьеи - С12
ДЕ = Есюа CI2, N-АПФ - Е евяэ. CI2, С-АПФ
В четырех моделях, а именно N-домен - Cbz-Phe-His-Leu, N-домен - Cbz-Phe-His-Leu - хлорид-анион С12, С-домен - Cbz-Phe-His-Leu и С-домен - Cbz-Phe-His-Leu - хлорид-анион С12, была проведена молекулярная динамика со временем моделирования 15 пс. В результате была получена величина ДЕ—3,8 ккал/моль, демонстрирующая предпочтительное связывание С12 с N-доменом. Отметим, что рассчитанная нами величина ДЕ гораздо ближе по значению к разнице в энергиях связывания хлорид-аниона с доменами АПФ, полученной из кинетических данных для активирующего хлорид-аниона Таким образом, проведенный расчет служит подтверждением предположения о том, что именно ближний к иону цинка активного центра хлорид-анион (С12) в структурах обоих доменов соответствует активирующему хлорид-аниону.
Среди аминокислот, входящих в ближайшее окружение С12, как мы уже отмечали, наблюдается единственная замена Met в С-домене на Тгр в N-домене (табл 4). Мы оценили,
как эта замена может влиять на энергию связывания хлорид-аниона С12 с доменами АПФ Для этой цели мы использовали метод термодинамического интегрирования, позволяющий находить разницу в свободных энергиях начального и конечного состояний процесса. В нашем случае рассчитывалась разница в свободных энергиях при мутации Тгр на Ala у N-домена и Met на Ala у С-домена. Схема расчета имеет следующий вид-AG, AG,
N-домен АПФ с С12-(Тгр)
А
AG.
N- или С-домен АПФ с С12 -(Ala)
А
AG,
N-домен АПФ без С12-(Тгр)
AG,
-С-домен АПФ с С12 (Met)
А
AG,
N- или С-домен АПФ без C12-«S-(А1а)
ag4
-С-домен АПФ без С12 (Met)
Для данной схемы можно записать следующие равенства: AG5 + AG, = AG3 + AG, (4) AG6 + AG2 = AG4 + AG7 (5) Поскольку нас интересует разница в энергиях связывания хлорид-аннона С12 с N- и С-доменами, т е AG5-AG6, вычитая из уравнения (4) уравнение (5), получаем-AG5 - AG6 = -AG | + AG2 + AG3 - AG4 (6) Полученная в результате данного расчета разница между энергиями связывания хлорид-аниона С12 с N- и С-доменами составила -0,95 ккал/моль, т.е. замена Met на Тгр при переходе от С- к N-домену приводит к усилению связывания хлорид-аниона. Таким образом, эта замена, по-видимому, является одной из причин различного сродства хлорид-аниона С12 к N- и С-доменам АПФ.
Что касается другого центра связывания хлорид-анионов (СП), более удаленного от иона цинка, то логично было принять его за центр связывания ингибирующего хлорид-аниона. В настоящее время мы не можем предложить механизма ингибирующего действия данного аниона. Однако, приняв СИ за ингибирующий хлорид-анион, нам удалось объяснить разницу в кинетике гидролиза субстратов под действием N-и С-доменов АПФ в присутствии высоких концентрации КС1. Согласно кинетическим данным, ингибирующий хлорид-анион в случае N-домена связывается с одинаковой константой со свободным ферментом и фермент-субстратным комплексом (табл. 2). В случае С-домена ингибирующий хлорид-анион практически не связывается со свободным ферментом, но связывается с фермент-субстратным комплексом, т.е. связывание субстрата улучшает связывание хлорид-аниона (табл. 2). Согласно проведенным нами структурным расчетам, в С-домене в отсутствие
^ArgI066
Atgte
субстрата центр связывания хлорид-аниона Cil может быть заблокирован остатком Lys 1088 (рис. 11), который образует ионную связь с карбоксильной группой остатка Asp1084. При связывании субстрата боковая цепь Lys поворачивается в сторону активного центра, где взаимодействует с карбоксильной группой субстрата. Боковая цепь остатка Asp, в свою очередь, также отворачивается от центра связывания СИ, при этом этот центр становится доступным для связывания хлорид-аниона (рис. 11). В N-домене соответствующий Lys490 не образует ионной связи с Asp486, поскольку боковая цепь Asp486 в свободном ферменте, как и в фермент-субстратном комплексе, отвернута от центра связывания хлорид-аниона СИ, и, соответственно, Lys490 в свободном N-домене не блокирует центр связывания хлорид-аниона СП. Таким образом, в случае N-домена СП-связывающий центр одинаково доступен как в свободном ферменте, так и в фермент-субстратном комплексе.
AiglO'
Рис. 11. Возможное положение остатков Lysl088 и Аяр1084 в С-домене АПФ быка (а) и положение этих аминокислот в комплексе С-домена с субстратом СЬг-РЬе-ЬПв^еи (б).
выводы
1. Предложен способ получения каталитически активного >1-домена АПФ путем селективной термоденатурации С-домена в составе двудоменного соматического фермента с последующим протеолизом его трипсином.
2 Определены кинетические параметры гидролиза двух субстратов - СЬг-РЬс-Шв-Ьеи и Ра-РЬе-Иу-СТу - под действием двух однодоменных форм АПФ при различных концентрациях хлорид-анионов Предложена кинетическая схема, описывающая механизм функционирования однодоменных форм АПФ, учитывающая связывание с ферментом двух хлорид-анионов, один из которых является активатором, а другой ингибитором фермента Показано, что константы активации 1*1- и С-доменов АПФ хлорид-анионами различаются на два порядка, а константы ингибирования имеют близкие значения.
3 Определены кинетические параметры гидролиза субстрата СЬг-РЬе-Шв-Ьеи под действием двудоменного соматического АПФ при различных концентрациях хлорид-анионов. Проанализирован механизм функционирования данной формы АПФ с учетом связывания четырех хлорид-анионов. Выявлено взаимное влияние доменов в составе соматического АПФ
4 Построены модели пространственных структур С- и >1-доменов АПФ быка. Показано существование двух потенциальных центров связывания хлорид-анионов на каждом из доменов.
5 Рассчитаны энергии связывания активирующего хлорид-аниона с С- и Ы-доменами АПФ, свидетельствующие о существенно лучшем связывании данного аниона с Ы-доменом АПФ. Показано, что присутствие остатка Тгр в С12-связывающем центре Ы-домена АПФ может рассматриваться как одна из причин более высокого сродства активирующего хлорид-аниона к М-домену Предложено структурное объяснение улучшения связывания ингибируняцего хлорид-аниона с С-доменом АПФ при связывании субстрата.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
1. Voronov S., Zueva N (Moiseeva N.l. Orlov V., Arutyunyan A , Kost O. Temperature-induced selective death of the C-domain within angiotensm-converting enzyme molecule (2002) FEBS Lett., 522, 77-82.
2. Воронов C.B., Биневский П В., Зуева Н.А. (Моисеева Н.А.). Палюлин В.А., Баскин И И, Орлова М.А., Кост О.А. Структурно-функциональные особенности гомологичных доменов ангиотензинпревращающего фермента (2003) Биоорганическая химия, 29, 470478.
3. Моисеева Н.А.. Биневский П.В., Баскин И.И., Палюлин В.А., Кост О.А. Роль двух центров связывания хлорид-анионов в функционировании тестикулярного ангиотензинпревращающего фермнта (2005) Биохимия, 70, 1415-1422.
4. Voronov S., Zueva N. (Moiseeva N.). Kost О. Features of the thermal unfolding of angiotensin-converting enzyme (2001) Abstracts of the 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS), Eur. J. Biochem., Lisbon, 190.
5. Воронов C.B., Зуева H.A. (Моисеева Н А.). Кост О.А, Структурно-обусловленное различие в термической устойчивости доменов ангиотензин-превращающего фермента (2002) Материалы V Симпозиума "Химия протеопитических ферментов ", Москва, 58
6. Zueva N. (Moiseeva N.). Voronov S., Borodina I, Kost О Homologous domains of angiotensin-converting enzyme exhibits different thermostability (2002) Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: fundamentals & applications", Moscow, 151.
7. Zueva N. (Moiseeva N.), Binevski P., Kost O. Regulative action of chloride in the reactions catalyzed by single-domain forms of angiotensin-converting enzyme. (2004) Abstracts of the 29lh Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Eur. J Biochem, Warsaw, 81.
Ао&бА
\
$-9991
Подписано в печать 04 мая 2006 г. Заказ 640. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Глава 1 Общие сведения об ангиотензин-превращающем ферменте.
1.1. Локализация и функции ангиотензин-превращающего фермента в организме.
1.2. Структура гена ангиотензин-превращающего фермента.
1.3. Первичная структура ангиотензин-превращающего фермента и особенности углеводной компоненты фермента.
1.4. Пространственная структура ангиотензин-превращающего фермента.
1.4.1. Пространственная структура С-домеиа ангиотензин-превращающего фермента человека.
1.4.2. Пространственные структуры комплексов С-домена ангиотензин-превращающего фермента с лизиноприлом, каптоприлом и эналаприлатом.
1.4.3. Пространственные модели N-домена ангиотензин-превращающего фермента и комплекса N-домена с лизиноприлом.
1.4.4. Механизм функционирования активных центров ангиотензин-превращающего фермента.
1.5. Каталитические свойства отдельных N- и С-доменов ангиотензинпревращающего фермента и доменов в составе соматического фермента.
Глава 2 Активация ангиотензин-превращающего фермента хлорид-анионами.
2.1. Влияние хлорид-анионов на N- и С-домены ангиотензинпревращающего фермента.
2.2. Аминокислоты, отвечающие за связывание хлорид-анионов в ангиотензин-превращающем ферменте.
2.3. Хлорид-связывающие центры в С-домене и в гомологах ангиотензинпревращающего фермента.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3 Материалы и методы исследования.
3.1. Материалы.
3.2. Методы исследования.
3.2.1. Синтез аффинного сорбента.
3.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензинпревращающего фермента.
3.2.3. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента.
3.2.4. Получение N-домена соматического ангиотензин-превращающего фермента.
3.2.5. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента.
3.2.6. Обессоливание ангиотензин-превращающего фермента.
3.2.7. Подготовка образцов к секвенированию.
3.2.8. Кинетические измерения.
3.2.9. Исследование структуры ангиотензин-превращающего фермента
Ф методами биоинформатики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I
Глава 4 Получение трех форм ангиотензин-превращающего фермента.
4.1. Получение и характеристика соматического ангиотензинпревращающего фермента быка.
4.2. Получение и характеристика тестикулярного ангиотензинпревращающего фермента быка.
4.3. Получение N-домена ангиотензин-превращающего фермента быка.
4.3.1. Каталитические характеристики N-домена ангиотензинпревращающего фермента.
Глава 5 Влияние хлорид-анионов на кинетические характеристики ангиотензин-превращающего фермента.
5.1. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза
Cbz-Phe-His-Leu под действием С- и N-доменов ангиотензин-превращающего фермента.
5.1.1. Определение влияния ионной силы раствора на активности С- и N-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка.
5.1.2. Определение механизма действия хлорид-анионов в реакции гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента.
5.2. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза Fa-Phe-Gly-Gly под действием С- и N-доменов ангиотензинпревращающего фермента.
5.2.1. Определение механизма действия хлорид-анионов в реакции гидролиза Fa-Phe-Gly-Gly под действием N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента.
5.3. Влияние хлорид-анионов на кинетические параметры гидролиза Cbz-Phe-His-Leu под действием соматического ангиотензин-превращающего фермента и определение механизма действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых данной формой фермента.
Глава 6 Построение моделей пространственных структур N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка.
6.1. Сравнение аминокислотных последовательностей N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка и человека.
6.2. Общие сведения о пространственных моделях N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка.
6.2.1. Аминокислоты, отвечающие за связывание субстрата Cbz-Phe-His-Leu в N- и С-доменах ангиотензин-превращающего фермента быка.
6.2.2. Пространственное расположение потенциальных центров связывания хлорид-анионов в моделях ^N- и С-доменов ангиотензин-превращающего фермента быка.
6.2.3. Роль С12 в функционировании однодоменных форм ангиотензинпревращающего фермента быка.
6.2.4. Оценка разницы в энергиях связывания хлорид-аниона С12 с Nи С-доменами ангиотензин-превращающего фермента.
6.2.5. Роль СП в функционировании однодоменных форм ангиотензин-превращающего фермента быка.
ВЫВОДЫ.
Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, известный также как пептидил-дипептидаза А, ЕС 3.4.15.1), широко распространенный в организме человека и животных, является ключевым ферментом регуляции сосудистого тонуса. Огромный интерес к этому ферменту во всем мире связан с тем, что синтезированные ингибиторы АПФ оказались очень эффективными при терапии различных видов гипертонии, сердечно-сосудистой недостаточности и инфаркте миокарда. Ингибиторы АПФ стали лекарством номер 1 в кардиологии, и в настоящее время ежедневно более 200 млн. человек принимают их в качестве антигипертензивных препаратов. Кроме того, имеются сведения о положительном эффекте перорального введения ингибиторов АПФ при атеросклерозе и при инсулин-зависимом диабете.
С другой стороны, АПФ является привлекательным объектом исследования для биохимиков, поскольку сочетает в себе ряд уникальных свойств, таких как наличие двух гомологичных каталитически активных доменов с несколько различными свойствами в составе одной полипептидной цепи, существование в составе фермента специфического углевод-связывающего центра, активация фермента анионами.
В настоящее время остаются не выясненными вопросы о взаимодействии доменов в составе АПФ, о причинах существования отрицательной кооперативности активных центров фермента, о природе конформационных изменений в структуре молекулы при связывании лиганда, о механизме активации АПФ анионами, о механизме шеддинга АПФ с мембраны и т.д.
Особый интерес вызывает активация АПФ анионами. Активные центры, расположенные на разных доменах, обладают разным сродством к анионам. Кроме того, в зависимости от гидролизуемого субстрата, профили активации фермента анионами сильно различаются. В различных тканях организма концентрация хлорид-анионов различна, в связи, с чем в зависимости от локализации АПФ, может предпочтительно "работать" тот или иной домен фермента и может меняться круг гидролизуемых под действием АПФ субстратов. Это, в свою очередь, ставит вопрос о создании тканеспецифичных ингибиторов к отдельным доменам
АПФ. В 2003 году была расшифрована кристаллическая структура С-домена АПФ человека, продемонстрировавшая наличие двух центров связывания хлорид-анионов даже в однодоменной форме фермента. Все эти данные ставят вопрос о выявлении роли хлорид-анионов и описании механизма действия хлорид-анионов в реакциях, катализируемых АПФ. Однако, несмотря на несомненную актуальность исследования активации доменов АПФ данный вопрос остается практически неизученным.
Целью данной работы является комплексное исследование взаимодействия хлорид-анионов с однодоменными формами АПФ и двудоменным соматическим ферментом, что включает в себя изучение влияния хлорид-анионов на кинетику реакций, катализируемых различными формами АПФ, и структурное обоснование особенностей влияния хлорид-анионов на различные формы фермента. В качестве объекта исследования был выбран фермент быка.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
ВЫВОДЫ
Предложен способ получения каталитически активного N-домена АПФ путем селективной термоденатурации С-домена в составе двудоменного соматического фермента с последующим протеолизом его трипсином.
Определены кинетические параметры гидролиза двух субстратов - Cbz-Phe-His-Leu и Fa-Phe-Gly-Gly - под действием двух однодоменных форм АПФ при различных концентрациях хлорид-анионов. Предложена кинетическая схема, описывающая механизм функционирования однодоменных форм АПФ, учитывающая связывание с ферментом двух хлорид-анионов, один из которых является активатором, а другой ингибитором фермента. Показано, что константы активации N- и С-доменов АПФ хлорид-анионами различаются на два порядка, а константы ипгибирования имеют близкие значения.
Определены кинетические параметры гидролиза субстрата Cbz-Phe-His-Leu под действием двудоменного соматического АПФ при различных концентрациях хлорид-анионов. Проанализирован механизм функционирования данной формы АПФ с учетом связывания четырех хлорид-анионов. Выявлено взаимное влияние доменов в составе соматического АПФ.
Построены модели пространственных структур С- и N-доменов АПФ быка. Показано существование двух потенциальных центров связывания хлорид-анионов на каждом из доменов.
Рассчитаны энергии связывания активирующего хлорид-аниона с С- и N-доменами АПФ, свидетельствующие о существенно лучшем связывании данного аниона с N-доменом АПФ. Показано, что присутствие остатка Тгр в С12-связывающем центре N-домена АПФ может рассматриваться как одна из причин более высокого сродства активирующего хлорид-аниона к N-домену. Предложено структурное объяснение улучшения связывания ингибирующего хлорид-аниона с С-доменом АПФ при связывании субстрата.
1. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John M., Tregear G., and Corvol P. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 93869390.
2. Erdos E.G., and Skidgel R.A. The angiotensin I-converting enzyme. (1987), Lab. Invest., 56, 345-348.
3. Friedland J., Setton C., and Silverstein E. Induction of angiotensin-converting enzyme in human monocytes in culture. (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 843-849.
4. Costerousse O., Allegrini J., Lopez M., and Alhenc-Gelas F. Angiotensin I-converting enzyme in human circulatory mononuclear cells. Genetic polymorphism in T-lymphocytes. (1993), Biochem. J., 290, 33-40.
5. Strittmatter S.M., Kapiloff M.S., and Snyder S.H. 3H.Captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 1027-1033.
6. Сахаров И.Ю., Данилов C.M., и Сухова Н.В. Очистка и исследование физико-химических свойств ангиотензинпревращающего фермента из печени человека. (1987), Бюлл. Экспер. Биол. Мед., 103, 308-310.
7. Sakharov I.Y., Danilov S.M., and Dukhanina E.A. Affinity chromatography and some properties of the angiotensin-converting enzyme from human heart. (1987), Biochim. Biophys. Acta, 923, 143-149.
8. Laliberte F., Laliberte M.F., Alhenc-Gelas F., and Chevillard C. Cellular and subcellular immunohistochemical localization of angiotensin-converting enzyme in the rat adrenal gland. (1987), Lab. Invest., 56, 364-371.
9. Igic R., and Kojovic V. Angiotensin I converting enzyme (kininase II) in ocular tissues. (1980), Exp. Eye Res., 30, 299-303.
10. Defendini R., Zimmerman E.A., Weare J.A., Alhenc-Gelas F, and Erdos E.G. Angiotensin-converting enzyme in epithelial and neuroepithelial cells. (1983), Neuroendocrinology, 37, 32-40.
11. Strittmatter S.M., Lo M.M.S., Javitch J.A., and Snyder S.H. Autoradiographic visualization of angiotensin-converting enzyme in rat brain with 3HJcaptopril: localization to a striatonigral pathway. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1599-1603.
12. Esther C.R., Marino E.M., Howard Т.Е., Michaud A., and Corvol, P. The critical role of tissue angiotensin-converting enzyme as revealed by gene targeting in mice. (1997), J. Clin. Invest., 99, 2375-2385.
13. Corvol P., Williams T.A., and Soubrier, F. Peptidyl dipeptidase A: angiotensin I-converting enzyme. (1995), Methods Enzymol., 248, 283-305.
14. Ramachandran R., Sen G.C., Misono K., and Sen I. Regulated cleavage-secretion of the membrane-bound angiotensin-converting enzyme. (1994), J. Biol. Chem., 269,2125-2130.
15. Das M., Hartley J.L., and Soffer R.L. Serum angiotensin-converting enzyme. Isolation and relationship to the pulmonary enzyme. (1977), J. Biol. Chem., 252, 1316-1319.
16. El-Dorry H.A., MacGregor J.S., and Soffer R.L. Dipeptidyl carboxypeptidase from seminal fluid resembles the pulmonary rather than testicular isoenzyme. (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun., 115, 1096-1100.
17. Yasui Т., Alhenc-Gelas F., Corvol P., and Menard J. Angiotensin I-converting enzyme in amniotic fluid. (1984), J. Lab. Clin. Med., 104, 741-751.
18. Schweisfurth H., and Schioberg-Schiegnitz S. Assay and biochemical characterization of angiotensin I-converting enzyme in cerebrospinal fluid. (1984), Enzyme, 32, 12-19.
19. Ehlers M.R., and Riordan J.F. Angiotensin-converting enzyme: new concepts concerning its biological role. (1989), Biochemistry, 28, 5311-5318.
20. Corvol P., and Williams T.A. Peptidyl-dipeptidase A/angiotensin I-converting enzyme. (1998), in Handbook of Proteolytic Enzymes (Edited by: Barrett A.J., Rawlings N.D., and Woessner J.F.) pp. 1066-1076, Academic Press.
21. Turner A.J., and Hooper N.M. The angiotensin-converting enzyme gene family: genomics and pharmacology. (2002), Trends Pharmacol. Sci., 23, 177-183.
22. Eriksson U., Danilczyk U., and Penninger J.M. Just the beginning: novel functions for angiotensin-converting enzyme. (2002), Curr. Biol., 12, R745-R752.
23. Gibbons G.H. Vasculoprotective and cardioprotective mechanism of angiotensin-converting enzyme inhibition: the homeostatic balance between angiotensin II and nitric oxide. (1997), Clin. Cardiol., 20, 18-25.
24. Skeggs L.T., Kahn J.R., and Shumway N.P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. (1956), J. Exp. Med., 103, 295-299.
25. Ruschityka F.T., Noll G., and Luscher T.F. The endothelium in coronary artery diseases. (1997), Cardiology, 88, 3-19.
26. Yang H.Y.T., Erdos E.G., and Levin Y. A dipeptidyl carboxypeptidase that converts angiotensin I and inactivates bradykinin. (1970), Biochim. Biophys. Acta, 214, 374-376.
27. Soffer R.L., and El-Dorry H.A. Angiotensin-converting enzyme: immunologic, structural, and developmental aspects. (1983), Fed. Proc., 42, 2735-2739.
28. Chrysant S.G. Vascular remodeling: the role of angiotensin-converting enzyme inhibitors. (1998), Am. Heart J., 135, S21-S30.
29. Parving H.H., Tarnow L., and Rossing P. Renal protection in diabetes an emerging role for calcium antagonists. (1997), Cardiology, 88, 56-62.
30. Skidgel R.A., and Erdos E.G. Novel activity of human angiotensin I converting enzyme: release of the NH2- and COOH-terminal tripeptides from the luteinizing hormone-releasing hormone. (1985),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1025-1029.
31. Skidgel R.A., Engelbrecht S., Johnson A.R., and Erdos E.G. Hydrolysis of substance P and neurotensin by converting enzyme and neutral endopeptidase. (1984), Peptides, 5, 769-776.
32. El-Dorry H.A., Bull H.G., Iwata K., Thornberry N.A., Cordes E.H., and Soffer R.L. Molecular and catalytic properties of rabbit testicular dipeptidyl carboxypeptidase. (1982), J. Biol. Chem., 257, 14128-14133.
33. Velletri P.A. Testicular angiotensin I-converting enzyme (E.C. 3.4.15.1). (1985), Life Sci., 36, 1597-1608.
34. Reeves P.G., and O'Dell B.L. Zinc deficiency in rats and angiotensin-converting enzyme activity: comparative effects on lung and testis. (1988), J. Nutr., 118, 622626.
35. Scallon B.J., Fung W.J., Tsang T.C., Li S., Kado-Fong H., Huang K.S., and Kochan J.P. Primary structure and functional activity of a phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D. (1991), Science, 252, 446-448.
36. Tujioka H., Misumi Y., Takami N., and Ikehara Y. Posttranslational modification of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-specific phospholipase D and its activity in cleavage of GPI anchors. (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 737-743.
37. Leisle L., Parkin E.T., Turner A.J., and Hooper N.M. Angiotensin-converting enzyme as a GPIase: a critical reevaluation. (2005), Nat. Med., 11, 1139-1140.
38. Fuchs S., Frenzel K., Hubert C., Lyng R., Muller L., Michaud A., Xiao H.D., Adams J.W., Capecchi M.R., Corvol P., Shur B.D., and Bernstein K.E. Male fertility is dependent on dipeptidase activity of testis ACE. (2005), Nat. Med., 11, 1140-1142.
39. Deddish P.A., Wang J., Michel В., Morris P.W., Davidson N.O., Skidgel R.A., and Erdos E.G. Naturally occurring active N-domain of human angiotensin I-converting enzyme. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 7807-7811.
40. Deddish Р.А., Wang L.-X., Jackman H.L., Michel В., Wang J., Skidgel R.A., and Erdos E.G. Single-domain angiotensin I converting enzyme (kininase II): characterization and properties. (1996), J. Pharmacol. Exp. Ther., 279, 15821589.
41. Биневский П.В., Никольская И.И., Позднее В.Ф., и Кост О.А. Получение и характеристика N-домена ангиотенгин-превращающего фермента быка. (2000), Биохимия, 65, 765-774.
42. Hubert С., Houot А.-М., Corvol P., and Soubrier F. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene. (1991), J. Biol. Chem., 266, 15377-15383.
43. Riordan J.F. Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives. (2003), Genome Biol., 4(8): 225.
44. Ehlers M.R.W., Schwager S.L., Scholle R.R., Manji G.A., Brandt W.F., and Riordan J.F. Proteolytic release of membrane-bound angiotensin-converting enzyme: role of the juxtamembrane stalk sequence. (1996), Biochemistry, 35, 9549-9559.
45. Erdos E.G., and Gafford J.T. Human converting enzyme. (1983), Clin. Exp. Hypertens. Part A - Theory and Pract., 5, 1251-1262.
46. Das M., and Soffer R.L. Pulmonary angiotensin-converting enzyme. Structural and catalytic properties. (1975), J. Biol. Chem., 250, 6762-6768.
47. Conroy J.M., Hartley J.L., and Soffer R.L. Canine pulmonary angiotensin-converting enzyme. Physicochemical, catalytic and immunological properties. (1978), Biochim. Biophys. Acta, 524,403-412.
48. Kost O.A., Bovin N.V., Chemodanova E.E., Nasonov V.V., and Orth T.A. New feature of angiotensin-converting enzyme: carbohydrate-recognizing domain. (2000),/. Mol. Recognit., 13, 360-369.
49. Hartley J.L., and Soffer R.L. On the oligosaccharide moiety of angiotensin-converting enzyme. (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 1545-1552.
50. Ripka J.E., Ryan J.W., Valido F.A., Chung A.Y., Peterson C.M., and Urry R.L. N-glycosylation of forms of angiotensin converting enzyme from four mammalian species. (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, 503-508.
51. Shai S.Y., Fishel R.S., Martin B.M., Berk B.C., and Bernstein K.B. Bovine angiotensin converting enzyme cDNA cloning and regulation. Increased expression during endothelial cell growth arrest. (1992), С ire. Res., 70, 12741281.
52. Orth Т., Voronov S., Binevski P., Saenger W., and Kost O. Glycosylation of bovine pulmonary angiotensin-converting enzyme modulates its catalytic properties. (1998), FEBSLett., 431, 255-258.
53. Lattion A.L., Soubrier F., Allegrini J., Hubert C., Corvol P., and Alhenc-Gelas F. The testicular transcript of the angiotensin I-converting enzyme encodes for the ancestral, non-duplicatedform of the enzyme. (1989), FEBS Lett., 252, 99-104.
54. Kumar R.S., Kusari J., Roy S.N., Soffer R.L., and Sen G.C. Structure of testicular angiotensin-converting enzyme. A segmental mosaic isozyme. (1989), J. Biol. Chem., 264, 16754-16758.
55. Howard Т.Е., Shai S.Y., Langford K.G., Martin B.M., and Bernstein K.E. Transcription of testicular angiotensin-converting enzyme (ACE) is initiated within the 12th intron of the somatic ACE gene. (1990), Mol. Cell. Biol., 10, 42944302.
56. Ehlers M.R.W., Chen Y.-N.P., and Riordan J.F. The unique N-terminal sequence of testis angiotensin-converting enzyme is heavily O-glycosylated and unessential for activity or stability. (1992), Biochem. Biophys. Res. Commun., 183, 199-205.
57. Kasturi S., Jabbar M.A., Sen G.C., and Sen I. Role of glycosylation in the biosynthesis and activity of rabbit testicular angiotensin-converting enzyme. (1994), Biochemistry, 33, 6228-6234.
58. Sturrock E.D., Yu X.C., Wu Z., Biemann K., and Riordan J.F. Assignment of free and disulfide-bonded cysteine residues in testis angiotensin-converting enzyme: functional implications. (1996), Biochemistry, 35, 9560-9566.
59. Sturrock E.D., Danilov S.M., and Riordan J.F. Limited proteolysis of human kidney angiotensin-converting enzyme and generation of catalytically active N-and C-terminal domains. (1997), Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 16-19.
60. Елисеева Ю.Е. Структурно-функциональные особенности ангиотензин-превращающего фермента. (1998), Биоорг. химия, 24, 262-270.
61. Ehlers M.R.W., Chen Y.-N.P., and Riordan J.F. Spontaneous solubilization of membrane-bound human testis angiotensin-converting enzyme expressed in Chinese hamster ovary cells. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1009-1013.
62. Beldent V., Michaud A., Wei L., Chauvet M.-T., and Corvol P. Proteolytic release of human angiotensin-converting enzyme. (1993), J. Biol. Chem., 268, 2642826434.
63. Ehlers M.R.W., Schwager S.L., Chubb A.J., Scholle R.R., Brandt W.F., and Riordan J.F. Proteolytic release of membrane proteins: studies on a membrane-protein solubilizing activity in CHO cells. (1997), Immunopharmacology, 36, 271278.
64. Sadhukhan R., Sen G.C., Ramchandran R., and Sen I. The distal ectodomain of angiotensin-converting enzyme regulates its cleavage-secretion from the cell surface. (1998),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 138-143.
65. Chubb A.J., Schwager S.L.U., Merwe E.V., Ehlers M.R.W., and Sturrock E.D. Deletion of the cytoplasmic domain increases basal shedding of angiotensin-converting enzyme. (2004), Biochem. Biophys. Res. Commun., 314, 971-975.
66. Pang S., Chubb A.J., Schwager S.L., Ehlers M.R., Sturrock E.D., and Hooper N.M. Roles of the juxtamembrane and extracellular domains of angiotensin-converting enzyme in ectodomain shedding. (2001), Biochem. J., 358, 185-192.
67. Woodman Z.L., Schwager S.L.U., Redelinghuys P., Carmona A.K., Ehlers M.R., and Sturrock E.D. The N-domain of somatic angiotensin-converting enzyme negatively regulates ectodomain shedding and catalytic activity. (2005), Biochem. J., 389,739-744.
68. Sturrock E. D., Natesh R., van Rooyen J. M., and Acharya K. R. Structure of angiotensin I-converting enzyme. (2004), Cell. Mol. Life Sci., 61, 2677-2686.
69. Natesh R., Schwager S.L.U., Sturrock E.D, and Acharya K.R. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex. (2003), Nature, 421, 551-554.
70. Gordon K., Redelinghuys P., Schwager S.L.U., Ehlers M.R.W., Papageorgiou A.C., Natesh R., Acharya K.R., and Sturrock E.D. Deglycosylation, processing and crystallization of human testis angiotensin-converting enzyme. (2003), Biochem. J., 371, 437-442.
71. Natesh R„ Schwager S.L.U., Evans H.R. Sturrock E.D, and Acharya K.R. Structure details on the binding of antihypertensive drugs captopril and enalaprilat to human testicular angiotensin I-converting enzyme. (2004), Biochemistry, 43, 8718-8724.
72. Воронов C.B., Биневский П.В., Зуева H.A., Палюлин В.А., Баскин И.И., Орлова М.А., и Кост О.А. Структурно-функциональные особенности гомологичных доменов ангиотензинпревращающего фермента. (2003), Биоорганическая химия, 29, 470-478.
73. Hooper N.M. Families of zinc metalloproteases. (1994), FEBS Lett., 354, 1-6.
74. Holm L., and Sander C. Protein folds and families: sequence and structure alignments. (1999), Nucleic Acids Res., 27, 244-247.
75. Brown C.K., Madauss K., Lian W., Beck M.R., Tolbert W.D., and Rodgers D.W. Structure of neurolysin reveals a deep channel that limits substrate access. (2001), Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3127-3132.
76. Arndt J.W., Нао В., Ramakrishnan V., Cheng Т., Chan S.I., and Chan M.K. Crystal structure of a novel carboxypeptidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. (2002), Structure (Camb.), 10, 215-224.
77. Hausrath A.C., and Matthews B.W. Thermolysin in the absence of substrate has an open conformation. (2002), Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 58, 10021007.
78. Naqvi N., Liu K., Graham R. M., and Hussain A. Molecular basis of exopeptidase activity in the C-domain of human angiotensin I-converting enzyme. Insights into the origins of its exopeptidase activity. (2005), J. Biol. Chem., 280, 6669-6675.
79. Fernandez J.H., Hayashi M.A.F., Camargo A.C.M., and Nashich G. Structiral basis of the lisinopril-binding specificity in N- and C-domains of human somatic ACE. (2003), Biochem. Biophys. Res. Commun., 308, 219-226.
80. Acharya K.R., Sturrock E.D., Riordan J.F., and Ehlers M.R. ACE revisited: a new target for structure-based drug design. (2003), Nature reviews, 2, 891-902.
81. Tzakos A.G. and Gerothanassis I.P. Domain-selective ligand-binding model and atomic level pharmacophore refinement in angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitors. (2005), Chembiochem., 6, 1089-1103.
82. Marcic В., Deddish P. A., Jackman H. L., Erdos E. G., and Tan F. Effects of the N-terminal sequence of ACE on the properties of its C-domain. (2000), Hypertension, 36, 116-121.
83. Fernandez J. H., Neshich G., and Camargo А. С M. Using bradykinin-potentiating peptide structure to develop new antihypertensive drugs. (2004), Genet. Mol. Res., 3, 554-563.
84. Kim H.M., Shin D.R., Yoo O.J., Lee H., and Lee J.O. Crystal structure of Drosophila angiotensin I-converting enzyme bound to captopril and lisinopril. (2003), FEBSLett., 538, 65-70.
85. Ray K., Hines C.S., Coil-Rodriguez J., and Rodgers D.W. Crystal structure of human thimed oligopeptidase provides insight into substrate recognition, regulation, and localization. (2004), J. Biol. Chem., 279, 20480-20489.
86. Hangauer D.G., Monzingo A.F., and Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. (1984), Biochemistry, 23, 5730-5741.
87. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolys in and related zinc peptidases. (1988), Acc. Chem. Res., 21, 333-340.
88. Ehlers M.R., and Riordan J.F. Angiotensin-converting enzyme: zinc- and inhibitor-binding stoichiometrics of the somatic and testis isozymes. (1991), Biochemistry, 30,7118-7126.
89. Wei L., Alhenc-Gelas F., Corvol P., and Clauser E. The two homologous domains of human angiotensin I-converting enzyme are both catalytically active. (1991), J.Biol.Chem., 266, 9002-9008.
90. Deddish P. A., Jackman H. L., Skidgel R. A., and Erdos E. G. Differences in the hydrolysis of enkephalin congeners by the two domains of angiotensin converting enzyme. (1997), Biochem. Pharmacol., 53, 1459-1463.
91. Wei L., Clauser E., Alhenc-Gelas F., and Corvol P. The two homologous domains of human angiotensin I-converting enzyme interect differently with competitive inhibitors. (1992), J. Biol. Chem., 267, 13389-13405.
92. Voronov S., Zueva N., Orlov V., Arutyunyan A., and Kost O. Temperature-induced selective death of the C-domain within angiotensin-convertin enzyme molecule. (2002), FEBS Lett., 522, 77-82.
93. Jaspard E., Wei L., and Alhenc-Gelas F. Differences in the properties and enzymatic specificies of the two active sites of angiotensin I-converting enzyme (Kininase II). (1993), J.Biol.Chem., 268, 9496-9503.
94. Deddish P. A., Marcic В., Jackman H. L., Wang H.Z., Skidgel R. A., and Erdos E. G. N-Domain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting enzyme: angiotensin (1-7) and keto-ACE. (1998), Hypertension, 31, 912-917.
95. Araujo M.C., Melo R.L., Cesari M.H., Juliano M.A., Juliano L., and Carmona A.K. Peptidase specificity characterization of C- and N-terminal catalytic sites of angiotensin I-converting enzyme. (2000), Biochemistry, 39, 8519-8525.
96. Cotton J., Hayashi M.A., Cuniasse P., Vazeux G., Ianzer D., De Camargo A.C., and Dive V. Selective inhibition of the C-domain of angiotensin I converting enzyme by bradykinin potentiating peptides. (2002), Biochemistry, 41, 6065-6071.
97. Binevski P.V., Sizova E.A., Pozdnev V.F., and Kost O.A. Evidence for the negative cooperativity of the two active sites within bovine somatic angiotensin-converting enzyme. (2003),FEBSLett., 550, 84-88.
98. Andujar-Sanchez M., Camara-Artigas A., and Jara-Perez V. A calorimetric study of the binding of lisinopril, enalapril and captopril to angiotensin-converting enzyme. (2004), Biophys. Chem., Ill, 183-189.
99. Skirgello O.E., Binevski P.V., Pozdnev V.F., and Kost O.A. Kinetic probes for inter-domain co-operation in human somatic angiotensin-converting enzyme. (2005), Biochem. J., 391, 641-647.
100. Skeggs L.T., Marsh W.H., Kahn J.R., and Shumway N.P. The existence of two forms of hyper tens in. (1954), J. Exp. Med., 99, 275-282.
101. Gorenstein C., and Snyder, S.H. Two distinct enkephalinases: solubilization, partial purification and separation from angiotensin converting enzyme. (1979), Life Sci., 25, 2065-2070.
102. Oshima G., Nagasawa K., and Kato J. Renal angiotensin I-converting enzyme as a mixture of sialo- and asialo-enzyme, and a rapid purification method. (1973), J. Biochem., 80, 477-483.
103. Na K.-J., and Lee H.-J., Role of chloride ion as allosteric activator of angiotensin-converting enzyme. (1983), Arch. Biochem. Biophys., 227, 580-586.
104. Bunning P., and Riordan J.F. Activation of Angiotensin Converting Enzyme by Monovalent Anions. (1983), Biochemistry, 22, 110-116.
105. Dorer F.E., Kahn J. R., Lentz К. E., Levine M., and Skeggs L. T. Purification and properties of angiotensin-converting enzyme from hog lung. (1972), С ire. Res., 31, 356-366.
106. Dorer F.E., Kahn J. R., Lentz К. E., Levine M., and Skeggs L. T. Hydrolysis of bradykinin by angiotensin-converting enzyme. (1974), Circ. Res., 34, 824-827.
107. Fernley R. T. Equine angiotensin converting enzyme: a zinc metalloenzyme. (1977), Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 4, 267-281.о
108. Inokuchi J., and Nagamatsu A. Tripeptidyl carboxypeptidase activity ofkininase II (angiotensin-converting enzyme). (1981), Biochim. Biophys. Acta., 662, 300-307.
109. Jaspard E., and Alhenc-Gelas F. Catalytic properties of the two active sites of angiotensin I-converting enzyme on the cell surface. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun., 211, 528-534.
110. Cheung H.-S., Wang F.-L., Ondetti M. A., Sabo. E. F., and Cushman D. W. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. (1980), J. Biol. Chem., 255, 401-407.
111. Persson A. V., Russo S. F., and Wilson I.B. A new chromogenic substrate for angiotensin-converting enzyme. (1978), Anal. Biochem., 91, 674-683.
112. Rohrbach M., Williams E. В., and Rolstad R. A. Purification and substrate specificity of bovine angiotensin-converting enzyme. (1981), J. Biol. Chem., 256, 225-230.
113. Ehlers M. R., and Kirsch R. E. Catalysis of angiotensin I hydrolysis by angiotensin-converting enzyme: effect of chloride and pH. (1988), Biochemistry, 27, 5538-5544.
114. Shapiro R., Holmquist В., and Riordan J.F. Anion Activation of Angiotensin Converting Enzyme: Dependence on Nature of Substrate. (1983), Biochemistry, 22, 3850-3857.
115. Шарафутдинов Т.З. Молекулярная и кинетическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента из легких быка. (1990), Дисс. канд. хим. наук, МГУ, Москва.
116. Riordan J.F., Harper J.W., and Martin M. The catalytic mechanism of angiotensin converting enzyme and related enzymes. (1986), Journal of Cardiovascular pharmacology, 8,29-34.
117. Harper J.W., Shapiro R., and Riordan J.F. Observation of a Chloride-Dependent Intermediate during Catalysis by Angiotensin Converting Enzyme Using Radiationless Energy Transfer. (1987), Biochemistry, 26, 1284-1288.
118. Shapiro R., and Riordan J.F. Inhibition of Angiotensin Converting Enzyme: Dependence on Chloride. (1984), Biochemistry, 23, 5234-5240.
119. Liu X., Fernandez M., Wouters M.A., Heyberger S., and Husain A. Arg'098 is critical for the chloride dependence of human angiotensin I-converting enzyme C-domain catalytic activity. (2001), J. Biol. Chem., 276, 33518-33525.
120. Shapiro R., and Riordan J.F. Critical Lysine Residue at the Chloride Binding Site of Angiotensin Converting Enzyme. (1983), Biochemistry, 22, 5315-5321.
121. Dutzler R., Campbell E. В., Cadene M., Chalt В. Т., and MacKinnon R. X-ray structure of a CIC chloride channel at 3.0A reveals the molecular basis of anion selectivity. (2002), Nature, 415, 287-294.
122. Sen I., Kasturi S., Jabbar M.A., and Sen G.C. Mutations in two specific residues of testicular angiotensin-converting enzyme change its catalytic properties. (1993), J. Biol. Chem., 268, 25748-25754.
123. Chen Y.N.P., and Riordan J.F. Identification of essential tyrosine and lysine residues in angiotensin converting enzyme: evidence for a single active site. (1990), Biochemistry, 29, 10493-10498.
124. Tipnis S.R., Hooper N.M., Hyde R., Karran E., Christie G., and Turner A.J. A human homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase. (2000), J. Biol. Chem., 275, 33238-33243.
125. Vickers C., Hales P., Kaushik V., Dick L., Gavin J., Tang J., Godbout K., Parsons Т., Baronas E., Hsieh F„ Acton S., Patane M., Nichols A., and Tummino P.)
126. Guy J.L., Jackson R.M., Jensen H.A., Hooper N.M., and Turner A.J. Identification of critical active-site residues in angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) by site-directed mutagenesis. (2005), FEBSJ., 272, 3512-3520.
127. Sundberg L., and Porath J. Preparation of adsorbents for biospecific affinity chromatography. Attachment of group-containing ligands to insoluble polymers by means of bifuctional oxiranes. (1974), J. Chromatogr., 90, 87-98.
128. Кост O.A., Гринштейн C.B., Никольская И.И., Шевченко А.А., и Биневский П.В. Выделение солюбилизированной и мембранной форм соматического ангиотензин-превращающего фермента каскадной аффинной хроматографией. (1997), Биохимия, 62, 375-383.
129. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., и Джонс К. (1991), Справочник биохимика, Мир, Москва, 461-466.
130. Bull H.G., Thornberry N.A., and Cordes E.H. Purification of angiotensin-converting enzyme from rabbit lung and human plasma by affinity chromatography. (1985), J. Biol. Chem., 260, 2963-2972.
131. Hooper N.M., and Turner A.J. Isolation of two differentially glycosylated forms of peptidyl-dipeptidase A (angiotensin-converting enzyme) from pig brain: a re-evaluation of their role in neuropeptide metabolism. (1987), Biochem. J., 241, 625-633.
132. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1970), Nature, 227, 668-672.
133. Helmerhorts E., and Stokes G.B. Microcentrifuge desalting: a rapid, quantitative method for desalting small amounts of protein. (1980), Anal. Biochem., 104, 130135.
134. Holmquist В., Bunning P., and Riordan J.F. A continuous spectrophotometric assay for angiotensin-converting enzyme. (1979), Anal. Biochem., 95, 540-548.
135. Bieth J.-G. Theoretical and practical aspects of proteinase inhibition kinetics. (1995), Methods Enzymol., 248, 59-84.
136. Conroy J.M., and Lai C.I. A rapid and sensitive fluorescence assay for angiotensin-converting enzyme. (1978), Anal. Biochem., 87, 556-561.
137. Cornish-Bowden A. Fundamentals of enzyme Kinetics, revised ed.; Portland Press: London, 1999; 32-33.
138. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., and Higgins D.J. The CLUSTAL X windows interface: flexble strategies for multiple sequence alingment aided by quality analysis tools. (1997), Nucleic Acids Res., 25, 4876-4882.
139. Sybyl6.6. Tripos Inc. 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144, http://www.tripos.com.
140. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G„ Bhat T.N, Weissig H., Shindyalov I.N., and Bourne P.E. The Protein Data Bank. (2000), Nucleic Acids Res., 28, 235-242.
141. Laskowski R.A., Macarthur M.W., Moss D.S., and Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. (1993), J. Appl. Cryst., 26, 283-291.
142. Sen I., Samanta H., Livingston W., and Sen G.C. Establishment of transfected cell lines producing testicular angiotensin-converting enzyme. Structural relationship between its secreted and cellular forms. (1991), J. Biol. Chem., 266, 21985-21990.
143. Harris R.B., and Wilson I.B. Physicochemical characteristics of homogeneous bovine lung angiotensin-I converting enzyme. (1982), Int. J. Peptide Protein Res., 20,167-176.
144. Воронов C.B., Биневский П.В., Еремин C.A. и Кост О.А. Метод поляризации флуоресценции в исследовании различных форм ангиотензин превращающего фермента. (2001), Биохимия, 66, 968-975.
145. Kabsch W., and Sander С. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. (1983), Biopolymers, 22, 2577-2637.a
