Конформационный анализ белкового компонента онкофетальных гликопротеинов методами оптической спектроскопии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ТИХООКЕАНСКИЙ ИНС7ШУТ В100РГАНИЧЕСК0Я химии ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗКАКЕШ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН

1'а правах рукописи

ВАКОРИНА ТАТЬЯНА ИВАНОВКА

КОНФОРМАЦШ&Ш АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО КОМПОНЕНТА

011КО5ЕТА11Ьг1Т<ТЛ1«0ПР01таНСВ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

02.00.10 - бкосргандаеская химия, хга.'.ия природных и физиологически активных вйцсств

АВТОРЕ '1.Е Р А Т. диссертации на ссн'скачио ученой степгп:! кпнпчдатз хк^'.гчрслих наук

Ьладипостох - 199;:

Работа выполнена в лаборатории структурных и аналитических методов коследования Тихоокеанского института биооргани-чзской химии Дальневосточного отделения РАК.

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

Берущее предприятие:

доктор химических паук [а.Ф. Павленко)

член-коррэспоьдент РАН ¡О.С. Оводов

доктор химических наук Т.О. Соловьёва кандидат химических наук E.G. Караулов

Институт органической химии им.Н.Д. Ззлинского РАН

Защита состоится (л^иЯ. 1992 г. в часов

на гаседзнии специализированного совета Д 003.99.01 яо защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022: г. Владивосток, проспект МО-лэтия Владивостока 159, ТОБОХ. •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО.РАН: г. Владивосток, проспект К^О-летия Владивостока 159, ДВГИ.

Автореферат разослан " А^" Я^рг^^11992 г.

Учёный секретарь Специализированного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

¿7

Г.И. Прокопенко

Актуальность проблемы. Процесс злокачественной трансформации клеток сопровождается оказыванием ьецесув, ассоциированных с опухолевыми клетками и отличающихся от компонентов нормальных клеток. Ъ"'л эещзства, названные онкофетальчыми антигенами,обладают способнос;ь;о специфически взаимодействовать с иммунокомпе-тентными нлеткчми, участвовать в разлапых иммунных реакциях: являются достаточно специфическими и надёжными маркёрами злокачественных опухолей.

Для понимания механизма злокачественных образований и разработки оффектипиых методов их ранней диагностики и терапии необходима кирокне структурные исследования оннофетальных антигенов: изучение конформации мсле:сул к выяснения характера связи мезду пространственной структурой и антигенной активностью. Проблема заключается в том, что онкофетальные' антигену представляют собой, как правило, гли;сспрэтеинь: с высоким содержанием углеводного компонента. До настоящего времени конфорча^ионный анализ белкового компонента х'ликопротеинов проводился методами оптической спектроскопии, разработан:»ими для белков. Однако эти исследования носили оценочный характер, так как не было сдечано попытки обосновать применение этих методов к количественному определения пространственной структуру белкового компонента глико-протеиноъ, особенно, с высоким содержанием углеводов.

Объектами исследования явились онкофэтальше антигены: ра-ково-эмбряональниЯ антиген (РЭЛ), трофоблэстспецифический Л т-' гликопротеин (ТСГ) и родственный км I ^-кислый гликопротеин (АКТ), содержание углеводов в которых составляет от 30 до 60%.

Цель работа. Целью данного исследования явилось:

1. Разработка методологические основ применения методов ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии, инфракрасной (ИК) спектроскопии, кругового дихроизма, широко используемых для структурных исследований белков, к ко.чфор.уацискному .чнализу гликопротеино^

с высоким еодортлннем углеводного компонента.

2. Исследование пространственной структуры белкового компонента я конформэционяэй стабильности ыопакул онкофетальннх гли-копрот^инов в иироксм диапазоне температура н рН растаора,

3. Установление характера сеяэи ме^'СУ изменением пространственней структуры под действие!« ¡симданской модификации и им^, ,(2-химичег.кей актизностъч энк-^оталы-ых антигенов.

Научная новизна и практически! ценность. Впервые сделана попытка систематических исследований по применению методов оптической спектроскопии и методов предсказания по аминокислотной последовательности, разработанных для белков, к количественному определению элементов вторичной структуры белкового компонента гликопротеинов с вмсшсим содержанием углеводов. Впервые исследована иторичнад к третичная структуре, онкофетальних антигенов (РЗА и ТСГ) и их кснфоркашонная стабильность в широком ди&паэонэ температуры и рК раствора. Установлен характер взаимосвязи между иммунохимической активностью и изменением пространственной структуры онкофетальных антигенов в процессе химической модификации. Методом УФ-спектроскснии определены истинные молекулярные аеса гликопротеинов.

Показана принципиальная возможность применения методов УФ-спектроскопии, ИК-спекгроскопии, кругового дихроизма (ЗД) к количественно^ определению элементов вторичной структуры белкового компонента гликопротеинов с высоким содержанием углеводов. Предложена методика учНта вклада углеэодного компонента глкко-протеина в ИК-снектр (Амид I). Полученные характеристики кон-формационной стабильности АКТ, РЭА и ТСГ представляют интерес в разработке методов их з ¡¿деления и очистки, а также при подборе условий для различных химических модификаций с целью выяснения функциональных свойств -этих гликопротеинов.

Апробация работы и публикации .Основные результаты работы были представлены на III Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных продуктов (София, I9S5) и У1 Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1968). По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Обг»м работы. Диссертация состоит из введения, обзора лито-рптурь:, экспериментальной части, обсуждения результатов, быво-г.ое, списка литературы, приложения. Работа изложена на 1Ы странице , с г. перчит 33 рисунка 13 таблиц и 283 лчтярптурных ссылок.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Образны гликопротеинов получены в лаборатории хи..<ии неинфекционного иммунитета ТИЬОХ ДВО РАН: АЯГ ьвделен из крови человека пс стандартной методике (Charlwooa et ai,, 1976 ); РЭА выделен из метастазов аденокарциномы прямой кишки е печень, как описано раннее (Павленко и др., 1985) ; ТСГ выделен' из ретропла-центэрной кровк (F&vlenso et al., 1965). Молекулярное масси, определённые bDS-электрофорэзом в грэдиэнтэ пористости полиак-риламидкого геля, равны: АКТ - 45+0,5 kDa; РЭА - 220+1 OkDa ; ТСГ - 75+3 t-Па. Содержание белка, определенное по методу Лоури, равно: АКТ - 56Я; РЭА - 475?; ТСГ - 68%.

Регистрация УФ~слектров поглэз;ения производилась на спектрофотометре Сагу 219 (Variai , США) в каарцэвых кювегьх с толщиной слоя I см при ширине цели I нм. ИК-спектры поглощения дейтерирсванных гликопротеинов в d2° регистрировали на спектрофотометре Partiu Elioer M-I80 (США) в юозетах с окнами из CaF-, с толшиной слон 80,1 юсм. Спектры КД регистрировали на спектро-поляринетре Jaocc-ïOOA (Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя I см в ближней УФ-области (320-240 нм) и 0.1 см з далёкой УФ-области (240-190 им).

Концентрацию белкового комлонеггта з растворе гликопротеина определяли по содержанию азота в молекуле модифицированным методом Кьелъдалк (Joenics, 1974 ). Концентрация гликопротеина в растворе определяли из УФ-спектра в максимума поглощения при 273 ни.

Расчёт иьтенсивности ИК-опектров и эллиптичности спектров КД гликопротеинов в далёкой УФ-области производили на средний аминокислотный остаток; эллиптичность спектров КД гликопротеинов в ближней УФ-области рассчитывали на молярную концентрацию.

Определение остатков тирозина и триптофана проводили по вторым производным УФ-спектров поглощения. Доступность этих остатков молекулам воды определяли иэ дифференциальных спектров тепловой пергурбации (ТДДС).

Для расчёта элементов вторичной структуры белкового ксшо-нента гликопротеинов по ИК-спектрам использовал синтезатор кривых CK-I (Чиргадзе и др., 1975). Расчёт элементов вторичной структуры гликопротеинов по спектрам КД проводили на ЭВМ EC-I06I,

б

используя программу СопЬ1п, версия I (РгоуьпсЬег а, 1982). Расчёт элементов вторичной структуры 'методами предсказания по аминокислотной последовательности прозодили на ЭВМ ЕС-1061, используя автоматический алгоритм Финкельштейна и Птицына (Р^гзуп о.В., Р1пке:1^91п А.У., 1933).

ОБСУВДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

I. Определение молекулярного веса и идентификация исследуемых обрапцов гллчонротоиноз

Гарантом успешного опредзления пространственной структура белка и гликопротекна методами оптической спэктроскопии является знание его истинного молекулярного ьоса, а не кажущихся молеку-лярны.'С масс, определенных БШ-электрофпрезо».-.

Задача определения истинного молекулярного ьеса гликопроте-инов решалась сравнительным анализом результатов УФ-спектроскопии (молярный показатель поглощения и состав ароматических аминокислот), полученгмх экспериментально для наших образцов и теоретических, рассчитанных согласно аминокислотной последовательности белкового компонента соответствующих гликопротеинов. При решении отои задачи проведён анализ исследуемых образцов гликопротеинов сралнением о известными, для которых установлена аминокислотная последовательность белкоього компонента. Необходимость зтого анализа вызьана высокой гетерогенностью исследуемых объектов, обусловленной полиморфипмом.

Результаты сравнительного анализа приведены в таблице I. При определении молярного показателя поглощения (¿^сп ^ исполь-зс :алась концентрация белкового компонента гликопротеина в растворе, измеренная модифицированным мзтодом Кьельдаля. Отношение ^зксп.и ^теор.• Равио° 1<1 Для АКТ и РЭА, свидетельствует о соответствии аминокислотной последовательности образцам и отсутствии в них примени, поглощающей в этой области. Это подтверждают данные по составу остатков ароматических аминокислот, полученные из второй производной УФ-спактров поглощения растворов АКТ и РЭА (табл. I). Дяя АКТ и РЭА истинные молекулярные веса ниже молекулярных масс, определённых БК^-электрофорезо^, на 27 и 16$ соотсетственно. Именно ети значения молекулярных весов АКТ и . РЭА будут далее использованы при расчёте алементов вторичной структуры методами оптической спектроскопии.

Таблица I.

Экспериментальные и рассчитанные характеристики онкофеталькшс глитопротеянев

1 ЯИЧОЛрО-

теи.ч*

¡¡27 3 /с 278 -"эксп.'бтеор.

Содержание аромат.

тирозин триптофан

Содержание белча3з %

Молекулярный вес в »На

углевсдная часть*1

гликопро-

5

теин

ЛИГ

РЗ А

ТСГС1)

ТСГС2)

ТСГ(З)

7СГ(4)

1,10 1,10 1,00 0,96 0,90 0,93

II 28

(II) (28) 19 119) 24 (24)

23 (24)

24 (26)

3 (3) 10 (10) (6) (8) (9) (8)

6 7 7 7

55,0 42,0

ее,5

68,9 6Э,0 69,7

',56,0) (47,0)

(58,0)

17.0 100,6

17.1

21.2 21.2 20,3

(16,6) (98,0)

(16.3)

(20.4)

(20.5) (20,7)

38,3 173,5

54.3 68,1

68.4 69,1

(45) (220)

(75)

Примечания: 1 - согласно .-.шикокислотчой последовательности вес белковой части молекулы в ^ равен: АКТ - 21,25; РЭА - 72,87; ТСГ(1) - 37,2; ТСГ(2) - 46,9. В скобках приведены значения:

2 - согласно аминокислотной последовательности;

3 - определено по методу Лоури;

4 - рассчитано в соответствии с моносахаридным составом;

5 - молекулярные массы, определённые ¿сб-электрофорезом.

Для ТСГ известна амимокйлотная последовательность белкового компоненте молекул 4-х видов. Дад каждой аминокислотной последовательности проведён сравнительный анализ экспериментальных и теоретических данных (табл.1). Из отношения &эксп<и следует, что аминокислотная носледспатсльность I более всего походит к исследованному образцу ТСГ. Однако молекулярный вес, рассчитанный ira эту последовательность, имеет низкое значение по сряьненню с молек-улярной массой (38Й). Для последовательности 2 отношение £„..„„ ниже 1,0 на величину погрешности спе-

ül.CiI. îtop.

ктральныг из.'лерениД, зато оцененный молекулярный вес более подходит к молекулярной массо. Поэтому исследованному образцу ТСГ с равной вероятностью мотет соответствовать как последовательность I, так и 2. При расчёте в^ориччей структуры ТСГ использованы молекулярные- носа, рассчитанные ;¿¿» обе последовательности.

2. Исследование пространственной структуры онколи: тельных гликопротеинов

ИК-спектроскопия

Для расчёта элементов вторичной структуры белкового компонента глшеопротешюв использован метод ИК-спектроскопии, основанный на аддитивности зкладов поглощения ¿-спирал-, /-структуры и неупорядоченной формы в контур пептидного поглощения полосы Амид I болкоь. Для применения overo метода к гликопротэи-нам проведен анализ влияния углеводного компонента на контур пегло'.цьния полосы Амид I и разработана методика количествен«. -го учёта углеводного поглощения.

'/¡{-спектры исследованных гликопротеиноь, снятые в растворе тяжелой воды, в области 1500-1700 см-1, (з,:о»т очистной ¡«акс.'лчум при 1633-1637 см~^. В качестве примерь га рис.! приредон IÍK-спекгр АЛГ.

Дли выделения а ПК-спектре гликоппотенпа пэлао-

цения кьобходпмо так ¡ra, как и в белке, вычесть поглощение боковых групп г.минокислстных остатков (рнс.1а-3) о^л;;пг от vjfMiKa, поглоч'чние углеводной части молекулы. Ил ::онос:а-ар'.'дных r.cT&TKOj, составляющих углеводную часть молекулы глкчзпроуеу.".", в области колебания Амид I поглощают остатки N -ацетилглякосП-чкна {Gic/' Ac) и -ацетил:(ейраминовой кислоты (NANA). Для оценки вкладе углеводного поглощен/л в ПК-спектр гличопротекна

А

g, М-1, см'1

0.2

ОД

1550

1650 см-1 1600

1650

1700

Рис Л. Анализ ИК-спектра АКТ в 0,05 М фосфатном буфере ( ?D с = ЗЛ5%1б~^М). р: I - экспериментальной спектр*, 2 - по глотание углечодов; 3 - поглощение боковых групп; 4 - пептидное поглощение. б: I - пептодное поглощение; 2, 3, 4 - f -структуре; 5 - -спираль; 6, 7 - неупорядоченная фою.ма.

сняты ИК-спектры отих моносахаридов в растворе тяжёлой воды в области 1500-1700 см-1. Спектр углеводного поглсиен.ш (рис, Са-2), рассчитанный согласно содержанию GlcKAcat еака в гликопротеине, имеет основной максимум при 1625 см"1. Интегральная интенсивность углеводного поглощения составляет для АКТ и ^А около Iftf-, для TQ' - около 9% от интегральной интенсивности полосы Акид I соответствующего гликопротеина. Углеводное поглощение и поглощение боковых груш аминокислотных остатков вычтено из контура поглощения Амид I гликопротеина. Контур оставшегося поглощения, отражающий пептидное поглощение, разложен на составляющие полосы, характерные для ¿-спирали, «-структуры и неупорядоченно.} форумы. Результаты разложения полосы пептидного t.o г лощен/л глико-протеино'в ка составляющие для определения элементов вторичной структуры приведены в таблице 2.

Содержание структурных форм определено отношением интегральной интенсивности (В) к интегральной интенсивности. состветсвул-

Таблица 2. Определение содержания элементов вторичной структуры онкофетальных гликолротсинов методом ИК-сиечтроскопии

элементы структуры см Д\>1/А, см--1 I В-Ю-4 1 ЬГ1см_'?| содержание структуры, %

АКТ

-спираль 1649 16,0 57 0,1 0,33 8+15

1610 12,0 25 0,9 ' 0,08

А-форма 1630 27,5 276 0,5 3,30 41,0

¿683 15,5 54 0,4 0,26

неулсряд. 1652 -10,0 158 1,0 1,53

форма [1668 20,0 50 0,4 0,37. 42,2

ГЗА

[1613 20,0 03 0,9 0,34

,5-форыа -|1633 29,0 210 0,5 . 2,72 50,0

(1688 16,0 20 0,4 0,10

чеупоряд. 1657 39,0 192 1,0 1,80

форма 1679 26,0 68 0,5 0,90 52,0

ТСГК

1620 20,0 50 " 0,9 0,26

./5-форма 1635 30,0 320 0,5 2,90 53,6

1690 20,0 36 0,4 0,22

неупоряд. 1660 35,0 180 0,8 1,67

форма 1675 22,5 56 0,7 0,35 45,0

результаты расчёта на последовательности I и 2 различаются на

аеП 100%-ному содержанию данной структуры. Для ¿-спирали к полученному значению добавляется 15$, являющиеся порогом чувствительности метода для этой структуры.

■ Круговой дихроизм

Спектр КД гликспротеина в бтетей УФ--области (рис.2а) обусловлен электронными переходами в остатках ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина, триптофана,- и в дисульфидных ■ связях. Наличие выраженной тонкой структуры спектров КД в блик- ■

А

о

С*} t

о

X

<—I

<х>

200

220

240

240

280

320 Л, им

Ряс.2. Спектры КД гликспротеинов к 0,01 М фосфатном буфете: а - ароматическая область. С - пептидная область. I - Aid', Z - F3A, 3 - TCP. i', 2', 3' - рассчитанные спектры'КД углеводного'компонента АКТ, FSA, ТСГ соответственно.

ней Уч-гбласти свидетельствует о существенной ассиметрии окружения бокозих групп названных грс;.'ат:1ческкх аминокислот, о rtecT-ксЯ фиксации и тек самым с хорошо развитой третичной стру/турч

г.такоггротеиьов.

Спектр КЗ гликопротепка в д^хой У^-области (240-190 им), в которой,"в основном, происходят электронные переходы в пептидных rnvrmax, нос-т карман®, о его вторичной структуре. Аля^ «уртчУккпЯ хатктернрт;:ки ч^ттос? белкового

7а"7личопротс;'нов «гольаепама juacerfiwemw белков по спектра» ЗД ferns«*»« и Дт.онеона ( K^vnian. .r^sor.,<i9=i>. Сиглн.-но ^ K*:cwM«a:.!« НД-спектр АКТ (рис.26-1) соответствует ртзрич-но? с*руктур'-, соя-рта'-» Г««:«» --спирали и хоют*»-..-«»

Р -структуры. Спектр КД РЭА (рис.25-2) соответствует полностью р -структурированной вторичной структуре. Форма спектра КД ТСГ (рис.26-3) необычна для болкоц и подобного спектра е указанной классификации нет. Поэто~1у оценить качественно вторичную структуру ТСГ не представляется возможным б рамках етой классификации,

Количественное ог/рядр^оние элементов зторж'ней структуры белкпБого компонента гяикопротеиков по спектрам КД в далекой УФ-области проведено по методу Прокенчера и Глокнера, который основывается на спектрах 1\Ц реальных белкез с известной вторичной структурой. Для применения этого метода к гликспротеинам с высоким содержанием углеводного компонента необходимо оценить вклад углеводной части молекул в спектры КД в далекой УФ-области. Для оценки отого Еклада сняты спектры КД С1сКАс и ШША, вносящих 'вклад в оптическую активность данной области КД-спектра. Спектры ЧД углеводного компонента представлены на рис.26. Спектр КД углеводного компонента гшчли ¡;з спектра КД гликолротгина и оставшийся спектр проанализировали по методу Пропенчера и Глопюрп. Результаты расчета элементов вторичной структуры пли^опротсинов приведены в таблице 3.

Таблица 3. Содержание элементов вторичной структура белкового компонента гликопротеилов (?), рассчитанное по спектрам КД

/ 9- -спираль .3 - структур' ^-иагиб "оставпаяся'

АКТ 23,0 - 38,0 19.0 20,0

ВД-2 Т*"Л * 21,0 РОА о.о — 39,0 69,0 18,0 14.0 ?2,0 17,0

¡\М 0,0 ТСГ 1,0 — 72,0 52,0 15,0 24,0 23,0

К,"-2 0,0 50,0 ,

* - НД-1 рас •лег по экспериментальным спектрам; :.Д-: - ■ .О.Д "Ч-Т

с уче том ьхлада углеводов.

Из 18 ,б.-.и ¡•¿.' 3 следует, что учет вклада углеводгого

Г.Г!>К 0ПГ) згекнэв приводит к перерас пртдр л с (»•.;■" с: од": х-амич

о; -■■урн" 01 ВТО ргчноЯ структуры на 1-4?, "то находит"*1 ь ГТрсД*.":'.

ошибки метода. Поэтому складом углеводного компонента в спектр КД гликопротеина при расчёте элементоз вторичной структуры по методу Провенчера и Глокнера можно пренебречь.

В заключение этого раздела следует откети'.о, что оценка склада углеводного компонента в спектр КД глшсопротеига, основанная на аддитивности вкладов 01е;.тАси ПАПА, является только первым приближением. В действительности рассчитать вклад ;;к>бого компонента в спектр КД молекулы - задача невероятно сложная. П^н решении задачи мы исходили из литературных данных о хорошем соответствии экспериментального и рассчитанного по содержанию углеводов спектров КД углеводного компонента АКТ.

Методы предсказания по аминокислотной последовательности

К сожалению, в литературе отсутствуют данные рентгеност-руктурного анализа вторичной структуры онкофэтальных гликопро-теинов. В этой связи, для сравнения полученных нами данных по вторичной структуре белкового комонента АКТ, РЭА л ГСГ использовав предсказательный метсд Чу и Фасмана (4-40 и метод Дафто-на и Хайдера (Д-Х) - модификация первого. Оба метода основаны fia применении конфермашюннкх параметров аминокислот, характеризующих вероятность их пребывания в различных структурных формах. Кроме тоге, для АКТ и РЭА сделин расчет вторичной структуры по методу Финкелыптейна и Птицнна (Ф-П), осноранноку нэ. стереохи-мических принципах сворачивания полипептндлоЛ цепи белковой w ■ лекулы в глобулу. Результаты расчёта элементов вторичной структуры белкового компонента гликопротеиноь методами пре дсказания ггриьедены з таблице 4. Расчёт вторичной структуры ТСГ сделан на последовательности I и 2. Данные методов Ч-Ф, Д-Х и Ф-П для развёрнутой цепи по вторичной структуре АКТ и ГЭА хорово согласуются. В состоянии глобулы во вторичных структурах этч.х гликопроте-инов уменьшается доля упорядоченных структур на 5-155? л увеличивается содержание неупорядоченной фор»™ на 20-30? (табл.4). 4 По данным метода Ч-Ф составлены схемы молекул исследуемых гликопротеинов, в которых выделены вероятностные области /-спирали, -структуры, JS-изгибов и неупорядоченной формы. В качестве примера на рис.3 приведена схема молекулы АКТ.

Таблица 4. Содержание элементов вторичной структуры гликотгро-теинов {%), рассчитанное предсказательными методами

У.етод * «1-спираль ^-структура 6-изгиб неупорлд. с

4-5 27,6 АКТ 41,4 15,5 15,5

д-х 24,9 40,3 15,5 19,3

Ф-П-1 26,5 30,0 15,0 26,5

ф-П-2 12,0 7,5 РЭА 24,0 51,6 7,0 24,5 57,0 16,4

А 7,0 45,2 25,7 22,2

Ф-П-1 7,0 42,5 26,0 24,5

Ф-П-Я 2,0 ТСГ(1) 3*1,0 21,0 43,0

Ч-Ф 5,6 46,2- 26,2 22,0

Д-Х 3,3 ТСГ (2) 15,9 27,5 23,3

Ч-й 7,0 47,5 25,5 20,0

д-х 8,1 43,4 23,1 25,4

- для развэрнутой молекулы; Ф-П-2 - для глобулы

-лтыг-чт-кым'п.

1 (

о—отатаг«гг-

Рис.3. Схема уолекулн АКТ. тапт- ¿—-"пираль, нш- /-структура,

а - £ -изгиб;--неупорядоченная формь, {+) гедрофобные

•/.тетки, (-) - гидрофильные участки. ] - места посадки углеводных цепей.

кхвестно, что аминокислотная последовательность Авп-Х-8ег/ ОЪг является необходимым условием для присоединения И-гликози-лимидных углеводных" цепей на полипептвдкую цель в гликопротеияе. Проведенный нал; и анализ конформаиил вероятных мест глико&илиро-вания почкпептпдной цепи АКТ, Р&А и ТСГ показывает, что около 6С$ из них являются областями /-изгибов. Согласно данным ней-

тронного рассеяния АКТ, приведенным в литературе, углэводные цепи расположены на поверхности белкового кора молекулы. Поэтому -изгибы, которые являются предпочтительной кснформацией полипептедной цепи в местах присоединения углеводных цеп^й в молекуле гликопротепна, должны быть поверхностными при сворачивании полипептидной цепи в глобулу. В связи с этим, представляло интерес определить внутренние и поверхностные учг-стки пслипептвдной цени с состоянии глобулы. Д::я этой цели испольсо--зил метод Кайта и Дулитла,заключающийся в расчете относительной гидрсфобноети и гидрофильности амиьокислотчьгс остатков. По результатам этого метода белковые ггасг.ч исследованных. глчкопро-теинов характеризуются наличием больших гидрофилы их участков, которые, преимущественно, расположены в областях неупорядоченной формы и.р-изгибов (рис.3). Это предполагает, что они должны быть поверхностными при сворачивании полипептидной цепи гли--копротяина в глобулу. Вероятные места гликозилированил полилеп-тидн'й цепи (Аоп-х-Зег/ТЬг), расположенные а основном в области /-изгибов, на 85-90^ являются гидрофильными участками в соответствии с расчетом по методу Кайта и Дулитлн, что согласуется с данными нейтронного рассеяния, свидетольствуюшими о поверхностном расположении углеводных цепей в гликопротемнд.

Сравнительный анализ прадсказательпь'х :1 сляктп'злъньгх методов исследования онкоюотальних 'Ушкогротг.'шов

Полученные данные по вторичной структура бзлковои части молекул АКТ, РЭА и ТСГ двумя независимыми методами оптической спектроскопии (ИК и КД) и методами предсказания по аминокислотной последовательности позволяют провести сравнительный анализ ц оценить возможность их прикензнкя для определения кенформации белкового компонента гликопротеинов с высоким содержанием углеводов. Результаты оценки вторичной структура гликопротеинов методами ИК и КД имедат хорошее согласие (табл.2 к 3). Пр.! оценке вторичной структуры методом ИК-епеатросяопии необходимо учитывать поглоцение углеводной части молекулы; з случае ОД лкладом углеводной части молекул можно.лрзкебрачь.

Результаты предсказания вторичной cтpyктypN белковой части молекул исследованных гликопротеинов методами Чу-Тасмана, Д&ф-го-

на-Хайдера и Финкельштейна-Птицына для развёрнутой цепи согласуются с результатами методов КД и ИК-спектроскопии (табл.2, 3 и 4) Результате метода Финкельштейна-Птицына для глобулы отличается от результатов вышеуказанных методов пониженным содержанием упорядоченных структур. Метод Финкельштейна-Птицына для глобул: учитывает взаимодействие между боковыми группами аминокислотных остатков полипептвдной цепи в молзкуле белка. В молекуле глико-протеина, кр;ле боковых групп аминокислотных остатков, имеются углеводное цепи, которые, вероятно, влияют на процесс сворачивания полипептвдной цепи в глобулу. Поэгок/ представляется нецелесообразным использование метода Финкедьтгейна-Птицина для глобулы при оценке вторичной структуры гликопротеинов с высоким содержанием углеводов.

Хорошее согласие в результатах оценки элементов вторичной структуры белкового компонента гликопротеинов спектральными и предсказательными методами показывает принципиальную возможность приленснил методов УФ-, ИК-спектроскопии, КД, а также методов Чу-Фасмана, Дафтона-Хайдера и Финкельштейна-Птицына для развёрнутой цепк к количественному определению белкового компонента вторич.чых структур гликопротеинов.

Вторичные структуры РЭА и ТСГ характеризуются высоким содержанием £-структуры (более 50$). Сходство вторичных структур этих гликопротеинов обменяется высокой гомологией (6С%) аминокислотных посчедозательностей их молекул. Вторичная структура АКТ, наряду с >-структурой, содержит около 25$ ¿-спирали.

3. Анализ информационных изменений в онкофетальных глико-протеинах методом кругового дихроизма

Зависимость конйорыацчонной стабильности оккофетьлыдде гликопротеинов от изуензия температуры и рН раствора

Температурные исследования спектров КЦ гликопротеинов в области 320-24. нм (рис. 4) показывают, что в третичной структуре ТСГ при емпературе 45-50°С, АКТ и ГЭА при 60-70°С наступает кон-формационный переход. До конформационного перехода в спектрах КД гликопротеинов ьаб.шод8ятся незначительные изменения эллиптичности по,юс, которые являются полностью обратимыми; в точках конфор-

Kl 293

0 191. 202

К 195

20

60

40

0

"з \

. л

-12

12

j__

30 50 70сС

30

50 70°С

Рис.4. Изменение эллиптичности полосы при 293 ни о?' темпеоатуры: I -АКТ; 2 - РС-А; 3 - 7СГ.

Рис.5. Изнене.чко эллиптичности полосы при 195 нм (I - AKV), при 20? нм (2 г РЭА), при 191 ге.; (3 - 1СГ) от температуры.

мацнонногэ перехо.па .наблюдается резкое падение эллкггти-шости полос с сглктрэ;:, '-:то оовд^тельетгуе? и "плавлении" треттпг-^Л структуры гаикопротеинов, "осле информационного перехода при 60 С для ТОГ и 70°С дчп РЭА и АКТ происходит полное разрушение трет:мю;1 структуры.

Не ряду с "плш?ление:<" структуры при поаы^нии

температур.'! происходи:1 разруяен/е йтортной структуры глико-.тротоиног, о чем свэдн?е.яьствумт стктры ¡И ь области 2-10 -190 (jiHO.ü;. Кпч и фдучяч троти !нс;! структуры, наим^ньсей T'"'i.'i!op:i гурчо" стабильность» сОладч?1 :1?ор1Г-1чая структура ТСГ. Точкг^ .>'oii4:.op,''i;;.;oiiiioro по ;>'.-.-р;пной структур.» ТОГ

являр гея темгглратура 52°ü, AIC - <32°С, ^.-А - С-«°0. До эт;:у пг-рагуп cowi-m::^ -о г.'ор.тнйге с?рук-.-у.л:< ^лигэлротсинс::

¡ОТЧЯ üajw.av

!<7optr'Hoft сгрукгурь ' ••••n*p:s-:ypiio-*<*iiarypi<f эваипч

образцов гликопротекноэ проаедена по методу Провончера и Глок-иерр. Б области конфсркацконного перехода во вторичной с-'рук-тург АКГ происходит уменьшение содоржани.ч ¿-спирали на 9% и такое г.е увеличение доли неупорядоченной формы; ьо вторичных структурах РЭА и ТОГ происходит уменьшение доли _б -структуры (20% и 10?' соответственно), которая полностью исчезает через дзое суток после охлавденил раствора.

рН-исследовании рас'всрои гликопротеинов по спектрам ОД приведены в кислой и щелочной областях. В КД-спектрах РЭА и ТСГ в области 320-240 им (рис.6) при рН от 4 до 10 наблюдаются незначительные изменения эллиптичности полос, что свидетельствует с стабильности третичных структур в этой области. Яри рН 4,0 происходит разрушение третичной структуры о.их глнкопротеянов.

[0] 293

[6]

19I, 202

М

195

ср о

к

4

•1 3 12 рН Рпс.о. Из'-е'гг'ние эллиптичности полосы при 293 нм от рН среды: I - ЛИГ; 2 - РЭА; 3 - ТСГ.

-■>12

12 сН

Рис.7. ¡¡злмпение эллиптичности полосы при 19т «л (I Г02 нм (2 - РОА), при 191 нм (3 - ТСГ) от рН среди.

пои

При титровании растворов в щелочную область после рН 10,С наблюдаются значительные изменения в ВД-слектрах РЗА и ТСГ. Следует отметить поведение отрицательной полосы при 245 нм в щелочной области. При рН 10,0-11,0 эллиптичность этой полосы падает, при рК 11,0-12,0 в ВД-спектрч ТСГ появляется положительная полоса высокой эллиптичности при 249 нм, в ВД-спектре РЭА-при 252 нм. Такая рН-зависимость эллиптичности полосы при 245-нм позволяет отнести её к переходам в остатках тирозина молекул РЭА к ТСГ.

В отличив от РЭА и ТСГ КД-спечтри АКТ в области 320-240 нм более чувствительны к изменению рН растзира. 3 облает!! рН 4,29,0 в спектре каблюдактся значительные изменения эллиптичности полос, которые являются полностью обратимыми поело обратного титрования до нейтрального рН. Полоса ионизированного остатка тирозина в ДЦ-спектре АКТ образуется при 243 нм после рН 10,0,

Спектры КД гликопротеиноз в пептидной области (рис.7) при рК 4,0-10,0 сводетельствуюг о высокой стабильности вторичных структур. Ропкие изменения в спектрах наблюдаются при рН пике 4,0 и выси 10,0. Вторичная структура РЭА отличается наибольшей устойчивостью к изменению рН. По данным расчёта злементоз вторичной структуры рН-денатурированных гликопро.теиногз, проведённым по методу Проьенчера и Глскнара, определены интервалы рН, при которых конформг\ционные изменения полностью обратили. Для АКТ этой областью является рН 4,0-11,0; для РЭА -- рН 3,0-11,0; для ТСГ - рН 3,5-9,0. Как при температурной, так и при рН денатурации, ТСГ, содержаний наименьшее количество углеводов (30^), более подвержен воздействию среда, чел АКГ и РЭА с содержанием углеводов 44$ и 50% соответственно. Вероятно, козалентно-евяза-нные углеводные цепи в гликопротзине стабилизируют кенформац.т молекулы.

Модификация остатк-ов триптофана в молекулах онкофетальных антигенов

Для выяснения характера связи мезду пространственной структурой и антигенной активностью РОЛ и ТСГ проведена химическая модификация И-бромсукцинимидом остатков триптофана в эт;гх молекулах. Контроль га изменением пространственной структуры ь:о-

лекул гс'А л ТСГ проведён по спектрам КД.

По методу второй производной УФ-спектра поглощения определено, что в молекуле РЭА содержится 10 остатков триптофана, но нж по оценкам метода ТГЩС (температурно-пертурбационная дифференциальная спектроскопия) молекулам вода доступны 3-5 остатков пои рН 7,2-4,0. Модификации поверхностных остатков триптофана проведена в ацетатном буфере (рН 4,0); внутренних - в растворе 6 М г^лнидингидрохлорида (рН 4,0), где происходит полное развёртывание молекулы.

Модификация трёх остатков триптофана в молекуле КЗ А в ацетатном буфере приводит к незначительным изменениям в третичной структуре (рис.8) и не изменяет вторичной структуры к антигенной активности.

[Э]

234

[9]

292

со

I

■ о

4 4

Ч 2

Рис.8. Зависшости эллиптичности полос ?34 ни (1,2) и 292 им (2,4) е КД-споктрах РЭА от числа остатков триптофана, модифицированных в 0,01 М ацетатном буфере (1,3) и в 6 М гуанидингкдрохлорвде (2,4).

число остатков 2 4 6 триптофана

Суцесавениоз изменение эллиптичности полос при 292 и 234 га наблюдается при модификации четвёртого и пятого остатков. Это дает основание предположить, что они частично погружены во внутреннюю часть молекулы. Вторичная структура при этом не меняется. Антигенная активность уменьшается на 10-15$, Вароятг>, четвёртый ил1. пятый остаток входит в антигенные детерминанты. Нарушение'вторичной структуры наблюдантся лишь при модификации лести и более остатков триптофана (рис.9). При этом значительно меняется спектр в области 320-230 нм (рис.8), антигенная активность уменьшается ещё на 40Й.

Füg. S. Спектры КД растзоров РЭА и его производных: 1 - в 0,01 М КН2Р04; 2 - в 0,01 И КНоР04 поело диализа из раствора б М гуа-ницингидрохлорида (слектр РОЛ э 0,01 М ьпОЛс , где шдифиципова-ио 6 остатков, совпадает со спектром 2);3,4 - в 0,01 К KHrPOj

после диальза из раствора б М гуаиидлнгидрошгорида, где модифицировано 3, 6 остатков соответственно .

X им

При модификации остатков триптофана в 6 М гуалндингидосхло-риде равнопароятко могут быть модифицированы все 10 остатков. Модификация трёх остатков в развёрнутой ыолекуле РЭА с последующим диализом з фосфатном буфере приводит к изменениям как в третичной, так и во вторичной структурах. Антигенная активно *.ть при STOM уменьшается ьа 40% относительно натизнэго образца. При модификации пгасти остатков триптофана в 6 М гуанидингидрохлори-де с последующим дизлмзом происходит полное разрушение пространственной структуры молекулы РЗА (рис.8,9), Антигенная активность при этом уменьшается из ВЛЗ.

Таким образом, внутренние остатки триптофана играют рахнуч роль л формировании пространственной стгуктуры молекул» Pi'fi. Антигенная активность является более чузсгзителыюЯ к изм«?ийг;иям в трет^г-ной структуре. Полученные доьны^ указылавт на значительную з^роятг.ссть топографической природы большинства пнгиг?чн:;х . детеру.'гнант в PJ,\.

Ь молекул? ТСГ содгр-чится б остатков триптофана; при 7,2-4,0 г,- натчнно:.* ТСГ на поверхность зкочонировано 2 uci-wui тригггсфдн!. В КД-егтктре ТСГ в области .520-220 им наибо.:«?'« чур-

120

т

о

Рис. 10. Зависимость эллиптичности полосы при 235 нм ч Х^-спектре ТСГ от числа модифицированных остатков триптофана в 0,01 Ы ацетатном буфере (рН 4,0).

число остатков

I

3

триптофана

ствигельной к добавксм к-бромсукцинимида является полоса при 235 нм. При модификации одного остатка триптофана эллиптичности этой полосы уменьшается на 33% от натинмой (рис., 10). Антигенная активность при этом уменьшается на 10'/.. Во вторичной структуре не наблюдается каких-либо изменений. Модификация второго и последующих остатков приводит к изменения как третичной, так и втсричнсй структур молекулы ТСГ. Эти изменения в пространственной структуре ТСГ сопровождаются снижением ентигслаой активности до 5052. Эти результаты показывают, что, по крайней мере, один поверхностный остаток триптофана входит в антигенные детер-минанть:.

2Г' ВЫВОДЫ

1. Показана принципиальная возможность применения методов ИК-спектроскопии, УФ-спектроскопи.ч и КД для количественного определения элементов вторичной структуры белкового компонента гликопротеинов о высоким содержанием углеводов.

2. Предложена методика учёта вклада углеводного компонента в ИК-епектр гликопротсина в области колебания Амид I.

3. При определении содержания элементов вторичной структуры белкового компонента по методу Провенчера и Глокнера вкладом углеводных цепей в спектр ИД гликопротеинов можно пренебречь.

4. Методом УФ-спекггроскопии определены истинные молекулярные веса исследуемых гликопротеинов.

5. При расчёте вторичной структуры опкофетьльных гликопротеинов показано, что РЭА и ТСГ характеризуются высоким содержанием £ -структуры;'для АКТ характерно,наряду с JS-структурой, наличие I -опирали.

6. Определены критические температуры, Еыше которых конформаци-онные изменения во вторичной структуре белкового кохяюнента онкофетальншг гликопротешгоз становятся необратимыми.

7. Показана высокая конформационная стабильность онксфетальных гликопротеинов в широком диапазоне pH раствора; определены значения pH, при которых конформационные изменеия являются полностью обратимыми.

8. Установлено влияние химической модификации остатков триптофана на изменение пространственной структуры онксфетальных антигенов и их антигенную активность. Получены денные, указывающие ка топографическую природу большинства ана'игенных де-

- _терминант молекул PSA и ТСГ.

Основное содержание диссертации изложено в следуюших

V публикациях:

1. Moroz 3..V,, Glazunov V.P., Valtorina T.I., Oainolcov S.E., Pavlenkö A.F., Ovodov ïu.S. Spectral and lmcunooheinice.1 studies of spatial structural features and djnaaios properties of Trophoblast glycoprotein//Abstr. Ill International Conference on Chemistry and Biotechnology of dloiobycaly Active Producta. Sofia. 1933. P. JA-3,3.

2. Морог С.В., Глазунов В.П., Вакорина Т.И., Павленко А.Ф., Одиноков С.Е., Оводов Ю.С. Исследование взаимосвязи пространственной структуры и антигенной активности трофобласт-специфического Jij-гликопротеина // Биоорган, химия. 1987. T.I3, » 4. С.519-527.

3. Пгвленко А.Ф.", Мороз С.В., Вакорина Т.И., Глазунов В.П., Одиноков С.Е., Оводов Ю.С..Локализация антигенных детерминант i.a молекуле трофобластспецифического 3 j -гликопротек-на // Биоорган, химия. 1987. T.I3, W II. C.I535-I54I.

4. Глазунов В.П., Вакорина Т.И., Одиноков С.Е.. Куршса А.В., Павленко А. Ф. Роль остатков триптофана s проявлении антигенной активности РЭА // Виоорган. химия. 1985. Т.14, !Р 9, C.II66-II70.

5. Вакорина Т.Н., Глазунов В.П., Ньбиуялин А.А., Одиноков С.Е, Информационный анализ белковой части гликопротеинов с высоким содержанием углеводов // Тез. докл. У1 Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков, 1988.

• С,95-96.

6. Pavlenko А.P., Koroz S.V., Glazuuov V.P., Yakorina T.I., beloirorsovi* N.I., Odinolcov S.E., Ovodov Yu.S. Trophoblast-spesific .^-glycoprotein. Ita spatial structure and localization of antigenic determinants // Eumcr Biology.19SS. V.9, . f. ¿49-262.

f