Кинетические закономерности и механизмы взаимодействия лигандов с рецепторами. Ацетилхолиновый рецептор мускаринового типа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ЯРВ Яак Лембитович

УДК 541.124:577.171.6

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ С РЕЦЕПТОРАМИ. АЦЕТИЛХОЛИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР МУСКАРИНОВОГО ТИПА

02.00.15 Химическая кинетика и катализ

Диссертация

на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва 1990

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии и на кафедре органической химии Тартуского университета.

Официальные оппоненты доктор химических наук профессор В.П.Торчилин доктор биологических наук профессор А.Л.Болдырев доктор химических наук С.В.Зайцев

Ведущая организация - Институт химической и биологической физики АН Эстонской ССР.

Защита диссертации состоится " " .......... 1990 г. в

.... час на заседании специализированного Совета Д 053.05.76 по химическим наукам при Московском государственном университете по адресу: 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Диссертация разослана " " ............. 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук _ .Д.Ы ■ • Р.Е.Айсина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы■ Центральное место в рецепторной теории передачи информации в живых организмах занимает представление о взаимодействии эндогенных и экзогенных лигандов со связывающими центрами рецепторов. На этой стадии обеспечивается селективность действия рецепторных систем, а также открывается путь к модуляции или блокированию физиологически активными веществами процесса передачи информации. Заложенные здесь практические возможности целенаправленного влияния на регуляторные процессы живого организма объясняют актуальность исследования рецептор-лигандных взаимодействий и интерес к созданию "фармакофоров" для оптимизации и прогнозирования структур физиологически активных веществ. С этой целью интенсивно развиваются количественные методы анализа взаимосвязи активности и строения физиологически активных веществ,включая конформационный анализ молекул лигандов с помощью ЭВМ.

С другой стороны, развиваются и экспериментальные возможности исследования рецептор-лигандных взаимодействий. С начала семидесятых годов широкое применение нарел метод радиолигандного анализа, что привело к появлению в литературе большого числа экспериментальных данных, полученных в равновесных условиях связывания лигандов с рецепторами. При этом, однако, не раскрывается механизм процесса и нельзя установить физическое содержание вычисляемых параметров, что уменьшает информативность и надежность результатов анализа.

Кроме того, анализ собранного нами из литературы банка данных по взаимодействию лигандов с мускариновым рецептором показывает, что в практике часто не соблюдается требование о равновесном состоянии системы, что приводит к дополнительным трудностям интерпретации результатов. Все это в значительной степени мерало реализации фундаментальных и практических задач в области рецепторологии.

Выходом из сложившейся ситуации является развитие кинетической теории рецептор-лигандных взаимодействий и анализ механизмов этих процессов методами физической органической химии. Только при этом можно ожидать прорыва в сторону более глубокого понимания физико-химических основ рецепторных механизмов, включая и молекулярные основы селективности их функционирования .

В данной работе на примере мускаринового рецептора проведен комплекс кинетических исследований с целью выяснения

молекулярных механизмов реиептор-лиганяных взаимодействий. Изученный рецептор распространен в. центральной и периферической нервной системе и участвует в регуляции ряда важных физиологических процессов. В связи с этим фармакологические свойства этой рецепторной системы подробно описаны и соответствующие представления послужили отправной точкой для нарих исследований, проводившихся с конца семидесятых годов и положивших начало практическому применению кинетического подхода для исследования механизма взаимодействия лигандов с рецептором. Далее эти методы исследования нарли применение и в других лабораториях мира в целях изучения закономерностей взаимодействия лигандов с рецептором.

Конкретные цели и задачи исследования связаны с физико-химическим изучением механизма и специфичности лиганд-рецеп-торных взаимодействий, а также с выявлением некоторых структурных и функциональных особенностей мускаринового рецептора из центральной и периферической нервной системы. Основным подходом явилось последовательное применение методов химической кинетики. Аля достижения поставленных целей был решен ряд фундаментальных и практических задач, к которым можно отнести следующие.

Во-первых, определение физико-химических свойств лиганд-связываюиего центра мускаринового рецептора и выявление закономерностей солюбилиэации рецелторного белка.

Во-вторых, установление кинетических закономерностей связывания антагонистов с мембранным рецептором и исследование эффектов температуры и концентрации электролита на кооперативный характер этого процесса. Кроме того, изучена кинетика диссоциации комплексов рецептора с антагонистами и разработана многостадийная кинетическая схема рецептор-лигандного взаимодействия.

В-третьих, исследование кинетических закономерностей взаимоотношения агонистов и антагонистов при их связывании с мускариновым рецептором.

В-четвертых, изучение взаимной зависимости свойств ре-цепторного белка и биоМембраны и определение роли липидного окружения рецептора в кооперативном механизме связывания лигандов.

В-пятых, на основе разработанных кинетических схем рассматриваются вопросы взаимоотношения строения и активности мускариновых лигандов. Составлен банк литературных данных, содержаний более 6000 отдельных констант диссоциации для 400

2

взаимодействующих с мускариновым рецептором венеств. На вазе этого банка данных проведен анализ современного состояния и тенденция развития физико-химической рецептологии на частном примере мускаринового рецептора.

Научная новизна работы связана с созданием нового научного направления, заключающегося в исследовании механизма и специфичности рецептор-лигандных взаимодействия методами химической кинетики и количественного анализа эффектов строения и среды на теоретической основе принципа линейности свободных энергий реакций.

Разработаны методы изучения кинетики связывания радиоактивных и нерадиоактивных лигандов с мембранным и солюбили-зированным рецепторами и диссоциации рецептор-лигандных комплексов. Впервые проведено систематическое исследование кинетики этих процессов сравнительно для мускариновых рецепторов мозга, сердца и тонкой кирки крысы.

Доказан многостадийный механизм связывания антагонистов с мускариновым рецептором мозга, сердца и тонкой кирки крысы, включающий ряд медленных стадия изомеризации рецептор-лиганд-ного комплекса. Для рецепторов мозга и сердца обнаружен факт кооперативной регуляции скорости комплексообразования и доказано существование разных лиганд-связывающих центров на мембранном рецепторе. Систематически изучена зависимость кооперативного эффекта от температуры и концентрации электролита, что позволило более детально охарактеризовать физико-химическую природу обнаруженного феноменона.

Доказан неконкурентный характер связывания агонистов и антагонистов с рецептором, что свидетельствует об образовании тройного комплекса в этом процессе.

Измерена кинетика химической модификации функциональных групп, контролирующих лиганд-связывеюаие свойства мускаринового рецептора, с целью получения количественных параметров для характеристики доступности этих групп в мембранном и солюбилизированном рецепторах. Получено доказательство участия -БН и -СООН групп рецептора в определении его лиганд-свя-зывающих свойств и -ЗЗ-группи при стабилизации активной кон-формации рецепторного белка.

Разработан подход к изучению сольватационных свойств лиганд-связываюиих центров белков с применением иона N,И-ди-метил-2-фенилазиридиния в качестве зонда. Установленные для сольволиза этого зонда количественные закономерности влияния среды дают возможность охарактеризовать сольватационные

3

свойства в лиганд-связывающих центрах белков.

В работе исследовалась функциональная взаимосвязь муска-ринового рецептора и биомембраны путем сопоставления свойств мембранного и солюбилизированного рецепторов, в том числе активационных параметров для инактивации этих препаратов. Применение биоспецифических УФ зондов показало, что взаимодействие лигандов с мускариновым рецептором изменяет микровязкость биомембраны.

Установленные кинетические закономерности впервые дают возможность обсудить эффекты строения лигандов на отдельных стадиях их взаимодействия с мускариновым рецептором. В рамках данной работы был составлен уникальный банк литературных данных радиолигандного анализа, охватывающий более 6000 констант диссоциаций для препаратов мускаринового рецептора из разных тканей. Обобщение этих данных позволило продемонстрировать несостоятельность одностадийной равновесной схемы для связывания с мускариновым рецептором хинуклидинилбензилата, наиболее часто применяемого лиганда в опытах с этим рецептором. На базе собранного материала дана оценка современному состоянию и тенденциям развития физико-химической рецеп-торологии на частном примере мускаринового рецептора.

Практическая значимость работы состоит в том, что в ней сформулирован ряд общих подходов к исследованию механизма взаимодействия лигандов с клеточными рецепторами, представляющих интерес для целенаправленного поиска новых физиологически активных веществ. Кроме того, многостадийный механизм связывания лигандов с рецептором имеет, очевидно, более общую распространенность и представляет интерес при исследовании других рецепторных систем. В работе проведен синтез радио-лигандов, меченных тритием до высокой удельной радиоактивности, что отменяет необходимость в импортных препаратах для научных и практических целей. Составленный банк данных, допускающий автоматизированный поиск информации на ЭВМ по необходимым признакам, является уникальным справочным материалом и будет включен в состав пакета экспертных систем, составляемых фирмой "СотриВгид", Венгрия. Результаты данных исследований внедрены в практику при выполнении планов научно-исследовательской работы Тартуского университета. Результаты работы и теоретические обобщения по механизмам рецептор-лигандного взаимодействия используются в преподавании основ физической биохимии на химическом отделении Тартуского университета.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования данной работы был ацетилхолиновыя рецептор мускаринового типа (мускариновый рецептор) коры больших полушарии мозга, сердца и тонкой кирки крысы. В опытах использовали суспензии мембранных фрагментов в буферных растворах,а также препарат согаобилизированного рецептора мозга. В отдельных опытах использовали синаптосомы коры мозга крысы. Связывание радиолигандов с мембранным рецептором определяли на стекло-волокнистых фильтрах фирмы Whatman (GF/B и GF/C). Солюбилизированный рецептор определяли методом гель-фильтраций на миниатюрных колонках Sephadex G-50. Следует отметить, что осе эти методики были приспособлены к проведению кинетических измерений методом отбора проб.

з

В работе использовали коммерческие препараты L-[ Н]хи-

3 3

нуклидинилбензилата (30-40 Ки/ммоль, L-[ Н]ХБ) и L-[ Н]метил-

з

скополамина (32 Ки/ммоль, L-[ Н]МеСА) фирмы "Amersham", Анг-

3 3

лия. L-[ Н]Мегилхинуклидинилбензилат (32 Ки/ммоль,L-[H]МеХБ)

3 3

был нами синтезирован метилированием L-[ Н]ХБ, [ Н]метил-

3

пиперидинилбензилат(72 Ки/ммоль,[ Н]МеПБ) был любезно предоставлен проф. Т.Бартфаем (Стокгольмский университет). Другие лиганды были коммерческие продукты, либо синтезировались в нащей лабораторий, либо предоставлялись для исследования проф. Н.Н.Годовиковым (ИНЭОС АН СССР, Москва).

1.1. Солюбилизация рецептора

Из исследованных нами 15 детергентов (Triton Х-45,100, 102,114,165 и 405, Tween-20,40,60 И 80, додецилсульфат, холат и дезоксихолат натрия, CHAPS, дигитонин) для солюбилизации мускаринового рецептора применим дигитонин, дающии максимальный выход солюбилизации до 50*, и CHAPS о выходом до 10*. Условия солюбилизации оптимизировали варьированием температуры и длительности обработки мембран детергентом,а также отношения концентрации белка и детергента. Комплекс рецептора с

3

L-[ Н]ХБ солюбилизируется кроме дигитонина и CHAPS такте детергентами Triton Х-100, 102, 114 и 165 с выходами до 50*. Соединения ряда Tween оказались неэффективными, хотя они хорошо солюбилизируют другие белки мозговых мембран. Рецеп-торные частицы в мицеллах дигитонина или Triton Х-100 элюиру-гатся при гель-хроматографии в виде симметричных пиков и характеризуются стоксовыми радиусами 58Я и 4бХ, соответственно. Реиепторный белок удалось очистить афинной хроматогра-

фией до 1000 раз по сравнению с исходным дигитониновым солю-билизатом. Эта процедура, однако, не оказалась тривиальной в связи с малой скоростью диссоциации рецептора из комплексов с афинными сорбентами, синтезированными из з-(2'-аминобенз-гидрокси)тропана, рекомендованного К.Хага и Т.Хага (J.Biol. Chem.,1983) в качестве афинного лиганда. Емкость сорбента определялась структурой и длиной "ножки" и оказалась максимальной в случае цепочки из 12 звеньев:

-NH(CH2)gNHC(0)(CH2)2C(D)-l. Из этого афинного сорбента удалось при 25°С и в присутствии 1,5 нМ ХБ вытеснить в течение 2 часов 10* связанного с гелем рецептора, а в течение 12 часов выход элюирования увеличился до 20*. Поэтому афинную хроматографию не удалось применить для рутинной очистки рецептора в целях его использования в кинетических измерениях. Резюме. Оптимизированы условия солюбилизации мускаринового рецептора коры больших полушарий мозга крыс, изучены возможности очистки рецептора афинной хроматографией и установлены стоксовские радиусы солюбилизированных рецепторных частиц.

1.2. Функциональные группы, контролирующие связывание

антагониста с рецептором.

По данным литературы химическая модификация SH-,SS-,NH2-и соон'-групп мускаринового рецептора приводит к икгиаированию части лиганд-связывающих центров, что было принято как доказательство химической гетерогенности этого белка в биомембранах (Hedlund & Bartfai, 1979; Цемуракин и др., 1982; Birdsall & Hulme, 1983; Sokolovsky, 1983). В отличие от использованного в этих работах традиционного подхода, нами была измерена кинетика ингибирования связывающих свойств рецептора при разных концентрациях модифицирующих реагентов. Опыты показали, что при достаточном избытке модифицирующего реагента достигается полное ингибирование лиганд-связываюших свойств рецептора и этот процесс описывается кинетикой реакции первого порядка (Рис.1). Такие результаты не подтверждают представление о структурной гетерогенности мускаринового рецептора мозга. Кроме того, наблюдаемые кинетические закономерности говорят о том, что для ингибирования рецептора достаточно модифицирования одной функционально важной группы белка. Доступность этой группы в структуре белка модифицирующим реагентам характеризуется бимолекулярной константой скорости процесса и сопоставление последних величин для разных состояний рецептора дает информацию о структурных изменениях белка.

6

т

с

-23-

10 20 30 Время.мин

и-

о 3

2-

см о

0.1 0,2 0,3 [п-ХМБ],мМ

Рис.1.Ингибирование мембранного мускаринового рецептора мозга крыс п-хлормеркурийбензоатом (1-контроль, 2-0.ОЗмМ, 3-0,07мМ, 4-0,15мМ, 5-0,ЗмМ) и зависимость кнавл для ингибирования мембранного (1) и солюбилизированного (2) рецепторов от концен-

трации реагента,

специфическое связвание Ь-[ Н]ХБ.

По нарим данным активный центр мускаринового рецептора формируется с участием -БН, -БЭ- и СООН-групп. Можно предположить, что первая из них расположена в активном центре, так как связанные с рецептором лиганды защищают эту группу от модифицирующих реагентов. В то же время доступность -ББ- и СООН-групп химическим модификаторам не меняется при образо-

з

вании комплекса рецептора с Н]ХБ. Следовательно, эти

группы расположены вне активного центра и важны для сохранения активной конформации рецепторного белка. Для солюбилизированного рецептора соблюдаются те же закономерности и увеличивается только скорость реакций.

Нари опыты с этиловым ацетимидатом не подтвердили участие Ш2~группы при формировании активного центра мускаринового рецептора. Важно отметить, что в отличие от реагентов, использованных другими авторами для определения аминогрупп, этиловый ацетимидат не дает побочную реакцию с ЭН-группами, что существенно в связи с наличием этих групп в активном центре рецептора.

Резюме. Лиганд-связывающие свойства мускаринового рецептора контролируются 5Н-, -ЭЭ- и СООН-группами белка, из которых две последние расположены вне центра связывания лиганда и отвечают за активную конформацию белка. Анализ кинетики химического модифицирования свидетельствует о гомогенности популяции рецепторных участков в препарате мозговых мембран.

7

1.3. Физико-химические свойства лиганд-связываюиего центра рецептора

В настоящей работе предлагается способ зондирования активных центров белков, которые специфически связывают катион-ные лиганды, путем измерения кинетики модифицирования белка ионом И,Ы-диметил-2-фенилазиридиния (I). Скорость процесса лимитируется стадией размыкания азиридиниевого цикла в активном центре белка с образованием карбониевого иона (II), который алкилирует доступные для реакции нуклеофильные группы.

Если при этом ингибируются связывающие или каталитические свойства белка, это можно использовать для измерения кинетики модифицирования. Чувствительность метода зависит при этом от методики определения данного белка, что особенно важно при изучении минорных компонентов биологических систем, к которым относятся и рецепторы клеточных мембран.

В основе метода лежит установленная для сольволиза иона N,N-диметил-2-фенилазиридиния зависимость скорости реакции от общей основности реакционной среды:

log к » (-6,7+0,8) + (0,011+0,003)В, (1)

которая представляет собой упроиеннуя форму корреляционного уравнения Коппеля-Пальма:

log к = log к° + yY + рР + ЪВ + еЕ , (2)

где У и Р характеризуют полярность и поляризуемость растворителей, В и Е -параметры общей основности и обиеи кислотности среды. На базе уравнения (1) решается обратная задача определения по скорости разложения азиридиниевого иона параметра В для среды, в которой протекает реакция.

Метод был апробирован в случае холинэстераз, для которых отдельно доказано соблюдение единой изокинетической зависимости реакций азиридиниевого иона в органических растворителях и в активном центре ферментов. Для ацетилхолинэстераз яда кобры,электрического органа электрического угря и мозга крыс, а также для оутирилхолинэстерази сыворотки крови лоршди получили значения В в интервале от 140 до 170. Такие значения В весьма близки В=156 для воды, а также величинам В для ряда других гидроксильных растворителей. Следовательно, соответствующий участок активного центра холинэстераз открыт для воды. Ионы М,И-диметил-2-фенилазиридиния ингибируют связывание

Phe-CH - ОН,

Х+ '

Me Me I

г+ 2

Phe—СН+- СН

II

лигандов с мускариновым рецептором, что допускает определение параметра В=261 для этого белка. Оказывается, что свойства связывающих центров холинорецептора и холинэстераз значительно различаются. При этом В для рецептора сопоставима с этой константой для амидов и алкиламидов карбоксильных кислот, моделирующих пептидные фрагменты белковой структуры. Одновременно можно высказать предположение об отсутствии сольватационноя воды в этом центре связывания лигандов. Резюме. Разработан и на примере холинэстераз и мускаринового рецептора применен метод "химического зондирования" лиганд-связываюиих центров белков ионом N.Н-диметил-2-фенилазири-диния и показано различие в их сольватационных свойствах.

2. МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ АНТАГОНИСТОВ С МУСКАРИНОВЫМ

РЕЦЕПТОРОМ

2.1. Кинетический анализ связывания радиолигандов

Кинетику связывания радиоактивных антагонистов с мембранным рецептором измеряли в псеадомономолекулярных условиях, при которых процесс описывается уравнением кинетики первого порядка:

-к 1 В = В + В (1 - е НабЛ )

1: ПБ Зр ' /

(3)

где В^-обиее связывание радиолиганда с фильтрами в момент

времени 1, В -величина неспецифического связывания и В -пэ ер

максимальное значение специфического связывания радиолиганда. Опыты показали, что неспецифическое связывание быстро достигает равновесного состояния и во времени не меняется (Рис.2), что технически упрощает проведение кинетических измерений. Константы кнабЛ' а также параметры Впд и Вдр рассчитали по уравнению (3) нелинейным методом наименьших квадратов.

Рис.2. Ассоциация Н]ХБ (2,7 нМ) с мембранным мускариновым рецептором мозга крыс, 0,05 М К-фосфатныя буфер, 25°С, 1-обиее связывание, 2-неспецифи-ческое связывание в присутствии Ю мкМ атропинсульфата, концентрация белка 0,04 мг/мл, обьем пробы 1 мл.

Врэмя.ман

Далее мы анализировали зависимости кнавл от концентрации реагента, а также от условий реакционной среды или концентрации добавляемых в реакционную среду других лигандов. До нащих исследований это не было общепринятым подходом в ре-цепторологии, где в основном ограничивались проведением экспериментов равновесного связывания, предполагая соблюдение одностадийной схемы комплексообразования:

И + А - -- ИА , (4)

ных взаимодействий достаточно определения константы К,:

а

по которой для количественной характеристики рецептор-лиганд-ззаимоде( [К] [А]

К = - . (5)

а [1?А]

Резюме■ Разработан кинетический подход для изучения механизма связывания радиолигандов с мускариноэым рецептором.

2.2. Изомеризация комплекса антагониста с ыускариновым рецептором.

Согласно схеме (4) псевдомономолекулярная константа скорости комплексообразования должна линейно зависеть от концентрации лиганда:

кнабл = к-! + к1[А] • (6>

Нари опыты, однако, выявили более сложный характер этой

зависимости (Рис.3), что свидетельствует о неадекватности

одностадийной равновесной схемы связывания мускариновых ан-

3 3

тагонистов с рецептором. Связывание г.— £ Н]МеСА и ь-[ Н]МеХБ с мембранным рецептором мозга (Рис.За,б) описывается в изученном интервале концентрации лигандов гиперболической зависимостью кнабл от [А]. В случае Ь-[3Н]ХБ (Рис.Зв) и [3Н]МеПБ при увеличении концентрации лиганда наблюдается дополнительное ускорение комплексообразования с достижением нового предельного значения кнабл- Последний факт свидетельствует о кооперативной регуляции этого процесса. Аналогичная зависи-

3

мость характеризует также связывание ь-[ Н]ХБ с рецептором сердца, в случае же рецептора тонкой кирки кооперативная регуляция скорости процесса отсутствует (Рис.Зв). Таким образом, уже качественное сопоставление результатов для рецепторов разных тканей выявляет определенные различия, установление которых методами равновесного анализа невозможно.

Ю

5 -

и

2-

1 -

2 и 6 8 10

[Н3Н]МеСА] .нМ

0 2 4. 6 6 10 [Ь-[Зн]МеХБ] ,нМ

5 10

[ь[3Н]ХБ].нМ

5 10

[1г[3Н] ХБ]. нМ

Рис.3. Зависимость к „ от „ , набл

[ Н]МеХБ (Б) и Н]ХБ (В) для

концентрации Н]МеСА (А), Ь-мембранных препаратов муска-

ринового рецептора мозга (О ) / сердца (0 ) и тонкой кищки(Ц),

о 3

25 С, и результаты титрования этих рецепторов с Н]ХБ (Г).

Гиперболическая зависимость кнабл от концентрации лиганда соответствует последовательной реакционной схеме, учитывающей образование по меньшей мере двух рецептор-лигандных комплексов :

КА к1

К + А ИА (ИА) , (7)

из которых в качестве продукта реакции при выводе уравнения скорости процесса учитывается только последний. Иными словами, только комплекс (ИА) определяется фильтрационным методом и КА смывается с фильтра. Конечно,обратимой реакцией следует признать также образование комплекса (НА), так как радиоли-ганд вытесняется из этого комплекса избытком других лигандов.

С учетом этого получим для реакции образования рецептор-лигандного комплекса следующее уравнение: к, [А]

= ктт-^ + '

по которому можно рассчитать параметры к-надл' к^ и . В

случае изученных соединений, однако, значения к „ были

набл

значительно больше , что не допускало в большинстве случаев определения последней величины по данным кинетики.

Смещение равновесного состояния стадии изомеризации рецептор-лигандного комплекса невозможно при добавлении избытка реагента. Последний факт необходимо учесть наряду со скоростью диссоциации комплекса при подборе радиолигандов для количественного определения рецептора методами, в которых для отделения связанного лиганда от его избытка в растворе пользуются методом фильтрации проб или центрифугированием. Резюме. Доказана двухстадийная реакционная схема для связывания эффективных антагонистов с мускариновым рецептором, включающая медленную стадию изомеризации рецептор-лигандного комплекса и выявлена кинетическая характеристика тканевой специфичности для этого рецептора.

2.3. Кооперативное связывание антагониста с рецептором

Сигмойдальные части зависимостей к , от [А] в реак-з з наол

циях Ь-[ Н]ХБ и [ Н]МеПБ с мембранными рецепторами мозга и

сердца говорят о кооперативной регуляции скорости этого процесса в результате связывания с рецептором дополнительных молекул антагониста. Титрование рецептора теми же радиолиганда-ми, однако, показывает, что стехиометрия определяемого на стекло-волокнистых фильтрах комплекса при высоких концентрациях лиганда не меняется (Рис.зг). Это означает, что кооперативно регулируется только скорость перехода комплекса в медленно диссоциирующую форму. Следовательно, независимо от конкретного механизма кооперативного эффекта, в мембранных препаратах мускаринового рецептора мозга и сердца можно различать два типа центров, взаимодействующих с антагонистами. Эти центры различаются по эффективности связывания лиганда, а также тем, что в регуляторных участках не происходит образования медленно диссоциирующегося комплекса (НА).

Количественный анализ кооперативного эффекта проводили по следующей кинетической модели:

КА к1

й ИА ^г (ИА)

К

х

«КА

■><Кх 1 (9)

0

к

КА НА ^ - А (ЙА)

-х

которую можно рассматривать как комбинацию двухстадийноя схемы и кооперативной модели Хилла с учетом всех связанных с последней теоретических ограничений. Также предполагается, что кроме изомеризационной стадии все остальные равновесия в системе достигаются быстро, и соответствующие комплексы,включая п молекул антагониста в комплексе Ап(11А), не поддаются экспериментальному определению методом фильтрации.

В соответствии со схемой (9) выражение для кнавл записывается при следующим образом:

<1 Кх

[А] К 21 к [А]п [А]

к = ■*■_ ___ +. ^_ _ + к' (10)

набл ^ + [д] КхП+[А]П КХ"+[А]П Кд+[А]

Первое слагаемое этого уравнения описывает начальную гиперболическую часть зависимости к,,.,, от [А], где [А]<К , второе

нао л х

слагаемое соответствует сигмойдальной части этой зависимости.

Константа к' характеризует диссоциацию комплекса и малая ско-

3 3

рость этого процесса в случае Г.— Г Н]ХБ и [ Н]МеПБ позволяет пренебречь свободным членом уравнения (10) при обработке данных. В расчетах ограничивались определением цельночисленных значений коэффициента Хилла.

Рецепторы мозга, сердца и тонкой кирки характеризуются близкими значениями констант Кд и к^ (Табл.1), что, очевидно, свидетельствует об одинаковой природе лиганд-связываюиих центров этих белков и протекающих в них процессов конформаци-онной изомеризации. Отсутствие кооперативного эффекта в случае рецептора тонкой кирки скорее всего связано отличием его надмолекулярной структуры в биомембране.

В соответствии с моделью Хилла п не может превышать числа лиганд-связывающих центров кооперативно функционирующей системы. Поэтому трудно присвоить конкретное содержание высоким значениям п. Тем не менее удовлетворительное соответствие теоретической кривой и экспериментальных данных по связы-3 3

ванию !,-[ Н]ХБ и [ Н]МеПБ с рецепторами мозга и сердца достигается при значениях п>6-7. Вместе с первым слагаемым в уравнении скорости (10) это указывает на возможность кооператив-

ного функционирования до восьми лиганд-связывающих центров. Резюме. Обнаружена кооперативная регуляция скорости связывания эффективных антагонистов с мускариновым рецептором мозга и сердца, что возможно при существовании в структуре мембраны комплексов из нескольких взаимозависимых центров. В мембранах тонкой кирки кооперативная регуляция скорости комплексо-образования не обнаруживается.

Таблица 1

Кинетические параметры взаимодействия радиоактивных антаго-истов с мембранным мускариновым рецептором мозга крысы, 25°С,

рН 7,40, 0,05М К-фосфатный буфер.

_____ ^ __

__с нМ с _с_2__нМ

1.Ь-МеСА 9,7±2,1 11,9±0,8 - - - 9 ±4 0,08±0,01

2. МеПБ 5,5±3,1 1,4±0,3 21+8 3,6±0,4 7 6,7±0,8 0,4±0,1

3.Ь-ХБ 1,3±0,5 1,2±0,3 4,4±1 1,8*0,2 6-7 1,3±0,4 ~0,002

4,1|-МеХБ 5,0±2,3 4,6+0,5 - - - 14 ±4 0,13±0,04

2.4. Влияние температуры на кооперативное взаимодействие

з

[ В]МеПБ с мускариновым рецептором мозга

Варьирование температуры приводит к изменению кинетичес-

3

кого механизма взаимодействия [ Н]МеПБ с мембранным рецептором мозга, что отражается в разной форме зависимости кнав_ от концентрации этого антагониста (Рис.4). Полученные при оси 42°С кривые могут быть при этом рассмотрены как предельные случаи более сложной зависимости, наблюдаемой при 25°С. Формально этим случаям соответствуют отдельные слагаемые уравнения (10), т.е. гиперболическая функция в условиях [А] при 42°С, и зависимость Хилла в условиях кЯЮ при 0°С. При низкой температуре скорость изомеризационноя стадии рецептор--лигандного комплекса, не поддерживаемой кооперативным эффектом, крайне малая, что говорит о резкой зависимости константы к^ от температуры. Такой качественный вывод согласуется с приближенной оценкой активационной энергии Ед=95 кДж/моль для изомеризационноя стадии на основе кинетических данных при температурах 25°С и 42°С. В то же время константа скорости

3

диссоциации комплекса [ Н]МеПБ и рецептора мозга в интервале температур от 0°С до 42°С хорошо описывается уравнением Аррениуса и допускает расчет активационной энергии процесса 58+20 кДж/молъ. Высокие значения активационной энергии сви-

О 20 ¿0

[[ЗН]МеГ1Б].нМ

детельствугат о конформационных переходах рецепторного белка в изомеризационных процессах рецептор-лигандного комплекса.В то же время константа равновесия изомеризационного процесса,рассчитанная как отношение , мало зависит от температуры. Резюме. Изомеризационные процессы рецептор-лигандного комплекса характеризуются высокими значениями активационной энергии, что свидетельствует о значительных конформационных изменениях рецепторного белка.

2.5. Влияние концентрации электролита на кооперативное

з

взаимодействие Н]ХБ с мускариновым рецептором

Форма зависимости кнабл от [А] меняется при добавлении соли в реакционную среду (Рис.5). При этом наблюдается сдвиг кооперативной части зависимости в область более высоких концентраций лиганда, что свидетельствует об уменьшении эффективности связывания молекул антагониста с обоими типами рецепторных участков. Последний факт хорошо согласуется с представлением о первичном солевом эффекте при сорбции катионного реагента в т.н. анионном центре связывания, который предположительно является компонентом активной

Рис.5. Влияние КС1 ( © - 0,1 М; ©-0,2 м; 0 -0,5 М; □ -0,8 М; Д-2,0 М; ф - без добавки соли) на кинетику связывания Ь-[3й]ХБ с мембранный мускариновым рецептором мозга крысы, 25°С, рН 7,40, о,05М К-фосфатный буфер.

10 20 [1-[ЭН]ХБ].нМ

поверхности холинорецепторов.

В отличие от сорбционных стадий, скорость изомеризации рецептор-лигандных комплексов не зависит от свойств реакционной среды. Следовательно, изомеризационные процессы протекают в изолированном от эффектов внешней среды центре связывания лиганда. Из тех же результатов следует,что умеренное изменение концентрации соли не вызывает в белково-липидной структуре мембран мозга таких изменений, которые могли бы повлиять на динамику конформационных переходов рецепторных комплексов в мембранной структуре.

Резюме. Изомеризация рецептор-лигандного комплекса - внутримолекулярный процесс конформационной перестройки рецепторного белка и ее скорость не зависит от концентрации добавленного в реакционную среду электролита.

2.6. Двухстадияная изомеризация комплекса антагониста и рецептора

В литературе встречаются противоречивые данные о кинетике диссоциации комплекса антагонистов с мускариновым рецептором. В ряде случаев этот процесс подчиняется кинетическим закономерностям реакции первого порядка (Yamamura et al,1974; Hosey et al, 1981; Luthln et al, 1984), в то время как в других работах кинетические данные описывают уравнением скорости,которое включает два экспоненциальных члена (Aguilar et al, 1982,-Galper et al, 1982; Klein, 1980).

Проведенное нами исследование кинетики диссоциации комп-3 3

лексов L-[ Н]ХБ и L-[ Н]МеСА с мускариновым рецептором мозга показало, что наблюдаемые кинетические закономерности этого процесса зависят от длительности предварительной инкубации

16

антагониста с рецептором до начала измерения кинетики диссоциации (Рис.6). При коротких временах предварительной инкубации кинетика диссоциации описывается уравнением с двумя экспоненциальными членами,

= В + t п

В , е зр1

В „е эр2

(11)

что соответствует образованию двух типов комплексов рецептора и антагониста,(КА) и ((Г?А)) . Эти комплексы различаются по скорости диссоциации, но они оба определяются фильтрационным методом. Доля комплекса, диссоциирующего с большей скоростью, уменьшается во времени по мере его перехода в медленно диссоциирующую форму и через определенное время процесс диссоциации описывается кинетикой реакции первого порядка.

т|со с

500 Время,мин

Рис.Б. Кинетика диссоциации комплекса мускаринового рецеп-

3

тора и !,-[ Н]ХБ п зависимости от длительности предварительной инкувации реакционной смеси. 14 МИН, 2-12 МИН, 3-25 МИН, 462 МИН И 7-1440 МИН.

(ЯА)

Следовательно, в случае Ь-[ Н]ХБ равновесие

- 4 - ((ИА)) к

-У

(12)

сдвинуто в сторону более медленно яиссоциируюиего комплекса <(ИА)). Аналогичные закономерности, объясняющие возможности получения кинетических кривых разной формы для диссоциации комплекса радиолиганда и рецептора, были получены также в

3

случае Ь-[ Н]МеСА. Измерение кинетики диссоциации комплекса путем вытеснения из него радиолиганда избытком нерадиоактив-

3

ного антагониста не позволяет □ случае !,-[ Н]ХБ исследовать непосредственно вторую изомеризационную стадию, так как в этом случае молекулы лиганда связываются также в регулятор-ных центрах рецептора. Поэтому вычисляемые для этого лиганда константы

превращению комплексов Ап(КА) и Ап((КД||, в которых п ио-лекул лиганда А связано с регулпторными центрами рецептора.

-4 - 1 к =1,6-10 с У

-5 -1

1,3-10 с соответствуют

Для Н]МеСА можно определить константы скорости второй

-4 -1 —4 -1

изомеризационной стадии, к^=8•10 с и к_^=3,5■10 с .

Резюме. Установлен факт двухстадийной' изомеризации определяемого методом фильтрации комплекса антагониста и мускаринового рецептора.

2.7. Кажущаяся необратимость взаимодействия ХБ с ыускариновыы рецептором мозга

Первым коммерчески доступным и до сих пор наиболее (иироко применяемым радиолигандом для определения мускаринового рецептора является ХБ и особенно его Ь-энантиомер. С начала семидесятых годов для этого лиганда в литературе опубликовано большое количество значений К^, вычисленных по уравнению: [И] [А]

[ИА] = - . (13)

Ка+ [А]

Анализ этих данных, однако, выявляет разброс результатов, который в отдельных случаях превышает несколько порядков величины константы Кд, несмотря на одинаковый источник рецептора и идентичные условия эксперимента. При этом обнаруживается тенденция изменения величин рК^ в зависимости от года опубликования результатов (Рис.7). Аналогичная тенденция проявляется при сопоставлении рК, и величин удельной радиоак-

а 3

тивности использованного в опытах Ь-[ Н]ХБ.

Такие факты находят обьяснение в рамках представления,

3

согласно которому для Ь-[ Н]ХБ в координатах уравнения (13) получают не кривые равновесного связывания радиолиганда, а кривые титрования рецептора. Форма последних определяется концентрацией рецептора в пробе, которая в свою очередь уменьшается исследователями по мере увеличения удельной радиоактивности доступного им лиганда.

1975 1980 1985 год

Рис.7. Сопоставление приведен-

ных

литературе К

а

для

взаимодействия ь-[~Н]ХБ с мембранным рецептором мозга крыс (рН 7,4, 0,05 М К-фосфат-ный буфер, 25°С) и года их опубликования.

Можно добавить, что в некоторых работах для Г.— [ Н]ХБ прямо показана зависимость кажущихся величин Kd от концентрации рецептора (Hed-lund et al, 1979,-Ludford,1980;Nilvebrant, 1986). Однако этим фактам не было уделено должного внимания.

Кажущаяся необратимость взаимодействия ХБ с мускариновым рецептором связано, во-первых, исключительно высокой эффективности! связывания лиганда, так как наблюдаемая константа

диссоциации К . определяется комбинацией констант К,, К,, и a All

Ki2- В случае L-ХБ оба изомеризационные равновесия сдвинуты в сторону продукта и вычисляемая по данным кинетики Kd<2nM.

Во-вторых отметим, что истинное равновесие многостадийного процесса комплексообразования достигается в случае ХБ медленно и необходимое для этого время инкубации значительно больше одного часа, что часто используется в опытах с этим лигандом.

Таким образом, по кинетическим причинам одностадийная реакционная схема не обеспечивает адекватное описание взаимодействия мускаринового рецептора с L-ХБ, хотя именно этим радиолигандом получено подавляющее больщинство опубликованных в литературе результатов радиолигандного анализа. Естественно, что аналогичные кинетические аспекты необходимо учесть и в случае других радиолигандов, используемых для определения мускаринового рецептора.

На основе полученных нами данных более подходящим антагонистом для применения в качестве лиганда-"репортера"

з

является L-[ Н]МеСА, который относительно быстро связывается с рецептором и имеет в изученном ряду радиолигандов наименьшую эффективность комплексообразования (Табл.1), что важно для проведения опытов при концентрациях радиолиганда ниже Кд. Резюме. По кинетическим причинам L-ХБ не является удобным радиолигандом мускаринового рецептора в опытах, требующий

достижения равновесного состояния системы, а в качестве

з

лиганда-"репортера" рекомендуется L-[ Н]МеСА.

3. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОДНОВРЕМЕННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДВУХ ЛИГАНДОВ С РЕЦЕПТОРОМ

3.1. Измерение кинетики ассоциации нерадиоактивного лиганда с мускариновым рецептором

Возможность измерения кинетики взаимодействия нерадиоактивных лигандов с мускариновым рецептором с помощью меченного тритием антагониста в качестве лиганда-"репортера" принципиально расширяет возможности кинетического подхода при ана-

лизе механизма рецептор-лигандных взаимодействий. Предпосылкой применимости этого метода является установление механизма ассоциации "репортерного" лиганда с рецептором. Выбирая на основе полученных в предыдущей части работы данных наиболее подходящую структуру "репортерного" лиганда и оптимальные условия эксперимента, можно ограничиться простейшей кинетической моделью для этого лиганда, учитывающей только две стадии процесса комплексообразования.

В простейшем случае связывание нерадиоактивного лиганда £, с рецептором описывается как быстрое равновесие по сравнению с диссоциацией и ассоциацией радиоактивного антагониста А:

КА к1

+ А _ ЙА (ИА)

к-1

К , (14)

ч

+ ь ~ ИГ.

В условиях [й]<<[Ь] и [Н3<<[А] связывание радиолиганда А с рецептором описывается уравнением скорости реакции первого

порядка и зависимость ^набл от концентрации обоих лигандов задается выражением: к [А]

к = -"--+ к-1 • <15>

НабЛ (1 + [Ь]/Кь) КА + [А] 1

Как видно, при реализации такого механизма рецептор-лигандных взаимодействий наблюдается уменьшение кнабл по мере увеличения концентрации лиганда Ь, и константу диссоциации К^ можно рассчитать из этой же зависимости.

В более сложном случае взаимодействие Ь с рецептором может сопровождаться медленной изомеризацией комплекса ИЬ в

К к,

+ А ^ А ^ ЛА ^ (ИА)

Кг, 1

+ Ь ^ ИЬ ^ (ИЬ)

(16)

В условиях избытка концентраций обоих лигандов по сравнению с концентрацией рецептора, изменение во времени концентрации комплексов (КА) и (НЬ) описывается двумя экспонентами: С(КА) " С11ехр(с11) н- С12ехр(с21) + с10 , (17)

С(11Ю = Сг!^«0!1' + С22ехр(С2^ + С20 ' (18)

к

где: -а + Уа* ' -а - Уа2 -4{

с = - и с = - ,

1 2 2

к,[А] к' [Г.]

а = -±- + -±- + к + к' . ,

КА + [А] Кь + [Ь]

к,[А] к1 ЛЬ]

f = -±- к' , + -=- к , + к ,к' .

КА + [А] 1 Кь + [Ь]

Если и к'_1 - малые величины по сравнению с наблюдаемой

константой скорости ассоциации "репортерного" лиганда с рецептором, получим при постоянной концентрации радиолиганда

гиперболическую засисимость к„.__ от концентрации нерадиоак-

наол

тивного лиганда Ь: к' ЛЬ]

кнабл = -- + СОП8,: ' (19)

набл К^ + [Ь]

которое допускает расчет параметров Кт и к1,. При этом наблюдаемая константа скорости увеличивается в присутствии добавленного нерадиоактивного лиганда, открывая возможность выбора между двумя кинетическими моделями (14) и (16). Для проверки нами исследовалось взаимодействие радиоактивного и нерадиоактивного МеХБ с рецептором мозга, используя в последнем случае

3

"репортерныя" лиганд ь-[ Н]МеСА. Полученные обоими методами результаты хорошо согласуются (см. Табл.1 и 2). Резюме. Кинетические закономерности связывания радиолиганда с рецептором в присутствии нерадиоактивного лиганда позволяют выбрать между двумя моделями рецептор-лигандного взаимодействия и определить кинетические параметры для нерадиоактивного лиганда.

3.2. Два типа мускариновых антагонистов

з

Измерение кинетики связывания Ь-[ н]МеСА с мускарино-вым рецептором мозга в присутствии нерадиоактивных антагонистов показало, что эфиры бензиловой (Рис.8а) и троповой кислот ускоряют этот процесс. Следовательно, эти соединения взаимодействуют с рецептором по кинетической модели (16), индуцируя в активном центре рецептора конформационныя переход, который приводит к образованию медленно диссоциирующей формы комплекса (¡11.). Ряд других антагонистов образует, однако, с рецептором быстро диссоциирующие комплексы и в соответствии со схемой (14) обратимо ингибируют процесс ассоциации Ь-[3Н]МеСА с рецептором (Рис.86) . Кнетические параметры, измеренные для ряда нерадиоактивных антагонистов приведены в Табл.2.

21

Таблица 2

Кинетические параметры взаимодействия антагонистов с муска-риновым рецептором мозга крыс, измеренные применением Ь-[3Н]МеСЛ в качестве радиолиганда-"репортера", 25°С, рН7,40, О,05М К-фосфатный буфер.

N Антагонист п/п

А нМ

2

10 к.

.-1

10 к-1 Ка

нм

РЬ

4.НОСС (О)О РЬ

РЬ

5. НОСС (О) ОС Н ,Л(СН )

РЬ

И^-Ме

б,8+2,3 5,6+0,9 14 ±4 0,13+0,03

38 ±13 3,4±0,6 68 ±10 9,6 ±1,7

РЬ ЭСС( РЬ

6.Н0СС(0)0С2Н4К (СН3)3 9,2±2,2 3,3+0,5 50 ± 9 2,3 ±0,2

РЬ

7. Н0СН2СНС (О) 0-/~ММе

РЬ

8.Н0СН2СНС(0) РЬ

9.НОСН2СНС(0)0-^ ЛМе

Ч

6,3±2,О 6,0±1,0 10 ± 1 О,20_±0,03 3,0±1,0 6,1±1,0 21 ± 3 О,11±0,02

О 3,7±1,2 3,0±0,5 30 ± 7 0,14±0,03

РЬ

Ю.Н0СС(0)0С„Н (СН„)_ 8, 5±0, 8 (Кт ) • „ < 4 о о ь

СУС5Н9

11.РЬС(О)0С2Н4М+(СН3)3 3760±540 (К^

12,РЬСН2С(О)0С2Н4Н+(СН3)3 4530±380 (К^

О 5

[МеХБ].нМ

0 12 3 [Бензоилхолин]. мкМ

Рис.8. Влияние МеХБ (А) и бензоилхолина (Б) на кинетику

з

ассоциации Ь-[ Н]МеСА (0,8 нМ) с мембранным рецептором мозга крыс при 25°С, рН 7,40, 0,05 М К-фосфатный буфер.

Таким образом, по данным кинетики комплексообразования мускариновые антагонисты можно разделить на две группы в соответствии с рассмотренными вире кинетическими моделями ре-цептор-лигандного взаимодействия. Следовательно, при анализе взаимосвязи активности и структуры, все мускариновые антагонисты не могут быть рассмотрены в рамках единой реакционной серии. Это, однако, было неизбежным до наших исследований, когда константы К^ были единственными параметрами, предоставляющими возможность анализа специфичности рецептора.

Важным выводом из полученных результатов является также тот факт,что наличие медленной изомеризационной стадии рецептор- лигандного комплекса не есть решающий фактор, отличающий мускариновые антагонисты от агонистов. Как видно,среди эффективных антагонистов встречаются также лиганды, взаимодействие которых с рецептором описывается как быстрое равновесие. Резюме. Классические мускариновые антагонисты разделяются на две группы на оснований наличия или отсутствия медленной стадии изомеризации рецептор-лигандного комплекса.

3.3. Кинетика вытеснения лиганда из комплекса с рецептором

Процесс вытеснения из рецепторного комплекса лиганда Ь избытком лиганда А условно можно разделить на два этапа: освобождение рецептора при диссоциации Ь из комплекса и связывание А с освободившимся рецептором: к1

(М.) -Н + Ь , (20)

к

И + А На°Л)(ИА) . (21)

При условии к'_1<кнабл скорость превращения (ЯЬ) в (ЯА) определяется стадией диссоциации комплекса (м,) . Это позволяет определить одним радиоактивным лигандом А константу к' для нерадиоактивных лигандов I,. Использование при этом достаточно продолжительных времен предварительной инкубации рецептора с нерадиоактивным лигандом I, позволяет селективно характеризовать наиболее медленную стадию многостадийного изомеризационного процесса. Эта методика была проверена

з

сопоставлением данных вытеснения [ Н]МеПБ из рецепторного комплекса избытком ХБ и соответствующего "зеркального" опыта, заключаюыегося в измерений кинетики вытеснения МеПБ из рецеп-

з

торного комплекса с помоию Ь-[ Н]ХБ. При этом получали к„„_-

-4 -1 -4 -1 лисс

(6,7+0,8)10 си кДИсс= (6,3±0,6)10 с , соответст-

23

венно.

Предлогаемой методикой измеряли константы скорости диссоциации комплексов рецептора мозга с двумя рядами N-алкил-замещенных бензиловых эфиров III и IV (Таблица 3).

Ph НОСС( £>h

'N* III

(сн2)пн

?h

НОСС(О)ОС Н N £h 24

IV

'снз'2(снг'пн

Таблица 3

Константы скорости диссоциации антагонистов типа III и IV из комплекса с мускариновым рецептором мозга крысы 7,40, 0,05 М K-фосфатный буфер.

п ряд III ряд IV

1 1,4 +0,4 5,0 +0,9

2 2,4 +0,5 2,4 +0,2

3 3,0 +0, 4 2,5 +0,4

4 2,9 +0,4 2,7 +0,2

5 3,0 +0,2 3,2 +0,3

6 3,9 +0,3 2,7 +0,2

1 2,7 +0,2 3,1 +0,3

в 3,9 +0,3 3,1 +0,2

9 3,6 +0,3 3,5 +0,2

10 4,1 +0,5 2,9 +0,2

25°С, pH

Из этих результатов видно, что скорость диссоциации

комплекса мало зависит от длины н-алкильного заместителя у

атома азота в спиртовой части изученных бензиловых эфиров.

Кроме того, эти зчения к практически не зависят от

дисс

строения углеводородного скелета спиртовой части, отделяющей атом азота от сложноэфирной группы в молекуле антагониста. С другой стороны, однако, в случае аналогичных бензилатов с третичным атомом азота в спиртовой части обнаруживается значительное уменьшение кдисс по мере осложнения структуры спиртовой части при переходе от линейной полиметиленовой цепочки к эпициклическим структурам.

Резюме. Предлагается способ измерения кинетики диссоциации комплекса мускаринового рецептора и нерадиоактивногр лиганда с применением радиоактивного лиганда-"репортера" и показано, что кватернаризация атома азота в спиртовой части бензиловых антагонистов приводит к потере чувствительности рецептора относительно к структурным особенностям этих лигандов.

3.4. Неконкурентный характер взаимодействия мускариновых агонистов и антагонистов с рецептором

В присутствии мускариновых агонистов скорость связывания

з

[ Н]МеПБ с рецепторами мозга и тонкой кирки уменьшается, что согласуется с моделью быстрого равновесного связывания аго-ниста с рецептором. Однако, влияние агониста на зависимость кнабл от кониентРации антагониста, а также зависимость скорости связывания антагониста при разных концентрациях агониста, не описываются закономерностями, которые следовало бы ожидать при соблюдении конкурентной схемы рецептор-лигандного взаимодействия. Так, например, зависимость кнаСл от концентрации карбамоилхолина не описывается гиперболической функцией и отличается от нее более плоской формой. Важно добавить, что аналогичная плоская форма характеризует также кривые вытеснения агонистами радиоактивных антагонистов в равновесных условиях связывания лигандов. Последний факт многократно обсуждался в литературе (В1г<3за11 et а!, 1980; Агопз1ат а!,1979) и использовался как довод в пользу

гетерогенности центров связывания мускариновых агонистов.

Для дальнейшего понимания механизма взаимозависимого комплексообразования агонистов и антагонистов с рецептором нами исследовалось влияние карбамоилхолина и оксотреморина на

з

кинетику связывания [ Н]ИеПБ с рецептором тонкой кирки (Таблица 4). В случае этого рецептора отсутствует эффект

з

кооперативной регуляции скорости связывания [ Н]МеПБ, что упрощает анализ результатов.

10 1 1 П)=о

о Ор"'

о X - /а^о Э[Г] = 2.5 мкМ -

о о 1 Э—0-б> [|_]=7,5 мкМ 1

О Ю 20

[[зн]МеПБ].нМ

Рис. 9. Влияние карбамоилхолина (I,) на кинетику ассоциации

з

С Н]МеПБ с мембранным мускариновым рецептором тонкой кирки крысы, 25°С, рН7,4, 0,05М К-фосфатный буфер.

Таблица 4

Влитие карбамоилхолина и оксотреморина на кинетику связыва-

з

ния [ Н]МеПБ с мембранным рецептором тонкой кирки крысы, 25°С, рН 7,40, 0,05 М К-фосфатный буфер.

Концентрация агониста мкМ

К. , НМ А

ю^.с-1

103к_1,с-1

6,7+2,5

8,8±1,1

1, 2±.0,3

2,5 5,0 7,5 15,0

Карбамоилхолин

7,8±2,9 5,4^=1,3 1,3±0,3

6,0±3,8 3,0+0,7 1,2±0,4

6,3±3,0 1,8±1,1 1,2±0,4

6,4±4,0 0,4±0,3 1,1±0,2

0,05 0,083 0,10 0,27

Оксотреморин

6,9±2,6 4,9±1,О 1,1±0,3

8,7±3,7 3,4±1,5 1,4±0,4

5,8+2,9 1,3+0,9 1,3±0,3

7,8+4,2 0,4±0,3 1,2±0,2

0

В присутствии агониста скорость изомеризации комплекса рецептора с антагонистом уменьшается (Рис.9). В то же время агонисты в пределах точности эксперимента не влияют на эффективность связывания антагониста с рецептором, характеризуемой константой КА (Табл.4). Формально такая ситуация соответствует неконкурентному механизму ингибирования агонистом I. связывания с рецептором антагониста А, что возможно при одновременном взаимодействии этих реагентов с рецептором:

КА к1 А - --=-->■ (ЛА)

KL |*КТ 8 (22)

RL-

*КА * Р* 1 « - Д т r.ra SMRA)

В этой схеме LRA - тройной комплекс антагониста, рецептора и агониста, (RA) и L(RA) обозначают определяемые методом фильтрации комплексы радиолиганда с рецептором. В условиях быстрого равновесия между R, RL, RA и LRA, а также пренебрегая ввиду малой скорости процессами "деизомеризации" комплексов (RA) и L(RA), для наблюдаемой константы скорости связывания радиолиганда получим следующее выражение:

ki<KL +

--Г-i-Г- '

К (1+ -А-) + ■(__ + -——) [L]

[А] [А]

В случае рецептора тонкой кирки для изученных агонистов

з

и [ Н]МеПБ =1, так как наблюдаемое значение Хд от концентрации агониста не зависит. Одновременно р> =0, т.е. тройной комплекс с экспериментально определяемой скоростью не изо-меризуется. При этом получаются для карбамоилхолина

мкМ и для оксотреморина Кт =80^14 нМ. Несколько иная ситуация

1>

характеризует рецептор мозга, при одновременном взаимодейст-

з

вии которого с карбамоилхолином и [ Н]МеПБ имеем р> =0,3±0,1 и К^=11±4 мкМ. Как было показано раньше, эти рецепторы проявляют также разные кооперативные свойства при связывании антагонистов, что скорее всего связано с их разной надмолекулярной структурой.

Таким образом, мускариновые агонисты и антагонисты образуют тройные комплексы с рецептором, не влияя на эффективность быстрого равновесного связывания второго лиганда с белком. Это возможно при наличии на рецепторе двух типов центров связывания, различающихся по специфичности к лигандам и по функциональной роли. В то же время проявляется взаимозависимость протекающих в этих центрах процессов. С одной стороны, связывание агонистов с рецептором уменьшает скорость изомеризации комплекса рецептора с антагонистом. С другой стороны, важнейшим физиологическим ответом связывания антагониста с рецептором является ингибирование передаваемого агонистом сигнала в нервной клетке. В свете полученных результатов можно высказать гипотезу, что это происходит не в результате простой конкуренции этих лигандов. Предлагаемая модель позволяет также уточнить понятие частичного агониста, который, повидимому, является лигандом, обладающим одинаковым или близким сродством к обоим типам связывающих центров рецептора.

В более общем плане следует отметить, что реакционная схема (22) также отражает гетерогенность связывающих центров для мускариновых антагонистов, которая, однако, возникает в результате многостадийного механизма связывания антагониста, используемого в качестве радиоактивного "репортерного" лиганда. Эти осложнения удалось бы избегать при применении радиоактивных агонистов для непосредственного изучения механизма их взаимодействия с мускариновым рецептором. Однако, посредством радиоактивных агонистов удается определить только часть реиепторных участков, которая согласно общепринятой интерпретации соответствует доле васокоафинных центров связывания агониста. С другой стороны, также известно, что резуль-

таты определения рецептора радиоактивными агонистами в значительной степени зависят от условии, при которых происходит отделение связанного с рецептором лиганда от его избытка в реакционной среде. Это можно объяснить быстрой диссоциацией этих лигандов из комплекса с рецептором. В последнем случае агонисты не могут быть применены в качестве радиолигандов для количественного определения мускаринового рецептора. Резюме. Агонисты неконкурентно ингибируют связывание антагонистов с мускариновым рецептором, свидетельствуя об образовании в этом процессе тройного комплекса: агонист-рецептор-антагонист.

4. ВЗАИМОЗАВИСИМОСТЬ СВОЙСТВ МУСКАРИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И

БИОМЕМБРАНЫ

Мускариновый рецептор структурно интегрирован с биомембраной как трансмембранный белок (КиЬо а1, 1986), что позволяет ожидать также интегрированности функциональных свойств этого белка и окружающих его белкого-липидных комплексов. Для оценки влияния мембранного окружения на рецептор нами сопоставлялись данные для мембранного и солюбилизирован-ного препаратов рецептора мозга, в частности, стабильность белка, доступность функциональных групп химическим модификаторам и кинетические закономерности связывания лиганда. С другой стороны, исследовалось воздействие рецепторного белка на состояние биомембраны.

4.1. Биоыембрана и стабильность рецептора

Механизмы спонтанной инактивации солюбилизированного и мембранного рецепторов существенно различаются, о чем свидетельствуют разные температурные зависимости констант скорости этого процесса (Рис.10). В первом случае высокое значение кажущейся активационной энергии ЕА=158±7 кДж/моль хорошо согласуется с аналогичными величинами для денатурации многих растворимых в воде белков (.1о1у,1965), стабильность которых определяется взаимодействиями между отдельными частями молекулы белка. Значение Е^=57±8 кДж/моль для мембранного

рецептора значительно ниже Е. для растворимых белков, но

а

сравнимо с параметрами аналолгичного содержания в интервале значений от 20 до 70 кДж/моль, вычисленных из температурной зависимости разных физико-химических свойств биологических и искусственных липидных структур (Во1сЗугеу, 1981; Оеуеаих, 1985; Ре Kruijff а1, 1985).

28

Рис. 10. Инактивация мембранного (1) и солюбилизированного диглтонлном (2) мускаринового рецептора мозга крыс.

3.0

3.5 103-Т1

¿.О

линейная зависимость

1п * от

рецептора охватывает данные при -15 С.

Из Рис. 10 видно, что 1/Т для мембранного Следовательно, механизм инактивации мембранного рецептора не меняется при замораживании мембранных фрагментов. В то же время при замораживании солюбилизированного рецептора теряется значительная часть лиганл-СЕПЗываюыей активности препарата. Эти данные можно понять, если предполагать, что стабильность мембранного рецептора контролируется состоянием его липидного окружения, которое, в свою очередь, зависит от температуры.

Обработка фрагментов биомембран фосфолипазами инактивир-ует связанный с ними мускариновый рецептор, что объясняется нарушением структуры липидноп фазы минорным количеством лизо-липидонз (Aronstam а1,1977; Раг^азага-СЬу е« а1,1Э84).

Неожиданным результатом, однако, была найденная нами инактивация фосфолипазой А^ солюбилизированного дигитонином рецептора. Этот факт свидетельствует о важной роли одной или нескольких молекул лецитина для сохранения связываюиих свойств рецептора в мицелле детергента.

Резюме. Стабильность мембранного мускаринового рецептора определяется состоянием окружающей белок липидной фазы и для сохранения активности солюбилизированного рецептора требуется взаимодействие белка с молекулами лецитина.

4.2. Биомембрана и кооперативные свойства рецептора

Кинетика комплексообразования антагонистов с мембранным мускариновым рецептором мозга и сердца говорит о кооперативном взаимодействии разных центров связывания лиганда. С целью выявления роли биомембраны при такой функциональной интегра-

ции лиганд-связываюмих центров рецепторного комплекса, нами

з

исследовалась кинетика связывания Н]ХБ со солюбилизиро-

ванным рецептором мозга. Полученные результаты показывают, что разрушение мембранного окружения рецептора препятствует кооперативной регуляции скорости изомеризационной стадии рецептор-лигандного комплекса так как зависимость кнавл от концентрации Ь-[3Н]ХБ описывается в случае солюбилизирован-ного рецептора мозга гиперболой в соответствии с двухстадий-ной кинетической моделью комплексообразования (Рис.11). Таким образом, биомембрана играет решающую роль при реализации кооперативного взаимодействия лиганд-связываюших центров рецептора, что может быть объяснено агрегацией нескольких рецепторных субьединиц в мембранном комплексе.

[1_-3[Н]ХБ].нМ

Рис.11. Кинетика ассоциации Ь-

з

[ Н]ХБ со солюбилизированным мускариновым рецептором мозга крыс,25°С, 0,05 М К-фосфатный буфер, рН 7,40, Кд=3,8+0,8 НМ, к1=(2,3+0,2)10~3С1.

Разрушение мембранного окружения рецептора сопровождается кроме качественных изменений в механизме связывания Ь-[3Н]ХБ также изменением подвижности белковой структуры рецептора, так как скорость изомеризационной стадии рецептор-лигандного комплекса уменьшается при солюбилизации более чем 5 раз. Уменьшается также эффективность быстрой стадии связывания антагониста с рецептором, говорящая об изменениях в структуре и свойствах соответствующего центра связывания лиганда.

К аналогичному выводу можно придти при рассмотрении данных химической модификации функциональных групп активного центра: в результате солюбилизации белка эти группы становятся более доступными модифицирующим реагентам (Рис.1). Резюме. Интеграция рецепторного белка в структуру биомембраны определяет конформационную динамику и кооперативные свойства его лиганд-связываюших центров.

4.3. Изменение состояния биоиекСрана при связывании

лиганлов с мускариновнм рецептором

Взаимодействие специфических лиганлов с рецептором мозга крысы вызывает уменьшение микровязкости липидноя части Оиомембран, изменение которого прослеживалось с помощью флюоресцентного зонда 1-ацил-2-[12-(э-антрил)-11-транс-додеценоил]-эп-глицеро-З-фосфохолина, предварительно включенного в структуру мембранных фрагментов. Эти опыты выполнялись совместно с лабораторией проф. Л.Д.Бергельсона (ИБОХ АН СССР, Москва). Оказалось, что состояние липидного бислоя меняется под действием мускариновых агонистов и антагонистов (Рис.12). Неспецифические лиганды, например ионы тетраметиламмония, не влияют на микровязкость мембраны (Рис.12). Поляризация флюоресцентного излучения зонда меняется в течение 1-2 минут после добавления лигандов, в том числе и ХБ, в мембранную суспензию. Это означает, что изменение состояния биомембраны индуцируется первой быстрой стадией связывания антагониста.

Рис.12. Изменение поляризации флюоресценции УФ-зонда в мембранных фрагментах мозга карба-моилхолином (1), атропином (2) и ионами тетраметиламмония (3).

мембраны оказывается наиболее способов определения рецептор-наблюдаемые при этом эффекты насыщаются при концентрациях лиганда, которые сопоставимы или ниже концентрации активных центров рецептора. Это можно понять исходя из представления о псевво-кристаллическои состоянии биомембраны, в котором возможно распространение кооперативного фазового перехода, индуцированного взаимо*-действием лиганда с одним рецептором, но охватывающего множество других рецепторных частиц на мембранной поверхности. В результате этого связывание лиганда с дополнительными молекулами рецептора не сопровождается дальнейшим изменением

31

1одГи

Измерение микровязкости чувствительным из известных лигандного взаимодействия, и

свойств биомембраны.

Резюме. Взаимодействие вгонистов и антагонистов с мускарино-вым рецептором влияет на состояние биомембраны, вызывая уменьшение микровязкости липидных компонентов.

5. ЭФФЕКТЫ СТРОЕЮЯ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ЛИГАНДОВ С МУСКАРИНОВЬМ РЕЦЕПТОРОМ

В соответствии с классическими представлениям, молекулы мускариновых антагонистов содержат помимо полярных фрагментов (аммониевые, сложноэфирные„ эфирные или гидроксильные группы) также аполярные (углеводородные) заместители, от строения которых в значительной степени зависит эффективность действия этих веиеств (Abramson et al,1969; Barlow et al,1963; Baker et al,1971; Ing,1949). В рамках данной работы обсуждяются механизмы молекулярного узнавания мускариновым рецептором мозга крыс этих аполярных заместителей, используя для количественной характеристики последних константы гидро-фобности (log Р) и молекулярной рефракции (ГЖ) (Hansch et al,l973). При этом установленные нами кинетические механизмы взаимодействия лигандоз с рецептором открывают возможность изучения эффектов строения на отдельных стадиях рецептор-лигандного взаимодействуя. Кроме результатов собственной работы при этом применялись также некоторые константы диссоциации из составленного нами банка литературных данных.

5.1. Разные uexaisouu ззлияния аполярнгас заместителей на эффективность лигандов с рецептором

Корреляция pKd с константами гидрофобности log Р разбивает мускариновиг антагонисты на подсерии в зависимости от наличия или отсутствия в ыолекуле полярных функциональных групп (Рис.13а). В случае алкиламмониевых соединений, простых эфиров и спиртов соблюдается корреляционное уравнение

pKd = рК° + q?los Р (24)

с близкими коэффициентами ij> □ интервале от 0,6 до о, 8, но разными отрезками ординаты. Ряд сложных эфиров описываются этим же уравнением сi|>=Q,7±0,2. С другой стороны, для бензи-латов получим ^ =1, 5±0,2, что отличается от ^ для остальных лигандов. Отдельную группу составляют также сложные эфиры троповой кислоты, эффективность взаимодействия которых с рецептором мало зависит от строения аполярноп части молекулы. Следовательно, е зависимости от некоторых других факторов строения проявляются разное механизмы взаимодействия аполяр-

32

них заместителей антагонистов с мускариновым рецептором.

Весьма близкие выводы о возможности разных типов связи рецептора с лигандами сделаны и в других исследованиях взаимосвязи структуры и биологической активности мускариновых лигандов (Тропща и ДР, 1985), результаты которых были опубликованы спустя несколько лет после нарей работы.

Если изменение наклона зависимости pKd от log Р свидетельствует о изменении механизма взаимодействия лиганда с рецептором, то наблюдаемые на Рис. 1ЭА параллельные сдвиги корреляционных зависимостей можно объяснить также тем, что [икали констант гидрофобности для этих групп соединений сдвинуты в результате появлпения в молекуле дополнительных полярных атомов, характеризующихся отрицательными инкрементами log Р. В таком случае параллельным сдвигам корреляционных зависимостей трудно присвоить конкретного физического содержания.

В отличие от log Р ркала MR не отражает сольватационные эффекты и характеризует прежде всего объем молекул. Оказывается, что применением MR вместо log Р те яе данные для алкиламмониевых соединений, простых эфиров и спиртов можно описать оОцей зависимостью (Рис.136):

pKd = с + ^ MR , (25)

где =0,0Э1±0,009 и с=-1,1±0,7. При этом отдельные реакционные серии составляют бензиловне эфиры ( =0,17*0,05) и тропаты ( .

Таким образом, параметры MR предоставляют альтернативную возможность корреляции эффективности мускариновых лигандов, давая при этом более универсальные зависимости. Этот факт не объясняется просто тем, что между параметрами log р и MR соблюдается хорорая корреляция, так как включение полярных функциональных групп в структуру лигандов приводит к раздроблению этой зависимости. Следовательно, описываемый величиной MR объем молекулы следует признать по сравнению с log Р более универсальным параметром для описания взаимодействия антагонистов с мускариновым рецептором, хотя в рамках существующих теорий белок-лигандного взаимодействия наблюдаемым закономерностям, включая значения наклонов корреляционных зависимостей, трудно присвоить конкретное физическое содержание. Резюме■ Мускариновые антагонисты разделяются по характеру зависимости рК^ от строения лигандов на несколько группы, отражая разные механизмы молекулярного узнавания этих веществ рецептором.

Рис. 13. Зависимость pKd (Q ,Ди[]| и рКд (©) для мускариновых антагонистов от гидрофобности (А) и от объема (Б) лигандов (О и О -сложные эфиры, Д -простые эфиры, □ -алкиламмониевые соединения). Значения log Р' вычисляли без учета вклада атома азота. Номера соединений 1-12 соответствуют Табл.1 и 2.

Остальные соединения имели следующую структуру:

13- (Ph)(cvHex)C(OH)COO(CH2)2N Et,,Me;

14- ( VCOOC Н NEt ;

\_' суНех * *

16- PhCH2COO-^ ^+Ме2;

18- Ph2CHCH2OC2H4KMe3;

20- PhC.H-ОС-Н N+Me„;

2 4 2 4 о

22- Ph2CHC4HgN Ме3;

24- суНехС Н -N Ме„;

5 10 о

гб- Очг>

PhU 28 /t-7pNH2

30-

О-

15- Ph2CHCOOC2H4N Ме3;

17- PhCH2C00

-С21 1

N Me,

19- cyHexC2H40C2H4N Me3;

21- EtOC„H.N+Et„;

2 4 3

23-

25- PhC5H10N Me3;

27- PentH Et„

29-

NH„

5.2. Сопоставление параметров К. и К.

Л а

Антагонисты, в случае которых соблюдается двухстадийная схема рецептор-лигандного взаимодействия, характеризуются двумя константами диссоциации, Кд и Kj. При этом параметры Кд имеют одинаковое содержание с константами К^ для других лигандов. Это вытекает из единой зависимости соответствующих величин от MR, а также из одинаковых наклонов зависимостей рКа и pKrt от log Р' (Рис.13). Значение \^)=0,8i0,2 для рК

д '' ^ Д ^ 4 V' . Ч / . у «, , а «.ип ^ А

бензилатов хорошо согласуется с представлениями о гидрофобном связывании лигандов в активных центрах белков.

С другой стороны, из этих же результатов следует, что процесс изомеризации рецептор-лигандного комплекса индуцируется только в случае бензиловых эфиров и тропатов. Остальные антагонисты, рассматриваемые в рамках приведенной на Рис. 13 корреляции связываются с рецептором в соответствии с одностадийной реакционной схемой как обратимые лиганды.

Оказывается, что константы Кд для бензилатов и тропатов можно рассматривать в рамках единой зависимости, если учитывается влияние только алкильного заместителя этих сложных эфиров (Рис.14). При этом нет принципиального различия между шкалами 1од Р и МИ, так как в обеих случаях в получаемых зависимостях проявляется четкий излом. Подобные изломы хорощо известны из химии ферментов и обычно интерпретируются в рамках представления об ограниченных размерах связывающего центра белка. Вероятно, что этим и обьясняется факт, что эффективность связывания тропатов не чувствует изменений в структуре лиганда (Рис.13), так как по значениям МКА1к эти вещества останутся за "точкой излома". До "точки излома" соблюдается линейная зависимости рКд от (Рис.14):

РКА = СА + ТАМЕА11с ' <26>

где И±0,04.

В случае бензилатов и тропатов К ,=К,К,, где К.=к ./к,.

а А 1 1-11

Последняя величина характеризует изомеризационное равновесие, которое также зависит от строения лиганда. При этом проявляется аналогия в зависимостях рК1 и рКд от мкдцс' вкпичая соблюдение корреляционного уравнения: рк1 = СА + у^Кд^ , (26)

где -^=0,12±0,05.

Таким образом, в случае бензилатов имеем \уд= ^ и оба константы К, и к, дают свой вклад в зависимость К. от

а 1 а

строения лиганда, <у= .

30 ио 50 МРД1к

I I I 1

2 - Д 7 О -

2/ ДОЧ2

о. 1 - 5 /об

0 - I I I -

_1_I_130 ¿0 50

мргд1к

Рис.14. Зависимость рКд и рК^ от строения алкильной части сложноэфирных антагонистов, номера соединений соответствуют Табл. 1 и 2.

Обращает на себя внимания факт, что рецептор "узнает" строение лиганда на двух следующих друг за другом стадиях рецептор-лигандного взаимодействия. Аналогичный эффект повторного проявления гидрофобности субстрата на стадиях сорбции и катализа известен для ряда ферментов и нащел объяснение в рамках представления о возможности вторичной сорбции реагента со стороны фермента в результате замыкания гидрофобной полости его активного центра на стадии активации (Aavlksaar а1,1971; Мартинек и др,1974; Клесов 1977; Бере-зин и Мартинек, 1977). Можно высказать предположение о том, что повторное проявление одинакового фактора специфичности на последовательных стадиях сорбции и изомеризации рецептор-лигандного комплекса также связано конформационной перестройкой рецепторного белка в процессе взаимодействия с лигандом. Резюме. Установлены закономерности влияния строения антагонистов на стадиях связывания лиганда и последующей изомеризации рецептор-лигандного комплекса.

5.3. Влияние структуры антагониста на изомеризационные процессы

Объем (или гидрофобность) молекулы антагониста не определяет возможности протекания конформационной изомеризации рецептор-лигандного комплекса. Инициация этого процесса очевидно связана с особенностями структуры кислотной части этих соединений. К этим факторам строения можно отнести

36

наличие гидроксильноя группы и ароматического цикла, как это имеет место в случае эфиров трсповой и бензиловоя кислот. Для соединения первого типа скорость изомеризационного процесса превраиения комплекса в обоих направлениях мало зависит от строения антагониста (Табл. 1 и 2). В случае бензиловых эфиров, однако, переход от полиметиленовоя к алициклическоя и затем к бициклической структуре алкильноя части уменьшает значения обеих констант скорости, к^ и (Табл. 1 и 2).

Наиболее малая скорость изомеризационных процессов характеризует Ь-ХБ. С другоя стороны, объем алкильных групп тропатов больше по сравнению с этой группой в молекуле ХБ, что отражается в величинах МИ^^, и комплексы рецептора с тропатами изомеризуются быстрее. Скорость изомеризационных процессов увеличивается также при алкилировании ХБ (Табл. 1 и 3). На основании этих данных можно высказать предположение о существовании некоторого оптимального размера (объема) спиртовой части антагонистов, котрой соответствует наиболее малая скорость конформационных перестроек. В случае тех же лигандов происходят предположительно и наиболее существенные изменения конформации рецептора.

Резюме■ Скорость конформационного перехода рецепторного белка на стадии изомеризации рецептор-лигандного комплекса контролируется объемом заместителя алкильноя части этих лигандов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве основного подхода в нащих исследованиях применялся метод кинетического анализа взаимодеяствия муска-ринового рецептора с лигандами, а также процессов химической модификации, термоинактивации и солюбилизации рецепторного белка. Необходимо подчеркнуть, что нарей целью, естественно, было не простое приспосабливание методов кинетики к изучению рецепторов, а получение ответов на определенные вопросы, в первую очередь касающейся кинетической модели рецептор-лигандного взаимодействия и механизмов молекулярного узнавания структуры лиганда рецептором. Оказывается,что при этом многие проблемы в принципе не могут быть решены общепринятыми методами равновесного связывания радиолигандов с рецептором, так как в рамках этого подхода характеризуется суммарный процесс и определению поддаются только медленно диссоциирующие рецептор- лигандные комплексы. Кроме того, скорость изомеризации этих комплексов в отдельных случаях может оказаться настолько малой, что не допустит достижения в условиях эксперимента

37

истинного равновесного состояния. Все это указывает на принципиальные преимущества методов кинетического анализа.

Обнаруженный многостадийный механизм взаимодействия ряда эффективных антагонистов с мускариновым рецептором составляет конкретную основу для интерпретации результатов,полученных также другими методами рецепторологии и открывает принципиально новые возможности анализа механизмов молекулярного узнавания лиганда в связывающем центре рецептора. При этом, на основе кинетических закономерностей взаимодействия мускариновых антагонистов с рецептором, выявлялась необходимость разделения этих лигандов на две группы и только после этого стало возможным обсуждение факторов,определяющих эффективность связывания этих лигандов с рецептором и контролирующих стадию конформаиионной изомеризации рецептор-лигандного комплекса.

Проявление максимумов в зависимостях скорости иэомериза-ционных стадий от строения антагонистов свидетельствует о существовании некоторого оптимального пространственного соответствия этих молекул или отдельных их частей и связывающего центра рецептора. Вероятно, что при этом образуются наиболее тесные контакты между рецептором и лигандом, обеспечивающие максимально глубокое "внедрение" лиганда в полость связывающего центра в результате изомеризационных процессов рецептор-лигандного комплекса.

Принципиально важным результатом следует признать установление факта о том, что связывание агонистов и антагонистов с мускариновым рецептором на быстрой стадии рецептор-лигандного взаимодействия не является конкурентным, что подводит к модели рецептора с разными лиганд-связывающими центрами. Аналогичный вывод вытекает также из факта кооперативной регуляции скорости изомеризации комплекса рецептора с антагонистом. Однако в этом случае связывание дополнительных молекул лиганда с рецептором не ингибирует изомеризацию рецептор-ли-гандного комплекса, а наоборот, ускоряет этот процесс. Вероятно, что именно на этом этапе рецептор-лигандного взаимодействия имеет место разделение лигандов на агонисты и антагонисты. В рамках такой модели можно дать конкретное объяснение действию частичных агонистов, которые с близкой эффективностью взаимодействуют с центрами обоих типов.

Существует, естественно, предел применимости кинетического подхода в целях изучения механизмов клеточного рецептора, поскольку исследуемая система лишена функциональной взаимо-

38

связи с нейрональной клеткой, что несомненно отражается в свойствах рецептора. С другой стороны, однако, даже извлечение рецепторного белка из биомембраны сохраняет определенные черты кинетического поведения этого белка, несмотря на теснуп взаимозависимость свойств рецептора и его мембранного окружения. В этой связи можно надеяться, что определенная часть установленных закономерностей и механизмов рецептор-лиганд-ного взаимодействия отражает протекающие в живой природе ре-цепторные процессы и выявление соответствующих закономерностей в рамках разработанного нами научного направления кинетической рецепторологии способствует достижению более общих целей изучения клеточных рецепторов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработанный на основе комплексного использования методов химической кинетики подход для изучения механизма взаимодействия лигандов с мембранным и солюбилизированным рецепторами является информативным и эффективным, несмотря на сложность изучаемых биологических структур, на их исключительно низкую концентрацию, а также на наличие ряда методических и экспериментальных трудностей и позволяет переоценить и качественно дополнить многие общепринятые представления, основанные на применении простой одностадийной равновесной модели рецептор-лигандного взаимодействия.

2. Взаимодействие с мускариновым рецептором эффективных антагонистов, производных бензиловой и троповой кислот, протекает как многостадийный процесс, включающий стадии мономолекулярной изомеризации рецептор-лигандного комплекса. Этим изомеризационным стадиям соответствуют внутримолекулярные конформационные переходы рецептор-лигандного комплекса, скорость которых не зависит от концентрации добавленного в среду электролита.

3. Скорость связывания бензиловых антагонистов с мускариновым рецептором мозга и сердца кооперативно регулируется избытком лиганда, если в случае рецептора гладких мыщц тонкой кирки этот эффект отсутствует. На активной поверхности кооперативно регулируемых рецепторов обнаруживаются два типа ли-гандсвязывагащих центров. Определена эффективность связывания Ь-ХБ и МеПБ с этими центрами и по закономерностям влияния соли на эти константы диссоциации установлена роль ион-ионных взаимодействий при образовании рецептор-лигандного комплекса.

39

4. Влияние агонистов на кинетику связывания антагонистов с мускариновым рецептором носит неконкурентный характер и свидетельствует ое образовании тройного комплекса агонист-рецептор-антагонист в этом процессе. Образование такого комплекса необходимо учесть при интерпретации результатов радиолигандного анализа.

5. Лиганд-связываюыие свойства мускаринового рецептора контролируются -ЭН, -СООН и -ЭБ- группами белка и химическая модификация -нн2 групп не влияет на связывающие свойства рецептора. Кинетические закономерности реакции модифицирования свидетельствуют о гомогенной популяции рецепторов в мозговых мембранах. Степень доступности ЭН-группы рецептор-ного белка к химическим модификаторам меняется при связывании лигандов в активном центре рецептора, а также в процессе его солюбилизации.

6. Скорость реакции иона N,М-диметил-2-фенилазиридиния с нуклеофилами зависит от общей основности реакционной среды, описываемой параметром В, что открывает возможности применения этого реагента в качестве зонда для оценки сольватаци-онных свойств лиганд-связываюиих центров белков. Показано, что лиганд-связывающий центр мускаринового рецептора характеризуется основностью, близкой к основности амидных групп и не включает сольватную воду.

7. Мембранное окружение мускаринового рецептора определяет его лиганд-связывающие свойства и кооперативный характер взаимодействия с антагонистами, а также закономерности процесса инактивации рецепторного белка, как следует из сопоставления свойств мембранного и солюбилизированного рецепторов. Исследование временной зависимости выхода солюбилизации рецептора при разных концентрациях детергентов позволило оптимизировать этот процесс, а также оценить влияние структуры детергента на эффективность их действия. Решающим для сохранения лиганд-связывающей активности солюбилизированного рецептора является взаимодействие рецепторного белка с несколькими молекулами фосфолипидов.

8. Специфическое взаимодействие мускаринового рецептора в мембранных фрагментах коры мозга крысы с агонистами и антагонистами непосредственно влияет на физическое состояние биомембраны, о чем свидетельствует изменение её микровязкости, измеряемой с помощью липидного флюоресцентного зонда.

9. На основе кинетических закономерностей взаимодействия высокоэффективных сложноэфирных антагонистов с мускариновым

40

рецептором проведен анализ физико-химических основ молекулярного узнавания этих лигандов на отдельных стадиях процесса. Образование первого, быстро диссоциируюиего комплекса в последовательном механизме взаимодействия рецептора с антагонистами определяется строением аполярной части лигандов. Возможность изомеризации рецептор-лигандного комплекса определяется структурой ацильного фрагмента сложноэфирного антагониста. Скорость изомеризационной стадии лиганда контролируется строением алкильной группы реагента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1. jarv J., Hedlund В., Bartfal Т. Isomerlzatlon of the muscarinic receptor - antagonist complex. J. Biol. Chem., 1979, 254, 5595-5598.

2. jarv J., Hedlund В., Bartfal T. Kinetic studies on muscarinic antagonist - agonist competition. J. Biol. Chem., 1980, 255, 2649-2651.

3. jarv J. The role of anionic site in the specificity of chollnesterases. In: Proceedings of the 3rd Congress of Hungarian Pharmacological Society (Darvas F., ed.), Akademiai Kiado, Budapest, 1980, pp. 53-69.

4. JSrv J., Salt effect in the alkaline hydrolysis of some acetic esters with catlonic substituents in the leaving group. Organic Reactivity, 1980, 17, 36-50.

5. JSrv J. Specificity of the muscarinic acetylcholine receptor. In: Proceedings of USSR-Sweden III Symposium on Physico-Chemlcal Biology, Nauka, Moscow, 1981, pp. 49-50.

6. jarv J., Bartfai T. The importance of hydrophobic interactions In the antagonist binding to the muscarinic acetylcholine receptor. Acta Chem. Scand., 1982, B36, 487-490.

7. Лангел Ю.Л., Ринкен A.A., Тяхепыльд Л.Я., Ярв Я.Л. Кинетика инактивации мускаринового холинорецептора. Нейрохимия, 1982, 1, 343-351.

8. Лангел Ю., Ринкен А.А., Ярв Я.Л. Термостабильность мускаринового холинорецептора. В кн: Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии, Тбилиси, 1982, с.285-286.

9. Palumaa P., Mahar A., JSrv J. Kinetic analysis of butyrylcholinesterase inhibition with N,N-dimethyl-2-phenylazlridinium ion. Bioorganlc Chemistry, 1982, 11,

41

394-403.

10. Палумаа П.Я., Кяэмбре Т.Х. , Ярв Я.Л. Кинетика реакции N,N-димстил-г-фенилазиридиния с мускариновым холино-рецептором и ацетилхолинэстеразами. Биоорган, химия, 1983, 9, 1348-1356.

11. Сепп A.B., Краузберк Т.Х., Ярв Я.Л. Исследование кинетики термоинактивации ацетилхолинэстеразы мозга крыс и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лоради. Неирохимия, 1983, 2, 247-255.

12. Ринкен A.A., Лангел Ю.Л., Ярв Я.Л. Солюбилизация дигитонином мускаринового холинорецептора и его комплекса с хинуклидинилбензилатом. Биол. мембраны, 1984, 1, 341-348.

13. Ринкен A.A., Лангел Ю.Л., Тяхепылд Л.Я. , Ярв Я.Л. Кинетика инактивации солюбилизированного дигитонином мускаринового холинорецептора. Биохимия, 1984, 49, 1799-1802.

14. Силлард Р.Г., Ярв Я.Л., Бартфаи Г. Кинетическое проявление кооперативности взаимодействия хинуклидинилбензи-лата с мускариновым холинорецептором мозга крыс. Биол. мембраны, 1985, 2, 426-431.

15. Palumaa P., Soomets U., Järv J. Effects of reaction medium and temperature on solvolysis of N,N-dimethyl-2-phenylaziridinium ion. Organic Reactivity, 1985, 22, 238-259.

16. Палумаа П.Я., Райдару Г.И., Ярв Я.Л., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. Синтез и реакция с ацетилхолинэстеразой меченного тритием N,н-диметил-2-фенилазиридиниевого иона. Биоорган, химия, 1985, 11, 1348-1358.

17. Кыйв А.Х., Ринкен A.A., Ярв Я.Л. Изменение кооперативных свойств мускаринового рецептора при его солюбилизации. Реакц. способн. орган, соед., 1986, 23, 405-413.

18. Силлард Р.Г., Лангел Ю.Л. , Ярв Я.Л., Годовиков H.H., Карданов H.A., Трифонова С.А. Кинетика диссоциации антагонистов из комплекса с мускариновым рецептором мозга крыс. Реакц. способн. орган, соедин., 1986, 23, 373-383.

19. Ярв Я.Л., Ринкен A.A., Тоомик Р.Я., Лангел Ю.Л. Аффинные сорбенты для мускаринового рецептора. В кн: Материалы V Всесоюзного биохимического съезда. Наука, Москва, 1986, с.461-462.

20. Лангел Ю.Л., Силлард Р.Г., Ярв Я.Л., Годовиков H.H., Карданов H.A., Трифонова С.А. Взаимодействие н-алкил-

замещенных холинбензилатов с холинэстеразами. Реакц. способн. орган, соедин., 1986, 23, 133-142.

21. JSrv J., Sillard R., Bartfal Т. Influence of temperature on cooperative binding of N-nethylpiperidinyl benziiate with muscarinic receptor from rat cerebral cortex. Изв. АН ЭССР, Химия, 1987, 36, 172-180.

22. силлард P.Г., Ярв Я.Л., Бартфай Т. Влияние концентрации электролита на кооперативность взаимодействия L-хинукли-динилбензилата с мускариновым рецептором мозга крыс. Биол. мембраны, 1987, 4, 685-663.

23. Ринкен А.А., Лангел Ю.Л., Ярв Я.Л. Солюбилизация некоторыми детергентами мускаринового холинорецептора и его комплекса с хинуклидинилбензилатом. Биохимия, 1987, 52, 303-310.

24. Соометс У.В., Палумаа П.Я., Ярв Я.Л. Механизм реакции N,N-диметил-г-фенилазиридиния с аиетилхолинэстеразой в ее активном центре. Биоорган, химия, 1987, 13, 198-203.

25. Эллер М.Х., Кыйв А.X., Лангел Ю.Л., Ринкен А.А., Тнхэпылд Л.Я., Ярв Я.Л. Неприменимость хинуклидинил-бензилата для экспериментов с мускаринопым рецептором в равновесных условиях. Нейрохимия, 1987, 6, 605-610.

26. Палумаа П.Я., Ярв Я.Л., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф.

з

Получение 2-(М,11-диметиламино)-/4 1 - Н/ацетофенона. Радиохимия, 1987, 231-232.

27. Eller М., JSrv J. Two-step isomerization of quinuclidi-nyl benzilate-muscarinic receptor complex. Meurochem. Int., 1988, 12, 285-289.

28. Раидару Г., Ринкен А., Ярв Я. Гель-хроматография солю-билизированного мускаринового рецептора. Изв. АН ЭССР, ХИМИЯ, 1988, 37, 92-99.

29. Eller М., JSrv J., Paluaaa P. Influence of non-radio-

3

active ligands on kinetics of N-methyl-[ H]scopolamine binding to muscarinic receptor. Organic Reactivity, 1988, 25, 372-386.

30. Manevich E.M., K6iv A., JSrv J., Molotkovsky J.G., Bergelson L.D. Binding of specific ligands to muscarinic receptor alters the fluidity of membrane fragments from rat brain. FEBS Lett., 1988, 236, 43-46.

31. Kesvatera Т., Aaviksaar A., Peenemaa E., JSrv J. High-concentration salt effects in acetylcholinesterase reactions. Bioorganic Chemistry, 1988, 16, 429-439.

32. Эллер M.X., Ярв Я.Л., Палумаа П.Я. Влияние нерадиоактив-

з

ных лигандов на кинетику связывания N-метил-[ н]скопол-амина с мускариновым рецептором. Реакц. способн. орг. соед., 1988, 26, 354-369.

33. Eller М., Jarv J. Mechanism of N-methylscopolamlne Interaction with muscarinic receptor from rat cerebral cortex. Neurochem. Int., 1989, 15, 234-238.

34. Raidaru G., Rinken A., Jarv J., LShmus M. Chromatographic analysis of Digitalis glycosides and their relation to solubilization of muscarinic receptor. Изв.АН 3CCP, ХИМИЯ, 1989, 38, 119-124.

35. Eller M., JSrv J., Loodmaa E. Kinetic analysis of interaction of ester antagonists with muscarinic receptor. Organic Reactivity, 1989, 26, 199-210.

36. Jarv J., Eller M. Effect of ligand volume on affinity of muscarinic antagonists. Organic Reactivity, 1989, 26, 188-189.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭТИХ ИССЛЕДОВАНИИ ОБОБЦЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

37. Bartfai Т., Hedlund В., Jarv J., Nordstrom О., Muscarinic acetylcholine receptor. In: Natural Toxins (Eaker D., Wadstrom Т., eds.). Pergamon Press, Oxford -New York, 1980, pp. 531-536.

38. Jarv J., Rinken A. Effect of sulfhydryl reagents on antagonist binding with muscarinic receptors. In: Receptors and Ion Channels (Ovchinnikov Y.A., Hucho F., eds.). Walter de Gruyter & Co, Berlin - New York, 1987, pp. 101-108.

39. Jarv J., Sillard R. Cooperative interaction between the different antagonist binding sites of muscarinic receptor. In: Synaptic Transmitters and Receptors (Tucek S., ed.). Academia, John Wiley & Sons, Praha - New York, 1987, pp.101-107.

40. JSrv J., Bartfai T. Muscarinic Acetylcholine Receptor. In: The Cholinergic Synapse. Handbook of the Experimental Pharmacology (Whittaker V.P., ed.), Springer Verlag, Heidelberg - New York - London - Paris -Tokyo, 1988, pp.315-345.

41. Eller M., JSrv J. Commentary. Kinetic aspects of quinuclidinyl benzilate interaction with muscarinic receptor. Neurochem. Int., 1988, 13, 419-428.

42. JSrv,J., Arukuusk,P., K5iv,A., Rinken,A. Muscarinic receptor - biomembrane inetraction. In: Highligts of

Modern Biochemistry (Kotyk.A., Skoda,J., Paces,V., Kostka.V., eds.), VSP International Science Publishers, Zeist, 1989, pp. 1073-1082.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ ТАКЖЕ В

МАТЕРИАЛАХ СЛЕДУЮЩИХ КОНФЕРЕНЦИИ И СИМПОЗИУМОВ:

43. Bartfal Т., JSrv J., Hedlund В. Two-step binding of antagonists to muscarinic receptor. Abstracts,7th Meeting of International Society for Neurochemlstry, 1979, Jerusalem, p.213.

44. Bartfal Т., Hedlund В., JSrv J., Nordstrom 0. Muscarinic acetylcholine receptor. Abstracts, 6th International Symposium on Animal, Plant and Microbial Toxins, 1979, Uppsala, p.56.

45. Alberts P., JSrv J., Hedlund В., Nordstrom 0., Unden A., Westlind A., Bartfal T. Muscarinic acetylcholine receptor. Abstracts, International Symposium on Physico-chemical Biology, 1981, Tbilisi, p.49.

46. Jarv J., Krausberk Т., Palumaa P. Alkylation of the anionic site of cholinseterases and muscarinic acetylcholine receptor with N,N-dimethyl-2-phenylaziri dinium ions. Abstracts, 12th International Congress of Biochemistry, 1982, Perth, p.184.

47. Jarv J., Langel U., Rinken A. Different localization of the muscarinic acetylcholine receptors in the membrane structure of rat brain. Abstracts, 15th FEBS Meeting, Brussels, 1983, p.283.

48. Лангел Ю.Л., Ринкен А.А., Ярв Я. Л. Неодинаковая локализация молекул мускаринового холинорецептора в мембранах мозга крыс. 9я Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы, 1983, Ереван, с. 150-151.

49. Ринкен А.А., Лангел Ю.Л., Ярв Я.Л. Термоинактивация мембраносвязанного мускаринового холинорецептора. 9ая Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы, 1983, Ереван, с. 228-229.

50. Силлард Р.Г., Лангел Ю.Л., Тяхепылд Л.Я., Ярв Я.Л. Взаимодействие метацина и его аналогов с мускариновым рецептором и холинэстеразами. 9ая Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы, 1983, Ереван, с. 233-234.

51. Лангел Ю.Л., Кыйв А.X., Ринкен А.А., Ярв Я.Л. Солюбили-зация мускаринового холинорецептора и его комплекса с лигандом. Тезисы, 1бая Конференция ФЭБО, 1984, Москва,

С. 343.

52. Ярв Я. Л., Силлард Р.Г., Тнхепылд Л.Я. Кооперативное связывание антагонистов с мускариновыы холинорецептором. Тезисы докладов, 8ой Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР и ГДР, 1985, Рига, с.130-131.

53. JSrv J. Cooperative interaction between different antagonist binding sites of muscarinic receptor. Abstracts, 6th ESN General Meeting, 1986, Prague, p.78.

54. Ярв Я., Ринкен А. Влияние сульфгидрильных реагентов на взаимодействие антагониста с мускариновым рецептором. Тезисы докладов, Симпозиум "Рецепторы и ионные каналы", СССР-Западный Берлин, 1986, Ташкент, с.33-34.

55. Силлард Р.Г., Лангел Ю.Л., Тяхепылд .Я., Ярв Я.Л. Кооперативная регуляция взаимодействия хинуклидинилбен-зилата с мускариновыы рецептором мозга, сердца и тонкой кирки крысы. Тезисы симпозиальных докладов региональной конференции "Молекулярные механизмы регуляции метаболических процессов", 1986, Минск, с. 8-10.

56. Jarv J., Eller М. Kinetic analysis of muscarinic receptor interaction with benzilic and tropic esters. Abstracts, 10th International Symposium on Medicinal Chemistry, 1988, Budapest, p. 59.

57. Rinken A., jarv J. Kinetics of chemical modification of membrane-bound and solubilized muscarinic receptors. Abstracts, 14th International Congress of Biochemistry, 1988, Prague, p. 239.

58. Eller M., JSrv J. Kinetic studies of N-methylscopolamine interaction with muscarinic receptor from rat brain. Abstracts, 14th International Congress of Biochemistry, 1988, Prague, p. 239.

59. JSrv J. Muscarinic receptor - blomembrane interaction. Abstracts, 14th International Congress of Biochemistry, 1988, Prague, p. 25.

60. Jarv J., Eller M. Two subtypes of muscarinic antagonists. Book of Abstracts, 32nd IUPAC Congress, 1989, Stockholm, p. 76.

61. Rinken A., Arukuusk P., JSrv J. Effect of phospholipase A2 on membrane-bound and solubilized muscarinic receptors. Program and Abstracts, 7th International Conference on Cyclic Nucleotides, Calcium and Protein Phosphorylation, 1989, Kobe, p. 45.

62. J8rv J. Role of biomembrane on ligand binding to

46

muscarinic receptor. International Conference on Structure and Functions of Blomembranes, 1989, Calcutta, p. 33.

Результаты диссертации были дологены на VI Международном симпозиуме по животным, растительным и микробиологическим токсинам (Уппсала,1979); на III Симпозиуме СССР-Швеция по физико-химической биологии (Тбилиси,1981); на II Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии (Тбилиси,1982); на Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы (Ереван,1983); на 16п Конференции ФЭБО (Москва,1984); на VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Рига,1985); на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,19 86); на Международном нейрохимическом конгрессе (Прага,1986); на Симпозиуме СССР-Западный Берлин (Ташкент,1986); на V Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва,1987); на Международном биохимическом конгрессе (Прага,1988); на X Международном симпозиуме по медицинской химии(Будапешт,1988), на 32м Конгрессе IUPAC (Стокгольм,1989), на VII Международной конференции по циклическим нуклеотидам (Кобе,1989), на Международной конференции по структуре и функциям биомембран (Калькутта,1989), а также на межреспубликанских семинарах "Мускариновый рецептор" (Тарту, 1982, 1984).