Исследование биоспецифической агрегации микро- и наночастиц с помощью светорассеяния тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Н * К/л.

НЕКРАСОВ ВЯЧЕСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АГРЕГАЦИИ МИКРО- И НАНОЧАСТИЦ С ПОМОЩЬЮ СВЕТОРАССЕЯНИЯ.

01.04.17 - «химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск-2013 , 1!; ;

б ?Шг11-

005061213

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

Чернышев Андрей Витальевич, ИХКГ СО РАН

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

Докторов Александр Борисович, ИХКГ СО РАН

кандидат физико-математических наук, Ломзов Александр Анатольевич, ИХБФМ СО РАН

Ведущая организация: доктор физико-математических наук,

Лукзен Никита Николаевич, Международный Томографический Центр СО РАН

Защита диссертации состоится «26» июня 2013 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХКГ СО РАН

Автореферат разослан «23» мая 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета

Д.х.н. а.А. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время существует актуальная проблема учета гетерогенности биологических систем, возникающая при описании динамики биологических систем. В настоящее время такие системы, как правило, исследуются в приближении средних параметров, когда все элементы системы считаются одинаковыми по своим свойствам. Это приближение не всегда обоснованно, и иногда может приводить к неправильным эффектам. Поэтому вопрос корректного учета существующих неод-нородностей является актуальным при попытке понять, насколько это может быть важно.

Ключевую роль в этих исследованиях играет выбор удобной модельной системы. Потенциально функция распределения может влиять на скорость протекания реакции в биологических системах.

Интерес к изучению таких систем дополнительно стимулирован практическими интересами некоторых вопросах иммуноагглютинации, имеющими приложения в медицинской сфере.

Основные цели работы:

1. Модифицировать сканирующий проточный цитометр для измерения поляризационного сигнала индикатриссы от одиночных частиц.

2. Провести теоретический анализ возможного влияния функции распределения частиц по количеству поверхностных рецепторов на скорость агрегации частиц.

3. Разработать подходы к определению константы димеризации агрегации частиц в том случае, когда измерение абсолютной концентрации частиц в процессе реакции затруднено.

Научная новизна работы. Впервые разработана модифицированная схема сканирующего цитометра, позволяющая измерять одновременно два сигнала индикатриссы, являющихся различными комбинациями элементов матрицы Мюллера. Проведенные эксперименты на латексных микросферах и хламидомонадах доказали преимущества данной схемы перед стандартной в области дискриминации различных субпопуляций частиц в одной пробе.

Разработанная математическая модель, учитывающая конечную функцию распределения частиц по количеству рецепторов, позволяет корректно учитывать гетерогенность агрегирующих частиц.

Предложен новый функционал от концентраций частиц, позволяющий определять константу скорости димеризации в реакции агрегации в том случае, когда невозможно измерение абсолютных концентраций частиц в ходе реакции, а также при существовании "мертвого" времени измерений.

Практическая значимость работы заключается в разработке нового инструментального решения для измерения оптических сигналов от индивидуальных частиц, которое улучшает возможности для решения обратной задачи определения параметров измеряемых частиц. Разработанная математическая модель агрегации неоднородных по количеству поверхностных рецепторов позволяет корректно учитывать существующую гетерогенность частиц. Предложенный функционал от концентраций частиц позволяет определять константу димеризации даже без знания абсолютных концентраций частиц.

Полученные результаты имеют значения для дальнейшей работы по корректному определению параметров биоспецифической агрегации.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Улучшенная схема поляризационного сканирующего цитометра повышает информативность оптических измерений одиночных частиц. Уста-

новлено, что средние размеры и показатель преломления хламидомонад составляют (8.9±1.6) мкм и (1.439±0.021), соответственно.

2. Разработанная математическая модель агрегации в гетерогенной системе позволяет учитывать распределение частиц по параметрам для определения константы скорости агрегации мономеров, существенно различающихся по количеству поверхностных сайтов связывания.

3. Для уравнения Смолуховского предложен функционал от вектора концентраций агрегатов для определения константы скорости димеризации. Показано, что для широкого класса ядер уравнения Смолуховского значение этого функционала линейно зависит от времени на начальной стадии.

Личный вклад соискателя. Все приведенные в работе результаты получены либо самим автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Изложенные в диссертационной работе результаты докладывались и обсуждались на следующих международных и всероссийских конференциях: XII Всероссийский семинар "Нейроинформа-тика и ее приложения " (Красноярск, 2004); Proceededings of the forth in-yernational conference on bioinformatics of genome regulation and srtructure (Novosibirsk, 2004); Chemical and Biological problems of Proteomics, International Conference (Новосибирск, 2004); Десятая Всероссийская Научная Конференция Студентов-Физиков и Молодых Ученых (Москва, 2004); III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010); Материалы молодежной конкурс-конференции "Фотоника и оптические технологии" (Новосибирск, 2011).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах из списка ВАК, и 6 тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 127 страницах,

содержит 27 рисунков, 4 таблиц. Список цитируемой литературы включает 117 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы.

Первая глава представляет собой литературный обзор. В первой части главы описаны наиболее распространенные оптические методы исследования реакции агрегации, которые условно делятся на две основные группы - исследования на ансамбле и на одиночных частицах. Обсуждаются преимущества и недостатки каждого из подходов с точки зрения применимости в практических приложениях. Во второй части описывается свойства уравнения Смолуховского, являющегося базовым для понимания процессов агрегации. Рассмотрены случаи точных, аналитических решений уравнения Смолуховского для различных физических приложений. Приведены существующие способы приближенных и асимптотических методов решения в некоторых частных случаях. В частности, описывается асимптотическое поведение на начальных стадиях реакции агглютинации, и на поздних стадиях, с точки зрения теории динамического сканирования. Обсуждается вопрос существования гель-эффекта для различных ядер уравнения Смолуховского. Отдельно рассмотрен вопрос влияния разнообразных физических факторов на скорость агрегации для биоспецефических реакций. Особое внимание уделено практическим приложениям теории агрегации, в частности определению концентрации антител в растворе в медицинских приложениях.

Глава заканчивается описанием проблем, возникающих при исследовании реакции агглютинации в биомедицинских приложениях и формулировкой общих целей диссертации.

Первую главу завершает постановка задачи, где указаны конкретные задачи, сформулированные исходя из общей цели.

Вторая глава посвящена

l.&iltf

1ЛЧ0*

Integral 5/

описанию схемы сканирующего проточного цитометра. Предложен вариант модификации, названный поляризационным сканирующим ци-тометром, позволяющий измерять одновременно две сигнала индикатриссы, являющимися различными комбинациями матрицы Мюллера. Данная модификация существенно улучшила возможности сканирующего цитометра в области идентификации и харак-теризации измеряемых частиц, что было продемонстрировано на двух экспериментальных системах — мо-

Рис. 1 Экспериментальные сигналы от хламидомонад и микросфер размерами 2 и 6 мкм.

j monomer | | dimer |

i

-J I

/ Л

-X

л/ INn

Г

дельных полистирольных микросферах и зеленых водорослях (СЫатус1отопаз гетЬагскН). На рис.1 приведен результат измерений в терминах интегральных оптических сигналов от двух индикатрисе, от пробы частиц, содержащей хламидомонады и два

типа латексных микросфер, раз-Рис. 2 Два различных поляризационных оптических сигнала от мономеров и димеров микросфер мерами 2 И 6 мкм. На рис.2 при-с размеров 2 мкм

ведены два поляризационных

Tim«, art units

сигнала индикатриссы для мономеров и димеров латексных частиц, имеющих размеры 2 мкм.

Третья глава посвященная результатам работы в исследовании динамики агрегации частиц, и состоит из двух разделов. Первый раздел главы посвящен развитию кинетической теории агрегации и содержит результаты, касающиеся теоретической части работы. В первом подразделе выводится следующая формула для зависимости константы реакции между двумя одинаковыми по размеру сферическими частицами для модели белых сфер с черными пятнами в кинематическом пределе.

где Х\ 2 и у¡^ - количество свободных и занятых лигандами рецепторов на поверхности частиц соответственно, кая — кинетическая константа.

На основании данной формулы было показано, что кинетика образования димеров С2 в первоначальные моменты времени не зависят от явного вида функции распределения агрегирующих частиц по количеству рецепторов на поверхности, а зависит только от средних параметров, таких как концентрация рецепторов в объеме /0 и концентрация антител в растворе

В следующем подразделе рассмотрен вопрос о влияние конечной ширины функции распределения частиц по количеству рецепторов на поверхности на дальнейшую динамику агрегации. Показано, что в дальнейшем конечная ширина функции замедляет скорость агрегации по сравнению с тем случаем, когда все частицы одинаковые. Для частного случая,

(1)

А0

(2)

когда функцию распределения можно представить в виде суммы двух дельта-функций, получено аналитическое решение.

В следующем подразделе доказано, что если функцию распределения частиц по посадочным местам можно представить в виде гауссового распределения, то для начальных стадий агрегации функция распределения мономеров по количеству рецепторов, эволюционирует тоже в гауссиан с неизменной дисперсией, но изменяющейся амплитудой и средним количество рецепторов. Для более сложного случая, когда первоначальное распределение представляется в виде суммы гауссианов, получены уравнения, описывающие поведение функции распределения по количеству рецепторов в виде системы обыкновенных дифференциальных уравнений.

Далее, в следующем подразделе, рассмотрен вопрос определения константы димеризации агрегирующих частиц. Показано, что если ввести

00

следующий функционал от концентрации агрегатов У = —- , который

есть доля суммы всех агрегатов относительно мономеров, то можно доказать следующую зависимость этого функционала от времени.

7(0 = ^,(0)*,,/ + о(гЭ) (3)

где С,(0) — первоначальная концентрация мономеров в растворе, ¿у; -константа димеризации. Данный функционал позволяет определять константу димеризации частиц, измеряя только относительную долю агрегатов в растворе в процессе реакции. Существует также несколько других стандартных способов определения константы димеризации кц

С,(0)

1

0 2 1с((0 2

Однако они требуют измерения абсолютной концентрации частиц в процессе реакции, что далеко не всегда возможно с точки зрения экспериментальных возможностей.

Причем в отличие от других существующих методов линеаризации зависимости измеряемых параметров предложенный функционал сохранят линейность вплоть до малостей третьего порядка по времени, независимо от конкретного вида ядра в уравнении Смолуховского. На рис.3 приведен пример моделирования функционалов У, Б, N для ядра в виде £(7^=/+/, а также их отличие от прямой линии, которая является точным решением для ядра в виде константы. Можно отметить, что функционал У ведет себя практически линейным образом на широком интервале безразмерных времен. Например, для безразмерного времени 1=1 функционал У=0.9 и отличается от прямой на 10%, причем концентрация мономеров для 1=1 падает более чем в 3 раза. Таким образом, данный параметр позволяет экспериментально определять константу кц просто линей-

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

безразмерное время, I Рис. 3 Результат численного моделирования У, N для уравнения Смолуховского с ядром к(Ц)=і+]

ной аппроксимацией относительной доли агрегатов, даже без измерения абсолютных концентраций и при наличии значительного мертвого времени экспериментальной установки.

В том случае, когда в начальный момент времени в растворе есть не только мономеры, но и агрегаты, то формула (3) требует модификации

где Мо(0) - первоначальная концентрация всех частиц. В этом случае определение константы димеризации также возможно по начальному на-

следующий подраздел посвящен рассмотрению реакции агрегации ла-тексных полимерных микросфер в том случае, когда необходимо учитывать дискретную природу рецепторов на поверхности частиц. Необходимость учитывать дискретность рецепторов возникает в том случае, когда характерное число занятых рецепторов на поверхности частицы сравнимо с единицей. В этом случае уже важно учитывать стохастическую природу химических реакций, которая приводит к тому, что возникает распределение частиц по количеству рецепторов на поверхности, даже в том случае, если все частицы одинаковые. При малых концентрациях антител в растворе возможно возникновение ситуации, когда на поверхности агрегатов частиц отсутствуют связанные антитела, несмотря на ненулевую концентрацию антител в растворе. Это приводит к тому, что кинетика реакции агрегации в случае малых концентрациях антител происходит по другим закономерностям, нежели в том случае, когда не учитывается в явном виде дискретность рецепторов на поверхности частиц. В силу существенной гетерогенности образующихся агрегатов по количеству свободных и заня-

2

(5)

клону функционала У, если учесть поправочный фактор

мМ\2

тых рецепторов на своей поверхности становится затруднительным расчет кинетики агрегации с помощью классических уравнений Смолуховского, оперирующих такими средними параметрами, как доля занятых и свободных рецепторов. В данном случае необходимо детальный учет всех участвующих в агрегации частиц, каждая их которых обладает индивидуальными параметрами. Для решения этой задачи использовался стандартный алгоритм, разработанный ОШзр1е, моделирующий химические реакции из первых принципов. Предложенная модель константы реакции между агрегатами различных размеров и с различным числом поверхностных рецепторов позволило на основе данного алгоритма провести численное моделирование реакции агрегации существенно неоднородной популяции частиц.

Последний подраздел посвящен проблеме межпопуляционной динамики микроорганизмов в проточных реакторах типа хемостат при учете гетерогенности микроорганизмов по скорости роста. На вход такого реактора подаются метаболиты постоянной концентрации с постоянной объемной скоростью, а на выходе выводится такой же объемный поток, через который выводится метаболиты и микроорганизмы, живущие в хемостате. Как хорошо известно, в таких реакторах в стационарном состоянии концентрация метаболитов и микроорганизмов не зависит от концентрации в хемостате метаболитов и микроорганизмов в начальный момент времени, что делает такие системы привлекательными для изучения. При отсутствии среди микроорганизмов взаимодействия типа "хищник-жертва" ранее было показано, что верна следующая формула:

входе в хемостат, пят — число различных типов микроорганизмов и ме-

(6)

где Л/ и Л,° - стационарная концентрации метаболитов в хемостате и на

таболитов, существущих в хемостате. Вывод данной формулы была основан на уравнениях биокинетики, описывающих рост микроорганизмов в терминах средних концентраций. В данном подразделе решен вопрос, что изменится в том случае, если более детально учитывать существующее распределение микроорганизмов по возрасту, который может влиять на скорость роста. Оказывается, даже в этой более детальной модели скорости роста микроорганизмов, эффект квантования плотностнозависимых факторов роста сохраняется в неизменном виде (6). Также был рассмотрен вопрос влияния еще одного типа гетерогенности микроорганизмов, связанный с неоднородностью популяций микроорганизмов по удельной скорости роста. В этом случае было показано, что для стационарного состояния соотношение (6) также остается верным.

В следующем разделе описываются экспериментальные результаты, посвященные исследованию биоспецифической агрегации. В первом подразделе сделан анализ точности определения параметров константы диме-ризации для реакции агрегации, в том случае, если пользоваться предложенным функционалом У, являющимся относительной долей агрегатов в растворе. Показано, что если в эксперименте измерять N частиц, то сред-неквадратическое отклонение параметра У из-за случайных флуктуаций, связанных с конечным числом измеренных агрегатов за одно измерение можно определить, как

Эта формула позволяет заранее планировать условия проведения эксперимента для достижения требуемой точности определения параметров агрегации.

Следующий подраздел экспериментального раздела посвящен определению константы димеризации для модельной системы из латексных мик-

(7)

росфер с помощью предложенного функционала У. В качестве системы антитело-рецептор был использован классическая пара биотин-стрептавидин. На поверх-• ность двухмикронных мик-

росфер был нанесен биотин,

Рис. 4 Динамика функционала У для полимерных

микросфер, покрытых биотипом. а в качестве антител в рас-

1.2 * 10

|о>

>" 0.9 0.4

О 25 Э0 35

Ьт*, тт

ки =(0.061 ±0.003)* 10

-'5см твор добавлялся стрептави-

дин. В эксперименте по агрегации в раствор, содержащий микросферами с биотином, добавлялся стрептавидин. Далее, в определенные моменты времени из реагирующей смеси извлекался малый объем, который разбавлялся в 100 раз, для замедления реакции, и в дальнейшем измерялся на сканирующем проточном цитометре. Благодаря тому, что сканирующий проточный цитометр позволяет легко отделять мономеры от агрегатов микросфер, возможно определение функционала У. Таким образом, последовательно измеряя У в несколько моментов времени, возможно определять константу димеризации, зная первоначальную абсолютную концентрацию моно-

Рис. 5 Результат агрегации для предыдущего экспе меров микросфер, римента, обработанного по стандартной методике

На рис.4 показан резуль-

смг

кп = (0.062 ± 0.008) * 10""--тат экспериментов по агре-

с

гации на сканирующем проточном цитометре. На рис.5 показаны результаты предыдущего эксперимента, обсчитанного по стандартной методике, использующей динамику абсолютных концентраций мономеров. Видно, что результаты совпадают с точностью до ошибок. Еще раз подчеркнем, что предлагаемый подход не требует от прибора измерять абсолютной концентрации агрегирующих частиц, и также позволяет измерять реакцию на поздних стадиях.

В следующем подразделе приведены результаты по агрегации тромбоцитов человека. Эксперименты проводились по такой же схеме, как и эксперименты с латексными частица. В качестве индуктора агрегации тромбоцитов выступал АДФ. В силу того, что решение обратной задачи для тромбоцитов сопряжено со значительными сложностями, в настоящий момент не существует надежных алгоритмов отделения мономеров тромбоцитов от их агрегатов, в связи с чем прямое использование функционала У для определения константы димеризации невозможно. Однако, если сделать предположение, что экспериментально наблюдаемая функция распределения частиц по интегралу светорассеяния состоит из двух фракций, относящихся к мономерам и агрегатам, причем каждая из фракций описы-

вается логнормальным

п 120

15 минут

□

Эксперимент Теория

распределением, то возможно определять отно-

си га

сительную долю агрега-

о 80-I п

тов для каждого измерения, если считать, что функция распределения

0

±_|ЗЁВ8МЙВД ><П « т ,

1000 2000 3000 мономеров тромбоцитов Интеграл светорассеяния, у.е. НРМ,ЫРННЯ гп „именем.

неизменна со временем. На рис.6 приведен ре-

Рис. 6 Гистограмма тромбоцитов от интеграла светорассеяния

зультат обработки данных через 15 минут после начала агрегации для одного из доноров. На следующем рисунке приведены экспериментальные результаты по агрегации тромбоцитов для двух доноров, по которым были

2

3

>

г-

1-

о

о

4

Время, НИН

8

12

16

О 4 8 12 16 Время, мин

Рис. 7 Результаты агрегации для двух доноров

кп =(1.1 ±0.1)- 10""см3/сдля первого и кп =(6.0 ± 0.5) ■ 10"12 см3/с для второго

донора соответственно

определены константы скорости димеризации тромбоцитов, которые оказались близки к предельным диффузионным скоростям агрегации.

В последнем подразделе приведены экспериментальные результаты по агрегации полимерных частиц нанометровых размеров (70 нанометров). Для агрегации использовался один из стандартных коммерческих доступных наборов для определения белка СРВ, который является одним из важнейших маркеров острой фазы заболевания. В силу того, что размер частиц выходит за рабочий диапазон сканирующего проточного цитометра, измерения агрегации проводились на ансамбле частиц с помощью спектрофотометре на длине волны 540 нм стандартным турбодиметрическим методом, который заключался в измерении динамики оптической плотности раствора реагирующих латексных микросфер от времени. Поскольку для определения параметров агрегации требуется решать обратную задачу, которая включает в себя решение прямой задачи, необходимо уметь рассчитывать оптическую плотность раствора агрегатов с известными кон-

0.90-1

центрациями. Это возможно с помощью исполь-

зования алгоритмов расчета оптических свойств частиц с произвольной формой методом дискретных диполей. С помощью

о 25 50 75 100 125 150 175 2С0 225 250 275 300 325 Ите, 5ес

стандартных существую-

Рис. 8 Результаты подгонки экспериментальные данных по кинетики оптической плотности к теоретическим для трех различных концентраций белка.

щих алгоритмов были рассчитаны сечения экстинк-

ции для различных агрега-

тов. Далее, используя алгоритмы СШБр1е для динамики агрегации гетерогенных частиц, была рассчитана динамики кинетики оптической плотности раствора для различных параметров системы, которые не были известны заранее, таких как среднее число рецепторов на поверхности 70-ти на-нометровых микросфер, константа аффиности антитело-рецептор и кинетическая константа. Из сопоставления теоретических и экспериментальных результатов были определены эти неизвестные параметры для данной используемой тест-системы, которые оказались равны следующим:

Кё = (1.82 ±0.7) »10"" Л/ // = 9.0 ±2.2 Р = (4±1.4)»10~6

где Ка - константа аффинности, N - среднее количество рецепторов на микросфере, Р - кинетическая константа.

Таким образом, можно по кинетики оптической плотности определять параметры тест-системы. Либо, зная эти параметры из предварительных экспериментов, определять неизвестную концентрацию антител в пробе.

В Заключении сформулированы основные результаты диссертации:

1. Продемонстрировано использование новой поляризационной схемы сканирующего проточного цитометра для измерения биологических частиц (хламидомонады). Экспериментально показано, что поляризационный сигнал позволяет улучшить возможности классификации.

2. Для уравнения Смолуховского предложен функционал от вектора концентраций агрегатов для определения константы скорости димеризации. Показано, что для широкого класса ядер уравнения Смолуховского значение этого функционала линейно зависит от времени на начальной стадии.

3. На двух экспериментальных системах (агрегация тромбоцитов и агрега-

ция латексных микросфер, покрытых биотином) определена константа скорости димеризации с помощью предложенного функционала.

4. Теоретически показано, что конечная функция распределения частиц по

посадочным местам замедляет скорость протекания агрегации. В том случае, когда скорость реакции между частицами максимальна, скорость агрегации димеров на начальной стадии не зависит от функции распределения мономеров по количеству занятых рецепторов.

5. Показано, что в реакции агрегации, идущей с участием микросфер, в случае низких концентрациях добавленных антител необходимо учитывать дискретную природу рецепторов.

6. Предложено обобщение свойства "квантования" коэффициентов чувствительности в сообществе микроорганизмов с неоднородным распределением субпопуляций по скорости роста и возрасту. Показано, что учет распределения микроорганизмов по скорости роста и возрасту не нарушает "квантования" коэффициентов чувствительности контролирующих рост факторов

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. В.М.Некрасов, А.В.Чернышев, А.Н.Дегерменджи «Сохранение эффекта "квантования" коэффициентов чувствительности в микробных популяциях при наличии распределения клеток по скорости роста и возрасту», Доклады Академии Наук, т.406, №4 (2006): 1-3.

2. L.Fiorani, V.P.Maltsev, V.M.Nekrasov, A.Palucci, K.A.Semyanov, V.Spizzichino «Scanning flow cytometer modified to distinguish phytoplankton cells from their effective size, effective refractive index, depolarization, and fluorescence», Applied Optics 47, № 24 (2008): 4405^*412.

3.D.I.Strokotov, A.E.Moskalensky, V.M.Nekrasov «Polarized Light -scattering Profile—advanced Characterization of Nonspherical Particles with Scanning Flow Cytometry», Cytometry Part A 19A, № 7 (июль 1, 2011): 570579.

4. И.В.Колесникова, В.М.Некрасов, Т.Н.Шерстова, Г.А.Цветовская, Е.Д.Чирикова, В.П.Мальцев, А.В.Чернышев «Определение динамических характеристик тромбоцитов по начальной стадии их агрегации», Вестник НГУ, 4 (2009): 23-30.

г

<7

Подписано к печати 20 мая 2013г. Тираж 100 экз. Заказ № 029. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

На правах рукописи

0420135^76^

Некрасов Вячеслав Михайлович

Исследование биоспецифической агрегации микро- и наночастиц с помощью светорассеяния

Специальность 01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель -к.ф.м.н. Чернышев А.В.

Новосибирск 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...................................................................................................................3

Глава 1. Обзор литературы.......................................................................................................8

1.1. Оптические методы исследования процесса агрегации...............................................8

1.2. Агрегация.............................................................................................................................19

1.2.1. Случаи точного решения уравнения Смолуховского..................................................22

1.2.2. Приближенные и асимптотические методы решения уравнения Смолуховского ...27

1.2.3. Влияние физических факторов на скорость биоспецифической агрегации..............36

1.2.4. Методы определения концентрации антител по результатам оптических измерений39 Глава 2. Модернизация сканирующего проточного цитометра......................................43

2.1. Оптическая система регистрации флуоресценции......................................................43

2.2. Поляризационные измерения на сканирующем проточном цитометре.................52

Глава 3. Исследование динамики агрегации частиц.........................................................60

3.1. Развитие кинетической теории агрегации....................................................................63

3.1.1. Влияние функции распределения частиц по количеству поверхностных рецепторов на динамику агрегации....................................................................................................................63

3.1.2. Замедление скорости агрегации, обусловленное конечной шириной функции распределения частиц.................................................................................................................72

3.1.3. Аналитическое выражение для динамики димеров частиц в случае гауссового вида распределения..............................................................................................................................76

3.1.4. Квазилинейная зависимость относительной доли агрегатов от времени..................78

3.1.5. Учет дискретности количества рецепторов для частиц нанометровых размеров.... 89

3.1.6. Агрегация микроорганизмов в процессе роста: сохранение канонического вида биокинетических уравнений при учете распределения по скорости роста и возрасту........93

3.2. Экспериментальное исследование реакции агрегации..............................................97

3.2.1. Дисперсия относительной доли агрегатов............г.......................................................97

3.2.2. Биоспецифическая агрегация латексных микросфер..................................................99

3.2.3. Агрегация тромбоцитов................................................................................................102

3.2.4. Латексно-усиленная турбидиметрия...........................................................................106

Выводы.................................................................................................................110

Литература..........................................................................................................115

Введение

Дисперсные системы широко распространены в природе. Существует два принципиально разных подхода при исследовании дисперсных систем: исследование системы как целого, и изучение отдельных ее составляющих. При проведении исследований дисперсионной системы как целого, интерпретация результатов зависит от степени гетерогенности системы, которая зачастую заранее не известна. Исследование же отдельных составляющих частей системы от степени гетерогенности не зависит и дает наиболее полную и детальную информацию о системе.

Изучение особенностей кинетических процессов, связанных с биологическими объектами, биохимических реакций, молекулярной динамики элементарных процессов - это краткий список вопросов, которыми занимается наука биокинетика. Как правило, биологические процессы очень сложные, на их протекание влияет множество различных факторов. Зачастую, чтобы упростить описание системы, многие исследователи полагают, что изучаемая система состоит из элементов с одинаковыми свойствами. Неоднородность (гетерогенность) элементов популяции по биологическим и физико-химическим свойствам учитывается редко. Однако известно, что биологические системы характеризуются существенной неоднородностью, и для исследования биологической системы важно учитывать распределения частиц (составляющих систему) по параметрам (например, количество рецепторов на поверхности клеток, размер частиц и пр.). В ходе реакции в биологической системе параметры частиц (клеток) меняются, что проявляется в изменении соответствующей функции распределения.

В последние годы с разработкой новых методов появляется все больше

экспериментальных работ, посвященных исследованию биоспецифической

агрегации частиц как микро-, так и нанометрового диапазона размеров. При этом

наиболее распространенными экспериментальными методиками по исследованию

агрегации частиц являются оптические. Среди этих оптических методов

выделяется проточная цитометрия, так как позволяет с большой скоростью

3

измерять одиночные частицы исследуемой популяции, достигая высокой статистической точности и информативности без априорных предположений о функции распределения частиц по параметрам. Однако, для количественных кинетических исследований биоспецифической агрегации частиц в сильно неоднородных средах, эти методы не были достаточно развиты, либо - не применялись. Актуальность данной работы таким образом определяется как методами, так и объектами исследования.

С одной стороны, существует проблема повышения информативности измерения одиночных частиц за короткое время в целях накопления достаточной статистики в кинетических измерениях процессов биоспецифической агрегации, что решается в данной работе развитием перспективной инструментально-методической базы, основанной на технологии сканирующей проточной цитометрии, и с измерением динамики функций распределений. Важность исследований обоснована фундаментальной ролью данных процессов в нормальной жизнедеятельности биологического организма.

С другой стороны, существует проблема корректного определения количественных параметров динамики биоспецифической агрегации в среде с неоднородным распределением связывающих центров. Эта проблема решается в данной работе развитием нового метода обработки динамики функций распределения частиц по измеряемым параметрам.

Целью данной диссертационной работы является исследование агрегации частиц микронных и нанометровых размеров с помощью светорассеяния. Проведенная работа развивает потенциал технологии сканирующей проточной цитометрии для кинетических исследований в биологических дисперсных системах.

В работе

1. Продемонстрировано использование сканирующего проточного цитометра для регистрации биологических частиц (хламидомонада). Экспериментально показано, что поляризационный сигнал позволяет улучшить возможности их классификации.

2. Для реакции агрегации предложен новый функционал для определения константы скорости между двумя мономерами частиц, основанный на измерении только относительной концентрации мономеров и агрегатов частиц. Показано, что для широкого класса ядер в уравнении Смолуховского этот функционал ведет себя почти линейным образом в широком диапазоне безразмерного времени.

3. На двух экспериментальных системах (агрегация тромбоцитов и агрегация латексных микросфер, покрытых биотином) продемонстрировано, что предложенный функционал позволяет извлекать константу скорости димеризации.

4. Исследована реакция агрегации на первоначальных стадиях образования олигомеров. Показано, что конечная ширина функции распределения мономеров по посадочным местам замедляет скорость протекания агрегации.

5. Теоретически и экспериментально доказано, что в том случае, когда скорость реакции между частицами максимальна, влияние функции распределения на скорость протекания реакции минимально.

6. Показано, что в реакции агрегации, идущей с участием микросфер, в случае низких концентрациях добавленных антител нельзя пользоваться стандартными моделями константы агрегации, и необходимо учитывать дискретную природу рецепторов.

7. Предложено обобщение эффекта "квантования" коэффициентов чувствительности в сообществе микроорганизмов с неоднородным распределением субпопуляций по скорости роста и возрасту. Показано, что введение такого распределения в динамику межпопуляционного взаимодействия микроорганизмов не нарушает эффект.

Проведенная работа позволила развить потенциал метода проточной цитометрии для исследования биоспецифической агрегации микро- и нано- в гетерогенных системах. Практическая ценность настоящей работы определяется использованием полученных результатов: - в иммунологии;

- в исследовании вирус-клеточного взаимодействия;

- в серологическом анализе методом иммуно-агглютинации;

- в анализе гемостаза (свертываемости крови).

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН.

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 117 наименований. Диссертация изложена на 127 страницах, включает 4 таблицы, 27 рисунков.

В первой главе сделан литературный обзор, который описывает современное состояние дел в области агрегации частиц, несущий на себе биологические метки. Рассмотрены методы измерения агрегации частиц, основанные на оптических технологиях. Описаны способы определения параметров процесса агрегации исходя из данных, получаемых в оптических методах измерений.

Во второй главе описан новый вариант сканирующего проточного цитометра, позволяющего проводить поляризационные измерения. Предложенная схема позволяет измерять две комбинации матрицы Мюллера, в отличие от предыдущего варианта.

Третья глава представляет собой теоретическое и экспериментальное исследование процесса биоспецифической агрегации микро- и нано частиц с помощью светорассеяния. Показано, что существование гетерогенности агрегирующих частиц по количеству рецепторов влияет на скорость протекания процесса агрегации. Для некоторых простейших моделей константы агрегации агрегатов в уравнении Смолуховского доказано, что суммарная скорость реакции замедляется с ростом ширины функции распределения по количеству рецепторов. Предложен и экспериментально проверен новый способ определения константы скорости образования димеров, основанный только на измерении относительной концентрации мономерных частиц и полной концентрации частиц, который возможно применять в более широком диапазоне экспериментальных условий, чем традиционные методы. Разработана новая модель константы скорости

агрегации микросфер, покрытых антителами, учитывающая дискретность числа антител. Проведенные расчеты и эксперименты показывают, что предложенная модель более адекватно описывает замедление скорости агрегации в области малых концентраций индукторов агрегации.

В заключении кратко сформулированы основные результаты работы. Основные результаты представлены в 7 статьях, включенных в прилагаемый перечень.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Улучшенная схема поляризационного сканирующего цитометра повышает информативность оптических измерений одиночных частиц. Установлено, что средние размеры и показатель преломления хламидомонад составляют (8.9±1.6) мкм и (1.439±0.021), соответственно.

2. Разработанная математическая модель агрегации в гетерогенной системе позволяет учитывать распределение частиц по параметрам для определения константы скорости агрегации мономеров, существенно различающихся по количеству поверхностных сайтов связывания.

3. Для уравнения Смолуховского предложен функционал от вектора концентраций агрегатов для определения константы скорости димеризации. Показано, что для широкого класса ядер уравнения Смолуховского значение этого функционала линейно зависит от времени на начальной стадии.

Содержание диссертации докладывалось на международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 2005 г.), на десятой всероссийской научной конференции студентов-Физиков и молодых ученых (Москва, 2004), на международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 1999 г., 2000 г., 2002 г.), на XII Всероссийском семинаре "Нейроинформатика и ее приложения" (Красноярск, 2004), на международной конференции "Биоинформатика структуры и регуляции геномов" (Новосибирск, 2004), на III Евразийском конгрессе по

медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА - 2010" (Москва, 2010 г.), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН.

Основные результаты диссертации опубликованы в 7 статьях реферируемых журналов.

Глава 1 .Обзор литературы

1.1. Оптические методы исследования процесса агрегации

Одна из главных проблем в коллоидной химии - определение функции распределения частиц по размерам в исследуемом образце. Разработано множество различных физических методик, направленных на решение данной проблемы, каждая из которых обладает своими собственными достоинствами, недостатками и областью применимости. При изучении продуктов реакции агрегации, проходящей в жидкой фазе, характерных для многих биологических процессов, наибольшее распространение получили оптические методы исследования, обладающие рядом важных преимуществ. Основное преимущество - возможность неразрушающего, бесконтактного получения информации об агрегатах. Это особенно важно для исследования продуктов агрегации биологических частиц, агрегаты которых могут распадаться на более мелкие агрегаты при контактном воздействии, в силу непрочных нековалентных связей между субъединицами в агрегате.

Все оптические методы можно условно разделить на два больших класса -исследование оптических свойств на ансамбле частиц, и на отдельных частицах. Исследования на ансамбле частиц позволяют узнать некоторую усредненную информацию об измеряемой популяции агрегатов, в то время как измерения отдельных частиц позволяют получить максимально полную информацию об оптических свойствах индивидуальных агрегатах. Приборы, измеряющие светорассеяние на ансамбле, как правило, проще в устройстве и эксплуатации, но

платой за это является неполнота получаемых данных, по сравнению с более сложными приборами, измеряющими индивидуальные частицы.

Как правило, различные методы имеют довольно-таки узкий диапазон по концентрациям частиц, при которых приборы, основанные на данном методе, работают в оптимальном режиме. Обычно разброс по концентрациям относительной оптимальной не превышает одного порядка. Другой важный параметр - характерные размеры частиц, которые способен измерить прибор, диапазон которых также не превышает одного-двух порядков. Такие весьма жесткие ограничения по динамическому диапазону размеров обычно связаны с сильно нелинейной зависимостью сигнала от размера частиц.

В нижеследующей таблице приведен краткий список наиболее распространенных методов, исследующих коллоидные растворы.

Таблица 1

Название метода Ансамбль (А)/ индивидуальная частица (И) Диапазон размеров, <1 Характерные концентрации частиц, см"3

Оптическая микроскопия И >0.2 пт

Электронная микроскопия И >1 пт

Култер И >0.5 ¡ш Ю7

Динамическое светорассеяние И 2-5000 пт Ю\й=0.7т)

Флуктуация турбидиметрии А 109(ё=0.3 /мп)

Малоугловое рассеяния И 0.2-2 ¡мп Ю'-Ю*

Дифракционная спектроскопия ограниченное разрешение 3-550 ¡мп 104(ё=10/^)

Статическое светор ассеяние/ нефелометрия А 2-480 пт 108(<1=0.7/*и)

Конфокальная микроскопия ограниченное разрешение \00nm Конфокальная микроскопия

4п микроскопия ограниченное разрешение 20 пт

Турбидиметрия А 0.04-1 /т 109(с1=0.3 /ш)

Спектротурбидиметрия А 0.2-15 [мп

Проточная цитометрия И 0.3-15 //т

Оптическая микроскопия, история возникновения которой в своем простейшем варианте светового микроскопа восходит к концу 15 века, позволяет исследовать объекты размером порядка половины длины волны видимого диапазона. Благодаря его низкой стоимости и простоте использования, а также совместимости с флуоресцентными измерениями, этот метод до сих пор применяется в клинической диагностики и биологии, особенно в тех случаях, когда у исследователя есть основания сомневаться в диагнозе, полученным по другим методикам. В последнее время появились полностью автоматизированные микроскопы, позволяющие максимально ускорить рутинную составляющую этого метода, быстро сканировать большое поле зрения и подсчитывать е частицы определенной формы из заранее заданного набора стандартных фигур.

Электронная микроскопия обладает зна