Исследование агрегации наночастиц коллоидного золота и их конъюгатов с биополимерами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

КРАСНОВ ЯРОСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ АГРЕГАЦИИ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА И ИХ КОНЪЮГАТОВ С БИОПОЛИМЕРАМИ

02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Саратов - 2003

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор Хлебцов Николай Григорьевич кандидат биологических наук, с.н.с. Дыкман Лев Абрамович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Клении Виталий Иосифович доктор химических наук, профессор Щербаков Александр Анатольевич

Ведущая организация: Казанский государственный технологический

университет

Защита диссертации состоится " /3" 2003 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 212. 243. 07 по химическим наукам при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская 83, корп. I, химический факультет С ГУ

С диссертацией можно ознакомился в Научной библиотеке Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского

Автореферат разослан "//" 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, профессор /-у оу ФедотоваО.В.

«

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Биоконъюгаты коллоидного золота (КЗ) с полимерами представляют собой наночастицы, к поверхности которых прикреплены макромолекулы. Эти макромолекулы играют роль стабилизатора коллоида и имеют специфические «сайты», способные участвовать во взаимодействиях с комплементарными молекулами («молекулами-мишенями») в реакциях типа антиген-антитело, лектин-углевод, рецептор-лиганд и т.п. Такие конъюгаты широко используются в последние годы как эффективные оптические преобразователи биоспецифических взаимодействий, в детектируемый оптический сигнал в устройствах, называемых биочипами и биосенсорами (Mullett et al., 2000; Schultz, 2003). Подобные устройства представляют большой интерес для биологии (определение нуклеиновых кислот, белков и метаболитов), медицины (скрининг лекарственных веществ, выявление антител и антигенов, диагностика инфекций) и химии (экспресс-мониторинг окружающей среды, количественный анализ растворов и дисперсных систем).

Характерные спектральные свойства и красный цвет золя обусловлены поверхностным плазмонным резонансом золотых наночастиц вблизи длины волны 520 нм (Bohren, Huffinan, 1983). Взаимодействие конъюгатов КЗ с молекулами-мишенями может приводить либо к агрегации частиц, либо к изменению толщины и структуры полимерной оболочки за счет присоединения молекул-мишеней (Schultz, 2003). В случае агрегации величина и положение резонанса заметно изменяются из-за сильного оптического взаймодействия наночастиц золота, когда среднее расстояние между ними меньше их размеров (Schatz, 2001, Khlebtsov et al. [10], цифры в скобках соответствуют списку опубликованных работ). При этом спектр экстинкции (поглощение + рассеяние, далее используется термин «поглощение») системы может изменяться существенным образом, вплоть до визуально наблюдаемого изменения цвета Изменения спектров, обусловленные адсорбцией биополимеров на поверхности металлических частиц, сравнительно малы, однако даже эти малые эффекты были успешно использованы для биологических приложений (Schultz, 2003).

Оба описанных сценария (адсорбция на отдельных частицах или агрегация) относятся к реализации метода, называемого sol-particle-immunoassay (SPIA) (Leuvering et al., 1980). Этот метод весьма прост в реализации, однако за почти 20-летнюю историю развития количество публикаций и примеров реального практического использования оказалось довольно скромным. Только в самое последнее время появились работы, указывающие на возможность его использования в качестве высокопроизводительного клинического теста (Englebienne, 2001). Причина слабого внедрения метода связана, вероятно, с недостаточным пониманием физико-химических i

ответственных за трансформацию измеряемых

рассеяния света при биоспецифическом связывании молекул-мишеней с биоконъюгатами. В частности, не была должным образом изучена зависимость спектров поглощения и рассеяния света кластерами от размера золотых частиц, а также зависимость структуры агрегированных биоконъюгатов от условий и времени формирования и связь между структурой кластеров и их спектрами поглощения и статического рассеяния. Кроме того, не была проведена сравнительная оценка возможностей применения спектров поглощения и рассеяния для разработки аналитических тестов, основанных на биоспецифической агрегации частиц КЗ. Большой интерес представляет также сопоставление экспериментальной временной зависимости спектров поглощения и рассеяния света с расчетами на основе современных теоретических моделей.

Целью диссертационной работы являлось экспериментальное исследование процессов агрегации наночастиц КЗ и их конъюгатов с биополимерами методами спектроскопии поглощения и спектроскопии статического рассеяния света (ССРС) под углом 90 градусов.

Задачи исследования:

Экспериментальное исследование зависимости спектров поглощения и рассеяния света кластерами, образованными при солевой агрегации золотых частиц, от времени агрегации, размера частиц и концентрации соли (быстрый и медленный режимы агрегации); Экспериментальное исследование спектров поглощения и рассеяния света при агрегации золей золота биополимерами, включая биоспецифические пары;

Электронно-микроскопическое (ЭМ) исследование структуры агрегатов, сформированных при разных условиях. Исследование корреляции между структурой кластеров и их спектрами поглощения и статического светорассеяния;

Проведение сравнительной оценки возможностей применения спектров поглощения и рассеяния для разработки аналитического теста, основанного на биоспецифической агрегации;

Качественное сравнение временной зависимости спектров поглощения агрегирующих золей с расчетами на основе моделей кластер-кластерной агрегации и дискретной дипольной аппроксимации (ОБА).

Научная новизна работы:

Обнаружено, что при быстрой солевой агрегации, соответствующей формированию некомпактных диффузионно-ограниченных (ЭЬСА [6]) кластеров, вид спектров поглощения золей золота зависит от размера первичных частиц. Этот экспериментальный результат находится в качественном с согласии с модельными теоретическими расчётами.

Установлено, что имеется несколько типов возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или конъюгатов с

полимерами на их основе, которым соответствуют определённые типы структур агрегатов. Данная взаимосвязь определяется расстоянием между частицами в агрегатах, размером агрегатов, а также и размером агрегирующих частиц.

На примере биоспецифической пары протеин А + экспериментально продемонстрирована возможность оптимизации БР1А с использованием спектров поглощения биоагрегатов.

Научно-практическая значимость работы:

Изучение связи между размером первичных мономеров агрегатов, их структурой и полимерным покрытием частиц необходимо для решения прикладных задач стабилизации дисперсных систем полимерными добавками.

Представленные в работе данные о кинетике спектров статического светорассеяния при неспецифической или специфической агрегации биоконъюгатов на основе КЗ могут найти приложение для развития новых методик анализа на уровне нано - и пикомолярных концентраций полимера. Результаты работы могут найти также применение для оптимизации высокопроизводительных лабораторных клинических методов анализа, основанных на использовании биоспецифической агрегации, детектируемой планшетным фотометром.

Достоверность научных результатов, представленных в работе, обусловлена использованием для их получения апробированных методик измерений с учетом возможных погрешностей. Достоверность подтверждается воспроизводимостью экспериментальных результатов и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным согласием с независимыми исследованиями других авторов.

На защиту выносятся следующие основные положения:

Быстрая солевая агрегация мелких золотых частиц (5 нм) дает сильно уширенные одномодовые спектры с пониженным основным пиком, но без второго пика поглощения. Быстрая агрегация более крупных частиц (15 и 30 нм) сопровождается появлением второго длинноволнового пика поглощения. Этим спектрам соответствуют рыхлые ветвистые кластеры с фрактальной размерностью меньше 2 и наличием внутренних цепочечных структур.

Агрегация биконъюгатов КЗ приводит к формированию кластеров без прямого контакта частиц, а соответствующие спектры всегда имеют только один максимум со сдвигом в красную область и с заметным уширением. В зависимости от размера агрегатов наблюдается как повышение (на начальных этапах), так и уменьшение максимума поглощения.

Величина спектрального смещения максимума поглощения коррелирует с концентрацией молекул-мишеней, вызывающих биоспецифическую агрегацию конъюгатов КЗ с биомакромолекулами при взаимодействии с их «узнающими» сайтами.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в рамках планов госбюджетных НИР.

Исследования поддерживалась грантами РФФИ (проекты № 98-03-32664а, 01-03-33130а, 01-04-48736а), CRDF № REC-006, INCAS-S 98-4-04, а так же двумя аспирантскими грантами Международного научного фонда Дж. Сороса (2000-2001 гг.).

Апробация результатов:

Основные результаты диссертации обсуждались на следующих научных конференциях:

VIII Всероссийская конференция "Химия для медицины и ветеринарии" (Саратов, Россия, 1998).

4-th Conference on Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory and Applications (Vigo, Spain, 1999).

Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, Россия, 2000).

10-th International Conference on Colloid and Interface Science (Bristol, England, 2000).

5-th International Conference on Light Scattering by Nonspherical Particles (Halifax, Canada, 2000).

Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine (Saratov, Russia, 2000,2001).

5-я Пущинская конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века", (Пущино, Россия, 2001).

Международная научная конференция. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, Россия, 2001).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 работ, приведенных в конце автореферата.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка цитируемой литературы из 139 ссылок. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, иллюстрирована 31 рисунком и 3 фотографиями.

Краткое содержание работы.

Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно- ">

практическое значение, сформулированы цель и задачи исследований и кратко изложены основные результаты диссертации.

В Главе 1 представлен обзор литературы по теме работы. В первой части обзора рассмотрены методы синтеза золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости полученных золей, затем влияние

полимеров на устойчивость и агрегацию частиц КЗ, а также оптические свойства металлических наночастиц золей и получение конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами. Во второй части обзора обсуждаются: применение биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ, использование КЗ для оптических биосенсоров, формулируются нерешенные проблемы и постановка задач исследования.

Глава 2 посвящена описанию материалов и методов исследования, включая используемые реактивы, приборы и методики измерения. В начале главы рассмотрены методики синтеза золотых наночастиц заданного размера и получения их конъюгатов с биополимерами. Описаны также методики проверки качества биоспецифических маркеров с помощью твердофазного иммуноанализа и ЭМ анализа агрегатов. Минимальное защитное количество стабилизирующего вещества и оптимальное значение рН для получения конъюгатов определяли в и-образных иммунологических планшетах с лунками объемом 200 мкл по методике, разработанной в нашей лаборатории (Дыкман и Богатырев, 1997). В твердофазном иммуноанализе сначала проводили блокирование оставшихся свободными "сайтов" связывания на нитроцеллюлозной мембране с адсорбированными биоспецифическими макромолекулами, а затем - визуализацию продуктов реакции с помощью иммунохимического маркера. Для уменьшения расхода маркера окраску мест связывания проводили в специальных пакетиках, приготовленных из пленки "Рагай1т М". Препараты для ЭМ анализа готовили стандартным образом на лиофилизированных подложках. ЭМ снимки получали на микроскопе Теэк ВБ-500.

Для измерений ССРС использовалась модифицированная флуоресцентная приставка к спектрофотометру «Спекорд М-40» (рис. 1, Богатырев и др. [12]). Приставка позволяет освещать кювету с измеряемым образцом под прямым

Рис. 1. Схема работы спектрофотометра в режиме измерения экстинкции и бокового светорассеяния, где цифрой 1 обозначен двухлучевой монохроматор, 2 и 3 - измерительный пучок и пучок сравнения, 4 и 5 -зеркала, 6 и 7 - диффузные рассеиватели; 8 - фотоэлектронный умножитель, 9 и 10 - измерительные кюветы.

углом по отношению к фотоприемнику, который регистрирует рассеяние в малом телесном угле, ориентированном перпендикулярно падающему свету. В режиме измерения ССРС диффузор (6), используемый при калибровке приставки, заменяется образцом (10), а для компенсации поглощения в пучок сравнения устанавливается дополнительная кювета с образцом (9Ь). В режиме измерения поглощения кювета с образцом (10) устанавливается в стандартное положение 9а.

Глава 3 посвящена экспериментальным и теоретическим исследованиям солевой агрегации наночастиц золота и серебра. Были синтезированы золи КЗ с диаметром частиц около 5, 15, 30, 45 и 60 нм. Проведены следующие серии экспериментов: (1) изучение зависимости спектров поглощения золей золота и серебра от режима агрегации (быстрая/медленная) и размера частиц; (2) сравнение экспериментальных спектров КЗ с модельными теоретическими расчетами; (3) исследование влияния инициатора агрегации на кинетику изменения спектров поглощения золей (агрегационные агенты: КаС1, СаС12, пиридин); (4) влияние предварительной стабилизации золотых золей раствором Т^уееп^О на спектры поглощения их агрегатов; (5) изучение ССРС при солевой агрегации золотых наночастиц; (6) установление связи между структурой агрегатов КЗ и их спектральными свойствами. Всего было исследовано 22 различные системы.

Экспериментальные исследования временного изменения поглощения света при солевой агрегации коллоидных золотых и серебряных наночастиц, в зависимости от режима (быстрый/медленный) их агрегации и от размера самих частиц показали, что имеется похожая зависимость изменения спектра поглощения коллоидных частиц золота и серебра от режима агрегации. На всех рисунках автореферата поглощение (А) дано в единицах оптической плотности, рассеяние (/90 ) в относительных единицах.

Помимо скорости агрегации, существенное влияние на спектральные характеристики золей золота оказывает размер (диаметр) самих агрегирующих наночастиц (меньше или больше 10 нм). Отсутствие второго пика поглощения в исследованном интервале длин волн (400-800 нм) у агрегатов частиц КЗ с диаметром около 5 нм (КЗ-5) в быстром режиме агрегации (рис. 2а), является основным зарегистрированным нами отличием от спектров агрегации золей КЗ с частицами около 15 (КЗ-15) и 30 нм (К3-30) в диаметре (рис. 2Ь, с).

Для сравнения экспериментальных спектров с теоретическими расчётами, при моделировании процесса агрегации использовалась трехмерная решеточная модель кластер-кластерной агрегации с броуновскими траекториями одиночных частиц и промежуточных кластеров. Описание модели агрегации и методики расчета теоретических спектров приведено в нашей работе [б].

400 500 600 700 Длина волны,нм

А (с)

400 500 600 700 Длина волны, нм

800

400 500 600 700 800 Длина волны, нм

(<0

500 600 Длина волны,

700

нм

500 600 700 Длина волны, нм

Рис. 2 Экспериментальные спектры поглощения золей: КЗ-5 (а) КЗ-15 (Ь) и КЗ-ЗО (с), при их быстрой солевой агрегации, и теоретический расчет по методу БОА (см. текст) для 5 (с!) и 30 (е) -нанометровых золотых частиц. Кривые 0 соответствуют поглощению исходных золей. Экспериментальное время

агрегации: (а) - 0.5(1), 3.5(2), 9.5(3) и 22(4) мин; (Ь) - 0.5(1), 9.5(2) и 43 (3) мин; (с) - 0.5(1), 12.5(2) и 50(3) мин.

В использованной модели при перемещении частицы или кластера на один шаг решетки и наличии контакта с другой частицей или кластером образуется объединенный кластер. Такой сценарий соответствует диффузионно-ограниченному механизму агрегации и дает фрактальную размерность агрегатов около 1.8. В качестве условной единицы времени использовали момент образования 10 новых кластеров в системе. В каждый такой момент определялась функция распределения кластеров по размерам, и вычислялся спектр поглощения по методике [6]. Оптические свойства каждой частицы моделировались в дипольном приближении, а взаимодействие частиц учитывалось в терминах ренормализационной БОА модели (Матке! е/ а/., 1996). Сравнение экспериментальных и рассчитанных спектров представлено на рис. 2. Для нормировки теоретических спектров использовалась оптическая плотность мономеров при А,^ - Ат(^ктгх). Рис. 2 показывает, что в рамках теории БОА действительно подтверждается зарегистрированное различие в спектрах поглощения диффузионно-ограниченных фрактальных агрегатов с малыми (5 нм) и более крупными 15 и 30-нм частицами.

При отладке экспериментальных методик было проверено, что концентрационная зависимость спектров поглощения и рассеяния золей удовлетворяет условиям однократного рассеяния. Исследование быстрой солевой агрегации золей КЗ-15, КЗ-ЗО и КЗ-60 (средний диаметр частиц 60 нм) показало, что спектры поглощения и рассеяния изменяются сходным образом - формируется усиленный длинноволновый максимум (рис. 3). Чувствительность обеих методик к агрегационным изменениям примерно одинакова, хотя и несколько выше для спектров рассеяния.

Было исследовано влияния инициатора агрегации (агрегационные агенты: НаС1, СаС12, пиридин) на кинетику изменения спектров поглощения золей КЗ-15, КЗ-ЗО и КЗ-40. В согласии с хорошо известными данными (Кройт, 1955) было подтверждено сильное влияние валентности катиона на зависимость скорости агрегации золя от количества добавленной соли (соли одновалентного катиона требуется в 50-60 раз больше, чем двухвалентного, для аналогичных изменений спектра агрегирующего золя). В случае добавки пиридина к золям золота изменения спектров поглощения были аналогичны таковым при солевой агрегации этих золей, но происходили во много раз медленнее.

Спектры поглощения были использованы для изучения влияния ,

предварительной стабилизации золотых золей молекулами полимера на последующую солевую агрегацию. В качестве экспериментальной модели был взят золь К3-30, стабилизированный неионным ПАВ Т\уееп-20 в кислой среде. В работе показано, что существенные спектральные изменения системы наблюдаются только в тех случаях, когда количество добавленного полимера соответствует лишь «частичной» стабилизации, так что добавление соли приводит к формированию заметной доли агрегатов.

А

(а) 1(90)

А

(Ь) 1(90)

0.7

0.0

1.4

-3 0 800

о.о ^^—=*-- - 0

500 600 700 800 Длина волны, нм

500 600 700 Длина волны, нм

Рис. 3. Динамика спектра поглощения (Ех1.) и рассеяния (вс.) света при быстрой солевой агрегации золя КЗ-ЗО (а) и КЗ-15 (Ь). Кривые 0 соответствуют поглощению и рассеянию исходных золей. Время агрегации для ЕхС. и Бс. соответственно: (а): 6 (1) и 2 (1); 19 (2) и 15 (2); 50 (3) и 53 (3); 94 (4) и 97 (4) мин; (Ь): 1 (1) и 4 (1); 8 (2) и 11 (2) мин.

Один из основных разделов работы был посвящен экспериментальному исследованию связи между структурой агрегатов и их спектральными свойствами. Результаты этих исследований представлены в Главе 3 (солевая агрегация частиц КЗ) и в Главе 4 (агрегация конъюгатов КЗ с полимерами). Было установлено, что нескольким основным типам возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или их конъюгатов с биополимерами соответствуют определённые типы структур агрегатов. Вид спектров определяется, прежде всего, размером агрегатов и средним расстоянием между частицами, а также размером агрегирующих частиц (рисунки 4 и 5). Медленная солевая агрегация нестабилизированных золей золота приводит к уменьшению пика поглощения без существенного смещения его в красную область (рис. 4а). Таким спектрам соответствуют мелкие компактные агрегаты при наличии большой доли отдельных неагрегированных частиц (см. пример, на рис. 4а). Медленная агрегация соответствует реакционно-ограниченному режиму формирования кластеров с более компактной структурой и фрактальной размерностью около 2.1 [6].

Быстрая солевая агрегация золей золота с очень малыми частицами (около 5 нм) дает сильно уширенные одномодовые спектры с пониженным основным пиком, но без второго пика поглощения (рис. 2а). Быстрая агрегация золей с более крупными частицами может сопровождаться появлением второго длинноволнового пика поглощения (рис. 4Ь). Этим спектрам соответствуют

рыхлые ветвистые кластеры с фрактальной размерностью меньше 2 и наличием внутренних цепочечных структур (рис. 4Ь).

400 500 600 700 800 Длина волны, нм

А (Ъ)

0.6

0.4

0.2

0.0

- О -1

' \ □ -2

' 1 д -3

/ 1

' над ^ -

ей

\

\

, 1 , 1 " т 1*" "

V .

400 500 600 700 800 Длина волны, нм

Рис. 4. Динамика спектра поглощения золя КЗ-ЗО при его медленной (а) и быстрой (Ь) агрегации (с ЭМ фотографиями образующихся при этом агрегатов соответственно), после добавки к золю золота солевого раствора. Кривые 0 соответствуют поглощению исходных золей, время агрегации: (а) - 0.5(1), 18(2) и 40 мин (3); (Ь) - 0.5(1), 12.5(2) и 50 мин (3).

Другие типы агрегированных структур и соответствующих спектров наблюдаются при неспецифической и биоспецифической агрегации конъюгатов КЗ.

500 600 700 800 Длина волны, нм

500 600 700 800 Длина волны, нм

<Ъ)

55 nm

* * » J

Рис. 5. Динамика спектров поглощения (Ext.) и рассеяния (Sc.) света системой: (а) - золь КЗ-ЗО защищенный Tween-20 (рН = 3) и добавка ЧСА, (Ь) - конъюгат золя КЗ-ЗО с протеином А и добавка к нему IgG (с ЭМ фотографиями образующихся при этом агрегатов соответственно). Кривые 0 соответствуют поглощению и рассеянию исходных систем (до добавки ЧСА и IgG), время агрегации - (a): Ext.- 2 (1), 30 (2) и 103 мин (3); Sc.- 5 (1), 33 (2) и 100 мин (3); (b): Ext. и Sc. через 1.5 часа (1) и 5.5 (2) часов соответственно.

Неспецифическая агрегация соответствует взаимодействию КЗ + адсорбированный полимер с добавляемым в систему раствором другого полиамфолита за счет гидрофобных и (или) электростатических сил (рис. 5а).

Примером такой системы является взаимодействие в кислой среде золя КЗ стабилизированного неионным поверхностно активным веществом Tween-20 с добавляемыми молекулами человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) (см. ниже, Глава 4). В случае биоспецифического взаимодействия типа антиген-антитело (рис. 5Ь) агрегация инициируется взаимодействием специфических сайтов адсорбированного биополимера с молекулами мишенями в растворе или в составе другого конъюгата. Принципиальной особенностью таких агрегатов из частиц КЗ, покрытых полимером, является наличие диэлектрической прослойки между частицами без прямого омического контакта. В результате среднее расстояние между частицами может достигать нескольких нанометров. Спектры таких агрегатов имеют сдвиг максимума в красную область, заметно уширены, но практически не бывают двухмодовыми (рис. 5Ь и 6а, Ь).

Подобные агрегаты не имеют ветвистой структуры, характерной для солевых фрактальных кластеров. Кроме среднего меж частичного расстояния, важнейшее значение имеет общий размер агрегата (Lazarides and Schatz, 2000). В зависимости от размера агрегатов может наблюдаться как повышение, так и уменьшение максимума поглощения на начальных этапах агрегации.

В Главе 4 приводятся данные экспериментальных исследований спектров поглощения и рассеяния света кластерами, формирующимися при агрегации (неспецифической и биоспецифической) конъюгатов наночастиц КЗ различного размера (около 15, 30 и 60 нм) с различными полимерами. Были исследованы следующие системы: / КЗ + желатин или ЧСА; 2 (КЗ + Tween-20) + ЧСА или желатин; 3 (КЗ + Protein А) + IgG; 4 (КЗ + IgG) + Protein А; 5 (КЗ + Protein А) + (КЗ + IgG). Всего было исследовано 17 различных систем. Прикладной целью этих исследований была разработка спектрального варианта метода SPIA для аналитического определения концентрации биополимеров в растворе.

Данные экспериментов показывают, что увеличение среднего меж частичного расстояния в агрегатах за счет утолщения между ними полимерной прослойки приближает их спектры поглощения и рассеяния света к спектрам исходных неагрегированных золей (рис. 2с и 5; 2Ь и 6). На рис. 6 приведены спектры поглощения и рассеяния для агрегатов золя КЗ-15, формирующихся в системах (КЗ-15 + Tween-20) + ЧСА (рис. 6а), а также для биоспецифической агрегации в системе (КЗ-15 + Protein А) + IgG (рис. 6Ь). При заданной абсолютной толщине полимерной оболочки оптические свойства конъюгатов и агрегатов существенно зависят от отношения толщины оболочки к размеру частиц. Экспериментально установлено, что, при прочих равных условиях, в случае биоспецифической агрегации наибольшие относительные изменения в спектрах поглощения и рассеяния наблюдаются для 15-нм частиц в ряду 15, 30 и 60 нм. Следует отметить, что данное заключение справедливо при условии полного покрытия частиц полимером и при условиях реализации агрегационного режима взаимодействия. В случае чисто адсорбционной

Рис. 6. Динамика спектров поглощения (Ext.) и рассеяния (Sc.) света золем КЗ-15: (а) - защищенным Tween-20; (b) - конъюгат КЗ-15 с протеином А, после добавки к нему раствора ЧСА и IgG соответственно. Кривые О соответствуют поглощению и рассеянию исходных систем до агрегации, время агрегации: - (a): Ext. и Sc - 6 (1) и 3 (1), 20 (2) и 16 (2), 74 (3) и 70 (3) мин; (b): Ext. и Sc. - 6 (1) и 2 (1); 19 (2) и 15 (2); 50 (3) и 53 (3); 94 (4) и 97 (4) мин соответственно.

модели важна проблема оптимизации наносенсоров [10], в которой следует учитывать различие в адсорбционной емкости золей различного размера.

Результаты проведённых экспериментальных исследований показывают прямую зависимость между количеством добавляемого второго белка, инициирующего агрегацию конъюгатов золей КЗ-15, и величиной смещения (положением) пика поглощения данных систем в длинноволновую область (значение А.,,,^ ). По результатам этих экспериментов получена калибровочная кривая для быстрого и технически простого количественного теста типа SPIA. Подобный тест может найти применение в медицине, ветеринарии и лабораторной практике (рис. 7а).

Эксперимент, представленный на рис. 7а, был продолжен с использованием расширенного интервала концентраций добавляемого белка и использованием частиц K3-30. На рис. 7Ь представлена зависимость сдвига максимума поглощения суспензии конъюгата (КЗ + Protein А) от количества агрегирующего агента (IgG). Общий вид полученной кривой имеет левую, почти прямолинейно возрастающую часть (соответствует рис. 7а), а затем зависимость становится немонотонной. Из полученных данных следует, что минимальная детектируемая концентрация соответствует примерно 0.01

мг/мл, а верхний предел примерно в 12 раз больше. Эти пределы могут быть существенно расширены чисто инструментальным путем с использованием малых объемов пробы и соответствующих фотодетекторов (Еп§1еЫеппе й а1., 2001). Следует отметить, что механизмы взаимодействия между белковыми макромолекулами на поверхности наночастиц золота не изучены достаточно полно. Поэтому в практических исследованиях необходимо подбирать оптимальные условия по буферу, концентрации реагентов, порядку смешения и т.п. для конкретной биоспецифической пары полимеров.

550 -

540 -

530

0.00 0.04 0.08 0.12 Концентрация мг/мл

525

0 200 400 600 800 Концентрация мг/л.

Рис. 7. Зависимость величины максимума поглощения конъюгатов КЗ-15 + Протеин А (а) и КЗ-ЗО + Протеин А (Ь) от концентрации добавленного

ДО.

В Заключении приводятся основные результаты исследований.

Основные результаты и выводы:

1. Впервые обнаружено, что при быстрой солевой агрегации золей КЗ, соответствующей формированию некомпактных диффузионно-ограниченных (ОЬСА) кластеров, вид спектров зависит от размера первичных частиц. Этот экспериментальный результат находится в качественном согласии с модельным теоретическим расчётом.

2. Установлено, что имеется несколько типов возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или их конъюгатов с полимерами, которым соответствуют определённые типы структур агрегатов. Данная взаимосвязь определяется, прежде всего, общим размером кластеров, который зависит от механизма агрегации и размера мономеров, и средним расстоянием между частицами.

3. Проведено экспериментальное сравнительное исследование агрегации частиц КЗ методами спектроскопии поглощения и статического рассеяния света. Показано, что на начальных стадиях агрегации спектры рассеяния являются более чувствительным тестом для агрегации, по сравнению со спектрами поглощения.

4. Исследована возможность применения спектров поглощения, для аналитического определения биополимеров, инициирующих агрегацию частиц КЗ. Предложен модифицированный тест типа SPIA для достаточно быстрого и технически простого количественного определения белков, который может найти применение в медицине, ветеринарии и лабораторной практике.

Список цитированной литературы:

1. Кройт Г. Р. Наука о коллоидах. Т. 1. М.: Инлит., 1955.

2. Bohren С. F., Huffman D. R. Absorption and Scattering of Light by Small

Particles. New York: John Wiley&Sons, 1983.

3. Englebienne P., Van Hoonacker A., Verhas M. II Analyst. 2001. V. 126. P. 1645.

4. Lazarides A. A., Schatz G. С. II J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 460.

5. Leuvering J. H. W., Thai P. J. H. M., van der Waart M., Schuurs A. H. W. M. //

J. Immunoassay. 1980. V. 1. P. 77.

6. V. A. Markel, V. M. Shalaev, E. B. Stechel, W. Kim, R. L. Armstrong // Phys.

Rev. B. 1996. V. 53. P. 2425.

7. Mullett W. M., Lai E. P. C., Yeung J. M. // Methods. 2000. V. 22. P. 77.

8. Schatz G. C. // Theochem. 2001. V. 573. P. 73.

9. Schultz D.A. // Cun-ent Opinion in Biotechnology. 2003. V.14. P. 13.

Список опубликованных работ no теме диссертации:

1. Дыкман Л. А., Богатырев В. А., Краснов Я. М., Пискунов В. А., Щёголев С. Ю. Использование коллоидного золота для диагностики острых кишечных инфекций // В сб. научн. трудов: "Химия для медицины и ветеринарии", Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 1998, с. 54-57.

2. Khlebtsov N. G., Dykman L. A., Krasnov Ya. M., Melnikov A. G. Extinction of light by aggregated gold particles and aggregated conjugates of gold particles to biospecific macromolecules // "Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory and Applications" / Ed. by F. Obelleiro, J. L. Rodriguez, and T. Wriedt, Vigo (Spain): Vigo Univ. Press., 1999, pp. 43-50.

3. Краснов Я. M., Дыкман JI. А., Хлебцов Н. Г. Спектральное исследование солевой и биоспецифической агрегации коньюгатов коллоидного золота // Тезисы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино: Пущинский научн. центр, 2000,с. 63.

4. Krasnov Ya. М., Dykman L. A., Khlebtsov N. G. Extinction of light by clusters of colloidal gold particles formed in the biospecific aggregation regime // Proc.

of 10-th Int. Conf. on Colloid and Interface Science, Bristol, UK. 2000 (http://www.chm.bris.ac.uk / iacis 2000/)

5. Khlebtsov N., Dykman L., Bogatyrev V., Krasnov Ya., Medvedev B. Extinction and scattering of light by gold nanoparticle clustersresulting from salt and biospecific aggregation // "Light Scattering by Nonspherical Particles: Halifax Contributions", Ed. by G. Videen, Q. Fu, and P. Chylek, Adelphy, Maryland: Army Research Laboratory, 2000, pp. 245-248.

6. Хлебцов H. Г., Дыкман JI. А., Краснов Я. М., Мельников А. Г. Поглощение света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующихся в режимах медленной и быстрой агрегации // Коллоидный журнал. 2000. Т. 62. № 6. С. 844-859.

7. Краснов Я. М., Дыкман JI. А., Хлебцов Н. Г. Иммунологическая тест-система на основе биоспецифической агрегации конъюгатов коллоидного золота // 5-я Пущинская конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино: Пущинский научн. центр, 2001, с. 34-35.

8. Богатырев В. А., Дыкман JI. А., Краснов Я. М., Хлебцов Н. Г. Оптические эффекты в суспензиях коллоидного золота в процессе иммунохимических реакций, реализуемых на частицах золя // Межд. научн. конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск, 2001, с. 19-21.

9. Dykman L. A., Krasnov Ya. М., Bogatyrev V. A., Khlebtsov N. G. // SFM'2000: "Optical Technologies in Biophysics and Medicine II" / Ed. by V. V. Tuchin, Proc. SPIE, Vol. 4241, Bellingham, Washington: SPIE Publ., 2001, pp. 37-41.

10. Khlebtsov N. G., Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Krasnov Ya. M., Melnikov A. G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Izvestiya VUZ. Applied Nonlinear Dynamics. 2002. V. 10 №. 3 (Special English Issue). P. 172187.

11. Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Krasnov Ya. M., Plotnikov V. K., Khlebtsov N. G. Biospecific assembling of gold nanoparticles with protein or oligonucleotide linkers as studied by light scattering and extinction spectra // SFM'2001: "Optical Technologies in Biophysics and Medicine III" / Ed. by V.V. Tuchin, Proc. SPIE, Vol.4707, Bellingham, Washington: SPIE, 2002, pp.266-274.

12. Богатырев В. А., Дыкман JI. А., Краснов Я. M., Плотников В. К., Хлебцов Н. Г. Метод дифференциальной спектроскопии рассеянного света для исследования биоспецифических реакций в системах конъюгатов золотых наночастиц с белками или олигонуклеотидами // Коллоидный журнал. 2002. Т. 64. № 6. С. 745-755.

Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman 10, _Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 57._

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.

2оо?-А i

»1564*

Введение.

Глава 1. Литературный обзор и задачи исследования. 1.1. Гидрозоли коллоидного золота и их применение.

1.1.1. Методы формирования золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости золей.

1.1.2. Влияние полимеров на агрегативную устойчивость золей и формирование конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами.

1.1.3. Применение биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ.

1.2. Нерешенные проблемы и постановка задач исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Методики формирования золотых наночастиц заданного размера

5 - 60 нм) и их конъюгатов с полимерами.

2.2.1. Получение золей золота со средним диаметром частиц 30 нм.

2.2.2. Получение золей золота со средним диаметром частиц 15 нм.

2.2.3. Получение золей золота со средним диаметром частиц 5 нм.

2.2.4. Образование конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами.

2.3. Проверка качества биоспецифических маркеров с помощью твердофазного иммуноанализа.

2.4. Электронно-микроскопический анализ агрегатов наночастиц коллоидного золота.

2.5. Метод измерения спектров статического рассеяния света на спектрофотометре "Specord М-40".

Глава 3. Поглощение и рассеяние света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующимися в режимах медленной и быстрой агрегации.

3.1. Зависимость спектров экстинкции от режима агрегации (быстрая/медленная) и размера частиц.

3.2. Сравнение экспериментальных спектров с модельными теоретическими расчетами.

3.3. Влияние инициатора агрегации на изменения спектров экстинкции (на примере пиридина). 3.4. Влияние предварительной стабилизации золотых золей с помощью

Tween-20 на спектры экстинкции их агрегатов.

3.5. Спектры статического рассеяния света при солевой агрегации золотых наночастиц.

3.6. Связь между структурой агрегатов и их спектральными свойствами при солевой агрегации золотых наночастиц.

Глава 4. Спектральные свойства кластеров, формирующихся при агрегации конъюгатов наночастиц коллоидного золота с полимерами.

4.1. Исследование спектров поглощения и статического рассеяния для агрегатов, формирующихся в системах КЗ + желатин и (КЗ + Tween20) + ЧСА.

4.2. Спектры поглощения и статического рассеяния при биоспецифической агрегации в системе (КЗ + Protein А) + IgG.

4.3. Связь между структурой агрегатов конъюгатов наночастиц коллоидного золота с полимерами и их спектральными свойствами.

4.4. Спектральный вариант метода SPIA для аналитического определения концентрации биополимеров.

Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно-практическое значение, сформулированы цель и задачи исследований и кратко изложены основные результаты диссертации.

В Главе 1 представлен обзор литературы по теме работы. В первой части обзора рассмотрены методы синтеза золотых наночастиц и физико-химические основы агрегативной устойчивости полученных золей, затем влияние полимеров на устойчивость и агрегацию частиц КЗ, а также оптические свойства металлических наночастиц золей и получение конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами. Во второй части обзора обсуждаются: применение биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ, использование КЗ в оптических биосенсорах, формулируются нерешенные проблемы и постановка задач исследования.

Глава 2 посвящена описанию материалов и методов исследования, включая используемые реактивы, приборы и методики измерения. В начале главы рассмотрены методики синтеза золотых наночастиц заданного размера и получения их конъюгатов с полимерами. Описаны также методики проверки качества биоспецифических маркеров с помощью твердофазного иммуноанализа и ЭМ анализа агрегатов. Минимальное защитное количество стабилизирующего вещества и оптимальное значение рН для получения коныогатов определяли в U-образиых иммунологических планшетах с лунками объемом 200 мкл по методике, разработанной в нашей лаборатории [18]. В твердофазном иммуноанализе сначала проводили блокирование оставшихся свободными "сайтов" связывания на нитроцеллюлозной мембране с адсорбированными биоспецифическими макромолекулами, а затем - визуализацию продуктов реакции с помощью иммунохимического маркера. Для уменьшения расхода маркера окраску мест связывания проводили в специальных пакетиках, приготовленных из пленки Parafilm "М". Препараты для ЭМ анализа готовили стандартным образом на лиофилизированных подложках. ЭМ снимки получали на микроскопе Tesla BS-500.

Для измерений ССРС использовалась модифицированная флуоресцентная приставка к спектрофотометру «Спекорд М-40» [29]. Приставка позволяет освещать кювету с измеряемым образцом под прямым углом по отношению к фотоприемнику, который регистрирует рассеяние в малом телесном угле, ориентированном перпендикулярно падающему свету.

Глава 3 посвящена экспериментальным и теоретическим исследованиям солевой агрегации наночастиц КЗ и серебра. В главе представлены следующие серии экспериментов: (1) изучение зависимости спектров поглощения золей КЗ и серебра от режима агрегации (быстрая/медленная) и размера частиц; (2) сравнение экспериментальных спектров КЗ с модельными теоретическими расчетами; (3) исследование влияния инициатора агрегации на кинетику изменения спектров поглощения золей (агрегационные агенты: NaCl, СаС12, пиридин); (4) влияние предварительной стабилизации золотых золей раствором Tween-20 на спектры поглощения их агрегатов; (5) изучение ССРС при солевой агрегации золотых наночастиц; (6) установление связи между структурой агрегатов КЗ и их спектральными свойствами. Всего было исследовано 22 различные системы.

Экспериментальные исследования временного изменения поглощения света при солевой агрегации коллоидных золотых и серебряных наночастиц, в зависимости от режима (быстрый/медленный) их агрегации и от размера самих частиц показали, что имеется похожая зависимость изменения спектра поглощения частиц КЗ и серебра от режима агрегации. Помимо скорости агрегации, существенное влияние на спектральные характеристики золей золота оказывает размер (диаметр) самих агрегирующих наночастиц (меньше или больше 10 нм). Отсутствие второго пика поглощения в исследованном интервале длин волн (400800 нм) у агрегатов из 5 нанометровых частиц КЗ в быстром режиме агрегации, является основным зарегистрированным нами отличием от спектров коагуляции золей КЗ с частицами размера от 15 до 30 нм.

Для сравнения экспериментальных спектров с теоретическими расчётами при моделировании процесса агрегации использовалась трехмерная решеточная модель кластер-кластерной агрегации с броуновскими траекториями одиночных частиц и промежуточных кластеров. Описание модели агрегации и методики расчета теоретических спектров приведено в нашей работе [28].

В использованной модели при перемещении частицы или кластера на один шаг решетки и наличии контакта с другой частицей или кластером образуется объединенный кластер. Такой сценарий соответствует диффузионно-ограниченному механизму агрегации и дает фрактальную размерность агрегатов около 1.8. В качестве условной единицы времени использовали момент образования 10 новых кластеров в системе. В каждый такой момент определялась функция распределения кластеров по размерам, и вычислялся спектр поглощения по методике [28]. Оптические свойства каждой частицы моделировались в дипольном приближении, а взаимодействие частиц учитывалось в терминах ренормализационной DDA модели [30]. Сравнение экспериментальных и рассчитанных спектров показывает, что в рамках теории DDA действительно подтверждается зарегистрированное различие в спектрах поглощения диффузионно-ограниченных фрактальных агрегатов с малыми (5 нм) и более крупными 15 и 30-нм частицами.

При отладке экспериментальных методик было проверено, что концентрационная зависимость спектров поглощения и рассеяния золей удовлетворяет условиям однократного рассеяния. Исследование быстрой солевой агрегации золей КЗ со средним диаметром частиц 15, 30 и 60 нм показало, что спеюры поглощения и рассеяния изменяются сходным образом - формируется усиленный длинноволновый максимум. Чувствительность обеих методик к агрегационным изменениям примерно одинакова, хотя и несколько выше для спектров рассеяния.

Было исследовано влияния инициатора агрегации (агрегационные агенты: NaCl, СаС1г, пиридин) на кинетику изменения спектров поглощения золей КЗ с диаметром частиц 15, 30 и 40 нм. В согласии с хорошо известными данными [31] было подтверждено сильное влияние валентности соли на зависимость скорости агрегации золя от количества добавленной соли (одновалентной соли требуется в 50-60 раз больше, чем двухвалентной, для аналогичных изменений спектра агрегирующего золя). В случае добавки пиридина к золям КЗ изменения спектров поглощения были аналогичны таковым при солевой агрегации этих золей, но происходили во много раз медленнее.

Спектры поглощения были использованы для изучения влияния предварительной стабилизации золотых золей молекулами полимера на последующую солевую агрегацию. В качестве экспериментальной модели был взят золь КЗ с диаметром частиц 30 нм, стабилизированный полимером Tween-20. В работе показано, что существенные спектральные изменения системы наблюдаются только в тех случаях, когда количество добавленного полимера соответствует лишь «частичной» стабилизации, так что добавление соли приводит к формированию заметной доли агрегатов.

Один из основных разделов работы был посвящен экспериментальному исследованию связи между структурой агрегатов и их спектральными свойствами. Результаты этих исследований представлены в Главе 3 (солевая агрегация частиц КЗ) и в Главе 4 (агрегация конъюгатов КЗ с полимерами). Было установлено, что нескольким основным типам возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или их конъюгатов с биополимерами соответствуют определённые типы структур агрегатов. Вид спектров определяется, прежде всего, размером агрегатов и средним расстоянием между частицами, а также размером агрегирующих частиц. Медленная солевая агрегация обычных (нестабилизированных) золей КЗ приводит к уменьшению пика поглощения без существенного смещения его в красную область. Таким спектрам соответствуют мелкие компактные агрегаты при наличии большой доли отдельных неагрегированных частиц. Медленная агрегация соответствует реакционно-ограниченному режиму формирования кластеров с более компактной структурой и фрактальной размерностью около 2.1 [28].

Быстрая солевая агрегация золей КЗ с очень малыми частицами (около 5 нм) дает сильно уширенные одномодовые спектры с пониженным основным пиком, но без второго пика поглощения. Быстрая агрегация золей с более крупными частицами может сопровождаться появлением второго длинноволнового пика поглощения. Этим спектрам соответствуют рыхлые ветвистые кластеры с фрактальной размерностью меньше 2 и наличием внутренних цепочечных структур.

Другие типы агрегированных структур и соответствующих спектров наблюдаются при неспецифической и биоспецифической агрегации конъюгатов КЗ.

Неспецифическая агрегация соответствует взаимодействию конъюгатов КЗ + (адсорбированный полимер) с добавляемым в систему раствором другого полиамфолита за счет гидрофобных и (или) электростатических сил. Примером такой системы является взаимодействие конъюгата КЗ + Tween-20 с добавляемыми молекулами человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) или желатина (см. ниже, Глава 4). В случае биоспецифического взаимодействия типа антиген-антитело агрегация инициируется взаимодействием специфических сайтов адсорбированного биополимера с молекулами мишенями в растворе или в составе другого конъюгата. Принципиальной особенностью таких агрегатов из частиц КЗ, покрытых полимером, является наличие диэлектрической прослойки между частицами без прямого омического контакта. В результате среднее расстояние между частицами может достигать нескольких нанометров. Спектры таких агрегатов имеют сдвиг максимума в красную область, заметно уширены, но практически не бывают двухмодовыми. Подобные агрегаты не имеют ветвистой структуры, характерной для солевых фрактальных кластеров. Кроме среднего межчастичного расстояния, важнейшее значение имеет общий размер агрегата [14]. В зависимости от размера агрегатов может наблюдаться как повышение, так и уменьшение максимума поглощения на начальных этапах агрегации.

В Главе 4 приводятся данные экспериментальных исследований спектров поглощения и рассеяния света кластерами, формирующимися при агрегации неспецифической и биоспецифической) конъюгатов наночастиц КЗ различного размера (15, 30 и 60 нм) с различными полимерами. Были исследованы следующие системы: 1 КЗ + желатин или ЧСА; 2 (КЗ + Tween-20) + ЧСА или желатин; 3 (КЗ + Protein А) + IgG; 4 (КЗ + IgG) + Protein А; 5 (КЗ + Protein А) + (КЗ + IgG). Всего исследовано 17 различных систем. Прикладной целью этих исследований была разработка спектрального варианта метода SPIA для аналитического определения концентрации биополимеров в растворе.

Данные экспериментов показывают, что увеличение среднего межчастичного расстояния в агрегатах за счет утолщения между ними полимерной прослойки приближает их спектры поглощения и рассеяния света к спектрам исходных неагрегированных золей. При заданной абсолютной толщине полимерной оболочки оптические свойства конъюгатов и агрегатов существенно зависят от отношения толщины оболочки к размеру частиц. Экспериментально установлено, что, при прочих равных условиях, в случае биоспецифической агрегации наибольшие относительные изменения в спектрах поглощения и рассеяния наблюдаются для 15-нм частиц в ряду 15, 30 и 60 нм. Следует отметить, что данное заключение справедливо при условии полного покрытия частиц полимером и при условиях реализации агрегационного режима взаимодействия. В случае чисто адсорбционной модели важна проблема оптимизации наносенсоров [24], в которой следует учитывать различие в адсорбционной емкости золей различного размера.

Результаты проведённых экспериментальных исследований показывают прямую зависимость между количеством добавляемого второго белка, инициирующего агрегацию конъюгатов золей КЗ с 15-нм частицами, и величиной смещения пика поглощения данных систем в длинноволновую область (значение А.тах). По результатам этих экспериментов получена калибровочная кривая для быстрого и технически простого количественного теста типа SPIA. Подобный тест может найти применение в медицине, ветеринарии и лабораторной практике.

Эксперимент был продолжен с использованием расширенного интервала концентраций добавляемого белка и использованием частиц КЗ большего размера (30 нм), для определения зависимости сдвига максимума поглощения суспензии конъюгата (КЗ + Protein А) от количества агрегирующего агента (анти-IgG человека). Общий вид полученной кривой имеет левую, почти прямолинейно возрастающую часть, а затем зависимость становится немонотонной. Из полученных данных следует, что минимальная детектируемая концентрация соответствует примерно 0.01 мг/мл, а верхний предел примерно в 12 раз больше. Эти пределы могут быть существенно расширены чисто инструментальным путем с использованием малых объемов пробы и соответствующих фотодетекторов [27]. Следует отметить, что механизмы взаимодействия между белковыми макромолекулами на поверхности наночастиц золота не изучены достаточно полно. Поэтому в практических исследованиях необходимо подбирать оптимальные условия по буферу, концентрации реагентов, порядку смешения и т.п. для конкретной биоспецифической пары полимеров.

В Заключении приводятся основные результаты исследований.

Основные результаты и выводы:

1. Обнаружено, что при быстрой агрегации, соответствующей формированию некомпактных диффузионно-ограниченных (DLCA) кластеров, вид спектров зависит от размера первичных частиц. Этот экспериментальный результат находится в качественном согласии с модельным теоретическим расчётом.

2. Установлено, что имеется несколько типов возможных трансформаций спектров поглощения при агрегации золей золота или их конъюгатов с полимерами, которым соответствуют определённые типы структур агрегатов. Данная взаимосвязь определяется, прежде всего, общим размером кластеров, который зависит от механизма агрегации и размера мономеров, и средним расстоянием между частицами.

3. Проведено экспериментальное сравнительное исследование агрегации частиц КЗ методами спектроскопии поглощения и статического рассеяния света. Показано, что на начальных стадиях агрегации спектры рассеяния являются более чувствительным тестом для агрегации по сравнению со спектрами поглощения.

4. Исследована возможность применения спектров поглощения для аналитического определения биополимеров, инициирующих агрегацию частиц КЗ. Предложен модифицированный тест типа SPIA для достаточно быстрого и технически простого количественного определения белков, который может найти применение в медицине, ветеринарии и лабораторной практике.

Заключение и выводы

В данной работе нами были проведены экспериментальные и теоретические исследования СП и ССРС процессов солевой агрегации наночастиц КЗ и при агрегации золей золота полимерами, включая биоспецифические пары с целью изучения некоторых нерешенных проблем в этой области. Мы провели исследования влияния нескольких параметров на спектральные характеристики золей КЗ при их агрегации, а именно: размера золотых частиц (диаметр около 5, 15, 30, 45, и 60 нм), скорости (быстрая/медленная) агрегации, времени агрегации, степени защищенности золя полимером, отсутствия непосредственного контакта между частицами в агрегате и размера самого агрегата.

Кроме добавляемых растворов соли (NaCl, СаСЬ), было исследовано влияние размера агрегирующих золотых частиц, скорости и времени агрегации золей КЗ на СП данных систем при добавке к ним пиридина для выяснения спектральных характеристик КЗ в зависимости от свойств агрегирующего агента. В случае добавки пиридина к золям КЗ изменения СП были аналогичны таковым при солевой агрегации этих золей, но происходили во много раз медленнее. Для случая быстрой солевой агрегации золей КЗ провели качественное сравнение экспериментальной временной зависимости СП и ССРС с расчетами на основе современных теоретических моделей, которое показало удовлетворительную сходимость результатов эксперимента и теоретических расчетов. Спектры поглощения были использованы для изучения влияния предварительной стабилизации золотых золей молекулами полимера на последующую солевую агрегацию. В качестве экспериментальной модели был взят золь КЗ-ЗО, стабилизированный ПАВ Tween-20. В работе показано, что существенные спектральные изменения системы наблюдаются только в тех случаях, когда количество добавленного полимера соответствует лишь «частичной» стабилизации, так что добавление соли приводит к формированию заметной доли агрегатов.

Исследование быстрой солевой агрегации золей КЗ со средним диаметром частиц 15, 30 и 60 нм показало, что СП и ССРС изменяются сходным образом -формируется усиленный длинноволновый максимум. Чувствительность обеих методик к агрегациониым изменениям примерно одинакова, хотя и несколько выше для спектров рассеяния.

Экспериментальные исследования СП и ССРС золями КЗ при их неспецифической и биоспецифической агрегации были проведены для наночастиц КЗ различного размера (15, 30 и 60 нм) с различными полимерами. Данные эксперименты проводились с целью изучения влияния отсутствия непосредственного контакта между частицами и величины среднего межчастичного расстояния в агрегатах за счет утолщения между ними полимерной прослойки на СП и ССРС агрегатов золей КЗ. Прикладной целью этих исследований была разработка спектрального варианта метода SPIA для аналитического определения концентрации биополимеров в растворе. Сравнительная оценка возможностей применения СП и ССРС для разработки аналитических тестов, основанных на биоспецифической агрегации частиц КЗ, показала, что предложенный в данной работе метод измерения ССРС тоже имеет хорошую перспективу в качестве аналитического или диагностического теста биоспецифических взаимодействий в системах биоконъюгатов на основе КЗ.

Один из основных разделов работы был посвящен экспериментальному исследованию связи между структурой агрегатов и их спектральными свойствами. Сопоставляя все оптические и ЭМ данные, мы приходим к выводу, что имеется несколько типов возможных трансформаций спектров экстинкции при агрегации золей золота или конъюгатов золотых частиц с полимерами и соответствующие им типы структур агрегатов. Вид спектров определяется, прежде всего, размером агрегатов и средним расстоянием между частицами, а также размером агрегирующих частиц КЗ.

Направление и перспективы нашей дальнейшей работы видятся нам в решении ряда задач. На примере расчетов величины и положения максимумов поглощения и статического рассеяния мы показали, что максимальная эффективность наносенсоров достигается в диапазоне с диаметром частиц КЗ 40-80 нм со слабо выраженным максимумом вблизи диаметра 60-70 нм. Экспериментальная проверка этих выводов представляет, по нашему мнению, несомненный интерес с практической точки зрения. Насколько нам известно, детальные экспериментальные исследования по оптимальности размера золотых частиц при использовании их как компонента биосенсора в литературе отсутствуют, если не считать отдельных данных [26, 27]. Для оптимизации конъюгата-наносенсора наряду с размером частиц имеет значение структура полимерного слоя. В частности, установление верхней границы по толщине первичного слоя, за которой изменения экстинкции и рассеяния света от сенсора при дальнейшем изменении диэлектрического окружения заметно падает. Наличие надлежащих технических средств позволило бы получить СП и ССРС агрегирующих золей КЗ целиком, то есть их части за областью 850 нм. Решение этой проблемы даст более полную информацию о спектральных характеристиках процессов агрегации КЗ и соответственно о структуре и размере агрегатов.

1. Борен К., ХафменД. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. М.: Мир.- 1986.-660 с.

2. Вукс М. Ф. Рассеяние света в газах, Жидкостях и растворах. JI.: Изд-во ЛГУ. 1977.

3. Югенин В. И., Щеголев С. Ю„ Лаврушин В. И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов: Изд-во СГУ. 1977. -176 с.

4. Кленин В. И. Термодинамика систем с гибкоцепными полимерами. Саратов: Изд-во СГУ. 1995. - 734 с.

5. Kerker М. The scattering of light and other electromagnetic radiation. New York: Academic Press, 1969.

6. Quinten M., Kreibig U. И in: "Optical Particle Sizing: Theory, and Practice", Ed. by Gouesbet G., Grehan G., New York: Plenum. 1988. - P. 249-258.

7. Kahlau Т., Quinten M., Kreibig U. Extinction and angle-resolved light scattering from aggregated metal clusters // Appl. Phys. A. 1995. - Vol. 62. - № 1. - P. 19-27.

8. Lin M. Y., Lindsay H. M, Weitz D. A., Ball R. C., et al. Universality in colloid aggregation //Nature. 1989. - Vol. 339. -№ 6223. - P. 360-362.

9. Lin M. Y., Lindsay H. M., Weitz D. A., Ball R. C., et al. Universality of fractal aggregates as probed by light scattering // Proc. R. Soc. London Ser. A. 1989. -Vol. 423.-№ 1864.-P. 71-87.

10. Хлебцов H. Г., Богатырев В. А., Дыкман JT. А., Мельников А. Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоид, журн. 1996. - Т. 58. - № 1. - С. 144.

11. StorhoffJ. J., Lazarides A. A., Mucic R. С., Schatz G. С., et al. What controls the optical properties ofDNA-linked gold nanoparticle assemblies ? //J. Am. Chem. Soc. 2000. - Vol. 122. - № 19. - P. 4640-4650.

12. Lazarides A. A., Lance К. K, Jensen T. R., Schatz G. C. Optical properties of metal nanoparticles and nanoparticle aggregates important in biosensors // Theochem. 2000. - Vol. 529. - P. 59.

13. Schatz G. С. Electrodynamics of nonspherical noble metal nanoparticles and nanoparticle aggregates // Theochem. 2001. - Vol. 573. - P. 73.

14. Lazarides A. A., Schatz G. C. DNA-linked metal nanosphere materials: Structural basis for the optical properties // J. Phys. Chem. B. 2000-Vol. 104. - P. 460-467.

15. Mullett W. M, Lai E. P. C., YeungJ. M. Surface plasmon resonance-based immunoassays // Methods. 2000. - Vol. 22. - P. 77-91.

16. Schultz D. A. Plasmon resonant particles for biological detection // Current Opinion in Biotechnology. 2003. - V. 14. - P. 13-22.

17. Дыкман JI. А., Богатырев В. А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа (обзор) // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 4. - С. 411.

18. Schalkhammer Т. Metal nanoclusters as transducers for bioaffinity interactions. Monatshefte fur Chemie/ Chemical Monthly. 1998. - Vol. 129.-№ 10.-P. 1067-1092.

19. Mirkin C. A., Letsinger R. L, Mucic R. C., Storhoff J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials // Nature. -1996. Vol. 382. - P. 607-609.

20. Schneider В. H., Dickinson E. L., Vach M. D., HoijerJ. V., and Howard L. V. Highly sensitive optical chip immunoassays in human serum // Biosens. Bioelectron. 2000. -Vol. 15.-P. 13-22.

21. Lyon L. A., Mustek M. D., Natan M. J. Colloidal Au-enhanced surfaceplasmon resonance immunosensing//Anal. Chem. 1998.-Vol. 70.-P. 5177-5183.

22. Yguerabide J., Yguerabide E. Light-scattering submicroscopic particles as highly fluorescent analogs and their use as tracer labels in clinical and biological applications // Anal. Biochem. 1998.-Vol. 262.-P. 137, 157.

23. Khlebtsov N. G., Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Krasnov Ya. M., Melnikov A.

24. G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Izvestiya VUZ. Applied Nonlinear Dynamics. 2002. - Vol. 10. - №. 3 (Special English Issue). P. 172— 187.

25. LeuveringJ. H., Thai P. J., van der Waart M., Schuurs A. H. Sol particle immunoassay (SPIA)//J. Immunoassay. 1980. - Vol. l.-P. 77-91.

26. Martin J. M. C., Paques M„ van der Velden-De Groot T. A., Beuvery E. C. Characterization of antibody labelled colloidal gold particles and their applicability in a sol particle immuno assay (SPIA) // J. Immunoassay. — 1990. -Vol. 11. № l.-P. 31-47.

27. Englebienne P., Van Hoonacker A., Verhas M. High-throughput screening using the surface plasmon resonance effect of colloidal gold nanoparticles // Analyst. -2001. Vol. 126. - P. 1645-1648.

28. Хлебцов H. Г., Дыкман Л. А., Краснов Я. М., Мельников А. Г. Поглощение света кластерами коллоидных золотых и серебряных частиц, формирующихся в режимах медленной и быстрой агрегации // Коллоид, журн. 2000. - Т. 62. - № 6. - С. 844-859.

29. Богатырев В. А., Дыкман Л. А., Краснов Я. М., Плотников В. К, Хлебцов

30. H. Г. Метод дифференциальной спектроскопии рассеянного света для исследования биоспецифических реакций в системах конъюгатов золотых наночастиц с белками или олигонуклеотидами // Коллоид, журн. 2002. -Т. 64,-№6.-С. 745-755.

31. Markel V. A., Shalaev V. М., Stechel Е. В., et al. Small-particle composites. I. Linear optical properties // Phys. Rev. B. 1996. - Vol. 53. - № 5. - P. 24252436.

32. Кроит Г. P. Наука о коллоидах. Т. 1. Необратимые системы. М.: Инлит. -1955.-540 с.

33. Turkevich J. Colloidal gold. Part I, II // Gold Bull. 1985. - Vol. 18. - P. 8691, 125-131.

34. Бусев A. #., Иванов В. M. Аналитическая химия золота. М.: Наука. - 1973. - 264 с.

35. Жигмонди Р. Коллоидная химия. Харьков, Киев: Изд-во НКСнаба УССР. - 1933.-452 с.

36. Сведберг Т. Образование коллоидов. JL: Науч. хим.-техн. - 1927. - 111 с.

37. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspensions //Nature Phys. Sci. 1973. - Vol. 241. - P. 20-22.

38. Дыкман JI. А. Развитие методологии иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота. Дис. канд. биол. наук. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов. 1996.

39. Brown К. R., Walter D. G., and Natan М. J. Seeding of colloidal Au nanoparticle solutions. 2. Improved control of particle size and shape. // Chem. Mater. 2000. - Vol. 12. - № 2. - P. 306-313.

40. Brown К R. and Natan M. J. Hydroxylamine seeding of colloidal Au nanoparticles in solution and on surfaces. // Langmuir. 1998. - Vol. 14. - № 4. -P. 726-728.

41. Jana N. R., Gearheart L., Murphy C.J. Seeding growth for size control of 5-40 nm diameter gold nanoparticles // Langmuir. 2001. - Vol. 17. - P. 6782 -6786.

42. Jana N. R., Gearheart L., Murphy C. J. Evidence for seed-mediated nucleation in the chemical reduction of gold salts to gold nanoparticles // Chem. Mater. 2001.-Vol. 13.-P. 2313-2322.

43. Jana N. R., Gearheart L., Murphy C. J. Wet chemical synthesis of silver nanorods and nanowires of controllable aspect ratio // Chemical Commun. -2001.-P. 617-618.

44. De Mey J., Moeremans M. The preparation of colloidal gold probes and their use as marker in electron microscopy // In: Advansed techniques in biological electron microscopy / Ed. Koehler J. K. Berlin: Springer-Verlag. - 1986. - Vol. 3.-P. 229-271.

45. De Brouckere L., Casimir J. Preparation d'hydrosols d'or homeodisperses tres stables // Bull. Soc. Chim. Belg. 1948. - Vol. 57. - P. 517-524.

46. Muhlpfordt H. The preparation of colloidal gold particles using tannic acid as an additional reducing agent // Experientia. 1982. - Vol. 38. - P. 1127-1128.

47. Tschopp J., Podack E. R., Muller-Eberchard H. J. Ultrastructure of the membrane attack complex of complement: Detection of the tetramolecular CP-polymerizing complex C5b-8 // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79. -P. 7474-7478.

48. Baschong W., LucocqJ. M, Roth J. "Thiocyanate gold": small (2-3 nm) colloidal gold for affinity cytochemical labeling in electron microscopy // Histochemistry. 1985. - Vol. 83. -№ 5. - P. 409-411.

49. Патент РФ № 2013374, МКИ C01G 7/00, B01J 13/00. Способ получения биоспецифических маркеров конъюгатов коллоидного золота / Богатырёв В. А., Дыкман Л. А., Щеголев С. Ю. (Россия). - 6 с.

50. Shulepov S. Yu. and Frens G. Surface roughness and particle size effect on the rate of perikinetic coagulation: Experiment. // J. Coll. and Interf. Scien. 1996. -Vol. 182.-P. 388-394.

51. Щукин E. Д., Перцов А. В., Амелина E. А. Коллоидная химия: Учебник для вузов. М.: МГУ. - 1982. - 348 с.

52. Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсионные системы: Учебник для вузов, 2-е изд. - М.: Химия. - 1989. -464 с.

53. Thiele #., Норре К., Moll G. Uber das kolloide Gold // Kolloid-Z. u. Z. Polymere. 1962. - Bd. 185. - Ht. 1. - S. 45-52.

54. Баран А. А. Полимерсодержащие дисперсные системы. Киев: Наук, думка, 1986,-204 с.

55. Chow М. К., Zukoski С. F. Gold sols formation mechanisms: Role of colloidal stability //J. Coll. and Interf. Scien. 1994. - Vol. 165. - P. 97-109.

56. Stoscheck С. M. Protein assay sensitive at nanogram levels // Anal. Biochem. -1987. Vol. 160. - P. 301 - 305.

57. Ciesiolka Т., Gabius H. J. An 8-to 10-fold enhancement in sensitivity for quantitation of proteins by modified application of colloidal gold // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 168. - P. 280 - 283.

58. Englebienne P., Van Hoonacker A., Valsamis J. Rapid homogeneous immunoassay for human ferritin in the Cobas Mira using colloidal gold as the reporter reagent // Clin. Chem. 2000. - Vol. 46. - P. 2000-2003.

59. Techniques in immunocytochemistry / Eds. Bullock G. R., Petrusz P. London: Acad. Press. - 1982. - Vol. 1. - P. 431; - 1985. - Vol. 3. - P. 256.

60. Immunohistochemistry / Ed. Cuello A. C. N.-Y.: J. Wiley and Sons. - 1993. -347 p.

61. Шалаев В. М., Штокман М. И. Оптические свойства фрактальных кластеров (восприимчивость, гигантское комбинационное рассеяние, рассеяние на примесях) // ЖЭТФ. 1987. - Т. 92. - № 2. - С. 509-522.

62. Маркель В. А., Муратов Л. С., Штокман М. И. Теория и численное моделирование оптических свойств фракталов // ЖЭТФ. 1990. - Т. 98. -№3.-С. 819-837.

63. Butenko А. V., Chubakov P. A., Danilova Yu. Е., et al. Nonlinear optics of metal fractal clusters // Z. Phys. D. 1990. - B. 17. - S. 283-289.

64. БутенкоА. В., Шалаев В. М., Штокман М. И. Гигантские примесные нелинейности в оптике фрактальных кластеров // ЖЭТФ. 1988. - Т. 94. -№ 1. - С.107-124.

65. Faulk W„ Taylor G. An immunocolloid method for the electron microscope // Immunochemistry. 1971.-Vol. 8.-P. 1081-1083.

66. Edwards P., Wilson T. Choose your labels // Laboratory practice. — 1987. — Vol. 36.-P. 13-17.

67. Tuckwell J. The uses of colloidal gold technology in biochemistry // Biochemist. -1991.-Vol. 13.-P. 6-7.

68. Holgate C. S., Jackson P., Cowen P. N., Bird С. C. Immunogold-silver staining: New method for immuno-staining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. 1983. - Vol. 31. - P. 938-944.

69. Danscher G., Norgaard J. O. R. Light microscopic visualization of colloidal gold on resin-embedded tissue I I J. Histochem. Cytochem. 1983. - Vol. 31. - P. 1394-1399.

70. Brada D., Roth J. "Golden blot'-detection of polyclonal and monoclonal antibodies bound to antigens on nitrocellulose by protein A gold complexes // Anal. Biochem. - 1984. - Vol. 142. - P. 79-83.

71. Surek В., Latzko E. Visualization of antigenic proteins blotted onto nitrocellulose using the immuni-gold-staining (IGS)-method // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. - Vol. 121. - P. 284-289.

72. Hsu Y. H. Immunogold for detection of antigen on nitrocellulose paper// Anal. Biochem. 1984. - Vol. 142. - P. 221-225.

73. ПолакД., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир. - 1987. - 74 с.

74. Михайлов А. Т., Симирский В. Я. Методы иммунохимического анализа в биологии развития.-М.: Наука, 1991,-228 с.

75. Новые методы иммуноанализа / под ред. Коллинза У. П. М.: Мир. -1991.-280 с.

76. BeesleyJ. Е. Colloidal gold: A new revolution in marking cytochemistry // Proc. Roy. Microsc. Soc. 1985. - Vol. 20. - P. 187-197.

77. Рехтер M. Д., Миронов А. А. Коллоидное золото в электронной микроскопии И Успехи современной биологии. 1990. - Т. 109. - С. 467480.

78. Horisberger М. Colloidal gold and its application in cell biology // Int. Rev. Cytol.- 1992.-Vol. 136.-P. 227-287.

79. LeuveringJ. H., Thai P. J., Mvan der Waart., Schuurs A. H. A sol particle agglutination assay for human chorionic gonadotrophin // J. Immunol. Meth. -1981.-Vol. 45.-P. 183-194.

80. Gribnau T. J. C., LeuveringJ. H. W., van Hell H. Particle-labelled immunoassays: a review//J. Chromatogr. 1986. - Vol. 176.-P. 175-179.

81. WielaardF., Denissen A., van der Veen L., Rutjes /. A sol particle immunoassay for determination of anti-rubella antibodies. Development and clinical validation // J. Virol. Meth. 1987. - Vol. 17. - P. 149-158.

82. Van Erp R„ Gribnau T. J. C„ van Sommeren A. P., Bloemers H. P. Application of a sol particle immunoassay to the determination of affinity constant of monoclonal antibodies // J. Immunoassay. 1991. - Vol. 12. - P. 425-443.

83. Zeisler R., Stone S. F., Viscidi R. P., Сету E. H. Sol particle immunoassays using colloidal gold and neutron activation //J. Radioanal. Nucl. Chem. 1993. -Vol. 167.-P. 445-452.

84. Thanh N. T. K„ Rosenzweig Z. Development of an aggregation-based immunoassay for anti-protein A using gold nanoparticles // Anal. Chem. 2002. -Vol. 74.-P. 1624-1628.

85. Otsuka H., Akiyama Y., Nagasaki Y., Kataoka K. Quantitative and reversible lectin-induced association of gold nanoparticles modified with a-lactosyl-бУ-mercapto-poly (ethylene glycol) // J. Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 123. - P. 8226-8230.

86. Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПБ.: Наука. - 1994. - 400 с.

87. Horisberger М, RossetJ., Bauer И. Colloidal gold granules as markers for cell surface receptors in the scanning electron microscopy // Experimentia. 1975. -Vol. 31.-P. 1147-1151.

88. De Harven E., Leung R., Christensen H. A novel approach for scanning microscopy of colloidal gold-labeled cell surfaces // J. Cell Biol. 1984. - Vol. 99. - P. 53-57.

89. Scopsi L., Larsson L. I., Bastholm L., Nielsen M. N. Silver-enhanced colloidal gold probes as marcers for scanning electron microscopy // Histochemistry. -1986.-Vol. 86. P. 35-41.

90. MohamedM. В., Volkov V., LinkS., El-SayedM. A. The «lightning» gold nanorods: fluorescence enhancement of over a million compared to the gold metal // Chem. Phys. Lett. 2000. - Vol. 317. - P. 517.

91. Tsai D. P., Kovacs J., Wang Z. et al. 131. Photon scanning tunneling microscopy images of optical excitations of fractal metal colloid clusters // Phys. Rev. Lett. -1994. Vol. 72. -№ 26. - P. 4149-4152.

92. Draine В. Т., Goodman J. J. Beyond Clausius-Mossotti. Wave propagation on a polarizable point lattice and the discrete approximation // Astrophys. J. 1993. -Vol. 405.-P. 685-697.

93. Elghanian R., StorhoffJ. J., Mucic R. C., Letsinger R. L., Mirkin C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles // Science. 1997. - Vol. 277. - P. 1078-1081.

94. Kim Y. J., Johnson R. C., Hupp J. T. Gold nanoparticle-based sensing of 'spectroscopically silent' heavy metal ions // Nano Letters. 2001. - Vol. 1. - P. 165-167.

95. Glauco R. S. and Millery J. H. Oligonucleotide detection using angle-dependent light scattering and fractal dimension analysis of gold-DNA aggregates // J. Am. Chem. Soc.-2001.-Vol. 123.-№ 27. P. 6734-6735.

96. Malinsky M. D., Kelly K. L., Schatz G. C. and van Duyne R. P. Nanosphere lithography: Effect of substrate on the localized surface plasmon resonancespectrum of silver nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 2001. - Vol. 105. - P. 2343-2350.

97. Zhou H. S., AokiS., Honma /., et al. Conformational change of protein cytochrome b-562 adsorbed on colloidal gold particles; absorption band shift // Chem. Commun. 1997. - P. 605-606.

98. Talon T. A., Mirkin C. A., Letsinger R. L. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes // Science. 2000. - Vol. 289. - P. 1757-1760.

99. Schultz S., Mock J., Smith D. R., Schultz D. A. Nanoparticle-based biological assays // Clinical Ligand Assay. 1999. - Vol. 22. - P. 214-216.

100. Phizicky E. M. and Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis //Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 59. - P. 1959-1964.

101. Reynolds R. A., Mirkin C. A., and Letsinger R. L. Homogeneous, nanoparticle-based quantitative colorimetric detection of oligonucleotides // J. Am. Chem. Soc.-2000.-Vol. 122.-№ 15. P. 3795-3796.

102. Niemeyer С. M., and Ceyhan B. DNA-directed functionalization of colloidal gold with proteins // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - Vol. 40. - № 19. - P. 3685-3688.

103. Wink Т., van Zuilen S. J., Bult A., and van Bennekom W. P. Liposome-mediated enhancement of the sensitivity in immunoassays of proteins and peptides in surface plasmon resonance spectrometry // Anal. Chem. 1998. - Vol. 70. — P. 827-832.

104. Frostell-Karlsson A., Remaeus A., Roos H., et al. Biosensor analysis of the interaction between immobilized human serum albumin and drug compounds for prediction of human serum albumin binding levels //J. Med. Chem. 2000. -Vol. 43.-P. 1986-1992.

105. Adamczyk M., Moore J. A., and Yu Z. Application of surface plasmon resonance toward studies of low-molecular weight antigen-antibody binding interactions // Methods. 2000. - Vol. 20. - P. 319-328.

106. GestwickiJ. E., Hsieh H. V„ andPitner J. B. Using receptor conformational change to detect low molecular weight analytes by surface plasmon resonance // Anal. Chem. 2001. - Vol. 73. - P. 5732-5737.

107. He L., Musick M. D., Nicewarner S. R., Salinas F. G., et al. Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA hybridization // J. Am. Chem. Soc. 2000. - Vol. 122. - P. 9071-9077.

108. Mock J. J., Barbie M., Smith D. R., Schultz D. A., Schultz S. Shape effects in plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticlcs II J. Chem. Phys. B. 2002. - Vol. 116. - P. 6755-6759.

109. Haynes C. L., van Duyne R. P. Nanosphere lithography: a versatile nanofabrication tool for studies of size-dependent nanoparticle optics II J. Phys. Chem. В.- 2001. Vol. 105. - P. 5599-5611.

110. Yguerabide J., Yguerabide E. Resonance light scattering particles as ultrasensitive labels for detection of analytes in a wide range of applications // J. Cell Biochem. Supp. 2001. - Vol. 37. - P. 71-81.

111. Frutos A. G. and Corn R. M. SPR of ultrathin organic films // Anal. Chem. -1998.- Vol. 70. P. 449A-455A.

112. Kurihara K. and Suzuki K. Theoretical understanding of an absorption-based surface plasmon resonance sensor based on Kretchmann's theory // Anal. Chem. 2002. - Vol. 74. - P. 696-701.

113. KangX., Jin Y, Chen G., and Dong S. In situ analysis of electropolymerization of aniline by combined electrochemistry and surface plasmon resonance // Langmuir. 2002. - Vol. 18. - P. 1713-1718.

114. Kugimiya A., and Takeuchi T. Surface plasmon resonance sensor using molecularly imprinted polymer for detection of sialic acid // Biosens. Bioelectron.-2001.-Vol. 16.-P. 1059-1062.

115. Yarmush M. L., Patankar D. В., and Yarmush D. M. An analysis of transport resistances in the operation of BIAcore; implications for kinctic studies of biospecific interactions // Mol. Immunol. 1996. - Vol. 33. - P. 1203-1214.

116. Nieba L., Krebber A., and Pluckthun A. Competition BIAcore for measuring true affinities: large differences from values determined from binding kinetics // Anal. Biochem.- 1996.-Vol. 234.-P. 155-165.

117. Fabrikanos A., Athanassiou S., Lieser К. H. Darstellung stabiler Hydrosole von Gold und Silber durch Reduktion mit Athylendiaminletraessigsaure // Z. Naturforschg. -1963. -Bd. 18. -S. 612-617.

118. Khlebtsov N. G. Spectroturbidimetry of fractal clusters: test of densitycorrelation cutoff// Appl. Opt. 1996. - Vol. 35. -№ 21. - P. 4261-4270.

119. Данилова Ю. Э. Локализация оптического возбуждения в коллоидных агрегатах серебра. Дисс. канд. физ.- мат. наук, Институт автоматики и электрометрии СО РАН, Новосибирск, 1999.

120. Meakin P. Models for colloidal aggregation // Ann. Rev. Phys. Chem. 1988. -Vol. 39. - P. 237-267.

121. Mackowski D. W. Calculation of total cross sections of multiple-sphere clusters //JOSA A. 1994.-Vol. U.-№ 11.-P. 2851-2861.

122. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. - 544с.

123. Khlebtsov N. G., Bogatyrev V. A., Dykman L. A., Melnikov A. G. Spectral extinction of golloidal gold and its biospecific conjugates // J. Colloid Interface Sci. 1996. - Vol. 180. - P. 436-445.

124. Market V. A., Muratov L. S., Stockman M. I., George T. F. Theory and numerical simulation of optical properties of fractal clusters // Phys. Rev. B. 1991. - Vol. 43.-№ 10.-P. 8183-8195.

125. Dykman L. A., Krasnov Ya. M, Bogatyrev V. A., Khlebtsov N. G. II In: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II / Ed. Tuchin V. V., Proc. SPIE, V. 4241, Bellingham, Washington: SPIE Publ. 2001. - P. 37.

126. Jullien R. The application of fractals to investigations of colloidal aggregation and random deposition//New.J. Chem. 1990.-Vol. 14.-№3.-P. 239-253.

127. Хлебцов H. Г., Мельников А. Г. Структурная анизотропия фрактальных кластеров и ориентационные оптические эффекты в прошедшем свете // Коллоид, журн. 1998. - Т.60. - № 6. - С.843-851.

128. Егоров А. М., Диков М. М. Структура и механизм действия антител // Журн. ВХО им. Менделеева. 1982. - Т. 27. - № 4. с. 381-388.

129. Хлебцов Н. Г., Дыкман JI. А., Богатырев В. А., Хлебцов Б. Н. Двухслойная модель биоконъюгатов коллоидного золота и ее применение для оптимизации наносенсоров//Коллоид, журн. 2003. - Т. 65. -№ 4. С. 552562.