Функциональные полимерные системы для высокочувствительного анализа белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

РОБЕР Марина Юрьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Специальность 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

00347 1 Ю9

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2009

003471109

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук Т. Б. Тенникова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук А. Ю. Меньшикова

доктор химических наук, профессор Л. А. Карцова

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский политехнический университет

Защита диссертации состоится «18» июня 2009 года в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О. д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан «15» мая 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.229.01 кандидат физ.-мат. наук

Н. А. Долотова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание новых высокочувствительных методов анализа белков имеет огромное значение для современной медицины и биологии, поскольку диагностика многих патологических состояний основана на детектировании маркерных белков в сложных биологических жидкостях. Развитие биотехнологии также требует разработки быстрых и чувствительных методов анализа белковых молекул, ответственных за протекание биотехнологических процессов (рекомбинантная технология, тканевая инженерия).

Макропористые носители на основе синтетических полимеров на протяжении последних десятилетий успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов. Применение носителей данного типа для создания биораспознающих систем в формате биочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, позволяет повысить чувствительность и сократить время выполнения анализа. При этом эффективность анализа существенно зависит от свойств используемой твердой матрицы. Так, присутствие на поверхности носителя тех или иных функциональных групп определяет способ иммобилизации адсорбционпо-активпого лиганда, а реакционная способность и количество этих групп - биоспецифическую адсорбционную емкость твердой фазы. Морфологические особенности используемой матрицы также играют важную роль в обеспечении высокой адсорбционной емкости и возможности создания для молекулы белка условий, максимально близких к ее существованию в растворе. Таким образом, развитие биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их биоаналитическую эффективность.

Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых сорбентов. Наличие в химической структуре сополимера эпоксидных групп позволяет проводить одностадийное ковалентное связывание молекул белка с поверхностью данного сорбента. Тем не менее, существенным недостатком ГМА-ЭДМА сорбентов является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксирановых циклов, а также недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В связи с этим, создание общего алгоритма конструирования трехмерных платформ для биочипов различного назначения и разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обеспечивающие быстрое связывание лиганда с поверхностью, представляется актуальной задачей.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порово-го пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя. В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи!

- поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к быстрому взаимодействию с аминогруппой молекулы белка;

- оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ полученных жестко сшитых сополимеров;

- оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с заданным

■., размером пор;

- исследование на примере модельного белка закономерностей иммобилизации ли-гандов на поверхности полученных носителей;

- оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев;

- выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков;

- оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач.

Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка. При выполнении работы были использованы следующие методы исследования!

- свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров;

- элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров;

- интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам;

- сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов;

- тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей;

- люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эффективности их практического использования.

Научная новизна работы. Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, гли-цидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленг-ликольдиметакрилата. Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках. Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей.

Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

Основные положения, выносимые па защиту:

- Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепаых сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленг-ликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком;

- Поровая структура полученных материалов удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную носителя;

- Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference "Modern Problems of Microbiology and Biotechnology" (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007) (Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепа, Эстония). Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте технической химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в Журнале прикладной химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов.

Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников.

Данная работа выполнялась в соответствии с планом НИР ИБС РАН по теме «Создание материалов биомедицинского назначения на основе синтетических и природных полимеров», а также в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (грант DFG KA 1784/4-1 и стипендия Немецкого Академического Общества по международному обмену DAAD 325 А/06/70831), при участии Военно- медицинской академии им. С. М. Кирова и технической поддержке фирмы BIA Separations GmbH (Любляна, Словения).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введепип обоснована актуальность работы, обозначена научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы состоит из трех разделов. В первом разделе рассмотрены особенности синтеза, методы исследования, а также химия поверхности полимерных макропористых сорбентов монолитного типа. Второй раздел посвящен способам создания биоаффинных разделительных фаз (нековалентная, ковалентная и ориентационная иммобилизация, прямой твердофазный синтез пептидов на поверхности носителя). В третьем разделе обсуждаются основы микроанализа, материалы, используемые для создания операционных слоев биочипов, методы детектирования целевого белка в исследуемом образце.

Глава 2. Экспериментальная часть содержит описание использованных в работе материалов, оборудования, а также методов синтеза и исследования получаемых полимерных материалов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

К несомненным достоинствам монолитных сорбентов на основе сополимера глици-дилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА) можно отнести механическую и химическую стабильность, а также наличие в структуре сополимера реакционно-способных эпоксидных групп, позволяющих проводить одностадийную ковалентную поверхностную иммобилизацию макромолекул белка. Однако существенным недостатком данного материала является длительность процесса связывания лиганда с участием эпоксидных групп, а также недостаточно высокая адсорбционная емкость носителя.

Поэтому в представляемой работе синтезированы два новых макропористых монолитных сорбента на основе тройного сополимера Ы-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМА-ЭДМА), а также сополимера 2-цианоэтилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (ЦЭМА-ЭДМА). Полученные полимерные материалы, наряду с известным ГМА-ЭДМА твердым сополимером, в дальнейшем были использованы в качестве разделительной фазы в конструируемых микроаналитических устройствах (биочипах).

Важной особенностью динамических процессов, основанных на межфазовом распределении вещества, с использованием макропористых монолитных носителей является возможность полного протекания подвижной фазы сквозь слой сорбента, что исключает диффузионные ограничения нормальному массопереносу, характерные для колонок, упакованных дисперсным сорбентом. Однако при реализации биоспецифических (аффинных) взаимодействий в непроточном формате, необходимо учитывать, что в данном случае молекулы анализируемого вещества достигают специфических адсорбционных сайтов без участия потока жидкости, т. е. исключительно за счет собственной диффузии. Поэтому определяющим этапом представляемого исследования являлась оптимизация процессов синтеза обсуждаемых сополимеров, которые должны обладать необходимыми поровыми характеристиками. При этом подразумевается гомогенность поровой структуры, а также размер пор, обеспечивающий, с одной стороны, свободное проникновение крупных молекул белка внутрь трехмерного норового пространства как в процессе иммобилизации, так и при последующем аффинном взаимодействии растворимого и связанного с поверхностью комплементов, а с другой, достаточную поверхность для достижения оптимальной адсорбционной емкости носителя.

3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА н ЦЭМА-ЭДМА.

Синтез сополимеров осуществляли методом фотоинициируемой свободно-радикальной полимеризации в присутствии иорогенных растворителей. В качестве инициатора использовали 2-гидрокси-2,2-димстилацетофснон (Дарокур-1173). Наличие в структуре полимерных продуктов функциональных групп основного мономера подтверждали методом ИК-снектроскоиии. Так, о присутствии гидрокеифталимидного фрагмента в структуре сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА свидетельствуют характеристические полосы при 1788 и 1817 см"1, которые можно отнести к валентным колебаниям карбонильной связи эфирной и имидной групп. Детектируемая в ИК-спектре сополимера ЦЭМА-ЭДМА характеристическая полоса при 2260 см"1 отвечает валентным колебаниям связи углерод-азот нитрильной группы.

Для решения задачи направленного формирования поровой структуры, оптимальной для проведения биологического микроанализа, было исследовано влияние параметров фотоинициируемой полимеризации на поровую структуру получаемого полимерного продукта. Синтез сополимеров оеущестатяли в условиях вариации концентрации инициатора, времени облучения, а также ирироды и соотношения порогенных растворителей. Как видно из графика, представленного на Рпс. 1 а, максимальный выход для всех трех сополимеров достигается при концентрации инициатора 0.8-1.0 масс%. Дальнейшее увеличение концентрации Дарокура-1173 не оказывало влияния на выход продуктов реакции, но при этом сопровождалось появлением более плотных участков на поверхности монолитного слоя. Причина этого явления заключается в формировании высокосшитых участков сополимера, практически лишенных пор или содержащих поры очень маленького размера.

С целью определения оптимального времени облучения была исследована зависимость выхода сополимеров от времени фотоинициируемой полимеризации (Рис. 1 б). Максимальный выход для сополимеров ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА достигался через 20 минут облучения, тогда как для тройного сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА этот параметр составлял 30 минут.

б)

И 30-

0,4 0,6 0.8 1,0 1.2 1,4 Концентрация инициатора, %

Время реакции, мин

Рис. 1. Зависимость выхода сополимеров от концентрации инициатора (а) и времени реакции (б).

3.1.1. Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА от природы порогенных растворителей.

С целью получения монолитных макропористых носителей со средним размером пор (не менее 1 мкм), обеспечивающим свободное проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную емкость носителя, было изучено влияние различных порообразующих агентов и их комбинаций на поровые характеристики получаемого полимерного материала.

При синтезе сополимера ГМА-ЭДМА, по аналогии с опубликованными данными для процессов термоинициируемой полимеризации, в качестве порообразующих веществ были использованы циклогексанол и додеканол., Однако в нашем случае проведенные исследования показали отсутствие существенного влияния соотношения циклогексанола и додеканола как на скорость фотоинициируемого процесса, так и на средний размер пор полученных полимерных образцов (Табл. 1).

Таблица 1

Данные интрузионной ртутной порометрии для сополимера ГМА-ЭДМА

Образец Соотношение порогенов (%, об/об) Соотношение порогены/ мономеры (%, об/об) Средний размер пор, нм Площадь поверхности, м2/г

циклогексанол додеканол

Э1 100 60/40 1500 29

Э2 90 10 60/40 1600 28

ЭЗ 70 30 60/40 1660 22

Условия: время облучения 20 мин, концентрация Дарокур-1173 1 масс%, соотношение ГМА/ЭДМА = 60/40 о6% (68/32 мол%).

№ ги д р о кси фта л и м и д пы й эфир акриловой кислоты (ГФИАК) был выбран для синтеза функциональной полимерной подложки, предназначенной для микроанализа белков, вследствие наличия в его структуре активированной сложноэфирной группы. При этом выбранный сомономер представляет собой кристаллическое вещество, требующее растворения для введения его в органическую реакционную смесь. Используемый для этого растворитель, а именно, 1,4-диоксан, автоматически становится компонентом системы порогенных растворителей и вносит свой вклад в формирование поровой структуры материала.

Поскольку 1,4-диоксан растворяет ГФИАК, образующийся полимер, содержащий звенья данного мономера, будет сольватирован присутствующими в реакционной смеси молекулами растворителя. Это может затруднить процесс разделения фаз и, соответственно, образование твердого полимерного макропористого продукта. Поэтому получение двойного сополимера ГФИАК-ЭДМА, пригодного для применения в качестве основы биочипа, не представляется возможным. Для получения полимерного материала, имеющего поровые характеристики, близкие к таковым сополимера ГМА-ЭДМА, часть ГМА в исходной полимеризационной смеси заменяли на ГФИАК. Таким образом, конечный полимерный продукт содержал два типа функциональных групп, способных к взаимодействию с аминогруппой молекулы белка, а именно, эпоксидные и сложноэфирные. Однако, в силу различной реакционной способности этих групп в выбранных условиях связывания молекул белка, иммобилизация лиганда имела место преимущественно с участием сложноэфирной группы ГФИАК, тогда как лишь незначительное количество эпоксидных групп могло принимать участия в реакции.

В Таблице 2 представлены результаты интрузионной ртутной порометрии для 18 образцов, полученных с использованием следующих порогенов в разных комбинациях и соотношениях: циклогексанол, додеканол, ПЭГ-400 и ПЭГ-600. 1,4-диоксан являлся постоянным компонентом реакционной смеси во всех экспериментах. Использование додеканола в качестве сопорогена приводило к увеличению среднего размера пор как в случае

циклогексаяола, так и ПЭГ, Кроме того, наблюдалась ожидаемая пропорциональность между количеством додеканола в реакционной смеси н средним размером пор полимерного продукта, И соответствии с полученными результатами по определению размера пор сополимеров при использовании данных и о ро ген о в. можно утверждать, что термодинамическая несовместимость использованных порообразу!ощих агентов и сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА увеличивается в ряду:

1,4-диоксан < ПЭГ < циклогекеанол < додеканол

Использование соотношения порогом ы/'мономеры ~ 60/40 приводило к образованию сшитого полимерного материала со средним размером пор 15-170 им (образцы Г1-Г4 и Г6-Г12), неудовлетворительным ддя использован и я данных материалов при конструирований биочипа. Приемлемый размер пор был получен для образца Г5, а также для образцов Г13-Г18, при синтезе которых соотношение порогены мономеры составило 75/25, а в качестве порогенов были использована смесь ПЭГ/додеканол. Однако большинство данных образцов (образцы Г5, П4, Г15, Г17, Г18) имели чрезвычайно малую: величину площади поверхности (2-5 м2 т). Исключение составили образцы Г13 и Г1б, для которых площадь поверхности была определена равной 14 и 44 м /г, соответственно. Различия в величине поверхности внутри норового пространства обсуждаемых образцов можно объяснить особенностями их норовой структуры. По данным интрузяонной ртутной яорометрии, образцы Г13 и Г16 имеют бимодальное распределение пор по размерам. В частности, образец Г16 содержит мезопоры размером 15-30 нм, доля которых составляет 15% от общего объема пор; для образца ПЗ размер мезопор и занимаемый ими объем составляют 15 нм и 4.5%, соответственно. Образцы Г14. П5, Г17 и Г18 пс содержат мезопор, что отражается на величине площади поверхности внутри норового пространства.

Согласно данным иптрузионпой ртутной порометрии (Табл. 2) и сканирующей электронной микроскопии (Рис. 2). образец ПЗ представляется наиболее оптимальным с точки зрения среднего размера пор. площади поверхности и гомогенности ггоровой структуры. Поэтому именно данный образец был выбран для дальнейших исследований.

Рлс. 2. Микрофотографии образцов, полученные методом СЭМ: (а) поверхность образца Г1, (б) скол образца Г1. (в) поверхность образца ПЗ, (г) скол образца Г13. (д) поверхность образца Г16, (е) скол образца Г16.

Таблица 2

Данные интрузионной ртутной порометрии, полученные для сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА

Образец Соотношение порогенов (%, об/об) Соотношение пороге ны/ мономеры (%, об/об) Средний размер пор, нм Площадь поверхности, м2/г

1,4-диоксан циклогексанол додеканол ПЭГ-400 ПЭГ-600

Г1 42 58.0 60/40 30 78

Г2 42 58.0 60/40 15 -

ГЗ 42 5.8 52.2 60/40 15 -

Г4 42 40.6 17.4 60/40 60 138

Г5 42 29.0 29.0 60/40 1800 2

Г6 42 17.4 40.6 60/40 20 155

Г7 42 29.0 29.0 60/40 20 30

Г8 42 34.8 23.2 60/40 170 21

Г9 42 29.0 29.0 60/40 130 24

ПО 42 23.2 34.8 60/40 70 85

Г11 42 23.2 34.8 60/40 60 52

Г12 42 17.4 40.6 60/40 60 58

Г13 42 29.0 29.0 75/25 1900 14

Г14 42 23.2 34.8 75/25 1350 5

Г15 42 34.8 23.2 75/25 1570 4

Пб 42 17.4 40.6 75/25 1160 44

Г17 42 29.0 29.0 75/25 1600 4

Г18 42 23.2 34.8 75/25 1450 5

Условия', время облучения 30 мин, концентрация Дарокур-1173 1 масс%, соотношение ГФИАК/ГМА/ЭДМА=13.3/53.3/33.3 мол%.

Обозначения: ПЭГ - полиэтиленгликоль.

В ряду сополимеров ЦЭМА-ЭДМА в условиях вариации системы Порогенных растворителей было синтезировано и исследовало У образцов. Размер пор. распределение пор но размерам и площадь поверхности полученных образцов представлен^ в Таблице 3:

Таблица 3

Данные ингруэионной ртутной порометрии для сополимера ЦЭМА-ЭДМА

Образец Соотношение порогенов ("о. об, об) Соотношение ПОрОГСНЫ' мономеры (%, об/об) Средний размер нор. нм Площадь поверхности, иг/г

циклогекоаноп ДОДОКЙНОЛ пэг- 200 ПЭГ-400 Г1ЭГ- 600

Щ 100 60,40 950 33

Ц2 100 60 40 ЮО 36

Ш 50 50 60/40 800 33

Ц4 70 30 60-40 950 26

Ц5 100 6040 680 27

Ц6 50 50 60/40 1050 36

Ц7 30 70 Й0/40 920 24

Ц8 50 50 60 40 850 32

Ц9 50 50 60,40 710 34

УслоеияЛ арелш облучения 20 мин, концентрация Дарофр-Л73 J массЩ соотношение ЦЭЬ£А/ЭДМА~60/40 об% (68/32 моя%).

Обозначения: ПЭГ - поли эш лен гликоль.

Все образцы, для синтеза которых использовали циклогексанол и додекапол, имели удовлетворительные размер пор и значение площади поверхности. Совместное использование этих веществ, взятых в различном соотношении, не влил л о на норовы с характеристики полученных полимерных образцов

Рис. 3. Микрофотографий образцов, полученные методом СЭМ: (а) Поверхность образца 1.(5, (б) скол образца Ц5, (в) поверхность образца Ц6, (г) скол образца Ц6.

ПЭГ-200, используемый в качестве самостоятельного порогена, также демонстрировал удовлетворительные порообразующие свойства, хотя и несколько уступал циклогекса-нолу и додеканолу. Использование смеси ПЭГ-200 с додеканолом в качестве порогенной системы позволило получить сополимеры с наиболее оптимальным размером пор и общей площадью поверхности.

Исследования, проведенные методами интрузионной ртутной порометрии и сканирующей электронной микроскопии показали (Рис.3), что образец Ц6 обладает подходящими для использования в микроаналитических платформах характеристиками, включая средний размер пор около 1 мкм, высокое значение площади поверхности (36 м2/г), узкое распределение пор по размерам и гомогенную морфологию поверхности.

3.2. Исследование закономерностей иммобилизации белка на поверхности макропористых монолитных носителей на основе синтезированных сополимеров.

Сополимер ГМА-ЭДМА представляет собой хорошо изученный материал монолитного типа, и условия иммобилизации белка на его поверхности были оптимизированы ранее. В частности, было показано, что максимальное количество белка (200 нмоль/г сорбента) связывается с поверхностью полимерной матрицы через 16 часов проведения реакции при 37°С, рН 9.3 и концентрации белка в исходном растворе не менее 5 мг/мл. Реакция одностадийного ковалентного связывания аминосодержащего лиганда протекает в данном случае по следующей схеме:

РН9.3 у

СН2-СН^СН2 + МН2-| -- с—О—сн2~(|;н—СН2—N4—^

3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации белка па поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА.

С целью оптимизации условий иммобилизации модельного белка бычьего сывороточного альбумина (БСА) на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА было исследовано влияние параметров процесса, таких как время реакции, рН и концентрация исходного раствора, на количество лиганда, связывающееся с поверхностью полимерной матрицы.

В случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА связывание белка с поверхностью матрицы осуществляется за счет взаимодействия активированной сложноэфирной группы

Было изучено влияние условий процесса, а именно, времени реакции (Рис. 4 а), концентрации белка в реакционном растворе (Рис. 4 б) и рН раствора (Табл. 4), на количество БСА, связывающееся с поверхностью полимера.

Время реакции, мин Концентрация БСЛ в исходном растворе, мг/мл

Рис. 4. Зависимость количества БСА, связанного с поверхностью сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА от времени реакции (а) и концетрации БСА в исходном растворе (б). Условия: (а) концентрация БСА 5 мг/мл, рН 9.4; (б) время реакции 2 часа, рН 9.4.

Таблица 4

Зависимость количества связанного с сополимером ГФИАК-ГМА-ЭДМА

Количество

рН иммобилизованного БСА,

нмоль/г сорбента

7.0 62 ±7

7.6 142 ±14

8.1 190 ±15

8.7 225 ± 17

9.4 250 ± 20

Условия: концентрация раствора белка 5 мг/мл, время реакции 2 ч, температура 37°С.

Очевидно, что реакционная способность активированных сложноэфирных групп носителя оказалась достаточной для того, чтобы сократить время иммобилизации белка по сравнению с сополимером ГМА-ЭДМА с 17 до 2 часов. При этом количество БСА, связывающееся за данное время с поверхностью сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА, составляет 250 нмоль/г сорбента или 17.8 нмоль/м2 (41% поверхности порового пространства), тогда как в случае ГМА-ЭДМА монолита за 16-18 часов связывается 200 нмоль/г сорбента.

3.2.2. Иммобилизация модельного белка на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

Реакция взаимодействия аминогруппы молекулы белка и сложноэфирной группы носителя протекает по схеме:

о - ^

0Т + |Й| -V

мн-

Для определения оптимального времени функционализации сополимера ЦЭМА-ЭДМА была изучена зависимость количества иммобилизованного белка от времени реакции (Рис. 5 а). Как видно из представленной кинетической кривой, через 4 часа значение количество связанного с поверхностью сорбента белка достигает максимума, после чего остается практически неизменным. При этом максимальная величина связывания белка, обнаруживаемая в случае ГМА-ЭДМА сополимера через 16-18 часов реакции и равная 200 нмоль/г сорбента, в случае сополимера ЦЭМА-ЭДМА достигается менее чем за 1 час.

Концентрация исходного раствора белка, необходимая для достижения максимальной адсорбционной емкости, как и в случае двух других сополимеров, составила 5 мг/мл (Рис. 5 б).

В Таблице 5 представлены значения максимального количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА лиганда, полученные при различных рН. Очевидно, что при повышении рН количество связанного с матрицей белка возрастает, однако эта зависимость не столь существенна, как в случае сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА.

__ б) <

а)

«г

о 250

400 600

Время реакции, мин

КснцентрацияБСА, мг/ыл

Рис. 5. Зависимость количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА модельного белка БСА от времени реакции (а) и концетрации БСА в исходном растворе (б). Условия: (а) концентрация БСА 5 мг/мл, рН 9.4; (б) время реакции 4 часа, рН 9.4.

Таблица 5

Зависимость количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА белка от рН среды

рН Количество

иммобилизованного БСА,

нмолъ/г сорбента

7.0 306 ±15

8.0 327 ±17

9.4 350 ±19

Условия: концентрация раствора белка 5 мг/мл, время реакции 4 ч, температура 37°С.

Таким образом, максимальная емкость сополимера ЦЭМА-ЭДМА составляет 350 нмоль лиганда/г сорбента или 9.7 нмоль/м2, что соответствует 22% занятости площади поверхности порового пространства используемого материала.

3.3. Полимерные платформы биочипов на основе макропористых метакрилатных слоев.

3.3.1. Изготовление платформы биочипа.

Процедура создания микроаналитических платформ осуществлялась в несколько ^ттттр^т'т стадий, включающих процессы

химической или механической обработки стекла (кислотное || тттрюуешя.^юшт- травление или фрезерование) с

целью изготовления операци-ШШШ-МШ^тШЛШШ^' онных ячеек на его поверхно-

сти, силанизацию поверхности

Рис. 6. Схема создания основы (платформы) биочипа.

полученных ячеек и, наконец, реакцию сополимеризации соответствующих сомономеров непосредственно в изготовленных ячейках (Рис. 6). Эксперименты по оптимизации глубины операционной ячейки проводили с использованием 11 н. плавиковой кислоты. Длительность реакции определялась целевой глубиной ячейки и составляла от 10 мин (глубина ячейки 0.08 мм) до 30 мин (глубина ячейки 0.2 мм).

Образовавшиеся в результате взаимодействия с плавиковой кислотой фторидные группы превращали в гидрокеильные кипячением в гидроксиде натрия. Поверхность полученных ячеек обрабатывали силанизирующим агентом З-(триметокеисилил) пропилметак-рилатом. Выбор данного силана обусловлен его способностью вступать в реакцию сополимеризации с метакриловыми мономерами, обеспечивая тем самым прочное связывание полимера с поверхностью стеклянной подложки.

3.3.2. Биологический анализ с использованием модельной биоснецифическои пары мышиный IgG - антитела против мышпного IgG.

3.3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации аффинного лиганда на поверхности полимерной составляющей платформы биочипа.

Разработка метода анализа белка на биочипс, в первую очередь, подразумевает поиск оптимальных условий иммобилизации аффинного комплемента к анализируемому белку (аффинного лиганда) на поверхности операционной матрицы. В Разделе 3.2 были представлены данные по иммобилизации модельного белка на поверхности синтезированных сополимеров. Следует отметить, что в данном случае были определены условия реакции, при которых с матрицей связывалось максимальное количество БСА. Однако максимальное количество прививаемого лиганда не всегда является оптимальным с точки зрения эффективности биологического анализа, построенного на образовании специфических комплексов. Поэтому оптимальные условия иммобилизации лиганда могут быть установлены лишь по результатам проведенного аналитического теста.

В данной серии экспериментов была использована модельная аффинная пара мышиный иммуноглобулин G - антитела против мышиного иммуноглобулина G, полученные иммунизацией коз. При этом мышиный иммуноглобулин G использовали в качестве аффинного лиганда, а растворенный коньюгат козьих антител против мышиного иммуноглобулина G с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 555 рассматривался как анализируемый объект.

С целью определения оптимального количества аффинного лиганда, иммобилизованного на поверхности носителя, было исследовано влияние условий реакции иммобилизации, включая температуру, концентрацию и рН раствора, на результаты анализа, а именно, на количество детектируемого растворенного белка, комплементарного к иммобилизованному лиганду. Для сополимера ЦЭМА-ЭДМА также варьировали время реакции иммобилизации, поскольку предварительно было установлено, что в случае данног о носителя за 1 час с поверхностью связывается приблизительно такое же количество белка, как и для сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА, в то время как максимально возможное количество связанного лиганда достигается через 4 часа. Поскольку осуществление кова-лентного связывания лиганда с поверхностью макропористого носителя в течение 4 ч выражается в существенно более интенсивном флуоресцентном сигнале, в последующих экспериментах с использованием сополимера ЦЭМА-ЭДМА иммобилизацию белка проводили в течение данного времени. При использовании в качестве полимерной матрицы сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА реакцию иммобилизации проводили в течение 17 и 2 часов, соответственно.

В целях оптимизации концентрации и рН раствора белка были использованы две буферные системы, а именно, 0.01 M натрий-боратный буфер (рН 9.5) и 0.01 M фосфатно-солевой буфер (рН 7.5). На Рис. 7 представлены зависимости интенсивности флуоресцен-

ции регистрируемого сигнала меченого козьего 1кО оч рН иммобилизации лиганда (мышиного 1ёО). установленные для сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФЙАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭ-МА-ЭДМА. Из представленного рисунка очевидно, что осуществление реакции иммобилизации при рН 7.5 выражается в более интенсивном сигнале, регистрируемом после образования аффинной пары с анализируемым компонентом, а, следовательно, повышает чувствительность анализа. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о ТОМ, что рН 9,5, при котором с поверхностью матрицы связывается наибольшее количество белка, в условиях биоанализа оказался неопта мальньШ, ч то, скорее всего, связано со стери чески ми препятствиями аффинному взаимодействию за счет экранирования значительного числа сайтов связывания лиганда при его высокой поверхностной плотности.

Концентрации мьешкцого нммуиостйэд'.тнна с1, .чг.'мл

0,? е.л о, Б с.в 'и

Концентрация Нитяного ИМмуИиТ.ЮСуЛГШЙ Ч[

Условия: реащюо иммобилизации лиганда осуществляли при 37°С, время реакции составляло 17 ч для ГМА-ЭДМА. 2 ч для ГФИАК-ГМА-ЭДМА, 4 ч для ЦЭМА-ЭДМА Погрешность- измерения интенсивности флуоресценции составляла 5-7

концентрация МЫ10 ЫНа нм.иукоГч'юбтлннч С, мг.-'аи

Рис. 7. Зависимости интенсивности флуоресценции анализируемого белка от рН и концентрации раствора лиганда при его иммобилизации, установлен»ые для сополи мс ров-носителей 1'МА-ЭДМА (а), ГФИАК-ГМА-ЭДМА (б) и ЦЭМАОДМА (в).

На Рис. 7 также представлена зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала от концентрации Мышиного иммуноглобулина О в растворе при его иммобилизации. Монотонное увеличение ингенсивности сигнала с увеличением концентрации лиганда наблюдается липгь в случае сополимера ГМА-ЭДМА. Использование матрицы на основе сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА позволяет получать достаточно интенсивный сигнал адсорбированного белка уже при концентрации лиганда 0.2 мг/мл, что, по-видимому, связано с меньшей плотностью адсорбционных сайтов сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА по сравнению с двумя другими материалами, а, следовательно, более быстрым их насыщением аффинным лигандом. В случае сополимера ЦЭМЛ-ЭДМА, интенсивность сигнала возрастала

при увеличении концентрации ли ганда в растворе при его иммобилизации от 0.2 до 0.8 мг.'мл, однако при использовании концентрации 1 мг/мл интенсивность флуоресценции адсорбированного комплемента снижалась, причиной чего, вероятно, является чрезмерно высокая плотность л и га! ¡да па единицу поверхности, вызывающая серьезные стеричсские препятствия образованию аффинного комплекса.

Для определения оптимальной температуры реакции иммобилизации полимерно-неорганические Йлйстины инкубировали с раствором мышиного иммуноглобулина С? при и 37-С. Ьыло показано, что проведение реакции иммобилизации при температуре 37°С выражается в более интенсивном флуоресцентном сигнале.

Для оценки необходимости проведения процедуры блокирования поверхностных реакционных групп носителя после иммобилизации ли-ганда, был осуществлен эксперимент с использованием двух слайдов, поверхность одного из которых после иммобилизации ли ганда блокировали с использованием раствора ВС А в фосфатао-солевом буфере, в то время как поверхность второго оставляли не блокирован ной. 11редставленные на Рис. 8 результаты демонстрируют значительное увеличение соотношения сигнал-шум, являющееся характеристикой качества светящихся зон (спотов), при блокировании поверхности.

К.:1 »"Г ......... мышиного muQlior.lo6y.lH1 |я С, мГ М.1

Рнс. 8. Влияние процедуры блокирования поверхности монолита на качество спотов: изменение соотношения сигнал/шум.

Условия: температура реакции иммобилизации ЗТ^С, рН 7.5. Погрешность намерения составляла 5-У

3.3.2.2. Сравнение эффективности разработанных трехмерных микроаналитических устройств на основе метакрилатных монолитов и стандартных двумерных стеклянных чипов.

Биологические микрочипы на основе стекла, поверхность которого модифицирована реакционно-способными группами, достаточно широко используются в настоящее время для проведения обсуждаемого биологического анализа. В качестве сравнения, нами были использованы стеклянные чипы с поверхностью, активированной альдегидными группами. Основное отличие разработанных нами полимерных носителей от стеклянных заключается в том, что в первом случае реакция специфического связывания лиганда и анализируемого объекта протекает н порах трехмерного носителя, в то время как во втором реакция аффинного комплекеообразова ния имеет место лишь на двумерной поверхности отекла. Из представленных на Рис. 9 диаграмм видно, что полимерные трехмерные матрицы демонстрируют более высокое соотношение сигнал/шум но сравнению со стеклянным носителем. Такой результат обусловлен более высокой адсорбционной емкостью пористого носителя по сравнению с пленарным.

Для оценки воспроизводимости результатов микроанализа, полученных с использованием той или иной поверхности, обычно используют коэффициент изменчивости (К), который представляет собой отношение стандартного отклонения значения интенсивности флуоресценции анализируемой зоны к значению интенсивности флуоресценции этой юны. При этом различают коэффициент изменчивости сигналов, полученных в одном экспери-

менте на одном носителе (Ев) и коэффициент изменчивости сигналов, Полученных при исследовании ряда носителей данного типа (К2). В Таблице 6 представлены коэффициенты изменчивости, полученные для синтезированных сополимеров и альдегид-еодержащих стеклянных слайдов.

а)

^■ШЛ-ЗДМЛ

J CI- .KI M.; уг> , ЙИЙЦАМЛ-ЗДМЛ I

ей>и1|снт]39|[цд м 1,1111г к ii4mv плг.ю&г-.шиа g. ml 41

0,2 а 4 0 е } 6 10

К О НИ СИ Т |> IM1ILF1 TlllllMI). *>!':)•: or л jlj ^iti и, нгЛсл

Рис. Сравнительная диаграмма зависимости максимального соотношения си шал/шум, полученного для разных материалов, от концентрации лиганда в растворе при иммобилизации: (а) концентрация анализируемого белка 200 иг/мл, (б) концентрация анализируемого белка 20 нг/мл.

Таблица 6

Коэффициенты изменчивости и пределы детектирования, полученные для исследуемых носителей

Носитель К,, % К,, % Предел детектирования, нг/мл

Стекло 17 14 200 ± 20

ГМА-ЭДМА 8 £ 20x2

1 'ФИАК-ГМА-Э ДМА 17 1У 20*2

ЦЭМА-ЭДМА 10 11 10±1

Таким образом, сополимеры ГМА-ЭДМЛ и ЦЭМА-ЭДМА демонстрируют достаточно высокую воспроизводимость флуоресцентного сигнала. Коэффициенты изменчивости, полученные для сополимера !'ФИАК"-ГМА-')ДМА близки к коэффициентам изменчивости стеклянных слайдов. Скорее всего, это обусловлено недостаточно высокой воспроизводимостью синтеза данного сополимера, обладающего более дефектной поверхностью по сравнению с сополимерами ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА. Однако можно заключить, что применение вее\ порученных полимерных материале» позволяет детектировать, как минимум, в 10 раз меньшее количество анализируемого белка по сравнению с пленарными стеклянными слайдами.

3.3.3. Применение разработанных аналитических устройств на основе сополимера ГМА-ЭДМА для детектировании аи гп гел к антигену Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

Разработанная основа биочипа на основе макропористого монолита ГМА-ЭДМА была Использована для создания тест-системы, предназначенной для обнаружения в сыворотке крови человека антител к антигену Treponema pallidum, являющемуся возбудителем

тяжелого инфекционного заболевания сифилиса. В качестве одного из решений задачи I высокоэффективною серологического скрининга нпсслсннх ноже/ быть предложено соЩ-\ ганце использования высокоспецифичиого антигена Т. pallidum с технологией биочипов. В данной работе был использован антиген Т. pallidum с молекулярной массой 17 kDa- полу; ченныЙ генно-янженерным способом в культуре Е. coli. Концентрацию предназначенного дли иммобилизации раствора антигена варьировали от 0.2 до 1 мг/мл. На Рис. 10 представлены флуоресцирующие зоны, полученные после точечного нанесения образцов положительных и отрица тельных сы воротов: кропи на поверхность биочипа с последующей обработкой тест-системы по л и клепальным и антителами против человеческих антител к антигену Г. pallidum, мечеными ФИТЦ. Как видно из Рис. 10. концентрация антигена 0.4 мг'мл может быть рекомендована в качестве оптимальной, так как се использование обеспечивало достаточный флуоресцентный сигнал после обработки тест-системы положительной сывороткой, в то время как при использовании отрицательной сыворотки сигнал регистрировался как незначительный. При увеличении концентрации лиганда от 0.4 до 1 мг/мл флуоресценция зон. полученных с использованием отрицательной еывйротки, увеличивалась, что может быть следствием н(-специфиченкого взаимодействии других сывороточных белков с антигеном Т. pallidum.

Чувствительность и специфичность тест-системы на основе сополимера ГМА-ЭДМА с ковадентно связанным рскомбишщтным антигеном Т. pallidum составили 92 и 80%, соответственно. Полученное значение чувствительности является удовлетворительным и близким к значению того же параметра для стандартного иммуноферментного метода (93.5%), Значение специфичности является ниже принятых величин, что можно объяснить необходимостью дальнейшей оптимизации разработанного метода.

Ü.2 мг/мл 0.4 мг'мл 0.6 мг/мл 0.8 мг/мл 1.0 мг/мл

0.2 мг/мл 0.4 мг/мл 0.6 мг/мл 0.8 мг мл 1.0 мг'мл

Рис. 10. Изображение флуоресцирующих зон, полученных с использованием люминесцентной микроскопии. Верхний ряд мготои получен ири использовании положительнЫХОЫвороток, Нижний - при аспользованни отрицательных сывороток

3.3.4. Детектирование остеопонтивя в клеточном еупернатанте с использованием разработанных шшоамалитнческих устройств.

Разработанные прототипы биочипа были использованы для детектирования остсо-понтина (белка, являтощегося одним из оонов^ьгу маркеров кавтесЗразования) с целью контроля за ростом клеточной маесы В процессе инженерии костной ткани.

Для определения предела детектирования тест-систсмы концентрацию модельных растворов остеопонтина варьировали от 0.001 до 1 мкг мл. Изображения флуоресцирующих зон (слогов), полученных при разных концентрациик, представлены на Рис. Ц. Предел детектирования составил 0.0] мят/мл (пли 0.3 пмоль'мл).

Рис. 11. Изображение флуоресцирующих зон, полученных при использовании различных концентраций оетеопонтина.

Для оценки возможности детектирования оетеопонтина и реальной биологической жидкости с помощью разработанной тест-системы были использованы 2 су-перпатанга, один из которых был получен после культивации клеточной линии, берущей начало от клеток первичной ос тс оса рко мы. а, следовательно, данный образец должен содержать определенное количество оетеопонтина. Второй образец, арпоп не содержащий

Рис. 12. Соотношение еигнал'шум, полученное для остсопсш"ш> бь!Л получен в резуль-иеследуемых носителей при детектировании остео- тате «У^тавации первичных мезен-понтина в клеточном супсрнатанте, химальных стволовых клеток, пешу-

Погрешность намерения составляла 5-6 %. ченных из жировой ткани. Данные

образцы сложных жидкостей подвергались анализу с использованием всех грех разработанных сополимеров. Все материалы позволили детектировать присутствие оетеопонтина н первом образце и его отсутствие во втором. На Рис. 12 представлены значения соотношения сугнал/шум, полученные при детектировании оетеопонтина с использованием исследуемых носителей.

Выводы

1. Впервые осуществлен синтез епгитых жесткоцепных сополимеров N - гидроксифта-лимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиме-такрилата (ГсЬИДК-ГМЛ-ЭДМД) и 2-ци а ноэтил метакрилата и этилен гл и коль ди метакрилата (ЦЭМА-ЭДМА). Установлены оптимальные условия получения методом фотоинициируемой полимеризации сополимеров гл и цид и л метакрилата и этиленг-ликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА), ГФИА К-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА, обеспечивающие получение материалов с заданными норовыми характеристиками.

I

2. Исследовано влияние условий ковалентно!« связывания модельное белка (бычьего сывороточного альбумина) с поверхностью синтезированных сополимеров (время реакции. р1!, концентрация раствора белка) на степень модификации носителя белком. Показано, что максимальная степень модификации сорбента лигандом I! случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА достигается за 2 часа и составляет 250 нмоль/г.

I-

I

III 111

ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМЛ-ЭДМЛ

тогда как для сополимера ЦЭМЛ-ЭДМА эта величина достигает 350 нмоль/г сорбента при проведении реакции в течение 4 часов.

3. Разработан принцип конструирования полимерно-неорганической основы биочипа на основе стеклянной поддерживающей среды и макропористых полимерных носителей, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, обработку полученных ячеек ненасыщенным силанизирующим агентом и синтез привитого сополимера непосредственно в изготовленных ячейках.

4. С использованием модельной пары комплементарных белков мышиный иммуногло-булии G - козьи антитела против мышиного иммуноглобулина G оптимизированы основные условия осуществления биоанализа, обеспечивающие максимальную эффективность сконструированных микроустройств. Показано, что чувствительность анализа, проводимого на чипе с монолитным полимерным слоем на порядок превышает таковую для планарных стеклянных чипов.

5. На примере выявления антител к антигену бледной трепонемы в сыворотке крови человека, а также детектирования остеопонтина в клеточном супернатанте продемонстрирована перспективность применения полученных прототипов микроаналитических систем для медицинских и биотехнологических целей.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Г. Н. Химич, Е. Н. Рахматуллина, М. Ю. Слабоспицкая, Т. Б. Тенникова. Синтез и исследование поровой структуры полимерных монолитных сорбентов.// Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78. 4. С. 623-628.

2. M. Yu. Slabospitskaya, Е. G. Vlakh, N. N. Saprykina, Т. В. Tennikova. Synthesis and investigation of a new macroporous monolithic material based on an N-hydroxyphthalimide ester of acrylic acid-co-glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate terpolymer. /1 J. Appl. Polym. Sei. 2009. V. 111. P. 692-700.

3. E. G. Vlakh, M. Yu. Slabospitskaya, T. B. Tennikova. Solid phase peptide synthesis on macroporous methacrylate monolithic layers, in booki А/. Flegel, M. Fridkin, С. Gilon, J. Slaninova (Eds.). Peptides 2004. Proceedings of the 3rd International and 28th European Peptide Symposium. Lausanne: Kenes International (2004). P. 5-6.

4. M. Ю. Слабоспицкая, E. Г. Влах, H. В. Раздольская, M. В. Сердюцкая, А. М. Иванов, Т. Б. Тенникова. Прототип биологического микрочипа на основе макропористых монолитных носителей для диагностики сифилиса. В сб. «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007». Сборник трудов международной научной конференции. Санкт-Петербург. 17-19 апреля, 2005. С. 191-196.

5. М. Ю. Слабоспицкая, Г. Н. Химич, Т. Б. Тенникова. Получение макропористых монолитных ГМА-ЭДМА сополимеров методом фотоинициирусмой радикальной полимеризации. Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах". Санкт-Петербург, 1-3 февраля, 2005. Ч. С. 84.

6. М. Ю. Слабоспицкая, Е. Г. Влах, Т. Б. Тенникова. Макропористые полимерные слои для создания биологических микрочипов. Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах". Санкт-Петербург, 1-3 февраля, 2005. Ч. 2. С. 86.

7. M. Slabospitskaya, Е. Vlakh, Т. Tennikova. New polymer monolithic materials for protein microarrays. 5th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems". Saint-Petersburg, Russia, June 20-24,2005. Book of Abstracts. P-166.

8. I. Kalashnikova, N. Ivanova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova. Use of microarray approach for quantitative detection of virus-like particles. Monolith Summer School (MSS 2006) "Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis", Portoroz, Slovenia, May 28-31,2006. www.monoliths.com/ SummerShcool.

9. M. Yu. Slabospitskaya, E. S. Sinitsyna, E. G. Vlakh, Т. B. Tennikova. Bioanalytical testsystems based on polymer monolithic materials. International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). Moscow, Russia, 25-30 June, 2006. Book of Absracts. P 248.

10.M. Yu. Slabospitskaya, E. G. Vlakh, N.V. Razdolskaya, M.V. Serdyutskaya, A. M. Ivanov, Т. B. Tennikova. 3-D biochips based on macroporous monolithic polymers for diagnostics of syphilis. European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Procesess (Euromat 2007). Nuremberg, Germany, September 10-13, 2007. www. euromat2007. ferns. org, X42-1944.

11. M. Ю. Слабоспицкая, E. Г. Влах, Т. Б. Тенникова. Синтез тройного метакрилатного сополимера для создания белковых микрочипов. 3-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах". Санкт-Петербург, Россия, 17-19 апреля, 2007. С. 36.

12. М. Slabospitskaya, Е. Vlakh, N. Rasdolskaya, A. Ivanov, Т. В. Tennikova. Microanalytical platform based on macroporous methacrylate copolymers for serum diagnostics of syphilis. The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference "Modern Problems of Microbiology and Biotechnology", Odessa, Ukraine, May 28-31,2007. Book of Abstracts. P. 91.

13. E. Vlakh, M. Yu. Slabospitskaya, E. S. Sinitsyna, T. Tennikova. Rigid macroporous methacrylate-based copolymers for 3-D protein microarray. Baltic Polymer Symposium

2007 (BPS 2007). Druskinikai, Lithuania, September 19-21, 2007. Book of Abstracts, P. 38.

14.E. Maksimova, M. Slabospitskaya, E. Vlakh, T. Tennikova. Synthesis of rigid macroporous polymer supports based on 2-cyanoethyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. 4-th Saint-Petersburg Young Scientists Conference "Modern Problems of Polymeric Science", April 15-17, 2008. Book of Abstracts, P. 48.

15.E. Vlakh, E. Maksimova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova. Development of cyano-bearing macroporous materials for bioaffinity based processes. Baltic Polymer Symposium

2008 (BPS 2008). Otepaa, Estonia, May 13-16,2008. Book of Abstract, P. 69.

16.E. Maksimova, M. Slabospitskaya, E. Vlakh, T. Tennikova. Novel functional methacrylate monoliths with reactive cyano-groups. Monolith Summer School and Symposium for Biochromatography, Bioconversion, and Solid Phase Synthesis (MSS 2008). Portoroz, Slovenia, 30 May -4 June, 2008. Book of Abstracts, P. 36.

17.Marina Slabospitskaya, Elena Maksimova, Evgenia Vlakh, N. Saprykina, C. Kasper, Tatiana Tennikova. Comparison of different functional macroporous monolithic polymers for 3-D protein nanoarray. 6th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems". Saint-Petersburg, Russia, June 2-6,2008. Book of Abstracts. P. 219.

18.M. Slabospitskaya, J. Walter, E. Vlakh, F. Stahl, C. Kasper, T. Tennikova. New format of monoliths applications'. 3D-protein nanoarrays. Monolith Summer School and Symposium for Biochromatography, Bioconversion, and Solid Phase Synthesis (MSS 2008). Portoroz, Slovenia, 30 May -4 June, 2008. Book of Abstracts, P. 32.

Отпечатано копировально-множительным участком отдела обслуживания учебного процесса физического факультета СПбГУ. Приказ № 571/1 от 14.05.03. Подписано в печать 14.05.09 с оригинал-макета заказчика. Ф-т 30x42/4, Усл. пен. л. 1. Тираж 120 экз., Заказ № 971/с. 198504, СПб, Ст. Петергоф, ул. Ульяновская, д. 3, тел. 929-43-00.

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Макропористые монолитные носители на основе синтетических полимеров.

1.1.1. Общие представления о твердых макропористых полимерных носителях.

1.1.2. Получение макропористых монолитных полимерных носителей.

1.1.2.1. Механизм формирования поровой структуры в процессе микрофазового разделения.

1.1.2.2. Особенности получения макропористых полимерных носителей в блоке.

1.1.2.3. Порообразующие агенты.

1.1.2.4. Мономеры и сшивающие агенты.

1.1.2.5. Побочные реакции циклизации и образования внутримолекулярных сшивок.

1.1.3. Методы исследования морфологической структуры макропористых монолитов.

1.1.4. Химия поверхности полимерных носителей монолитного типа.

1.2. Способы создания носителей для твердофазного биологического анализа.

1.2.1. Способы модификации поверхности носителя биоаффинными зондами (лигандами).

1.2.1.1. Нековалентная иммобилизация.

1.2.1.2. Ковалентная иммобилизация.

1.2.1.3. Ориентационная иммобилизация.

1.2.1.4. Применение подходов твердофазного пептидного синтеза.

1.З.,Микроаналитические системы для анализа белков.

1.3.1. Основные принципы микроанализа.

1.3.2. Общие представления о материалах, используемых для создания операционных слоев микрочипов.

1.3.2.1. Двумерные (2D) носители.

1.3.2.2. Трехмерные (3 D) носители.

1.3.3. Методы детектирования целевого компонента в исследуемом образце.

1.3.3.1. Радиоизотопный анализ.

1.3.3.2. Ферментный анализ.

1.3.3.3. Флуоресцентный анализ.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы.

2.3.1. Синтез сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА.

2.3.1.1. Получение N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты.

2.3.1.2. Осуществление процесса свободно-радикальной полимеризации.

2.3.2. Изучение закономерностей иммобилизации аффинного лиганда на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА и сополимера ЦЭМА-ЭДМА с использованием БСА в качестве модельного белка.

2.3.2.1. Процедура иммобилизации.

2.3.2.2. Аналитические методы определения концентрации белка.

2.3.2.3. Анализ растворимых продуктов реакции.

2.3.3. Создание микроаналитических слайдов (платформы биочипа) на основе полимерной монолитной матрицы и стеклянной поддерживающей среды.

2.3.3.1. Обработка поверхности стекла (кислотное травление и силанизация).

2.3.3.2. Получение монолитных полимерных слоев в подготовленных ячейках слайдов.

2.3.4. Биологический анализ с использованием полученных прототипов биочипа.

2.3.4.1. Тестирование микроаналитических систем с использованием модельной биокомплементарной системы мышиный IgG — антитела против мышиного IgG.

2.3.4.2. Микроанализ на поверхности стеклянного 2-D биочипа.

2.3.4.1.Создание тест-систем для диагностики сифилиса на основе сополимера ГМА-ЭДМА.

2.3.4.4. Определение остеопонтина в клеточном супернатанте.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА.

3.1.1 Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА от природы используемых порогенных растворителей.

3.2. Исследование закономерностей иммобилизации белка на поверхности макропористых монолитных носителей на основе синтезированных сополимеров.

3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации модельного белка на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА.

3.2.2. Иммобилизация модельного белка на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.2.2.1. Исследование продуктов реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.2.2.2. Оптимизация условий проведения реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.3. Полимерные платформы биочипов на основе макропористых метакрилатных слоев.

3.3.1. Изготовление платформы биочипа.

3.3.2. Биологический анализ с использованием модельной системы мышиный IgG - антитела против мышиного IgG.

3.3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации аффинного лиганда на поверхности полимерной матрицы.'.

3.3.2.2. Сравнение эффективности разработанных наноаналитических устройств на основе метакрилатных монолитов и стандартных двумерных стеклянных чипов.

3.3.3. Применение разработанных аналитических устройств на основе сополимера ГМА-ЭДМА для детектирования антител к антигену Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

3.3.4. Детектирование остеопонтина в клеточном супернатанте с использованием разработанных наноаналитических устройств.

Выводы.

Разработанные в конце 80-х годов макропористые монолитные сорбенты на основе синтетических полимеров в настоящее время успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов, таких как, высокоэффективная жидкостная хроматография, ферментативные реакции, капиллярная электрохроматография, газовая хроматография, химический катализ. Уникальные особенности поровой структуры макропористых монолитов, обеспечивающие адсорбционную доступность поровой поверхности для крупных и малоподвижных молекул белка, позволили предположить, что данные материалы могут быть использованы для конструирования непроточных микроаналитических устройств (прототипов биочипа), состоящих из инертной поддерживающей среды и ко-валентно связанного с ней слоя полимерного монолита.

В последние годы активное развитие переживает новая биотехнологическая отрасль, направленная на миниатюризацию методов анализа биологических объектов. Применение в различных областях биологии и медицины аналитических тест-систем, выполненных в формате биологических микрочипов, становится все более распространенным явлением. Интерес к этим миниатюрным приборам обусловлен предоставляемой ими возможностью проводить комплексный аналитический скрининг материала с минимальными затратами времени и дорогостоящих реагентов. Действие подобных тест-систем основано на функциональном ответе биообъектов, иммобилизованных на поверхности твердого носителя, на присутствие в растворе соответствующего комплемента. Поскольку свойства стационарной фазы играют важную роль в обеспечении эффективности биоанализа, материалы, используемые в целях иммобилизации биологических молекул должны удовлетворять ряду строгих требований, которые включают в себя механическую и химическую стабильность, отсутствие неспецифического взаимодействия с биологическими объектами, обеспечение хорошего качества наносимых зон (спотов) анализируемого вещества, простоту манипуляций и совместимость с системой детектирования.

При выборе способа создания адсорбционной матрицы, обладающей биоаффинными свойствами, значительную роль играет химическая природа стационарного носителя, поскольку именно она определяет возможность проведения того или иного способа функционализации сорбента аффинными лигандами. Наиболее простой способ иммобилизации может быть осуществлен посредством их физической адсорбции. Этот подход широко используется в таких видах биологического анализа, как имму-ноферментный тест, иммуноблоттинг и дот-иммуноанализ. Однако наличие слабых взаимодействий с матрицей может повлечь за собой потерю аффинной емкости сорбента за счет десорбции лиганда с поверхности при незначительных изменениях в составе жидкой фазы или температуры. Поэтому ковалентное связывание лиганда с поверхностью матрицы считается наиболее предпочтительным с точки зрения обеспечения его устойчивости в аналитических условиях. Следует отметить, что и в этом случае имеются определенные ограничения. Проведение процедуры иммобилизации имеет смысл лишь при условии сохранения биологической активности лиганда, поэтому реакцию необходимо проводить в максимально мягких условиях, а реакционные группы белка, принимающие участие в процессе иммобилизации, не должны располагаться в непосредственной близости от активного сайта биомолекулы.

Таким образом, развитие технологии биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их эффективность.

Макропористые монолитные носители на основе синтетических полимеров получают методом свободно-радикальной полимеризации в блоке в присутствие по-рообразующих агентов. Данный тип сорбентов характеризуется неизменной поровой структурой, которая формируется в процессе синтеза и сохраняется в сухом состоянии. Оптимизация условий синтеза обсуждаемых материалов обеспечивает возможность направленного формирования поровой структуры в зависимости от поставленной задачи.

Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭД-МА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых монолитных носителей. Наличие эпоксидных групп в химической структуре сополимера позволяет проводить одностадийную ковалентную иммобилизацию молекул белка на поверхности сорбента. Однако существенным недостатком данного носителя является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксира-новых циклов и недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В свете обозначенной проблемы разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обладающие более высокой реакционной способностью, представляется актуальной задачей.

Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя.

В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи:

• поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к взаимодействию с аминогруппой молекулы белка;

• оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ ^ полученных жестко сшитых сополимеров;

• оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с задан- ; ным размером пор;

• исследование закономерностей иммобилизации лигандов на поверхности полученных носителей на примере модельного белка;

• оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев;

• выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков;

• оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач. Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка.

При выполнении работы были использованы следующие методы исследования:

- свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров;

- элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров;

- интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам;

- сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов;

- тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей;

- люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эф- »-фективности их практического использования.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилме-такрилата и этиленгликольдиметакрилата, а также 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата.

• Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках.

• Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей.

Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепных сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольди-метакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком;

- Поровая структура полученных носителей удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную емкость носителя;

- Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference "Modern Problems of Microbiology and Biotechnology" (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007)

Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва)' и 2008 (Отепа, Эстония).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в журналах: Журнал Прикладной Химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов. Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте Технической Химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007).

Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников.

ВЫВОДЫ

1. Впервые осуществлен синтез сшитых жесткоцепных сополимеров N - гидро-ксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМА-ЭДМА) и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ЦЭМА-ЭДМА). Установлены оптимальные условия получения методом фотоинициируемой полимеризации сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА, обеспечивающие получение материалов с заданными поровыми характеристиками.

2. Исследовано влияние условий ковалентного связывания модельного белка (бычьего сывороточного альбумина) с поверхностью синтезированных сополимеров (время реакции, рН, концентрация раствора белка) на степень модификации носителя белком. Показано, что максимальная степень модификации сорбента лигандом в случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА достигается за 2 часа и составляет 250 нмоль/г, тогда как для сополимера ЦЭМА-ЭДМА эта величина достигает 350 нмоль/г сорбента при проведении реакции в течение 4 часов.

3. Разработан принцип конструирования полимерно-неорганической основы биочипа на основе стеклянной поддерживающей среды и макропористых полимерных носителей, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, обработку полученных ячеек ненасыщенным силанизирующим агентом и синтез привитого сополимера непосредственно в изготовленных ячейках.

4. С использованием модельной пары комлементарных белков мышиный иммуноглобулин G - козьи антитела против мышиного иммуноглобулина G оптимизированы основные условия осуществления биоанализа, обеспечивающие максимальную эффективность сконструированных микроустройств. Показано, что чувствительность анализа, проводимого на чипе с монолитным полимерным слоем на порядок превышает таковую для планарных стеклянных чипов.

5. На примере выявления антител к антигену бледной трепонемы в сыворотке крови человека, а также детектирования остеопонтина в клеточном супернатан-те продемонстрирована перспективность применения полученных прототипов микроаналитических систем для медицинских и биотехнологических целей.

1. Д. А. Фридрихсберг. Курс коллоидной химии. JL: Химия, 1974. 352 с.

2. А. М. Шур. Высокомолекулярные соединения. М.: Высшая школа, 1966. 504 с.

3. О. Okay. Macroporous copolymer networks. // Prog. Polym. Sci. 2000. V. 25. P. 711779.

4. K. W. Pepper. Sulphonated cross-linked polystyrene: A monofunctional cation-exchange resin. И J. Appl. Chem. 1951. V. 1. P. 124-132.

5. H. Jacobelli, M. Bartholin, A. Guyot. Styrene Divinyl Benzene Copolymers. I. Texture of Macroporous Copolymers with Ethyl-2-Hexanoic Acid in Diluent. // J. Appl. Polym. Sci. 1979. V. 23. P. 927-939.

6. I. M. Abrams, J. R. Millar, A history of the origin and development of macroporous ion-exchange resins. // React. Polym. 1997. V. 35. P. 7-22.

7. Т. B. Tennikova, M. Bleha, F. Svec, Т. V. Almazova, B. G. Belenkii. High Performance Membrane Chromatography of Proteins: a Novel Method of Protein Separation. II J. Chromatogr. 1991. V. 555. P. 97-107.

8. Т. B. Tennikova, F. Svec. High-performance membrane chromatography: highly efficient separation method for proteins in ion-exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase modes. II J. Chromatogr., 646, 1993, 279-288.

9. A. E. Rodrigues, B. J. Ahn, A. Zoulalian. Intraparticle-Forced Convection Effect in Catalyst Duffusivity Measurements and Reactor Design. // AIChE J. 1982. V. 28. P. 541546.

10. A. E. Rodrigues, Z. P. Lu, J. M. Loureiro. Peak resolution in linear chromatography. Effects of intraparticle convection. II J. Chromatogr. A. 1993. V. 653. P. 189-198.

11. J. J. Meyers, A. I. Liapis. Network modeling of the convective flow and diffusion of molecules adsorbing in monoliths and in porous particles packed in a chromatographic column. II J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 3-23.

12. F. Svec, J. M. J. Frechet. New Formats of Polymeric Stationary Phases for HPLC Separations: Molded Macroporous Disks and Rods. // J. Mol. Recogn. 1996. V. 9. P. 326334.

13. F. Svec, E. C. Peters, D. Sykora, C. Yu, J. M. J. Frechet. Monolithic Stationary Phases for Capillary Electrochromatography Based on Synthetic Polymers: Designs and Applications. // J. High Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 3-18.

14. F. Svec. Preparation and HPLC applications of rigid macroporous organic polymer monoliths. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 747-766.

15. R. Mallik, T. Jiang, D. S. Hage. High-Performance Affinity Monolith Chromatography: Development and Evaluation of Human Serum Albumin Columns. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 7013-7022.

16. A. Podgornik, J. Jancar, M. Mefhar, S. Kozamernik, D. Glover, К. Cucek, M. Barut, A. Strancar. Large-scale methacrylate monolithic columns: design and properties. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2004. V. 60. P. 179-189.

17. B. Gu, Y. Li, M. L. Lee. Polymer Monoliths with Low Hydrophobicity for Strong Cation-Exchange Capillary Liquid Chromatography of Peptides and proteins. // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 5848-5855.

18. N. M. Smith, Z. Jiang. Developments in the use and fabrication of organic monolithic phases for use with high-performance liquid chromatography and capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 416-440.

19. A. Jungbauer, R. Hahn. Polymethacrylate monoliths for preparative and industrial separation of biomolecules assemblies. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 62-79.

20. A-M. Siouffi. About the С term in the van Deemter's equation of plate height in monoliths. II J. Chromatogr. A. 2006. V. 1126. P. 86-94.

21. E. Vlakh, N. Ostryanina, A. Jungbauer, T. Tennikova. Use of monolithic sorbents modified by directly synthesized peptides for affinity separation of recombinant tissue plazminogen activator (t-PA). //J. Biotechnol. 2004. V. 107. P. 275-284.

22. N. D. Ostryanina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Multifunctional Fractionation of Polyclonal Antibodies by Immunoaffinity High-performance Monolithic Disk Chromatography. II J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 163-171.

23. R. Mallik, D. S. Hage. Affinity monolith chromatography. // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1686-1704.

24. G. A. Platonova, Т. B. Tennikova. Affinity processes realized on high-flow-throughmethacrylate-based macroporous monoliths. II J. Chromatogr. A, 1065, 2005, 19-28.в

25. M. Kato, K. Inuzuka, K. Sakai-Kato, T. Toyo'oka. Monolithic Bioreactor Immobilizing Trypsin for High-Throughput Analysis. // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 1813-1818.

26. F. Svec. Organic polymer monoliths as stationary phases for capillary HPLC. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 1419-1430.

27. F. Svec, A. A. Kurganov. Less common applications of monoliths. III. Gas chromatography. И J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 281-295.

28. F. Svec, J. M. Frechet, in: Svec, F., Tennikova, Т. В., Deyl, Z. (Eds.) Monolithic materials: preparation, properties and applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. V. 67. P. 19-50.

29. K. Dusek, In:Polumer networks: structure and mechanical properties (A. J. Chompff, S. Newman Eds). New York: Plenum Press. 1971. P. 245-260.

30. O. Okay, U. Akkan. Heterogeneities in polyacrylamide gels immersed in acetone-water mixtures. // Polym. Bull. 1998. V. 41. P. 363-370.

31. J. Urban, D. Moravcova, P. Jandera. A model of flow-through pore formation in methacrylate ester-based monolithic columns. // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1064-1073.

32. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet. Rigid Macroporous Polymer Monoliths. // Adv. Mater. 1999. V. 11.P. 1169-1181.

33. S. Xie, R. Alington, J. M. J. Frechet, F. Svec, in: Scheper T. {Ed.) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. 2002. V. 76. P. 87-125.

34. J. Courtois, E. By strom, K. Irgum. Novel monolithic materials using poly (ethylene glycol) as porogen for protein separation. // Polymer. 2006. V. 47. P. 2603-2611.

35. A. I. Cooper, C. D. Wood, A. B. Holmes. Synthesis of well-defined macroporous polymer monoliths by sol-gel polymerization in supercritical C02- H Ind. Eng. Chem. Res. 2000. V. 39. P. 4741-4744.

36. A. I. Cooper, A. B. Holmes. Synthesis of molded monolithic porous polymers using supercritical carbon dioxide as the porogenic solvent. // Adv. Matter. 1999. V. 11. P. 1270-1274.

37. A. K. Hebb, K. Senoo, A. I. Cooper. Synthesis of porous cross-linked polymer monoliths using 1,1,1,2-tetrafluoroethane (R134a) as the porogen. // Composites Sci. Tech. 2003. V. 63. P. 2379-2387.

38. J. Yin, G. Yang, H. Wang, Y. Chen. Macroporous polymer monoliths fabricated by using metal-organic coordination gel template. // Chem. Comm. 2007. P. 4614-4616.

39. Y. Shi, Y. Sun. Fabrication and Characterization of a Novel Biporous Spherical Adsorbent for Protein Chromatography. // Chromatographia. 2003. V. 57. P. 29-35.

40. J. Dai, Z. Bao, G. L. Baker, M. L. Bruening. High-Capacity Binding of Proteins by Poly(Acrylic Acid) Brushes and Their Derivatives. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 42744281.

41. I. N. Savina, B. Mattiasson, I. Y. Galaev. Graft polymerization of acrylic acid onto macroporous polyacrylamide gel (cryogel) initiated by potassium diperiodatocuprate. // Polymer. 2005. V. 46. P. 9596-9603.

42. K-F. Du, D. Yang, Y. Sun. Fabrication of high-permeability and high-capacity monolith for protein chromatogaphy. // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1163. P. 212-218.

43. E. G. Vlakh, Т. B. Tennikova. Preparation of methacrylate monoliths. // J. Sep. Sci. 2007. V. 30. P. 2801-2813.

44. M. Merhar, A. Podgornik, M. Barut, M. Zigon, A. Strancar. Methacrylate monoliths prepared from various hydrophobic and hydrophilic monomers Structural and chromatographic characteristics. II J. Sep. Sci. 2003. V. 26. P. 322-330.

45. A. Strancar, A. Podgornik, M. Barut, R. Necina, in: Scheper T. {Ed.) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. 2002. V. 76. P. 49-85.

46. B.Gu, J. M. Armenta, L. Lee. Preparation and evaluation of poly(polyethylene glycol methyl ether acrylate-co-polyethylene glycol diacrylate) monolith for protein analysis. II J. Chromatogr. A. V. 1079. P. 382-391.

47. Т. B. Tennikova, B. G. Belenkii, F. Svec. High-performance membrane chromatography. A novel method of protein separation. // J. Liq. Chromatogr. 1990. V. 13. P. 63-70.

48. O. Okay, M. Kurz, K. Lutz, W. Funke. Cyclization and Reduced Pendant Vinyl Group Reactivity during the Free-Radical Cross-Linking Polymerization of 1,4-Divinylbenzene. // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 2728-2737.

49. O. Okay, H. J. Naghash, I. Capek. Free-radical crosslinking copolymerization: effect of cyclization on diffusion-controlled termination at low conversion. // Polymer. 1995. V. 36. P. 2413-2419.

50. H. J. Naghash, O. Okay. Gel formation by chain-crosslinking photopolymerization of metyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. // Polymer. 1997. V. 38. P. 1187-1196.

51. А. Ю. Билибин. Функциональные свойства полимеров. СПб: СПбГУ, 1998. 136 с.

52. F. Baeuml, Т. Welsch. Improvement of the long-term stability of polyimide-coated fused-silica capillaries used in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. V. 961. P. 35-44.

53. A. Marushka, O. Kornysova. Continuous beds (monoliths): stationary phases for liquid chromatography formed using the hydrophobic interaction-based phase separation mechanism. // J. Biochem. Biophys. Meth. 2004. V. 59. P. 1-48.

54. J-L. Cabral, B. Dirk, C. D. Skinner. Pore size characterization of monolith for electrochromatography via atomic force microscopy in air and liquid phase. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1108. P. 83-89.

55. S. Brunauer, P. H. Emmett, E. Teller. Adsorption of Gases in Multimolecular Layers. II J. Am. Chem. Soc. 1938. V. 60. P. 309-319.

56. J. Urban, S. Eeltink, P. Jandera, P. J. Schoenmakers. Characterization of polymer-based monolithic capillary columns by inverse size-exclusion chromatography and mercury-intrusion porosimerty. И J. Chromatogr. A. 2008. V. 1182. P. 161-168.

57. M. R. Buchmeiser. Polymeric monolithic materials: Syntheses, properties, functionalization and applications. II Polymer. 2007. V. 48. P. 2187-2198.

58. L. G. Berruex, R, Freitag, Т. B. Tennikova. Comparison of antibody bindnig to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. II J. Pharm. Biomed. Anal 2000. V. 24. P. 95-104.

59. Q. Luo, H. Zou, Q. Zhang, X. Xiao, J. Ni. High-performance affinity chromatography with immobilization of protein A and L-histidine on molded monolith. // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 481-489.

60. R. Mallik, T. Jiang, D. S. Hage. High-performance affinity monolith chromatography: development and evaluation of human serum albumin columns. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 7013-7022.

61. T. Jiang, R. Mallik, D. S. Hage. Affinity monoliths for ultrafast immunoextraction. // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 2362-2372.

62. P. F. Ruhn, S. Garver, D. S. Hage. Development of dihydrazide-activated silica supports for high-performance affinity chromatography. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 669. P. 9-19.

63. H. Xuan, D. S. Hage. Immobilization of aracid glycoprotein for chromatographic studies of drug-protein binding. II Anal Biochem. 2005. V. 346. P. 300-310.

64. G. Mino, S. Kaizerman. A new method for the preparation of graft copolymers. Polymerization initiated by eerie ion redox systems. II J. Polym. Sci. 1958. V. 31. P. 242243.

65. T. Rohr, E. F. Hilder, J. J. Donovan, F. Svec, J. M. J. Frechet. Photografting and the Control of Surface Chemistry in Three-Dimensional Porous Polymer Monoliths. // Macromolecules. 2003. V. 36. P. 1677-1684.

66. V. Pucci, M. A. Raggi, F. Svec, J. M. J. Frechet. Monolithic colomns with a gradient of functionalities prepared via photoinitiated grafting for separations using capillary electrochromatography. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 779-788.

67. K.Kanamori, К. Nakanishi, Т. Hanada. Rigid Macroporous Poly(divinylbenzene) Monoliths with a Weil-Defined Bicontinuous Morfology Prepared by Living Radical Polymerization. // Adv. Mater. 2006. V. 18. P. 2407-2411.

68. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet, C. Viklund, K. Irgum. Control of Porous Properties and Surface Chemisrty in "Molded" Porous Polymer Monoliths Prepared by Polymerization in the Presence of TEMPO. // Macromolecules. 1999. V. 32. P. 63776379.

69. Я. Туркова. Аффинная хроматография, пер. с англ. М., Мир, 1980. 471 с.

70. И. Лефтковитс, Б. Пернис. Иммунология. Методы исследований, пер. с англ., М., Мир, 1983. 349 с.

71. А. Д. Мирзабеков, Д. В. Прокопенко, В. Р. Чечеткин. Применение матричных биочипов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине, в: Информационные медико-биологические технологии (В.А. Княжев, К.В. Судаков). М.: ГЕОТАР-МЕД, 2002. С. 166-198.

72. М. Nisnevitch, М. A. Firer. The Solid Phase in Affinity Chromatography: strategies for antibody attachment. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 49. P. 467-480.

73. G. Elia, M. Silacci, S. Scheurer, J. Scheuermann, D. Neri. Affinity-capture reagents for protein arrays. // Trends in Biotechnology. 2002. V. 20. P. 19-22.

74. F. Rusmini, Zh. Zhong. Protein Immobilization Strategies for protein biochips. // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 1775-1789.

75. Q. Xu, K. S. Lam. Protein and Chemical Microarrays-Powerful Tools for Proteomics. J. Biomedicine and Biotechnology. 2003. V. 5. P. 257-266.

76. R. F. Taylor. Protein Immobilization: Fundamentals and Application. New York: Marcel Dekker. 1991.

77. G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith. Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992.

78. M. Wilchek, T. Miron. Thirty years of affinity chromatography. React, and Funcsh. Polym. 1999. V. 41. P. 263-268.

79. Z. Bilkova, J. Churacek, Z. Kucerova, J. Turkova. Purification of anti-chimotrypsin antibodies for the preparation of a bioaffinity matrix with oriented chymotrypsin as immobilized ligand. J. Chromatogr. B. 1997. V. 689. P. 273-279.

80. О. Е. Galanina, М. Mecklenburg, N. Е. Nifantiev, G. V. Pazynina, N. V. Bovin. GlicoChip: multiarray for the study of carbohydrate-binding proteins. Lab Chip. 2003. V. 3. P. 260-265.

81. C. S. Lee, B. G. Kim. Improvement of protein stability in protein microarrays. Biotechnology letters. 2002 V. 24. P. 839-844.

82. J. Turkova. Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function. J. Chromatogr. 1999. V. 722. P. 11-31.

83. R. Frank. Spot-Synthesis: An Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support. // Tetrahedron. 1992. V. 48. P. 9217-9232.

84. S. P. Fodor, J. Leighton Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas. Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. // Science. 1991. V. 251. P. 767-773.

85. W. Kusnezov, T. Pulli, O. Witt, J. D. Hoheisel. Solid Supports for Protein Microarrays an Related Devices. In:Protein Microarrays. M. Schena, Ed. Jones and Barlett Publishers. Sudbury. 2005. P. 247-284. '

86. R. P. Ekins, R. Chu, E. Biggart. The development of microspot, multi-analyte radiometric immunoassay using dual fluorescentlabelled antibodies. // Anal. Clin. Acta. 1990. V. 227. P. 73-96.

87. R. P. Ekins, F. W. Chu. Multianalyte microspot immunoassay-microanalytical "compact disk" of the future. // Clin. Chem. 1991. V. 37. P. 1955-1967.

88. R. P. Ekins. Ligand assay: from electrophoresis to miniaturized microarrays. // Clin. Chem. 1998. V. 44. P. 2015-2030.

89. M. F. Templin, D. Stoll, M. Schrenk, P. C. Traub, C. F. Vohringer, Т. O. Joos. Protein microarray technology. // Trends in Biotechnology. 2002. V. 20. P. 160-166.

90. W. Kusnezow, Y. Syagailo, S. Ruffer, N. Baudenstiel, C. Gauer, J. D. Hoheisel, D. Wild, I. Goychuk. Optimal Design of Microarray Immunoassays to Compensate fo Kinetic Limitations. //Mol. Cel. Proteom. 2006. V. 5. P. 1681-1696.

91. W. Kusnezow, Y. Syagailo, S. Ruffer, K. Klenin, W. Sebald, J. D. Hoheisel, C. Gauer, I. Goychuk. Kinetics of antigen binding to antibody microspots: Strong limitations by mass transport to the surface. // Proteomics. 2006. V. 6. P. 794-803.

92. P. Schuck, A. P. Minton. Analysis of mass Transport-Limited Binding Kinetics in Evanescent Wave Biosensors. // Anal. Biochem. 1996. V. 240. P. 262-272.

93. В. Goldstein, D. Coombs, X. He, A. R. Pineda, C. Wofsy. The influence of transport on the kinetics of binding to surface receptors: application to cells and BLAcore. II J. Mol. Recogn. 1999. V. 12. P. 293-299.

94. W. Kuznezow, J. D. Hoheisel. Solid supports for microarray immunoassays. // J. Mol. Recogn. 2003. V. 16. P. 165-176.

95. G. MacBeath, S. L. Schreiber. Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination. // Science. 2000. V. 289. P. 1760-1763.

96. W. Shao, Z. Zhou, I. Laroche, H. Lu, Q. Zong, D. D. Patel, S. Kingsmore, S. P. Piccoli. Optimization of Rolling-Circle Amplified Protein Microarrays for Multipiexed Protein Profilling. И J. Biomedicine and Biotechnology. 2003. V. 5. P. 299-307.

97. В. B. Haab, M. J. Dunham, P. O. Brown. Protein microarray for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solution. // Genome Biology. 2001. V. 2. P. 0004.1-0004.13.

98. A. Sreekumar, M. K. Nyati, S. Varambally, T. R. Barrette, D. Ghosh, T. S. Lawrence, A. M. Chinnaiyan. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins. // Cancer Research. 2001. V. 15. P: 7585-7593.

99. S. Piletsky, E. Pletska, A. Bossi, N. Turner, A. Turner. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 82. P. 86-92.

100. H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, J. Schneider-Mergerier, U. Reineke. Coherent Membrane for Parallel Microsynthesis and Screening of Bioactive Peptides. // Biopolymers.2000. V. 55. P. 188-206.

101. JI. С. Гальбрайх. Целлюлоза и ее производные. // Соросовский образовательный журнал. 1996. V. 11. Р. 47-53.

102. М. Reck, F. Shtal, J. G. Walter, M. Hollas, D. Melzner, T. Scheper. Optimization of a Microarray Sandwich-ELISA adainst hINF-у on a Modified Nitrocellulose membrane. II Biotechnology Progress. 2007. V. 23 (6). P. 1498-1505.

103. D. Murtinco, A. R. Lagoa, F. A. P. Garcia, M. H. Gil. Cellulose derivatives membranes as supports for immobilization of enzymes. // Cellulose. V. 5. P. 299-308.

104. А. М. Колчинский, Д. А. Грядунов, Ю. П. Лысов, В. М. Михайлович, Т. В. Наседкина, А. Ю. Турыгин, А. Ю. Рубина, В. Е. Барский, А. С. Заседателев.

105. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. // Мол. Биол. 2004. Т. 38. С. 5-16.

106. А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, С. М. Иванов, Е. И. Дементьева, А. Д. Мирзабеков. Белковые микрочипы. II Доклады академии наук. 2001. Т. 5. С. 701704.

107. P. Arenkov, A. Kukhtin, A. Gemmell, S. Voloshchuk, V. Chupeeva, А. Mirzabekov. Protein Microchips: Use for Immunoassay and Enzymatic Reactions. // Anal. Biochem. 2000. V. 278. P. 123-131.

108. R. S. Yalow, S. A. Berson. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. // J. Clin. Investig. 1960. V. 39. P. 1157-1175.

109. Г. Фримель. Иммунологические методы, пер. с нем. М.: Медицина, 1987. 472 с.

110. П. С. Барбан, Р. А. Пшеничнов, А. Н. Пантюхина, И. Б. Ившина. Иммунофлуоресцентный анализ, Свердловск, 1988. 174 с.

111. L. A. Ernst, R. К. Gupta, R. В. Mujumdar, A. S. Waggoner. Cyanine dye labeling reagents for a sulfhydryl groups. Cytometry. 1989. V. 10. P. 3-10.

112. P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М: Мир, 1991.

113. J. Vidic, Ales Podgornik, Ales Strancar. Effect of the glass surface modification on the strength of methacrylate monolith attachment. // J. Chromatogr. A, 2005. V. 1065. P. 51-58.

114. Г. H. Химич, E. H. Рахматуллина, M. Ю. Слабоспицкая, Т. Б. Тенникова. Синтез и исследование поровой структуры полимерных монолитных сорбентов. // ЖПХ. 2005. Т. 78 (4). С. 623-628.

115. Т. А. Алфрей, Дж. Борер, Г. Марк. Сополимеризация. М: Издательство иностранной литературы, 1953. 266 с.

116. JI. Ф. Мерингова, Г. Ф. Леонтьева, Т. В. Гупалова, Т. Б. Тенникова, А. А. Тотолян. Выделение и исследование рекомбинантного IgG-связывающего рецептора стрептококка группы G с использованием макропористых дисков. // Биотехнология. 2000. Т. 4. С. 45-52.

117. С. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, Т. Tennikova. Fast Isolation of Protein Receptors from Streptococci G by Means of Macroporous Affinity Disks. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 65. P. 65-72.

118. К. Наканиси. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир, 1965.440 с.

119. P. Angenendt, J. Glokler, D. Murphy, H. Lehrach, D. J. Cahill. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials. // Anal. Biochem. 2002. V. 309. P. 253-260.

120. P.Angenendt, J. Glokler, J. Sobek, H. Lehrach, D. J. Cahill. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. II J. Chromatogr. A. 2003. V. 1009. P. 97-104.

121. S. Razzouk, J. C. Brunn, C. Qin, С. E. Туе, H. A. Goldberg, W. T. Butler. Osteopontin Posttranslatioanl Modications, Possibly Phosphorylation, Are Required for In Vitro Bone Resorption but Not Osteoblast Adhesion. // Bone. 2002. V. 30. P. 40-47.