Нуклеотидная последовательность генов, кодирующих субъединицы фотосинтетических реакционных центров бактерии Chloroflexus aurantiacus: , тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТКТУТ ШООРГАНЙЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.Ы.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи УДК 577.113.5,

ШЫуклер Борис Ефимович НУКДКОТЩЩАЯ ПОСЛЦДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ, КОДИРЭТЩИХ

субьедшщы «ютооштетичесши ркакционных центров

бактерии ошжоклгхиз АТОАКПАОиБ.

02.00.10. -• Биооргашческая химия, хгоше пртродацх и физиологична! иктнвкцх вещестЕ

Автореферат

диссертации .на соискание ученой степсам ■кандидата м'шческш: наук

ШСКВЛ-1990

Работа выполнена в Институте биоорганической химии мм. М.М.Шемякина Академии наук СССР.

Научный руководитель: доктор химических наук Н.Г.АБДУЛАЕВ

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Ю. А. БЕРЛИН кандидат химических наук М. А. ЗЛЬДАРОВ

Ведущая организация - Мезкфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и био-органичеокой химли им.А.Н.Белозерского МГУ гол.М.В.Ломоносова.

Защита состоится 2- коЯ^к 1990г. в ¿0 час. на заседании специализированного совета Д 002 35 01 по защите диссертаций на соискание'ученой степени.доктора наук при Институте биоорга-ничосхой хямии км. М. М. Шемякина Академии наук СССР по адресу: 117871 ГСП - 7, Москва, В-437, уд. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оиооргагшчеокой химии к»;. М.М.Шемякина Академии наук СССР.

Автореферат разослан о-иУГДсрЯ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

А.НЕСМЕЯНОВ

Актуальность проблемы. Фотосинтез является основным природным процессом, утилизирующим энергию солнечного света. Ключевым этапом фотосинтеза является разделение зарядов на специализированных фотосинтетичееких мембранах бактерий и хлоропластов растений при поглощении кванта света. Этот процесс происходит в хлорофилл-белковых интегральных мембранных комплексах, называемых реакционными центрами ( РЦ ). Успешная кристаллизация и расшифровка третичной структуры РЦ пурпурных бактерий расширяет возможности структурно-функциональных исследований БЦ высших растений и* фотосинтезирующих бактерий, поэтому возрастает актуальность исследований молекулярной природа фотосинтетического аппарата методами молекулярной биологии и химии белка.

Термофильная нитчатая скользящая бактерия Chlorofle.zua auronttacua, как свидетельствует каталог I6S рРНК, представляет собой одну из древнейших ветвей; эволюции эубактерг* и обладает рядом уникальных свойств. Строение фо то синт a m ■ э с •. -о -го аппарата этой бактерии сочетает в себе черты таких ' эволю-ционно далеких груш:, как зеленые серные {Chlcroblaceae) и пурпурные (Bhodosplrillaceae, Chromatiaceoe) бактерии. С зелеными бактериями С. auront 1асиз сблия'ает пигментный состав и организация светособирадщего комплекса в виде хлоросом. В то ке время, по спектральным характеристикам РЦ С. aurait locus имеет сходство с РЦ пурпурных бактерий и фотосистем.! II (([ОН ) эдсшях растений. Очевидно, что расшифровка первичной структуры белков комплекса РЦ О. aurantùîcus предсгааяяет существенный интерес*, тем более, что в отлично от уже изученных РЦ пурпурных бактерий, РЦ С. aurontlacm состоит не из грех, а лить из двух субъединиц и является наиболее просто устроенным РЦ из известных в настоящее время. Исследование структуры РЦ С. auront locus и других фотосинтезтгруэдих бактерий является важным подходом для изучения как молекулярных механизмов, так и эволюции фотосинтеза.

Цель работы. Данная работа является частью исследований, проводимых в лаборатории белков светочувствительных систем Института биоорга! .гчесгой химии АН СССР, по установлению пер-, вичной структуры субъединзд реакционного центра С.curant locus и кодирующих их генов. :

Научная новизна и практическая ценность работы. Установлены первичные структуры генов, кодирующих 1- и Ы-субъеданицы РЦ С. awantiacus. На их основе выведены полные аминокислотные последовательности. Анализ нуклеотидных последовательностей, фланкирующих данные гены, показал, что они составляют бицистронпый оперой (у пурпурных бактерий аналогичные оперо-ны, названные puf, являются полицистронкыми). Таким образом, определена полная нуклеотидная последовательность pu/-оперона С. auront tacua.

Знание первичной структуры РЦ С. auront1аапэ является необходимым условием для изучения его пространственной организации методами рентгеноструктурного анализа и для дальнейших работ ло изучению молекулярных механизмов функционирования РЦ методами направленного мутагенеза.

Аппробацчя работы и публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи. Результаты исследований докладывались на V Совотско-Шве'йцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" '''Рига, 1988); на V Международной конференции молодых ученых социалистических стран (Пущино, .1988), на симпозиуме по молекулярной биологии мембранных комплексов в фотосинтетических бактериях (Фрайбург, ФРГ, 198Э).

Объем работы. Диссертация изложена на /2 î/стрэницах машинописного тэкста и состоит из введения/обзора литературы, обсуждения результатов, эксперимента^ной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего/3 У ссылок. Работа содеркиг/л^ц. 3 Ta6jIII4- в обзоре литературы рассмотрены вопросы клонирования, молекулярной организации и регуляции генов, входящих в ри/-опероны пурпурных несерных фотосинтезирую-идх бактерий.

. СОДЕРЖАНИЕ"РАБОТЫ.

1. Выделение геномной ДНК ив С.awant 1асиэ.

Известно много модифицированных методов выделения бактериальной геномной ДНК. Большинство из них основано на разрушении клоточных стенок при помощи протеиназ с последующей обработкой лизированной клеточной массы фенолом и дальнейшим

осаждением нуклеиновых кислот этанолом. Полученный таким образом препарат жбо обрабатывают РНК.чзой с последующим лерз-осввдением ДНК, ¿ибо центрифугируют в градиенте плотности ,СэС1 с дальнейшим диализом.

Нам удалосъ существенно упростить и ускорить процедуру выделения бактериальной геномной ДНК С. аигаМ1асиз. Было обнаружено, что клетки С. аигапХЬасиз лизируются после обработки стандартным буфером для выделения плазмидной ДНК ( 50 тИ глюкозы, 25 тМ трис-НС1, рН 8.0, 10 тМ ЭДТА и 6 мг/мл лизоцима) и последующей инкубации в растворе, содержащим 150 тМ N301, 100 тМ трис-НС1, рН 8.0, 50 пЖ ЭДТА и 0.5% ДСН. После сфа-йотки полученного лазата посладовательно фенолом, смесью фенол-хлороформ (1:1) и хлороформом к воднол фазе добавляли двойной объем этанола и образовавшуюся "медузу" быстро тет:е-носили в чистую пробирку. Такая операция дает возможность избирательно осадить геномную ДНК., в то время как основная масса РНК оставалась в супернатанте. Это позволило откаяатюя от стадии обработки суммы осажденных нуклеиновых кислот К£С-азой. Удаленна этой стадии, на наш взгляд, дзет дополнительные гарантии качества конечного препарата, потому что после обработки РНКазой необходимо повторно проводить обработку фенолом-хлороформом и первосакдение ДИК, что монет отразиться на целостности получаемой бактериальной геномной ДНК.

Полученный препарат геномной ДНК С. аигапИапиг, по данным электрофореза в 0,455 агврозном геле, имел подвижность не больяе,' чем *нтактная ДНК фага Л,*,'.то есть состоял из фрагментов ДНК размером не менее РО ООО пар ссксваний.

2. Получение геномных оибляоа'ек'из ДНК С. аигспИасиз.

К настоящему времени разработаны разнообразные метода клонирования бактериальной геномной ДНК. Наиболее часто используются следующие подхода: 1) расщепление ДНК р&зтриктааамп, разделение растриктннх фрагментов в агарознсм геле и перенос их на нитроцеллюлозу или найлон, ~блог-п;бридизация с меченными олигонуклгогвдрнми етли ник-транслированными зондами, вырезание и целенаправленное клонирование и субгслонировение гиб-р*1,5гзукщтсзя фрагментов ДШ для последующего секвениров^ния;

2) статистическое расщепление геномной ДНК выбранной рестриктазой, выделение фракции расщепленной ДНК определенного размера и клонирование либо в фаговом, либо в плазмидном векторе, дальнейшие скрининг, блот-гибридизационный анализ, суб-клонироЕание и секвенирование отобрьнных фрагментов; 3) тонирование сравнительно небольших фрагментов геномной ДИК в серийные наборы вкспрессирукэдих векторов для проведения дальнейшего иммуноскрижтага и секвенкреваник.

Б данной работе был использован метод, использующий отдельные элементы описанных подходов. Получение геномной библиотеки из ДНК С. aurontiacus было основано на частичном^ гидролизе геномной ДНК рестриктазой с четырехнуклеотидным сайтом узнавания. Теоретическая вероятность встречаемости таких мест в геноме составляет 1/44 = 1/25G, то есть один сайт узнавания на 256 пар оснований, а практически сайты могут встречаться как с большей, так и о меньшей частотой. Так как сайт узнавания выбранной ре'Втриктазы может на определенном коротком участке генома встретиться слишком часто, было решено сконструировать параллельно две геномные библиотеки на основе одного и того же принципа, но используя различные рестриктазы.

Для получения первой библиотеки (Рис.1) геномная ДНК С. auronttacua подвергалась частичному гидролизу рестриктазой Sau ЗА I. Условия расщепления подбирались таким образом, чтобы основная масса образующейся статистически расщепленной ДНК приходилась на фрагменты дшшой от 1 ООО до 5 ООО пар оснований. Мшлшалькая длина фрагментов составила около 300 пар оснований, максимальная - до 1С ООО пар оснований. Во избежание артефактов лигирования в виде образования сшитых между собой фрагментов был применен ранее описанный прием (Забаров-ский и др., 1985)i. Липкие концы фрагментов, полученные после обработки'Геномной ДНК рестриктазой Sau ЗА I, подвергались частичной достройке при помощи dGTP, йАТР и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Аналогичным образом, при помощи dCTP и dTTP подвергались частичной достройке липкие концы векторной ДНК -плазмида pUC 8, предварительно линеаризованной рестриктазой Sal 01. В результате векторная ДНК тэряла способность к ре-цирку лг.ризации, фрагменты ДНК - к лигированию.между собой, а полученные укороченные липкие концы вектора и клонируемых

Геяоюшя ДНК

С. аигагИасиэ

Частичное расщепление ретриктвзоЗ Баи ЗА

САТС-

:СТАС САТС-

-СТАС

Частичная достройка липких концов: + фрагмент Кленова

+ йСТР, (1АТР

-СТАС

-АС 6А-

СА-

-АС

-АС

рисе)

Векторная ДНК

Расщепление рестриктозой Ба1 И

ТССА-

Частичная достройка липких концов: + фрагмент Кленопэ

+ <ЗТТР, йСТР

=АССТ

ТС-

-СТ

Датирование: + Т4 ДНК-лигаза

I Трансформация Е.соИ, + "Дтанм МН-1 30000 рекоибЕнантныгс клонов

I

Ме1-РЬе-А1о-С2п-Уа1-Аэп- Туг- ь Гибридизация с Р-ыэчекнш 3' -ТАС-ААС-СС^-СТ1-СА^-ТТС-АТ-5' | олигонуклеотш^лш зондом 1а

42 позитивных сигнала гибридизации

Ме^РЬе-А1а-С1п~Уа1-АБП-Туг- Гибрпцизацяя с 32Р-ыече:шыи 5' - АТС-ТТТ-СССАС-СА^-ААТ -ТА-3' олигонутшеоп.дшш зондом 16

2 позитивных сигналя гибридизации: клоны рйС а9 и рЕС С10

Рис I. Схема конструирования к скрининга первой геномной библиотеки.

Я0~

НО-

Геномная ДЧК

С. auront locus

Частичное расцепление ретриктазой Alu I

ОН

pucel

Векторная ДНК

-Р

ОН р_ -Р НО"

ОН -Р

Р_ НО"

Расщепление рестриктазой Sraa I

____ОН

-р

но_

НО"

Датирование: + Т4 ДНК-лигаза

Дефосфорилирование: + щелочная фосфотаза Е.col i

ОН

"ОН

I Трансформация E.coll, I штамм MH-I 30000 рекомбинантных клонов

-Ile-Glu-Glu-Ile-Glu-Pro I Гибридизация с 32Р-ыеченным 3'-TA^-CTT-CTT-TAj-CTT-GG-5' I олкгонуклеотидным зондом 2а

5 позитивных сигналов гибридизации

I Гибридизация с ^2Р-иеченной I вставкой из клена pRC а9

1 позитивный сигнал гибридизации: клон pRC II-9

Рис £. Схема конструирования и скрининга второй геномной библиотеки.

фрагментов становились комплементарны друг другу. После дотирования вектора и фрагментов в отношении 10:1 ''была получена первая библиотеки в виде химерных плазмид. -Son нерексмбинант-ных клонов не превышал 2%. а

Вторая геномная библиотека (Ряс.2) была получена датированием плазмида рис 8, расщепленной рестриктазой Sma I и де-фосфорилированной бактериальной щелочной фосфатазсй, и фрагментов, образующихся при частичном гидролиза ДНК С. auront I-асиз эндонуклеазой рестрикции Alu I. Длина клонируемых фрагментов составляла, как и б первом случае, от 300 до 10000 пар оснований. Фон нерекомЗилантмых клонов составил около 9%.

3. Выбор последовательностей для сзнтеза олигонуклеотидных зондов.

Выбор последовательностей для синтеза олигонуклеотидных зондов является важной проблемой клонирования, обус;;ов."еттой вырожденностью генетического кода. Исследователи обычно стремятся уменьсигь вырс.здояность много вариантных зондов, чтобы повысить специфичность гибридизации. Для этого используют такие приемы как: 1) синтез групп зондов с меньшей вырозденнос-тью и проведениэ гибридизации с какдсй из этих групп - наиболее широко распространенный подход: 2) синтез единств"иной ожгонуклеотидной цепи г; использованием частоты встречаемости кодояов - этот вариант возможен в том случае, если для данной ' ткана данного организма ранее утю-lбили изучена белки ч соот-. ветстЕукЕДО*йм гены (bathe и др.,1985}; 3) синтез полной смеси олигонуклеотидов и последущее ргздэленле смеси на Оракцки хроматографическими иетодьми (Штрухин и др., 1965): 4) синтез во всех местах неоднозначной обратной трансляции инозина (I), который способен взаимодействовать с любым нуклеотидом (Takatoshi и др., 1985).

Нами был использовав подход, ociioi энный на гостулати из гипотезы неоднозначного соответствия. Этот постулат гласит, что в дополнение к обычному взаимод-йстнию нуклеотидов разро-шв'ю образование г эр дт-.-вду G и 'ЦТ) (Яыоин, 1387). При образовании G/T-пары возникает комплементарное взаимодействие по тилу I/N, где I - инозин, а N - любой другой ную.еотид, Ранее

было показано, что инозин ведет себя как инертное основание, которое ки дестабилизирует, ни укрепляет структуру дуплекса ДНК (Oïitsuka и др., 1985). Из схожести механизма образования неканонической пары G/T и пари I/N следует, что хотя пара G/T и не вносит вклад в прочность комплементарного связывгпия олигонунлеотидного зонда с соответствующей ему структурой ДНК, но и ле шляется помехой для гибрида;зяции. ,

Исходя из вышеизложенного, синтез зондов осуществлялся следующим образом: если в кодирующем триплете аминокислот в третьем положении находится А или G, то в зонде синтезируется G; если С или Т, - то Т; если в третьем положении может находиться любой из четырех нуклеотидов, - то G+T. В отличие от инозиеового метода, при удачном стечении обстоятельств вместо G/T-nap образуются нормальные G/C- или А/Т-пары, что увеличивает специфичность гибридизации. При использовании такого подхода G/T-парн^могут образовываться только в тех местах, где олигонуклэотйдный зонд попадает На вырожденные третьи позиции в кодирующих т^шлзтах. У наиболее часто используемых в практической работе 14-20-звенных зондов может образоваться до 4-6 G/T-nap. Однако, если к такому "неудачному" зонду синтезировать по вышеописгшому принципу комплементарный слиго-нуклеотидный зонд, то ■ последовательность последнего будет предельно Слизка к структуре искомого фрагмента ДНК. В наиболее вероятном усредненном варианте^'бу^т иметься по 2-3 несоответствия с искомой структурой в виде G/T-nap (у каждого из зондов).

Параллельно с работой по созданию геномных библиотек в лаборатории велись исследования полипептидов РЦ С. aurontia-cus. Проведенная с препаратом апобелка РЦ работа привела к выводу, что РЦ С.auront(асиз организован в виде двух субъединиц с стноеительн11ми~молекулярными массами 28 кДа и 32 кДа. Расщеплешь препарата РЦ бромцианом, протеиназой из St. aure-us и трипсином позволило выделить свыше 50 индивидуальных пептидов. Для 33 из них были установлены частичные иди полные аминокислотные последовательности.

Наиболее подходящими для синтеза олигонуклеотидных зондов оказались N-конец бромцианового пептида (U)PAQVNY... и фрагмент пептида трипсинового гидролиза ...IEEIEP... .

На основании этих структур и вышеприведенных рассуждений были синтезированы (к.х.н. Еыстров Н.С.) следующие комплементарные зонды:

1а) зонд, комплементарный мРНК: Б'-ТАСТТ^АСТТСцОССААСАТ-З1, 10) зонд, гомологичный мРНК: 5'-atgtttgcjcaggtjaatta-3'.

2а) зонд, комплементарный мРНК: 51-GGTTG^ATTTCTTC^AT-З1, ' 26) зонд, гомологичный мРНК: 5'-AT^GAGGAGAT^GAGGO-З*.

4. Поиск фрагментов генов I- и М-субъедиюгл РЦ О .entrant locus.

Поело трансформации E.coli (штамм Ш-1) химерными плазми-

дами из первой геномной библиотеки было получено около 30 ООО

ор

рвкомбинантквх клонов. В результате скрюинга при помост ' Р-

меченного олигонуклеотидного зонда )а (метка вгэдилась в ож-

гонуклеотидкае зонд;; при помощи полинуклеотидкшазы фага Т4 и Ър

[7- РЗАТР' ) было отобрано 42 к*лона, девавших положительные сигналы гибридизации различной интенсивности. Эти клоны далее гиСридгаювали чз Р-ме\<энным зондом 16. 3 рэзультато Шло получено только да«-; положительных сигнала гибридизации (Рте.1). Соответствуэдие- ем клона были названы pRC а9 и pRC G10. . Нук-леотидные последовательности клонированных в зтих. плазмидах вставок определялись по методу Мтсамэ-Гилберта в твердофазном наряжу, разработанном Чувтьло и Кравченко (Chuypilo и' др., 1984). '

Стратегия определения нуклеотидной последовательности ¡фодставлена на рис.3. После расщепления плазм (^чой ДНК• соответствующей рестриктазой мотка вюдалаоь в рестрикткые фрагменте двумя методами: в случае Б'-выступающих концов фрагментов - при помощи соответствующего Li-32P]dNTP -и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. cnll, а в случае 3'-выступающие концов (образующихся,-кзггоимер, после расщепления ДНК рост ргктазами JCpn I и Нае TI) - при помощи [a-o2F]dddTP и терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (в составе кита фирмы "¿mersham" для введения мотки в 3'-концы). Далее моченное по двум концам фрагменты ДНК расщеплялись одной или несколькими

FF 2a,О A TT TT E ИХ I la,б V KFK A

il s i il W l U 4 - 4 UJ I

P-* L--* И *

•«400 п.о.»

рИС а9

1

——I

pRC Ml

pRC H4 pRC II-9

L.

, pRC 112

pRC A5

pRC G10

Рис. 3. Организация ри/-оперона С. aurontlacua и стратегия определения его нуклеотидной последовательности. Показано расположение клонированных фрагментов yi указаны рестриктные сайты, использований о для секвэннрования' по методу Максама-Гилберта. Обозначения: А - Avail; Е - Haell; F - Hinil; H - HindiII; К - Kpnl; T - TaqI; V - Aval; X - Xbal; P ~> - промотор pujf-оперона; L-», M-»- - гены субъединиц РЦ; 1a,б и 2а,0 - места расположения слиго-нуклеотидных зондов. Длина стрелок ( ' >-». ) соответствует участкам ДНК, по которым выведена структура рцГ-опврона.

I I

с

подходящими ростриктазами для получения гомогенно меченных укорочешшх фрагментов, которые после этого разделялись электрофорезом в б-8% ПААГ. В некоторых случаях вместо дополнительного расщепления ростриктазами использовалась процедура разделения комплементарных ценой моченных с двух концов фрагментов. Выделонныо после элюции из ПАЛГ гомогенно мечопше одно или двухцепочечные фрагменты непосредственно использовались для определения их нуклеотидних последовательностей.

Длина большей вставки (из клона pRCa9) составила 1178 пар оснований. Анализ установленной нуклеотидной последовательности г.озволил выгести доя частичные аминокислотные последовательности. Их сравнение с первичными структурами L- и М-субъединиц РЦ трех видов пурпургах бактерий и сопоставление с уже определенными аминокислотными последовательностями пептидов РЦ С. aurait lacus показали, что установлены пэрЕичнне структуры большей части одной из субъодшшц (середина и С-концевая область) и приблизительно 1/3 второй субъедишщы РЦ С.auront locus (N-концевая область). N-концевзя структура второй субъедишщы отличалась от последовательности, определенной ранее автоматической деградацией апоСелка по методу Здма-на, когда была выявила единственная аминокислотная цепочка: SRAKAKDPRFPDPSFTW. Этот факт подтвердил сделанный ранее вывод о том, что N-конец второй субъедигащы блокирован.

Далее был проведен поиск участка ДНК, кодирующего недостающую N-концевую область первой субъединицц. Р-моченкый. оли-гонуклеотидпый зонд 2а был использован для скрининга 30 ООО рекомбинантаых клонов, полученных трансформацией клеток Л.colt (штамм МН-1) химерными плазмэдами из второй библиотеки. Было найдено 5 клонов, гибридизовагааихся с. этим зондом. С зондом 26 ни один из этих клонов не гибридисовслся. Один из этих пяти клонов, названный pRC II-9, бил отобран гибридизацией с 32Р-меченной ник-транслированной вставкой из клона pRC а9. Было найдено, что стлазмида из клоиэ pRC II-9 несет вставку длиной 593 пары оснований. Определение и анализ нуклеотидной последовательности этой-вставки показали, что в клонированном фрагменте 450 пар оснований кодируют часть структурного гена первой субъедишщы (N-концовая область), а 143 nnp;i оснований принадлежат области, фланкирующей 5'-конец первого гена.

Для поиска участков ДНК, кодирующих недостающую С-конце-вую область второй субъединицы РЦ С. auront1асиэ, проводили скрининг 20 000 новых трансформантов из первой библиотеки при помощи 32Р-меченного олигонуклеотидного зонда 16, в котором структура одной из цепей четырехкомпонентной смеси полностью совпала с последовательностью, кодирующей положенный в основу зсндов 1а,б пептид. В результате был получен единственный клон pRC А5, содержащий фрагмент ДНК длиной 423 пары оснований, кодирующий центральную часть гена второй субъединицы (Рис. 3). Вставка из.этого клона была выделена, ник-трансли-ровака радиоактивным 1а-^2р]йАГР и использовалась для скрининга еще 30 ООО рекомбинантных клонов из этой же библиотеки. Было выявлено 7 гибрадизующихся клонов, из которых два, рНСМ1 и pRC М2, содержащие наибольшие вставки, были использованы для определения яуклэотидной последовательности (Рис. 3). В результате была .определена нухлеотвдная последовательность, кодирующая С-концевую область второй субъединицы, а также еще 302 пары оснований пос/гэ. терминирующего кодона этой субъединицы.

Тёким образом, были установлены первичные,структуры генов, кодирующих две субъздиницн РЦ С. auronttacus. Длина первого гена составила 936 пар .оснований (вместе с инициирующим и терминирующим кодонами), длина второго - 924 пары оснований. При выведении полных аминокислотный последовательностей обеих субъединиц учитывались данные, полученные методами белковой химии (Рис. А). Во-первых, данные С-концевого анализа, полученные методом гидразинолиза на препарате апобелка РЦ С. аиг-antiacua, указывают на отсутствие посттрансляционной модификации полипептидных цепей РЦ, так как были идентифицированы два G-концевых аминокислотных остатка - валкн и продан, которые совпадают с С-кОнцевыми амийокислотами, выведенными по структуре генов. Во-вторых, было выяснено, что у обеих субъединиц соответствующие ATG-инициируэдим кодонам формилметио-нины подвергаются посттрансляционному удалению, причем, если у первой субъединицы N-конец остается открытым (см. выше), то N-конец второй субъединицы блокируется группой с невыясненной структурой и молекулярным весом около 60 Дальтон. Окончательно нами было установлено, что длина полипептидной цепи, соот-

ветствугацей первому гену, составляет 310 аминокислотных остатков, а второй - 306. Правильность выведанных аминокислотных последовательностей подтверждается ранее определенной структурой ряда пептидов (Рис. 4). Работа с апоСежом РЦ и полученными из него пептидами проводили« сотрудники нашего Института Заргаров A.A., Кутузов М.А., Тележинская И.Н., Ле-ишэ Н.Б. и Золотарев А.О.

По аналогии с РЦ пурпурных бактерий, две субъединицн РЦ С. aurontlacua были нами обозначены как L- (первая) и М-субъ-единицы (вторая), хотя в дашом случае вычисленный молекулярный вес L-субъединицы (light) РЦ О.auront locus (35014 Д) оказался несколько выше, чем у М-субьедшшци (medium) (34 922Д).

5. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей.

В результате определении нуклеотидной последовательности было подтверждено, что РЦ С. aurontíacua состоит из двух различных субъединиц, которые кодируются двумя последезательно расположенными генами (Рис. 3, 4).

Гены L- и М-субъединиц РЦ О. auront tacna начинаются с AXG-инищшрующих кодонов, которым предшествуют последовательности Шайн-Далгарно (Рис. 4), причем расстояние между последними ATG-кодонами составило, соответственно, 5 и 9 пар оснований, что хорошо коррелирует с усредненной формулой сайта связывания рибосомы (A/C)GGAG(A/G)N3_10ATG. G+C-состав обоих генов оказался одинаковым - 54.4%, что сравнимо с G+C-составом хромосомной ДНК С. aurontlacua. Исследование частот использования кодонов в генах "L" и "М" показывает, что преимущественно используются кодош, содержащие а третьем положении G или О (соответственно, 66.6% и 69.0%) (Рис. 5), однако для термофильной бактерии G. au-antlacu3 эти показатели можно назвать неожиданно низкими, так как в генах L-. и М-субъеди:щц РЦ мо-зофильных фотосинтезируицих бактерий из рода Hhcdosplrilla-ceae содержание кодонов с G или С в третьем положении достигает 89%.

На расстоянии 119 и 142 пары оснований от инициирующего ATG-кодона L-субъединицы обнаружены последовательности ТАТАСТ

1 agctaacagatcggcccggttgtagttg

29 aggataagaagggcaagacractca'mtcgagatgccgggtctgcactggtagacaàco 89 ctggttcagtataccacagctîatîcttgtïttatatggaagaagcgaatggtaatcgat 149 tagacgtttgqaaaato^atttaagggttcata-atgoaaaattaaatatcgatacctata

' '09. gctogaoaaiv^tgtatcaggcgtattatactggccgaaaaggcggtaaaattttgcttat

209 CATTACACCrTAïCCr.A(?rCAGGGCAACCGTAAGGCGCGATGTGAGAACûGTCGOCGCGC

329 aoaccgtcagc^GAGCGAGTCGCTATGAGCAGAGCAMAGCGUAGACCCCCGTTTTCCC

1 ~ (K) S R Л- К А К D P R F P

389 GACTTTTCGTTCACCGTCGÏÏGAGGGTGCGCGGGCCACACGAGTACCGGGAGGGCGGACG ' D F S F T 7 V E G A__R A T R 7 P G G R T

449 ATl'GAAGAAArCGAGCCGGAATACAAGATCAAAGGGGGCAGAACCTTTAGTGCGATCTTC

32 TEEIEPEYK 1 К G R T T F S A I F

509 CGTTACGATClCCTTTGAr^CTGGGTAGGGCCGTTCTACGTTGGCmTGGGGCTTTGTC

52 Jî YDFFDFÏÏVGPFY7 G FWG F V

569 TCGGTCATCGGGAÏCATCTTOGGTTCGTATTTCTACATCAACGAGAUAATCCTCAAAGGT

72 S V I G I'IFGSY FY 1 N ETI LR

(529 CCCTAraCAA'CACCGCAAAACTTOmGCCGGACGAAT'rGATCCCCCGCC.ACCCGAACTT

92P Y S I F Q N F F_A__G_R I D P F P P F. h

689 GGGTrGGGGTTTGCCGCACCCGGÏGMCCGGGCTTTGCCTGGCAGATGACCGTCCTCTM

112 G L G F A A ? G E F G F A W Q M T 7 L F

T49 GCGACGArrCCTTTCTTCGGCTGGATGATGCGCCAGGTCGATATTAGTATGAAGCTCCAT

132 A T I A F F G »v if Ы RQVDISVKLD

809 ATGGGCrATCACGTTCCGATTGCATTCGCKKlTCCA.TTTTCGGCCTGGTTAGTCCTCCAG

152MGYHVPIAFGY AFSAV/LVLQ

869 nmTTCGCCCGATAGCCCTCGG^AIGTGGCACGAAGGCTTCGTGCTCGGCAÏTATGCCC

172 V I . R P 1 A l G U W Я E G F V L G T M P

929 CACCTCGAlTGGGTGTCGAATTTTGGCTATCGCTACAATAATraCTTCTACAATCCGTTC

192 E LDÏÏVSNFGYR Y NTfFF Y N P F

989 CAGGGX'ATCGGCATGACGGGACTGTTCGCATCAACCTGGCTGCTGGCCTGCCACCGCTCG

212 H AIGITGIFASTW LLAGH G S

1049 CTCAT^CTCAGCCiTCCGCAGTACCGTGGCCCGGAAGGTGGCGATATTGAGMCGTCTTC

232 L I Ъ S A A Q Y R G PEGGDIENVF

И 09 TTCCGTGACGTGCAGÏADTATTCAGTGGGCGAGTCGGGTGTGCACCGATTAGGGTACATC

252 F R 1) V Q Y Y S Y G E S G 7HRLGYZ

1 169 TTCGCGATTGGCGGCATCCTGTGGGCTGATGTGTGGAT'ÎTTGCTGTCGGGCTGGCCGGTG

272 F A IGGILSJDLCILISGWPT

1229 CAGGAK'GGGTMGCTTCTGGAA'm.'CTGGAATAATCTGCCCTTGTGGAGCGGCGTCTAG

292 QDW VSFW.NFÏÏiïîfLPFWSGV***

1289 agaggagcacactggt AÏGGCGACAATCAATATGACGCCGGGCGATCTGGAACTGGGT

1 (M) A ï 1 N M T P G D L E L G

1347 CGTGATCGCGGTCGGATCGGAAAAGCAATTGAGATTGGGOTCCTGGAAAAGTTCGGGTTC

14 R ü R G R I G К P I E I P L L E N F G F

1 407 GiTAGGCAGCTCGGCGCGTTCTATCTCGGGTTTTGGAA.CGCAGTGGCTTACATCACCGGr

34 DSQLGPF Y LGFWNA VAYITG

1467 GGWTCrrTACCTTTATCTGGCrGATGGTGATGnTGCTCAGGTGAATTACAATCCGGTG

54GIFT F1Y/LUVH F A Q V N Y N P V

1527 GCCTTTGOCAAGrACTTIGTGGTCTTGCAAATCCATCCGCCGrCATCACGCTATGGCCTG

74AFAKYFVVLQIDPFSSR Г G I.

15Q7 AGCTTrCGGCCGCTGAATGAGGGTGGATGGTGGCTCATCGCGA.CCTTCTTCCTOACCGTC

94 SFPPLNEG G !У Yi I, I- A T F F L T V

1C47 TCGATC1TCGCGTGGTATATGCACATCTATACCCGCGCCAAGGCGCTCGGGATTAAGCCC.

114 S I F A Yi Y M H I Y T Я A К A L G T К P

1707 TACCTGGCTTACGGCTTCACCGGTGCGATTGCGCTCÏACGÏGGTGATGTATATCA'raCGT

134 Y L A Y GFT G AIALY h VIYIIR

1767 CCGGTGTGGATGGGTGArrCGTCGGAAGCGCCGGCCCACGGCATCAAAGCGCTGCTCGAC 154 P V Yi U G DWSZAPA H G I К A L I D

1827 TGGACGAATAATGTGAGCGTGCGTTACGGCAArrTCTACTACAATCCGTTCCACATGCTC

174 If- T П N V S Ч К Y G N F Y Y N P F H M L__ '

1887 TCGATCTTGlTCTTCCÏCGGATCAAOGTTGTTGCTGGGGATGCAGGCCGGTACCAnTGG

194 S I F F L L G S T L L L A U H A G T I ïï

1947 GCACTCGAAAAGTACGCTGCCCACGAGGAATGGAATGAGATTCAGGCTCCCGCTACCGGT

214 A L E К Y A A H E F, ïï N E I Q A P G T G

¿00T ACCGACCGTGCTCAGCTCÏTGTGGCGCTGGTGCATGGGCTTTAACGCGAATGCGTACTCG

234 J'_? R A Q L F Y/ R Y/ 0 M G F N A N A Y S

2067 ATCCACCTGTGGGCATTCTGGTTCGCCTGGTTGTGCGGTATTACCGGTGCATTCGGTGTC

254 1 H L W A F ff F A Yi L С G I T G A L G У

2127 TTCTTCTCAATGCCCGATTTTGTCMTAACTGGTXCCAATGGGGTATTGAAGCCGGCATC 274 F F S M P D F - V N N fY F Q W G I E AGI

2187 AACTATCCGCAAGGTCCUCGCCACGGGTTECAGXGCCGTAGCGTTCGTGACACTTCTCT 294 HYPQ GPTPP V S L P ***

2247 ACCTTCCTCCCGGCCTOTCGCGCGTCATCAjACGGGCGACAGGTTGTTTATTGCACGGGG <------.----->««*/,*****

2307 AGAGGTGACTATCTGAAGACTGGTGTATCAAATCTGGCTTCATAAOAGTCATTGCACGCG 2367 GOTTGAGGTGTGGCACCGGCGGGTCGGTGGCTTGTTG'rCGGTGGGGGCGTAGGGGCACG

2427 GCATGCCGTGCCCGTACGGCICCTGTCGTACCAGTAGAGAC3ACGCATGCGTCGCCCGTA

2487 CCAGCGïCCAGCGGTGAATTGTGTAGGTGGTGCATCAGGGGGATC 2531

Рис.4. Нуклеотидная последовательность puf-оперена G. auront l-аспз и выведенные аминокислотные последовательности L- и М-субъ-единиц РЦ. Обозначены: а) промоторше участки -35 и -10; последовательности Шайн-Далгарно - подчеркнуты- и выделены жирным шрифтом; б) сигнал р-независимой тормилацш транскрипции - подчеркнут стрелками и звездочками; в) другие инвертированные повторы - подчеркнуты стрелками; г) подчеркнуты пептидные последовательности, опредо-лонлые методами белковой химии.

и TTGACA, которые хорошо совпадают с известными каноническими последовательностями прокариотических промоторных• областей

-10 И -35: T80A35t45A60A50rr9G и T82T84G78AG5C54a45• Это дало основания полагать, <jjo участок генома, прилегающий к 5'-концу гена L-субъединицы, является промоторной областью оперона, в котором ген L-субъе.цшшды является первым геном.

Через 31 пару оснований после терминирующего кодона гена М-субъодиницы обнаружена характерная для р-независимой терминации транскрипции прокариот шпилечная структура (Рис. 6), к которой непосредственно примыкает Т-богатая последовательность. Эти данные позволили предположить, что гены L- и М' субъедшшц РЦ С. auront lacuc, составляют самостоятельный би-цистрошшй оперон. Недавно Сила опубликована работа (Shiozawa и др.. 1989), в которой был определен размер мРНК puf-оперона G. aurantiacus - 2.3 тыс. пар оснований,"то есть этот факт подтверждает, что puf-оперон у О. auront locus является бицис-трошшм. Опредалотшй авторам этой работы Б*-конец мРНК подтверждает наше предположение о промоторном участке ри/-оперс-на С. ivirantlocus,, однако общая длина мРНК указана примерно на 200 пер оснований больше, чем предполагает расположение сигнала р-независимой терминации транскрипции. В "литературе описаны случаи, когда 3'-конец »лРНК бактериального оперона определяется не первой шпилькой для- ртнезависимой терминации транскрипции, а второй, следующей за ней, терминация на,которой требует дополнительных белковых факторов (Gabellínl. и др., 1986). Возможно, что синтез mPIIK puf-оперона С. аигап-tlocus также терминируется на одной из двух шпилек, расположенных ближе к 3'-концу определенной нами последовательности ДНК (Рис. 4), однако, окончательный ответ может дать только точное картирование 3'-конца мРНК pu/-оперона С. auront locus. •

Из литературных данных известно, что гены L- и М-субъеди- . ниц РЦ пурпурных бактерий входят в состав так называемых puf-оперонов, которые помимо генов pjLfb и pu/M содержат также reim, кодирующие другие белки фотосинтетического аппарата (Kaplan и др., 1988). Это гены цитохрома с, а- и ß-полипептидов светособирающего антенного комплекса, белка Q, участвующего в регуляции биосинтеза бактериохлорофиллов, а также гены pufR и РЧГХ (функции соответствующих им белковых продуктов пока точ-

«l" „m" „l" „M" „l" -M" *l" «m'

ттт F 12 9 tot s' 0 0 tat у 5 6 tgt с d 0

ttc F 21 17 tcc S 0 0 tac Y 9 11 tgc с 2 2

ТТЛ F 2 0 tca S 3 5 taa * "o 0 ■ tga * 0 0

ttg F 2 6 tcg S 6 4 таг: * 1 \ .1 1 tgg ïï 13 17

стт L 1 0 cct P 0 Ü cat H 0 û cg't R 4 4

сто L 9 11 ccg F 8 3 cac H 6 6 cgc H 4 4

ста L 0 0 с ca F 1 3 ca a Q 1 3 0г,a R Л 0

0tg L 7 13 ccg F 12 14 cag Q 6 4 cgg R 2 1

атт I 11 9 act T 0 0 aat N 7 11 agt S 2 0

атс I 12 15 acc T 5 9 aac N 3 5 agc S 4 3

ата I 2 0 аса T 3 1 aaa К 4 2 aga R 1 0

атс, M 8 10 acg T 2 5 aag К 2, 4 agg R 0 0

gtt 7 5 1 g ct A 4 6 GAT D 9 6 GGT G 7 15

gtc 7 8 4 GCC A 7 9 GAC D 3 1 une G 17 10

GTA V 3 0 G CA A 5 4 GAA E 7 6 GGA G 3 3

GT3 V 6 9 G CG A -•б Ш GAG E 5 5 GGG a 8 1

Рис, 5. Использование кодонов в генах L- и М-субъедишш, РЦ С. auront locus.

но не установлены). Таким образом, ра/-оперон G. auront locus организован существенно проще аналогичных ри/-оперонов пурпурных фотогаштезирукщих бактерий.

Ранее было показано, что ри/-ошррн пурпурной фотосинте-зирунцей бактерии Fhodobucter capsulaiиа имеет два промотора (Bauer и др., 1988). Регулируемый кислородом сильный промотор находится на расстоянии 318 пар оснований от инициирующего кодона гена pu/Q (первой ген рцГ-опорсна этой бактерии) и на-

СГ]

поминает сайт связывания фактора, подобного субъединице о РНК-полимеразы Ё. coll. Второй промотор является конститутивным и более слабым. Он удален от гена pu/Q на 130 пар оскова-

7П

ний и похон на сайт связывания о -подобного фактора РНК-полимеразы. Поскольку в случае G.aurontlacue нами был обнаружен

и-с

А А C.-.G Ü:A G.".<J C.-.G C.-.G C.-.G G.-.C C.-.G U:A C.-.G U:A C.-.G

SerLeuProTer C.-.G

UCACUGCCGUAGCGUUCGUGACACUUCUCUACCUUCCUCCCGG•UUGUUUAUUGCACGGGGG

Рис. 6. Структура возможного сигнала р-независимой терми-нации транскрипции.

7П

промоторный участок, подходящий под консенсус о и находящийся на расстояшш 142 пары оснований от начала гена pu/L, то для поиска возможного промоторпого участка о6® наш Оыл проведен еще один скришшг второй геномной библиотеки.

При помощи 32Р-меченной ник-транслированной Еставки из клона pRC II-9 среди 20 ООО ремэмбияантов был отобран клон pRC Н4. Длина вставки в этом клоне составила 802 пары оснований и, таким образом, получена« нами последовательность участка геномной ДНК C.aurantiacua была продлена в 5*-область на 207 пар оснований. В итоге, на участке длиной 352 пары оснований пород инициирующим кодоном гена pu/L не удалось обнаружить последователиности, похожей на промоторный участок ти-рп

па о РКК-полимеразы Е. coll (Рис. 3, 4).

Следует также обратить внимание на тот факт, что в ходе работы не был выделен ни один клон, содержащий полноразморннй ген pu/L- Возможное объяснение.этого факта связано с тем, что обнаруженные в ри/~опероне С. acurantlacuo регуляторные элементы - промоторы, участки связывания рибосом - структурно очень близки соответствующим элементам генов Е. coll и могут узнаваться ее ферментативными системами, а образующийся продукт гена pu/L оказывается токсичным для клеток-хозяев.

6. Анализ первичной структуры Ь- и M субъединиц РЦ Ch.lorofleaxLS auront lacua.

Сравнение аминокислотных последовательностей L- и М-субъ-вдиниц РЦ С. auronttacua между сс"1ой , а' 'Ькжэ с L- и М-еуСъ~ единицами пурпурных бактерий представлоно на рис. 7. Обозначены: I - Rhodosplrlllum rubr.œi; II - Rhodobaeter capsulatus; III - Rhodobaeter sphaeroldes; VI - riiodopseudonionas viridis; V - ChloroflexiL3 auront locus.

Степень гомологии двух субъединиц РЦ G. auront lacuo составила около 27% (86 совпадающих остатков, обозначены - *). Более высокая степень гомологии наблюдается при сравнении каждой из них с L- либо М-субъединицами РЦ пурпурных бактерий (35-37%). При сравнении L-субъединиц РЦ всех пяти видов было выявлено 88 консервативных аминокислотных остатков, э при сравнении М-субъединиц - 81 ( совпадающие аминокислоты подчеркнуты). 26 аминокислотных остатков оказались сверхконсервативными, то есть их расположение одинаково как у L-, та,; и у м-субъединиц РЦ всех пяти сравниваемых вэдов (Рис. 7, обозначены - в). Таким образом, несмотря на различное положение 0. auront locus и пурпурных бактерий в эволюционных классификациях, при сравнении строения и свойств их фотосинтетических реакционных центров обнаруживается определенное сходство, что свидетельствует о возможности единого происхождения фотосинтетическоп> аппарата бактерий. Вместе с тем, полученные наш данные подтверждают, что PII G. auront lacua, состоящий лишь из двух субъединиц, является наиболее просто устроенным РЦ из известных в настоящее время, a G. auront locus -древнейшим представителем фотосиптезирущих бактерий.

Обнаруженная гомология первичны* структур Ь~ и М-субъединиц РЦ С. cuTantiacii3 и пурпурных бактерий позволила нам предложить модель укладки полипептидных цепей РЦ С. auront I-асиз в мембране '(Рис. 8). На рлс.7 трансмембранъые а-спироль-ные участки отмечены скобами с буквами А-Е. Эта модель также согласуется с рассчитанными профилями гидрофобности (Kyte и др., 1Э82).

1 SEYQNILTGVQVRTAP-HS-APIAKGII'PH-L-CKPGF-SYVÎLGKIG-DAQ I-M

1 AEÏQOTPNQVQVAGAP-EMGIKEDVDTPERTPACr--MFN—ILGWMG-NAQ II-M

1 AEÏQNIFSQVQVRG-PADLGMTEDVMLAHESGVG-P-F-STLLGWFG-NAQ III-M 1 ADYQTI YTQIQ^RG -Г -HIT VSGE7ÎGDîïDR-V-GKF -FYSYWLGKIG -DAQ IY-M

1 X-ATIJMTP---GDLELGRDRGR-I-GKP-IEIPIiEMFGFDSQ V-M

* * * « ■ »*

¡ SRAKAKDPRFPDFSFTWEGARATRVP—GGRTIEEIEPEYKIKGRTTF-SAIFRYDPFDFW V-L

1 ALLSFERKYRV—RGG-TL-------IGG-----------DLFDFW IV-L

1 ALLSFERKYRVP—GG-TL--------VGG----------NLFDFW III-L

1 ALLSFERKYRV—GG-TL-------IGG----------SLFDFW II-L

1 ALISFERKYRV—rgg-TL--------IGG-----------DLFDFW I-L

46 IGPIYLGSTTVLSLVFGFFAIEIIGFffi^LASVNW—SPMEFGRQFFWLGLEPPAAEYGIß I-M

46 IGPIYLGIAGTVSLAFGAAÏÏFFTIGV7ÎYWYQAGF—DPFIFMRDLFFFSLEPPPAEYGLA II-M

47 LGPIYLGSKíVLSLFSGIiMffFFTiGIWWyQAGff—NPAVFJjRDLFFFSLEPPAPEYGLS III-M

46 IGPIYLGASGLAAFAFGSTAILIILFNMAAEVHF—DPLOFFRQFFWLGLYPPKAQYGMG IV-M

37 LGPFYLGFraAVAYITGGIFTíI»mm1C?AQV-l«-lffVAFAKYFVmiIDFPSSRYGLS V-M i-A-1 - - — —

M* * r * ***** * * * **■■ Ш*

60 VGPFYVGÍWGFVCVI-GIIFGSYFYIHETIÍKGPYSIPQNF---FAGRIDPPPPELGLG V-L

26 YGPYFVGFFG-VSAIFFIFLGVSLIGYA-ASQGPTWDF—F-----AISINPPDLKYGLG IV-L

26 VGPFYVGFFG-VATFFFAALGIILIAWSAVLQG-TWNFQ-----—LISVYPPALEYGLG III-L

26 VGPFY^'GFFG-VTTIFFA'i'IfiFIiLILWGAAMQG-TTMPQ-------LISIFPPPVENGLN II-L

26 VGPFYVGFFG-VrTLLF!rVLGTALIVWGAAL-GPSWT---F----WQISINPPDVSYGLA I-L

104 F-APUEGGMQIAGFFLTTSILLWWVRMYRRARALKMGTHTAWAFASAIFLFLSLGFIR I-M

104 I-AP^GGVWQIASLFMAISVIAWVfVPmRADQlGMGl®MWAn¿AIWLWSVLGFffR II-M

105 FAAPLKEGGLWLIASFFMFVAWSWGRTYlMQAIiGMGKHTAWAFI^AIWLWirVIXîFIR III-M

104 I-PP^GGWirafAGLFMTLSLGSWWIRVYSRARALGLGTHIAWNFAAAIFFVLCIGCIH IV-M

95 F-PPIJiEGGYrTTLIATïFLTVSIFAffYMIYTPAKALGIKPYLAYGFTGAIALYLVIYIIR ' V-M ~ ~ В--=-T - — „ o -

» * M ■ ***■*'*' ■* ** «*

115 i1 AAP G EP £?АЩК VLF AT I ÄFF GW!№QY¿3SMk1dMG Y¿vp IAFGV AFSAWLVLQVir V-L 77 -AAPLLEGGFWQAITVCALGAFISWMIJIHIVEISRKLGIGMWI^CVPIFMFCVI^ IV-L 77 G-APLAKGGLWQIITICATGAFVSWALREVEICRKLGIGYHIPFAPAFAILAYLTLVLPR I1I-L 77 V~MLDKGGLWQVITVCATGAFCSWAIÄE№IGRKXGIGFHIPVAPSMAIFAYLTLVVIR II-L 77 M-№MKKLWQIITFSAIG№VSWALI^ I-L

i рыждорб ебургс 1ррн1еяткзрзторрнтшзiарьусзашза мнс!атiь 1-м

! Р1ШСЗ»37АРРУС1ГЗН1Л«ГГН01'ЗЬБНСК1™«>ГНГЛ,31АЛЬУ03АШ,ЛМНС;АТ1Ъ 11-М

; Р1ШСЗ^ЗЕАУРУС1ЕЗН11)*ГГ1даЗЬ1/!1СЫОТГ-1РГНа131ЛР1,УСЗАШ'АМН«АТ1Ъ ш-м

i рт17с5»зес7ргси7рн1б»ъта1'31нус№,уусршюр31с-га¥сссььрааи0ат1ь iv- м

■ рутардабеарани^ у-м

■ ■ * * ■* **ш * »« я* ■*■*■ * * ** ♦«* ■ *

Й1СМгаЕСРУ1С1МРНЫ)*У51СРСта71даГ7даРНА1С1ГСЬРА5Т«Ъ1^СНСЕЬ1Ь ' У-Ь

PIJuШSWGШPYGII£HWWVШGYQШГ,nmWGlШSVSFШNШLGLHGGLП, IV-!,

ружса«усуаррус1№тн1ш73ктсутгсдануг1ра№да15урртмьа1^шг;аиь ш-ь

РМ1ШСЗ«СТАРРТ01датН11!«731гастаУС№1ГО{РРШШ1Т5Ы'РТТАУ;АЬ\]ШСАи/Ь п-т,

РУМ?«;СА№аУСРРУСРМТНП)УУЗНТСУ0УА№т№ШйС1ТЦ'РТТСШАЬ11СЗЬ1Ь 1-Ь

аузюлавне7рл1тбнатааенмьрм«тмарнатме31го«а--1№-ау1.ст1:тса1с i - м

АУГВРССЕРДП^а1УБНСТАЗЕЙАА1Рт«ТМСРКАТМЕС1НН?/Д1т«-АУМУТЬТСС1С 11-М

АУЗНГССЕНЕЫ;а1АБН(1ТМЕЙМ1^т»ТМСР;!ДГЩ;С1Ш»А1№М-А\'ЬУГЬТ0С10 ш-м

АУАНРССВНЕ1Е01ТтаТАУЕНААЬРт№Т1СРНАГ1ЕЗУНН1УС-даРЗигаУЗЛЗУС IV- м

а1жуаанее«?1е1сш'сгстт(лмн№смст^ау51нь$уар№ра№-1сс1тсаьс' у-м

- I-—г- Е--_:

* * * а т * я ** « '

заасшюре---------с0б1ему--ррглуаутзу(^;ушёсу1ра-1сс115лвьс у-ь

5уал---?с--бавкукташе!'(-аур-квуусу31саъ3111кьс1ри3111рьтса--гс 1у-ь

бали---ре--какемвтрбнеб-трр-га)ьусу31стьс шпьоьыбьзауерза-ьс iii-ъ

бш---ру—коктмвтрь'нев-тур-ношсузустьс1нн1л11ььашауе№за-сс 11-ь

зам—ра~-ксЕ7Шст1т-тур~ата15Устш1т(]Ъ1ШЗАУУкз1-1с 1-ъ

шлгст-уубш-реисукнсьа-рар 305

ш£СТ-^вшгу-*асглюуа--рутр зое хыбст-уушгсу^сошсма-рш 307 иьтст-рушшь-исукнсаа-рбурауъратрбразисарк 323 ут?змрбр'/1ш-рсис1еа01кур0сртрру31р 306

* ■ ■ , ■

1й£с№ру0в-*уз?жршй --ргшбсу 310 тi азсршгпг,*рш»стоь1)1 --рру/з 273 М1шп№т*у1)т(1тта1--ртшр0й1№ ?.в. МЬУЗСИУЕБЫКБЬТШШЖ—РГЙГАБМАСИЫС 281 м11£ар1тгсз*рв'ш,щ(жь--т-м--н0 275

1-М 11-М

ш-м

1У-М У-М

У-Ь 1У-Ь III-ь 11-Ь 1-Ъ

Г :с. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей Ь- и М-субъ-иц РЦ С. аигапИасиз и пурпурных Сахгерий. Обозначения в тексте.2«

цитоплазма

тг

е м б р а н а

68 У

[тйг|

и

98

Т

Г

г&ЩЬ [ШЬ] " £

III

157

275

IV

189

ц-субьединица

ПЕРИПЛАЗМА

Сшм!

соон-'

306

йл

IV

210

286

Г1&П ГГ^СГ!

III

177

кшм?1

II

122

89

С.

Ь-СУБЪЕДИНИЦА

310

-СООН

Рис. 8. Модель укладки голалептадшх цепей РЦ С.апгапИа-сиа в .мембране. Слева расположена М-, справа - Ь-субъединица.

Дальнейшее изучение пространственной организации и молекулярных механизмов функционирования РЦ методами рентгенострук-турного анализа и ограниченного протволиза позволит точно локализовать активные центры полипептидов, расположение связанных с ними хромофоров и, в конечном итоге, уточнить предложенную модель. ,

вивода.

1. Сконструированы дво геномные библиотеки бактерии Chloro-flexua auront locus. "

2. Получена серия рекомбгашнтшх плозмлД,^содержащих участки ри/-оперона бактерии С. auront1асиз.

3. Определена полная нуклеоти,-'лая последовтельлость pu/-оперена С. auront locus, и внутри нгэ установлены першчные структуры генов (pu/L и paß'), кодирующих L- и М-суОъиди-ницы фотосинтетических реакционных центров С. aurontiacus.

4. На основе структуры генов pu/L и pu/M вывожены полные аминокислотные последовательности L- и М-субъединиц РЦ С.auront iacua.

5. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей, фланки руицих геш pu/L и pu/M и показано, что ри/-оперон С. auront locus является бицистронным и наиболее просто устроенным среди изученных ри/-оперонов.

Основные результаты' диссертации изложены в следующих статьях и докладах:

1. Ovchlnnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Zolotarev a.s., Shmukler В.E.; Zargarov A.A., Kutuzov M.A., Telezhlnskr.'.ya I.N., Le-vlna N.B. Photosynthetle reaction centre of Chloroflexus aurantlacus. I. Primary structure of L-subunlt. - FE3S Lett.-, 1988, v. 231, n: 1, p. 23T-242.

2. Ovchlnnikov Yu.A.., Abdulaev N.G., Shmukler B.E., Zargarov A.A., Kutuzov M.A., Telezhinskaya I.N., Levlna N.B., Zolotarev A.S. Photosynthetle reaction centre of Chloroflexus aurantlacus. II. Primary structure of M-3ubun1t. - FEBS Lett., 1988, v. 232, n. 2, p. 364-368.

3. Золотарев А.С., Шмуклер Б.Е., Заргаров- A.A., Кутузов M.A., Левша Н.Б., Телехинская И.Н., Бухаров А.А., Абдулаев И.Г. Первичная структура L-субъединицы реакционного центра бактерии Chloroflexus aurantlocus. - Тезисы V советско-швейцарского симпозиума "Биологические мембраны: структура и функции", Рига, 1988, с. 145

4. Zargarov A.A., Telezhlnskaya IJ., Kutuzov H-A., Shmukler B.E., Zolotarev A.S. Structural stadies of the reaction center oi bacterium Chloroflexua aurant1асиз. - Abstracts oi the Vth conference oi young scientists of socialist countries on bloorganic chemistry, Pushchino, USSR, 1988, p. 56-57. #

5. Zolotarev A.S., Kutuzov M.A., Shmukler B.E., Zargarov A.A., Telezhlnskaya I.H., Levina Ы.В., AMulaev N.G. Photoreac-tion centre of Chloroflexus aurantlacus. Primary structure and membrane topology. - Abstracts of the symposium molecular biology of membrane-bound complexes in phototrophic bactrla, Freiburg, FRG, 1989, p. 109.

6. Кутузов Ы.А., Шмуклер Б.Е., Заргаров А.А., Тележинская

И.И., Левина Н.Б., Золотарев A.G., Абдулаев Н.Г. Изучение структуры фотосинтетического реакционного центра зеленой термофильной бактерии Ctiloroflexua caironttocua. - Биоорган. химия, 1990, т. 16, N 9, в печати.

Т-11053 от20.07.90г. Формат изд. 60x84 1/16 Объем 1,5п.л. Зак.129/7 Тир.100

1ШиПечатник" Мосгорпечать. Н.Краснохолмская д.5