Олигорибонуклеотиды, содержащие перфторарилазидную группу в гетероциклическом основании - новые фотоаффинные реагенты для модификации биополимеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

МЕЩАНИНОВА МАРИЯ ИВАНОВНА

ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ПЕРФТОРАРИЛАЗИДНУЮ ГРУППУ В ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОМ ОСНОВАНИИ - НОВЫЕ ФОТОАФФИННЫЕ РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

003482709

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель: к.х.н., доцент Веньяминова Алия Гусейновна

Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Готтих Марина Борисовна

к.х.н., с.н.с. Левина Ася Сауловна

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет

Защита состоится « 2009 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (11К), содержащие модифицированные звенья с группировками различной химической природы, широко применяются для изучения закономерностей НК-НК и НК-белкового узнавания, структурной топографии активных центров белков и сложных рибонуклеопротеидных комплексов, таких как рибосома, в антисмысловой биотехнологии, а также для создания на их основе диагностических систем и потенциальных терапевтических препаратов с улучшенными фармакокииетичсскими и фармакодинамическими свойствами. Особый интерес среди аналогов НК вызывают их производные, содержащие активные группировки, способные к образованию ковалентпых связей с реакциопноспособными группами биополимеров. Разработка методов направленного введения таких группировок в НК является актуальным направлением исследований в современной биоорганичсской химии.

Одним из основных требований при конструировании и применении аналогов НК, содержащих активные группировки, является минимальное искажение структуры НК и их комплексов с белками и нуклеиновыми кислотами в процессе взаимодействия. Весьма удобным вариантом модификации олигонуклеотидов является модификация гетероциклических оснований. Активная группировка, присоединенная к гетероциклическому основанию посредством линкера, может быть пространственно приближенной к комплементарной цепи ПК-мишени или определенному центру в белке и, в силу этого, может оказывать четко локализованное воздействие. Химические методы синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по гетероциклическому основанию, позволяют регламентировать количество введенных модифицированных нуклеозидов, их тип и расположение в цепи.

Цель и задачи исследования

Целыо данной работы являлась разработка метода синтеза олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях и создание на их основе новых фотоактивирусмых реагентов для аффинной модификации биополимеров. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• разработать методы синтеза модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих в гетероциклических основаниях функциональные группы-предшественники;

• разработать метод твердофазного Н-фосфонатного синтеза олигорибонуклеотидов-предшественников;

• разработать метод получения олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях, исходя из олигомеров-предшествешшков;

• синтезировать фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группировку в гетсроцикле, и изучить свойства полученных конъюгатов.

Научная новизна н практическая ценность работы. С использованием впервые синтезированных модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих атом брома или 4-хлорфенильную группировку в гетероциклическом основании, получены олигорибопуклеотиды-предшественники, содержащие эти функциональные группы. Разработан метод получения на их основе олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях уридина, аденозина и цитидина. Впервые

получены производные олигорибонуклеотидов с 4-азидотетрафторбензамидной группировкой в С5-положении уридина, С8-положении аденозипа и Ш-положепии цитидина, являющиеся перспективными фотоактивируемыми реагентами для изучения РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий. Проведено сравнительное исследование термической стабильности дуплексов новых конъюгатов с ДНК и РНК и их способности к комплементарно-адресованной фотомодификации модельных РНК- и ДНК-мишеней. Показано, что введение аминолинкеров различной длины в гетероциклические основания рибонуклеозидов, расположенных внутри цепи, практически не влияет на Т„л дуплексов, в то время как функционализация концевых рибонуклеозидов приводит к некоторой дестабилизации дуплекса. Введение 4-азидотетрафторбензамидной группы в С5-, С8- и N4-положения рибонуклеозидов понижает Тпл дуплексов. Показано, что степень фотомодификации РНК и ДНК зависит от длины линкера и расположения модифицированного нуклеотида в цепи. Определена позиционная направленность модификации ДНК и показано, что основным сайтом модификации, приводящей к образованию ковалентных ад-дуктов, является остаток гуанина, расположенный рядом с фотоактивной группой и находящийся в дуплексе. Ряд синтезированных фогоактивируемых аналогов мРНК был успешно использован для определения нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, формирующих мРНК-связывающий центр рибосом человека (Карпова Г.Г. с соавт., 2000-2008 г.г.).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, Россия, 1998г), на XV международном круглом столе «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Левей, Бельгия, 2002г), на Ш-ем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002г), на международной конференции «Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference» (Новосибирск, Россия, 2003г), на международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г.Кнорре (Новосибирск, Россия, 2006г) и др.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 149 страницах, содержит 15 рисунков, 10 схем и 13 таблиц. Библиография включает 327 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Известны два основных подхода к фупкционализации гетероциклических оснований олигонуклеотидов. Пресинтетический подход основан на использовании на определенной стадии олигонуклеотидного синтеза премодифицированных синтонов, уже содержащих линкер с защищенной функциональной группой, "обнажение" которой может происходить либо отдельно, либо одновременно с удалением всех защитных групп с олигонукле-отида. Постсинтетический подход основан на использовании на определенной стадии олигонуклеотидного синтеза модифицированных синтонов, имеющих в нужном положении гетероцикла "уходящую" группу, заменяемую на функциональный линкер уже в составе олигомера. Мы выбрали постсинтетический подход, который позволяет получать из одного олигонуклеотида-предшественника серию олигомеров, отличающихся лишь строением линкера либо активной группировкой.

Для химического синтеза модифицированных олигонуклеотидов в основном используют твердофазный фосфитамидный метод ^(¡^(¡¿е Б. е/ а/., 1981). К его достоинствам можно отнести эффективность реакции конденсации, возможность синтезировать с хорошим выходом протяженные олигонуклеотиды. Недостатки этого метода заключаются в необходимости "кэпирования" и окисления межнуклеозидной связи после каждой стадии конденсации, что приводит к увеличению продолжительности цикла синтеза. Твердофазный Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов (Garegg Р.1 е1 а1., 1985\ РгоеИкг В. е/ а1, 1986) отличается экономичностью и высокой эффективностью взаимодействия Н-фосфоната с ОН-компонентом в присутствии конденсирующего реагента; простотой получения пуклеозид-З'-Н-фосфоиатов и устойчивостью этих мономеров к окислению и гидролизу при хранении и в условиях синтеза; отсутствием необходимости защищать межнуклеозидный фосфат; устойчивостью межнуклеозидных Н-фосфонатных групп в условиях олигонуклеотидного синтеза и возможностью их однократного окисления в конце синтеза, что приводит к меньшему числу стадий при получении целевого олигоме-ра. Этим методом можно синтезировать с хорошим выходом олигонуклеотиды средней длины как в автоматическом, так и в "ручном" вариантах.

Для синтеза модифицированных по гетероциклу олигорибонуклеотидов был выбран твердофазный Н-фосфонатный синтез в "ручном" варианте, основанный на сочетании двух кислотолабильных групп различной устойчивости, а именно, диметокситритилыюй ((МеО)2Тг) группы для защиты 5-гидроксилов и тетрагидропиранилыюй (ТЬр) - для защиты 2'-гидроксилов (по аналогии с Веньятшова А.Г. с соавт., 1990).

Нашей первой задачей было разработать методы синтеза модифицированных рибо-нуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих "уходящие" группы в гетероциклических основаниях.

1. Синтез модифицированных рнбонуклеозид-З'-Н-фосфонатов

В качестве "уходящей" группы для С5-/С8-положений нуклеозидов, на наш взгляд, наиболее удобны атомы галоидов, поскольку они удовлетворяют требованиям, предъявляемым к таким группам: простота получения соответствующих мономерных синтонов; стабильность в процессе синтеза; мягкие условия замены "уходящей" группы на другие группировки. Галоидсодержащие олигонуклеотиды могут служить не только олигонуклеотидами-предшественниками, но и выступать в качестве самостоятельных инструментов молекулярно-биологических исследований.

Из галоидов наиболее привлекательным в качестве "уходящей" группы является атом брома. Вг-Содержащие нуклеозиды (1-4) были синтезированы взаимодействием нуклеозидов с бромом в различных условиях, причем в случае уридина и гуанозина реакция проходила в бромной воде, а для аденозина и цитидина требовались кислые условия (схема 1).

но он

(2) С8-ВГ-С

(4) С5-ВГ-С

16ч, 55 .V

Строение полученных бромсодержащих рибонуклеозидов подтверждали элементным анализом.

Судя по литературным данным, атом брома в гетероциклическом основании остается инертным ко всем реагентам, используемым в ходе твердофазного синтеза, однако последующее деблокирование экзоциклических аминогрупп и удаление олигонуклеотида с полимера с помощью копц. NH4OH в жестких условиях может приводить к получению амиионроизводных олигонуклеотидов (см., напр., Ferrer Е. et al., ¡997). Мы исследовали степень сохранности модельных бромсодержащих рибонуклеозидов C5-Br-U (1), С8-Вг-

G (2), С8-Вг-А (3), С5-Вг-С (4) при выдерживании их в условиях деблокирования олигонуклеотидов (конц. МН4ОН:этанол (3:1), 16 ч, 55 °С или 3 сут, комнатная температура). В качестве контроля использовали специально синтезированные аминосодержащие рибонук-леозиды-маркеры. По данным обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 1) при повышенной температуре (55 °С) C8-Br-G остается неизменным, в случае C5-Br-U наблюдается образование до 7 % C5-NH2-U, а в случае С8-Вг-А и С5-Вг-С - около 30 % C8-NHrA и C5-NH2-С, соответственно, и до 60 % неидентифицированпых продуктов. При обработке конц. NII4OH при комнатной температуре наблюдали образование около 1 % C5-NH2-U и 3 % C8-NH2-A, а в случае С5-Вг-С - около 5 % C5-NH2-C и 15 % неидентифицированпых продуктов. На основании этих данных для синтеза олиго-рибонуклеотидов, содержащих модифицированный

I_I

О 5 10 15 20 25»

. 3 сут. кммэткоя температур.! Also

(1)

0 5 10 15 20 25 мин

А;м

(NH, uNM, {Br ,NM, ь>,

MAL

Рис. 1. Аналитическая ОФ ВЭЖХ реакционных смесей после обработки модифицированных нуклеозидов копц. Ы^ОН.этанол (3:1 j: (1) - C5-Br-U (1), (2) - С8-Вг-А (3), (3) - С5-Вг-С (4), (4) - C5-Br-G (2). Хроматограф "Милихром Л-02" (Эконова, Россия), колонка (2.0x75 мм) с Prontosil С-18 AQ (5 мкм, Masherey-Nagel, Германия), градиент концентрации ацетонитрила (0-50 %) в 0.01 М NaOAc, рН 5.0 (скорость потока 150 мкл/мин).

С1" = C5-Br-C, U1" = C5-Br-U, G1" = C8-Br-G, Alir = C8-Br-A, С""* = С5-№12-С, Un"2 = C5-NH2-U, Ani,2 = C8-NU2-A, * = неидентифицирован-ные продукты.

_1_I_I_|_

0 5 10 15 20 25»

цитидин, было решено использовать подход, в котором в качестве модифицированного синтона выступает 04-(4-хлорфеннл)уридин (по аналогии с Allersort C.R. et ai, 1997).

Синтез 04-(4-хлорфенил)уридина (04-ClPh-U) (5) проводили в несколько стадий, представленных на схеме 2. Все реакции проходили с хорошими выходами (80-95 %).

_( и н Схема 2

о 1 " 44 " 44

\-{ „„„д.,о., ПМАГ, Е,^ \_7 Е.,14 )—( )—(

НО О» ЕГДЮ 051Е1 ' * Е»ОК.Е., НО ОН

1 ' ОЭ.Е!,

ТРЭ-С] - гршишфшшлбсчполсульфожлпрнд (5) ()4-С1ГЬ-(]

Строение 04-С1РЬ-и (5) подтверждали элементным анализом.

Следующим этапом работы был синтез модифицированных М,5',2'-защищснных нук-леозидов (6г, 7д, 8д, 9г) и их З'-Н-фосфонатов (6-9) в соответствии с разработанной нами схемой (схема 3).

о о о ,. . о о о Схема 3

(1),,^ (6а), Хв, (6б)|иА^(6в)1и^в, (6г)1ВХ,„ (6) X,»

„V .А1 „V »У „V ««у

ПО ОН Оа-о ОН ПО о-£> по о-ф _ 9 о-0

I / Т / (СЛО^Н0-?"0 „

0-1'=0 (CJ1S)4NM Н

N111«

ОД!» (8а)Х» {ЩЛ» (8B)NV (8r)H^w (8д,Л» (8№

................................v^üj-o "41) N^Sj-o o-O 1Ю o-\_> HO o-Q о O-Q

I /— T /- *

(C,ll,ljNll и

- w ■ «-О- «-О? ci_0~v ci~0"°

(5) А (9a) А (96) А (9в) A (9r) А (9) А

0*V J O^Y (AJ 0*V oA.J ,AJ

..И,, A-Hn vvHo .Ho .Ho Uo

I / T )— + "o-i=o

' 1 / (CJI,),N.I H

(i) TMSCI/Py; ibuCl; H20, (|7) T1PDS.CI2/Py, (>Vi)Ö /"-толуолсульфокислота, (/V) bzCl/Py; (v) «шрфолин/Ру; (w) TEABr/KF; (vif) (MeO)2TrCI/Py; H20; (vi//) Im/PCIjfTEA; H20 ,

s T.l'lJSi N—Si 1.1.3.3-тсгр

к су- '»- 'v« • yr

ишОушрил Гмлттл 4-хл1>рфащл ' г—

Использование "транзитной" 1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксан-1,3-диилыгой защитной группы Маркевича позволяло временно блокировать 3'- и 5-гидроксилы модифицированных нуклеозидов для введения тетрагидропиранилыюй защитной группы в 2'-положение рибозы. Реакция проходила в пиридине с высоким выходом (85-95 %). Взаи-

модействие 3'-,5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-нуклеозидов (6а, 76, 8а, 9а) с 3,4-дигидро-2Н-пираном приводило к получению их 2'-0-тетрагидропиранильных производных (66, 7в, 86, 96) с выходом около 65 %. Экзоциклические аминогруппы гуанозина и аденозина защищали изобутирильной и бензоилыюй группами, соответственно, при этом с целью улучшения растворимости гуанозина защиту вводили на первой стадии с получением 1Ч2-изобутирил-8-бромгуапозина (7а), а в случае 8-бромаденозииа бензоили-рование проводили после введения тетрагидропиранилыюй группы (соединение 8в). Удаление Т1Р08ьзащиты происходило при помощи фторид-иона за 1.5 ч при 60 °С с образованием модифицированных 2'-0-тетрагидропиранилнуклеозидов (6в, 7г, 8г, 9в). Введение димегокситритильной группы по 5'-гидроксилу приводило к получению модифицированных 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранилнуклеозидов (6г, 7д, 8д, 9г), которые при взаимодействии с триимидазолидом фосфора давали соответствующие 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранилнуклеозид-3'-Н-фосфонаты (6-9), содержащие атом брома или 4-хлорфепильную группировку в гетероциклическом основании. Строение всех полученных новых соединений (ба-г, 7а-д, 8а-д, 9а-г) подтверждали методами протонного магнитного резонанса и элементного анализа. Строение новых З'-Н-фосфонатов (6-9) было доказано методами 3|Р-ЯМР и Е81-масс-спектрометрии (табл. 1).

Таблица 1. Выходы и характеристики модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфоиатов.

№

З'-Н-Фосфомат

"Р-ЯМР (CDClj), S, м.д. (Ji-.ii')

Выход,%

ESI-MS : m/z

Вычислено: [М+НГ

(6)

5 '-О - Д и м етокс итр итил -2 '-О-тстр аги др оп ира нил-5-бромуриднн-3'-Н-фосфонат

¿1 KJ liu I

5Ч)-Диметокситритил-2'Ю-тетрагидроииранил-Ы2-изобутирил-8-бромгуанозин-3'-Н-фосфопат

П икахлнл UTtMITij п ^Т_П_татП1г11 пплпппчпип-

1.9,2.1 (Jimi 610 Г'ц)

82.0

876.4

876.0

(7)

1.9,2.0 (Jp-n 610 Гц)

92.0

984.8

985.0

(8)

5'-0-Диметокситритил-2'-0-тетрагидроииранил-Ы6-бензоил-8-бро.маденознн-3'-Н-фосфонат

2.0,2.2 (Jr.„610 Гц)

83.0

1002.3

1002.0

(9)

S'-O^HMeTOKCHTpHTwi^'-O-TeTpan^ponHpannri-04-(4-хлорфепил)уридин-3'-Н-фосфонат

1.5, 1.7 (Jp.ii 610 Гн)

73.0

906.1

906.0

Jimi - константа спин-спинового взаимодействия. Спектрометр AV-300 (Brukcr, Германия). 2 ESI-MS (ESI MS/MSD ХСТ, Agilent Technologies, США. Данные получены Герасимовой Ю.В.)

Разработка методов синтеза модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов и получение их в препаративных количествах позволили перейти к синтезу модифицированных олигорибонуклеотидов.

2. Твердофазный Н-фосфонатный синтез олнгорибонуклеотндов-предшественников, содержащих "уходящие" группы в гетероциклических основаниях

Синтез модифицированных по гетероциклу олигорибонуклеотидов-предшественников проводили по схеме 4. В качестве полимерного носителя для твердофазного синтеза использовали макропористое стекло МПС-700 с присоединенным к нему первым стандартным или модифицированным защищенным рибонуклеозидным звеном. Цикл наращивания олигонуклеотидной цепи (табл. 2) включал в себя удаление 5'-диметокситритильной защитной группы и последующую конденсацию с защищенным рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатом в присутствии пивалоилхлорида (Р1уС1).

(M.o)jT»<>i 0 в

. W

(Р)" | О ОТЬр

ШЩ

""1 » I \]

ОТЬр II—р=о

Ш'й)

W

(р)~ I " ОТ1,П

о t

i1

О OThp

О—1=0

о 1% С11С12СОгН/СН2С12; //") ^[.o^Trfi -| „ » , PivCl;

"1 о ?•

и

r«

и

В - защищенное о oihp немоднфицированное |]_1_0 или модифицированное Г" (Br, ClPh) основание

'») УРу П20, (F)w - модифицированный 1р полимерный носитель

В реакции конденсации использовали 5-кратные избытки защищенных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов и 25-кратные избытки РКС! но отношению к защищенному нуклеозиду на полимерном носителе. "Ручной" вариант твердофазного Н-фосфонатного синтеза позволяет получать стандартные и модифицированные олигонуклеотиды в препаративных количествах (масштаб синтеза 4 мкмоль).

Таблица 2. Протокол операций твердофазного Н-фосфонатного синтеза модифицированных олиго-рибонуклеотидов в "ручном" варианте._

п/п

Операция

Реагент, растворитель

Время, объем

Цикл присоединения одного нуклеотидного звена

!. Деблокирование 1% CHCI2CO2H в CH2CI2 0.5 мл, 2 мин

2. Промывка CH3CN абс. 3 х 0.5 мл

3. Дозирование мономеров и 0.05 М раствор нуклсозид-Н-фосфоната и по 150 мкл

конд.агента 0.25 М раствор PivCl в СНзСЫ^Ру^ (1:1) каждого раствора

4. Конденсация 2 мин

Повторение операций № 2,3,4

5. Промывка C1UCN абс. 3 х 0.5 мл

Окончание синтеза

I. Деблокирование 1%СНСЬС03НвСН2С12 0.5 мл, 2 мин

2. Промывка CII3CN абс. 3 х 0.5 мл

3. Окисление 0.1 М12вРу:Н20 (98:2) 20 мин

4. Промывка CHiCN абс 3 х 0.5 мл

После проведения необходимого числа циклов межнуклеотидной конденсации проводили деблокирование 5'-концевого гидроксила с последующим окислением с получением полимер-связанных М,2'-0-ТЬр-защищенных бром- или хлорфенилуридинсодержащих олигонуклеотидов, использованных далее для получения аминосодержащих олигомеров (см. раздел 3).

Как уже говорилось выше, галоидсодержащие олигонуклеотиды могут выступать в качестве самостоятельных инструментов исследований в молекулярной биологии. Поэтому нам представлялось целесообразным продемонстрировать возможность получения бром-содержащих олигорибонуклеотидов в рамках разработанного подхода. С этой целью полимер-связанные М,2'-0-ТЬр-защищенные бромсодержащие олигорибонуклеотиды обрабатывали конц. МН4ОН с последующим гидролизом 2'-0-тетрагидропиранилыюй группы и хроматографическим выделением незащищенных Вг-содержащих олигорибонуклеотидов (10-23) (схема 5). Их выходы и характеристики представлены в табл. 3. Нуклеозидный состав олигонуклеотидов подтверждали с помощью ферментативного гидролиза с последующим количественным анализом гидролизатов обращенпо-фазовой ВЭЖХ с использованием специально синтезированных модифицированных нуклеози-дов-маркеров.

В = Uia,

N6-bzAde,

N2-ibuGua,

N4-bzCyt,

N6-bz-8-BrAde,

N2-ibu-8-BrGua,

5-BrUra

j> OThp

•p=o

kohu.NI I .Ol I, 3 сут, комнатная температура_

0.01h HCl, 2 ч, 50 «С

- модифицированный полимерный носитель

m=3-ll

В' Ora, Ade, Gua, Cyt.

5-BrUra, 8-BrGua. S-BrAde

(10-19) (C5-Br-U) (20) (C8-Br-G) (21 -23) (C8-Br-A)

Таблица 3. Выходы и характеристики опигорибонуклеотидов, содержащих атом брома в гетероциклическом основании.

№ Олигорибонуклеотид Вых од', % Обращенно-фазовая ВЭЖХ

Время удерж ивания, мин Спектральные соотношения Нуклеозидный состав2

250 260 270 260 280 260 290 260

(10) U'"pApApA 27 11.3 0.77 0,80 0.44 0.19 U"' А 1.0: 3.0

(11) UBrpUpUpUpUpU 13 9.5 0.74 0.90 0.52 0.20 UBr :U= 1.0:4.7

(12) U"rpUpUpGpUpU 9 12.4 0.82 0.88 0.54 0.22 U1" U G l .0:3.9:1 1

(13) UpUu,pUpGpUpU 9 12.4 0.82 0.88 0.54 0.22 UBr U :G=1.0:3.9:1.0

(14) UpUpU'"pGpUpU 8 9.9 0.84 0.87 0.53 0.21 UB':U :G=1.1: 3.9:1.0

(15) UpUpUpGpUHrpU 8 9.4 0.80 0.90 0.57 0.24 UBr:U:G-l.2: 3.8:1.0

(16) UpUpUpGpUpU"' 9> 9.5 0.81 0.90 0.56 0.22 UK :U :G= 1.1: 3 .8:1.0

(17) UpUpCpU pApApA 8 15.0 0.79 0.84 0.47 0.18 U"' С U A 1,0:1.0:2.3:3.0

(18) UBrpCpUpGpUpGpUpUpU 7 10.7 0.86 0.88 0.58 0.25 U"' :С :U :G-1.1 1 0:4 8:2.2

(19) UpCpUBrpGpUpGpUpUpU 7 10.4 0.88 0.89 0.60 0.27 U'" :C U :G 1 3:1 0:4.7:2.2

(20) ApUpGBrpUpUpU 19 9.1 0.76 0.84 0.43 0.15 (',"' :U A 10 4.0.1.0

(21) AB,pUpGpUpUpU 7 12.3 0.79 0.87 0.49 0.15 A1" : U G 1 l.in 1 0

(22) CpA'"pGpCpUpCpCpA 10 8.2 0.81 0.97 0.69 0.32 ABr :C :U G :A-0.8:3.8:1.1:1.0:1.2

(23) CpApGpCpUBrpCpCpA 10 10,7 0,86 0.94 0.65 0.31 U"r :C :G A 1.2:4.0:1.0 2.0

1 Общий выход после ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ в расчете на первое нуклеозидное звено 1 Гидролиз с помощью нуклеазы Р| (5 ед.акг. в буфере (0.03 М 01 ¡ССХЖа, рН 5.2, 1 мМ /п.ЧО]), 16ч, 37 °С) и щелочной фосфатазы Е.соП (0.34 ед.акт. в буфере (0.1 М Трис-НС1, рН 7.8, 5 мМ 1У^С12), 4 ч, 37 °С) с последующим анализом методом ОФ ВЭЖХ (условия см. рис. 1). ' Синтез с использованием С5-Вг-и-содержащего полимерного носителя.

ЦиЛ^-Ц.'ЦЫм III Nil IH

Рис. 2. MALD1-TOF масс-спекгры бромсодсржащих олигорибонук-

леотидов:

Л - UpUpCpUB'pApApA (17),

расчетная |М+И]+ = 2229,2 Б - UBrpCpUpGpUpGpUpUpU (18),

расчетная [М+Н]+ = 2850.5. MALDI-TOF REFLEX III (Bruker Dallonics, Германия). Данные получены Ковалем В В.

Структура ряда бромсодержащих олигорибоиуклеотидов была дополнительно подтверждена методом МАЬО!-ТОР масс-спектрометрии (см., напр., рис. 2).

3. Синтез и выделение олигорибонуклеотидов, содержащих алифатические амнно-лннкеры в гетероциклических основаниях

Как уже говорилось выше, в данной работе представлен ностсинтетический подход, основанный на замене атома брома или 4-хлорфенильной группировки в составе олиго-нуклеотида на остаток диамина.

Предварительно был проделан ряд экспериментов на модельных модифицированных нуклеозидах.

3.1. Взаимодействие модифицированных нуклеозидов с алифатическими диаминами, подбор условий

В первой серии модельных экспериментов по взаимодействию нуклеозидов (1-3) и (5) с диаминами варьировалось несколько параметров реакции — температура, время и концентрация диамина. Анализ реакционных смесей проводили методом ОФ ВЭЖХ (условия см. рис. 1). Были определены времена полупревращения (¡¡/2) С5-Вг-1) (1), С8-Вг-Л (3) и 04-С1РЬ-и (5) в аминопроизводные и на их основе были выбраны оптимальные условия замены атома брома и 4-хлорфенильной группировки па остатки алифатических диаминов (табл. 4). В случае С8-Вг-0 (2) было показано, что полной замены атома брома на остатки диаминов не происходит даже при выдерживании с 7М раствором диамина при 70 °С в течение 10 ч.

Таблица 4. Условия замены "уходящих" групп па остатки алифатических диаминов в составе олиго-нуклеотида. _ _ _

ЕБА ТпМОА ТйгаМБА бМОА

С5-Вг-и (1) 4 ч, 37 "С 6 ч, 37 "С 8 ч, 55 "С

С8-Вг-А(3) 4 ч, 55 "С 4 ч, 55 "С 4 ч, 55 "С

04-С1Р11-1) (5) 40 мин, 42 "С 40 мин, 42 "С 40 мин, 42 "С

7М раствор диамина в этаноле

2 2М раствор диамина в этаноле

В качестве универсальных условий замены "уходящих" групп на остатки диаминов для нуклеозидов (1), (3) и (5) были выбраны 2М спиртовый раствор диамина, 18 ч, 42 °С.

Стандартной процедурой для удаления щелочелабильных 1М-защитных групп и полимера с олигонуклеотида является обработка смесыо конц. МН4ОН:этанол (3:1), поэтому мы исследовали поведение нуклеозидов (1), (3) и (5) при обработке конц. N11,011 как до, так и после обработки диаминами. В случае нуклеозидов (1) и (3) ни последующая, ни предыдущая обработки не влияли на состав реакционной смеси, однако нуклеозид 04-СП'Ь-и (5) при предварительной обработке N1140П полностью превращался в цитидин. Эти данные позволили заключить, что при получении аминосодержащих олигорибонуклеотидов исходя из хлорфенилуридинсодержащих олигорибонуклеотидов-предшественников следует использовать только обработку диаминами.

3.2. Деблокирование 1Ч-защитных групп экзоциклических оснований нуклеозидов в присутствии алифатических диаминов

В другой серии модельных экспериментов была проверена возможность удаления 1М-защитных групп при обработке М-ацилрибонуклеозидов алифатическими диаминами. В результате варьирования нескольких параметров реакции, таких как температура, время и концентрация диамина, были определены универсальные условия удаления М-защитных групп (2М спиртовый раствор диамина, 18 ч, 42 °С) для Ж-ацетилцитидина,

Ш-бензоиладенозина и Ш-изобутирилгуанозина. При обработке Ш-бензоилцитидина наряду с цитидином наблюдали образование переаминированного цитидина (до 40 % в зависимости от условий реакции) (см., напр., рис. 3).

Рис. 3. а) Обращеино-фазовая ВЭЖХ реакционной смеси при выдерживании Ы4-бензоилцитидина в 7М растворе этилендиа-мина в этаноле, 2ч, 55 °С;

б) маркеры (Оцитидип, Сь'=Ш-бепзоилцитидин, С* ЦМ-(2-аминоэтил)]цитидин).

Условия хроматографии см. рис. 1.

Суммируя данные разделов 3.1 - 3.2, можно сделать следующие выводы:

• для получения С5-аминоалкилуридин- и С8-аминоалкиладснозинсодержащих 2'-0-ТЬр-защищенных олигорибонуклеотидов М,2'-защищснные полимер-связанные С5-бромуридин- и С8-бромаденозинсодержащие олигомеры следует обрабатывать смесью конц. ЫП4ОН:этанол при комнатной температуре с последующей обработкой диамином в условиях, приведенных в табл. 4, либо проводить обработку 2М спиртовым раствором диамина в течение 18 ч при 42 °С. В последнем случае цитидиновые звенья в составе этих олигорибонуклеотидов должны иметь лабильные М-ацетильные защитные группы (во избежание реакции переаминирования);

• синтез модифицированных олигорибонуклеотидов, содержащих алифатический ами-нолинкер в С8-положении гуанозина, через бромсодержащий олигомер невозможен ввиду жестких условий замены атома брома на диамин;

• для получения Ж-аминоалкилцитидинсодержащих 2'-0-Т11р-защищеиных олигорибонуклеотидов М,2'-защищенные полимер-связанные 04-хлорфепилуридинсодсржащие олигомеры необходимо обрабатывать 2М спиртовым раствором диамина в течение 18 ч при 42 °С. В этом случае стандартные цитидиновые звенья в составе этих олигорибонуклеотидов также должны иметь лабильную Ы-ацетильпую защиту.

Эти рекомендации были использованы при получении модифицированных олигорибонуклеотидов, содержащих остатки различных диаминов в гетероциклических основаниях.

3.4. Синтез и выделение аминосодержащих олигорибонуклеотидов

Полимер-связанные защищенные С5-бромуридин-, С8-бромаденозин- или 04-хлорфенилуридинсодержащие олигорибонуклеотиды, полученные по схеме 4, были использованы для получения аминосодержащих олигорибонуклеотидов (схема 6) в условиях, приведенных в разделах 3.1-3.2. Таким образом был получен ряд аминосодержащих олигорибонуклеотидов, 2'-гидроксильпая группа которых была защищена тетрагидрони-ранилышй группой. Необходимо отметить важность использования 2'-0-тетрагидропиранильной кислотолабилыюй защитной группы в разработанной схеме синтеза, позволяющей избежать нежелательного расщепления олигорибонуклеотидов

под воздействием алифатических аминов при использовании 2'-0-щелочелабильных защитных групп.

Схема 6

/) конц.Х! 1^011:угано:1, И) Ш^СИДМ^; ь„2-№1(С112),-Ш) 0.01н НС1; Т=23-П4'6

В' = ига, лае, Ст, Су1, СЗ-ЦЫН^ига, С8-Ц,Ш2-Ас1е, N4-L„^^H2-Cyt

- модифицированный полимерный носитель

(24-45) (С5-Ь ЫН.-и) (46-54) (С8-Ц,ЫН,-А)

- ига, Ыб-ЬгАае, Х2-|ЬиС;иа, Ы4-ЬгС51, №-асС>1, 5-Вгига, К6-1и-8-ВгАс1е. 04-С1РЬ-ига

"1 » |

ОТЬр •1>=0

Ш")тт

или (»),('")

(рЬ^г«

а

и

XI

(55-63) (Ы4-ЦКН2-С)

Удаление 2'-0-тетрагидропиранилыюй группы и хроматографичсское выделение незащищенных аминосодержащих олигорибонуклеотидов (24-63) проводили по аналогии с (Веньяминоеа А.Г. с соавт., 1990)\ их выходы и характеристики представлены в табл. 5. Нуклеозидный состав олигопуклеотидов подтверждали с помощью ферментативного гидролиза с последующим количественным анализом гидролизатов обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием специально синтезированных модифицированных нуклеози-дов-маркеров. Для сравнения модифицированные олигорибонуклеотиды (37,38,47-49) были получены также и фосфитамидным методом, с использованием предварительно синтезированных новых 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранил-5-бромуридии- и 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропирапил-Н6-бензоил-8-бромаденозин-ЗЧМ,К-диизопропил-(2-цианэтил)-фосфитамидов. Была показана возможность сочетания в твердофазном синтезе двух 2'-защитных групп - /лретбутилдиметилсилилыюй и тетра-гидропиранильной — без существенного изменения протокола фосфитамидного синтеза; выходы целевых олигорибонуклеотидов были сопоставимы.

Таблица 5. Выходы и характеристики олигорибонуклеотидов, содержащих алифатическую аминогруппу в гетероциклическом основании.

X" Олигорибонуклеотид Выход1 ,% Обращенно-фазовая ВЭЖХ

Время удерживания, мин Спектральные соотношения Нуклеозидный состав5

250 260 270 260 280 260 290 260

1 2 3 4 5 6 7 8 9

(24) и^'грАрАрА 12 9.3 0.88 0.72 0.32 0.14 и^ы'г :А=1 0:з о

(25) и12ш12ририририри 9 8.7 0.83 0.83 0.46 0.16 иь2*"2;и=1.0:4.7

(26) и1'2ы,2ририрСрири 3 7.9 0.88 0.84 0.50 0.22 1>2Ы12 I: С- 0.8 1.0

(27) ири^'^рирврири 5 15.0 0.91 0.80 0.46 0.20 и^"2:11:0-0.9:3.9:1.2

(28) ирири1'2,м|2р0рири 5 15.3 0.90 0.78 0.50 0.21 иьум|2 •,:.<; от.и.'.и

(29) иририрОри^'^ри 5 9.2 0.88 0.84 0.51 0.21 :1Ш-1.0:4.0:1.1

(30) иририрСрири1^''"! 11.9 0.92 0.81 0.49 0.20 и4Ш12 .с с; 0.9 я ■> 1 о

(31) иь2ы1:рСрСр11рири 7 8.1 0.86 0.86 0.46 0.22 иь2ы12 ;С:и=1.0:2.1:3.0

(31) и4'м|2рСрСририри 82„. 7.9 0,85 0.87 0.46 0.23 и*-2м|2 :С:и=1.0:2.7:3.0

(32) и'г^'грСрирСририри 8 8.4 0.84 0.84 0.44 0.25 и'-2м,2 (М.'.Г, 1.1 1.0.4.1:1.0

(33) СрЛрОрСри1'2ь|,2рСрСрЛ 6 12.7 0.92 0.89 0.61 0.21 :С:0:А=1.0:4.0:1.2:2.2

(34) СрАрСрСри'^|12рСрСрА 5 12.8 0.91 0.87 0.57 0.25 ицы12 :С:0:А=1.1:4.1:1.0:1.9

(35) СрЛрОрСри'-'''м'2рСрСрА 4 13.9 0.93 0.89 0.59 0.27 С (• Л «8381 0.1 У

(36) и^'грСрирСрирОририри 6 10.3 0.92 0.84 0.55 0.26 и1-2н|12 :С:11:С=<0.8:1.0:5.0:2.1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

(37) UpCpUL2lNU2pGpUpGpUpUpU 6 10.4 0.93 0.85 0.56 0.24 UL2N1I2:(:.!.: G I .M.O l 7.2 2

(38) UL2N1 '2pCpUpCpUpCpGpUpGpU pUpU 8 11.3 0.90 0.82 0.46 0.20 ljL2Nii2 C;U:G-1.1:3.1:6.2:2.0

(39) UpUpCpCpUL2w'2 II4 10.5 0.90 0.82 0.49 0.23 UL2MI2 C:U=1.0:3.1:2.0

(40) UpUpCpApCpUL2MI2 11.6 0.89 0.84 0.50 0.24 (jLÄ С.'.: Л- 1 0 ?. 1 2 2 0.9

(41) UpUpUpAp ApCpUL2bl '2 94 10.1 0.88 0.84 0.52 0,22 U'-2™2 C:U:A=1.0:1.1:3.2:1.9

(42) UpUpUpApApCpUpCpUL2Nll2 84 10.3 0.89 0.85 0.48 0.21 UL2NII2 C:U:A=1.1:2.0:4.1:1.9

(43) UpUpUpApApCpUpCpUpCpCp U^NIIj 8J 11.0 0.90 0.83 0.50 0.24 UL2NII2 C:U:A==1.1:4.0:4.9:2.0

(44) UpUpCpUL2bll2pApA 10 14.1 0.89 0.83 0,48 0.21 1>2Ы|2 C:U:A=0.9:1.0:2.3:3.2

(45) UpUpCpUL2N1 '2p ApApA 10 15.1 0.88 0.84 0.50 0.22 UL2NII2 С l.::A O S 1.0 2 2 3 2

(46) AL2N,l2pUpGpUpUpU 6 11.3 0.79 0.92 0.61 0.24 aL2«I2 C:U:G:A=1.1:4.0:1.0

(47) UpUpCpUpAL2bll2ApApApA 10 10.8 0.82 0.99 0.73 0.41 AL2™2 C:U:A4).9:3.8:1.1:1.0:1.1

(48) UpUpCpUpApA4NU2pApApA 11 10.7 0.81 0.98 0.74 0.42 C:U:A-=0.9:3.8:1.0:0.9:1.1

(49) UpUpCpUpApApAL2N"2pApA 9 10.8 0.81 0.98 0.73 0,43 A'-2MI2 C: U :A=0.9:4.0:1.0:1.0:1.1

(50) UpUpCpUpApApApAL2bllipA 9 10.9 0.85 0.99 0.73 0.43 AW C:U:A=1.0:3.9:1.1:1.0:1.1

(51) UpUpCpUpApApApApAL2NII2 104 10.6 0.82 1.01 0.75 0,44 aL2KII2 C:U:A=0.9:3.9:1.0:1.1:1.1

(52) UpCpUpUpCp ApG pAL2N1 '2PA 9 10.9 0.82 0.97 0.76 0.41 C:U:G:A=1.0.4.0.1.1:1.1:1.0

(53) CpAL2Nll2pGpCpUpCpCpA 7 10.3 0.82 1.00 0.75 0.40 д4Ы12 C:U:G:A=0.9:3.9:1.1:1.0:1.1

(53) CpAL2NU2pGpCpUpCpCpA ioiJ 10.0 0.81 1.00 0.76 0.40 aL2UI2 C:U:G:A=0.9:3.9:1.0:1.0:1.1

(54) CpALäNll2pGpCpUpCpCpA II 11.9 0.86 0.96 0.71 0.31 aL,UI2 C:I.'G A 0.9:3 S 1.1.1.1:1 0

(55) CL2NH2pApGpCpUpCpCpA 92J 10.9 0.82 0.90 0.65 0.34 £l.2M!2 C:U:G:A=0.9:3.9:1.1:1.0:3.1

(56) UpUpCL2M '2pUpAp А 6' 8.7 0.84 0.80 0.43 0.13 ci.2ui2 U:A=1.1:3.0:2.1

(57) UpUpCL2NU2pUpApApA 5' 8.7 0.84 0.80 0.43 0.13 CL2N1 '2 U:A-1.2:3.1:3.0

(58) UpUpCL<iN"2pUpApApA 15-* 10.9 0.82 0.81 0.41 0.12 £l.6M 12 U:A=0.8:3.2:3.0

(59) C'2M12pApUpApApUpApU 5' 10.6 0.87 0.87 0.46 0.11 CI,UI2 U:A==0.7:3.2:4.2

(60) CL4NII2PApUpApApUpApU 6J 10.7 0.81 0.80 0.38 0.09 C'"tW12 U:A-0.8:3.0:4.2

(61) C'^pApUpApApUpApU 81 11.4 0.80 0.80 0.38 0.09 С'-вЫ12 U:A=0.8:3.1:4,2

(62) GpApApC1 <>K"2p ApUpAp А 12 s 12.7 0.85 0.78 0.40 0.13 СЦК112 U:A:G-1.0:1.1:4.7:1.3

(63) UpUpUpUpGpApApCL<>MI2 12w 11.4 0.84 0.82 0.46 0.16 cl.tKII2 U:A:G=1.0:4,0T.8:1.1

2 Синтез с использованием Ж-ацетилцитидина. 1 Отсутствует стадия обработки конц. N! L,011.

4 Синтез с использованием C5-Br-U-, С8-Вг-А-содержащего или универсального полимерного носителя (Glen Research).

5 Условия ферментативного гидролиза см. табл. 3.

U = -NII(CH2)2-, L, = -NH(CH2),-, L4 = -NH(CH2)4-, Ц = -NH(CH2)6- „ . . . ..

v v ■ Piic. 4. MALDI-TOF масс-спектры

, g аминосодержащих олигорибонуклео-

тидов:

A - UpCpUWpGpUpGpUpUpU (37),

расчетная [M+H]+ = 2829.5; Б - UpUpCpUWpApApA (45), расчетная [M+Hf =2208.3. MALDI-TOF REFLEX III (Bruker Daltonics, Германия). Данные получены Ковалем B.B.

-A- А.

-иг

Структура рада олнгонуклеотидов была дополнительно подтверждена методом MALDI-TOF масс-спсктрометрии (см., напр., рис. 4).

Разработанный ностсинтетический подход к химическому синтезу функциоиализиро-ванных по гетероциклическому основанию олигорибонуклеогидов дает возможность регламентировать количество модифицированных нуклеотидов, их тип и положение в цени; проводить ферментативные и химические манипуляции по свободным 5'- и 3'-концам рнбоолигомера; получать Br-содержащие олигорибонуклеотиды как самостоятельные фоточувствительные аналоги РНК для изучения РНК-белковых взаимодействий, для рентгеноструктурного анализа РНК и РНК-связывающих белков и т.д.; получать из одного Вг- или хлорфснилсодержащего олигомера-предшественника путем взаимодействия с различными бифункциональными нуклеофилами семейство олигорибонуклеогидов, отличающихся только строением функционального линкера.

Создаваемое при данном подходе функциональное разнообразие линкеров позволяет вводить в олигорибонуклеотиды группы различной химической природы и с различным типом действия: ковалеитносшивающис РНК-НК и РНК-белки, деградирующие ПК, стабилизирующие структуру IIK и др.

В данной работе возможности этого подхода продемонстрированы на примере синтеза новых типов фогоактивируе.мых рсакционносиособных производных олигорибонуклео-тидов.

4. Синтез и выделение олнгорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группировку в гетероциклических основаниях

Фотоактивируемыс производные олнгонуклеотидов широко используются при изучении НК-НК и ПК-белковых взаимодействий, играющих ключевую роль в целом ряде биологических процессов. Инертность фотоактивных группировок в широком диапазоне изменений химических условий в отсутствие света и высокая реакционная способность, возникающая при "включении" реагента путем облучения в нужный исследователю момент, являются неоспоримым преимуществом данного типа олигонуклеотид-ных производных. В качестве фотоактивиых групп весьма популярны ароматические азиды, обладающие высоким квантовым выходом фотомодификации (Schuster C.B. et al., 1992). Известно, что олнгодсзоксирибонуклеотиды, несущие остатки перфторарилазидов в различных положениях цени, способны модифицировать ДНК, РНК и взаимодействующие с ними белки (см., напр., Levina A.S. et al., ¡993; Коваль В.В. с соавт., 1997). Синтез аналогов РНК с введенными в заданное положение цепи модифицированными рибонуклеозидами, несущими фотоактивируемыс группы, позволяет получать инструменты для изучения РНК-белок или РНК-НК взаимодействий.

Ранее Л.Г.Веньяминовой с сотр. был синтезирован с использованием пресинтегиче-ского подхода аналог мРНК, содержащий инициирующий кодон AUG, в котором в С8-положепие адснозина через триметилендиаминовый линкер была введена перфторарила-зидная группировка (Репкоеа М.Н. с соавт., 1996). Данная работа является продолжением и развитием этих исследований.

Ацилирование незащищенных С5-аминоалкилуридин-, С8-амипоалкиладенозин- и N4-амипоалкнлцитидинсодержаших олигорибонуклеогидов (24-63) N-оксисукцшшмидным эфиром 4-азидотстрафгорбе1Войной кислоты в водно-органической среде проходило за 1.5 ч (схема 7).

(28-49) (C5-LNH2-U) (50-58) (C8-L„NH,-A) (59-67) (N4-L„NH2-C)

о f

OH * cr-p=o

cf-

pH 8.5

и

В' - незащищенное основание L.-NIKCI!,),.- о

n = 2,3,4,6 m - 3...11

ü

(6S-Í9) (C5-LnNHR-U) (90-98) (C8-L„NHR-A) (99-107) (N4-LnNHR-C)

Нерфторарилазидные производные олигонуклеотидйв (64-103) выделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход в реакции ацилирования, в расчете на исходный аминосодержа-щий олигонуклеотид, составлял 50-85 %.

Таблица 6. Выходы и характеристики олигорибонуклеотидов, содержащих нерфторарилззидную группу в гетероциклическом основании. _ ____ _ _

ЛЬ Олигорибонуклеотид Выход1 ,% Время удерживания, мин ЛЪ Олигорибонуклеотид Выход1 .% Время удерживания, мин

1 2 3 4 5 6 7 8

(64) U'-2NHKpApApA 82 11.0 (84) UpUpCpULz!"1KpApA 76 16.6

(65) U'^liRpUpUpUpUpU 60 108 (85) UpUpCpU LzMut рАрЛрА 60 17.7

(66) U'-2MiKpUpUpGpUpU 56 9.5 (86) A^m<pUpGpUpUpU 79 13.0

(67) ири"2мжрирсрири 84 18 0 (87) UpUpCpUpA^M1KApApApA 63 12.8

(68) UpUpUI2'NllKpGpUpU 75 18.4 (88) UpUpCpUpApA^^'pApApA 65 12.5

(69) UpUpUpGpU12м IKpU 52 11.6 (89) UpUpCpUpApApAL2,Mt'pApA 72 12.7

(70) UpUpUpGpUpUL2N"K 59 12.4 (90) UpUpCpUp ApApAp ALz,N1 u<pA 75 12.9

(71) UL2N'KpCpCpUpUpU 62 99 (91) UpUpCpUpApApApApAL2N'u< 67 12.4

02) UL2MwpCpUpGpUpUpU 74 10.4 (92) UpCpUpUpCpApGpAL2wu<pA 74 134

(73) CpApGpCpUL2NIpCpCpA 64 12.9 (93) CpAL2Mu< pCpCpUpCpCpA 56 13.2

(74) CpApGpCpULJN1pCpCpA 71 12 9 (94) C[)Al,niuí pGpCpUpCpCpA 65 13 5

(75) CpApGpCpUL'N,u< pCpCpA 70 14.2 (95) CL2M u<pApGpCpUpCpCpA 78 15.9

(76) UL2NílKpCpUpGpUpGpUpUpU 63 12.9 (96) UpUpC^'pUpApA 65 12.9

(77) UpCpU12N11KpGpUpGpUpUpU 67 12 6 (97) UpUpC^'^pUpApApA 68 13.0

(78) UL2M,KpCpUpCpUpCpGpUpGpUpUpU 62 13.4 (98) UpUpCL«t-UKpUpApApA 73 15.3

(79) UpUpCpCpU'-2NUK 72 12.3 (99) С L2Nlüí AUAAUAU 86 15.8

(80) UpUpCpApCpUL2f'"K 75 13.5 (100) cL4MIKauaauau 82 15.7

(81) UpUpUpApApCpUL2Nuií 67 12.0 (101) С Lf.'MU< AUAAUAU 85 16.4

(82) UpUpUpApApCpUpCpUL2N1"" 73 122 (102) GAACLoMU<AUAA 78 15.2

(83) UpUpUpApApCpUpCpUpCpCpU^"" 65 12.9 (103) UUUUGAAC 4wui 83 15.1

1 Выход после обращенно-фазовой ВЭЖХ в расчете на исходный аминосодержащий олигонуклеотид. L2 = -NH(CH2)2-, L, = -NH(CH2)j-, L, = -NH(C112)4-, U = -NH(CIIZ),,-, R = C(0)C6F4N3

Гомогенность синтезированных перфторарилазидных производных олигорибонуклеотидов составляла 90-99 % по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ; их выходы и характеристики приведены в табл. 6.

5. Свойства 4-азндотетрафторбензамидных производных олигорибонуклеотидов

В ходе выполнения работы была исследована способность олигорибонуклеотидов (РНК*) с введенными в гетероциклическое основание амино- и перфторарилазидогруп-пами образовывать комплементарные комплексы с ДНК- и РНК-мишепями.

При изучении термической стабильности ряда дуплексов (табл. 7, рис. 5) было показано, что введение аминолинкеров различной длины как в С5-положение уридина, так и в К4-положение цитидина, расположенных в середине цепи, практически не влияет на температуру плавления дуплексов ни в случае РНК-, ни в случае ДНК-мишени. При введении модификаций в С8-положение аденозина, близкого к 5-концу, температура плавления дуплексов понижается как в случае РНК-, так и в случае ДНК-мишени на 3-6 °С.

((I) б'-ТССАЭСТС

пли

(г) в'-исйдесис

" |_лнн

З'-АССиССАС

LlNHR

З'-АССиССАС З'-АССиСвАС З'-АССиССАС

(73)

(74)

(75)

(93)

(94)

Ьи=-МН(СНД,-п = 2, 3,4, 6

((1) 5'-АТАТТАТСТТСАААА

(г) 5'-АиА1)иАиСииСАААА

— цмнк

З'-иАиААиАС

ЦГЛЖ

З'-иАиААиАС З'-иАиААиАС З'-ААиАСААЗ

З'-СААСииии

(99)

(100) (101) (102) (103)

(59)

(60) (61) (62) (63)

Рис. 5. Структуры дуплексов, образованных модифицированными октарибонуклеотидами с комплементарными олигонуклеотидами.

Таблица 7. Температуры плавления (°С) дуплексов, образованных модифицированными октарибонуклеотидами с комплементарными олигонуклеотидами 5'-г(ШСАОСиО) и 5'-(1(ТСОАОСТС); 5'-г(АиАииА1ЮШСАААА) и

Аминосодержащие олигонук-леотиды РНК ДНК Фотореагенты Р11К ДНК

3'-АССи^"2СОАС (33) 55 38 3'-АСС11ь2ы|ц("ьЛ*<СОАС (73) 49 30

3'-АССи4м12СОАС (34) 56 38 3'-АССи4ы|С|,|Н''ЛсСАС (74) 49 31

З'-АССи'-^ССАС (35) 55 38 3'-АССи1'^1"-""с'''<^зСОАС (75) 50 31

3'-АССиСОА^'гС (53) 49 33 3'-АССиСОА1-^"ч1"с<>''чмзС (93) 48 28

З'-АССиСОА^'^С (54) 51 35 3'-АССиСОА4~"чи|с|5''ЛС (94) 46 29

З'-АССиССАС (К) 55 38

З'-илиАЛилС-г^'1: (59) 17 13 3'-илиАА11АС 1*2Гч1 'С(ОК:<>1'4нз (99) 8 8

З'-иАиААиАС 1'4ГчИ2 (60) 21 15 З'-иАиААиАСь4ГчИС<и)Сб1'4нз (100) 9 9

З'-иАиААиАС1^"* (61) 16 13 З'-иАиААиАСЦмк-<°|Ч|'4мз (101) 11 8

З'-АЛиАС^'^ААС (62) 35 24 3,-ААиАС1''№'1-1"к'Ли5ААО (102) 22 16

З'-С ААСииии (63) 20 13 3'-С^"с,"^^'АЛСииии (103) 17 6

З'-иАиААиАС (К,) 20 15

З'-ААиАСААО (К,) 36 26

З'-СААСииии (К3) 23 12

Ц = -ЫН(СН2)2-, Ь, - -ЫН(СН2)3-, Ц = -ЫН(СН2)4-, Ц = -ЫН(СН2)6-;

Условия: 0.1 М №С1,10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ№гЕОТЛ; концентрации олигонуклеотидных компонентов 1.310"5 М; длина волны 270 нм; скорость нагрева 0.7-1 С/мин. Дифференциальные кривые термической денатурации получены Пышным Д.В.

Введение перфторарилазидной группировки (табл. 7) приводит к понижению температуры плавления дуплексов в случае ДНК-мишепи на 5-8 °С, а в случае РНК-мишени в пределах 1-13 °С в зависимости от модифицированного основания и длины линкера. Это

можно объяснить "объемностью" перфторарилазидной группы и ее большей пространственной заторможенностью.

Следует также отметить, что все исследованные нами дуплексы РНК-РНК*, содержащие как амино-, так и 4-азидотетрафторбензамидную группировки в С5-положении ури-дина и С8-положении аденозина, были существенно стабильнее соответствующих гибридных ДНК-РНК* дуплексов (разница в температурах плавления составляла 16-21 °С). При введении модификации в Ш-положение цитидина температура плавления РНК-РНК* и ДНК-РНК* дуплексов отличалась на 1-11 °С.

На заключительном этапе работы была продемонстрирована возможность использования новых фотоактивируемых конъюгатов олигорибонуклеотидов для сайт-направленной модификации РНК и ДНК. В качестве мишеней были выбраны эйкоза- и пентадеканукле-отиды рибо- и дезоксирибо-ряда с одинаковой последовательностью оснований, а в качестве реагентов - 4-азидотетрафторбензамидные производные октарибонуклеотидов (7375, 93, 94, 99-103) (рис. 6).

5"-*рТСССТОСАССТОСТТСАТСС-3' (с1)

или

5'-*риСССиССАССиССииЭА1ЮС-3' (г)

I. ин«

(73) З'-АССиСвАС

1

ю

15

(74)

(75)

(93)

(94)

З'-АССиССАС

цмнн З'-АССиССАС

З'-АССиСвАС

ЦЫНЯ

З'-АССиССАС

Ц*-МН(СН2)„-п =2, 3.4,6

5'-*рАТАТТАТСТТСАААА

или

5'-*рАиАииА1ЮииСАААА

цыня

З'-иАиААиАС' <")

Ь/.'НВ

З'-иАиААиАС (ЮО)

ЦИНР

З'-иАиААиАС <101)

1_6мнр

З'-ААиДСААС (1Ю)

1_6мнр!

З'-СААСииии (103)

юнтныо аддукты, %

III и

(73) (74) (75] (93) (94) (99) (100) (101) (102) (103)

Рис. 6. Модельные системы для сайт-направленной фотомодификации и ковалентные аддукты, образуемые с РНК и ДНК реагентами (73-75, 93, 94, 99-103), несущими перфторарилазидогруппы в гетероциклических основаниях. Условия облучения: 5 °С, 10 мин, 5-10 4Втсм"2, 303-365 нм; буфер 0.1 М ЫаС1, 1мМ №гЕШ'А, 0.01 М Трис-НС1 (рН 7.2); [мишень] М0'7М, [реагент] М0'5М

Таблица 8. Фотомоди(

>икация рибо- и дезоксирибо-мишеней реагентами (73-75, 93, 94, 99-103)

РНК-мишень ДНК-мишень РНК-мишень ДНК-мишень

Ковалентные Ковалент- Скрытая Общая Ковалентные Ковалент- Скрытая Общая

Реагент аддукты, % ные модифи- модифи- Реагент аддукты, % ные аддук- модифи- модифи-

аддукты,% кация, % кация, % ты, % кация, % кация, %

<,73) 10 8 5 13 (99) 56 27 28 55

(74) 11 14 5 19 (100) 54 27 25 52

(75) 15 28 7 35 (101) 58 34 19 53

(93) 14 33 13 46 (102) 25 11 38 49

(94) 21 39 12 51 (103) 55 35 25 58

Условия облучения см. рис. 6. 16

При анализе реакционных смесей с помощью гель-электрофореза в 20 %-ном ПААГ после фотомодификации мишеней реагентами (73-75, 93, 94, 99-103) наряду с полосой, соответствующей по подвижности исходной мишени, как в случае РНК, так и в случае ДНК наблюдаются продукты фотосшивки (ковалентные аддукты) с меньшей электрофо-ретической подвижностью. При увеличении длины линкера (от п=2 до п=6), а, следовательно, и "свободы действия" для перфторарилазидогруппы, в случае реагентов (73-75) и (83, 84) количество ковалентных аддуктов увеличивается, в то время как для реагентов (99-101) оно практически не меняется (рис. 6, табл. 8). Для реагентов серии (101-103) в случае, когда перфторарилазидогруппа находится у цитидина в середине цепи (102), количество ковалентных аддуктов существенно меньше, чем когда перфторарилазидогруппа находится у цитидина на 5'- или З'-конце цепи (101,103).

Для получения информации о позиционной направленности фотомодификации ДНК-мишени реакционные смеси после облучения обрабатывали пиперидином, при этом происходило расщепление мишени по модифицированным сайтам. Позиционную направленность ковалентных аддуктов и скрытой модификации при фотомодификации ДНК-мишени (рис. 7) определяли после обработки пиперидином фракции, соответствующей по подвижности ковалентным аддуктам и исходной мишени, соответственно, и рассчитывали "истинную" степень модификации по данному основанию.

6 7 9 11 12 19

5'-ТСССТССЛССТССТТСАТСС

7 8 9 10

5,-АТАТТЛТСТТСАААА

Позиционная направленность ковалентных аддуктов

В (73) а (74) □ (75) а (93) И (94)

Ж

% Позиционная направленность "скрытой" модификации ДНК-мишени

□ (73) В (74) И (75)

□ (93) И (94)

1

019 Т18 С12 Т11 69 а ее Т6 С4

Позиционная направленность

□ (99) В (100) 0(101) а (102)

□ (103)

Позиционная направленность "скрытой" модификации ДНК-мишени

0(99) В (100) 0(101) 0(102) И (103)

Рис. 7. Позиционная направленность ковалентных аддуктов (А) и "скрытой" модификации (Б) ДНК-мишени для реагентов (73-75, 93, 94) и (99-103), несущих перфторарилазидогруппу в гетероциклических основаниях.

В случае ковалентных аддуктов наряду с расщеплением мишени по модифицированным сайтам (т.н. щелочелабильные аддукты) для реагентов (93, 94) и (99-103) наблюдается значительное количество продуктов "сшивки" (от 30 до 45 % от общего числа ковалентных аддуктов), не подвергающихся расщеплению (т.н. щелочестабильные аддукты.

(Б)), при этом также происходит либо частичная регенерация исходной мишени, либо образование продуктов, совпадающих по подвижности с исходной мишенью. При обработке пиперидином исходной мишени обнаруживается "скрытая" модификация, т.е. модификация, не приводящая к ковалентному связыванию олигопуклсотида с мишеныо. В случае реагентов (73-75) и (93, 94) основным положением при модификации мишени, приводящей к образованию щелочелабильных продуктов, является пространственно близко расположенный к реакционноспособной группе остаток в9 и 012, соответственно. При этом при уменьшении длины линкера (п=6, 3, 2) несколько увеличивается "направленность воздействия" на 09 и 012. Для реагентов (99-101, 103), содержащих модифицированный цитидин на концах цепи, основным положением при модификации мишени, приводящей к образованию щелочелабильных продуктов, является остаток 08, по которому также проходит и основная "скрытая" модификация. В случае реагента (102), содержащего модифицированный цитидин в середине цени, "скрытая" модификация более чем в три раза превышает количество ковалентных аддуктов и проходит по основаниям Т10, Т9 и 08. Для реагентов, содержащих модифицированный аденозин, "скрытая" модификация затрагивает основания Т18 и Т11 в равной степени (~ по 5 %) в случае реагента (94), а для реагента (93) с коротким линкером преимущественно модифицируется основание Т11 (8 %). Для реагентов, содержащих модифицированный уридин, "скрытая" модификация по каждому положению не превышает 5 %.

Таким образом, впервые показано, что производные олигорибонуклеотидов, содержащих перфторарилазидную группу в гетероциклическом основании, способны к комгше-ментарно-адресованной фотомодификации НК.

Полученные в данной работе результаты по синтезу и применению фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов в сочетании с данными, полученными при использовании этих реагентов для определения нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, формирующих мРНК-связывающий центр рибосом человека (Карпова Г.Г. с соавт., 20002008 гг.), позволяют утверждать, что созданы новые фоточувствительные аналоги РНК, являющиеся перспективными фотоаффинными реагентами для исследования процессов, основанных на РНК-НК или РНК-белковых взаимодействиях.

Выводы

Разработан метод синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих алифатические аминолин-керы в гетероциклических основаниях урндина, адепозина и цитидина:

а) синтезированы новые модифицированные синтоны - 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранил-З'-Н-фосфонаты С5-бромуридина, С8-бромаденозина, С8-бромгуанозина и 04-(4-хлорфенил)уридина;

б) разработан метод твердофазного Н-фосфонатного синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих С5-бромуридин, С8-бромаденозин и С8-бромгуанозин в заданных положениях цепи;

в) разработан метод получения С5-аминоалкилуридин- и С8-аминоалкиладенозинсодержащих олигорибонуклеотидов исходя из их бромсодержащих олигомерпых предшественников;

г) разработан твердофазный метод синтеза Ж-аминоалкилцитидинсодержащих олигорибонуклеотидов с использованием 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранил-04-(4-хлорфенил)уридин-3'-Н-фосфоната.

2. Впервые получены фотоактивируемые конъюгаты олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группировку в С5-ноложении уридина, С8-положении аденозипа и Ш-положении цитидина.

3. Изучены свойства новых перфторарилазидных производных олигорибонуклеотидов:

а) исследована термическая стабильность дуплексов модифицированных олигорибонуклеотидов с ДНК и РНК. Показано, что введение аминолинксров различной длины в гетероциклические основания рибонуклеозидов, расположенных внутри цепи, практически не влияет на Тпл дуплексов, в то время как функционализация концевых рибонуклеозидов приводит к некоторой дестабилизации дуплекса. Введение 4-азидотетрафторбензамидной группы в С5-, С8- и Ш-положения рибонуклеозидов понижает Тпл дуплексов независимо от положения нуклеозида в цепи. Наибольшая дестабилизация наблюдается для реагента, содержащего фотогруппу в М-положении цитидина, расположенного в середине цепи;

б) впервые проведено сравнительное изучение комплементарно-адресованной модификации модельных РНК и ДНК-мишеней производными олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группу в С5-положении уридина, С8-положении аденозипа и Ш-положснии цитидина. Показано, что степень модификации РНК и ДНК зависит от расположения модифицированного нуклеотида в цепи и длины линкера. Определена позиционная направленность фотомодификации ДНК-мишени и показано, что основным сайтом модификации, приводящей к ковалентным аддуктам, является остаток гуанина, расположенный рядом с фотоактивной группой и находящийся в дуплексе.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Репкова М.Н., Иванова Т.М., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г. Н-Фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов, содержащих модифицированные основания // Биооргаи. химия. - 1998. - Т. 24. - С. 471-473.

2. Репкова М.Н., Иванова Т.М., Комарова П.И., Мещанинова М.И., Кузнецова М.А., Веньяминова А.Г. Н-Фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов, содержащих модифицированные основания. 1. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов с пер-фторарилазидными группами в гетероциклических основаниях // Биоорган, химия. -1999.-Т. 25.-С. 690-701.

3. Репкова М.Н., Мещанинова М.И., Иванова Т.М., Комарова Н.И., Пышный Д.В., Веньяминова А.Г. Олигорибонуклеотиды, содержащие аминоалкильную группу при N(4) ци-тозина, как предшественники новых реагентов для сайт-специфической модификации биополимеров // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2002. - С. 1104-1107.

4. Repkova М., Meschaninova М., Pyshnyi D., Venyaminova A. Oligoribonucleotides with functionalized nuclcobases as new modifiers of biopolymers // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2003. - V. 22. - P. 1509-1512.

5. Repkova M., Meschaninova M., Venyaminova A. New photoreactive oligoribonucleotide conjugates: hybridization and modification assays //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. -2004.-V. 23.-P. 969-975.

6. Мещанинова М.И. Новые фотоактивируемые аналоги мРНК- реагенты для модификации биополимеров // Актуальные проблемы современной пауки: Тр. 1-го Международного форума (6-й Международной конференции молодых ученых и студентов). Естественные науки. 4.45: Доп. сборник. / Науч.ред. А.С.Трунин, Д.В. Зипаев. Самара. - 2005. -С. 144-146.

7. Молотков М. В., Грайфер Д. М., Попугаева Е. А., Булыгин К. Н., Мещанинова М. И., Веньяминова Л. Г., Карпова Г. Г Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с З'-стороны от кодона в Л-участке // Биооргап. химия. - 2007. - Т. 33. - С. 431-441.

Подписано к печати «9» октября 2009 г. Формат бумаги 60x84, 1/16. Тираж 120 экз. Заказ № 18 Отпечатано «Нонпарель», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 330-26-

Содержание

Список принятых сокращений и обозначений

Введение

1. Функционализация гетероциклических оснований олигонуклеотидов с 9 целью создания реагентов для селективного воздействия на биополимеры (обзор литературы)

1.1. Функционализация гетероциклических оснований олигонуклеотидов

1.1.1. Экзоциклические аминогруппы гетероциклических оснований

1.1.1.1. Ж-Положение цитозина

1.1.1.2. Н2-Положение гуанина и Кб-положение аденина

1.1.2. С5-Положение пиримидинов

1.1.3. С8-Положение пуринов '

1.2. Производные олигонуклеотидов с реакционноспособными группами 37 в гетероцикле как инструменты селективного воздействия на биополимеры

1.2.1. Алкилирутощие производные олигонуклеотидов

1.2.2. Фотоактивируемые производные олигонуклеотидов

1.2.3. Реагенты для расщепления НК

Синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (НК), содержащие модифицированные звенья с группировками различной химической природы, широко применяются для изучения закономерностей НК-НК и НК-белкового узнавания, структурной топографии активных центров белков и сложных рибонуклеопротеидных комплексов, таких как рибосома, в антисмысловой биотехнологии, а также для создания на их основе диагностических систем и потенциальных терапевтических препаратов с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами [1-8]. Особый интерес среди аналогов НК вызывают их производные, содержащие активные группировки, способные к образованию ковалентных связей с реакционноспособными группами биополимеров. Разработка методов направленного введения таких группировок в НК является актуальным направлением исследований в современной биоорганической химии. Одним из основных требований при конструировании и применении аналогов НК, содержащих активные группировки, является минимальное искажение структуры НК и их комплексов с белками и нуклеиновыми кислотами в процессе взаимодействия. Весьма удобным, на наш взгляд, вариантом модификации олигонуклеотидов является модификация гетероциклических оснований (см., напр., обзоры [9-12]).

Химические методы синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по гетероциклическому основанию, позволяют регламентировать количество введенных модифицированных нуклеозидов, их тип и расположение в цепи. Учитывая простоту и экономичность синтетического цикла Н-фосфонатного метода, мы решили использовать этот метод для синтеза модифицированных олигорибонуклеотидов.

Целью данной работы являлась разработка метода синтеза олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях и создание на их основе новых фотоактивируемых реагентов для аффинной модификации биополимеров.

В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи: ■ разработать методы синтеза модифицированных нуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих в гетероциклических основаниях функциональные группы-предшественники ; разработать метод твердофазного Н-фосфонатного синтеза олигорибонуклеотидов-предшественников; разработать метод получения олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях, исходя из олигомеров-предшественников; синтезировать фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группировку в гетероцикле, и изучить свойства полученных конъюгатов.

Можно было ожидать, что в результате выполнения этих задач будут созданы новые перспективные фотоактивируемые реагенты для исследования процессов, основанных на РНК-НК или РНК-белковых взаимодействиях.

1. Функцнонализация гетероциклических оснований олнгонуклсотидов с целью создания реагентов для селективного воздействия на биополимеры (обзор литературы) '

В настоящее время конъюгаты олигонуклеотидов с группировками различной химической природы широко используются в молекулярной биологии, биотехнологии, фундаментальной медицине и других областях исследований (см., напр., обзоры [46,8,13,14]). Зачастую эти группировки не могут быть напрямую присоединены к функциональным группам НК (экзоциклическим аминогруппам, концевым фосфатам и др.), поэтому весьма актуальным является получение РНК и ДНК, имеющих в своем составе дополнительные функциональные группы, позволяющие присоединение этих заместителей. Т.о. задачу по синтезу модифицированных олигонуклеотидов можно условно разделить на две части: введение функциональных линкеров и введение различных группировок с использованием этих линкеров.

Функционализировать олигонуклеотиды можно по концевым и межнуклеотидным фосфатам, по 5'- и З'-гидроксилам, по 2'-положению рибозы, а также по гетероциклическим основаниям. Активная группировка, присоединенная к гетероциклическому основанию посредством линкера, может быть пространственно приближенной к комплементарной цепи НК-мишени или определенному центру в белке и, в силу этого, может оказывать четко локализованное воздействие. Химические методы синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по гетероциклическому основанию, позволяют регламентировать количество введенных модифицированных нуклеозидов, их тип и расположение в цепи.

В первой части обзора описаны методы введения в различные положения гетероциклических оснований олигонуклеотидов функциональных групп-предшественников, позволяющих дальнейшее присоединение группировок, способных взаимодействовать с биополимерами. Во. второй части будут рассмотрены несколько типов реакционноспособных производных олигонуклеотидов: фотоактивируемые реагенты, алкилирующие реагенты, а также реагенты для расщепления НК.

выводы

1. Разработан метод синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих алифатические аминолинкеры в гетероциклических основаниях уридипа, аденозина и цитидина: а) синтезированы новые модифицированные синтоны - 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранил-З'-Н-фосфонаты С5-бромуридина, С8-бромаденозина, С8-бромгуанозина и 04-(4-хлорфенил)уридина; б) разработан метод твердофазного Н-фосфонатного синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих С5-бромуридин, С8-бромаденозин и С8-бромгуанозин в заданных положениях цепи; в) разработан метод получения С5-аминоалкилуридин- и С8-аминоалкиладенозинсодержащих олигорибонуклеотидов исходя из их бромсодержащих олигомерных предшественников; г) разработан твердофазный метод синтеза Ы4-аминоалкилцитидинсодержащих олигорибонуклеотидов с использованием 5'-0-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранил-04-(4-хлорфенил)уридин-3'-Н-фосфоната.

2. Впервые получены фотоактивируемые конъюгаты олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группировку в С5-положении уридипа, С8-положении аденозина и Ж-положении цитидина.

3. Изучены свойства новых перфторарилазидных производных олигорибонуклеотидов: а) исследована термическая стабильность дуплексов модифицированных олигорибонуклеотидов с ДНК и РНК. Показано, что введение аминолинкеров различной длины в гетероциклические основания рибонуклеозидов, расположенных внутри цепи, практически не влияет на Т„л дуплексов, в то время как функционализация концевых рибонуклеозидов приводит к некоторой дестабилизации дуплекса. Введение 4-азидотетрафторбензамидной группы в С5-, С8- и Ы4-положения рибонуклеозидов понижает Тги дуплексов независимо от положения нуклеозида в цепи. Наибольшая дестабилизация наблюдается для реагента, содержащего фотогруппу в Ж-положении цитидина, расположенного в середине цепи; б) впервые проведено сравнительное изучение комплементарно-адресованной модификации модельных РНК и ДНК-мишеней производными олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбензамидную группу в С5-положении уридина, С8положении аденозина и Ы4-положении цитидина. Показано, что степень модификации РНК и ДНК зависит от расположения модифицированного нуклеотида в цепи и длины линкера. Определена позиционная направленность фотомодификации ДНК-мишени и показано, что основным сайтом модификации, приводящей к ковалентным аддуктам, является остаток гуанина, расположенный рядом с фотоактивной группой и находящийся в дуплексе.

1.3. Заключение

Суммируя данные, приведенные в разделах 1.1 и 1.2, можно утверждать, что направленное введение активных, в том числе и фотореакциониоспособных, группировок в гетероциклические основания олигонуклеотидов через функциональные линкеры оптимального строения позволяет создавать реагенты, способные выступать в качестве инструментов для решения различных задач в области молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины.

2. Синтез н свойства олигорибонуклеотидов, содержащих ' амино- и перфторарилазидобензамидные группы в гетероциклических основаниях (результаты и обсуждение)

Целью данной работы являлась разработка твердофазного Н-фосфонатного метода синтеза олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях и создание на их основе новых фотоактивируемых реагентов для аффинной модификации биополимеров.

Как уже говорилось выше, известны два основных подхода к функционализации гетероциклических оснований олигонуклеотидов. Пресинтетический подход основан на использовании на определенной стадии олигонуклеотидного синтеза премодифицированных синтонов, уже содержащих линкер с защищенной функциональной группой, "обнажение" которой может происходить либо отдельно, либо одновременно с удалением всех защитных групп с олигонуклеотида. Постсинтетический подход основан на использовании на определенной стадии олигонуклеотидного синтеза модифицированных синтонов, имеющих в нужном положении гетероцикла "уходящую" группу, заменяемую на функциональный линкер уже в составе олигомера. Как видно из обзора литературных данных, постсинтетический подход, хотя и обладает рядом преимуществ, но применяется достаточно редко и в основном для введения функциональных линкеров по экзоциюшческим аминогруппам пуринов и цитозина в составе олигонуклеотидов, полученных с использованием фосфигамидного метода синтеза (см., напр., [63,64,188]).

Мы выбрали постсинтетический подход, который позволяет получать из одного олигонуклеотида-предшественника серию олигомеров, отличающихся лишь строением линкера либо активной группировкой.

Учитывая простоту и экономичность синтетического цикла Н-фосфонатного метода, мы решили использовать этот метод для синтеза модифицированных олигорибонуклеотидов. Функционализация гетероциклических оснований олигорибонуклеотидов с использованием постсинтетического подхода в рамках твердофазного Н-фосфонатного метода в литературе не описана.

Нашей первой задачей было разработать методы синтеза модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих "уходящие" группы в гетероциклических основаниях.

2.1. Синтез и свойства модифицированных нуклеозидов

Атомы водорода в С5-/С8-положениях нуклеозидов не участвуют в образовании Уотсон-Криковских взаимодействий, поэтому возможно введение модификаций по этим положениям без существенного изменения свойств олигонуклеотида. В качестве "уходящей" группы для этих положений, на наш взгляд, наиболее удобны атомы галоидов, поскольку они удовлетворяют требованиям, предъявляемым к "уходящим" группам: простота получения соответствующих мономерных синтонов; стабильность в процессе синтеза; мягкие условия замены "уходящей" группы на другие группировки. Галоидсодержащие олигонуклеотиды могут служить не только олигонуклеотидами-предшественниками, но и выступать в качестве самостоятельных инструментов в молекулярной биологии для "фотосшивания" с ДНК- и РНК-связанными белками, для изучения механизмов действия ряда ферментов, для стабилизации триплексов, в рентгеноструктурных исследованиях НК и НК-связывающих белков, как нерадиоактивные метки, как антисенс-олигонуклеотиды и т.д. (см., напр., [19] и цит. там работы). Из галоидов наиболее привлекательным в качестве "уходящей" группы является атом брома.

Br-Содержащие нуклеозиды (88-91) были получены в результате взаимодействия нуклеозидов с бромом в различных условиях по [265-268], причем в случае уридина и гуанозина реакция проходила в бромной воде, а для аденозина и цитидина требовались кислые условия (схема 1). Строение полученных бромсодержащих рибонуклеозидов подтверждали элементным анализом.

Схема 1 о о о

C5-Br-U (88) но он но он но он но он

NH.

NH.

NH.

Далее необходимо было выяснить стабильность бромсодержащих нуклеозидов в процессе олигонуклеотидного синтеза. Судя по литературным данным, атом брома в гетероциклическом основании остается инертным ко всем реагентам, используемым в ходе твердофазного синтеза, однако последующее деблокирование экзоциклических аминогрупп и удаления олигонуклеотида с полимера с помощью конц. NHjOH в жестких условиях может приводить к получению аминопроизводных олигонуклеотидов (см., напр., [264]). Мы исследовали степень сохранности модельных бромсодержащих рибонуклеозидов C5-Br-U (88), C8-Br-G (89), C8-Br-A (90), C5-Br-C (91) при выдерживании в условиях, используемых при деблокировании олигонуклеотидов (конц. ИН40Н:этанол (3:1), 16 ч, 55 °С или 3 сут, комнатная температура). В качестве контроля использовали специально синтезированные аминосодержащие рибонуклеозиды-маркеры C5-NH2-U, C8-NH2-G, C8-NH2-A, C5-NH2-C. По данным аналитической ОФХ (рис. 1), при повышенной температуре (55 °С) C8-Br-G (89) остается неизменным, в случае C5-Br-U (88) наблюдается образование до 7 % C5-NH2-U, а в случае С8-В1--А (90) и С5-Вг-С (91) -около 30 % C8-NH2-A и C5-NII2-C, соответственно и до 60 % неидентифицированных продуктов. При обработке конц. NH4OH при комнатной температуре наблюдали образование около 1 % C5-NH2-U, 3 % C8-NH2-A, а в случае С5-Вг-С - около 5 % C5-NH2-С и 15 % неидентифицированных продуктов. На основании этих данных для синтеза олигонуклеотидов, содержащих модифицированный цитидин, было решено использовать подход, в котором в качестве модифицированного синтона выступает 04-(4-хлорфенил)уридин (по аналогии с [64]).

Синтез 04-(4-хлорфенил)уридина (04-ClPh-U) (92) (схема 2) проводили по [64] в несколько стадий через 2',3',5'-триэтилсилил(ТЕ8)-защищенный уридин, который реагировал сначала с TPS-C1, а затем с 4-хлорфенолом, давая TES-защищенный 04-(4-хлорфенил)уридин (схема 2). Удаление триэтилсилильных защит проводили действием

Схема 2 iPr О О

04-ClPh-U (92) но но

CH,C00H/THF/H,0 но он

Et.SiO OSiEt.

Et.biO OSlHl, но он

El.SiO О ЫН.

TPS-CI - триизопропилбснзолсульфохлорид уксусной кислоты в смеси тетраги дрофу ран/вода. Все реакции проходили с хорошими выходами (80-95 %).

А 260

10 15 20 25 мин

3 сут, комнатная температура

3) (2}

1)

UBl X X X о 5 10 15 20 25 мин

А 260 модифицированные нуклеозиды-маргары

CNH, сВг иВг anH1 GBr дВг

JM1 х X

10

15

20 25 мин

Рис. 1. Аналитическая ОФХ реакционных смесей после обработки модифицированных нуклеозидов конц. МН4ОН:этанол (3:1):

1) - C5-Br-U (1), (2) - С8-Вг-А (3). (3) - С5-Вг-С (4). (4) - С5-Вг-Г, (2). С = С5-ВГ-С, иВг = C5-Br-U. GBr = C8-Br-G, АВг = С8-Вг-А. Сш = C5-NH2-C, Vm2 = C5-NH2-U, АШ2 = C8-NH2-A, * = неидентифицированные продукты. условия хроматографии см. в "Экспериментальной части").

Получение модифицированных нуклеозидов (88-92) в препаративных количествах позволило перейти к следующему этапу нашей работы.

2.2. Синтез модифицированных нуклеозид-З'-Н-фосфонатов

Следующим этапом работы был синтез модифицированных Мр'Д'-защищенных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов.

Схемы синтеза Ыр'Д'-защищенных нуклеозид-Н-фосфонатов (93-96), содержащих атом брома или 4-хлорфенильную группировку в гетероциклических основаниях, приведены на схеме 3. Использование "транзитной" 1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксан-1,3-диильной защитной группы Марковича [269] позволило временно блокировать 3'- и 5-гидроксилы бромсодержащих нуклеозидов для введения тетрагидропиранильной защитной группы в 2'-положение рибозы. Реакция проходила в пиридине с высоким выходом (85-95 %). Взаимодействие 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-5-бромуридина (93а), 3',5'-0тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-Ы2-изобутирил-8-бромгуанозина (946), 3',5'-0-('1етраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-8-бромаденозина (95а) или 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-04-(4-хлорфенил)уридина (96а) с 3,4-дигидро-2Н-пираном приводило к получению, соответственно, 2,-0-тетрагидропиранил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-5-бромуридина (936), 2'-0-тетрагидропиранил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-К2-изобутирил-8-бромгуанозина (94в), 2'-0-тетрагидропиранил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-8-бромаденозина (956) и 2'-0-тетрагидропиранил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-04-(4-хлорфенил) уридина (966), со средним выходом около 65 %. Экзоциклические аминогруппы гуанозина и аденозина защищали изобутирильной и бензоильной группами, соответственно, при этом с целыо улучшения растворимости гуанозина защиту вводили на первой стадии с получением Н2-изобутирил-8-бромгуанозина (94а). В случае 8-бромаденозина бензоилирование проводили после введения тетрагидропиранильной группы с получением производного (95в). Удаление TIPDSi-защигы происходило при помощи фторид-иона за 1.5 ч при 60 °С с образованием модифицированных защищенных 2'-0-тетрагидропиранил-5-бромуридина (93в), 2'-0-тетрагидропиранил-Н2-изобутирил-8-бромгуанозина (94г), 2'-0-тетрагидропиранил-Ы6-бензоил-8-бромаденозина (95г) и 2'-0-тетрагидропиранил-04-(4-хлорфенил)уридина (96в). о n

После введения диметокситритильной группы по 5-гидроксилу были получены модифицированные N-защищенные 5'-0-диметокситритил-2'-0тетрагидропиранилрибонуклеозиды (93г, 94д, 95д и 96г), которые при взаимодействии с триимидазолидом фосфора давали соответствующие модифицированные N-ацил-З'-О-диметокситритил-2'-0-тетрагидропиранилнуклеозид-3'-Н-фосфонаты (93-96). Строение всех полученных новых соединений-предшественников подтверждали методами протонного магнитного резонанса и элементного анализа (см. раздел 3.3.2.1). Строение новых Н-фосфонатов было доказано методами 31Р-ЯМР и ESI-масс-спектрометрии (табл. 1).

1. Гринева Н. И., Карпова Г. Г. Комплементарно адресованное алкилирование рнбосомной РНК алкилирующнми производными олигонуклеотидов. // Молекуляр. биология. 1974. Т. 8. № 6. С. 832-844.

2. Кнорре Д. Г., Кудряшова Н. В., Лаврик О. И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции. // Успехи химии. 1998. Т. 67. № 5. С. 486-502.

3. Добриков М. И. Сайт-специфическая фотосенсибилизированная модификация нуклеиновых кислот бирадикальными и электрофильными реагентами. // Успехи химии. 1999. Т. 68. № 11. С. 1062-1079.

4. Грайфер Д. М., Карпова Г. Г., Кнорре Д. Г. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК. // Биохимия. 2001. Т. 66. № 6. С. 725-744.

5. Lavrik О. I., Khodyreva S. N. Photoaffinity probes in molecular biology of DNA replication and DNA repair. // Chemical probes in biology. / Ed. Schneider M. P. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 193-205.

6. Venkatesan N., Kim В. H. Peptide Conjugates of Oligonucleotides: Synthesis and Applications. // Chem. Rev. 2006. V. 106. № 9. P. 3712-3761.

7. Niittymaki Т., Lonnberg H. Artificial ribonucleases. // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. № 1. P. 15-25.

8. Lutz J.-F., Zarafshani Z. Efficient construction of therapeutics, bioconjugates, biomaterials and bioactive surfaces using azide-alkyne "click" chemistry. // Adv. Drug Del. Rev. 2008. V. 60. № 9. P. 958-970.

9. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. // Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. № 3. P. 165-187.

10. Beaucage S. L., Iyer R. P. The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives. //Tetrahedron. 1993. V. 49. № 10. P. 1925-1963.

11. Manoharan M. Designer antisense oligonucleotides: conjugation chemistry and functionality placement. // Antisense research and applications. / Eds. Crooke S. T. and Lebleu B. Boca Raton; Ann Arbor; London; Tokyo: CRC Press, 1993. P. 303-349.

12. Сильников В. H., Власов В. В. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот. // Успехи химии. 2001. Т. 70. № 6. С. 562580.

13. Ferentz A. E., Verdine G. L. The convertible nucleoside approach: structural engineering of nucleic acids by disulfide cross-linking. // V. 8. Nucleic acids and molecular biology. / Ed. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 1994. P. 13-40.

14. Андыпович С. И., Орецкая Т. С. Двуспиральные нуклеиновые кислоты с ковалентно связанными цепями синтез и применение в молекулярной биологии. // Успехи химии. 1998. Т. 67. № 3. С. 274-293.

15. Качалова А. В., Зубин Е. М., Орецкая Т. С. Методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки. // Успехи химии. 2002. Т. 71. № 12. С. 1173-1192.

16. Lyttle М. Н., Walton Т. A., Dick D. J., Garter Т. G., Beckman J. H., Cook R. M. New reagents and methods for the synthesis of internal and З'-labeled DNA. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. №5. P. 1146-1154.

17. Шефлян Г. Я., Кубарева Е. А., Громова Е. С. Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. // Успехи химии. 1996. Т. 65. № 8. С. 765-781.

18. Knorre D. G., Vlassov V. V., Zarytova V. F., Lebedev A. V., Fedorova O. S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. Boca Raton; Ann Arbor; London; Tokyo:CRC Press, 3994.

19. Каневский И. Э., Кузнецова С. А. Получение реакционноспособных производных нуклеиновых кислот и их использование для исследования структуры и функций биополимеров. // Успехи химии. 1998. Т. 67. № 7. С. 688-704.

20. Herdewijn P. Heterocyclic modifications of oligonucleotides and antisense technology. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000. V. 10. № 4. P. 297-310.

21. Карпова Г. Г. Химические аспекты комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот. // Известия СО АН СССР. Сер. химическая. 1987. Т. 12. № 4. С.82-95.

22. Кнорре Д. Г., Зарытова В. Ф., Бадашкеева А. Г., Федорова О. С. (1991), Итоги науки и техники. Биотехнология. ВИНИТИ, М., Vol. 31.

23. Englisch В. U., Gauss D. Н. Chemically modified oligonucleotides as probes and inhibitors. //Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991. V. 30. № 6. P. 613-722.

24. Sylvers L. A., Wower J. Nucleic acid-incorporated azidonucleotides: probes for studying the interaction of RNA or DNA with proteins and other nucleic acids. // Bioconjugate Chem. 1993. V. 4. №4. P. 411-419.

25. Luyten I., Herdewijn P. Hybridization properties of base-modified oligonucleotides within the double and triple helix motif. // Eur. J. Med. Chem. 1998. V. 33. № 7-8. P. 515-576.

26. Грайфер Д. М., Карпова Г. Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРИК производными олигорибонуклеотидов. // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. № 4. С. 584-596.

27. Weisbrod S. Н., Marx A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. // Chem. Commun. (Camb). 2008. № 44. P. 5675-5685.

28. Draper D. E. Attachment of reporter groups to specific, selected cytidine residues in RNA using a bisulfite-catalyzed transamination reaction. // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. №2. P. 989-1002.

29. Gillam I. C., Tcner G. M. N4-(6-Aminohexyl)cytidine and deoxycytidine nucleotides can be used to label DNA. // Anal. Biochem. 1986. V. 157. № 2. P. 199-207.

30. Hovinen J. A simple synthesis of N4-(6-aminohexyl)-2'-deoxy-5l-0-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidine. //Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. № 7. P. 1209-1213.

31. Markiewicz W., Godzina P., Markiewicz M., Astriab A. Synthesis of a polyaminooligonucleotide combinatorial library. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. №9-11. P. 1871-1880.

32. Singh S., Singh R. К. Synthesis and fluorescence studies of fluorescently labelled phosphoramidites: synthons for multiple labelled oligonucleotides. // Current science. 2006. V. 91. №6. P. 836-839.

33. Singh S., Singh R. K. Synthesis and fluorescence studies of some new fluorophores and their effect on hybridization of oligodeoxyribonucleotides. // J. Fluoresc. 2007. V. 17. № 2. P. 139-148.

34. Pieles U., Sproat B. S., Lamm G. M. A protected biotin containing deoxycytidine building block for solid phase synthesis of biotinylated oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 15. P. 4355-4360.

35. Johansson H. E., Belsham G. J., Sproat B. S., Hentze M. W. Target-specific arrest of mRNA translation by antisense 2'-0-alkyloligoribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 22. P. 4591-4598.

36. Walton T. A., Lyttle M. H., Dick D. J., Cook R. M. Evaluation of new linkers and synthetic methods for internal modified oligonucleotides. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. №5. P. 1155-1158.

37. Abdel-Rahman A. A.-H., Ali О. M., Pedcrsen E. B. Insertion of 5-methyl-N4-(l-pyrenylmethyl)cytidine into DNA. Duplex, three-way junction and triplex stabilities. // Tetrahedron. 1996. V. 52. № 48. P. 15311-15324.

38. Le Bran S., Duchange N., Namane A., Zakin M. M., Huynh-Dinh Т., Igolen J. Simple chemical synthesis and hybridization properties of non-radioactive DNA probes. // Biochimie. 1989. V. 71. № 3. P. 319-324.

39. Horn Т., Urdea M. S. Forks and combs and DNA: the synthesis of branched oligodeoxyribonucleotides. //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. № 17. P. 6959-6967.

40. He C., Verdine G. L. Trapping distinct structural states of a protein/DNA interaction through disulfide crosslinking. // Chem. Biol. 2002. V. 9. № 12. P. 1297-1303.

41. Noronha A. M., Noll D. M., Wilds C. J., Miller P. S. N(4)C-ethyl-N(4)C cross-linked DNA: synthesis and characterization of duplexes with interstrand cross-links of different orientations. // Biochemistry. 2002. V. 41. № 3. P. 760-771.

42. Swenson M. С., Paranawithana S. R„ Miller P. S., Kielkopf C. L. Structure of a DNA repair substrate containing an alkyl interstrand cross-link at 1.65 A resolution. // Biochemistry. 2007. V. 46. № 15. P. 4545-4553.

43. Campbell M. A., Miller P. S. Phosphodiester-mediated reaction of cisplatin with guanine in oligodeoxyribonucleotides. // Biochemistry. 2008. V. 47. № 48. P. 12931-12938.

44. Campbell M. A., Miller P. S. Cross-linking to an interrupted polypurine sequence with a platinum-modified triplex-forming oligonucleotide. // J. Biol. Inorg. Chem. 2009. V. 14. №6. P. 873-881.

45. Prakash T. P., Barawkar D. A., Kumar V., Ganesh K. N. Synthesis of site-specific oligonucleotide-polyamine conjugates. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. V. 4. № 14. P! 1733-1738.

46. Barawkar D. A,, Kumar V. A., Ganesh K. N. Triplex formation at physiological pH by oligonucleotides incorporating 5-Me-dC-(N4-spermine). // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 205. № 3. P. 1665-1670.

47. Rajeev- K. G., Jadhav V. R., Ganesh K. N. Triplex formation at physiological pli: comparative studies on DNA triplexes containing 5-Me-dC tethered at N4 with spermine and tetraethyleneoxyamine. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 21. P. 4187-4193.

48. Ganesh K. N., Kumar V., Barawkar D. A., Rajeev K. G., Rana V. S. Enhancing DNA triplex stability via nucleobase modifications. // Pure Appl. Chem. 1998. V. 70. № 2. P. 289-292.

49. MacMillan A. M., Verdine G. L. Synthesis of functionally tethered oligodeoxynucleotides by the convertible nucleoside approach. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. №24. P. 5931-5933.

50. MacMillan M., Verdine G. L. Engineering tethered DNA molecules by the convertible nucleoside approach. // Tetrahedron. 1991. V. 47. № 14-15. P. 2603-2616.

51. Wolfe S. A., Verdine G. L. Ratcheting torsional stress in duplex DNA. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. №26. P. 12585-12586.

52. Allerson С. R., Verdine G. L. Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. // Chem. Biol. 1995. V. 2. № 10. P. 667-675.

53. Lin S.-B., Blake K. R., Miller P. S., Ts'o P. O. Use of EDTA derivatization to characterize interactions between oligodeoxyribonucleoside methylphosphonates and nucleic acids. // Biochemistry. 1989. V. 28. № 3. P. 1054-1061.

54. Adarichev V. A., Kalachikov S. M., Kiseliova A. V., Dymshits G. M. Molecular Hybridization Probes Prepared with 4-Aminooxybutylamine. // Bioconjugate Chem. 1998. V. 9. №6. P. 671-675.

55. Godzina P., Adrych-Rozek K., Markiewicz W. T. Synthetic oligonucleotide combinatorial libraries. 3. Synthesis of polyaminonucleotides. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. № 11. P. 2397-2414.

56. Cosstick R., Douglas M. E. A novel approach to sequence specific cross-linking in oligonucleotides. //Nucleosides Nucleotides. 1991. V. 10. № 1-3. P. 633-634.

57. Erlanson D. A., Chen L., Verdine G. L. DNA methylation through a locally unpaired intermediate. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. № 26. P. 12583-12584.

58. Harris С. M., Zhou L., Strand E. A., Harris Т. M. New strategy for the synthesis of oligodeoxynucleotides bearing adducts at exocyclic amino sites of purine nucleosides. // J.Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. № 11. P. 4328-4329.

59. Kim H.-Y., Nechev L., Zhou L., Tamura P., Harris С. M., Harris Т. M. Synthesis and adduction of fully deprotected oligodeoxynucleotides containing 6-chloropurine. // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. № 38. P. 6803-6806.

60. Rife J. P., Cheng C. S., Moore P. В., Strobel S. A. The synthesis of RNA containing the modified nucleotides N2-methylguanosine and N6,N6-dimethyladenosine. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. № 12. P. 2281-2288.

61. Potier P., Adib A., Kochkin A., Hue I., Behr J.-P. Synthesis of oligonucleotides bearing polyamine groups for recognition of DNA sequence. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. №6-7. P. 1467-1468.

62. Huang H., Harrison S. C., Verdine G. L. Trapping of a catalytic HIV reverse transcriptase*template:primer complex through a disulfide bond. // Chem. Biol. 2000. V. 7. № 5. P. 355-364.

63. Plummer K. A., Carothers J. M., Yoshimura M., Szostak J. W., Verdine G. L. In vitro selection of RNA aptamers against a composite small molecule-protein surface. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 17. P. 5602-5610.

64. Ferentz A. E., Verdine G. L. Disulfide-crosslinked oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. № 10. P. 4000-4002.

65. Larson C. J., Verdine G. L. A high-capacity column for affinity purification of sequence-specific DNA-binding proteins. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. № 13. P. 3525-3526.

66. Ferentz A. E., Verdine G. L. Aminolysis of 2'-deoxyinosine aryl ethers: nucleoside model studies for the synthesis of functionally tethered oligonucleotides. // Nucleosides Nucleotides. 1992. V. 11. № 10. P. 1749-1763.

67. Ferentz A. E., Keating T. A., Verdine G. L. Synthesis and characterization of disulfide cross-linked oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. № 20. P. 9006-9014.

68. Min C., Verdine G. L. Immobilized metal affinity chromatography of DNA. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 19. P. 3806-3810.

69. Kim S. J., Stone M. P., Harris С. M., Harris Т. M. A postoligomerization synthesis of oligodeoxynucleotides containing polycyclic aromatic hydrocarbon adducts at the N6 position of deoxyadenosine. //J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. № 13. P. 5480-5481.

70. Yang I. Y., Johnson F., Grollman A. P., Moriya M. Genotoxic mechanism for the major acrolein-derived deoxyguanosine adduct in human cells. // Chem. Res. Toxicol. 2002. V. 15. №2. P. 160-164.

71. Yang I. Y., Chan G., Miller H., Huang Y., Torres M. C., Johnson F., Moriya M. Mutagenesis by acrolein-derived propanodeoxyguanosine adducts in human cells. // Biochemistry. 2002. V. 41. № 46. P. 13826-13832.

72. Plum G. E., Grollman A. P., Johnson F., Bresiauer K. J. Influence of an exocyclic guanine adduct on the thermal stability, conformation, and melting thermodynamics of a DNA duplex.//Biochemistiy. 1992. V. 31. №48. P. 12096-12102.

73. Kouchakdjian M., Eisenberg M., Johnson F., Grollman A. P., Patel D. J. Structural features of an exocyclic adduct positioned opposite an abasic site in a DNA duplex. // Biochemistry. 1991. V. 30. № 13. P. 3262-3270.

74. Marinelli E. R., Johnson F., Iden C. R., Yu P. L. Synthesis of l,N2-(1.3-propano)-2'-deoxyguanosine and incorporation into oligodeoxynucleotides: a model for exocyclic acrolein-DNA adducts. // Chem. Res. Toxicol. 1990. V. 3. № 1. P. 49-58.

75. Carmical J. R., Zhang M., Nechev L., Harris С. M., Harris Т. M., Lloyd R. S. Mutagenic potential of guanine N2 adducts of butadiene mono- and diolepoxide. // Chein. Res. Toxicol. 2000. V. 13. № 1. P. 18-25.

76. Carmical J. R., Zhang M., Nechev L., Harris С. M., Harris Т. M., Lloyd R. S. Mutagenic potential of guanine N(2) adducts of butadiene mono- and diolepoxide. // Chem. Res. Toxicol. 2000. V. 13. № 5. P. 430.

77. Nechev L. V., Harris С. M., Harris Т. M. Synthesis of nucleosides and oligonucleotides containing adducts of acrolein and vinyl chloride. // Chem. Res. Toxicol. 2000. V. 13. № 5. P. 421-429.

78. Nechev L. V., Kozekov I., Harris С. M., Harris Т. M. Stereospecific synthesis of oligonucleotides containing crotonaldehyde adducts of deoxyguanosine. // Chem. Res. Toxicol. 2001. V. 14. № 11. P. 1506-1512.

79. Wang H., Marnett L. J., Harris 'Г. M., Rizzo C. J. A novel synthesis of malondialdehyde adducts of deoxyguanosine, deoxyadenosine, and deoxycytidine. // Chem. Res. Toxicol. 2004. V. 17. №2. P. 144-149.

80. VanderVeen L. A., Harris Т. M., Jen-Jacobson L., Marnett L. J. Formation of DNA-protein cross-links between gamma-hydroxypropanodeoxyguanosine and EcoRI. // Chem. Res. Toxicol. 2008. V. 21. № 9. P. 1733-1738.

81. Kierzek E., Kierzek R. The synthesis of oligoribonucleotides containing N6-alkyladenosines and 2-methylthio-N6-alkyladenosines via post-synthetic modification of precursor oligomers. // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. № 15. P. 4461-4471.

82. Kierzek E., Kierzek R. The thermodynamic stability of RNA duplexes and hairpins containing N6-alkyladenosines and 2-methylthio-N6-alkyladenosines. // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. № 15. P. 4472-4480.

83. Bergsrom D. E., Ruth J. L. Synthesis of C-5 substituted pyrimidine nucleosides via organopalladium intermediate. //J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. № 6. P. 1587-1589.

84. Ruth J. L., Bergsrom D. E. C-5 Substituted pyrimidine nucleosides. 1. Synthesis of C-5 allyl, propyl and propenyl uracil and cytosine nucleosides via organopalladium intermediates. // J. Org. Chem. 1978. V. 43. № 14. P. 2870-2876.

85. Brumbaugh J. A., Middendorf L. R., Grone D. L., Ruth J. L. Continuous, on-line DNA sequencing using oligodeoxynucleotide primers with multiple fluorophores. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 15. P. 5610-5614.

86. Jablonski E., Moomaw E. W., Tullis R. H., Ruth J. L. Preparation of oligodeoxynucleotide alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. № 15. P. 6115-6128.

87. Dreyer G. В., Dervan P. B. Sequence-specific cleavage of single-stranded DNA: oligodeoxynucleotide-EDTAFe(II). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. № 4. P. 968-972.

88. Moser H. E., Dervan P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triplex helix formation. // Science. 1987. V. 238. № 4827. P. 645-650.

89. Griffin L. C., Dervan P. B. Recognition of thymidine*adenine base pairs by guanine in a pyrimidine triple helix motif. // Science. 1989. V. 245. № 4927. P. 967-971

90. Strobel S. A., Dervan P. B. Cooperative site specific binding of oligonucleotides to duplex DNA. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. № 18. P. 7286-7287.

91. Povsic T. J., Dervan P. B. Sequence-specific alkylation of double-helical DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. № 25. P. 9428-9430.

92. Cook A. F., Vuocolo E., Brakel C. L. Synthesis and hybridization of a series of biotinylated oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. № 9. P. 4077-4095.

93. Hug I., Tamilarasu N., Rana Т. M. Visualizing tertiary folding of RNA and RNA-protein interactions by a tethered iron chelate: analysis of HIV-1 Tat-TAR complex. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 4. P. 1084-1093.

94. Shah K., Neenhold H., Wang Z., Rana Т. M. Incorporation of an artificial protease and nuclease at the HIV-1 Tat binding site of trans-activation responsive RNA. // Bioconjugate Chem. 1996. V. 7. № 3. P. 283-289.

95. Santoro S. W., Joyce G. F., Sakthivel K., Gramatikova S., Bardas C. F. RNA Cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. № ll. p. 2433-2439.

96. Lermer L., Roupioz Y., Ting R., Perrin D. M. Toward an RNaseA mimic: a DNAzyme with imidazoles and cationic amines. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. № 34. P. 99609961.

97. Sonogashira K., Tohda Y., Hagihara N. A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes and bromopyridines. // Tetrahedron Lett. 1975. V. 16. № 50. P. 4467-4470.

98. Robbins M. J., Barr P. J. Nucleic acid related compounds. 39. Efficient conversion of 5-iodo to 5-alkynyl and derived 5-substituted uracil bases and nucleosides. // J. Org. Chem. 1983. V. 48. № 11. P. 1854-1862.

99. Haralambidis J., Chai M., Tregear G. W. Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. № 12. P. 4857-4876.

100. Gibson К. J., Benkovic S. J. Synthesis and application of derivatizable oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. № 16. P. 6455-6467.

101. Hobbs F. W. Palladium-catalyzed synthesis of alkynylamino nucleosides. A universal linker for nucleic acids. // J. Org. Chem. 1989. V. 54. № 14. P. 3420-3422.

102. Meyer R. В., Tabone J. C., Hurst G. D., Smith Т. M., Gamper H. Efficient, specific cross-linking and cleavage of DNA by stable, synthetic complementary oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. № 22. P. 8517-8519.

103. Han H., Dervan P. B. Different conformational families of pyrimidine-purine-pyrimidine triple hclices depending on backbone composition. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 14. P. 2837-2844.

104. Han H., Dervan P. B. Visualization of RNA tertiary structure by RNA-EDTA'Fe(II) autocleavage: analysis of tRNAPhe with uridine-EDTA'Fe(II) at position 47. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 11. P. 4955-4959.

105. Switzer C., Prakash T. P., Ahn Y. Synthesis and characterization of an oligonucleotide containing the bifurcated nucleobase co-adenylpropyl uracil. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. №7. P. 815-818.

106. Podyminogin M. A., Meyer R. В., Gamper H. B. RecA-catalyzed, sequence-specific alkylation of DNA by cross-linking oligonucleotides. Effects of length and nonhomologous base substitutions. // Biochemistry. 1996. V. 35. № 22. P. 7267-7274.

107. Belousov E. S., Afonina I. A., Podyminogin M. A., Gamper H. В., Reed M. W., Wydro R. M., Meyer R. B. Sequence-specific targeting and covalent modification of human genomic DNA. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 17. P. 3440-3444.

108. Singer M. J., Podyminogin M. A., Metcalf M. A., Reed M. W., Brown D. A., Gamper H. В., Meyer R. В., Wydro R. M. Targeted mutagenesis of DNA with alkylating RecA assisted oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 24. e38.

109. Reed M. W., Lukhtionov E. A., Gorn V., Kutyavin I., Gall A., Wald A. Meyer R. B. Synthesis and reactivity of aryl nitrogen mustard-oligodeoxyribonucleotide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1998. V. 9. № 1. P. 64-71.

110. Heystek L. E., Zhou H.-Q., Dande P., Gold B. Control over the localization of positive charge in DNA: the effect on duplex DNA and RNA stability. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. №46. P. 12165-12166.

111. Kahl J. D., Greenberg M. M. Introducing structural diversity in oligonucleotides via photolabile, convertible C5-substituted nucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. № 4. P. 597-604.

112. Khan S. I., Grinstaff M. W. Palladium (O)-catalyzed modification of oligonucleotides during automated solid-phase synthesis. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. № 19. P. 4704-4705.

113. Held H. A., Benner S. A. Challenging artificial genetic systems: thymidine analogs with 5-position sulfur functionality. //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. № 17. P. 3857-3869.

114. Charles I., Xi H., Arya D. P. Sequcnce-specific targeting of RNA with an oligonucleotide-neomycin conjugate. // Bioconjugate Chem. 2007. V. 18. № 1. P. 160169.

115. Hirose M., Sakamoto S., Uekita Y. Kitamura M., Inoue H. Oligonucleotide duplex stabilization by end-linked terpyridine x Cu(II) complexes. // Nucleic Acids Res. Suppl. 2003. №3. P. 135-136.

116. Bijapur J., Keppler M. D., Bergqvist S., Brown Т., Fox K. R. 5-(l-Propargylamino)-2'-deoxyuridine (UP): a novel thymidine analogue for generating DNA triplexes with increased stability. //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 8. P. 1802-1809.

117. Gowers D. M., Bijapur J., Brown Т., Fox K. R. DNA triple helix formation at target sites containing several pyrimidine interruptions: stabilization by protonated cytosine or 5-(l-propargylamino)dU. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 41. P. 13747-13758.

118. Sologoub M., Darby R. A. J., Cuenoud В., Brown Т., Fox K. R. Stable DNA triple helix formation using oligonucleotides containing 2'-aminoethoxy-5-propargylamino-U. // Biochemistry. 2002. V. 41. № 23. P. 72224-77231.

119. Rusling D. A., Powers V. E., Ranasinghe R. Т., Wang Y., Osborne S. D., Brown Т., Fox K. R. Four base recognition by triplex-forming oligonucleotides at physiological pH. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 9. P. 3025-3032.

120. Rusling D. A., Brown Т., Fox K. R. DNA triple-helix formation at target sites containing duplex mismatches. // Biophys. Chem. 2006. V. 123. № 2-3. P. 134-140.

121. Matulic-Adamic J., Daniher А. Т., Karpeisky A., Haeberly P., Sweedler D., Beigelman L. Functionalized nucleoside 5'-triphosphates for in vitro selection of new catalytic ribonucleic acids. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. V. 10. № 11. P. 1299-1302.

122. Gannett P. M., Darian E., Powell J. H., Johnson E. M. A short procedure for synthesis of 4-ethynyl-2,2,6,6-tetramethyl-3,4-dehydro-piperidine-l-oxyl nitroxide. // Synthetic Commun. 2001. V. 31. № 14. P. 2137-2141.

123. Nakano S., Kirihata Т., Fujii S., Sakai H., Kuwahara M., Sawai H., Sugimoto N. Influence of cationic molecules on the hairpin to duplex equilibria of self-complementary DNA and RNA oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. № 2. P. 486-494.

124. Durand A., Brown T. Synthesis and properties of oligonucleotides containing a cholesterol thymidine monomer. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2007. V. 26. № 6-7. P. 785-794.

125. Zhao Z., Peng G., Michels J., Fox K. R., Brown T. Synthesis of anthraquinone oligonucleotides for triplex stabilization. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2007. V. 26. №8-9. P. 921-925.

126. Tamura Т., Furukawa Т., Komatsu Y., Ohtsuka E., Inoue H. Toward artificial ribonucleases: design and synthesys of 2'-0-methyloligonucleotides with a terpyridine-copper (II) complex. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 1999. № 42. P. 109-110.

127. Нага K., Kitamura M., Inoue H. Synthesis and ribonuclease activity of oligonucleotides with N3-terpyridine x Cu(II)-linked thymine residues. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2006. №50. P. 71-72.

128. Mukoguchi D., Sakamoto S., Takayama H., Kitamura M., Inoue H. Structure-activity relationship of an antisense oligonucleotide-two Cu(II) complex conjugate as an artificial ribonuclease. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2008. № 52. P. 377-378.

129. Takayama H., Sakamoto S., Kitamura M., Inoue H. Development of site-specific artificial ribonucleases. // Nuclcic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2007. № 51. P. 203-204.

130. French D. J., McDowell D. G., Debcnham P., Gale N., Brown T. HyBeacon probes for rapid DNA sequence detection and allele discrimination. // Methods Mol. Biol. 2008. V. 429. P. 171-185.

131. Saintome C., Clivio P., Fourrey J.-L., Wolsard A., Favre A. Development of new nucleic acid photoaffinity probes : synthesis of 4-thiothymine labelled nucleoside analogues. // Tetrahedron Lett. 1994. V. 35. № 6. P. 873-876.

132. Khalimskaya L. M., Levina A. S., Zarytova V. P. Sequence-specific modification of DNA fragments by oligonucleotide derivatives containing alkylating groups at the C5 position of deoxyuridine. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. V. 4. № 8. P. 1083-1088.

133. Ueno Y., Kumagai I., Haginoya N., Matsuda A. Effects of 5-(N-aminohexyl)carbamoyl-2'-deoxyuridine on endonuclease stability and the ability of oligodeoxynucleotide to activate RNase H. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 19. P. 3777-3782.

134. Tanimoto M., Kamiya H., Minakawa N., Matsuda A., Harashima H. No enhancement of nuclear entry by direct conjugation of a nuclear localization signal peptide to linearized DNA. // Bioconjugate Chem. 2003. V. 14. № 6. P. 1197-1202.

135. Ito Т., Ueno Y., Komatsu Y., Matsuda A. Synthesis, thermal stability and resistance to, enzymatic hydrolysis of the oligonucleotides containing 5-(N-aminohexyl)carbamoyl-2'-O-methyluridines. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. № 10. P. 2514-2523.

136. Ueno Y., Ogawa A., Nakagawa A., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides. 162. Facile synthesis of 5'-5'-linked oligodeoxyribonucleotides with the potential for triple-helix formation. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. V. 6. № 23. P. 2817-2822.

137. Nomura Y., Ueno Y., Matsuda A. Site-specific introduction of functional groups into phosphodiester oligodeoxynucleotides and their thermal stability and nuclease-resistance properties. //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 14. P. 2784-2791.

138. Sawai H., Nakamura A., Sekiguchi S., Yumoto K., Endoh M., Ozaki H. Efficient synthesis of new 5-substituted uracil nucleosides useful for linker arm incorporation. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994. № 17. P. 1997-1998.

139. Ozaki H., Ogawa Y., Mine M., Sawai H. Effect of acridine with various linker arms attached to C5-position of 2'-deoxyuridine on the stability of DNA/DNA and DNA/RNA duplexes. //Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. № 5. P. 911-923.

140. Shinozuka K., Matsukura M., Okamoto Т., Sawai H. Synthesis and anti-HIV property of novel oligo-DNA phosphorothioate analogs bearing an intercalative moiety and/or polyamine residues. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. № 9-11. P. 2081-2084.

141. Shinozuka K., Umeda A., Aoki Т., Sawai H. Facile post-synthetic derivatization of oligodeoxynucleotide containing 5-methoxycarbonylmethyl-2'-deoxyuridine. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. № 1-3. P. 291-300.

142. Ozaki H., Mine M., Ogawa Y., Sawai H. Effect of the terminal amino group of a linker arm and its length at the C5 position of a pyrimidine nucleoside on the thermal stability of DNA duplexes. // Bioorg. Chem. 2001. V. 29. № 4. P. 187-197.

143. Ohbayashi Т., Kuwahara M., Hascgawa M„ Kasamatsu Т. Tamura Т., Sawai H. Expansion of repertoire of modified DNAs prepared by PCR using KOD Dash DNA polymerase. // Org. Biomol. Chem. 2005. V. 3. № 13. P. 2463-2468.

144. Ozaki H., Nishihira A., Wakabayashi M., Kuwahara M., Sawai H. Biomolecular sensor based on fluorescence-labeled aptamer. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. V. 16. № 16. P. 4381-4384.

145. Gauthier M. A., Klok H. A. Peptide/protein-polymcr conjugates: synthetic strategies and design concepts. // Chem. Commun. (Camb). 2008. № 23. P. 2591-2611.

146. Hein C. D., Liu X. M., Wang D. Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences. // Pharm. Res. 2008. V. 25. № 10. P. 2216-2230.

147. Kolb H. C., Finn M. G., Sharpless К. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001. V. 40. № 11. P. 20042021.

148. Huisgen R. "Centenary Lecture 1,3-Dipolar Cycloadditions". // Proc. Chem. Soc. 1961. V. № P. 357-396.

149. Kocalka P., El-Sagheer A. H., Brown T. Rapid and efficient DNA strand cross-linking by click chemistry. // ChemBioChem. 2008. V. 9. № 8. P. 1280-1285.

150. Ami Т., Fujimoto K. Click chemistiy as an efficient method for preparing a sensitive DNA probe for photochemical ligation. // ChemBioChem. 2008. V. 9. № 13. P. 20712074.

151. Sirivolu V. R., Chittepu P., Seela F. DNA with branched internal side chains: synthesis of 5-tripropargylamine-dU and conjugation by an azide-alkyne double click reaction. // ChemBioChem. 2008. V. 9. № 14. P. 2305-2316.

152. Roduit J.-P., Shaw J., Chollet A., Biogen S. A. Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing an aliphatic amino linker arm at selected adenine bases and derivatization with biotin. // Nucleosides Nucleotides. 1987. V. 6. № 1-2. P. 349-352.

153. Sarfati S. R., Pochet S., Guerreiro С., Namane A., Huynh-Dinh Т., Igolen J. Synthesis of flurocent or biotinylated nucleoside compounds. // Tetrahedron. 1987. V. 43. № 15. P. 3491-3497.

154. Singh D., Kumar V. A., Ganesh K. N. Oligonucleotides, part 5: synthesis and fluorescence studies of DNA oligomers d(AT)s containing adenines covalently linked at C-8 with dansyl fluorophore. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 11. P. 3339-3345.

155. Venyaminova A. G., Repkova M. N., Ivanova Т. M., Dobrikov M. I., Karpova G. G., Zarytova V. P. New photocrosslinking analogues of mRNA. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 1994. № 31. P. 207-208.

156. Репкова М. Н., Иванова Т. М., Филиппов Р. В., Веньяминова А. Г. Фотоактивирусмые перфторарилазидные производные олигорибонуклеотидов: синтез и свойства. // Биоорган, химия. 1996. Т. 22. № 6. С. 432-440.

157. Laayoun A., Decout J.-L., Defrancq Е., Lhomme J. Hydrolysis of oligonucleotides containing 8-substituted purine nucleosides. A new route for preparing abasic oligodeoxynucleotides. // Tetrahedron Lett. 1994. V. 35. № 28. P. 4991-4994.

158. Trevisiol E., Renard A., Defrancq E., Lhomme J. The oxyamino-aldehyde coupling reaction: an efficient method for the derivatization of oligonucleotides. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. № 50. P. 8687-8690.

159. Trevisiol E., Renard A., Defrancq E., Lhomme J. Fluorescent labeling of oligodeoxyribonucleotides by the oxyamino-aldehyde coupling reaction. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000. V. 19. № 9. P. 1427-1439.

160. Gamper H. В., Afonina L, Belousov E., Reed M. W., Podyminogin M. A. Use of quantitative ligation-mediated polymerase chain reaction to delect gene targeting by alkylating oligodeoxynucleotides. //Methods Mol. Biol. 2000. V. 133. P. 201-211.

161. Smith R. A. G., Knowles J. R. Aryldiazirines. Potential reagents for photolabeling of biological receptor sites. //J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95. № 15. P. 5072-5073.

162. Brunner J., Senn H., Richards F. M. 3-Trifluoromethyl-3-phenyldiazirine. A new carbene generating group for photolabeling reagents. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. № 8. P. 3313-3318.

163. Тараненко M. В., Мчедлидзе M. Т. Изучение кинетики фотолиза соединений, содержащих арил(трифторметил)диазириновую группу. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2002. Т. 43. № 1. С. 47-50.

164. Yamaguchi Т., Saneyoshi M. A photolabile 2', З'-dideoxyuridylate analog bearing an aryl(trifluoromethyl)diazirine moiety: photoaffinity labeling of HIV-l reverse transcriptase.//Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 17. P. 3364-3369.

165. Tate J. J., Persinger J., Bartolomew B. Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 6. P. 1421-1426.

166. Baranov P. V., Sergiev P. V., Dontsova О. A., Bogdanov A. A., Brimacombe R. The database of ribosomal cross links (DRC). // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 1. P. 187189.

167. Baranov P. V., Kubarenko A. V., Gurvich O. L., Shamolina T. A., Brimacombe R. The database of ribosomal cross-links: an update. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 1. P. 184-185.

168. Sergiev P., Dokudovskaya S., Romanova E., Topin A., Bogdanov A., Brimakombe R., Dontsova O. The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 11. P. 2519-2525.

169. Schuster G. В., Platz M. S. Photochemistry of phenyl azides. // V. 17. Advances in Photochemistry. / Ed. David H. Volman G. S. H. D. C. N., 1992. P. 69-143.

170. Gritsan N. P., Platz M. S. Kinetics, spectroscopy, and computational chemistry of arylnitrenes. // Chem. Rev. 2006. V. 106. № 9. P. 3844-3867.

171. Schapp K. A., Platz M. S. A laser flash photolysis study of di-, tri- and tetrafluorinated phenylnitrenes; implications for photoaffinity labeling. // Bioconjugatc Chem. 1993. V. 4. №2. P. 178-183.

172. Лаврик О. И., Хлиманков Д. Ю., Ходырева С. Н. Репликативный комплекс эукариот и его исследование с помощью аффинной модификации. // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. № 4. С. 563-572.

173. Лебедева Н. А., Речкунова Н. И., Дежуров С. В., Ходырева С. Н., Фавр А., Лаврик О. И. Новая бинарная система для фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимераз в ядерном экстракте. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 4. С. 584-591.

174. Bashkin J. К., Frolova E. I., Sampath U. Sequence-specific cleavage of HIV mRNA by a ribozyme mimic. //J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. № 13. P. 5981-5982.

175. Bashkin J. K., Gard J. K., Modak A. S. Synthesis and characterization of nucleoside peptides: toward chemical ribonucleases. 1. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. № 17. P. 51255132.

176. Bashkin J. K., Sampath U., Frolova E. Ribozyme mimics as catalytic antisense reagents. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. V. 54. № 1-3. P. 43-56.

177. Bashkin J. K., Xie J., Daniher А. Т., Sampath U., Kao J. L. F. Building blocks for ribozyme mimics: conjugates of terpyridine and bipyridine with nucleosides. // J. Org. Chem. 1996. V. 61. № 7. P. 2314-2321.

178. Putnam W. C., Daniher А. Т., Trawick B. N., Bashkin J. K. Efficient new ribozyme mimics: direct mapping of molecular design principles from small molecules to macromolecular, biomimetic catalysts. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 10. P. 21992204.

179. Putnam W. C., Bashkin J. K. Synthesis and evaluation of RNA transesterification efficiency using stereospecific serinol-terpyridine conjugates. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V. 24. № 9. P. 1309-1323.

180. Magda D., Miller R. A., Sessler J. L., Iverson B. L. Site-specific hydrolysis of RNA by europium(III) texaphyrin conjugated to a synthetic oligodeoxyribonucleotide. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. № 16. P. 7439-7440.

181. Hall J., Hiisken D., Haner R. Towards artificial ribonucleases: the sequence-specific cleavage of RNA in a duplex. //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 18. P. 3522-3526.

182. Perrin D. M., Garestier Т., Helene C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: a metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. №8. P. 1556-1563.

183. Hollenstein M., Hipolito C., Lam C., Dietrich D., Perrin D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008. V. 47. № 23. P. 4346-4350.

184. Hollenstein M., Hipolito С., Lam С., Perrin D. In vitro selection of a DNAzyme with three modified nucleotides. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2008. № 52. P. 73-74.

185. Lam C., Hipolito C., Perrin D. M. Synthesis and enzymatic incorporation of modified deoxyadenosine triphosphates. // Eur. J. Org. Chem. 2008. V. 2008. № 29. P. 4915-4923.

186. Hollenstein M., Hipolito C. J., Lam С. H., Perrin D. iM. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2+). // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. № 5. P. 1638-1649.

187. Ferrer E., Wiersma M., Kazimierczak В., Moller C. W., Eritja R. Preparation and properties of oligonucleotides containing 5-iodouraciI and 5-bromo- and 5-iodocytosine. // Bioconjugate Chem. 1997. V. 8. № 5. p. 757-761.

188. Fukuhara Т. K., Wisser D. W. Pyrimidine nucleoside antagonists. // J. Biol. Chem. 1951. V. 190. № 1. P. 95-98.

189. Long R. A., Robins В. K. // Synthetic procedures in nucleic acid chcmistry. V.l. / Eds. Zorbach W. W. and Tipson R. S. N.-Y.-London-Sydney-Toronto: Intersci. Publishers, 1968. P. 228-229.

190. Russell A. F., Prystasz M., Hamamura E. K., Verhcyden J. P. H., Moffatt J. G. Reactions of 2-acyloxyisobutyryI halides with nucleosides. V. Reactions with cytidine and its derivatives. //J. Org. Chem. 1974. V. 39. № 15. P. 2182-2186.

191. Markiewicz W. 'Г., Biala E., Kierzek R. Application of the tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl group in the chemical synthesis of oligoribonucleotides. // Bull. Pol. Acad. Sci.: Chem. 1984. V. 32. № 11-12. P. 433-451.

192. Willis M. C., Hiche B. J., Uhlenbeck О. C., Cech T. R„ Koch Т. H. Photocrosslinking of 5-iodouracil-substituted RNA and DNA to proteins. // Science. 1993. V. 262. № 5137. P. 1255-1257.

193. Willis M. C., LeCuyer K. A., Meisenheimer К. M., Uhlenbeck О. C., Koch Т. H. An RNA-protein contact determinated by 5-bromouridine substitution, photocrosslinking and sequencing. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 23. P. 4947-4952.

194. LeCuyer К. A., Behlen L. S., Uhlenbeck О. C. Mutagenesis of a stacking contact in the MS2 coat protein RNA complex. // EMBO J. 1996. V. 15. № 24. P. 6847-6853.

195. Talbot S. J., Goodman S., Bates S. R. E., Fishwick C. W. G. Stockley P. G. Use of synthetic oligoribonucleotides to probe RNA protein interactions in the MS2 translational operator complex. //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 12. P. 3521-3528.

196. Liu J., Verdine G. L. Synthesis of photoreactive DNA: incorporation of 8-bromo-2'-deoxyadenosine into synthetic oligodeoxynucleotides. // Tetrahedron Lett. 1992. V. 33. № 30. P. 4265-4268.

197. Shah K., Wu H., Rana Т. M. Synthesis of uridine phosphoramidite analogs: reagents for site-specific incorporation of photoreactive sites into RNA sequences. // Bioconjugate Chem. 1994. V. 5. № 6. P. 508-512.

198. Wick K. L., Matthews K. S. Interactions between lac repressor protein and site-specific bromodeoxyuridine-substituted operator DNA. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 10. P. 6106-6112.

199. Fischer A., Gdaniec Z., Biala E„ Lozynski M., Milecki J., Adamiak R. W. 19F NMR of RNA. The structural and chemical aspects of 5-fluoro-cytidine and -uridine labelling of oligoribonucleotides. // Nucleosides Nucleotides. 1996. V. 15. № 1. P. 477-488.

200. Beaucage S. L., Caruthers M. Deoxynucleoside phosphoramidites a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. // Tetrahedron Lett. 1981. V. 22. № 20. P. 1859-1862.

201. Garegg P. J., Regberg Т., Stawinski J., Stromberg R. Formation of internucleotidic bonds via phosphonate intermediates. // Chem. Scr. 1985. V. 25. № P. 280-282.

202. Garegg P. G., Regberg Т., Stavinski J., Stromberg R. Nucleoside hydrogenphosphonates in oligonucleotide synthesis. // Chem. Scr. 1986. V. 26. № 1. P. 59-62.

203. Froehler В. C., Matteucci M. D. Nucleoside H phosphonates: valuable intermediates in the synthesis of deoxyoligonucleotides. // Tetrahedron Lett. 1986. V. 27. № 4. P. 469472.

204. Bellon L. Oligoribonucleotides with 2'-0-(tert-butyldimethylsilyl) groups. // ibib. Unit 3.6.

205. Веньяминова А. Г., Горн В. В., Зенкова М. А., Комарова Н. И., Репкова М. Н. Автоматический Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов с использованием 2'-0-тетрагидропиранильной защитной группы. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. № 7. С. 941-950.

206. Stawinski J. Some aspects of H-phosphonate chemistry. // Handbook of organophosphorus chemistry. / Ed. Engel R. New York: Marcel Dekker Inc., 1992. P. 377-434.

207. Froehler В. C. Oligodeoxynucleotide synthesis: H-phosphonate approach. // Protocols for oligonucleotides and analogs. / Ed. Agrawal S. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., 1993. P. 63-80.

208. Froehler В. C., Ng P. G., Matteucci M. D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. //Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. № 13. P. 5399-5407.

209. Lewis E. S., Spears L. G. Ionization of the PH bond in diethyl phosphonate. // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. № 13. P. 3918-3921.

210. Ломакин А. И., Ястребов С. И., Попов С. Г. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов. I. Исследование носителей на основе силикагеля марки "Силохром". // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. № 7. С. 920-926.

211. Knorre D. G., Godovikova Т. S. Photoaffinity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes. // FEBS Lett. 1998. V. 433. № 1. P. 9-14.

212. Barley H. // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology / Eds T.S. Work, R.H. Burdon. N.Y.: Elsevier, 1983. P. 1-187.

213. Barley H., Staros J. V. // Azides and nitrenes: reactivity and utility / Ed. E.F.V. Scriven. Orlando, FI: Acad. Press, 1984. P. 433-490.

214. Keana J. F. W., Cai S. X. New reagents for photoaffmity labeling: synthesis and photolysis of functionalized perfluorophenyl azides. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. № 11. P. 3640-3647.

215. Young M. J. Т., Platz M. S. Polyfluorinated aryl azides as photoaffmity labeling reagents; the room temperature CH insertion reacrions of singlet pentafluorophenyl nitrene with alkanes. // Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. № 17. P. 2199-2202.

216. Young M. J. Т., Platz M. S. Functionalized perfluorophenyl azides: new reagents for photoaffmity labeling. // J. Fluorine Chem. 1989. V. 43. № 1. P. 151-154.

217. Schnapp К. A., Рое R., Leyva E,, Soundararajan N., Platz M. S. Exploratory photochemistry of fluorinated aryl azides. Implications for the design of photoaffmity labeling reagents. // Bioconjugate Chem. 1993. V. 4. № 2. P. 172-177.

218. Коваль В. В., Максакова Г. А., Федорова О. С. Фотомодификация ДНК перфторарилазидопроизводными олигонуклеотида. // Биоорган, химия. 1997. V. 23. № 4. Р. 266-272.

219. Levina A. S., Berezovsky М. V., Venjaminova A. G., Repkova М. N., Zarytova V. F. Photomodification of RNA and DNA fragments by oligonucleotide reagents bearing arylazide groups. // Biochimie. 1993. V. 75. № 1-2. P. 25-27.

220. Repkova M. N., Venyaminova A. G., Zarytova V. F. New photoreaetive RNA analogs. // Nucleosides Nucleotides. 1997. V. 16. №7-9. P. 1797-1798.

221. Bulygin K. N., Graifer D. M., Repkova M. N., Smolenskaya I. A., Veniyaminova A. G., Karpova G. G. Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center. // RNA. 1997. V. 3. № 12. P. 1480-1485.

222. Graifer D., Molotkov M., Eremina A., Ven'yaminova A., Repkova M., Karpova G. The central part of the 5.8 S rRNA is differently arranged in programmed and free human ribosomes. // Biochem. J. 2005. V. 387. Pt 1. P. 139-145.

223. Molotkov M., Graifer D., Demeshkna N., Repkova M., Ven'yaminova A., G. K. Arrangement of mRNA 3' of the A site codon on the human 80S ribosome. // RNA Biology. 2005. V. 2. № 1. P. 63-69.

224. Молотков М. В., Грайфер Д. М., Демешкина Н. А., Репкова М. Н., Веньяминова А. Г., Карпова Г. Г. Расположение матрицы с 3'-стороны от кодона в А-участке на 80S рибосоме человека. // Молекуляр. биология. 2005. Т. 39. № 6. С. 999-1007.

225. Булыгин К. Н., Бау-Драи 3. Фавр А., Веньяминова А. Г., Грайфер Д. М., Г.Г. К. Окружение З'-конца тРНК в А- и Р-участках 80S рибосомы. // Биоорган, химия. 2008. V. 34. № 1. Р. 96-106.

226. Хайрулина Ю. С., Молотков М. В., Булыгин К. Н„ Грайфер Д. М., Веньяминова А. Г., Г.Г. К. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека. // Молекуляр. биология. 2008. V. 42. № 2. Р. 306-313.

227. Bulygin К., Favre A., Baouz-Drahy S., Hountondji С., Vorobjev Y., Ven'yaminova A., Graifer D., G. K. Arrangement of З'-terminus of tRNA on the human ribosome as revealed from cross-linking data. // Biochimie. 2008. V. 90. № 11-12. P. 1624-1636.

228. Добриков М. И., Приходько Т. А., Сафронов И. В., Шишкин Г. В. Синтез и свойства светочувствительных капроновых мембран. Фотоиммобилизация ДНК. // Сиб. хим. журн. 1992. Вып. 2. С. 18-24.

229. Roberts М., Visser D. W. Uridine and cytidine derivatives. // J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. №3. P. 668-669.

230. Holmes R. E., Robins R. K. Purine nucleosides. IX. The synthesis of 9-P-D-ribofuranosyl uric acid and other related 8-substituted purine ribonucleosides. // J. Am. Chem. Soc. 1965. V. 87. № 8. P. 1772-1776.

231. Safrati S. R., Pochet S., Guerreiro C., Namane A., Huynh-Dinh Т., Igolen J. Synthesis of fluorescent or biotinylated nucleoside compounds. // Tetrahedron. 1987. V. 43. № 15. P. 3491-3497.

232. Веньяминова А. Г., Комарова H. И., Левина А. С., Репкова М. Н. Использование салицилхлорфосфина для синтеза рибонуклеозид-3'- и 5'-Н-фосфонатов. // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. № 4. С. 484-489.

233. Ефимов В. А., Буряков А. А., Ревердатто С. В., Чахмачева О. Г. Применение N-метилимидазолидного фосфотриэфирного метода для получения олигонуклеотидов, полезных при изучении рекомбинантиых ДНК. // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. № 10. С. 1367-1381.

234. Borer Р. N. // Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. V.l. / Ed. Fasman G. D. Cleveland: CRC Press, 1975. P. 589.

235. Belikov S., Wieslander L. Express protocol for generating G+A sequencing ladders. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. № 2. P. 310.

236. Barker R. F. Maxam and Gilbert sequencing using one meter gel system. // Nucleic Acids Sequencing. A Practical Approach. / Ed. Howe C.J. W. E. S. Oxford; New York; Tokyo: IRL Press, 1989. P. 126-127.

237. Damha M. J., Ogilvie К. K. Oligoribonucleotide synthesis. The silyl-phosphoramidite method. // Methods in Molecular Biology. V. 20. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. / Ed. Agrawal S., 1993. P. 81-114.