Химические аспекты фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ГОДОВИКОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА

ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОТО АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ РЕАГЕНТАМИ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

ООЗОВ49Э7

Новосибирск - 2007 г.

003064997

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант:

д.х.н., академик РАН Кнорре Дмитрий Георгиевич Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Лаврик Ольга Ивановна,

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

д.х.н., чл.-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

д.х.н. Василевский Сергей Францевич,

Институт химической кинетики и горения СО РАН.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « »_2007 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н.

Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Репликация, транскрипция, биосинтез белка протекают с участием сложных надмолекулярных структур, состоящих, в первую очередь, из набора белков и нуклеиновых кислот. Структуру белково-нуклеиновых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и методом ковалентного связывания белков с нуклеиновыми кислотами. Существует ряд задач, для решения которых химический метод представляется оптимальным. Так, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислотные остатки в белке, сближенные с участком узнавания нуклеиновой кислоты на разных стадиях белково-нуклеинового взаимодействия.

На сегодняшний день существует большое число способов ковалентного присоединения белков к нуклеиновым кислотам. Для аффинной модификации белков используют аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные реакционноспособные группировки в гетероциклических основаниях или углеводном остатке, а также на концевой или межнуклеотидной фосфатных группах. Особое место в арсенале химических реагентов занимают фотоактивируемые аффинные реагенты на основе ароматических азидов. При облучении арилазидная группа, содержащаяся в одной из взаимодействующих молекул, превращается в высокореационноспособную частицу (нитрен), которая может атаковать соседние группы атомов с образованием ковалентной связи между контактирующими партнерами. Идентификация образованного продукта "фотосшивки" позволяет судить о структурной организации белково-нуклеинового комплекса, а также о динамике функционирования системы. В связи с этим, конструирование и синтез фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов является одной из приоритетных задач биоорганической химии.

Несмотря на широкое использование арилазидных реагентов в молекулярно-биологических исследованиях, эксперименты по фотоаффинной модификации белков обычно заканчиваются получением данных одно- или двумерного гель-электрофореза с определением белков, по которым прошла модификация. Отсутствие информации о природе образующейся химической связи не всегда позволяет экспериментатору выбрать оптимальный путь и условия для выделения и анализа модифицированных белков. Это приводит к тому, что в случае лабильных связей утрачивается ценная информация об окружении реагентов в области связывания. Кроме того, из-за малой изученности природы продуктов модификации определенных аминокислотных остатков и механизмов их образования, подбор специфического реагента для каждого конкретного случая часто является недостаточно обоснованным. Фотохимические превращения арилазидных реагентов исследованы, как правило, для модельных соединений в неводных средах, т. е. в условиях, далеких от условий проведения фотоаффинной модификации белков и их комплексов. В связи с этим, полученные данные не могут объяснить ряд фактов, свидетельствующих о протекании в водных растворах реакций после прекращения облучения системы.

Таким образом, изучение механизмов фотовзаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков представляет собой актуальную задачу, поскольку ее решение обеспечит развитие метода фотоаффинной модификации нуклеопротеидных комплексов - перспективного подхода не только для установления структуры и функции биополимеров и их комплексов, но и для направленного воздействия на них.

Цель настоящей работы - установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и разработка новых подходов к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

Задачи, на решение которых было направлено настоящее исследование:

• изучение фотохимических превращений разного типа ароматических азидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров для выявления возможных вторичных, т. е. «темновых», процессов с их участием;

• установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков;

• дизайн и синтез новых фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для решения конкретных молекулярно-биологических задач.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате настоящей работы оформилось новое научное направление исследования строения продуктов фотоаффинной модификации белков, основанное на получении физико-химических характеристик исследуемого объекта путем последовательного использования конкретных моделей, обеспечивающих пространственное сближение реагирующих группировок - остатка арилазида и бокового радикала аминокислоты.

Результаты, полученные при детальном исследовании процессов фотолиза ароматических азидов в водных растворах, и установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков не только проливают свет на механизмы фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами, но и представляют несомненную практическую ценность. Они позволяют сформулировать на качественном уровне некоторые зависимости направления фотоиндуцированных реакций арилазидных реагентов от строения субстрата (аминокислотного остатка) и типа заместителей в арильном кольце азида. Это способствует осознанному выбору фотоактивируемой группы при конструировании фотоактивируемого реагента.

В рамках работы разработаны новые подходы к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза. Для введения арилазидных группировок по терминальным фосфатам деблокированных

олигодезоксирибонуклеотидов впервые использованы цвиттер-ионные производные олигонуклеотидов. С их применением получен ряд новых фотоактивируемых

амидофосфатов олигодезоксирибонуклеотидов, несущих л-азидофениламино-алкильную группу, селективную в отношении функциональных групп белков.

Впервые осуществлен ферментативный синтез ДНК-дуплексов, содержащих арилазидные группы в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК, благодаря использованию 5-[3-(Е)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбснзамидо)-пропенил-1 ]-2'-

дезоксиуридин-5'-трифосфата в качестве фотоактивнруемого аналога элонгирующего субстрата в полимеразной цепной реакции с Гад-полимеразой. Это представляет практический интерес, например, для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-аптамеров, так как использование такого типа дезоксинуклеозид-5'-трифосфата позволяет исключить стадию пост-селекционной модификации аптамера. Предложено новое направление использования арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

Сконструированы новые аналоги инициирующего и элонгирующего субстратов для ферментов матричного синтеза РНК: у-амидофосфаты АТР, несущие л-азидофениламиноалкильную группу, и производные UTP, содержащие остаток ароматического азида, присоединенный к С-5 положению гетероцикла через аминоаллильный спейсер. С использованием арилазидных аналогов UTP методом высокоселективного мечения исследован репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), выполняющие функцию репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 23 статьи и 2 обзора. Отдельные части работы докладывались на международных конгрессах и конференциях: «Cytometry», Лейк-Плэйсид, США, 1994; «Nucleosides&NucIeotides», JIa Йолла, США, 1996; на 13 Международном круглом столе «Nucleosides, Nucleotides&Their Biological Applications», Монпелье, Франция, 1998; «Trends in Nucleic Acid Chemistry», Москва, Россия, 2000; Forum of Yong Scientists Protein Structure-Function, Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB, Ойерас, Португалия, 2001; 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Лиссабон, Португалия, 2001; "RNA as Therapeutic And Genomics Target", Новосибирск, Россия, 2001; V.l. Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes". Новосибирск, Россия, 2002; «Chemical & Biological Problems of Proteomics», Новосибирск, Россия, 2004; Международный форум "Актуальные проблемы современной науки", Самара, Россия, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, Россия, 2006.

Часть материалов диссертации вошла в цикл работ «Ген-направленные биологически-активные вещества - производные олигонуклеотидов: синтез и исследование взаимодействия с нуклеиновыми кислотами», который был удостоен Государственной премии им. Ленинского комсомола 1989 г. в области науки и техники.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 419 страницах, содержит 91 рисунок, 63 схемы и 37 таблиц. Библиография включает 514 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований изложены в двух разделах диссертационной работы. Порядок появления разделов не связан ни с хронологией, ни с относительной важностью раздела. В разделе 1 представлены результаты исследований по установлению механизмов фотоиндуцированного взаимодействия ряда арилазидных реагентов, в основном, из числа широко используемых для фотоаффинной модификации белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, с боковыми радикалами аминокислот. Особое внимание уделено проблеме «темновых» процессов при фотоаффинной модификации белков. В разделе 2 описаны подходы к созданию высокоэффективных фотоаффинных реагентов - арилазидных производных нуклеиновых кислот, способных реагировать с определенными типами функциональных групп белков в составе надмолекулярных комплексов.

МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ БЕЛКОВ

Специфичность и эффективность модификации функциональных групп биополимеров арилазидными реагентами

Сравнительный анализ реакционной способности ароматических азидов по отношению к функциональным группам белков проводили с использованием модельного дуплекса, в котором один из комплементарных олигонуклеотидов был реагентом, а другой - мишенью модификации. У реагента к 5'-концевому фосфату непосредственно или через спейсер была присоединена арилазидная группа. К 3'-концевому фосфату олигонуклеотида-мишени через спейсер был присоединен остаток, имитирующий боковой радикал аминокислоты (схема 1). Образование комплементарного комплекса позволяет сблизить фрагмент аминокислоты с арилазидным остатком на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

Фотохимические превращения в дуплексах (схема 1), осуществляли при 4 "С, облучая реакционную смесь, содержащую производные олигонуклеотидов (10~5 М) в 0,16 М №С1, 0,02 М №2НР04, рН 8,9, светом 300-350 нм. О внутрикомплексном характере всех описываемых ниже реакций свидетельствует то, что при температуре выше Т„„ (35 °С) никаких превращений мишени в процессе облучения не наблюдалось. После облучения дуплексов (2,5-6 мин) реакционные смеси анализировали с помощью микроколоночной анионообменой хроматографии и/или гель-электрофореза. Количественное распределение продуктов модификации мишени определяли по денситометрическим профилям дорожек радиоавтографа или путем просчета собранных фракций, соответствующих хроматографическим пикам продуктов внутрикомплексного фотовзаимодействия. Результаты анализа продуктов, образующихся при облучении дуплексов, представлены в табл. 1.

Схема 1.

(«) 1иР1-<1(СрСрТрАрТрС)р (1-7) |32РН(СрСрТрАрТрС)р-АА

(8-14) З'^ЛрАрСрСрАрТрАрОр-ЛгГ^ 5' ^ РЕАГЕНТЫ

—м-(сн2)>1дн, (1)

-й^сн^инг

(2) <3>

—М-СН2СН;

(4)

—И-(СНг)3 И—¿-сН-МНг

(СНг),

(5) МН,

-с-сн-мн, сн2

-Ы-(СНгЬМ-С-СН;

)

АгИ3 =

—N (СН2)5—N—С-^ р

(8)

—Й-(СН2),-М—(

(9) ОгМ

Н I / \

о2

О-*

ч = 2 (11)

п-3 (12)

п = 4 (13)

п = 6 (14)

Из табл. 1 видно, что образование ковалентного аддукта — продукта сшивки олигонуклеотида-реагента с олигонуклеотцдом-мишенью (я) - наблюдается только в случае реагента, несущего и-азидотетрафторбензоильный остаток (8). Ранее Щобржов М.И. и др., 1992], было обнаружено, что фотомодификация нуклеотидных остатков реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот вызывает несколько типов повреждения мишени: образование ковалентных продуктов, как щелочестабильных, так и щелочелабильных, и скрытое повреждение мишени, проявляющееся при обработке пиперидином. Для выявления продуктов скрытой модификации мишеней в дуплексах олигонуклеотид-реагент*олигонуклеотид-мишень (а) реакционные смеси анализировали после их обработки пиперидином. Как видно из данных табл. 1, фотомодификация мишени реагентом (9) приводит к большей скрытой модификации по сравнению с реагентом (8) (30 % и 5 % соответственно). В то же время, при облучении дуплексов олигонуклеотида («) с реагентами на основе и-азидоанилина (соединения (10), (11), (13) и (14)) модификации функциональных групп олигонуклеотида-мишени (а) зарегистрировано не было.

Присоединение к 3'-концу олигонуклеотида (я) остатка лизина (соединение (5)) или фрагмента, моделирующего его боковой радикал, - остатка 1,3-диаминопропана

(соединение (1)), а также остатков ароматических аминокислот (соединения (6) и (7)), в большинстве случаев вызывает заметное увеличение эффективности модификации мишени (табл. 1). Исключением являются эксперименты по фотоаффинной модификации реагентами (8) и (9) производного олигонуклеотида, несущего остаток цистамина (соединение (3)), где выход ковалентных аддуктов не превышает 26 %. Возможно, что конформация данных комплементарных комплексов не обеспечивает достаточного для протекания реакции сближения остатка цистина и образующегося в ходе фотолиза арилнитрена.

Таблица 1

Результаты фотоиндуцированной модификации олигонуклеотида (а) и его

производных в комплементарном комплексе с арилазидными реагентами

Выход продуктов*, (%)

реагент (8) (9) (10) (П) (13) (14)

^шшень

А Б А Б А Б А А А

(я) 23 0(5**) 0 0(30**) 0 0 (0**) 0 0 0

(1) 47 24 27 21 17(14***) 30(19***) 44 58 52

(2) 36 67 43

(3) 26 0 22 0 63 0 32 68 40

(4) 24 0 25

(5) 54 17 46 9 0 39(43***) 57 71 63

(6) 52 16 39 8 0 51(53***) 16 28 18

(?) 69 0 11 31 9 0 6 10 8

*А - ковалентные аддукты; Б - продукты с увеличенной элекгрофоретической подвижностью;

**степень модификации после обработки пиперидином.

'♦♦Эксперименты, в которых 32Р-меченую мишень добавляли к предварительно облученному л-азидоанилиду олигонуклеотида.

На исследованных модельных дуплексах (схема 1) выявлена некоторая избирательность арилазидных реагентов к различным мишеням. В случае реагента на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты (8), с достаточно высокой эффективностью модифицируются боковые радикалы ароматических аминокислот. Существенное количество продуктов сшивки (69 %) наблюдается при облучении реагента (8) с мишенью, несущей индольную группу (7). Такая высокая эффективность модификации может объясняться тем, что в реакции синглетного перфторарилнитрена с индолом достигается максимальное абсолютное значение константы скорости бимолекулярной реакции [Магстек А., 1994]. Следует отметить, что остаток триптофана является одной из основных мишеней в белках для разного типа арилазидных реагентов [Кпогге й. О., Сос1о\чко\хг Т.8., 1998].

Для реагентов на основе л-азидоанилина (10) и л-азидофениламиноалкиламина (соединения (11), (13), (14)) наиболее «уязвимыми» мишенями при модификации служат производные олигонуклеотидов, несущие алифатические аминогруппы. Следует отметить, что основные продукты фотомодификации мишеней (1), (5) и (6) реагентом (10) имеют большую электрофоретическую подвижность по сравнению с

исходной мишенью, при этом электрофореграммы практически идентичны тем, которые наблюдались в случае, когда мишени добавлялись к предварительно облученному реагенту (10) (табл. 1). Это свидетельствует о том, что при облучении комплексов с реагентом (10) модификация осуществляется п-бензохинониминоимидом олигонуклеотида (15), который может вступать в реакцию с нуклеофилами с образованием продуктов как 1,2-присоединения (16), так и 1,4-присоединения (17) (схема 2, пути а и б, соответственно). При реализации пути а должно происходить отщепление олигонуклеотидного остатка реагента, что будет приводить к образованию продукта (16) с увеличенной электрофоретической подвижностью.

Схема 2.

Мз-

Н2М—'( })—ынх

ЧМ)-(10)

(б) ИН2Я'

(15) (4)

(17)

- Н—^ КНИ

=>т'+ щта

(16)

Я' - *рСЮТАТСрКН(СН;0зга1-1,уз (или РЬе)

\ — / ПК'

0

Х - —^-О-САТАССАА

1

О

При облучении комплексов аминокислотных производных олигонуклеотида (5) и (6) с реагентом (10) было обнаружено, что основной продукт модификации имеет ту же электрофоретическую подвижность, что и соединение (1). Это может рассматриваться как указание на превращение аминокислотных производных олигонуклеотида в амидофосфат (1) в ходе фотомодификации, т. е. на отщепление аминокислотного фрагмента. Масс-спектрометрический анализ образующихся после облучения продуктов также свидетельствует об образовании соединения (1). На спектрах основных продуктов модификации соединений (5) и (6) регистрируется пик с массой 1943,75, что соответствует структуре олигонуклеотидного производного (1). Такое превращение может быть объяснено протеканием реакции модификации по а-аминогруппе в олигонуклеотидных мишенях (5) и (6) с образованием производных типа (16) (схема 2,

путь а). Последующая атака кислородом карбонильной группы аминокислотного остатка электрофилыюго центра фрагмента

и-бензохинондиимина с одновременным разрывом амидной связи приведет к накоплению соединения (1) (схема 3).

и-с-с—НН(СН2)3МНР-ГГ (16)

II н ? ?

N-0-0—МН(СН2ЬННР-Г*"

А' 0-

М-С-С—ГЖ{СН3ЬН(Р-(Г © О-

Н2М(Н2СЬНГ*-Р-ЯИ

И' --СН2РК, ЧСН^МН:

МН(СН2)аМНР-р" он О"

Схема 3.

Отщепление нуклеотидного фрагмента в ходе модификации исключает возможность использования для радиохимической детекции ковалентных аддуктов радиоактивной метки 32Р в олигонуклеотидных реагентах и требует синтеза арилазидной группы, меченной ,4С или 3Н.

Необходимо отметить, что при конструировании фотореагентов на основе (4-азидофенил)-Л^-алкиламина должна учитываться природа спейсера, соединяющего арилазидный остаток с олигонуклеотидом. Так, нами было обнаружено, что в ходе облучения реагента (12) возможно расщепление связи между олигонуклеотидом и спейсером, связывающим фотоактивируемую группу с олигонуклеотидом. Среди продуктов фотолиза соединения (12) основным является соединение, время удерживания которого на анионообменной смоле совпадает со временем удерживания исходного олигонуклеотида. Подтверждением разрушения фосфамидной связи при облучении олигонуклеотидных реагентов на основе Дг-(4-азидофенил)-1,3-диаминопропана служат данные 3,Р-ЯМР спектроскопии. После облучения фотореагента (12) интенсивность сигнала алифатического амидофосфата (5 = 8,7 м. д.) в спектрах реакционной смеси уменьшается, и регистрируется новый сигнал при 5 = 3,7 м. д., который соответствует концевой фосфатной группе олигонуклеотида.

Фотонндуцированные реакции арилазидных реагентов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков

Серьезная проблема, с которой сталкиваются исследователи при интерпретации данных по фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов, связана с наличием вторичных, «темновых», стадий. Ранее, в работе автора [Gall T.S. (Godovikova), и др., 1983] было показано, что при облучении л-азидоанилина и его нуклеотидных производных в водных растворах накапливаются производные л-бензохинондиимина, которые, являясь электрофильными соединениями, могут взаимодействовать с нуклеофильными группами белков. В настоящей работе исследован процесс фотолиза в водных растворах различных по химической структуре ароматических азидов, и показано, что в ходе облучения некоторых из них образуются продукты, которые могут оказывать определенное воздействие на протекание реакции модификации биополимеров.

Фотоиндуцированные реакции в водном растворе реагентов на основе п-азидоанилина и его N-алкильных производных

По данным электронной спектроскопии обнаружено, что в ходе облучения Лг-(4-азидофенил)-1,4-диаминобутана (18) в водных растворах (рН 9,6) накапливается

(18)

>—NH —(СН2)4 —NHZ

hv /—\

(19)

>^0 + 4HJN-(CH2)4-NHiJ

W (20)

;=N-(CH2)t-NH2

продукт (19) с характерным

спектром в УФ-области (А.тах = 271 нм). При добавлении к продукту фотолиза 1 н. НС1 образуется соединение, которое

'шах

Схема 4.

по данным электронной, ИК-, 'Н- и иС-ЯМР-спектроскопии соответствует л-бензохинону (20).

Таким образом, данные настоящей работы и ранее полученные автором результаты указывают на то, что при использовании для фотоаффинной модификации белков реагентов на основе л-азидоанилина модифицирующей частицей может быть не только арилнитрен, но и продукты его дальнейшего превращения - соединения с хиноидной структурой. Для выявления участия л-бензохинониминиминиевого производного в процессе фотоаффинной модификации ферментов нами были поставлены эксперименты по модификации РНКазы А и ДНК-полимеразы I продуктами фотолитического разложения у-(и-азидоанилида)АТР и у-(л-азидоанилида)ТТР, соответственно.

Модификацию ферментов проводили двумя способами. Согласно первому, у-(п-азидоанилиды)ЫТР облучали в присутствии ферментов. Во втором варианте, фотоактивируемые производные Ъ1ТР предварительно облучали, после чего добавляли в реакционные смеси с ферментами. Как видно из данных, представленных в табл. 2, продукты фотолиза арилазидных производных МТР вызывают потерю ферментативной активности, аналогичную той, которая наблюдается при совместном облучении фермента с фотоактивируемым реагентом.

Таблица 2

Изменение активности ферментов* при облучении их су^и-азидоаннлидом^ТР или при добавлении к ферментам предварительно облученных арилазидных реагентов

Фермент Фотоаффинный реагент Активность, %

Панкреатическая рибонуклеаза А 1(Г3 М у-(п-азидоанилид)АТР 75 ±5

Предварительно облученный К) 3 М у-(п-азидоаннлид)АТР 70 ±5

ДНК-полимераза I 4 х 10"4 М у-(л-азидоаннлид)ТТР 78 ±6

Предварительно облученный 4 х 10~4 М у-(и-аз11доаш1лид)ТТР 73 ±10

*3а 100 % активности ферментов принимали активность, измеренную в стандартной реакционной смеси в отсутствие реагента

Совокупность полученных экспериментальных фактов свидетельствует о том, что при использовании реагентов на основе л-азидоанилина в модификации белков могут принимать участие частицы (л-бензохинондиимин и его производные), время жизни которых значительно превосходит время жизни первичных продуктов фотолиза (арилнитренов). Это, несомненно, необходимо учитывать при анализе данных по фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами.

Фотолиз в водных растворах п-азидофенилфосфата (21)

По данным 3|Р-ЯМР, в процессе облучения соединения (21) (рН 5,1) сигнал, соответствующий л-азидофенилфосфату (5 = -3,7 м. д.), исчезает, и появляется сигнал с химическим сдвигом 8 = 0,27 м. д., характерный для иона фосфата. По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения образуется также соединение, электронный спектр поглощения которого соответствует спектру л-бензохинона (20). Для

подтверждения строения продукт фотолиза экстрагировали хлороформом и исследовали с помощью инструментальных методов анализа (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ спектральных характеристик продукта фотолиза (21) (рН 5,1) с литературными данными для л-бензохинона (20)

Метод Экспериментальные данные Литературные данные для бензохннона

УФ-спектроскопия (СЭСЬ, Х;„п, нм, (1Н £)) 246,256 246 (4,30), 255 (4,23)

ИК-спектроскопия (КВг, ст"') 1656 1655 (С=0)

'Н-ЯМР (СБСЬ, 5, ррт) 6,77 (с, Н-2, Н-3, Н-5, Н-6) 6,79 (с, Н-2, Н-3, Н-5, Н-6)

"С-ЯМР (СОСЬ, 6, ррш) 187,11 (с, С-1, С-4), 136,45 (с, С-2, С-3, С-5, С-6) 187,00 (с, С-1, С-4), 136,40 (с, С-2, С-3, С-5, С-6)

По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения соединения (21) в водном растворе с рН 9,6 наблюдается образование соединения с УФ-спектром, характерным для

и-бензохинонмоноимина (22) (А,тах = 254 и 261 нм). Соединение (22) экстрагировали хлороформом, регистрировали 'Н-ЯМР-спектр. Протону иминогруппы отвечает мультиплетный сигнал в слабом поле ( 5 = 10,77 м. д.). Большое число линий указывает на то, что данный протон взаимодействует с соседними неэквивалентными протонами. Кроме мультиплета, в спектре регистрируются четыре дублета ['Н-ЯМР (СОС13, 5, м. д., ^ Гц): 7,27 (д, Н-3, 10,2), 6,76 (д, Н-5, 9,4), 6,62 (д, Н-2, 10,2), 6,46 (д, Н-6, 9,4)], которые представляют спиновую систему АМХС>. Такая сложная спиновая система

обусловлена ограничением во вращении вокруг Ы-С-связи. На основании данных 'Н-ЯМР спектроскопии можно сделать вывод, что из двух возможных резонансных структур, представленных на схеме 5, наибольший вклад вносит структура (22), а не цвиттер-ион (22а).

Для доказательства того, что продуктом фотолиза соединения (21) в водном растворе является п-бензохинонмоноимин (22), был осуществлен встречный синтез данного соединения путем окисления п-аминофенола оксидом серебра в водном растворе. Спектр 'Н-ЯМР продукта окисления л-аминофенола, зарегистрированный в хлороформе, соответствует спектру продукта фотолиза соединения (21) в буфере с рН 9,6.

Следует отметить, что в апротонном растворителе (СОС13) при 25 °С возможен медленный переход структуры (22) из син- в анти-конформацию. В случае син-конформации распределение сигналов в олефиновой области 'Н-ЯМР спектра определяется дезэкранированием ядра Н-3. Протон Н-5 будет экранирован неподелённой электронной парой атома азота, а протоны Н-2 и Н-6 - неподелённой

электронной парой атома кислорода. Спектральные параметры для структуры (22) были определены с помощью двойного гомоядерного резонанса на атомах водорода. Облучение образца слабым радиочастотным полем на резонансной частоте ядра Н-3 приводит к подавлению спин-спиновых взаимодействий ядра Н-2 с ядром Н-3, вследствие чего наблюдается исчезновение расщепления сигнала ядра Н-2 (дублет превращался в синглет). Непрерывное облучение образца на резонансной частоте ядра Н-3 приводит к тому, что происходит насыщение верхнего энергетического уровня этого ядра. В условиях медленного перехода соединения (22) из син- в аноти-конформацию с константой скорости около 1 с-1 «насыщенное» ядро Н-3 становится «насыщенным» ядром Н-5, в результате чего сигнал от ядра Н-5 исчезает из спектра. Подобные изменения в 'Н-ЯМР спектре наблюдали при радиочастотном облучении образца на резонансных частотах протонов Н-2, Н-5 и Н-6.

Таким образом, полученные результаты в совокупности свидетельствуют о том, что при облучении я-азидофенилфосфата (21) в водных растворах образуется гс-бензохинонмоноимин (22), который в силу своей неустойчивости претерпевает дальнейшее превращение в и-бензохинон (20) (схема 6).

Схема 6.

н2о он"

0=Р I.

о

1 (24)

2Н20

- МН(НгР04

О (22)

н2м-сн-соо~

(СН2)4 НЫ-РОз2" (23)

н2ы-сн-соо

(СН2)4 ш2

"ООС—СН- ПН— РОз (СН2)4

ш2

(23а)

Фотопревращение п-азидофепилфосфата при его облучении в присутствии лизина По данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, после облучения соединения (21) в 1 М растворе лизина (рН 9,6) был зарегистрирован сигнал с химическим сдвигом 9,37 м. д. Смещение сигнала исходного фосфомоноэфира (5 = -3,7 м. д.) в слабое поле указывает на превращение его в алифатический амидофосфат. Зарегистрированный сигнал с химическим сдвигом 2 = 9,37 м. д. может соответствовать а- (23а) или е-амидофосфату лизина (23) (см. схему 6). Поскольку арилнитрены не способны образовывать амидофосфаты, можно сделать вывод, что при фотолизе л-азидофенилфосфата образуется реакционноспособное фосфорилирующие соединение, которое модифицирует функциональную группу лизина. На роль этого соединения может претендовать метафосфат (24) (схема 6).

Одновременное образование фосфорилирующего соединения и л-бензохинонмоноимина при облучении реагентов на основе л-азидофенилфосфата выделяет эти фотоактивируемые производные из ряда других арилазидных реагентов. С одной стороны, это фотовключаемые фосфорилирующие реагенты, которые могут обеспечить модификацию аминокислотных остатков, непосредственно контактирующих с фосфатной группой субстрата. С другой стороны, элиминирование реакционноспособного в отношении нуклеофильных центров л-бензохинонмоноимина позволяет рассматривать исследуемый арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент.

Фотоиндуцировапные реакции п-питрозамещенных арилазидов в водных растворах Облучение 3-аминопропиламида 5-азидо-2-нитробензойной кислоты (25) в водных растворах приводит к накоплению трех основных продуктов фотолиза: М-(5-амино-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана (26), Аг-(2,5-динитробензоил)-1,3-диаминопропана (27) и соединения (28), которое элюируется с обращенной фазы при более высокой концентрации ацетонитрила по сравнению с другими продуктами фотолиза. Было обнаружено, что при насыщении облучаемого раствора кислородом выход соединения (28) увеличивается. На основании данных 'Н-ЯМР (табл. 4), этому соединению может быть приписана структура //-(3-аминопропил)-5-{3-(3-амино пропил карбамоил)-4-[3-(3-амино-пропилкарбамоил)-4-нитрофенил-Л'Д'0-азокси]фенил-ОМУ-азокси}-2-нитробенз-амида (28) (схема 7). Строение соединения (28) подтверждено данными 13С-ЯМР и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. В MALDI масс-спектре продукта фотолиза (28) наблюдается пик с т/г 959,25, соответствующий иону этого соединения с дополнительно присоединенными двумя молекулами трифторацетата и ионом натрия, т. е. [Л/(28) + 2 CF3COO" + Na]+. Трифторацетат в составе соединения выявляется также "F-ЯМР-спектроскопией. Появление его в качестве противоиона протонированного аминоспейсера обусловлено использованием раствора трифторуксусной кислоты в качестве элюента в процессе хроматографического разделения продуктов фотолиза арилазида (25).

Таблица 4

Данные 'Н-ЯМР для соединения (28) (DMSO-d6, 5, м. д., J, Гц)

J, Гц Д, 9,0 ДД 9,0, 2,4 Д, 2,4 М м м т, 6,0 т, 6,0 т, 6,0

:н), 3 8,34 4 8,56 6 8,47 8, 8' 9, 9' 10,10' NH NH' NH"

5, м.д. 3' 8,33 4' 8,29 6' 8,13 и 8" и 9" и 10" 9,04 8,99 8,90

3" 8,26 4" 8,22 6" 8,11 3,37 1,83 2,92

(28)

Схема 7.

До настоящего времени продукты фотолиза (26) и (27) (схема 8) рассматривались как результат превращения триплетного

арилнитрена (схема 8, путь а). Появление динитропроизводного (27) объясняли либо непосредственным

взаимодействием триилетиого нитрена с кислородом, либо через окисление образующегося предшественника - нитрозосоединения (29). Ниже, на схеме 8, суммированы все пути, по которым могут протекать в водных растворах фотоиндуцированные реакции реагентов на основе «-нитрозамещенных фенилазидов. На роль предшественника всех выявленных продуктов фотолиза нами впервые предлагается п-нитрозамещенный Л'-арилгидроксиламин (30) - продукт взаимодействия арилнитрена с молекулой воды (схема 8, путь б).

-- N1 —+ а-м=м-я

/ | \ п, ( ' <32)

/

© в

Н2Суд (27) -2 К-Ы = 0-0

/ П °г

' _02__о

Я-Ш—ОН (30)

диспропор-ционирование

(26) (29)

■Я-Н=Л-1 ♦

О (31)

=(

Я-Ы = 0 2 » Я-Ы02 <») (27)

II „ 0

1-.-1 м

г к--®--

= ы—я \

я-ы=м-я

(32)

-N02 Я' = -С-ЫН(СН2)3МН2 (25) к, Я' - Н (33)

Схема 8.

Ароматические /У-замещенные гидроксиламины очень чувствительны к окислителям; в водном растворе при действии кислорода воздуха они довольно быстро превращаются в азоксисоединения (31). Последние являются продуктами конденсации исходного Л'-арилгидроксиламина (30) с продуктом его окисления -нитрозосоединением (29). Другой, независимый от кислорода, путь образования нитрозосоединения - реакция диспропорционирования Л'-арилгидроксиламина. Из всех возможных химических процессов, протекающих с участием ТУ-арилгидроксиламинов, именно окисление кислородом воздуха и диспропорционирование представляют наибольший интерес с точки зрения метода фотоаффинной модификации. В обоих случаях может образоваться реакционноспособное в отношении функциональных групп белков нитрозосоединение (29) (схема 8, путь б).

При облучении водного раствора и-нитрофенилазида (33) в присутствии 30 % метанола (рН 8) нам удалось зарегистрировать образование Л?-(л-нитрофенил)гидроксиламина (30) (Я' = Н). В ходе фотолиза наблюдалось образование соединения, электронный спектр поглощения которого был аналогичен описанному в литературе для Л^-(/г-нитрофенил)-гидроксиламина (А.тах = 357 им). Выделение и идентификация Л'-арилгидроксиламинов затруднительны из-за неустойчивости соединений в водных растворах. Образование /У-арилгидроксиламина (30) в ходе облучения 4-нитрофенилазида в водных растворах было подтверждено реакцией азоксисочетания продукта фотолиза с 1-нитрозо-4-нитробензолом (29) (Я' = Н). Для того чтобы исключить влияние кислорода, фотолиз и-нитрофенилазида (33) в присутствии «ловушки» - 1-нитрозо-4-нитробензола - проводили в атмосфере

аргона. Предварительно было показано, что в условиях облучения нитрозосоединение устойчиво. Было обнаружено, что с увеличением дозы облучения, молярный коэффициент экстинции в области максимального поглощения 1-нитрозо-4-нитробензола (^.тах=282нм) падает. Это указывает на вовлечение нитрозосоединения в реакцию. Образующееся при этом соединение было выделено и идентифицировано нами как 4,4'-динитроазоксибензол (31) (Я' = Н).

Дополнительно мы исследовали взаимодействие 1 -нитрозо-4-нитробензола с предоблучённым азидом (33) (табл. 5). Как видно из данных табл. 5, с повышением концентрации 1-нитрозо-4-нитробензола выход 4,4'-динитроазоксибензола увеличивается симбатно. Это еще раз свидетельствует о том, что при облучении л-нитрозамещённых арилазидов в водных растворах в качестве активного промежуточного соединения может образоваться Д'-арилгидроксиламин.

Таблица 5

Зависимость выхода 4,4'-диинтроазоксибензола (31) от соотношения л-нитрофенилазид (33)/1-нитрозо-4-нитробензол (29)

Соотношение концентрации соединений (33) / (29) В отсутствие (29) 3,6/1 0,7/1

*Выход соединения (31), % 15 31 73

* - Выход оценен как молярный эквивалент относительно исходного количества

1 -нитрозо-4-нитробензола.

Характер конечных продуктов реакции диспропорционирования Д'-арилгидроксиламипов будет определяться рядом факторов. Известно, что диспропорционированию способствует формирование комплекса с переносом заряда. Для Д'-арилгидроксиламипов с таким заместителем в пара-положении как нитрогруппа, характерно образование комплексов при рН ~ 10. В случае производного гидроксиламина (30) (Я' = -С(0)МН(СН2)зМН2) в молекуле присутствует аминоспейсер, рЯ"а аминогруппы которого находится в области значения р/<"а для гидроксигруппы л-нитрозамещенного гидроксиламина (р/<*а = 10,2). Это может способствовать смещению равновесия в сторону образования цвиттер-иона гидроксиламина - соединения (30а) (схема 9).

Взаимодействие соединения (30а) с электронодефицитным нитрозосоединением (29) приведет к формированию комплекса с переносом заряда. В результате восстановления нитрогруппы в реакционной смеси будет появляться 2,5-динитрозопроизводное (34). Как было отмечено выше, для нитрозосоединений характерно вступать в реакции с Д'-арилгидрокси л аминами с образованием азоксисоединений. Вероятно, тример (28) является продуктом азоксисочетания динитрозопроизводного (34) с двумя молекулами Л^-ар ил гидроксиламина (30) (схема 9). Появление среди основных продуктов фотолиза «тримера» (28) при практическом отсутствии димерного азоксисоединения (31) -продукта азоксисочетания нитрозосоединения (29) с гидроксиламином (30) -обусловлено, вероятно, тем, что динитрозопроизводное (34) обладает большей реакционной способностью в реакции азоксисочетания, чем мононитрозосоединение (29).

.СО-Ш(СН2)3Ш5*

СНЩ3Ш-ОС?

N0; (30а)

;0Н ¡/ \ ы^—о-ны—■' *

СО-Ш(СН2)3МН3* СО-Ш(СН2)зМН3*

:0Н

0=Н

N=0 + ——

(34) ^СО-МЩСНгЬМН/ СО-Ш(СН2)5Ш)'

М ^ М

СО-ЫЩСНЖЫН СО- МН(СН2))МНЛ"-

(30) | *

(28) Схема 9.

Совокупность полученных нами результатов указывает на то, что при облучении фотоаффинных реагентов на основе я-нитрозамещенных арилазидов могут образоваться долгоживущие химически активные соединения - нитрозосоединения. В связи с высокой реакционной способностью данных продуктов фотолиза повышается вероятность протекания вторичных, т. е. «темновых» процессов. Исследования темповых процессов с возможным участием продуктов фотолиза и-нитрозамещенных арилазидов представлены в разделе «Продукты фотоиндуцированного взаимодействия функциональных групп белков с реагентами на основе ароматических азидов».

Фотохимическое превращение перфторировапного ароматического азида в водном растворе

Исследование фотопревращения перфтоарилазидных реагентов в водном растворе проводили на примере облучения раствора 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной

кислоты (35). На основании данных

/IV

(35)

Схема 10.

инструментальных методов анализа был сделан вывод, что основным продуктом, образующимся в ходе облучения перфторарилазида (35), является 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота (36) (схема 10). Электронный спектр поглощения продукта фотолиза соответствует спектру л-аминоперфторбензойной кислоты (\мах = 287 нм). В |3С-ЯМР спектре соединения (36), записанном в СЭзСЫ, наблюдаются семь сигналов, характерных для 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты. Слабопольный сигнал при 5 = 161,9 м. д. соответствует сильно дезэкранированному атому углерода С-7 карбоксильной группы. Далее последовательно располагаются в спектрах две группы пиков углеродов С-2, С-6 и С-3, С-5. Этим четырем атомам соответствует четыре сигнала: [|3С-ЯМР (ОгО, 8, м.д.): 145,9 (С-2), 149,5 (С-6), 135,6 (С-3), 138,1 (С-5)]. В этой группе распределение сигналов подвергается влиянию заместителей в ароматической системе аналогично сигналам атомов углерода, непосредственно связанных с заместителями. Более сильное смещение в сторону слабого поля сигналов С-2 и С-6 объясняется вицинальным

положением соответствующих атомов углерода относительно карбоксильной группы. Сигиал при 8 = 132,1 м. д. соответствует атому углерода С-1, а сигнал при 5 = 98,7 м. д. - углероду С-4.

Магнитная неэквивалентность атомов углерода в 2 и 6, 3 и 5 положениях соединения (36), вероятно, вызвана неэквивалентностью атомов фтора. В то время как 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильный остаток, с точки зрения спин-спинового взаимодействия ядер фтора, представляет собой типичную АА'ХХ' систему, в 19Р-ЯМР спектре продукта фотолиза (36) регистрируются два мультиплетных сигнала - 5 = 19,17 м. д. (м, 2Р, Р-2, Р-6) и 5 = -1,5 м. д. (м, 2Р, Р-З, Р-5) с равной интенсивностью. Магнитная неэквивалентность атомов углерода в 2 и 6, 3 и 5 положениях в 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоте, очевидно, обусловлена наличием в кольце такого заместителя как аминогруппа. Возможно, присутствие в составе молекулы продукта фотолиза функциональной группы, способной к образованию водородной связи, и такого электроотрицательного атома как фтор будет способствовать образованию внутримолекулярной водородной связи. Это, в свою очередь, приведет к неэквивалентности углеродов в орто- и орт о '-положениях в связи с тем, что один из них будет связан с фтором, принимающим участие в образовании водородной связи с аминогруппой.

Таким образом, нами обнаружено, что в отличие от всех остальных исследованных в рамках настоящей работы ароматических азидов, фотохимические превращения перфторарилазида в водной среде сходны с описанными реакциями в органических растворителях. Отличительным свойством перфторированных ароматических азидов является их способность с высокой эффективностью образовывать ковалентные аддукты с углеводородными и ароматическими молекулами при облучении в апротонной среде. В экспериментах на модельном дуплексе нами была продемонстрирована высокая эффективность фотомодификации боковых радикалов ароматических аминокислот такого типа реагентами (см. данные табл. 1). В связи с этим, можно полагать, что использование перфторарилазидов в качестве функциональных групп фотоаффинных реагентов обеспечит высокую эффективность образования фотосшивок, по крайней мере, к гидрофобным участкам белков и гетероциклическим основаниям нуклеиновых кислот.

Продукты фотоиндуцированного взаимодействия функциональных групп белков с реагентами на основе ароматических азидов

Для установления строения продуктов фотомодификации аминокислотных остатков нами предложен общий методический подход, в котором такая ключевая черта фотоаффинной модификации как протекание реакции в условиях сближения реакционных центров воспроизведена на простых модельных системах, а именно:

1) аффинный комплекс - стрептавидин*фотоактивируемый аналог биотина;

2) соединения, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка.

Общая стратегия определения структуры продуктов функциональных групп белков представлена на схеме ] 1.

Схема 11.

фотомодификации

(K.-1Ü М| Комплекс стрептпенднп-фогобиотмн

Г идролкзат

УФ-, MALDl-масс-сп&хтрос*стчя

1 IIN"'^ N'11 й> от Об НОТ ни -н. "llj—Ctlí—Г"r-f »1

с-а

Ai-N,—

CrpyifTypa продукта фото мо диф и к а ци и

]

ЯМР-. И К- УФ-, М ALL1I-мвес-спект рос когтив

Анализ послсдоаатет,нси:ти методом Эдмана

М ОД И фшд+1 р о fi л 11 н к 11

амин о к И СЛОТ И Ы11 ОС Т 1 ТОН

Выбор для фогоаффшшой модификации стрептавидина в качестве белковой мишени обусловлен тем, что этот Оелок характеризуется экстремально высоким сродством к биогину (!<„ = 10й М-1). Прочное связывание реагента (производное биотипа, содержащее остаток арилазида) с Объектом модификации (стрептапидип) позволяет ограничить область модификации функциональных групп белка в пределах участка связывания лиганда. Сочетание «селективного» фотоаффинного мечен им белка в составе модели стр ептавидин »фогоашшог биотина с использованием

высокочувствительных методов структурного анализа пептидов позволяет решить вопрос о природе модифицированной аминокислоты и получить минимальный набор спектральных данных для модифицированного пептида (УФ, МЛЫЛ-ТОР МЭ)

Задачей следующего этапа является создание с помощью методов синтетической органической химии «миниатюрной» модели, в которой увеличивается вероятность возникновения благоприятной взаимной ориентации реагирующих групп. Низкомолекулярдая модель лишена макромолекуяярного пептидного остова В то же время, она состоит из сближенных при помощи линкера ароматического азида и аминокислотного остатка, аналогичного тому, который подвергается модификации в белке. Данная модель должка обеспечить получение продуктов фото взаимодейств и я ароматического азида с аминокислотным остатком в количествах, достаточных для их анализа с помощью стандартного набора инструментальных методов исследования (УФ, ЯМР, МЗ).

Разработка общего методического подхода к изучению продуктов фотоаффинной модификации белков и демонстрация первых результатов по использованию предложенных моделей для установления строения продуктов фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков были проведены нами на примере реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты. Выбор такого типа арилазида в качестве объекта исследования обусловлен тем, что присутствие в молекуле реагента такой хромофорной группы как -Ы02 облегчает детекцию модифицированного белка и пептидов при их выделении с целью последующего анализа.

Фотовзаимодействие и "темновые" реакции фотоактивируемых аналогов биотина с активным центром стрептавидина

Возможность участия в модификации белков долгоживущих интермедиатов, генерируемых при облучении реагентов, несущих 5-азидо-2-нитробензоильную группу, исследовалась нами на примере фотоиндуцируемой аффинной модификации стрептавидина фотоактивируемыми аналогами биотина (37), (38) и (39) (схема 12).

Схема 12.

о

Из-

ЬТО N4 3

И-ИН-С-СН2-СН2-СН2-СН2'5- Э 1-= К=—СН2-СН2-КН—С"' - ' "N3 ю- 9- 8- 7- 6"а 2' Г О

б-р (37)

°2М 2 '... 1 0;Ч 2 ' „

71»

-СН2-СН2-СН2-МН—С л N3 —СНгСНг-СН^-СНгИН—с-' "-Ц,

о

о

(38) (39)

В экспериментах мольное отношение лиганд/белок составляло 4:1. В табл. 6 приведены данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (37) при различных условиях проведения реакции. Видно, что как в случае реакционной смеси с облучённым комплексом стрептавидин»фотобиотин (37) (реакционная смесь I), так и при модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения (37) (реакционная смесь II) образуются модифицированные пептиды, время удерживания которых на смоле с обращенной фазой практически совпадает (фракция 3).

Таблица 6

Данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (37) при различных условиях проведения реакции

№ реакц. смеси. Облучение фотобиотина Облучение реакц. смеси Хроматографнческие данные ** (время удерживания, мин)

1 — 40 с 6,97 (1), 11,72 (5)

II 40 с — 6,74 (1), 9,42 (2), 11,69 (5)

Контрольный эксперимент* 6,83 (7), 9,42 (2)

* — облученный фотоаналог биотина, ** — детекция при X = 360 нм

В ходе аналогичных экспериментов, проведенных с использованием в качестве лиганда фотоаналогов биотина (38) и (39), получается более сложный набор модифицированных пептидов (данные не приведены), но анализ соответствующих хроматографических данных также свидетельствует о протекании «темновой» стадии модификации.

Представленные выше результаты указывают на то, что при использовании реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты частицей, модифицирующей белок, может быть не арилнитрен, как считали ранее, а продукт его дальнейшего превращения, например, нитрозосоединение. Его предшественником, как было описано выше, может быть А^-арилгидроксиламин, который образуется в качестве промежуточного активного соединения при облучении и-нитрозамещённого арилазида в водном растворе (схема 8). Однако представленные ниже данные электронной спектроскопии указывают на то, что судьба арилнитрена, генерируемого в ходе облучения фотоактивируемых аналогов биотина, будет определяться размером спейсера, связывающего биотиновый остаток с арилазидной группой. Так, характер изменений в спектрах поглощения при фотолизе соединения (37) (рис. 1, а) аналогичен изменениям в спектрах поглощения, наблюдаемых при облучении фотобиотина (39) (данные не представлены). В то же время, при регистрации спектров продуктов фотолиза фотобиотина (38) наблюдаются отличительные особенности (рис. 1, сравни я и б).

¡0.4

I ,

Рис. 1. Изменения электронных спектров поглощения 0,5 мМ водно-спиртовых растворов (8 % МеОН) фотоаналогов биотина (37) (а) и (38) (#), при облучении в течение 0 с (+ + +), 8 с

(* * *), 16 с (---), 24 с (• - • •), 35 с (----), 55 с (.....), 75 с (-), 95 с (-------), X = 313 и 365

нм, 0,1 см кварцевая кювета.

Одним из путей превращения арилнитрена, образующегося при фотолизе соединения (37), может быть его внутримолекулярное взаимодействие с биотиновым остатком с образованием, согласно данным 'Н-ЯМР (табл. 7), циклического иминосульфурана (40) (схема 13). На преимущественное протекание внутримолекулярной реакции арилнитрена с биотиновым фрагментом также указывает возрастание процентного содержания основного продукта фотолиза (40) при понижении концентрации исходного арилазида (37) в облучаемом водном растворе.

Таблица 7

Данные 'Н-ЯМР для соединений (40) и (41) (CD3CN, 5, м. д. и J, Гц)

(Н) 3, д, 4, дд, 6, д 1е", дд 1а", дд 2", ддд 4", дд 5", ддд

(40) 5 8,07 7,19 7,24 4,10 3,96 4,9 4,78 4,22

J 9,0 9,0,2,5 2,5 13,2, 6,0 13,2,3,0 8,0, 6,0, 3,0 8,0, 5,5 10,5, 5,5,4,0

(41) 5 7,97 6,70 6,64 2,83 3,24 4,77 4,64 2,69

J 9,0 9,0,2,5 2,5 15,0,6,5 15,0, 1,5 8,5, 6,5, 1,5 8,5,6,0 10,0, 5,0,6,0

Соединение (40) оказалось неустойчивым. Время полупревращения 2,5 мМ водного раствора соединения (40) в единственный продукт - Лг-(5-амино-2-нитробензоил)-Л^'-(<^-(5-оксо)биотинил)-1,2-диаминоэтан (41) - при комнатной температуре составляло 8,5 суток (схема 13). Строение соединения (41) подтверждено спектральными данными ('Н-ЯМР (табл. 7), |3С-ЯМР, ИК, MS). В ИК-спектре аминопроизводного (41) наблюдается сильная полоса поглощения при значении волнового числа 1097,9 см"1, что может быть вызвано валентными колебаниями связи S=0. В масс-спектре этого соединения регистрируется сигнал с m/z 437,2, соответствующий иону [М - NO + Н]+.

ni

о

ÖL

о

"(сн^-с"

NH

C-NH-CH;

II

О

0

1

HN NH

ь.

о

(СНЛ-с' \

NH

C-NH-CHj-illj

2'ü, Г Г (40)

s@

I

CH2 c-nh-ch2

NO, О

Схема 13.

При фотолизе соединения (37) не было обнаружено продуктов, характерных для реакций триплетных нитренов. В то же время известно, что диалкилсульфиды часто используются в качестве ловушек синглетных нитренов. Таким образом, можно предполагать, что синглетный арилнитрен, образующийся при фотолизе соединения (37), не претерпевает интеркомбинационного перехода в триплетное состояние, а при создавшихся благоприятных условиях (близко расположенный нуклеофильный центр на биотиновом остатке) взаимодействует с нуклеофильным атомом серы. Однако возможность образования соединения (37) через взаимодействие триплетного нитрена с атомом серы биотинового остатка также нельзя упускать из рассмотрения. Такое

взаимодействие может протекать легко за счёт того, что электроноакцепторная нитрогруппа будет способствовать восстановлению нитрена с образованием сульфилимина (40).

Образование продуктов сульфиминовой природы при фотоаффинной модификации белков может привести к снижению выхода ковалентных аддуктов между фотореагентом и белком по трем причинам: 1) за счёт реакции нитрена с компонентами буфера (тиолсодержащими соединениями); 2) за счёт гидролиза ковалентных аддуктов с сульфиминовой связью, образующихся в случае модификации серусодержащих аминокислотных остатков; 3) в связи с возможным образованием ковалентно соединённых между собой участков внутри модифицированного белка за счет реакции активного сульфинимина с нуклеофильным боковым радикалом соседнего аминокислотного остатка.

Анализ модифицированных пептидов. Установление первичной структуры модифицированных пептидов проводилось нами с использованием стрептавидина, модифицированного реагентом (38) или фотобиотином (39). Что касается модификации стрептавидина фотоактивируемым аналогом биотина (37), в этом случае наблюдалось образование ковалентных аддуктов с неустойчивой ковалентной связью. По этой причине данные модифицированные пептиды в рамках настоящей работы не подвергались сиквенс-анализу. В случае реагента (38), для секвенирования по Эдману использовали модифицированный пептид, который, с одной стороны, образуется непосредственно при облучении комплекса стрептавидин*фотоаналог биотина (38), а с другой стороны, является продуктом реакции стрептавидина с долгоживущим интермедиатом, генерируемом при фотолитическом разложении соединения (38).

Индивидуальные пептиды, модифицированные реагентом (38) или (39), были получены в количествах (20-40 нмолей), достаточных как для секвенирования, так и для исследования их с помощью электронной спектроскопии. Смещение максимумов кривой поглощения модифицированных пептидов в длинноволновую часть спектра указывает на присутствие в составе продуктов хромофорной группы реагента (Лтах~385 им).

Последовательность аминокислотных остатков пептида, выделенного из гидролизата стрептавидина, модифицированного фотоаналогом биотина (38), была определена как Gly(74)Trp*ThrValAlaTrp*LysAsn(81), где Тгр* - модифицированный остаток триптофана. В MALDI-масс-спектре продукта регистрируется сигнал с m/z - 1455,1, соответствующий массе иона, образованного пептидным фрагментом с дополнительно присоединенным остатком арилнитрена и двух атомов кислорода. Последовательность аминокислотных остатков пептида, модифицированного фотоактивируемым аналогом биотина (39), была определена как Ser(52)ArgTyr*ValLeu(56), где Туг* -модифицированный остаток тирозина.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты проявляют некоторую избирательность по отношению к боковым радикалам ароматических аминокислот. В связи с этим, на следующем этапе нами были сконструированы низкомолекулярные модели, в которых

остатки ароматических кислот и 5-азидо-2-нитробензоильная группа были объединены в одной молекуле спейсером определенного размера. Роль последнего заключалась в обеспечении необходимого пространственного сближения двух ароматических фрагментов для реализации атаки арилнитрена по боковому радикалу тирозина или индольному остатку триптофана.

Продукты фотоипдуцированного взаимодействия 5-азидо-2-питробензоильных

реагентов с боковыми радикалами ароматических аминокислот

Учитывая результаты компьютерного моделирования, выполненного для нескольких

модельных соединений, для решения задачи по установлению строения продуктов

фотоиндуцированной модификации функциональных групп тирозина и триптофана мы

синтезировали Л^-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-этил}-5-азидо-2-

нитробензамид (42) и /У-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропионил-амино]-пропил}-5-

азидо-2-нитробензамид (43) (схема 14). Именно в данных модельных соединениях

реализуется благоприятная взаимная ориентация реагирующих групп.

N0,

02 И" н н2 н2 н2 н

—с—м—с—с—с—с—с—ин3' « "

....... . 6"ЛгЧ

С—С—С-С—N4,' ч

—М—С—С—С-С—N43* >2"

н

8" ' Н 1"

(42) Схема 14. («)

При анализе методом микроколоночной обращено-фазовой ВЭЖХ реакционных смесей, полученных при облучении соединения (42) в разных условиях, было обнаружено, что присутствие кислорода существенно влияет на набор продуктов фотолитического разложения соединения (42) (табл. 8).

Таблица 8

Распределение продуктов фотолиза соединения (42) в зависимости от условий облучения

[(42)], мМ Продукты фотолиза и их относительное содержание*, %

(44) (45) (46) (47) (48) (49) (50)

0,062" (н. у.) 12 14 7 13 10 4,5 14

0,062° (и. у.) 28 13,8 16 10,8 4

0,062" (02) 28,6 18,8 2,5 11,7 15,1

0,062г' (02) 39,6 8,3 29,8

0,062" и 0 (Аг) 23,3 15 9,7 32,5

Примечание. Здесь * - Количество продукта, оцененное интегрированием соответствующего хроматографического пика. Детекция на X = 220 нм. "Хроматографические профили получены сразу после облучения соединения (42). бХроматографические профили получены после выдерживания облученной реакционной смеси в темноте в течение 20 ч при 20 °С. Н. у. -нормальные условия.

Электронный спектр поглощения одного из неустойчивых продуктов (соединение (50)), образующихся в присутствии кислорода, (Я.тах = 278 нм) близок к электронному спектру поглощения 1-нитро-4-нитрозобензойной кислоты (Хтгх = 282 нм).

Устойчивые продукты фотопревращения соединения (42) были получены в количествах, достаточных для их анализа с помощью 'Н-ЯМР, электронной спектроскопии и МАЬШ-ТОР-масс спектрометрии. Среди продуктов фотолиза были обнаружены соединения (46)-(49), которые, по данным спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н (табл. 9), содержат остаток тирозина, структурно аналогичный остатку тирозина в исходном соединении (42). Это указывает на отсутствие модификации по боковому радикалу аминокислоты. На основании данных инструментальных методов анализа, продуктам фотолиза соединения (42) могут быть приписаны следующие структуры: амино-(46), нитро-(47), азокси-(48) и азосоединения (49) (схема 15).

Схема 15.

(42)

О ^ N

НИ Н2С

\

н,с.

Л/

'<4

II N4,*

(44) (нестабильное) АгМН2 + АгГЧОа + Аг— ГЧ^—Аг 4- Аг— М = Аг +

(46) (47)

(45)

О—Г^Лг I + другие продукты

При анализе данных по фотолизу соединения (42) в атмосфере аргона интригующим моментом является образование азоксисоединения (48) (табл. 8). Этот результат не укладывается в рамки предлагаемой до настоящего исследования концепции механизма фотолиза арилазидов. До сих пор образование азоксисоединений при фотолизе арилазидов рассматривалось как результат взаимодействия триплетного нитрена с нитрозосоединением, который, в свою очередь, может быть продуктом реакции арилнитрена с кислородом (см. схему 8, путь а). Учитывая, что при облучении в водных растворах лара-нитрозамещенных арилазидов может образоваться, как было описано выше, //-замещенный арилгидроксиламин (см. схему 8, путь б), мы впервые предлагаем его на роль предшественника ароматических амино- (46), азокси- (48), азо-(49) и нитрозосоединений (50).

Структура соединения (45) формально соответствует продукту внедрения высокореакционноспособного арилнитрена по связи С-Н бокового радикала тирозина, находящейся в орто-положении по отношению к гидроксильной группе. На это указывают данные 'Н-ЯМР спектроскопии. В ароматической части 'Н-ЯМР-спектра остатка тирозина наблюдаются существенные изменения (табл. 9):

1) не регистрируется сигнал Н-3", и изменяются химические сдвиги протонов Н-2", Н-5" и Н-6";

2) Н-7" - протоны метиленовой группы становятся неэквивалентными, а из-за конформационных изменений в алифатическом фрагменте изменяются константы их спин-спинового взаимодействия с Н-8" протоном.

Таблица 9

Данные 'Н-ЯМР спектроскопии для соединения (42) и продуктов его фотолиза в

воде; (5, ррш; J, Нг)

Соединение Н-2", Н-6" Н-3", Н-5" Н-7" Н-8" Н-1' Н-2' Н-3 Н-4 Н-6

(42) 7,0, д. 7 = 8,0 6,74, д. 7 = 8,0 3,07, д. 7=7,0 4,11, т. 7=7,0 3,3—3,6, м. 8,21, д. 7 = 8,8 7,31, дд. 7 = 8,8, 7=2,5 7,10, д. 7 = 2,5

(45) 7.41, д. н2- 7 = 1,8 6,93, дд. 7 = 8,0, 7=1,8 7,01, д. Н5- 7=8,0 3,25, дд. 7=14,0, 7 = 2,0 3,18, дд. 7= 14,0, 7 = 7,0 4,23, дд. 7= 14,0, 7 = 2,0 3,3-3,6, м. 8,15, д. 7 = 9,2 7,07, дд. 7 = 9,2, 7=2,6 7,23, д. 7=2,6

(46) 7,14, д. 7 = 8,0 6,79, д. 7=8,0 3,0-3,2, м. 4,15, т. 7=7,0 3,3-3,6, м. 8,07, д. 7 = 9,2 6,81, дд. 7=9,2, 7 = 2,5 6,60, д. 7 = 2,5

(47) 7,14, д. 7 = 8,0 6,77, д. 7 = 8,0 3,0-3,02, м. 4,16, т. 7=7,0 3,3-3,6, м. 8,38, д. 7 = 9,0 8,55, дд. 7=9,0, 7 = 2,5 8,41, д. 7=2,5

(48) 7,10, д. 7 = 8,0 6,72, д. 7=8,0 3,11, д. 7 = 7,0 4,16, т. 7=7,0 3,3-3,6, м. 8,34, д. 7 = 8,8 8,39 д. 7 = 8,8 8.14, дд. 7=8.8, 7 = 2.5 8.53 дд. 7=8.8, 7=2.5 8.11,д. 7 = 2.5 8.40 д. 7=2.5

(49) 7,09, д. 7 = 8,0 6,71, д. 7=8,0 3,1, д. 7 = 7,0 4,16, т. 7=7,0 3,3-3,6, м 8,39, д. 7 = 8,8 8,16, да. 7=8,8, 7 = 2,5 7,95, д. 7 = 2,5

Кроме этого, сигналы Н-2" и Н-6 ароматических протонов существенно сдвинуты в более слабое поле по отношению к их рассчитанным значениям с учетом влияния заместителя. Вероятно, это связано с анизотропным эффектом близко расположенных ароматических колец. Внедрение нитрена в Н-3" положение может быть дополнительно подтверждено значением константы спин-спинового взаимодействия (У2",б" = 1,8 ± 0,3 Нг). В случае внедрения арилнитрена в Н-2" положение, значение константы спин-спинового взаимодействия Цу\у) должно быть больше, чем 2,5 Нг. Следует отметить, что строение соединения (45) не может соответствовать какой-либо хиноидной структуре, т. к. значение константы спин-спинового взаимодействия (/¡".в") для таких соединений должно быть более 10 Нг. В пользу структуры (45) указывают

также данные MALDI-TOF масс-спектрометрин. Наиболее интенсивный пик m/z 355,3 соответствует рассчитанной массе молекулярного иона [М - NO]+. Кроме этого, зарегистрированы пик с m/z = 408,2, соответствующий рассчитанной массе молекулярного иона [М + Na]+, пики с m/z = 392,2 [М + Na - 0]+ и m/z = 378,2 [М + Na - NO]+.

На то, что соединение (45) является продуктом внутримолекулярной реакции, указывают также данные по исследованию фотолиза соединения (42) при разных концентрациях. Так, при концентрациях 6,2 х 10~5М, 0,36 х 10~3 М и 1,12 х 10~3М доля соединения (45) составляет, по данным хроматографического анализа, 28 %, 1 % и 0,6 %, соответственно.

Нами предлагается несколько возможных путей, приводящих к образованию (14-амино-19-гидрокси-6-нитро-2,9,12-триазотрицикло-[14.3.1.13,7]генэйкоза-1(20),3,5,7(21),16,18-гексаен-8,13-диона - продукта внутримолекулярной циклизации (45) (схема 16). При поглощении кванта света азидогруппа из основного состояния (S0) переходит в возбужденное (S^ (42*S). После этого происходит стабилизация возбужденного состояния путем отщепления молекулы азота с образованием синглетного нитрена(51) (схема 16).

Схема 16.

(42-Т) (53) (54) (55)

Синглетный арилнитрен (51) может внутримолекулярно взаимодействовать с ароматической системой тирозина по пути а (схема 16). Однако выход продукта фотолиза (45), образующегося по пути а, не может превышать 14 %, т. е. того количества, которое образуется в ходе облучения (табл. 8). Из данных табл. 8 видно, что образование соединения (45) происходит также в результате темновых превращений соединения (44). На роль соединения (44) можно предложить циклический О-замещенный Л'-арилгидроксиламин, который может образоваться в

результате прямого внедрения арилнитрена в О-Н-связь (схема 16, путь б). Соединение (44) образуется с более высокими выходами при облучении раствора арилазида, насыщенного кислородом. Это указывает на то, что в водных растворах возможен еще и другой, кислород-зависимый, путь его образования, вероятно, через генерирование триплетного нитрена (53) с последующим превращением его в бирадикальное производное (54) (схема 16, путь в).

Фотоипдуцировапное взаимодействие 5-азидо-2-нитробеизоилъпой группы с боковым радикалом триптофана

Среди продуктов фотолиза соединения (43) наряду с устойчивыми соединениями (58) и (59) (см. схему 17) было выделено соединение (57), которое с течением времени распадалось с образованием трех основных продуктов: неустойчивого соединения (60) и двух устойчивых соединений (59) и (61). На основании сходства химического поведения и электронных спектров поглощения продукта (57) (Хтах = 358 нм) и и-нитрофенилгидроксиламина (Хтах = 356 нм), соединение (57) было отнесено нами к производному //-замещенного арилгидроксиламина (схема 17). Согласно данным 'Н-ЯМР и электронной спектроскопии, а также МА1Л31-масс-спектрометрии, соединению (58) может быть приписана структура азоксисоединения, а соединению (59) - структура аминосоединения (схема 17).

При сравнении электронных спектров поглощения триптофана и соединения (61) выявляются изменения в области поглощения, соответствующей поглощению индольного кольца. Кроме того, в спектре соединения (61) наблюдается полоса поглощения (^-шах = 382 нм), свидетельствующая о наличии 5-амино-2-нитробензоильного остатка (Х.тах = 383 нм).

о ч-С.

- 3(43) II- -N4

?Ы2 '

З'СН; ЫН 12" ¿-О

^"--¿сн.ю-

о

К-С,

.а

о

N-0 N

н2о

О

н-й

■ (60)

днспропорционирование

О;

ч-с б 02Ы'

..N-0

°ГТ

'V

Ч4"

5-

/

(60)

о^

(59)

б^лЬ-СНа-бн-Ь-МН-СНгСНзСНгМН С^^ДА №1г

о2ы с-я

(58) О

У Г (61)

О^ 2 "

иХ

ОС? Ю" 11" 12Г 8- ИН21-

Схема 17.

Согласно данным 'Н-ЯМР, соединению (61) может соответствовать структура Дг-{3-[2-амино-4-(2-аминофенил)-4-оксобутириламино]-пропил}-5-амино-2-нитробенз амина (табл. 10, нумерация атомов для соединения (61) приведена на схеме 17 и аналогична нумерации для соединения (43)). Данные МА1Л}1-ТОР-масс спектрометрии подтверждают образование производного кинуренина (61). В масс-спектре соединения

(61) регистрируются сигналы с m/z 427 [М + Н]+, m/z 397 [М - N0]+, m/z 381 [М - NO -

or.

Таблица 10

Данные 'Н-ЯМР для соединения (61) (D20, 5, м. д. и J, Гц)

(II) 3 4 6 2" 5" 6" 7" 8" 10" 11"

о 8,04 6,77 6,65 — 7,84 7,45 6,82 6,91 3,78 4,50

J д, дд Д, — д, т, т, д, д, т,

9,0 9,0,2,4 2,5 8,0 8,0 8,0 8,0 6,0 6,0

Образование предшественника соединения (61) является кислород-зависимым процессом. Среди стадий процесса фотопревращения арилазида (43) кислород-зависимой стадией может быть окисление Л'-арилгидроксил амина (57), приводящее к образованию нитрозосоединения (60), которое, кроме того, может образоваться за счёт диспропорционирования соединения (57) (см. схему 17). Продуктом конденсации исходного //-арилгидроксил амина с нитрозосоединением будет азоксисоединение (58). Взаимодействие арилнитрозогруппы с индольным кольцом триптофана, вероятно, приводит к образованию продукта (61). При реакции диспропорционирования ТУ-арилгидроксиламина (57) наряду с нитрозосоединением будет также накапливаться аминосоединение (59) (схема 17).

С учетом того, что для нитрозосоединений с нитрогруппой в пара-положении бензольного кольца возможно образование комплексов с переносом заряда, можно предложить следующий путь взаимодействия нитрозосоединения (60) с функциональной группой триптофана, в результате которого будет накапливаться соединение (61) (схема 18).

NH-

от

ш,

VnH~н 0=N_ о 9Нз

<IT>-C-NH-CH2'fcH2 NO, (60)

NH,

C-CH,-Cll-C-NH Ö ° ¿H,

Н2Ьл Р Ц

f VC-NH-CH,

Но2(6,>

перенос 1 е

•O-N

NH2

H-N--Н

О

Н30*

О H

¿'jQ- NH2

C>CH,-Ck-C-NH

i> о ¿н,

H?J I "

Ьл 0 г"2

{Vc-NH-CH, NO,

NH, NH,

СН,СНС=0 ^ 4^_sCH,-CHC=0

NH ■ NH

¿H.^Thn n0 H ¿h,

! <3VtNH-CH;tH2

NO, NH2 CH,-ck-C-NH ° ¿H,

Схема 18.

В свете полученных результатов по фотовзаимодействию 5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с остатками ароматических аминокислот, можно сделать вывод, что мишенями при фотоаффинной модификации белков могут быть боковые радикалы таких ароматических аминокислот как тирозин и триптофан. Однако в случае триптофана могут образоваться продукты «скрытой» модификации типа (61). Отсутствие ковалентных аддуктов реагента с белковой мишенью будет

создавать большие затруднения при выделении модифицированного белка с целью последующего установления точки модификации.

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоилыюй группы с боковым радикалом тирозина

Результаты, полученные нами при исследовании фотоиндуцированной модификации аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе (табл. 1), свидетельствуют о том, что реагенты на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с высокой эффективностью модифицируют боковые радикалы ароматических аминокислот. Для установления строения продуктов фотомодификации функциональных групп тирозина и триптофана нами были сконструированы низкомолекулярные модели, в которых остатки ароматических кислот и арилазидная группа были объединены в одной молекуле спейсером определенного размера, обеспечивающим благоприятную взаимную ориентации реагирующих групп.

При фотолизе реагента на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты (62) в водных растворах наблюдалось, по данным ОФХ, образование двух основных продуктов фотореакции, которые, на основании данных 'Н-, |9Р-ЯМР (табл. 11), электронной спектроскопии и масс-спектрометрии, соответствуют аминосоединению (63) и продукту внутримолекулярной модификации по остатку тирозина — 4-амино-14,15,16,17-тетрафтор-3-(4-гидроксифенил)-2,6,11 -триаза-бицикло[ 11.2.2]гептадека-1(16),13(17),14-триен-5,12-диону (64) (схема 19).

Таблица 11

Данные ЯМР-спектроскопии для соединения (62) и продуктов его фотопревращения (63) н (64); (5, м. д., Гц)

Тип ядра и его Соединение и тип растворителя

положение (62) (ДМСО-йб) (63) (С03С№1)20 (64) (СОзОЧ/ОгО

(1:1, У/У)) (1:1, У/У))

Н-3, Н-6 3,00-3,12 (м) 3,00-3,12 (м) 2,86-3,36 (м)

Н-4, Н-5 1,40-1,44 (м) 1,38- 1,42 (и) 1,24-1,36 (м)

Н-9 3,36 (дд) 3,39-3,44 (м) 2,86-3,36 (м)

7= 7,8,7=5,5

Н-2", Н-6" 6,98 (д), 7 =8,4 6,98 (д), 7 =8,4 6,98-7,03 (м)

Н-3", Н-5" 6,70 (д), 7 =8,4 6,67 (д), 7 =8,4 6,69-6,76 (м)

Н-7" 2,80 II,(дд) 2,82 II,(дд) 2,86 - 3,36 (м)

7=13,5,7 = 5,5, 7=13,5,7 = 5,5,

2,55 И7..р (дд) 2,58 Н7..р (дд)

7=13,5,7=7,8 7=13,5,7=7,8

Р-2', Р-6' 27,9 (дд) 24,0 (д) 21,9-22,0 (и)

7=21,7,7=9,1 7=17,8 21,1-21,2 (м)

К-3\ К-5' 19,5 (дд) 7,9 (д) 14,9-15,1 (и)

7=21,7,7=9,1 7=17,8 12,6-12,7 (м)

В пользу предложенной для соединения (64) структуры свидетельствуют данные "Р-ЯМР. В исходном азиде (62) и его аминопроизводном (63) атомы Р-2' и Р-6', а также Р-З' и Р-5' являются попарно магнитно-эквивалентными, поэтому в спектрах

"F-ЯМР они представлены двумя сигналами (табл. 11). В то же время, в спектре соединения (64) присутствуют все четыре сигнала от анизохронных атомов фтора, поскольку в циклической молекуле затруднено вращение вокруг связи C-4'-N.

В спектре 'Н-ЯМР интегральная интенсивность сигналов от атома водорода Н-7" уменьшается на один протон, что указывает на его замещение.- В пользу предложенной структуры (64) говорят также данные MALDI-масс-спектрометрии. Зарегистрирован пик с m/z = 441,1, соответствующий молекулярному иону [М + Н]+ (рассчитано для C20H2lF4N4O3+ 441,155).

Схема 19.

Fv F

HN 2 __,

F F

(63)

(64)

Для наглядного представления данных по 'Н-ЯМР-спектроскопии атомы в соединении пронумерованы в соответствии с нумерацией исходного соединения, а не в соответствии с названием по номенклатуре IUPAC.

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбепзоилыюй группы с боковым радикалом триптофана

При облучении модельного соединения (65), в молекуле которого два ароматических фрагмента пространственно сближены для реализации атаки нитрена по индольному остатку триптофана, наблюдалось образование двух основных продуктов фотолиза: аминосоединения (66) и макроциклического соединения (67) — 8-амино-17,18,24,25-тетрафтор-4,10,14,20-тетрааза-тетрацикло-[14.4.3.03'23.217'20]пет:акоза-1,3(23),5, 16(24), 17,19(25),21-гептаен-9,15-диона (схема 20).

Соединение (66), согласно данным 'Н-ЯМР, содержит остаток триптофана, структурно аналогичный остатку триптофана в исходном соединении (65), что указывает на отсутствие модификации по боковому радикалу аминокислоты. При анализе спектра 19Р-ЯМР (табл. 12) видно, что в положении С-4' появляется функциональная группа, которая вызывает изменения химических сдвигов "F в орто- и орто'-положениях в сторону сильного поля. Увеличение электронной плотности обусловлено анизотропным эффектом аминогруппы, которая может появиться в ходе фотопревращения триплетного арилнитрена. Превращение соединения (65) в аминопроизводное (66) (схема 20) подтверждается также данными MALDI-TOF-масс анализа. В масс-спектре продукта фотолиза наблюдается ион с m/z 451,9,

соответствующий по массе иону, образованному из л-аминоперфторбензоильного производного (66) путем присоединения протона.

Схема 20.

О lb

с,-йн-6н2-6н2-£н2-йн-с—¿н-'<?н2

9NH2

hv -N2

nh2-

NH-

¿H2- ¿H2- NH—С—¿H - NH2

CH2

о

I

9NH2

На протекание реакции электрофильного замещения в ароматическом гетероцикле указывает изменение в спектре 'Н-ЯМР интегральной интенсивности ароматических протонов. Ароматическая система индола в соединении (67) содержит четыре протона вместо пяти протонов исходного соединения (65). Данные 'Н-ЯМР для соединения (67) свидетельствуют об отсутствии структурных изменений в пиррольном кольце: положение сигнала, соответствующего протону при С-2", практически не изменяется относительно исходного соединения (табл. 12). Следовательно, реакция протекает по бензольному кольцу индола. Анализируя характер расщепления сигналов ароматической системы, можно исключить положения С-5" и С-8" в качестве центров для атаки арилнитреном, потому что в противном случае наблюдалось бы наличие триплета (табл. 12). Следовательно, остаются два возможных центра для протекания реакции электрофильного замещения: С-6 и С-7. Принимая во внимание расчетные параметры суперделокализации для индола [Millie P., et al. 1968], можно предполагать, что положение С-7" является оптимальным для реализации атаки нитрена по бензольному кольцу индола с образованием макроцикла. По данным 19Р-ЯМР, в спектре соединения (67) наблюдается анизохронность всех атомов фтора в составе арилазидного остатка. В отличие от двух мультиплетов, регистрируемых в спектре 19Р-ЯМР исходного перфторарилазида (65), в спектре "F-ЯМР соединения (67) присутствуют четыре сигнала (табл. 12). В пользу структуры продукта (67) свидетельствует изменение характера спектра 'Н-ЯМР метиленовых групп (табл. 12). Как видно из данных табл. 12, наблюдается анизохронность протонов при одной СН2-группе (т. е. каждый из протонов при С-3 и С-4 представлен отдельным сигналом в спектре 'Н-ЯМР). Кроме того, наблюдается смещение сигналов протонов алифатических групп в сильное поле по сравнению с сигналами метиленовых групп в исходном соединении (65). В пользу структуры (67) говорят также данные MALDI-TOF-масс спектрометрии.

Зарегистрирован пик с m/z = 450,0, соответствующий молекулярному иону [М + Н]+, (рассчитано для C2iH20F4N5O2+ 450,155).

Таблица 12

Данные ЯМР-спектроскопин для соединения (65) н продуктов его фотопревращения (66) и (67); (5, м. д., 7, Гц)

Тип ядра н его положение Соединение и тип растворителя

(65) (D20) (66) (D20) (67) (CDjOD)

Н-5" 7,67 (д), 7 =8,1 7,68 (д), 7=8,1 6,98 (д), 7= 8,6

Н-8" 7,58 (д),/ = 8,1 7,57 (д), 7 = 8,1 7,66-7,72 (м)

Н-2" 7,39 (с) 7,39 (с) 7,42 (с)

Н-7" 7,33 (т), 7 =8,1 7,30 (т), 7 = 8,1 -

Н-6" 7,23 (т), 7=8,1 7,23 (т), 7 =8,1 7,5 (д), 7= 8,6

Н-8 4,27 (т), 7= 5,9 4,26 (т), 7 = 5,9 3,34-3,44 (м)

Н-10" 3,47 (м) 3,45 (м) 2,83-2,91 Н„г„(м) 2,21-2,29 Ню-р (м)

Н-5 3,28 Iis, (м) 3,07 Н5р (м) 3,26 Iis. (и) 3,05 П5р (м) 3,36 Нм (и) 3,73 H5ß (м)

Н-3 3,02 (т), 7 = 7,0 3,00 (т), 7 = 7,0 3,09 IIj« (м) 2,99 IIJP (м)

Н-4 1,49 (м) 1,47 (м) 1,44 Н4„(м) 0,49 HJ(1 (м)

F-2', F-6' 22,9 (м) 25,4 (м) 21,6- 21,9 (м) 19,2 -19,4 (и)

F-3', F-5' 14,2 (м) 8,9 (м) 17,6 -17,9 (м) 13,1 -13,5 (м)

Таким образом, совокупность полученных в настоящей работе данных указывает на то, что при использовании реагентов на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты следует ожидать образования устойчивых продуктов ковалентного присоединения реагентов к боковым радикалам ароматических аминокислот белковой молекулы.

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

Фосфорилирующпе производные олигонуклеотндов с цвиттер-ионной концевой группой как промежуточные соединения при синтезе фотоаффшшых реагентов

Модифицированные олигонуклеотиды широко используются в качестве прецизионных инструментов для исследования тонких биологических процессов, связанных с реализацией генетической информации. Одним из перспективных методов введения группировок с заданными свойствами в состав олигонуклеотндов, не приводящих к существенному изменению комплементационных свойств, может быть селективная модификация их 5'- или 3'-терминального моноэтерифицированного остатка фосфорной кислоты. Наибольшие успехи в селективной активации

моноэтерифицированных фосфатов олиго- и полинуклеотидов к моменту начала настоящей работы были достигнуты с применением окислительно-восстановительного конденсирующего реагента РЬ3Р/(РуЗ)2 [Самуков и др., 1979]. Нами выявлено участие растворителя в процессе активации данными реагентами фосфатных групп олигодезоксирибонуклеотидов. Так, в случае проведения реакции в БМР образуется фосфорилирующее производное олигонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилендиметилимино-группой (68) (5 ~ 2 м. д.) (схема 21). В то же время, при активации олигодезоксирибонуклеотидов смесью РЬ3Р/(Ру8)2 в ВМР/0М80/Н20 в спектрах 31Р-ЯМР образующегося соединения (69) отсутствует сигнал, соответствующий концевой фосфатной группе (5 —1,5 м. д.), и регистрируется сигнал

в области, характерной для пирофосфатов (5--16 м. д.). Это указывает на протекание

реакции внутримолекулярного пирофосфорилирования. Такое направление процесса ставит под сомнение применимость к олигорибонуклеотидам способа активации их в водно-органической среде с помощью РЬ3Р/(Ру8)2 в отсутствие нуклеофила. При проведении активации в присутствии нуклеофилов (М^-диметиламинопиридин, //-оксид //.//-диметиламинопиридина, //-метилимидазол) независимо от типа растворителя в спектрах 3|Р-ЯМР наблюдается смещение сигнала фосфатной группы в сильное поле (табл. 13), что свидетельствует об образовании соответствующих амидофосфатов олигонуклеотидов с цвиттер-ионной группой (70), (72) и соединения (71) (схема 21). Процесс завершается в течение 2-4 мин.

Схема 21.

Ме1т

РЬ1Р/(Ру5)1

+ о

р^р-ор-о 6

К| остаток олнгонуклсотида

ИМР : ОМЭО : Н,0

О

-о^-о.

О \

(69)

О

олп гону клеотид

/Т\ о Н5С—Ыл. ^М-Р-О.

о-

(72)

(71)

И,

(70)

н'<\+н О ы=с-о—р-о.

н3с

(68)

Достаточная стабильность соединений с цвиттер-ионной группой (табл. 13) обеспечивает возможность выделения их из реакционной среды путем осаждения в раствор 1лСЮ4 в ацетоне с целью последующего использования для фосфорилирования алифатических аминов в водных растворах. Нами обнаружено, что реакции соединений типа (68), (70), (71) и (72) (Ю-3 М) с алифатическими аминами (5-10-кратный избыток) протекают практически количественно при комнатной температуре и заканчиваются в течение нескольких минут.

Таблица 13

Кинетические характеристики реакции производных рТ(Лс) с водой (4,2 М) при 38 "С в РМИ и данные 3|Р-ЯМР-спектроскопии

Соединение 31Р-ЯМР, 8. м. д. к, мин"1 <1/2, мин

(72) -11,13 (7,2 ± 0,4) х 10 2 - 9,6

(71) -7,11 (1,5 + 0,2) х 10 г 46

о -0,55 (9,7 + 0,8) х 10"* 714

Разнесение во времени стадий активации олигонуклеотидов и фосфорилирования образующимися цвиттер-ионными производными олигонуклеотидов нуклеофильных групп обеспечивает возможность получения производных олигонуклеотидов, несущих остатки ароматических азидов, так как исключается опасность восстановления азидогруппы в присутствии трифенилфосфина. С использованием соединений (68), (70), (71) и (72) нами были получены различные амидофосфаты олигонуклеотидов, в том числе и аффинные реагенты на основе ароматических азидов, структуры которых представлены на схеме 1.

Производные олигонуклеотида, несущие остаток п-азидоанилина, присоединенный к концевому фосфату олигонуклеотида через линкеры разного размера (М3С6114М 1(С112)ПН11-с1(рАрС)б), были апробированы нами совместно с группой к.х.н. Н.Д. Кобец для фотоаффинной модификации белков хроматина, локализованных в области ТО-попторов [Кнорре Д.Г. и др., 2000].

Рис. 2. Результаты гель-электрофоретического анализа белков хроматина, модифицированных фотоактивируемыми производными р(3(АС)6, несущими остаток иара-ЫзСбН4ЫН(СН2)„КН-. Дорожки: / - п = 2, соединение (73); 2 - п = 4, соединение (74); 3 - п = 6, соединение (75). Черточки слева указывают на положение маркерных белков (молекулярные массы представлены в Да).

Из данных, представленных на рис. 2, видно, что интенсивность модификации белков в составе хроматина существенно зависит от длины линкерной группы, связывающей фотоактив ируемую группу и остаток олигонуклеотида. Наиболее эффективно модифицирует белки производное олигонуклеотида, несущее остаток «-азидоанилина, присоединенный к 5'-концевому фосфату через диаминотетраметиленовый спейсер (74) (дор. 2). В то же время, при увеличении длины линкера (соединение (75), п = 6) специфической модификации каких-либо дополнительных белков не наблюдалось, а эффективность модификации при этом несколько снижется (дор. 3 по сравнению с дор. 2). Полученные данные по эффективности модификации белков хроматина коррелируют с результатами исследований на специально сконструированной нами модельной системе — дуплексе (схема 1). Как было описано выше, именно производное олигонуклеотида, несущее остаток 4-азидофениламинобутана на 5'-концевом фосфате, с наибольшей эффективностью модифицирует в составе комплементарного комплекса

1

II

У

V б6000__ >

15043_

это « 1

гэти»_

функциональные группы белков, присоединенные к З'-концевому фосфату комплементарного олигонуклеотида (табл. 1).

Нами было обнаружено, что интенсивность модификации белков в составе хроматина зависит от строения ароматического азида. Так, эффективность модификации белков в случае использования реагентов на основе п-азидоанилина -ЫзСбН4"ЫН(СН2)пМН-с!(рТ)]6) значительно выше, чем в случае олигонуклеотидных производных, несущих 5-азидо-2-нитробензоильный фрагмент (данные не представлены).

Совокупность данных, полученных на модельном дуплексе и при фотоаффинной модификации белков хроматина, позволяет сделать вывод, что фотоактивируемые производные олигонуклеотидов, несущие остаток н-азидоанилнна, присоединенный к 5'-концевому фосфату через диаминотетраметиленовый спейсер, являются перспективными реагентами для проведения структурно-функционального анализа белково-нуклеиновых комплексов.

Арилазидные производные нуклеозид-5'-трифосфатов для ферментативного синтеза фотоактивнруемых ДНК-зондов и фотоаффинных ДНК- и РНК-реагентов

В последние годы достигнуты значительные успехи в получении фотоактивнруемых аналогов ДНК и РНК, несущих остаток ароматического азида в гетероциклическом основании, в процессе матричного биосинтеза с использования арилазидных производных с!ЫТР и ЫТР в качестве элонгирующих субстратов ДНК- и РНК-полимераз соответственно. Вместе с тем, нельзя не отметить, что во всех известных случаях фотоактивируемые группы энзиматически вводились только в одну из цепей в ДНК. В настоящей работе найдено решение задачи по химико-ферментативному синтезу фотоактивнруемых ДНК-дуплексов с реакционноспособными группами в обеих цепях ДНК.

Нами был осуществлен синтез ряда производных (с1)иТР (76(1), (77с1), (78(1), (79с1), которые различались либо природой арилазидного остатка, либо строением спейсера, соединяющего фотоактивируемую группу с С-5 положением пиримидинового гетероцикла (схема 22).

Среди четырех синтезированных производных сШТР было выявлено единственное соединение (78с1) - 5-[3-(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензамидо)-пропенил-1]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, которое заменило в полимеразной цепной реакции природный субстрат сГГТР. Фотоактивируемое производное сШТР (78с1) оказалось эффективным элонгирующим субстратом Тад-полимеразы. Более того, встраивание его в ДНК не нарушало ее способности служить матрицей на следующих этапах для получения комплементарной цепи. При гель-электрофоретическом анализе продукта, образующегося при синтезе ДНК в присутствии фотоаналога (78с!), было обнаружено, что его подвижность в геле уменьшается по сравнению с подвижностью продукта синтеза ДНК в системе с природными субстратами. Уменьшение электрофоретической подвижности свидетельствует о введении в ДНК-продукт модифицированных нуклеотидов с объемным заместителем. Данные ИК-спектроскопии указывают на

наличие в продукте ПЦР интенсивной полосы поглощения при 2100 см-1, характерной для азидогруппы. Было показано, что комплементарные цепи фотоактивируемой ДНК могут сшиваться между собой при облучении реакционной смеси продуктов ПЦР светом в области 313-345 нм.

Схема 22.

ООО

ОН Н (ОН)

r- чД^-О'

(78d),(78r) °29Nd)j (?9r) (80r)

В целях развития технологии флуоресцентной гибридизации in situ мы также исследовали соединение (78d) на предмет перспективы использования его для получения in situ фотоактивируемых ДНК-зондов (совместно с группой д.ф.-м.н. А.И. Полетаева). Элонгирование ДНК-зонда, гибридизованного in situ с хромосомами, с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии соединения (78d) и последующее облучение вызывало фотоиндуцированное присоединение зонда к ДНК в области его локализации. Это обеспечило возможность избирательного закрепления на метафазной хромосоме интересующего зонда с целью маркировки как целой хромосомы, так и ее определенного участка. Незакрепленные зонды были удалены в процессе денатурирующих отмывок. Способность зондов, ковалентно присоединенных к ДНК, оставаться на препарате после денатурирующих отмывок может быть использована в одноцветной гибридизации, что проиллюстрировано ниже на примере экспериментов с фотоактивируемым зондом pBR13/21, гибридизующимся с центромерным районом хромосом 13 и 21 (рис. 3).

Проба pBRl3/21 была использована нами для «несмываемого» маркирования хромосомы 13. Это избавило от необходимости проводить дифференциальное окрашивание хромосом, которое возможно не для всех препаратов и вариантов гибридизации. В ходе второй гибридизации на хромосоме 13 были локализованы космидные зонды (рис. 3, я и б). Последовательное проведение гибридизации с «маркированными» на первом этапе хромосомами позволяет локализовать каждый

зонд с использованием одного и того же препарата хромосом и даже одного флуорохрома.

Рис. 3. Двухступенчатая гибридизация с космидами. Зонд рВК13/21, меченный биотипом, был гибридазован, удлинен в присутствии фотоактивируемого дезоксиуридиН-б'Чрифосфата (78с1) и закреплен на хромосомах при обручении светом в области 313-345 им После денатурирующей отмывки быгщ проведена повторная гибридизация на том же препарате с космидами из библиотеки фрагментов хромосомы 13. Зонд р 131? 13/2!, остающийся на хромосоме после денатурирующей отмывки, служит маркером хромосомы 13 (яркий зеленый сигнал в цектромерном районе хромосомы 13). Более слабые парные зеленые сигналы указывают на локализацию космидньйе клонов в районах 13 у14 (о) и 13(}34 (6).

Нами было обнаружено, что ар платаны с производные ЦТР (см. егруктуры на схеме 21) способны заменить природный ЦТР при репликации РНК. Фотоакти пируем ыс производные ЦТР - соединения (78г), (79г) и (80г)) - были исследованы нами «»вместо с л.б.ч. Морозовой О.В. на предмет перспективы их применения как аффинных реагентов для идентификации белков, ответственных за элонгацию при репликации РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), С их использованием методом высоко селективно 10 мечения был исследован репликативный комплекс ВКЭ. и выявлены неструктурные белки (N83 и N85), играющие роль релликаз на разных стадиях развит ия вирусной инфекции.

Рис. 4. АвторадиотрамЩ геля после электрофоре гического разделения в 508-ПААГ (10 %-ный) продуктов фотоаффинного мечения белков реплика! никого комплекса ВКЭ (ядерная фракция через 48 ч после инфицирования), Инкубированного с различным« фмоаклйифуемыми производными 11ТР (дор. 2-4), и иммуноблоганг с МКА против белков N85 и N83 ВКЭ (дор. 1. использован реагент (80г)). Дорожки; 2 - соединение (80г), 3 - соединение (79г), 4 соединение (7 8г}.

Перевиваемая монослой над культура клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) была инфицирована вирусом клещеного энцефалита (штамм Софьин). Ядерная фракция зараженных клеток была выделена через 16 ч и 48 ч после заражения и добавлена к реакционной смеси, которая наряду с природными N ГР содержала одно из

12 3 4

N85

N53 -Ш 3

ЯМА

фотоактивируемых производных иТР. Синтез РНК ВКЭ в ядерной фракции проводили в присутствии актиномицина Д. Наличие актиномицина Д в реакционных смесях ингибировало ДНК-зависимый синтез клеточных РНК и не влияло на РНК-зависимую репликацию вирусного генома. После инкубации в течение 15 мин реакционную смесь облучали ультрафиолетовым светом (к > 313 нм), затем • добавляли [а-32Р]ЫТР. Продукты фотоаффинной модификации анализировали методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях.

Из результатов анализа, представленных на рис. 4, видно, что с точки зрения перспективы использования реагентов для фотоаффинной модификации белков, лучшими являются фотоактивируемые производные иТР, несущие перфторазидоарильную (78г) и л-азидофениламиноалкильную (80г) группы.

ВЫВОДЫ

I. Установлены механизмы фотоиндуцированного взаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков:

1). Обнаружено, что природа частиц, образующихся в ходе облучения арилазидных реагентов в водных растворах и принимающих участие в «темновых» стадиях фотоаффинной модификации биополимеров, зависит от типа заместителей в бензольном кольце.

• При наличии в пара-положении к азидогруппе заместителей с положительным мезомерным эффектом (л-азидоанилин, л-азидофениламиноалкиламин, н-азидофенилфосфат) продуктами фотолиза являются соединения с хиноидной структурой, обладающие реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам белков. Обнаружено, что при облучении и-азидофенилфосфата наряду с л-бензохинонмоноимином образуется фосфорилирующее производное, что позволяет рассматривать данный арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент.

• Арилнитрены, генерируемые при облучении ароматических азидов, у которых в пара-положении находится заместитель с отрицательным мезомерным эффектом (4-нитрофенилазид и амиды 5-азидо-2-нитробензойной кислоты), взаимодействуют с водой с образованием А^арилгидроксиламинов. Диспропорционирование последних или окисление их кислородом воздуха приводит к накоплению ароматических нитрозосоединений, ответственных за протекание «темновых» стадий при фотоаффинной модификации белков.

• При облучении 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты в водных растворах основным продуктом фотолиза является 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота.

2). Разработан комплексный подход для изучения специфичности и эффективности фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и

установления строения образующихся продуктов. Подход основан на использовании трех типов моделей, в которых боковой радикал аминокислотного остатка и арилазидная группа сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

• С использованием модельного дуплекса, состоящего из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, к 5'-концевому фосфату одного из которых непосредственно или через спейсер присоединена арилазидная группа, а к 3'-концевому фосфату другого - боковой радикал аминокислоты, выявлена избирательность арилазидных реагентов к различным функциональным группам биополимеров. Обнаружено, что в отличие от реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот, реагенты на основе л-азидоанилина, реагирующие при облучении через промежуточное образование высокоэлектрофильного производного л-бензохинондиимина, селективны по отношении к функциональным группам белков.

• С использованием модельного дуплекса или модельного комплекса стрептавидин»фотоактивируемый аналог биотина показано, что реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот с высокой эффективностью модифицируют боковые радикалы ароматических аминокислот. Для реагентов на основе л-азидоанилина и л-азидофениламиноалкиламина основными мишенями модификации являются алифатические аминогруппы аминокислотных остатков. При модификации а-аминогруппы /^-концевой аминокислоты возможно расщепление амидной связи после модифицированного остатка аминокислоты.

• С использованием модели, в которой арилазидная группа и остаток аминокислоты объединены в одну молекулу через спейсер определенного размера, установлено строение продуктов фотовзаимодействия двух ароматических азидов с остатками ароматических аминокислот. Обнаружено, что фотоиндуцированное взаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом тирозина протекает по С-Н связи бензильного атома углерода, в то время как 5-азидо-2-нитробензоильный реагент реагирует по орто-положению бензольного кольца. При фотовзаимодействии перфторазидоарильной группы с остатком триптофана образуется продукт модификации по бензольному ядру индольной группы триптофана. В то же время, взаимодействие реагента на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты с остатком триптофана приводит к образованию производного кинуренина - продукта «скрытой» модификации по пиррольному кольцу.

• Показано, что в условиях сближения реагирующих центров фотовзаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с группировкой, имитирующей боковой радикал метионина, приводит к образованию нестабильного ковалентного аддукга сульфилиминовой природы, который гидролизуется с образованием производного сульфоксида.

II. Разработаны новые подходы к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

• Впервые получено новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилен-диметилимино-группой. Показано, что такого типа соединение достаточно стабильно в водных условиях. В то же время наличие положительного заряда в структуре активирующей группировки обеспечивает ему высокую реакционную способность по отношению к различным нуклеофилам в широком диапазоне значений pH. С использованием цвиттер-ионных производных олигодезоксирибонуклеотидов разработан эффективный и простой в исполнении метод введения арилазидных группировок по терминальным фосфатам деблокированных нуклеиновых кислот. С его применением получен ряд новых фотоактивируемых амидофосфатов олигонуклеотидов - реагентов на основе /з-азидофениламиноалкиламина, перспективность которых как фотоаффинных модификаторов белков была продемонстрирована при исследовании белкового окружения ДНК в составе хроматина.

• Впервые осуществлен ферментативный синтез и амплификация фотоактивируемых дуплексов с арилазидными группами в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК путем включения высокоэффективного аналога элонгирующего субстрата Гад-полимеразы - 5-[3-(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-пропенил-1]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата - в продукт полимеразной цепной реакции. Показана перспективность применения арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

• С использованием фотоаналогов UTP, несущих остаток ароматического азида в С-5 положении гетероцикла, продемонстрирована возможность введения фотоактивируемых групп в РНК вируса клещевого энцефалита в составе ядерной фракции. С помощью синтезированной in situ фотоактивируемой РНК, методом высокоселективного мечения, исследован репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), играющие роль репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Годовикова Т.С.. Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. Реакционноспособные фосфамиды моно- и олигонуклеотидов // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 475-481.

2. Годовикова Т.С.. Зарытова В.Ф., Райт В.К., Лебедев A.B., Самуков В.В. Некоторые аспекты амидирования моноэтерифицированного фосфата нуклеотидов и динуклеотидов при действии трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисульфида // Изв. Сиб. Отд. АН СССР. Сер. хим. наук. 1986. Вып. 2. С. 110-115.

3. Zarytova V.F., Godovikova T.S.. Kutyavin I.V., Khalimskaya L.M. Reactive oligonucleotide derivatives as affinity reagents and probes in molecular biology // In: Biophosphates and Their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity / Eds. Bruzik K.S., Stec W.J. Elsevier Sci. Publ.. Amsterdam, 1987. P. 149-164.

4. Годовикова Т.С.. Зарытова В.Ф., Мальцева Т.В., Халимская Л.М. Активные производные олигонуклеотидов с цвиттер-ионной концевой фосфатной группой для конструирования аффинных реагентов и зондов // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 1246-1253.

5. Кудряшова Н.В., Шаманина М.Ю., Годовикова Т.С.. Ананько Е.А., Ахмадиева Ф.Ф., Ромащенко А.Г. Особенности взаимодействия ДНК-полимеразы I Е. coli и ее большого фрагмента с у-п-азидоанилидом dTTP // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 224-233.

6. Knorre D.G.. Godovikova T.S.. Nevinsky G.A. Oligonucleotide and their derivatives as a tool to study protein-nucleic acids interaction // In: Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology / Eds. B. Poglazov et al.. Bach Institute of Biochemistry and ANK.O. Moscow, 1995. P. 297-313.

7. Годовикова Т.С.. Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 858-867.

8. Godovikova T.S.. Knorre V.D., Maksakova G.A., Sil'nikov V.N. Synthesis of azidoaniline derivatives of oligonucleotides and investigaion of their photochemical behavior // Bioconjugate 'Chem.1996. P. 343-348.

9. Кобгц Н.Д., Горожанкин A.B., Годовикова T.C.. Сильников В.Н., Кнорре Д.Г. Аффинная модификация хроматина фотореакционноспособными производными олиготимидилата // Докл. АН. 1996. Т. 349. С. 822-825.

10.' Годовикова Т. С. Алексеев П.В., Кнорре Д.Г. Новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов IIДокл. АН. 1997. Т. 357. С. 259-262.

11. Godovikova T.S.. Kolpashchikov D.M., Orlova T.N., Richler V.A. New photoreactive deoxynucleoside-5*-triphosphates substitutes for thymidine-5'-triphosphate in the polymerase chain reaction I/FASEB J. 1997. V. II. P. 1367.

.12. Кнорре Д.Г., Биченкова E.B., Коваль В.В., Алексеев П.В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т.С. Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 663-669.

' 13. Knorre D.G., Alekseyev P. V., Gerassimova Yu. V., Sil'nikov V.N., Maksakova G.A., Godovikova T:S. Intraduplex photocross-linking of p-azidoaniline residue and amino acid side chains linked to the complementary oligonucleotides via a new phosphorylating intermediate formed in the Mukayama system // NucIeosides&Nucleotides. 1998 V. 17. P. 397-4J0.

14. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study nucleoprotein complexes (обзор) U FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 9-14.

15. Наседкина T.B., Мальков P.Б., Федорова Jl.И., Годовикова Т.С., Колпащиков ДМ., Полетаев А.И. Использование фотопришиваемых ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ II Цитология. 1998. Т. 40. С. 763-767.

16. Mishchenko E.L., ReinboltJ., Markushin Yu.Ya., Ehresman В. And Godovikova T.S. Tvrosin 54 and tryptophan 108 of //'-(d-biotinylj-l^-diaminobutane streptavidin are photolabelled by N-(2-nitro-5-azidobenzoyl)-Ar-(d-biotinyl)-l,4-diaminobutane and (/V-4-azidophenyl)-A"-(d-biotinyl)-1,4-

diaminobutane, respectively. Isolation, spectrophotometric characterization and sequence analysis of photolabelled peptides II J. Photochem. Photobiol. B:Biol.. 1998. V. 45. P. 9-18.

17. Кнорре Д.Г., Годовикова Т.С. Химические подходы к исследованию нуклеопротеидных структур (обзор) II Изв. АН. Сер. хим. 1999. С. 1225-1231.

18. Godovikova T.S., Kolpashchikov D.M., Orlova T.N., Richter V.A., Ivanovo T.M., Grochovsky S.L., Nasedkina T.V., Victorova L.S., Poletaev A.I. 5-[3-(E)-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamido)propenyl-l]-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate substitutes for thymidine-5'-triphosphate in the polymerase chain reaction // Bioconjugale Chem. 1999. V. 10. P. 529-537.

19. Morozova O.V., Kolpashchikov D.M., Ivanovo T.M., Godovikova T.S. Synthesis of a new photocross-linking 5-C-base-substituted UTP analogs and their application in highly selective affinity labeling of the tick-borne encephalitis virus RNA replicase proteins // Nucleosides&Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1513-1514.

20. Туницкая B.JI., Кочетков C.B., Годовикова Т.С.. Кочетков С.Н. Взаимодействие РНК-полимеразы бактериофага Т7 с аффинными модификаторами - аналогами нуклеозидтрифосфатов // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 60-66.

21. Mishchenko E.L., Kozhanova L.A., Denisov A.Yu, Gritsan N.P., Markushin Yu.Ya, Serebriakova M. V„ Godovikova T.S. Study of the chemical structures of photo-cross-linking products between Tyr and the 5-azido-2-nitrobenzoyl residue// J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2000. V. 54. P. 16-25.

22. Alekseyev P. V., Romanova I. V., Shakirov M.M., Godovikova T.S. p-Azidophenyl phosphate is a photoactivatable phosphorylating reagent and p-benzoquinone monoimine precursor // J. Photochem. Photobiol. B.Biol.. 2001. V. 65. P. 39-46.

23. Popova Т. V., Denisov A. Yu., Shakirov M.M., Komarova N.I., Alekseyev P. V., Serebriakova M. V., Godovikova T.S. // Long-lived reactive intermediate photogenerated from //-(5-azido-2-nitrobenzoyl)-W'-(d-biotinyl)-l,2-diaminoethane as an affinity reagent to streptavidin H J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2001. V. 61. P. 68-77.

24. Popova T.V., Mal'shakova V.S., Alekseyev P.V., Kudryashova N.V., Shakirov M.M, Savinkova L.L., Drachkova I.A., Godovikova T.S. Photoanalogues of the initiation substrates of the RNA polymerase II, 5-azido-2-nitrobenzoyl derivatives of the ATP y-amidophosphate: the possible photoinduced degradation of the functional group to an /У-arylhydroxylamine // Nucleosides, Nucleotides&Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 921-925.

25. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Попова Т.В., Шакиров М.М., Мапьшакова B.C., Шпенев О.Е., Савинкова Л.К., Серебрякова М.В., Годовикова Т.С. Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата РНК-полимеразы II на основе производных у-амидофосфатов NTP: синтез, химические и фотохимические реакции функциональных групп // Биоорган, химия. 2005. Т. 34. С. 332-343.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001. Подписано в печать 24.05.2007 Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага№ 1. Гарнитура "Times New Roman". Печать офсетная. Печ. л. 2,5. Уч.-изд. л. 2,8. Тираж 150. Заказ № 71 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ 15 СТРУКТУР МАТРИЧНОГО БИОСИНТЕЗА: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ (обзор литературы)

1.1. Подходы к синтезу фотоактивируемых аналогов компонентов 17 надмолекулярных структур матричного биосинтеза для решения задач по выявлению точек контакта между биополимерами

1.1.1. Ферментативные методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и 22 РНК

1.1.2. Химико-ферментативные методы получения фотоактивируемых 35 фрагментов ДНК и РНК

1.1.3. Химические методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и РНК

1.1.4. Роль би- и полифункциональных реагентов в получении специфичных 46 фотоактивируемых белков

Настоящая работа выполнена в рамках научного направления - «Исследование биологических структур, обеспечивающих хранение генетической информации и экспрессию генов, и разработка методов направленного химического воздействия на эти структуры». Она является оригинальным исследованием (с 1986 г. по 2006 г.), направленным на развитие одного из информативных методов физико-химической биологии - метода фотоаффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и их комплексов. Особое внимание в работе уделено изучению химических аспектов фотоаффинной модификации белков в связи с тем, что этот вариант биоспецифической модификации имеет очевидное преимущество, так как его использование открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.

Репликация, транскрипция, биосинтез белка протекают с участием сложных надмолекулярных структур, состоящих из белков и нуклеиновых кислот (НК). Структуру белково-нуклеиновых комплексов изучают с помощью инструментальных методов, в первую очередь таких как рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако привлечение ЯМР-спектроскопии для изучения надмолекулярных структур ограничено чувствительностью метода и недостаточной разрешающей способностью, в силу чего этим методом практически невозможно выявить роль отдельных нуклеотидных и аминокислотных остатков при взаимодействии таких больших молекул как компоненты белково-нуклеинового комплекса.

Самым информативным методом исследования пространственного строения природных соединений является метод рентгеноструктурного анализа, который позволяет получать исчерпывающие данные о координатах атомов в молекуле и тем самым обеспечивает определение конфигурации каждого фрагмента молекулы и анализ ее конформации. Однако чаще всего данный метод невозможно применить для исследования нуклеопротеидных комплексов из-за того, что далеко не всегда можно получить кристаллы белок-нуклеиновых или белок-белковых комплексов, пригодные для кристаллографических исследований с высоким разрешением. В первую очередь это касается надмолекулярных комплексов эукариот. К тому же, методом РСА можно изучать пространственную организацию молекулярных структур лишь в кристаллическом состоянии, хотя для понимания процессов, протекающих in vivo, гораздо более интересным является установление конформации молекул в растворе.

Достигнутые в последнее десятилетие значительные успехи в структурном анализе РНК- и ДНК-полимераз [1-6], рибосом и их функциональных комплексов с мРНК и тРНК [7-15] уже более прицельно ставят задачи, связанные с детальным изучением динамических процессов, в которых участвует ферменты и белки матричного биосинтеза. Ясно, что с использованием только метода рентгеноструктурного анализа достичь этих целей не удастся в силу сложности и динамичности названных систем. На сегодняшний день подходом, с помощью которого может быть получена детальная информация о структурно-функциональной топографии надмолекулярных комплексов, является метод химического аффинного сшивания. Именно ковалентное связывание белков с НК-лигандами открывает уникальную возможность фиксации белково-нуклеиновых комплексов, в том числе малостабильных, в определенном структурном состоянии. Многими исследователями предлагается использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА. Таким образом, значимость таких подходов и, в первую очередь, аффинного химического сшивания для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов не осталась в «дорентгеновской» эре. Эти методы востребованы и в настоящее время [16-24].

Для аффинной модификации белков чаще всего используют аналоги НК, содержащие различные реакционноспособные группировки в гетероциклических основаниях или углеводном остатке, на концевой или межнуклеотидной фосфатных группах. Особое место в арсенале химических реагентов занимают фотоактивируемые аффинные реагенты на основе ароматических азидов. Под действием облучения арилазидная группа превращается в высокореационноспособную частицу (нитрен), которая может атаковать соседние группы атомов с образованием ковалентной связи между контактирующими партнерами. Идентификация образованного продукта "фотосшивки" позволяет судить о структурной организации белково-нуклеинового комплекса, а также о динамике функционирования системы. В связи с этим, конструирование и синтез фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов является одной из приоритетных задач биоорганической химии.

Несмотря на широкое использование арилазидных реагентов в молекулярно-биологических исследованиях, эксперименты по фотоаффинной модификации белков обычно заканчиваются получением данных одно- или двумерного гель-электрофореза с определением белков, по которым прошла модификация. Отсутствие информации о природе образующейся химической связи не всегда позволяет экспериментатору выбрать оптимальный путь и условия для выделения и анализа модифицированных белков. Это приводит к тому, что в случае лабильных связей утрачивается ценная информация об окружении реагентов в области связывания. Кроме того, из-за малой изученности природы продуктов модификации определенных аминокислотных остатков и механизмов их образования, подбор специфического реагента для каждого конкретного случая часто является недостаточно обоснованным. Фотохимические превращения арилазидных реагентов исследованы, как правило, для модельных соединений в неводных средах, т. е. в условиях, далеких от условий проведения фотоаффинной модификации белков и их комплексов. В связи с этим, полученные данные не могут объяснить ряд фактов, свидетельствующих о протекании в водных растворах реакций после прекращения облучения системы [25-28]. На момент начала выполнения настоящей работы единственной группой фотоаффинных реагентов, для которых была выявлена природа долгоживущих интермедиатов, были производные л-азидоанилина. Ранее, авторами работ [29, 30] было показано, что при облучении в водных растворах л-азидоанилина и его нуклеотидных производных накапливаются соединения с хиноидной структурой, которые, являясь электрофилами, могут взаимодействовать с нуклеофильными группами белков. Отсутствие информации по механизмам фотолиза в водных растворах для других арилазидных реагентов не только затрудняет интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров, но и в значительной степени сдерживает поиск «универсальных» арилазидных групп, т. е. таких, которые бы при возбуждении светом в ближнем ультрафиолетовом диапазоне могли бы с высокой эффективностью модифицировать разнообразные функциональные группы биомолекул.

Таким образом, изучение механизмов фотовзаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков представляет собой актуальную задачу, поскольку ее решение обеспечит развитие метода фотоаффинной модификации нуклеопротеидных комплексов - перспективного подхода не только для установления структуры и функции биополимеров и их комплексов, но и для направленного воздействия на них.

Цель настоящей работы - установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и разработка новых подходов к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

Задачи, на решение которых было направлено настоящее исследование:

• изучение фотохимических превращений разного типа ароматических азидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров для выявления возможных вторичных, т. е. «темновых», процессов с их участием;

• установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков;

• дизайн и синтез новых фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для решения конкретных молекулярно-биологических задач.

Результаты проведенных исследований изложены в двух разделах диссертационной работы. Порядок появления разделов не связан ни с хронологией, ни с относительной важностью раздела. В разделе 2 представлены результаты исследований по установлению механизмов фотоиндуцированного взаимодействия ряда арилазидных реагентов, в основном, из числа широко используемых для фотоаффинной модификации белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, с боковыми радикалами аминокислот. Особое внимание уделено проблеме «темновых» процессов при фотоаффинной модификации белков.

Результаты, полученные при детальном исследовании процессов фотолиза ароматических азидов в водных растворах, и установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков не только проливают свет на механизмы фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами, но и представляют несомненную практическую ценность. Они позволяют сформулировать на качественном уровне некоторые зависимости направления фотоиндуцированных реакций арилазидных реагентов от строения субстрата (аминокислотного остатка) и типа заместителей в арильном кольце азида. Это способствует осознанному выбору фотоактивируемой группы при конструировании фотоактивируемого реагента.

В разделе 3 описаны подходы к созданию высокоэффективных фотоаффинных реагентов - арилазидных производных нуклеиновых кислот, способных реагировать с определенными типами функциональных групп белков в составе надмолекулярных комплексов. Разработанные подходы пост-синтетической селективной дериватизации монозамещенных концевых фосфатных групп олигонуклеотидов, в настоящее время нашли широкое применение в работах других научных коллективов, в том числе и зарубежных (например, [31]). Результаты работы, приведенные в разделе 3, демонстрируют то, как потенциал, заложенный при конструировании реагентов, реализуется при изучении некоторых белково-нуклеиновых комплексов матричного биосинтеза.

В рамках данной работы впервые осуществлен ферментативный синтез ДНК-дуплексов, содержащих арилазидные группы в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК, благодаря использованию 5-[3-(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-пропенил-1 ] -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфата в качестве фотоактивируемого аналога элонгирующего субстрата в полимеразной цепной реакции с 7а#-полимеразой. Это представляет практический интерес, например, для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-аптамеров, так как использование такого типа дезоксинуклеозид-5'-трифосфата позволяет исключить стадию пост-селекционной модификации . аптамера. Предложено новое направление использования арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

По материалам диссертации опубликовано 23 статьи, 2 обзора, 20 тезисов докладов.

выводы

I. Установлены механизмы фотошщуцированного взаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков:

1). Обнаружено, что природа частиц, образующихся в ходе облучения арилазидных реагентов в водных растворах и принимающих участие в «темновых» стадиях фотоаффинной модификации биополимеров, зависит от типа заместителей в бензольном кольце.

• При наличии в ш/?а-положении к азидогруппе заместителей с положительным мезомерным эффектом (л-азидоанилин, л-азидофениламиноалкиламин, л-азидофенилфосфат) продуктами фотолиза являются соединения с хиноидной структурой, обладающие реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам белков. Обнаружено, что при облучении л-азидофенилфосфата наряду с л-бензохинонмоноимином образуется фосфорилирующее производное, что позволяет рассматривать данный арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент.

• Арилнитрены, генерируемые при облучении ароматических азидов, у которых в пара-положении находится заместитель с отрицательным мезомерным эффектом (4-нитрофенилазид и амиды 5-азидо-2-нитробензойной кислоты), взаимодействуют с водой с образованием А^-арилгидроксиламинов. Диспропорционирование последних или окисление их кислородом воздуха приводит к накоплению ароматических нитрозосоединений, ответственных за протекание «темновых» стадий при фотоаффинной модификации белков.

• При облучении 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойпой кислоты в водных растворах основным продуктом фотолиза является 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота.

2). Разработан комплексный подход для изучения специфичности и эффективности фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и установления строения образующихся продуктов. Подход основан на использовании трех типов моделей, в которых боковой радикал аминокислотного остатка и арилазидная группа сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

• С использованием модельного дуплекса, состоящего из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, к 5'-концевому фосфату одного из которых непосредственно или через спейсер присоединена арилазидная группа, а к З'-концевому фосфату другого - боковой радикал аминокислоты, выявлена избирательность арилазидных реагентов к различным функциональным группам биополимеров. Обнаружено, что в отличие от реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот, реагенты на основе «-азидоанилина, реагирующие при облучении через промежуточное образование высокоэлектрофильного производного «-бензохинондиимина, селективны по отношении к функциональным группам белков.

• С использованием модельного дуплекса или модельного комплекса стрептавидин*фотоактивируемый аналог биотина показано, что реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот с высокой эффективностью модифицируют боковые радикалы ароматических аминокислот. Для реагентов на основе л-азидоанилина и л-азидофениламиноалкиламина основными мишенями модификации являются алифатические аминогруппы аминокислотных остатков. При модификации а-аминогруппы Л'-концевой аминокислоты возможно расщепление амидной связи после модифицированного остатка аминокислоты.

• С использованием модели, в которой арилазидная группа и остаток аминокислоты объединены в одну молекулу через спейсер определенного размера, установлено строение продуктов фотовзаимодействия двух ароматических азидов с остатками ароматических аминокислот. Обнаружено, что фотоиндуцированное взаимодействие

4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом тирозина протекает по С-Н связи бензильного атома углерода, в то время как

5-азидо-2-нитробензоильный реагент реагирует по о/?/ио-положению бензольного кольца. При фотовзаимодействии перфторазидоарильной группы с остатком триптофана образуется продукт модификации по бензольному ядру индольной группы триптофана. В то же время, взаимодействие реагента на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты с остатком триптофана приводит к образованию производного кинуренина - продукта «скрытой» модификации по пиррольному кольцу.

• Показано, что в условиях сближения реагирующих центров фотовзаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с группировкой, имитирующей боковой радикал метионина, приводит к образованию нестабильного ковалентного аддукта сульфиминовой природы, который гидролизуется с образованием производного сульфоксида.

II. Разработаны новые подходы к получению фотоаффшшых реагентов на основе ароматических азидов для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

• Впервые получено новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилен-диметилимино-группой. Показано, что такого типа соединение достаточно стабильно в водных условиях. В то же время наличие положительного заряда в структуре активирующей группировки обеспечивает ему высокую реакционную способность по отношению к различным нуклеофилам в широком диапазоне значений рН. С использованием цвиттер-ионных производных олигодезоксирибонуклеотидов разработан эффективный и простой в исполнении метод введения арилазидных группировок по терминальным фосфатам деблокированных нуклеиновых кислот. С его применением получен ряд новых фотоактивируемых амидофосфатов олигонуклеотидов - реагентов на основе л-азидофениламиноалкиламина, перспективность которых как фотоаффинных модификаторов белков была продемонстрирована при исследовании белкового окружения ДНК в составе хроматина.

• Впервые осуществлен ферментативный синтез и амплификация фотоактивируемых дуплексов с арилазидными группами в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК путем включения высокоэффективного аналога элонгирующего субстрата Тод-полимеразы - 5 - [3 -(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-пропенил-1 ] -2' -дезокси\ридин-5'-трифосфата - в продукт полимеразной цепной реакции. Показана перспективность применения арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

• С использованием фотоаналогов UTP, несущих остаток ароматического азида в С-5 положении гетероцикла, продемонстрирована возможность введения фотоактивируемых групп в РНК вируса клещевого энцефалита в составе ядерной фракции. С помощью синтезированной in situ фотоактивируемой РНК, методом высокоселективного мечения, исследован репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), играющие роль репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

1. Никифоров В.Г. Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы (1962-2001) // Мол. биология. 2002. Т. 36. С. 197-207.

2. Cramer P., Bushnell D.A., Kornberg R.D. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 Angstrom resolution // Science. 2001. V. 292. P. 1863-1876.

3. Gnatt A.L. Cramer P., Fu J., Bushnell D.A., Kornberg R.D. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution // Science. 2001. V. 292. P. 1876-1882.

4. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution // Nature. 1998. V. 391. P. 251-258.

5. Sawaya M.R., Prasad R., Wilson S.H., Kraut J., Pelletier H. Crystal structures of human DNA polymerase ß complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism//Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11205-11215.

6. Kiefer J.R., Mao C., Hansen C.J., Basehore S.L., Hogrefe H.H., Braman J.C., Beese L.S.

7. Crystal structure of a thermostable Bacillus DNA polymerase I large fragment at 2.1 A resolution// Structure. 1997. V. 5. P. 95-108.

8. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein С., Hartsch Т., Ramakrishman V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.

9. Schiuenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janel D., Bartes H., Agmon I., Franceschi F., YonathA. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution // Cell. 2000. V. 102. P. 615-623.

10. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.В., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. V. 289. P. 905-920.

11. Cate J.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Zk, Earnest T.N., Noller H.F. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes // Science. 1999. V. 285. P. 2095-2104.

12. Ramakrishnan V., Moore P.B. Atomic structures at last: the ribosome in 2000 // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 144-154.

13. Gutmann S„ Haebel P. W., Metzinger L., Sutter M., Felden В., Ban N. Crystal structure of the transfer-RNA domain of transfer-messenger RNA in complex with SmpB // Nature, 2003. V. 424. P. 699-703.

14. Joseph S. After the ribosome structure: how does translocation work? // RNA. 2003. V. 9. P. 160-164.

15. Stark H. Three-dimensional electron cryomicroscopy of ribosomes // Curr. Protein Pept. Sci. 2002. V.3.P. 79-91.

16. S.Penczek P.A., Frank J., Spahn CM. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation // J. Struct. Biol. 2006. V. 154. P. 184-194.

17. Baranov P.V., Sergiev P. V., Dontsova O.A., Bogdanov A.A., Brimacombe R. The database of ribosomal cross links (DRC) //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 187-189.

18. Khodyreva S.N., Lavrik 0.1. Photoaffmity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair // Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

19. Кнорре Д.Г., Кудряшова H.B., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: общие вопросы и исследование транскрипции // Успехи химии. 1997. Т. 66. С. 401-413.

20. Кнорре Д.Г., Кудряшова КВ., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции // Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

21. Meisenheimer К.М., Koch Т.Н. Photo-cross-linking of nucleic acids to associated proteins // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 32. P. 101-140.

22. Козлов И.А., Кубарева И.А., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Определение положения контактов фактора транскрипции NF-kB с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания // Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 63-73.

23. Борисова О.А., Романенков А.С., Метелев В.Г., Кубарева Е.А., Зубин Е.М., Тимченко М.А., Орецкая Т.С. ДНК-дуплексы, содержащие 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридин, как реагенты для аффинной модификации белков // Мол. биология. 2003. Т. 37. №3. С. 534-543.

24. Романенков А.С., Устюгов А.А., Зацепин Т.С., Никулова А.А., Колесников ИВ., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-kB с ДНК // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1474-1487.

25. Захаренко A.JI. Взаимодействие ДНК-полимераз с dNTP и их фотореакционноспособными аналогами. //Дис. . канд. хим. наук. Новосибирск, 2001. С. 66.

26. Галль T.C., Грицан Н.П., Мызина С.Д., Бажин Н.М., Немцева Е.В. и-Бензохинондиимин реакционноспособный промежуточный продукт фотолиза я-азидоанилина в водных растворах//Докл. АН СССР. 1983. Т. 273. С. 883-887.

27. Badashkeyeva A.G., Gall T.S., Efimova E.V., Knorre D.G., Lebedev A. К, Mysina S.D. Reactive derivative of adenosine-5'-triphosphate formed by irradiation of ATP y-/?-azidoanilid. //FEBS Lett 1983. V. 155. P. 263-266.

28. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК производными олигорибонуклеотидов // Мол. биология. 2001. Т. 35. №4. С. 584-596.

29. Capson T.L., Benkovic S.J., Nossal N.G. Protein-DNA cross-linking demonstrates stepwise ATP-dependent assembly of T4 DNA polymerase and its accessory proteins on the primer-template//Cell. 1991. V. 65. P. 249-258.

30. Reems C.R., WoodS., McHenry C.S. E. coli DNA Polymerase III holoenzyme subunits, a, b, and g directly interact with primer-template // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 5606-5613.

31. Коршунова Г.А., Сумбатян H.B., Топин A.H., Мчедлидзе М.Т. Фотоактивируемые реагенты на основе арил(трифторметил)диазиринов: синтез и использование для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий // Мол. биология. 2000. С. 966-983.

32. Mitina R.L., Doronin S. V., Dobrikov M.I., Tabatadze D.R., Levina A.S., Lavrik O.I. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Affinity labeling of the primer binding site // FEBS Lett. 1992. V. 312. P. 249-251.

33. Laletina E„ Graifer D., Malygxn A., Ivanov A., Shatsky I., Karpova G. Proteins surrounding hairpin Hie of the hepatitis С virus internal ribosome entry site on the human 40S ribosomal subunit // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 2027-2036.

34. Peletskaya E., Kogon A., Tuske S„ Arnold E., Hughes S. Nonnucleoside inhibitor binding affects the interactions of the fingers subdomain of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase with DNA // J. Virology. 2004. V. 78. P. 3387-3397.

35. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Buckle М., Roux Р., Вис H, Lavrik O.I. Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs // FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202.

36. Добриков М.И., Доронин С.В., Сафронов КВ., Шишкин Г.В., Лаврик O.K. Аффинная модификация ДНК фага М13 фотоактивным аналогом, встроенным в цепь праймера HIV-1 обратной транскриптазой // Химия в интересах устойчивого развития. 1994. Т. 2. С. 60-64.

37. Лебедева Н.А., Речкунова Н.И, Дежуров С.В., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Фотоактивные аналоги dTTP как субстраты термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35 // Биоорган, химия. 2004. Т. 30. С. 369-374.

38. Lavrik O.l, Kolpashchikov D.M., Nasheuer Н.Р., Weisshart К., Favre A. Alternative RPA conformations are detected by crosslinks with primer carrying photoreactive group at 3'-end //FEBS Lett. 1998. V. 441. P. 186-190.

39. Захаренко A.JI., Колпащиков Д.М., Ходырева C.H., Лаврик О.И., Менендес-Ариас Л. Исследования dNTP-связывающего участка обратной транскриптазы ВИЧ-1 с помощью фотореакционноспособных аналогов dNTP // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1227-1237.

40. WlassoffW.A., Kimura М., Ishihama A. Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe RNA polymerase II. Location of the catalytic sites //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5104-5113.

41. Колпащиков ДМ., Пестряков П.Е., Власов В. А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Изучение взаимодействия репликативного белка А человека с ДНК с помощью новых фотоактивируемых аналогов dTTP // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 194-198.

42. Наппа MM., Zhang Y., Reidling J.C., Thomas M.J., Jou J. Synthesis and characterization of a new photo-cross-linking CTP analogue and its use in photoaffinity labeling E. coli and T7 RNA polymerase // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2073-2079.

43. Insdorf N.F., Bogenhagen D.E. DNA polymerase gamma from Xenopes laevis. I. The identification of a high molecular weight catalytic subunit by a novel DNA polymerase photolabeling procedure // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 21491-21497.

44. Bambara R.A., Jessee C.B. Properties of DNA polymerases delta and epsilon, and their roles in eukaryotic DNA replication // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1088. P. 11-24.

45. Evans R.K., Johnson J.D., Haley B.E. 5-Azido-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate: a photoaffinity labeling reagent and tool for the enzymatic synthesis of photoactive DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1986. V. 83. P. 5382-5386.

46. Woody A. Y. V., Evans R.K., Woody R.W. Characterization of a photoaffinity analog of UTP, 5-azido-UTP for analysis of the substrate binding site on E. coli RNA polymerase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 150. P. 917-924.

47. Dontsova O.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., Skripkin E.A., Kopylov A.M., Bogdanov A.A. Identification of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit protein neighboring mRNA during initiation of translation // Biochimie. 1992. V. 74. P. 363-371.

48. Dokudovskaya S.S., Dontsova O.A., Bogdanova S.L., Bogdanov A.A., Brimacombe R. mRNA-ribosome interactions//Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. V. 18. P. 149-155.

49. Bhangu R., Juzumiene D., Wollenzien P. Arrangement of messenger RNA on Escherichia coli ribosomes with respect to 10 16S rRNA cross-linking sites // Biochemistry. 1994. V. 33. P.3063-3070.

50. Tate W, Greuer В., Brimacombe R. Codon recognition in polypeptide chain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor 2 // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 6537-6544.

51. Туницкая В. JI., Кочеткова С.В., Годовикова Т.С., Кочетков С.Н. Взаимодействие РНК-полимеразы бактериофага Т7 с аффинными модификаторами аналогами нуклеозидтрифосфатов // Мол. биология. 2000. Т. 34. С. 60-66.

52. Roberge M, Dahmus M.E., Bradbury E.M. Chromosomal loop nuclear matrix organization of transcriptionally active and inactive RNA polymerase in HeLa nuclei // J. Mol. Biol. 1988.1. V. 201. P. 545-555.

53. Bartholomew В., Dahmus M.E., Meares C.F. RNA contacts subunits IIo and lie in HeLa RNA polymerase II transcription complex //J. Biol. Chem. 1986. V. 261 P. 14226-14231.

54. Lin S., Henzel W.J., Nayak S., Dennis D. Photoaffinity labeling by 4-thiodideoxyuridine triphosphate of the HIV-1 reverse transcriptase active site during synthesis // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 997-1002.

55. Dissinger S., Hanna M.M. Synthesis and characterization of a new photo-cross-linking CTP analogue and its use in photoaffinity labeling E. coli and T7 RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1991. V. 219. P. 11-25.

56. Hanna M. V., Dissinger S., Williams B.D., Golston J.E. Synthesis and characterization of 5-(4-Azidophenacyl)thio.uridine 5'-triphosphate, a cleavable photo-cross-linking nucleotide analogue // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 5814-5820.

57. Yamaguchi Т., Saneyoshi M.A photolabile 2',3'-dideoxyuridylate analog bearing an aryl(trifluoromethyl)diazirine moiety: photoaffinity labeling of HIV-1 reverse transcriptase // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3364-3369.

58. Korshunova G.A., Topin A.N., Sumbatyan N.V., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Trifluoromethyldiazirine-containing dUTP: synthesis and application in DNA/protein crosslinking// Nucleoside Nucleotide. 1999. V. 18. P. 1097-1098.

59. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Е.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М.: Химия. 1970. С. 310-400.

60. Gnatt A., Fu J., Kornberg R.D. Formation and crystallization of yeast RNA polymerase II elongation complexes //J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 30799-30805.

61. Favre A. 4-thiouridine as an intrinsic photoaffinity probe of nucleic acid structure and interactions / In: Morrison H., ed. Bioorganic photochemistry: photochemistry and the nucleic acids. New York: John Wiley&Sons, Inc. 1990. V. 1. P. 379-425.

62. Favre A., Saintome C., Fourreu J.L., Clivio P., Laugaa P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions // J. Photochem. Photobiol. 1998. V. 42. P. 109-124.

63. Сергеев П.В., Донцова А.А., Богданов А.А. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день // Мол. биология. 2001. Т. 35. С. 559-583.

64. Baranov P. V., Gurvich O.L., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova 0,A. New features of 23S ribosomal RNA folding: the long helix 41-42 makes a "U-turn" inside the ribosome // RNA. 1998. V. 4. P. 658-668.

65. Mishima Y., Steitz J.A. Site-specific crosslinking of 4-thiouridine modified human tRNA(3Lys) to reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type I // EMBO J. 1995. V. 14.P.2679-2687.

66. Tate J.J., Persinger J., Bartolomew B. Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1421-1426.

67. Fleming S. Chemical reagents in photoaffinity labelling // Tetrahedron. 1995. V. 51. P. 12479-12520.

68. Sergiev P., Dokudovskaya S., Romanova E., Topin A., Bogdanov A., Brimacombe R., Dontsova 0. The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2519-2525.

69. Young M.C., Reddy M.K., Von Hippel P.H. Structure and function of the bacteriophage T4 DNA polymerase holoenzyme//Biochemistrry. 1992. V. 31 P. 1801-1812.

70. Stackhouse T.M., Meares C.F. Photoaffinity labelling of E. coli RNA polymerase/polyd(A-T). transcription complex by nascent RNA // Biochemistry. 1988. V. 27. № 8. P. 3038-3045.

71. Naryshkin N., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R.H. Structural organization of the RNA polymerase promoter open complex // Cell. 2000. V. 101. P. 601-611.

72. Kim T.-K, Lagrange Т., Wang Y.-H, Griffith J.D., Reinberg D., Ebright R.H. Trajectory of the RNA polymerase II transcription preinitiation complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94.P.12268-12273.

73. Doring Т., Mitchell P., OsswaldM., Bochkariov D., Brimacombe R. The decoding region of 165 RNA; a cross-linking study of the ribosomal A, P and E sites using tRNA derivatized at position 32 in the anticodon loop // EMBO J. 1994. V. 13. P. 2677-2685.

74. Brimacombe R., Mitchell P., Osswald. M., Bochkariov D. Clustering of modified nucleotides at the functional center of bacterial ribosomal RNA // FASEB J. 1993. V. 7. P. 161-167.

75. Brimacombe R. RNA-protein interactions in the Escherichia coli ribosome // Biochimie. 1991. V. 73. P. 927-936.

76. Лачетина E.C., Грайфер Д.М., Малыгин А.А., Шатский И.Н., Карпова Г.Г. Молекулярное окружение петли субдомена Ille IRES-элемента РНК вируса гепатита С на 40S субчастице рибосомы человека // Биоорган, химия. 2006. Т. 32. С. 311-319.

77. Mundus D„ Wollenzien P. Neighborhood of 16S rRNA nucleotides U788/U789 in the 30S ribosomal subunit determined by site-directed crosslinking // RNA. 1998. V. 4. P. 1373-1385.

78. Anthony-Cahill S., Griffith M., Noren C., Suich D., Schultz P. Site-Specific Mutagenesis with Unnatural Amino Acids // TIBS. 1989. V. 14. P. 400-403.

79. Kurzchalia T.V., Wiedmann M., Girshovich A.S., Bochkareva E.S., Bielka H., Rapoport T.A. The signal sequence of nascent preprolactin interacts with the 54 К polypeptide of the signal recognition particle //Nature. 1986. V. 320. P. 634-636.

80. Krieg U.C., Walter P., Johnson A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin to the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 8604-8608.

81. Pendergrast P.S., Chen Y., Ebright Y.W., Ebright R.H. Determination of the orientation of a DNA binding motif in a protein-DNA complex by photocrosslinking // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10287-10291.

82. Dumoulin P., Oertel-Buchheit P., Grander-Schbarr M., Schnarr M. Orientation of the Lex A DNA-binding motif on operator DNA as inferred from cysteine-mediated phenyl azide crosslinking // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2030-2034.

83. Dumoulin P., Ebright R.H., Kneytel R„ Kaptein R., Grander-Schbarr M., Schnarr M. Structure of the Lex A repressor-DNA complex probed by affinity cleavage and affinity photocross-linking//Biochemistry. 1996. V. 38. P. 4279-4286.

84. Chen Y., Ebright Y.W., Ebright R.H. Identification of the target of a transcription activator protein by protein protein photocrosslinking // Science. 1994. V. 265. P. 90-92.

85. Pezzuto J.M., Hecht S.M. Amino acid substitutions in protein biosynthesis. Poly(A)-directed polyphenylalanine synthesis // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 865-869.

86. Wiedmann M., Kurzchalia T.V., Hartmann E., Rapoport T.A. A signal sequence receptor in the endoplasmic reticulum membrane //Nature. 1986. V. 320. P. 634-636.

87. Kang M.E., Dahmus M.E. The Photoactivated cross-linking of recombinant C-terminal domain to proteins in a HeLa cell transcription extract that comigrate with transcription factors HE and IIF // J. Biochem. Chem. 1995. V. 270. P. 23390-23397.

88. Kohlstaedt L.A., Wang J., Friedman J.M., Rice P.A., Steitz T.A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor // Science. 1992. V. 256. P. 1783-1790.

89. Gentry D.R., Burgess R.R. Crosslinking of E. coli RNA Polymerase Subunits: Identification of Beta prime as the Binding Site of Omega // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1124-11.

90. Schafer H.-J., Rathgeber G., Kagawa Y. 2,8-Diazido-ATP a short-length bifunctional photoaffinity label for photoaffinity cross-linking of a stable ATP synthase (from the thermophilic bacterium PS3) II FEBS Lett. 1995. V. 377. P. 408-412.

91. Schäfer H.-J., Dose K. Photoaffinity cross-linking of the coupling factor 1 from Micrococcus luteus by 3'-arylazido-8-azido-ATP // J. Mol: Biol. 1984. V. 259. P. 15301-15306.

92. Schafer H.-J., Rathgeber G„ Dose K. Masafumi Y„ Kagawa Y. Photoaffinity cross-linking of Fi ATPase from the thermophilic bacterium PS3 by 3'-arylazido-ß-alanyl-8-azido-ATP//FEBS Lett. 1985. V. 186. P. 275-280.

93. Wölk J.P.W., Boorsma A., Knoche M., Schafer H.-J., Driessen A.J.M. The low-affinity ATP binding site of the E. coli SecA dimer is localized at the subunit interface // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 14924-14929.

94. Schafer H.-J., Rathgeber G., Dose K., Kagawa Y. Photoaffinity cross-linking of Fi ATPase from the thermophilic bacterium PS3 by 3'-aryIazido-ß-alanyl-2-azido-ATP // FEBS Lett. 1989. V. 253. P. 264-268.

95. Spirin A.S. Ribosomes. N.Y.: Kluver Acad. /Plenum Publishers, 1999.

96. Spahn C.M.T., Nierhaus K.H. Models of the elongation cycle: an evaluation // J. Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 753-772.

97. Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Структурно-функциональная топография рибосом £ coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК // Успехи химии. 1991. Т. 32. С. 3-49.

98. Донцова O.A., Богданова СЛ., Розен КВ., Скрябин Г.А., Скрипкин Е.А., Копылов A.M., Богданов A.A. Фотоаффинная модификация малой субчастицы рибосомы Escherichia coli 5'-диазирильными производными мРНК // Докл. АН СССР. 1990. Т. 313. С. 730-733.

99. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Karpova G.G., Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridine residues //Biochemistry. 1994. V. 33. P. 6201-6206.

100. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labelling of proteins at the mRNA binding site of rat liver ribosomes by an analogue of octauridylate containing an alkylating group attached to the 3'-end//FEBS Lett. 1981. V. 123. P. 269-272.

101. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labelling of rat liver ribosomal protein S26 by heptauridylate containing a 5'-terminaI alkylating group // Molec. Biol. Rep. 1984. V. 9. P. 219-222.

102. Stahl J., Karpova G.G. Investigations on the messenger RNA binding site of eukaryotic ribosomes by using reactive oligo(U) derivatives // Biomed. Biochim. Acta. 1985. V. 44. P. 1057-1064.

103. Shatsky I.N., Bakin A.V., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. How does the mRNA pass through the ribosome? // Biochimie. 1991. V. 73. P. 937-945.

104. Bulygin K.N., Graifer D.M., Repkova M.N., Smolenskaya I.A., Veniyaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center// RNA. 1997. V. 3. P. 1480-1485.

105. Демешкина НА., Лалетина Е.С., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Венъяминова А.Г., Грайфер ДМ., Карпова Г.Г. Окружение кодонов мРНК в Р- и Е-участках рибосом человека по данным фотосшивок с производными pUUUGUU // Мол. биология. 2003. Т. 37. С. 147-155.

106. Demeshkina N. Laletina Е., Meschaninova М., Ven'yaminova A., Graifer D., Karpova G. Positioning of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1627. P. 39-46.

107. Демешкина НА., Репкова М.Н., Венъяминова А.Г., Грайфер ДМ., Карпова Г.Г. Сшивки аналога мРНК, производного pUUAGUAUUUAUU с фотоактивируемой группой на остатке гуанозина, с 80S рибосомами человека // Мол. биология. 2002. Т. 36. С. 114-122.

108. Molotkov М., Graifer D., Demeshkina N., Repkova M., Ven'yaminova A., Karpova G. Arrangement of mRNA 3' of the A site codon on the human 80S ribosome // RNA Biology. 2005. V. 2. P. 63-69.

109. Graifer D., Molotkov M., Eremina A., Ven'yaminova A., Repkova M., Karpova G. The central part of the 5.8 S rRNA is differently arranged in programmed and free human ribosomes //Biochem. J. 2005. V. 387. P. 139-145.

110. Yusupova G. Zh., Yusupov M.M., Cate J.H.D., Noller H.F. The Path of Messenger RNA Through the Ribosome // Cell. 2001. V. 106. P. 233-241.

111. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V„ Favre A. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome // EMBO J. 2002. V.21. P. 5302-5311.

112. Бочкарев Д.Е. II Исследования взаимодействия тРНК с рибосомой методом импульсной фотоаффинной сшивки. Дис. . канд. хим.наук. Пущино: МГУ, 1993. 129 с.

113. Бочкарев Д.Е., Байдаков С.Н., Гиршович А.С. Техника быстрого смешивания и импульсного фотоаффинного мечения для изучения динамики функционирования рибосом//Докл. АН СССР. 1987. Т. 292. С. 241-245.

114. Wooddell СЛ., Burgess R. Topology of yeast RNA polymerase II subunits in transcription elongation complexes studied by photoaffmity cross-linking // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 13405-13421.

115. Bartholomew В., Braun B.R., Kassavetis G.A., Geiduschek E.P. Probing close DNA contacts of RNA polymerase III transcription complexes with the photoactive nucleoside 4-thiodeoxythymidine // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 18090-18095.

116. Persinger J., Bartolomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffmity labeling // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33039-33046.

117. Cramer P., Bushnell D.A., Fu J., Gnatt A.L., Maier-Davis В., Thompson N.E., Burgess R.R., Edwards A.M., David P.R., Kornberg R.D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism // Science . 2000. V. 288. P. 640-649.

118. Poglitsch C.L., Meredith G.D., Gnatt A.L., Jensen G.J., Chang W.-H., Fu J„ Kornberg R.D. Electron crystal structure of an RNA polymerase II transcription elongation complex // Cell. V. 98. P. 791-798.

119. Bartholomew В., Dahmus M.E., Meares C.F. RNA contacts subunits IIo and lie in HeLa RNA polymerase II transcription complex//J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 14226-14231.

120. Roberge M., Dahmus M.E., Bradbury E.M. Chromosomal loop/nuclear matrix organization of transcriptionally active and inactive RNA polymerase in HeLa nuclei // J. Mol. Biol. 1988. V. 201. P. 545-555.

121. Riva M., Carles C., Sentenac A., Grachev M.A., Mustaev A.A., Zaichikov E.F. Mapping the active site of yeast RNA polymerase В (II) // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 16498-16503.

122. Nudler E., Mustaev A., Lukhtanov E., Goldfarb A. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase // Cell. 1997. V. 89. P. 33-41.

123. Markovtsov V., Mustaev A., Goldfarb A. Protein RNA interactions in the active center of transcription elongation complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 3221-3226.

124. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.К, Лаврик О.И. Исследование взаимодействия репликативного белка А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP // Биоорган, химия. 1998. Т. 65. С. 160-163.

125. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.P., Khodyreva S.N., Fanning E., Farve A., Lavrik O.I. Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the З'-end of nascent DNA // FEBS Lett. 1999. V. 450. P. 131-134.

126. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D. Y., Wold M.S., Farve A., Lavrik O.I. Polarity of human replication protein A binding to DNA // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 373-379.

127. Колпащиков Д.М., Ходырева С.К, Лаврик О.И. Репликативный белок А связывает одноцепочечную ДНК полярно // Докл. АН. 2000. Т. 372. С. 824-826.

128. Колпащиков ДМ., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Исследование взаимодействия репликативного белка А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 194-198.

129. Wold M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.

130. Lee S.H., Pan Z.Q., Kwong A.D., Burgers P.M., Hurwitz J. Synthesis of DNA by DNA polymerase epsilon in vitro // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 22707-22717.

131. Tsurimoto Т., Stillman B. Multiple replication factors augment DNA synthesis by the two eukaryotic DNA polymerases, alpha and delta // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3883-3889.

132. Blachvell L.J., Borowiec J.A. Human replication protein A binds single-stranded DNA in two distinct complexes//Mol. Cell Biol. 1994. V. 14. P. 3993-4001.

133. Blachvell L.J., Borowiec JA., Masrangelo I.A. Single-stranded-DNA binding alters human replication protein A structure and facilitates interaction with DNA-dependent protein kinase//Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 4798-4807.

134. Хлиманков Д.Ю., Речкуиова H.H., Колпащиков Д.М., Петрусева И.О., Ходырева С.Н., Фавр А., Лаврик О.И. Исследование взаимодействия репликативного белка А с ДНК-дуплексами, содержащими бреши различного размера // Мол. биология. 2001. Т. 35. С. 827-835.

135. Bullock P.A. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro II Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 32. P. 503-568.

136. Mass G., Nethanel Т., Kaufmann G. The middle subunit of replication protein A contacts growing RNA-DNA primers in replicating simian virus 40 chromosomes // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 6399-6407.

137. Mass G., Nethanel Т., Lavrik O.I., Wold M.S., Kaufmann G. Replication protein A modulates its interface with the primed DNA template during RNA-DNA primer elongation in replicating SV40 chromosomes // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3892-3899.

138. Хшманков Д.Ю., Речкуиова H.H., Колпащиков Д.M., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. /Аффинная модификация флэпэндонуклеазы FEN-1 фотореакционноспособными ДНК // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 905-912.

139. Lavrik 01, Prasad R., Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoaffinity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.

140. Ankilova V.N., Knorre D.G., Kravchenko V. V., Lavrik O.I., Nevinski G.A. Investigation of the phenylalanyl-tRNA synthetase modification with y-(p-azidoaniIide)-ATP // FEBS Lett. 1975. V. 60. P. 172-175.

141. Невинский Г.А., Лаврик О.И., Фаворова О.О., Киселев JI.JI. Выявление нуклеотидсвязывающих участков двух типов в триптофанил-тРНК-синтетазе и их модификация // Биоорган, химия. 1979. Т. 5. С. 352-364.

142. Свердлов Е.Д., Царев СЛ., Модянов Н.Н., Липкий В.М., Грачев MA., Зайчиков Е.Ф., Плетнев А.Г. Фотоаффинная модификация РНК полимеразы Е. coli в транскрипционном комплексе аналогами субстратов // Биоорган, химия. 1978. Т. 4. С. 1278-1281.

143. Свердлов Е.Д., Царев С.А. Субъединицы РНК полимеразы Е. coli, контактирующие с 5'-концом РНК на разных стадиях транскрипции // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. С. 1110-1113.

144. Sverdlov E.D., Tsarev S.A., Kuznetsova N.F. Derivatives guanosine triphosphate -photoreactive substrates of E. coli RNA polymerase //FEBS Lett. 1981. V. 112. P. 269-301.

145. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т. 127. С. 654-657.

146. Grachev M.A., Zaichikov E.F. Photo-modification studies of the contacts of the 5'-terminus of growing RNA with the subunits of RNA-polymerase // FEBS Lett. 1981. V. 130. P. 23-26.

147. DeRiemer L.H., Meares C.F. Early steps in the path of nascent ribonucleic acid across the surface of ribonucleic acid polymerase, determined by photoaffinity labelling // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1612-1617.

148. Grachev MA., Mustaev A.A., Zaychikov E.F., in Chemical modification of enzymes. 1995. Eds. B.I. Kurganov, N.K. Nagradova, O.I. Lavrik. Nova Science Publishers, Inc., New York. P, 309-346.

149. Будкер В.Г., Гиршович A.C., Скобельцина Л.М. Способность jV-аминоацил-тРНК, ковалентно фиксированной N-ацильным радикалом на рибосоме вблизи пептидилтрансферазного центра, инициировать полипептидный синтез // Докл. АН СССР. 1972. Т. 207. С. 215-218.

150. Sheng N. Dennis D. Active site labeling of HIV-1 reverse transcriptase // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 4938-4942.

151. Boyer P.L., Ferris A.L., Hughes S.H. Cassette mutagenesis of the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1992. V. 66. P. 1031-1039.

152. Grachev M.A., Kolocheva T.I., Lukhtanov E.A., Mustaev A.A. Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. Highly selective affinity labelling by analogues of initiating substrates//Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 113-121.

153. Lebedeva N.A., Kolpashchikov D.M., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. A binary system of photoreagents for highly efficiency labeling of DNA polymerases // Biochem. Biophys. Res. Com. 2001. V. 287. P. 530-535.

154. Лебедева H.A., Колпащиков ДМ., Речкунова Н.И. Ходырева С.Н. Лаврик О.И. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 973-981.

155. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Farve A., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of proteins in nuclear extract by base excision repair intermediates // Biochem. Biophys. Res. Com. 2002. V. 297. P. 714-721.

156. Лебедева H.A., Речкунова Н.И., Дежуров С.В., Ходырева С.Н., ФаврА., Лаврик О.И. Новая бинарная система для фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимераз в ядерном экстракте // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 584-591.

157. Гайнутдинов Т.И., Шестова О.Е., Якубов Л.А., Добриков М.И., Власов В.В. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотидсвязывающих белков, представленных на поверхности эукариотических клеток. // Изв. АН. Сер. хим. 2002. Т. 7. С.1108-1112.

158. Шестова О.Е., Андреева О.Ю., Власов В.В., Якубов Л.А. Транспорт комплексов олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности в клеточное ядро // Докл. РАН. 1999. Т. 368. С. 264-267.

159. Якубов JI.А., Шестова О.Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. Участие специфических белков клеточной поверхности в транспорте нуклеиновых кислот в клетку // Докл. РАН. 1998. Т. 361. С. 550-553.

160. Bay ley Н., Staros J.V. Photoaffinity labeling and related techniques // Azides and nitrenes. 1984. P. 433-490.

161. Грицаи Н.П., Притчина E.A. Механизм фотолиза ароматических азидов // Успехи химии. 1992. Т. 61. С. 910-939.

162. Schuster G.B., Platz M.S. Photochemistry of phenyl azide // Ad. Photochem. 1992. V. 17. P. 69-143.

163. Gritsan N.P., Platz M.S. Kinetics and spectroscopy of substituted phenylnitrenes // Adv. Phys. Org. Chem. 2001. V. 36. P. 255-304.

164. Simutani M„ Nagakura S., Yoshikara K. The primary process of the photochemical formation of 1-nitrenopurene II Bull. Chem. Soc. Japan. 1976. V. 49. P. 2995-2998.

165. Gritsan N.P., Yuzawa Т., Platz M.S. Direct observation of singlet phenylnitrene and measurement of its rate of rearrangement // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 5059-5060.

166. Gritsan N.P., Zhai H.B., Yuzawa Т., Kanveik D., Brooke J., Platz M.S. Spectroscopy and kinetics of singlet perfluoro-4-biphenylnitrene and singlet perfluorophenylnitrene // J. Phys. Chem. A. 1997. V. 101. P. 2833-2840.

167. Gritsan N.P., Tigelaar D., Platz M.S. A laser flash photolysis study of some simple para-substituted derivatives of singlet phenylnitrene // J. Phys. Chem. A. 1999. V. 103. P, 3458-3461.

168. Gritsan N.P., Gudmundsdottir A.D., Tigelaar D., Zhu Z., Karney W.L., Hadad C.M., Platz M.S. A laser flash photolysis and quatum chemical study of the fluorinated derivatives of singlet phenylnitrene // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 1951-1962.

169. Born R., Burda C., Senn P., Wirs J. Transient absorption spectra and reaction kinetics of singlet phenylnitrene and its 2,4,6-tribromo derivative in solution // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 5061-5062.

170. Borden W.T., Gtitsan N.P., Hadad C.M., Karney W.L., Kemnitz C.R., Platz M.S. The interplay of theory and experiment in the study of phenylnitrene // Acc. Chem. Res. 2000. V. 33. P. 765-771.

171. Gritsan N.P., Zhu Z, Hadad C.M., Platz M.S. Laser flash photolysis and computational study of singlet phenylnitrene // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 1202-1207.

172. Gritsan N.P., Platz M.S. Kinetics, spectroscopy, and computational chemistry of arylnitrenes // Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 3844-3867.

173. Schnapp K.A., Poe R., Leyva E., Soundararajan N., Platz M.S. Exploratory photochemistry of fluorinated aryl azides. Implications for the design of photoaffinity labeling reagents // Bioconjugate. Chem. 1993. V. 4. P. 172-177.

174. Schnapp K.A., Platz M.S. A laser flash photolysis study of di-, tri- and tetrafluorinated phenylnitrenes; implications for photoaffinity labeling // Bioconjugate. Chem. 1993. V. 4. P. 178-183.

175. Pol'shakov D.A., Tsentalovich Yu.P., Gritsan N.P. Laser flash photolysis of fluorinated aryl azides in neutral and acidic solutions // Russ. Chem. Bulletin. 2000. V. 49. P. 50-55.

176. Platz M.S. Comparison of phenylcarbene and phenylnitrene. // Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 487-492.

177. Karney W.L., Borden W.T. Abinitio study of the ring expansion of phenylnitrene and comparison with the ring expansion of phenylcarbene // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 1378-1387.

178. Karney W.L., Borden W.T. Why does o-fluorine substitution raise the barrier to ring expansion of phenylnitrene? //J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 3347-3350.

179. DeGraff B.A., Gillespie D.W., Sundberg R.J. Phenyl nitrene. A flash-photo lytic inestigation of the reaction with secondary amines // J. Am. Chem. Soc. 1974. V. 96. P. 7491-7496.

180. Yonger C.G., Bell R.A. Photolysis of 3,4-diamidophenyl azides: evidence for azirine intermediates//;. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 8699-8701.

181. Liang T.Yu., Schuster G.B. Photochemistry ofp-nitrophenylazide: single-electron-transfer reaction of the triplet nitrene // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 546-548.

182. Liang T.Yu., Schuster G.B. Photochemistry of 3- and 4-nitrophenyl azides. Detection and characterization of reactive intermediates // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 7803-7810.

183. Odum R.A., Aaronson A.M. An intermolecular reaction of an aryl nitrene // J. Am. Chem. Soc. 1969. V. 91. P. 5680-5681.

184. Odum R.A., Wolf G. Effect of wavelength on the photolysis of p-cyanophenyl azide in dimethylamine // J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1973. P. 360-361.

185. Poe R., Schnapp K„ Young M.J.T., Grayzar J., Platz M.S. Chemistry and kinetics of singlet (pentafluorophenyl)nitrene//J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 5054-5067.

186. Leyva E., Sagredo R. Photochemistry of fluorophenyl azides in diethylamine. Nitrene reaction versus ring expansion // Tetrahedron. 1998. V. 54. P. 7367-7374.

187. Leyva E., Young M.J.T., Platz M.S. High yields of formal CH insertion products in the reactions of polyfluorinated aromatic nitrenes // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 8307-8309.

188. Young M.J.T., Platz M.S. Polyfluorinated aryl azides as photoaffmity labeling reagents; the room-temperature CH insertion reactions of singlet pentafluorophenyl nitrene with alkanes // Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 2199-2202.

189. Abramovitch R.A., Challand S.R., Scriven E.F.V. On the mechanism of intermolecular aromatic substitution by arylnitrenes // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 1374-1376.

190. Sundberg R.J., Suter S.R., Brenner M. Photolysis of ortho-substituted aryl azides in diethylamine. Formation and autoxidation of 2-diethylamino-l//-azepine intermediates // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 513-520.

191. Mair A.S., Stevens M.F.G. Triazines and related products. Part VIII. Potential irreversible chymotrypsin inhibitors: 3-alkyl-l,2,3-benzotriazin-4(3H)-ones and o-azidobenzamides // J. Chem. Soc. C. 1971. P. 2317-2324.

192. Purvis R., Smalley R.K., Strachan W.A., Suschitzky H. The photolysis of o-azidobenzoic acid derivatives: a practicable synthesis of 2-alkoxy-3-alkoxycarbonyl-3H-azepines // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1978. V. 1. P. 191-195.

193. Smith P.A.A. II Azides and Nitrenes. Reactivity and Utility. / Ed. E.F.V. Scriven. N.Y.: Acad. Press, 1984. P. 95-204.

194. Travers M.J., Cowles D.C., Clifford E.P., Ellison G.B. Photoelectron spectroscopy of the phenylnitrene anion // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 8699-8701.

195. Soundararajan N., Platz M.S. Descriptive photochemistry of polyfluorinatid azide derivatives of methyl benzoate // J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 2034-2044.

196. Marcinek A., Platz M. S. Unusually long lifetimes of the singlet nitrenes derived from 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamides // J. Phys.Chem. 1994. V. 98. P. 412-419.

197. Brinen J.C., Singh B. Electron spin resonance and luminescence studies of the reaction of photochemicaly generated nitrenes with oxygen, phosphorescence of nitrobenzenes // J. Amer. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 6623-6626.

198. Kon N. Suhadolnik R.J. Identification of the ATP Binding Domain of Recombinant Human 40-kDa 2',5'-01igoadenylate Synthetase by Photoaffmity Labeling with 8-Azido-alpha-32P.ATP//J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 19983-19990.

199. Mcintosh D.B., Parrish J.C., Wallace C.J.A. Definition of a nucleotide binding site on cytochrome c by photoaffinity labelling // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 18379-18386.

200. Liu J., Fan Q.R., Sodeoka M., Lane W.S., Verdine G.L. DNA binding by an amino acid residue in the C-terminal half of the Rel homology region // Chem. Biol. 1994. V. l.P. 47-55.

201. Ringheim G.E., Taylor S.S. Effects of cAMP-binding site mutations on intradomain cross-communication in the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase I // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 19472-19478.

202. Ringheim G.E., Saraswat L.D., Bubis J., Taylor S.S. Deletion of cAMP-binding site B in the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase alters the photoaffinity labeling of site A //J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 18247-18252.

203. Bubis J., Saraswat L.D., Taylor S.S. Tyrosine-371 contributes to the positive cooperativity between the two cAMP binding sites in the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase I // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 1570-1576.

204. Rush J., Königsberg W.H. Photoaffinity labeling of the Klenow fragment with 8-azido-dATP // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 4821-4827.

205. Wower J., Aymie M., Hixson S.S., Zimmermann R.A. Photochemical labeling of bovine pancreatic ribonuclease A with 8-azidoadenosine 3',5'-bisphosphate // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1563-1567.

206. Yuan C.S., Borchardt R.T. Photoaffinity labeling of human placental S-adenosylhomocysteine hydrolase with 2- H.8-azido-adenosine // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 16140-16146.

207. Chuan H., Lin J.,. Wang J.H. 8-Azido-2'-0-dansyl-ATP. A fluorescent photoaffinity reagent for ATP-binding proteins and its application to adenylate kinase // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7981-7988.

208. Lacapere J.J., Garin J., Trinnaman B„ Green N.M. Identification of amino acid residues photolabeled with 8-azidoadenosine 5'-diphosphate in the catalytic site of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 3414-3421.

209. Knight K.L., McEntee K. Tyrosine 264 in the recA protein from Escherichia coli is the site of modification by the photoaffinity label 8-azidoadenosine 5'-triphosphate // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 10185-10191.

210. Hollemans M„ Runswick M.J., Fearnley IM, Walker J.E. The sites of labeling of the beta-subunit of bovine mitochondrial Fl-ATPase with 8-azido-ATP // J. Biol. Chem. 1983. V.258. P.9307-9312.

211. Cho S.W., Ahn J.Y., Lee J., Choi S.Y. Identification of a peptide of the guanosine triphosphate binding site within brain glutamate dehydrogenase isoproteins using 8-azidoguanosine triphosphate // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13907-13913.

212. Shoemaker M.T., Haley B.E. Identification of a guanine binding domain peptide of the GTP binding site of glutamate dehydrogenase: isolation with metal-chelate affinity chromatography//Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1883-1890.

213. Kim H., Jacobson M.K., Rolli V., Menissier-de MurciaJ., Reinbolt J., Simonin F., Ruf A., Schulz G., de Murcia G. Photoaffinity labelling of human poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain//Biochem. J. 1997. V. 322. P. 469-475.

214. Grammer J.C., Kuwayama H., Yount R.G. Photoaffinity labeling of skeletal myosin with 2-azidoadenosine triphosphate//Biochemistry. 1993. V. 32. P. 5725-5732.

215. Mayinger P., Klingenberg M. Labeling of two different regions of the nucleotide binding site of the uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria with two ATP analogs //Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10536-10543.

216. Okamoto Y, Yount R.G. Identification of an active site peptide of skeletal myosin after photoaffinity labeling with yV-(4-azido-2-nitrophenyl)-2-aminoethyl diphosphate // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. V. 82. P. 1575-1579.

217. Kerwin B.A., Yount R.G. Photolabeling evidence for calcium-induced conformational changes at the ATP binding site of scallop myosin I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 35-39.

218. Kerwin B.A., Yount R.G. Photolabeling evidence for calcium-induced conformational changes at the ATP binding site of scallop myosin // Bioconjugate Chem. 1992. V. 89. P. 328-336.

219. Yamazumi K, Doolittle R.F. Photoaffinity labeling of the primary fibrin polymerization site: localization of the label to gamma-chain Tyr-363 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 2893-2896.

220. Myszka D.G., Swenson R.P. Synthesis of the photoaffinity probe 3-(p-azidobenzyl)-4-hydroxycoumarin and identification of the dicoumarol binding site in rat liver NAD(P)H:quinone reductase (E.C. 1.6.99.2) // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 4789-4797.

221. Brown R.L., Gramling R, Bert R.J., Karpen J. W. Cyclic GMP contact points within the 63-kDa subunit and a 240-kDa associated protein of retinal rod cGMP-activated channels // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 8365-8370.

222. Mayer A.N., Barany F. Photoaffinity cross-linking of TaqI restriction endonuclease using an aryl azide linked to the phosphate backbone // Gene. 1995. V. 153. P. 1-8.

223. Gibbs B.S., Benkovic S.J. Affinity labeling of the active site and the reactive sulfhydryl associated with activation of rat liver phenylalanine hydroxylase // Biochemistry. 1991. V. 30.P.6795-6802.

224. Tran C.M., Farley R.A. Photoaffinity labeling of the active site of the Na+/K(+)-ATPase with 4-azido-2-nitrophenyl phosphate // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 47-55.

225. Becker S., Bergman Т., Hjelmqvist L, Jeck R., Jornvall H., Leibrock H., Woenckhaus C. Photoaffinity labelling of lactate dehydrogenase from pig heart with a bifunctional NAD(+)-analogue // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1293. P. 277-283.

226. Hoppe J., Montecucco C., Friedl P. Labeling of subunit b of the ATP synthase from Escherichia coli with a photoreactive phospholipid analogue // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 2882-2885.

227. Catalano C.E., Allen D.J., Benkovic S.J. Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3612-3621.

228. Папьм В.А. Основы количественной теории органических реакций. JL: Химия. 1967. С. 272-273.

229. Черноловская ЕЛ., Черепанов П.П., Горожанкин А.В., Добриков М.И., Власов В.В., Ko6eif Н.Д Взаимодействие фотоактивных производных олиготимидилата с хроматином клеток HeLa // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 889-893.

230. Скиба Н.П., Ефимов B.A., Липкин B.M., Чахмахчева О.Г., Овчинников Ю.А. Локализация мест связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli с фоточувствительными аналогами матрицы // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. I023—I028.

231. Smith КС. Photochemical addition of amino acids to 14C-uracil // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V. 34. P. 354-357.

232. Годовикова T.C. // Исследования фотохимического взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков. Дис. . канд. хим.наук. Новосибирск, 1986. 143 с.

233. Stephanson L.G., Whiteley J.M. 5-Fluoro-2'deoxyuridine 5'-(p-azidophenylphosphate), a potential photoaffinity label of thymidylate synthetase // J. Med. Chem. 1979. V. 22. P. 953-957.

234. Коваль В.В. Максакова Г.А., Федорова О.С. Фотомодификация ДНК перфторарилазидопроизводным олигонуклеотида // Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 266-272.

235. Adams R., Acker D.S. Quinone imides. XXIII. Addition reactions of /7-quinonedibenzimide // J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 5872-5880.

236. Adams R., Schowalter K.A. Quinone imides. X. Addition of amines to p-quinonedibenzenesulfonimide// J. Am. Chem. Soc. 1952. P. 2597-2602.

237. Adams R., Elslager E.F. Quinone imides. XXV. Addition of mercaptanes to p-quinonedibenzenesulfonimide//J. Am. Chem. Soc. 1953. P. 663-666.

238. Лебедев A.B., Резвухин А.И. Закономерности изменений химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р-ЯМР производных нуклеотидов // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 149-185.

239. Tong L.K.I., Baetzold R.C. Kinetics of redox reactions of oxidized p-phenylenediamine derivatives. I//J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 1347-1353.

240. Corbett J.F. Benzoquinone imines. Part II. Hydrolysis of p-benzoquinone mono-imine and p-benzoquinone di-imine//J. Chem. Soc. (B). 1969. V. 3. P. 213-216.

241. Sadtler collection of standard NMA spectra // Philadelphia. P. A. 1980.

242. Corbett J.F. Benzoquinone imines. Part I. p-Phenylenediamine-ferricyanide and p-aminophenol-ferricyanide redox systems // J. Chem. Soc. (B). 1969. V. 3. P. 207-212.

243. Langenbach R.J., Danenberg P.V., Heidelberger C. Thymidylate synthetase: mechanism of inhibition by 5-fluoro-2'-deoxyurid'ylate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V. 48. P. 1565-1571.

244. Wieland Т., Pattermann F. Modellreaktion zur oxydativen Phosphorylierung // Angew. Chem. 1958. V. 70. P. 313-314.

245. Lapidot A., Samuel D. The points of bond fission in the hydrolysis of quinol phosphates using 180 as tracer//Biochim. Biophys. Acta. 1962. V. 65. P. 164-166.

246. Durckheimer W., Cohen L.A. The oxidative conversion of hydroquinone monophosphates to quinone ketals // Biochemistry. 1964. V. 3. P. 1948-1952.

247. Tomasi G.E., Dallam D. The phosphorylation reaction that accompanies the nonenzymic oxidation of 2-methyl-l,4-naphthohydroquinone diphosphate // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 1604-1613.

248. Cohen J.S., Lapidot A. Proof of the imidoil phosphate intermediate for oxidative phosphorylation in 180.dimethilformamide solution // J. Chem. Soc. (C). 1967. P. 1210-1213.

249. The Sadtler Standard Infrared Grating Spectra. Philadelphia. 1980.

250. Berger St., Ricker A. Zur Kenntnis des Chinoiden Zustandes XIX. 13C-Fourier-transform-Spektroskopie von orto- und para-Benzochinonen. / Korrelation zwischen chemischer Verschiebung und anderen Molekuldaten // Tetrahedron. 1972. V. 28. P. 3123-3139.

251. Faller J. W. Determination of organic structures by physical methods / Ed. Nachod F.C., Zuckerman J.J. Academ Press. 1973. V. 5. P. 75.

252. N orris R.K., Sternhell S. N.M.R. spectra of "/?-nitrosophenol" and its methyl derivatives // Austr. J. Chem. 1966. V. 19. P. 841-860.

253. Kramer D.N., Gamson R.M., Miller F.M. A study of the physical and chemical properties of the esters of indophenols I. Preparation // J. Org. Chem. V. 1959. V. 24. P. 1742-1747.

254. Tong L.K.J., Glesmann M.C. The mechanism of dye formation in color photography. III. Oxidative condensation with /?-phenylenediamines in aqueous alkaline solutions // J. Am. Chem. Soc. 1957. V. 79. P. 583-592.

255. Tong L.K.J., Glesmann M.C., Bent R.L. The mechanism of dye formation in color photography. VII. Intermediate bases in the deamination of quinonediimines // J. Am. Chem. Soc. 1960. V. 82. P. 1988-1996.

256. Tong L.K.J., Glesmann M.C. Kinetics and mechanism of oxidative coupling of /?-phenylenediamines // J. Am. Chem. Soc. 1968. V. 90. P. 5164-5173.

257. Tong L.K.J., Baetzold R.C. Kinetics of dye formation by flash photolysis in 1-octanol // J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 1394-1399.

258. Grachev M.A., Lukhtanov E.A., Mustaev A.A. Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. A method for localization of the sites of affinity labeling // Eur. J. Biochem. 1989. V. 180. P. 577-585.

259. Химия нитро- и нитрозогрупп. Т. 2. / под ред. Фойера Г. М.: Мир, 1973. С. 194. The chemistry of the nitro and nitroso groups. (Ed. Feuer H.). Interscience Publishers, New York London - Sydney - Toronto, 1969.

260. Heyrowsky M, Vavricka S., Exner 0. Charge-transfer interaction in complexes between acids and their anions//Collection Czechoslov. Chem. Commun. 1972. V. 37. P. 2858-2863.

261. Подлибнер, Б.Г., Некрасов, JI.H. Катодное восстановление я-нитроанилина в щелочных средах // Электрохимия. 1971. Т. 7. С. 1191-1195.

262. Bencheikh-Sayarh S., Cheminat В., Mousset G., Pouillen P. Reduction electrochimique de composes organiques en presence de tensio-actifs-IV // Electrochimica Acta. 1984. V. 29. P.1225-1232.

263. Seely G.R., Haggy G.A. Photochemistry in geterogenious system: chlorophyl-sensitized reduction of/?-dinitrobenzene by hydrazobenzene // J. Phys. Chem. 1987. V. 91. P. 440-447.

264. Green N.M. Avidin//Adv. Protein. Chem. 1975. V. 29. 85-133.

265. Власов В.В., Грачев М.А., Лаврик О.И. и др. Аффинная модификация биополимеров / под ред. Д.Г. Кнорре. Новосибирск: Наука, 1983. 242 с.

266. Bruice Т.С. Some pertinent aspects of mechanism as determined with small molecules I I Ann. Rev. Biochem. 1976. V. 45. P. 331-373.

267. Райхардш X. Растворители в органической химии. JI: Химия. 1973. 150 с

268. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Пер. с англ. М.: Мир.1976. С. 437-444.

269. Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. М.: Мир, 1977. С. 206.

270. Hayashi К, Swern D. Generation, reactions and multiplicity of benzoylnitrene // J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95. P. 5205-5210.

271. Hewick R.M., Hunkapiller M.W., Hood L.E., Dreyer W.J. A gas-liquid solid phase peptide and protein sequenator // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 7990-7998.

272. Kim H., Haley B. Identification of peptides in the adenine ring binding domain of glutamate and lactate dehydrogenase using 2-azido-NAD+ // Bioconjugate Chem. 1991. V. 2. P. 142-147.

273. Papini E., Santucci A., Schiavo G., Domenighini M., Meri P., Rappuoli R., Montelucco C. Tyrosine 65 is photolabeled by 8-azidoadenine and 8-azidoadenosine at the NAD binding site of diphtheria toxin//J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2494-2498.

274. Argarana C.E., Kuntz I.D., Birken S., Axel R., Cantor C.R. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 1871-1883.

275. Freitag S., Trong I.L., Klumb L., Stayton P.S., Stenkamp R.E. Structural studies of the streptavidin binding loop //Protein Science. 1977. V. 6. P. 1157-1166.

276. Weber P.C., Ohlendorf D.H., Wendoloski J.J., Salemme F.R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin // Science. 1989. V. 243. P. 85-88.

277. Weber P.C., Wendoloski J.J., Pantoliano M.W., Salemme F.R. Crystallographiс and thermodynamic comparison of natural and synthetic ligands bound to streptavidin // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 114. P. 3197-3200.

278. Chilkoti A., Tan P.H., Stayton P.S. Site-directed mutagenesis studies of the high-affinity streptavidin-biotin complex: contributions of tryptophan residues 79, 108 and 120 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 1754-1758.

279. Schubert W.M., Sweeney W.A., Latourette H.K Spectroscopic and other properties of large ring mono- and dimeric benzocyclanones prepared by a high-dilution Friedel-Crafts reaction // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 5462-5466.

280. Ross L., Barclay C. Cyclialkylation of aromatics. In: Friedel-Crafts and related reactions // Eds. Olah G.A. Willey, New York: Interscience. 1964. V. II. P. 785-977.

281. Khalaf A.A., Roberts M. New Friedel-Crafts chemistry XVI. A reconsideration of cyclialkylation and competing reactions of certain phenylalkyl, benzoalkyl and acetylphenylalkyl chlorides //J. Org. Chem. 1966. V. 31. P. 89-95.

282. Schubert W.M., Sweeney W.A., Latourette H.K. Spectroscopic and other properties of large ring mono- and dimeric benzocyclanones prepared by a high-dilution Friedel-Crafts reaction // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 5462-5466.

283. Gunther H. NMR spectroscopy. John Wiley. Chichester. 1980.

284. Gore P.H., Wheeler O.H. The absorption spectra of aromatic azo and related compounds. I. Azoxybenzenes // J. Am. Chem. Soc. 1956. V. 78. P. 2160-2163.

285. Curtin D.Y., Tveten J.L. Reaction of diarylzinc reagents with aryldiazonium salts. Direct formation of cis-azo compounds//J. Org. Chem. 1961. V. 26. P. 1764-1768.

286. Nakamoto K, Rundle R.E. Spectroscopic study of the monomer and dimmer in nitrosobensene derivatives // J. Am. Chem. Soc. 1956. V. 78. P. 1113-1118.

287. Hollenstein R., Philipsborn W. 13C and 'H-NMR spectra of or/Zzo-benzoquinones on the assignment problem in 13C spectra // Helv. Chim. Acta. 1973. V. 56. P. 320-322.

288. Будыка М.Ф., Кантор M.M., Алфимов M.B. Фотохимия фенилазида // Успехи химии. 1992. Т. 61. Вып. 1. С. 48-74.

289. Novak М„ Rajagopal S. A-Arylnitrenium ions // Adv. Phys. Org. Chem. 2001. V. 36. P. 255-304.

290. Сайке П. Механизмы реакций в органической химии. М.: Химия. 1991.

291. Общая органическая химия / Под ред. Д. Бартона, У.Д. Оллиса; Пер. с англ. Н.К. Кочеткова, М.А. Членова. М.: Химия, 1986. Т. 10: Нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, белки / Под ред. Е. Хаслама.

292. Реутов О.А., КурцА.Л., Бутин К.П. Органическая химия. М.: Бином. Лаборатория знаний,2004. С.456-462.

293. Stewart J.J.P. Optimization parameters for semiempirical methods. I. Method // J. Сотр. Chem. 1989. V. 10. P. 209-220.

294. Stewart J.J.P. Optimization parameters for semiempirical methods. II. Applications // J. Сотр. Chem. 1989. V. 10. P. 221-264.

295. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М. Органические люминофоры. М.: Химия, 1984. С. 11.

296. Турро Н. Молекулярная фотохимия. М.: Мир, 1967.

297. Greci L., Sgarabotto P. Reaction products of 2-methylindole with nitrosobenzenes: a reinvestigation. X-ray analysis of 2-(phenyl-N-oxidoiminomethyl)-3-phenylaminoindole // J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1984. V. 11. P. 1281.

298. Millie P., Malrieu J.P., Benaim J., Lallemand J.Y., Julia M. Researches in the indole series. XX. Quntum mechanical calculations and charge-transfer complexes of substituted indoles // J. Med. Chem. 1968. V. 11. P. 207-211.

299. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Аффинная модификация ферментов: проблемы и перспективы // Итоги науки и техники. Серия «Биоорганическая химия». М.: ВИНИТИ. 1988. Т. 13. С. 105-147.

300. Прокофьев М.А., Шабарова З.А. Производные нуклеотидов и олигонуклеотидов -инструменты исследования в молекулярной биологии // Мол. биология. 1978. Т. 12. Вып. 2. С. 245-259.

301. Knorre D.G., Vlassov V.V. Affinity modification of biopolymers. CRC Press, Boca Raton, FL. 1989.

302. Knorre D.G., Vlassov V.V, Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova OS. Dezign and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. / Boca Raton Ann Arbor - London -Tokyo: CRC Press. 1994. 366 p.

303. Гринева Н.И. Комплементарно адресованное алкилирование и фрагментация нуклеиновых кислот. В кн.: Аффинная модификация биополимеров. Новосибирск: Наука. 1983. С. 187-212. под ред. акад. Д.Г. Кнорре.

304. Agrawal S. Protocols for oligonucleotide conjugates. Synthesis and Analytical Techniques. / in Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ: Humana Press / 1994. V. 26. 390 p.

305. Зарытова В.Ф. Механизм реакций фосфорилирования, используемых в биоорганической химии // Итоги науки и техники. Серия «Биоорганическая химия». М.: ВИНИТИ. 1984. Т. 4. 232 с.

306. КирбиА., Уоррен С. Органическая химия фосфора. М.: Мир. 1971. 403 с.

307. Будкер В.Г., Зарытова. В.Ф., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д., Рязанкина О.И. Синтез 5-трифосфатов олигонуклеотидов//Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 618-625.

308. Shumyantzeva V. V., Sokolova N.I., Shabarova ZA. Modification of end phosphate groups in mono- and oligonucleotides //Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 903-916.

309. Зарытова В.Ф., Райт В.К, Черникова Т.С. Действие активирующих реагентов на межнуклеотидные связи в полирибонуклеотиде // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 1626-1632.

310. Smith М., Moffat J.G., Khorana H.G. Carbodiimides. VIII. Observation on the reactions of carbodiimides with acids and some new applications in the synthesis of phosphoric acid esters // J. Am. Chem. Soc. 1958. V. 80. P. 6204-6212.

311. Khorana H.G., Todd A.R. Studies on phosphorylation. Part XI. The reaction between carbodiimides and acid esters of phosphoric acid. A new method for the preparation of pyrophosphates // J. Chem. Soc. 1953. P. 2257-2260.

312. Самуков В.В. Селективная модификация концевых фосфатных групп в нуклеотидах и олигонуклеотидах. Дис. . канд. хим. наук. Москва, 1980. 150 с.

313. Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Шубина Т.Н. Селективная модификация монозамещенных фосфатных групп в 5'-моно- и полифосфатах нуклеозидов и олигонуклеотидов //Биоорган, химия. 1979. Т. 5. С. 886-894.

314. Кнорре Д.Г., Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Шубина Т.Н. Активация моно- и динуклеотидов смесью трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисульфида // Докл. АН СССР. 1977. Т. 236. С. 613-616.

315. Mukaiyama Т. An application of organic phosphorus compounds in the peptide and nucleotide synyhesis // Phosphorus and Sulfur. 1976. V. 1. P. 371-387.

316. Takaku H., Shimada Y., Nakajima Y., Hata T. A combined use of triphenyl phosphite and 2,2'-dipyridyl diselenide as a coupling reagent in oligonucleotide synthesis // Nucleic Acids Res. 1976. V.3.P. 1233-1248.

317. Hashimoto M., Mukaiyama T. Phosphorylation by oxidation-reduction condensation: preparation and reaction of S-(2-pyridyl)phosphorothioates I I Tetrahedron Lett. 1971. P. 2425-2428.

318. Jones R.A., Katritzky A.R. Tautomeric pyridines. Part I. Pyrid-2- and 4-thione I I J. Chem. Soc. 1958. P. 3610-3613.

319. Mukaiyama Т., Hashimoto M. Synthesis of olygothymidilates and nucleoside cyclic phosphates by oxidation-reduction condensation // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 8528-8532.

320. Альберт А., Серэ/сент E. Константы ионизации кислот и оснований. M.-JL: Химия. 1964. С.136-138.

321. Шейнкер Ю.Н., Померанцев Ю.И. О таутомерии некоторых производных гетероциклических соединений. IX. Строение солей оксипроизводных гетероциклического ряда//Ж. физ. химии. 1959. Т. 33. С. 1819-1829.

322. Бадашкеева А.Г., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г., Лебедев А.В., Шубина Т.Н. Активные фосфорилирующие производные динуклеотидов в олигонуклеотидном синтезе // Докл. АН СССР. 1975. Т. 222. С. 97-100.

323. Knorre D.G., Lebedev A.V., Zarytova V.F. Investigation of the mechanism of the active dinucleotide derivatives and their analogs //Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 1401-1418.

324. Cramer F., Winler M. Imidoesters, IV. Katalytische Wirkung von Dimethylformamid bei Reactionen von Phosphorsaureester-chloride // Chem. Ber. 1961. V. 94. P. 989-996.

325. Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Промежуточные соединения и промежуточные реакции в синтезе олигонуклеотидов // Успехи химии. 1985. Т. 54. Вып. 2. С. 313-337.

326. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Кнорре Д.Г., Лебедев А.В., Резвухин А.И., Ярмолинская Е.В. Аг-(дифенилфосфорил)-/7-Аг,Лг'-диметиламинопиридиний — активное фосфорилирующее производное дифенилфосфорной кислоты // Докл. АН СССР. 1979. Т. 248. С. 1124-1127.

327. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Кнорре Д.Г., Форбрюгеи X. Влияние и-ЛуУ-диметиламинопиридина на образование межнуклеотидной связи в ди- и триэфирном методе синтеза олигонуклеотидов // Докл. АН СССР. 1980. Т. 255. С. 878-881.

328. Jameson G.W., Lawlor J.M. Aminolysis of N-phosphorylated pyridines // J. Chem. Soc. 1970. (B). P. 53-57.

329. Wakselman M., Guibe-Jampel E. Phosphorylated pyridines. II. Aminopyridines // Tetrahedron Lett. 1970. P. 1521-1524.

330. Лошадкин H.A. Механизм нуклеофильного замещения у тетраэдрического атома фосфора // В кн.: О'Брайн Р. Токсические эфиры кислот фосфора. М.: Мир. 1964. С. 459-609.

331. Jencks W.P., Gilchrist М. Reactions of nucleophilic reagents with phosphoramidate // J. Am. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 3199-3209.

332. Зарытова В.Ф., Иванова EM., Кнорре Д.Г., Коробейничева И.К, Мальцева Т.В. Структура активных производных моноэфиров фосфорной кислоты по данным ИК-спектроскопии //Докл. АН СССР. 1980. Т. 255. С. 355-358.

333. Готтих М.Б., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Получение фосфамидов моно- и олигонуклеотидов в водной среде // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 1063-1067.

334. Cramer F., Schaller Н. Phosphorylierungs reaktionen mit salzen der Imidazolylphosphonate und Diimidazolylphosphinate // Chem. Ber. 1961. B. 94. S. 1634-1640.

335. Cramer F., Neunhoeffer H. Reaktionen von Adenosin-5'-phosphorsaureimidazoeid eine neue Synthese von Adenosindiphosphat und Flavin-Adenin-Dinucleotide // Chem. Ber. 1962. V. 95. P.1664-1669.

336. Юодка Б.А. О новых возможностях синтеза сложных эфиров нуклеотидил-(Р-»М)аминокислот (пептидов) // Журн. общ. химии. 1974. Т. 44. С. 2592-2593.

337. Azhaev A., Krayevsky A., Smirt J. Synthesis of CA and CCA derivatives containing 3'-amino-3'-deoxyadenosine. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1978. V. 43. P. 1647-1654.

338. Lohrmann R., Orgel L.E. Polymerization of nucleotide analogues. Reaction of nucleoside phosphorimidazolides with 2'-amino-2'-deoxyuridine // J. Mol. Evol. 1976. V. 7. P. 253-267.

339. Gibbs D.E., Orgel L.E. Some 5'-azido and 5'-amino-2'-deoxyribonucleosides, their 3'-phosphates and their 3'-phosphorimidazolidates // J. Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides. 1976. V. 3. P. 315-334.

340. Юодка Б., Лиоранчайте Л., Янушоните Л., Саснаускене С. Олигонуклеотиды и нуклеотидопептиды. XXVI. Синтез сложных эфиров нуклеотдил- и олигонуклеотидил-(5'-^-аминокислот (пептидов) // Биоорган, химия. 1976. Т. 2. С. 1513-1519.

341. Исагулянц М.Г., Ивановская М.Г., Потапов В.К., Шабарова З.А. Химическая конденсация олигонуклеотидов в комплементарном комплексе с активацией фосфата в месте разрыва полинуклеотидной цепи // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 239-244.

342. Chu B.C.F., Wahl G.M., Orgel L.E. Derivatization of unprotected polynucleotides // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 6513-6529.

343. Зарытова В.Ф., Годовикова T.C. Горн В.В., Шишкина ИГ. Способ получения аффинных сорбентов. Заявка №3897449/23-05 (дата положит, решения от 17.09.1986).

344. Bozhenok L.N., Khazina Е.В., Chernolovskaya E.L., Kobets N.D. Chromatin proteins surrounding the d(G-T)n repeats and polyamine influence as revealed by photoaffinity labeling with reactive pd(A-C)6 derivatives // FEBS Lett. 1998. V. 440. P. 38-40.

345. Кнорре Д.Г., Боженок Л.Н., Черноловская Е.Л., Шишкина И.Г., Годовикова Т.С., Зарытова В. Ф., Кобец Н.Д. Аффинное разделение белков хроматина клеток HeLa и их селективная модификация в области GT-повторов // Мол. биология. 2000. Т. 34. С. 55-59.

346. Grachev М.А., Zaychikov E.F. ATP y-anilidate: a substrate of DNA-dependent RNA-polymerase of Escherichia colill FEBS Lett. 1974. V. 49. P. 163-166.

347. Грачев M.A., Кнорре Д.Г., Лаврик О. И. у-Производные нуклеозид-5'-трифосфатов и нуклеозид-5'триметафосфаты новые реагенты для изучения активных центров ферментов и белковых факторов // Успехи биол. химии. 1986. Т. 27. С. 30-73.

348. Бабкина Г.Т., Зарытова В.Ф., Кнорре ДГ. Получение у-амидов нуклеозид-5'-трифосфатов в водном растворе с помощью водорастворимого карбодиимида // Биоорган, химия. 1975. Т. 1. С. 611-615.

349. Бабкина Г.Т., Грачев М.А., Зайчиков Е.Ф., Кнорре Д.Г., Ковригина B.C. Активное фосфорилирующие соединение в реакции нуклеозид-5'-трифосфатов с водорастворимым карбодиимидом //Изв. СО АН СССР. № 7. Сер. хим. наук. 1975. Вып. З.С. 128-132.

350. Leffler J.Temple R.D. The Staundinger reaction between triaryl phosphines and azides. A study of the mechanism// J. Am. Chem. Soc. 1967. V. 89. P. 5235-5246.

351. Shabarova Z.A. Synthetic nucleotide-peptides // Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 1970. V. 10. P. 145-182.

352. Савельев Е.П., Рябова T.C., Белецкая И.П., Шабарова З.А. Изучение кинетики гидролиза фосфалшдной связи в аденилил-(5'-»Л0-фенилапанине // Докл. АН СССР. 1964. Т.155.С. 1457-1459.

353. Воробьев О.Е., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Сравнительное изучение гидролитической устойчивости нуклеотидил-(Р-АО-фенилаланина // Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия. Т. 16. С. 66-71.

354. Соколова КН., Стумбравичуте 3., Пурыгин П.П., Шабарова З.А., Прокофьев MA. О вторичной структуре нуклеотидо-(-(Р-А^)-аминокислот (пептидов) // Докл. АН СССР 1967. Т. 174. С. 722-724.

355. Соколова Н.И. Гатинская Л.Г., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Изучение нуклеопептидной связи в производных ГМФ и ИМФ // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1969. Т. 14. С. 583-584.

356. Кочетков Н.К, Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова НА., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М.: Химия. 1970.

357. Michelson A.M. The organic chemistry of deoxynucleosides and deoxynucleotides // Tetrahedron. 1958. V. 2. P. 333-344.

358. Torchinsky Y.M. Sulfur in proteins. Oxford: Pergamon. 1981. P. 1-277.

359. Jocelyn P.C. Biochemistry of the SH group. London: Academic Press. 1972.

360. Staros J. V., Bayley H., Standring D.N., Knowles J.R. Reduction of aryl azides by thiols; implications for the use of photoaffinity reagents // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1978. V. 80. P. 568-572.

361. Cartwright I.L., Hutchinson D.W., Armstrong V.W. The reaction between thiols and 8-azidoadenosine derivatives // Nucleic Acids Res. 1976. V. 3. P. 2331-2339.

362. Buratowski S. The basics of basal transcription by RNA polymerase II // Cell. 1994. V. 77. P. 1-3.

363. Parvin J., Sharp PA. DNA topology and minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II // Cell. 1993. V. 73. P. 533-540.

364. Sayre M.H., Tschochner H, Kornberg R.D. Reconstitution of transcription with five purified initiation factors and RNA polymerase II from Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 23376-23382.

365. Мэнли Дж. Транскрипция и трансляция. Методы / Ред. Хеймс Б., Хиггинс С. М.: Мир. 1987. С. 92-98.

366. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989.

367. SentenacA. Eucaryotic RNA polymerases // Crit. Rev. Biochem. 1985. V. 18. P. 31-91.

368. Ludwig J. A new route to nucleoside 5'-triphosphates // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1981. V. 16. P. 131-133.

369. Sollogoub M„ Darby R.A., Cuenoud В., Brown Т., Fox K.R. Stable DNA triple helix formation using oligonucleotides containing 2'-aminoethoxy-5-propargylamino-U // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 7224.

370. Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 6633-6637.

371. Bergstrom D.E., Ogawa M.K. C-5 substituted pyrimidine nucleosides. 2. Synthesis via olefin coupling to organopalladium intermediates derived from uridine and 2'-deoxyuridine //J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 8106-8112.

372. Рихтер B.A. АТР:нуклеозид-5'-монофосфат фосфотрансфераза E. coli: выделение,iiхарактеризация, использование для препаративного получения Р( Р)-меченныхнуклеотидов. Дис. . канд. хим. наук. Новосибирск, 1988. 118 с.ii ii

373. Гриишев МЛ. Химический синтез а- Р.- и [у- Р]-нуклеозидтрифосфатов высокой молярной активности. Дис. . канд. хим. наук. Новосибирск, 1989. 179 с.

374. Reeve А.Е., Huang R.Ch.C. A method for the enzymatic synthesis and purification of a-32P.nucleoside triphosphates//Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 81-90.

375. Nelson D.J., Carter Ch.E. Purification and characterization of .thymidine 5'-monophosphate kinase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 5254-5262.

376. Kneal G., Broun Т., Kennard O. G-T base-pare in DNA helix: The crystal structure of d(GGGGTCCC) // J. Mol. Biol. 1985. V. 21. P. 805-814.

377. Туницкая В.Л., Мемелова Л.В., Скоблов Ю.С., Кочетков С.Н. Фотоаффинная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 продуктом полимеразной реакции, содержащим азидопроизводное UTP // Мол. биология. 2004. Т. 38. С. 1059-1066.

378. Cremer Т., Popp S., Emmerich Р., Lichter P., Cremer С. Rapid metaphase and interphase detection of radiation-induced chromosome aberrations in human lymphocytes by chromosomal suppression in situ hybridization // Cytometry. 1990. V. 11. P. 110-118.

379. Lichter P., Boyle A.L., Cremer Т., Ward D.C. Analysis of genes and chromosomes by non-isotopic in situ hybridization // Cenet. Anal. Technol. Appl. 1991. V. 8. P. 24-35.

380. Lichter P., Tang C.C., Call G„ Hermansson G„ Evans G.A., Housman D„ Ward D.C. High resolution mappingof chromosome 11 by in situ hybridization with cosmid clones // Science. 1990. V. 247. P. 64-69.

381. Selleri L., Hermansson G.G., Enbanks J.H., Evans G.A. Chromosomal in situ hybridization using yeast artificial chromosomes // Genet. Anal. Technol. Appl. 1991. V. 8. P. 59-66.

382. Nederlof P.M., van der Flier S., Wiegant J., Raap A.K., Tanke H.J., Ploem J.S., van der PloegM. Multiple fluorescence in situ hybridization // Cytometry. 1990. V. 11. P. 126-131.

383. Speicher M., Ballard S.G., Ward D.C. Karyotyping human chromosome by combinatorial multi-fluor FISH // Nature Genet. 1996. V. 12. P. 368-375.

384. Tkachuk D.C., Pinkel D., Kuo N.L., Weier H.U., Gray J.W. Clinical applications of fluorescence in situ hybridization // Genet. Anal. Technol. Appl. 1991. V. 8. P. 67-74.

385. Weber-Mattiesen K., Deerkerg J., Muller-Hermelink A., Winkemann M., Schlegelberger В., Grote W. Rationalization of in situ hybridization: testing up to 16 different probes on a single slide // Cancer Genet. Cytogenet. 1993. V. 68. P. 91-94.

386. Рубцов Н.Б., Карамышева T.B. Многоцветие современной цитогенетики, или multicolor fish today //Вестнн. ВОГСиС. 2000. № 11. С. 11-15.

387. Epstein L., Devries S., Waldman F,M. Reutilization of previously hybridized slides for fluorescence in situ hybridization // Cytometry. 1995. V. 21. P. 378-381.

388. Hames B.D., Higgins S.J. Transcription and translation: a practical approach.Oxford: JRL Press, 1984.

389. Argos P.A. A sequence motif in many polymerases // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 9909-9916.

390. Morozova O.V., Tsekhanovskaya N.A., Maksimova T.G., Bachvalova V.N., Matveeva V.A., Kit Yu.Yu. Phosphorylation of tick-borne encephalitis virus (TBEV) NS5 protein // Virus Research. 1997. V. 49. P. 9-15.

391. Ochiai E.Y. Recent Japanese work on the chemistry of pyridine 1-oxide and related compounds // Org. Chem. 1953. V. 18. P. 534-551.

392. Гершкович А.А., Серебряный С.Б. Водорастворимые 2-нитро-5-сульфофенильные соединения в пептидном синтезе // Биоорган, химия. 1979. Т 5. С. 1125-1132.

393. Perillo /., Lamdan S. Synthesis of 1,2-disubstituted 1,4,5,6-tetrahydropyridines // J. Heterocycl. Chem. V. 10. P. 915-923.

394. Lewis R. V., Roberts M.F., Dennis E.A., Allison W.S. Photoactivated heterobifunctional cross-linking reagents which demonstrate the aggregation state of phopholipase A2 // Biochemistry. 1977. V. 16. P. 5650-5654. •

395. Добриков М.И., Приходько T.A., Сафронов И.В., Шишкин Г.В. Синтез и свойства светочувствительных капроновых мембран. Фотоиммобилизация ДНК // Сиб. хим. журн. 1992. Вып. 2. С. 18-24.

396. Вейко Н.Н., Карпухин А.В., Сачимое А.Г., Немцова А.В., Ситковский ДМ. Биотинилирование ДНК с использованием фотоактивируемого реагента А-(4-азидо-2-нитробензоил)1,7-диаминогептана//Биотехнология. 1989. Т. 5. С. 414-419.

397. Богачев B.C. Синтез дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов с использованием в качестве активирующего реагента трифторуксусного ангидрида // Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 699-705.

398. Wedrychowski A., Olinski R., Hnilica L.S. Modified method of silver staining of proteins inpolyacrylamide gels//Anal. Biochem. 1986. V. 159. P. 323-328.

399. George C.P., Lira-DeVitro L.M., Wampler S.L., Kadonaga J.T. A spectrum of mechanisms for the assembly of the RNA polymerase II transcription preinitiation complex // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 1049-1059.

400. Jovin T.M., Englund P. Т., Bertsch L.L. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. Physical and chemical studies of a homogenous deoxyribonucleic acid polymerase // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 2996-3008.

401. Joyce C.M, Kelly W.S., Grindley N.D. Nucleotide sequence of the Escherichia coli polA gene and primary structure of DNA polymerase I // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1958-1964.

402. Речинский В.О., Драган С.М., Костюк Д.А., Ляхов Д.Л., Кочетков С.Н. Генетическая система отбора точечных мутантов РНК-полимеразы бактериофага Т7 // Мол. биология. 1991. Т. 25. С. 1588-1593.

403. Gudima S.O., Kostyuk D.A., Grishchenko О.1., Memelova L.V., Tunitskaya V.L., Kochetkov S.N. Synthesis of mixed ribo/deoxyribonucleotides by mutant T7 RNA polymerase //FEBS Lett. V. 439. P. 302-306.

404. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

405. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

406. Барам Г.И., Булева B.H., Добрикова Е.Ю., Петров В.Н. Множественность аффинной модификации РНКазы при алкилировании ее реакционноспособным аналогом 5'-дезоксирибонуклеотида//Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 613-620.

407. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Романенко В.П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом // Биоорган, химия. Т. 9. С. 516-521.

408. Горн В.В., Зарытова В.Ф. Твердофазный синтез олигодезоксирибонуклеотидов, пригодных для непосредственного использования в лигазной реакции // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 808-814.

409. Baram G.I. Portable liquid chromatograph for mobile laboratories. I. Aims // J. Chromatography A. 1996. V. 728. P. 387-399.

410. Cantor C.R., Tinoco l.Jr. Absorption and optical rotatory dispersion of seven trinucleoside diphosphates // J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 65-77.

411. The Handbook of Biochemistry and Molecular Biology: Nucleic Acids. / Ed. Т.Е. Fasman. Cleveland: CRC Press, 1975. P. 589.

412. Calvert J.G., Pitts J.N. Chemical actinometers for determination of ultraviolet light intensities in photochemistry, in: Photochemistry. / Wiley. New York. 1966. P. 780-788.

413. Pearlman D.A., Case D.A., Caldwell J.C., Seibel G.L., Singh U.S., Weiner P., Kollman P. A. AMBER 4.0. University of California, San Francisco, 1991.

414. Stewart J.J.P. MOPAC: A semiempirical molecular orbital program // J. Computer-Aided Molecular Design. 1990. V. 4. P. 1-105.

415. Sayle R., Milner-White E.J. RasMol: Biomolecular Graphics for All // Trends in Biochemical Sciences (TIBS). 1995. V. 20. P. 374.

416. Shallenberg E.E., Calvin M. II J. Am. Chem. Soc. 1955. V. 77. P. 2779-2783.

417. Gisin B.F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid // Anal. Chem. Acta. 1972. V. 58. P. 248-249.

418. Edelhoch H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins // Biochemistry. 1967. V. 6. P. 1948-1954.

419. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. / Киев: Наук. Думка. 1987. С. 123.

420. Tomlinson R. V., Tener G.M. The use of urea to eliminate the seconfary binding forces in ion exchange chromatography of polynucleotides // J. Am. Chem. Soc. 1962. V. 84. P. 2644-2645.

421. Eibl H., Lands W.E.M. A new sensitive determination of phosphate // Anal. Biochem. 1969. V. 30. P. 51-57.1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ