Механизмы фотоиндуцированного взаимодействия функциональных групп белков с реагентами на основе 4-азидофенилфосфата и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВ ПАВЕЛ ВАСИЛЬЕВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКОВ С РЕАГЕНТАМИ НА ОСНОВЕ 4-АЗИДОФЕНИЛФОСФАТА И 4-АЗИДО-2,3,5,6-ТЕТРАФТОРБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2006 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель: к.х.н. Годовикова Татьяна Сергеевна Научный консультант: академик РАН Кнорре Дмитрий Георгиевич

Официальные оппоненты: д.х.н. Сильников Владимир Николаевич

к.х.н., доцент Халимская Людмила Михайловна

Ведущая организация: Институт химической кинетики и горения

СО РАН

Защита состоится « 2006 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « £/_>■> А^г/^У 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н. Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аффинная модификация биополимеров и надмолекулярных комплексов является перспективным методом анализа их структуры и функции. Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном масштабе происходят многие биохимические события. Часто при синтезе фотоаффинных реагентов используются арилазиды. Последние, как известно, обладают способностью модифицировать различные функциональные группы и, тем самым, позволяют получать наиболее полную информацию об окружении реагентов в области связывания.

Несмотря на широкое применение ароматических азидов в фотоаффинном мечении белков, мало исследованными остаются процессы фотолиза арилазидов в водных растворах. В большинстве случаев не установлено также и строение соединений, образующихся при взаимодействии белков с арилазидами в результате облучения.

Таким образом, исследование фотохимического взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами биополимеров является актуальной задачей биоорганической химии.

Целью настоящей работы являлось установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия реагентов на основе 4-азидофенилфосфата и 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензойной кислоты с функциональными группами белков. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) изучить продукты фотолиза реагентов на основе и-азидофенилфосфата, образующиеся в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров; 2) сконструировать модельные системы в которых и-азидоперфторбензоильная группа и аминокислотный остаток сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков; 3) с использованием модельных систем изучить эффективность взаимодействия остатка 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с функциональными группами определённого типа биополимеров и установить строение продуктов внутримолекулярной модификации по остаткам Туг и Тгр.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что при облучении реагентов на основе и-азидофенилфосфата в водных растворах образуются фосфорилирующее производное и л-бензохинонмоноимин, что позволяет рассматривать исследуемые арилазиды как фотовключаемые бифункциональные реагенты. С помощью модельных систем, в которых остатки ароматических аминокислот сближены при помощи линкера с 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группой,

установлена структура продуктов фотоиндуцированного взаимодействия перфторазидоарильной группы с боковыми радикалами тирозина и триптофана.

Результаты данной работы могут оказаться полезными при планировании экспериментов с использованием реагентов на основе 4-азидофенилфосфата и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты, а также при интерпретации данных по фотоаффинной модификации белков.

Для получения реагентов на основе ароматических азидов было выделено и использовано новое фосфорилирующее производное олигонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилендиметилиминиевой группой,

образующееся при активации концевой фосфатной группы смесью трифенилфосфина-дипиридилдисульфида в ДМФ. Реакционная способность данного соединения по отношению к нуклеофильным реагентам и достаточная стабильность в водных растворах открывает возможность использования такого типа производных в качестве реагентов для аффинной модификации белков. Также с его использованием можно синтезировать сорбенты, содержащие иммобилизованные олигонуклеотиды, для аффинной хроматографии нуклеиновых кислот и белков.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ. Результаты работы были представлены на III Съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002 г. и международных конференциях: «Trends in Nucleic Acid Chemistry», Москва, Россия, 2000; Forum of Yong Scientists Protein Structure-Function, Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB, Ойерас, Португалия, 2001; 27lh Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Лиссабон, Португалия, 2001; "RNA as Therapeutic And Genomics Target", Новосибирск, Россия, 2001; «Chemical & Biological Problems of Proteomics», Новосибирск, Россия, 2004.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 22 рисунка, 55 схем и 12 таблиц. Библиография включает 167 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Механизм фотопревращения реагентов на основе /i-азидофенилфосфата в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров

Синтез и фотопревращение Р-(4-азидофенилового эфира) UDP при его облучении в водном растворе при pH 7.8. Первым этапом исследований было изучение процесса фотолиза в водных растворах р-(4-азидофенилового

эфира)иБР (4). Облучение всех образцов проводили светом ртутной лампы ДРШ-1000, фильтрованным набором светофильтров ЖС-3 и УФС-2 (Л.тах = 313 им, (1.35 ± 0.01) х 10,5-квант-с_1-см"1). .Синтез соединения (4) осуществляли путем фосфорилирования иМР АЛметилим идазол идом л-азидофенилфосфата (3) согласно схеме 1. За протеканием процесса следили путём регистрации спектров 3|Р-ЯМР. В спектре целевого продукта реакции (4) регистрируются сигналы соответствующие фосфатам как л-азидофенилфосфатного фрагмента (5 = -15.3 м.д. (д), J = 17.6 Гц), так и нуклеотидного остатка (8 = -10.4 м.д. (д), 3 = 17.6 Гц). Соединение (4) выделяли методом анионообменной гель-фильтрации, выход 28 %.

Схема 1.

о

О Е1зм о о I!

II (СР3С0)20 II II Ме1т п-м-г—к ри

* ' срзС-О-Р-К ^ ¿- —Т

О сг3со2 г О СР3СО2 Уз Ме1т

О^Н

он он

После облучения соединения (4) в водном растворе методом ионообменной ВЭЖХ регистрируется образование соединения, имеющего подвижность и спектральные отношения, соответствующие исходному уридин-5'-дифосфату (А240/А260 = 0.49, А25о/А2бо = 0.77, А27о/А260 = 0.90, А28о/А2бо = 0.46, А290/А2бо = 0.13, А30о/А260 = 0.08). Это указывает на то, что фотопревращение соединения (4) сопровождается расщеплением фосфоэфирной связи между арилазидной и пирофосфатной частями молекулы.

Фотопревращение п-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе при рН 5.1. Для изучения механизма фотопревращения л-азидофенилфосфата (1) в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров нами были изучены продукты его фотолиза. По данным 31Р-ЯМР в процессе облучения в воде исчезает сигнал с химическим сдвигом 5 = —3.7 м. д., соответствующий л-азидофенилфосфату, и появляется сигнал с химическим сдвигом 6 = 0.27 м. д., характерный для иона фосфата. По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения образуется соединение с ^-шах = 246 нм, что может соответствовать л-бензохинону. Для подтверждения структуры продукта фотолиза его экстрагировали хлороформом и анализировали с помощью инструментальных методов исследования (табл. !)•

Таблица 1

Сравнение спектральных данных продукта фотолиза с литературными данными для /1-бензохинона

Метод Экспериментальные данные Литературные данные для бензохинона

УФ-с пектроскопия (СЭСЬ, нм, 246, 256 246 (4.30), 255 (4.23)

И К-спектроскопия (КВг, ст"1) 1656 1655 (С=0)

'Н-ЯМР (СЭСЬ, 3, ррт) 6.77 (с, Н-2, Н-3, Н-5, Н-6) 6.79 (с, Н-2, Н-3, Н-5, Н-6)

"С-ЯМР (СЭС!,, .У, ррт) 187.11 (с, С1.С4), 136.45 (с, С2, СЗ, С5, С6) 187.00 (с, С1, С4), 136.40 (с, С2, СЗ, С5, С6)

Фотопревращение п-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе с рН 9.6. Известно, что и-бензохинон может образовываться при кислотном гидролизе «-бензохинонмоноимина (5). По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения соединения (1) в водном растворе с рН 9.6 образуется соединение с Хтах = 254 и 261 нм, что может соответствовать и-бензохинонмоноимину (5). Соединение (5) экстрагировали хлороформом, регистрировали 'Н-ЯМР-спектр. Протону иминогруппы отвечает мультиплетный сигнал в слабом поле ( 5 = 10.77 м. д.). Большое число линий указывает на то, что данный протон взаимодействует с соседними неэквивалентными протонами. Кроме мультиплета в спектре регистрируются четыре дублета ['Н-ЯМР (СОС13, 5, м.д, J, Гц): 7.27 (д, Н3, 10.2), 6.76 (д, Н5, 9.4), 6.62 (д, Н2, 10.2), 6.46 (д, Н6, 9.4)], которые представляют спиновую систему АМХС?. Такая сложная спиновая система обусловлена ограничением во вращении вокруг Ы-С-связи. На основании данных 'Н-ЯМР спектроскопии можно сделать вывод, что из двух возможных резонансных структур, представленных на схеме 2, наибольший вклад вносит структура (5), а не цвиттер-ион (5а).

Схема 2.

о" О "О"

N 5а N N 5

н' н' '• н

цвиттер-ион анпш- сын-

Для доказательства того, что продуктом фотолиза соединения (1) в водном растворе является и-бензохинонмоноимин, был осуществлен встречный синтез данного соединения путем окисления и-аминофенола оксидом серебра в водном растворе. Спектр 'Н-ЯМР продукта окисления

н-аминофенола, зарегистрированный в хлороформе, соответствует спектру продукта фотолиза соединения (1) в буфере с рН 9.6.

Следует отметить, что в апротонном растворителе (СОС13) при 25 °С возможен медленный переход из структуры (5) син- в ая/ли-конформацию. В случае смн-конформации распределение сигналов в олефиновой области 'Н-ЯМР спектра определяется дезэкранированием ядра Н-3. Протон Н-5 будет экранирован неподелённой электронной парой атома азота, а протоны Н-2 и Н-6 — неподелённой электронной парой атома кислорода. Спектральные параметры для структуры (5) были определены с помощью двойного гомоядерного резонанса на атомах водорода. Облучение образца слабым радиочастотным полем на резонансной частоте ядра Н-3 приводит к подавлению спин-спиновых взаимодействий ядра Н-2 с ядром Н-3, вследствие чего наблюдается исчезновение расщепления сигнала ядра Н-2 (дублет превращался в синглет). Непрерывное облучение образца на резонансной частоте ядра Н-3 приводит к тому, что происходит насыщение верхнего энергетического уровня этого ядра. В условиях медленного перехода соединения (5) из син- в анти-конформацию с константой скорости около 1 с-1 «насыщенное» ядро Н-3 становится «насыщенным» ядром Н-5, в результате чего сигнал от ядра Н-5 исчезает из спектра. Подобные изменения в 'Н-ЯМР спектре наблюдали при радиочастотном облучении образца на резонансных частотах протонов Н-2, Н-5и Н-6.

Фотопревращепие п-азидофеиилфосфата при его облучении в водном растворе с 2,6-ксилолом. Дополнительным подтверждением генерирования в ходе облучения продукта с хиноидной структурой (5) служит взаимодействие его с 2,6-ксилолом, результатом чего является образование красителя индаминового типа (6) — 3',5'-диметилиндофенола (схема 3).

Схема 3.

СН3

7 - -а СНз

леико-форма

- 2 5, - 2 Н+

.СНз

6 \:н3

Облучение светом водного раствора соединения (1) (0.34 х 10~3 М) и 2,6-ксилола

(2.6 х Ю-3 М)

приводит к образованию продукта реакции, имеющего в щелочной среде (0.01 М ЫаОН) синюю окраску (А.тах = 595 нм). При спектрофотометрическом титровании полученного раствора 0.1 М НС1

камтекс с переносом заряда

наблюдается изменение цвета в интервале рН 8.6-9.2. Это свидетельствует о том, что соединение (6) можно использовать в качестве кислотно-основного индикатора (ЛГ(„ = 8.9). Индикаторные свойства соединения (6) обусловлены тем, что раствор его ионизованной формы имеет интенсивную синюю окраску (А.тах = 595 нм, Ig 8 = 4.23). Кроме того, соединение (6) можно использовать в качестве окислительно-восстановительного индикатора. При добавлении к окрашенному раствору аскорбиновой кислоты наблюдается его обесцвечивание, что свидетельствует о восстановлении соединения (6) с образованием продукта в лейко-форме (7). Строение соединения (6) подтверждено данными 'Н-ЯМР спектроскопии ['Н-ЯМР (D20, 5, м.д., J, Гц): 7.17 (с, 2Н, Н2., Н6.), 7.00 (д, Н3, Н5, 2Н, 8.2), 6.63 (д, 2Н, Н2, Н6, 8.2), 2.04 (с, 6Н, -СН3)].

Красители индаминового типа образуются при взаимодействии фенолов с соединениями с хиноидной структурой. Ранее нами было показано, что при облучении и-азидофенилфосфата образуется неустойчивый в водных растворах и-бензохинонмоноимин. Накопление при фотовзаимодействии с ксилолом индофенола (6) свидетельствует о том, что скорость 1,6-присоединения w-бензохинонмоноимином ксилола превосходит скорость его гидролиза. Это может быть обусловлено тем, что реагирующие молекулы сближаются в пространстве путем образования комплекса с переносом заряда (см. схему 4). После формирования комплекса на первом этапе происходит характерное для хиноидных структур 1,6-присоединение 2,6-ксилола к и-бензохинонмоноимину с образованием соединения (7) (лешсо-форма соединения (6)). На втором этапе соединение (7) окисляется кислородом воздуха до 3\5'-диметилиндофенола (6).

Фотопревращение п-азидофенилфосфата при его облучении в присутствии лизина. По данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, после облучения соединения (1) в 1 M растворе лизина (рН 9.6) был зарегистрирован сигнал с химическим сдвигом 9.37 м. д. Смещение сигнала исходного фосфомоноэфира (5 = -3.7 м. д.) в слабое поле указывает на превращение его в алифатический амидофосфат. Зарегистрированный сигнал, с химическим сдвигом 5 = 9.37 м. д. может соответствовать а- (8а) или е-амидофосфату Lys (8) (см. схему 4). Поскольку арилнитрены не могут образовывать амидофосфаты, то можно сделать вывод, что при фотолизе и-азидофенилфосфата образуется реакционноспособное фосфорилирующие соединение, которое модифицирует функциональную группу лизина. На роль этого соединения может претендовать метафосфат (9) (схема 4).

Н2Ы-СН—СОСГ "ООС—СН-ИН—Р032"

(СН2)4 <СН2)4

НН-ГОз2" ын2

8 8я Одновременное образование фосфорилирующего соединения и и-бензохинонмоноимина при облучении реагентов на основе и-азидофенилфосфата выделяет эти фотоактивируемые производные из ряда других арилазидных реагентов. С одной стороны, это фотовключаемые фосфорилирующие реагенты, которые могут обеспечить модификацию аминокислотных остатков, непосредственно контактирующих с фосфатной группой субстрата. С другой стороны, элиминирование реакционноспособного в отношении нуклеофильных центров и-бензохинонмоноимина позволяет рассматривать исследуемый арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент. Таким образом, использование аффинных реагентов на основе такого арилазида, по сравнению с другими реагентами, открывает возможность получения наиболее полной информации в районе связывания реагента в процессе функционирования биологической системы.

.Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензоилъной группы с боковыми радикалами аминокислот в составе комплементарного

комплекса

Настоящий раздел посвящен сравнению эффективности модификации функциональных групп биополимеров широко используемыми в настоящее время реагентами на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты. Под эффективностью модификации в дальнейшем будет пониматься способность реагента обеспечивать образование определенного процента ковалентных аддуктов с исследуемым объектом.

Для сравнительного анализа взаимодействия арилазидных производных олигонуклеотидов с функциональными группами нуклеиновых кислот и белков мы сконструировали специальную модельную систему. Модель состоит из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, одно из которых является реагентом, а другое - мишенью модификации. У реагента к 5'-концевому фосфату через спейсер присоединена арилазидная группа. У мишени к 3'-концевому фосфату олигонуклеотида через спейсер присоединен боковой радикал аминокислоты. Образование комплементарного комплекса позволяет сблизить фрагмент аминокислоты с арилазидным остатком на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

В качестве мишеней для фотомодификации в работе использовали остатки соединений, моделирующих боковые радикалы цистина, лизина и триптофана - цистамин, пропилендиамин и 3-индолилуксусную кислоту, соответственно. Для присоединения фрагментов аминокислот в работе использовали олигонуклеотид СОТАТСр (10), а в качестве носителя фотоактивируемой группы - рОАТАССАА (11) (схема 5). Выбор в качестве мишеней модификации соединений с алифатической аминогруппой или боковым радикалом триптофана обусловлен тем, что при фотоаффинной модификации белков эти центры являются наиболее предпочтительным местом атаки арилазидными реагентами.

Схема 5.

К.= —ОН 10

Г Р

N11

10, 13-15

3' 5'

Я—рСТАТвСр*

рЙАТАССАА 5' 3'

\

н

12

13

14

15

Получение фотоактивируемых производных олигонуклеотидов и конъюгатов олигонуклеотидов с соединениями, имитирующими функциональные группы белков. Синтез соединений (12) — (15) осуществляли путем фосфорилирования алифатических аминогрупп с использованием нового активного производного соответствующего олигонуклеотида с цвиттер-ионной концевой группой. Фосфорилирующее производное моно- и олигонуклеотидов (16) было впервые выделено нами непосредственно после активации концевой фосфатной группы смесью трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисульфида в БМР (схема 6).

о

- II РЬ3Р, (РуБЬ

О— Р— к. —

ОМР

сн3ч ,о ы-с.

О ~ + II РЬ3Р— О— Р— сж I-о

17

СН3 н нзСч+ II кн о. и -2-► м = с_о— р— я Я'—НН-Р—Я

н3с I Л- Л

но ?

о

ОМР

16

К - нуклеозид или олигонуклеотид

В 31Р-ЯМР-спектре фосфорилирующего производного олигонуклеотида рс1(СГО) в 020, наблюдался сигнал от активированного концевого фосфата при -1.74 м. д. С течением времени интенсивность сигнала при -1.74 м. д. уменьшается, и через 20 ч он перестает регистрироваться. В то же время появляется сигнал при 3.95, соответствующий сигналу незамещенного концевого фосфата, что подтверждено путём добавления исходного олигонуклеотида рс!(ОТО) в качестве внутреннего контроля. Также появляется сложный сигнал в области, характерной для пирофосфатов с центром при -14.2 м. д.

Ранее на роль фосфорилирующего производного постулировалась фосфорилоксифосфониевая соль олигонуклеотида (17) Однако, при анализе ПМР спектра продукта гидролиза активированного производного тимидинмонофосфата нами не было обнаружено сигналов ни от трифенилфосфина, ни от дипиридилдисульфида, а были обнаружены сигналы от ДМФ в эквимолярных соотношениях ['Н-ЯМР (020, 5, м.д.): 7.99 (с), 2.90 (с) и 3.05 (с)].

Добавление к активированному олигонукпеотиду водных растворов аминов (1,3-диаминопропана, цистамина) приводит в течение нескольких минут к практически количественному превращению его в соответствующие амидофосфаты. По данным 31Р-ЯМР сигналы от концевых фосфатов смещаются в слабое поле при превращении из фосфомоноэфиров в амидофосфаты (5 ~ +8 м. д).

Фотохимические превращения в дуплексах осуществляли при 4 °С, облучая реакционную смесь светом X (300-350 нм) с интенсивностью света 1.2 х 1015 квант-с^-см"1 в течение 6 мин. Реакционная смесь содержала производные олигонуклеотидов (Ю-5 М) в 0.16 М ЫаС1, 0.02 М На2НР04, 0.1 мМ ЕОТА, рН 8.9. Реакционные смеси после облучения анализировали с

помощью анионообменной хроматографии и гель-электрофореза. Количественное распределение продуктов модификации определяли по денситометрическим профилям дорожек радиоавтографа.

Таблица 2

Результаты модификации олигонуклеотидных мишеней (10), (13) - (15) фотореагентом (12)

Эффективность модификации, % Мишень

(Ю) (13) (14) (15)

23 47 69 26

По результатам анализа, существенное количество продуктов сшивки (69 %) наблюдается при облучении фотореагента с мишенью, несущей индольную группу. Следует отметить, что именно данный аминокислотный остаток, а также остаток Туг, являются основными мишенями в белках для разного типа арилазидных реагентов. В связи с этим нами были предприняты исследования по установлению структуры продуктов их модификации реагентами на основе и-азидоперфторбензойной кислоты.

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с

боковыми радикалами ароматических аминокислот в модельных

соединениях

Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты. Для исследования продуктов модификации функциональных групп Туг, Тгр, реагентами на основе 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензойной кислоты нами были синтезированы модельные соединения, в которых аминокислотные остатки и арилазидная группа соединены спейсером разного размера. Структура таких соединений обеспечивает соответствующую ориентацию фотоактивируемой группы относительно аминокислотного остатка с тем, чтобы сблизить реагирующие центры на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков. Синтез соединений (18), (19), (20), (21) проводился через ацилирование аминогруппы спейсера, предварительно введенного в фотоактивируемую группу, с помощью активированных эфиров Бос-защищенных аминокислот (схема 7).

Строение синтезированных модельных соединений были подтверждены методами ЯМР-'Н, 1 Р, ИК- и электронной спектроскопий и МАЬШ-масс-спектрометрии.

ОВос

1. Вое—Туг—ОЭис

2. НСООН

О

II

К-С- ЫН—(СН2)„- ын2

о о

II II

Я- С- ИН—(СН2)„- 1-ш - с- сн - >ш2

сн2 ф

он

п=2 п=3 п=4

18

19

20

1. Вое— Тф—ОРГр

2. НСООН

11 "" —(© ~ N3 РФ = —((Р )>

О О

II II

К-С-МН-(СН2)„-МН-С-сн-ын2

сн2

п=3 21 гЯчТГ \

о сн3

II I Вое = —С-О-С—СН3

о

V

Эис'

V

СНз о

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с остатком тирозина. При фотолизе соединения (20) по данным ОФХ наблюдалось образование двух основных продуктов фотореакции: аминосоединение (22) и продукт внутримолекулярной модификации триплетным нитреном по бензильному атому углерода фенильного кольца тирозина (23) - 4-амино-14,15,16,17-тетрафтор-3-(4-гидроксифенил)-2,6,11-триаза-бицикло[ 11.2.2]гептадека-1(16), 13(17), 14-триен-5,12-дион (схема 8). Для наглядного представления данных по 'Н-ЯМР-спектроскопии атомы в соединении (23) пронумерованы в соответствии с нумерацией исходного соединения (20), а не в соответствии с названием по номенклатуре ШРАС.

Схема 8.

и 3" 2"

2 3 4 5 6 7 118 9 7" „...

ЫН—СН2-СН2-СН2-СН2-ЫН—с—сн—сн2^((^-он

Ьу н2о

М2

ЫН2

5" 6" 20

2 ? 4 5 6 7 Не 9 7"

-МН-СН2-СН2-СН2-СН2-Ш-С—СН-СНгЧОУ-ОН ' х * ИН2 1 '

5" 6" 22

СН2—СН2— >)Н 4 / Чи^О

СН2 С^

1ч и ю

СН2 Р Р СН-Ш2

ОН

В пользу предложенного строения соединения (23) свидетельствуют данные |9Р-ЯМР. В структурах исходного азида (20) и его аминопроизводного (22) атомы фтора Р2- и Р6- (Р3> и Ру) являются магнитно-эквивалентными в смысле химического сдвига, поэтому в спектрах 19Р-ЯМР они представлены двумя сигналами (табл. 3). В то же время, в спектре соединения (23) присутствуют все четыре сигнала от анизохронных атомов фтора, поскольку в циклической молекуле затруднено вращение вокруг связи С4—N. В спектре 'Н-ЯМР интегральная интенсивность сигналов от атома водорода Н7- уменьшается на один протон, что указывает на его замещение. Также в пользу предложенной структуры (23) говорят данные МАЬОЬмасс-спектрометрии {т/г 441.1 [М + Н]+ , рассчитано для СгоНг^^Оз* 441.155).

Таблица 3

Данные ЯМР-спектроскопии соединения (20) и продуктов его фотопревращения (22) и (23); (б, м.д., 3, Гц)

Тип ядра и его положение Соединение и тип растворителя

(20) (0М50-с16) (22) (С03СЬЮ20 (1:1, У/У)) (23) (С03С№020 (1:1, у/У))

Н - 3, Н - 6 3.00- 3.12 (м) 3.00-3.12 (м) 2.86-3.36 (м)

Н — 4, Н — 5 1.40-1.44 (м) 1.38- 1.42 (м) 1.24- 1.36 (м)

Н-9 3.36 (дд) 7=7.8,7=5.5 3.39-3.44 (м) 2.86-3.36 (м)

Н-2", Н-6" 6.98 (д), 7= 8.4 6.98 (д), 7= 8.4 6.98-7.03 (м)

Н-3", Н-5" 6.70 (д), 7= 8.4 6.67 (д), 7= 8.4 6.69-6.76 (м)

Н - 7" 2.80 Н7 (да) 7= 13.5,7=5.5, 2.55 Н7-о (дд) 7= 13.5,7 = 7.8 2.82 Н, о, (дд) 7= 13.5,7=5.5, 2.58 Нг-р (ДП) 7= 13.5,7 = 7.8 2.86-3.36 (м)

Р — 2', Р - 6' 27.9 (дд) 7=21.7,7 = 9.1 24.0 (д) 7= 17.8 21.9-22.0 (м) 21.1-21.2 (м)

Р-3\Р-5' 19.5 (дд) 7=21.7,7=9.1 7.9 (д) 7= 17.8 14.9-15.1 (м) 12.6- 12.7 (м)

При фотолизе в водном растворе соединений, содержащих остаток тирозина и спейсер длиной в две (18) или три (19) метиленовых группы, основными продуктами являются соответствующие аминопроизводные. Для поиска конформаций, в которых возможна внутримолекулярная модификация тирозинового остатка нитреном, было проведено компьютерное моделирование структур (18)-(20). Обнаружено, что в одной из конформаций, соответствующей энергетическому минимуму, для структуры с четырьмя метиленовыми группами атом азота нитрена и бензильный атом углерода остатка тирозина располагаются на расстоянии 0.38 нм. В структурах с двумя и тремя метиленовыми звеньями это расстояние составляет 0.75 нм, 0.45 нм, соответственно (рис. 1). Таким образом, в структуре с п = 4 реализуется энергетически выгодная

конформация, в которой реакционноспособные остатки сближены между собой, что обеспечивает возможность образовать продукты внутримолекулярной реакции.

с

Рис. 1. Пространственная структура модельных соединений по данным компьютерного моделирования: а) (18), Ь) (19), с) (20).

Фотовзаимодействие п-азидоперфторбензоилыюй группы с остатком триптофана. При облучении модельной структуры (21), в которую входил остаток триптофана, также наблюдалось образование двух продуктов — аминосоединения (24) и продукта внутримолекулярной модификации по бензольному ядру индольной группы триптофана - 8-амино-17,18,24,25-тетрафтор-4,10,14,20-тетрааза-тетрацикло[ 14.4.3.03,23.217,20]пентакоза-

1,3(23),5,16(24),17,19(25),21-гептаен-9,15-диона (25) (схема 9) Атомы соединения (25) пронумерованы в соответствии с соединением (21).

а

ь

Схема 9.

21

I 2 , „ „I___

25

На протекание реакции электрофильного замещения в ароматическом гетероцикле указывает изменение в спектре 'Н-ЯМР интегральной интенсивности ароматических протонов и изменение их химических сдвигов. Ароматическая система индола в соединении (25) содержит четыре протона вместо пяти, в случае исходного соединения (21) (табл. 4).

По данным "F-ЯМР, в спектре соединения (25) наблюдается анизохронность всех атомов фтора в составе арилазидного остатка, то есть, в отличие от двух мультиплетов в спектре 19Р-ЯМР исходного соединения (21), в спектре "F-ЯМР соединения (25) присутствуют четыре сигнала (табл. 4). Также в пользу структуры говорят данные MALDI-масс-спектрометрии (m/z 450.0 [М + Н]+, рассчитано для C^Hzt^NjíV 450.155).

Таблица 4

Данные ЯМР-спектроскопии соединения (21) и продуктов его фотопревращения (24) и (25); (5, м.д., J, Гц)

Тип ядра и его положение Соединение и тип растворителя

(21)(D20) (24)(D20) (25) (CDjOD)

Н — 5" 7.68 (д), J =8.1 7.68 (д), J=* 8.1 6.98 (д), J =8.6

Н — 8" 7.57 (д), J =8.1 7.57 (r),J— 8.1 7.66-7.72 (м)

Н-2" 7.39 (с) 7.39(c) 7.42 (с)

Н-7" 7.30 (T),J- 8.1 7.30 (т), J=8.1 -

Н-6" 7.23 (т), J= 8.1 7.23 (т), J= 8.1 7.23 (д), У =8.6

Н — 8 4.26 (i), J — 5.9 4.26 (t),J~ 5.9 3.34-3.44 (м)

Н- 10" 3.45 (м) 3.45 (м) 2.83-2.91 Н,о а (м) 2.21-2.29 Н,„ о (м)

Н — 5 3.26 Н5а (м) 3.05 H5li (м) 3.26 Н5а (м) 3.05 Hsu (м) 3.36 Н3а (м) 3.73 Hsb (м)

Н-3 3.00 (т), У = 7.0 3.00 (т), J—1.0 3.09 Н3а (м) 2.99 Н!0 (м)

Н-4 1.47 (м) 1.47 (м) 1.44 Hía (м) 0.49 Н4!) (м)

F - 2', F — 6' 22.9 (м) 25.4 (м) 21.6 — 21.9 (м) 19.2-19.4 (м)

F - 3', F - 5' 14.2 (м) 8.9 (м) 17.6-17.9 (м) 13.1 - 13.5 (м)

Таким образом, совокупность данных, полученных в настоящей работе, показывает, что при использовании реагентов на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты следует ожидать образования устойчивых продуктов ковалентного присоединения реагентов к остаткам ароматических аминокислот белковой молекулы.

Работа выполнена при поддержке грантов SCOPES 2000-2003, РФФИ 0204-48080, 01-04-06246 и №НШ-1419-2003-4.

выводы

I. Показано, что при облучении реагентов на основе и-азидофенилфосфата в водных растворах образуются фосфорилирующее производное и л-бензохинонмоноимин, что позволяет рассматривать исследуемые арилазиды как фотовключаемые бифункциональные реагенты.

II. Выделено и охарактеризовано фосфорилирующее производное олигонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилендиметил-иминогруппой. С его использованием разработан эффективный и простой в исполнении метод пост-синтетической дериватизации концевых фосфатных групп олигонуклеотидов, позволяющий вводить по ним различные функциональные группировки, в том числе и остатки ароматических азидов.

III. С использованием модели, состоящей из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, к 5'-концевому фосфату одного из которых через спейсер присоединена 4-азидоперфторбензоильная группа, а к З'-концевому фосфату другого — остаток пропилендиамина, цистамина или 3-индолилуксусной кислоты, исследовано внутрикомплексное фотохимическое взаимодействие. Обнаружено, что 4-азидоперфторбензоильный остаток на фоне взаимодействия с олигонуклеотидной мишенью модифицирует функциональные группы аминокислотных остатков. С наибольшей эффективностью данный арилазид взаимодействует с боковым радикалом триптофана.

IV. Для изучения фотовзаимодействия перфторазидоарильных реагентов с функциональными группами белков синтезированы модельные системы, в которых аминокислотные остатки тирозина или триптофана сближены при помощи линкера с 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. Обнаружено:

1. при облучении модельного соединения Аг-{4-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-бутил}-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида образуется 4-амино-14,15,16,17-тетрафтор-3-(4-гидроксифенил)-2,6,11-триаза-бицикло[ 11,2.2]гептадека-1 (16), 13( 17), 14-триен-5,12-дион - продукт внутримолекулярной модификации по бензильному атому углерода фенильной группы Туг.

2. при облучении модельного соединения /"/-{З-р-амино-З-ОН-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамид образуется 8-амино-17,18,24,25-тетрафтор-4,10,14,20-тетрааза-тетрацикло [ 14.4.3.03'23.217,20]пентакоза-1,3(23),5,16(24), 17,19(25),21 -гептаен-9,15-дион - продукт внутримолекулярной модификации по бензольному ядру индольной группы Тгр.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Годовикова Т.С. Алексеев П.В.. Кнорре Д.Г. Новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов // Докл. АН. 1997. Т. 357. С. 259-262.

2. Кнорре Д.Г., Биченкова Е.В., Коваль В.В., Алексеев П. В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т. С. Новый подход к изучению взаимодействия боковых радикалах аминокислот с арилазидами // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 663-669.

3. Aleksevev P.V.. Romanova I.V., Shakirov М.М., Godovikova T.S. p-Azidophcnyl phosphate is a photoactivatable phosphorylating reagent and p-benzoquinone monoimine precursor // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2001. V. 65. P. 39—46.

4. Алексеев П.В.. Морозкин Е.С., Попова Т.В., Годовикова Т.С. Фотохимическое взаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом триптофана // Труды 1-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки». Естественные науки. Самара: СГТУ. 2005. Ч. 45. С. 135-138.

5. Алексеев П.В.. Алексеева И.В., Ерченко И.А., Годовикова Т.С. 3',5'-Диметилиндофенол как продукт фотовзаимодействия л-азидофенилфосфата с 2,6-ксилолом // Труды 1-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки». Естественные науки. Самара: СГТУ. 2005. Ч. 45. С. 138-140.

6. Алексеев П.В.. Морозкин Е.С., Попова Т.В., Шакиров М.М., Годовикова Т.С. Фотохимическое взаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом тирозина в условиях сближения реакционных центров // Труды международной конференции «Физико-химическая биология». Новосибирск: АРТА. 2006. С. 81-82.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001. Подписано к печати и в свет 17.11.06 Формат бумаги 60x84/16. Бумага № 1. Гарнитура "Times New Roman". Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 120 Заказ № 114 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Аффинная модификация биополимеров фосфорилирующими реагентами и реагентами на основе 4-азидоарилфосфата и перфторарилазида

1 1 Аффинные реагенты с фосфорилирующей реакционноспособной группой и 10 группой, потенциально способной к фосфорилированию

111 Фосфорилирующие аффинные реагенты - производные моно-и олигонуклеотидов, содержащие реакционноспособную группу на 5'-конце

1 1 2 Фосфорилирующие аффинные реагенты - производные нуклеиновых кислот, содержащие реакционноспособную группу в составе межнуклеотидной пирофосфатной связи 1.1 3 Фотоаффинные реагенты на основе л-азидофенил- и

4-азидо-2-нитрофенилфосфата 1.14 Механизмы окисления гидрохинонфосфоэфиров

1 2 Применение перфторированных арилазидов для фотоаффинной модификации биополимеров

ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2 1 Механизм фотопревращения реагентов на основе л-азидофенилфосфата в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров

2 1 1 Синтез и фотопревращение Р-(4-азидофенилового эфира)1ГОР при его облучении в водном растворе при рН

2 1 2 Фотопревращение л-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе при рН

2 1 3 Фотопревращение л-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе при рН

2.1 4 Фотопревращение л-азидофенилфосфата при его облучении в водном растворе с 2,6-ксилолом

2 1 5. Фотопревращение л-азидофенилфосфата при его облучении в присутствии лизина

2 2. Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 72 боковыми радикалами аминокислот в составе комплементарного комплекса

2 2.1 Получение фотоактивируемых производных олигонуклеотидов и конъюгатов олигонуклеотидов с соединениями, имитирующими функциональные группы белков

2 2 2 Внутрикомплексное фотохимическое взаимодействие тетрафторазидобензоильной группы с боковыми радикалами аминокислот

2 3 Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковыми радикалами ароматических аминокислот в модельных соединениях

23 1 Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток

4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты

2 3 2 Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с остатком тирозина

2.3 3 Фотовзаимодействие л-азидоперфторбензоильной группы с остатком триптофана

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3 1 Материалы и методы 96 3 2 Компьютерное моделирование модельных соединений (80) - (82) 98 3 3 Синтез я-азидофенилфосфата 99 3 4 Синтез (Ц4-азидофенил)уридин-5'-дифосфата (63) 99 3 5 Фотолиз л-азидофенилфосфата в карбонатном буферном растворе (рН 9.6)

3 6 Выделение продуктов фотолитического разложения я-азидофенилфосфата в водном растворе (рН = 5.1) 3 7 Фотолиз я-азидофенилфосфата в присутствии лизина при рН

3 8 Синтез л-бензохинонмоноимина при рН

3 9. Фотолиз л-азидофенилфосфата в водном растворе 2,6-ксилола

3.10 Получение цетавлоновой соли олигонуклеотидов

3.11 Получение фосфорилирующих производных моно- и олгонуклеотидов 101 (77а) - (77ж) в DMF

3 12 Синтез 3'-(3-аминопропил)-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp

3 13 Синтез 3'-(3-аминопропил)-амидофосфата олигонуклеотида pGATACCAA

3 14 Синтез 3'-[2-(2-аминоэтилдисульфанил)-этил]-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (76) 3 15 Синтез 3'-[3-(3-индолилацетиламидо)пропил]-амидофосфата олигонуклеотида GGTATCp (75) 3 16 Синтез 5'-[3-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоиламидо)пропил]амидофосфата олигонуклеотида pGATACCAA (73) 3.17 Внутридуплексная фотохимическая модификация

3 18. Синтез трет-6у1токстафотпшшо-(4-третбутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (98) 3 19 Синтез Мгидроксисукцинимидного эфира третбутилоксикарбониламино-(4-/я/?е/л-бутилкарбонилоксибензил)-уксусной кислоты (99)

3 20. Синтез ;У-(3-аминопропил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (100)

3 21 Синтез Аг-(2-аминоэтил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (101)

3 22. Синтез//-(4-аминобутил)-4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензамида (102)

3 23 Синтез Лг-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-этал}-4азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (80) 3 24 Синтез Лг-{3-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-пропил}

4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбенз&мида (81)

3 25 Синтез ^-{4-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-бутил}

4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида (82)

3 26 Синтез /У-{3-[2-шино-3-(1//-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-4азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамида (83)

3 27 Идентификация основных продуктов фотолиза соединений (80), (81),

82), (84)

ВЫВОДЫ

ПРИМЕЧАНИЯ

В настоящее время все возрастающую роль в исследовании структуры нуклеопротеидов и динамики процессов с участием надмолекулярных комплексов играют химические методы Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном масштабе происходят многие биохимические события Часто при синтезе фотоаффинных реагентов используются арилазиды. Последние, как известно, обладают способностью модифицировать различные функциональные группы и, тем самым, позволяют получать наиболее полную информацию об окружении реагентов в области связывания [1]

Для исследования разных биологических систем используется широкий спектр ароматических азидов, различающихся типом заместителя в бензольном кольце. Фотореагенты на основе и-азидоарилфосфата хорошо зарекомендовали себя при изучении функционирования транскрипционного комплекса прокариот, а также для исследования важнейших биоэнергетических механизмов, локализованных в мембранах [2-5]. Фотоаффинные реагенты на основе я-азидоперфторбензойной кислоты в настоящее время широко используются для изучения белково-нуклеиновых комплексов функционирующих в процессе матричного биосинтеза биополимеров [6-8] Несмотря на широкое применение ароматических азидов в фотоаффинном мечении белков, малоисследованными остаются процессы фотолиза арилазидов в водных растворах В большинстве случаев не установлено также и строение соединений, образующихся при взаимодействии белков с арилазидами в результате облучения.

На протяжении ряда лет в Лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН проводится систематическое исследование механизмов фотоиндуцируемых реакций арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков К моменту проведения настоящей работы было обнаружено, что облучение в водных растворах двух типов арилазидов - я-азидоанилина и л-нитрозамещенных арилазидов приводит к образованию реакционноспособных соединений. Было установлено, что «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании л-нитрозамещенных арилазидных реагентов обусловлены образованием реакционноспособного ароматического нитрозосоединения [9] В случае реагентов на основе л-азидоанилина частицей, модифицирующей белки, может быть производное я-бензохинондиимина [10, 11]. Что касается реагентов на основе перфторазидоарила и л-азидофенилфосфата, то для них до сих пор не установлена даже природа модифицированного аминокислотного остатка При этом некоторые экспериментальные факты свидетельствуют о том, что в случае реагентов на основе /7-азидофенилфосфата в модификации белков могут принимать участие частицы не нитреновои природы Так, при фотомодификации тимидилатсинтазы 5-фтор-2'-дезоки-[6-3Н]-уридин-5'-(п-азидо-[2,6-14С]-фенил)-фосфатом, авторы наблюдали включение в фермент либо арилазиднои, либо нуклеотидной части реагента в зависимости от условий проведения эксперимента [12] Таким образом, исследование фотохимического взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков является до сих пор актуальной задачей биоорганической химии.

Целью настоящей работы являлось установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия реагентов на основе 4-азидофенилфосфата и 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензойной кислоты с функциональными групп белков Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• изучить продукты фотолиза реагентов на основе л-азидофенилфосфата, образующиеся в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров,

• сконструировать модельные системы, в которых я-азидоперфторбензоильная группа и аминокислотный остаток сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков;

• с использованием модельных систем изучить эффективность взаимодействия остатка 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с функциональными группами определенного типа биополимеров и установить строение продуктов внутримолекулярной модификации по остаткам Туг и Тф.

выводы

I. Показано, что при облучении реагентов на основе л-азидофенилфосфата в водных растворах образуются фосфорилирующее производное и л-бензохинонмоноимин, что позволяет рассматривать исследуемые арилазиды как фотовключаемые бифункциональные реагенты

II. Выделено и охарактеризовано фосфорилирующее производное олигонуклеотидов с цвиттер-ионной (3-фосфорилметилендиметилиминогруппой. С его использованием разработан эффективный и простой в исполнении метод пост-синтетической дериватизации концевых фосфатных групп олигонуклеотидов, позволяющий вводить по ним различные функциональные группировки, в том числе и остатки ароматических азидов.

III. С использованием модели, состоящей из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, к 5'-концевому фосфату одного из которых через спейсер присоединена 4-азидоперфторбензоильная группа, а к 3'-концевому фосфату другого -остаток пропилендиамина, цистамина или 3-индолилуксусной кислоты исследовано внутрикомплексное фотохимическое взаимодействие. Обнаружено, что 4-азидоперфторбензоильный остаток на фоне взаимодействия с олигонуклеотидной мишенью модифицирует функциональные группы аминокислотных остатков С наибольшей эффективностью данный арилазид взаимодействует с боковым радикалом триптофана.

IV. Для изучения фотовзаимодействия перфторазидоарильных реагентов с функциональными группами белков синтезированы модельные системы, в которых аминокислотные остатки тирозина или триптофана сближены при помощи линкера с 4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензоильной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. Обнаружено:

1. при облучении модельного соединения А''-{4-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-бутил}-4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензамида образуется 4-амино-14,15,16,17-тетрафтор-3-(4-гидроксифенил)-2,6,11 -триаза-бицикло[11.2.2]гептадека-1(16),13(17),14-триен-5,12-дион - продукт внутримолекулярной модификации по бензильному атому углерода фенильной группы Туг.

2. при облучении модельного соединения Л^-{3-[2-амино-3-(1Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамид образуется 8-амино-17,18,24,25-тетрафтор-4,10,14,20-тетрааза-тетрацикло[ 14.4 3.О3;гз.217'20]пентакоза-1,3(23),5,16(24), 17,19(25),21 -гептаен-9,15-дион - продукт внутримолекулярной модификации по бензольному ядру индольной группы Тф.

1. Knorre DG, Godovikova TS Photoaffmity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes //FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 9-14.

2. DeRiemer L H, Meares С F Synthesis of mono- and dinucleotide photoaffmity probes of ribonucleic acid polymerase // Biochemistry. 1981 V. 20. P. 1606-1612.

3. DeRiemer L H, Meares С F Early steps in the path of nascent ribonucleic acid across the surface of ribonucleic acid polymerase, determined by photoaffmity labelling // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1612-1617.

4. Кнорре ДГ, Кудряшова HB, JIaepm О И Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: общие вопросы и исследование транскрипции // Успехи химии. 1997. Т. 66 С 401-413

5. Грайфер ДМ, Карпова Г Г Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 584-596.

6. Кнорре ДГ., Кудряшова НВ, Лаврик О И Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции // Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

7. Badashkeyeva A G, Gall TS, Efimova E V, Knorre DG, Lebedev A V Mysina SD. Reactive derivative of adenosine-5'-triphosphate formed by irradiation of ATP y-p-azidoanilide // FEBS Lett. 1983. V. 155. P. 263-266.

8. Кудряшова HB, Шаманина МЮ, Годовикова ТС, Ананько ЕА, Ахмадиева Ф Ф, Ромащенко А Г// Особенности взаимодействия ДНК-полимеразы I Е coll и ее большого фрагмента с ^-w-азидоанилидом dGTP // Биохимия. 1993. Т. 58. Вып. 2. С. 224-232.

9. Stephanson L G, Whiteley J.M 5-Fluoro-2'deoxyuridine 5'-(p-azidophenyl phosphate), a potential photoaffinity label of thymidylate synthetase // J. Med. Chem. 1979. V. 22. P 953-957.

10. Смирнов ЮВ, Липкий ВЫ, Овчинников ЮА, Грачев МА, Мустаев А А Аффинная модификация центра связывания инициирующего субстрата ДНК зависимой РНК-полимеразы Ecoli аденозин-5'-триметофосфатом // Биоорган, химия. 1981. Т. 7 С. 1113-1116.

11. Grachev МА , Mustaev A A. Cyclic adenosine-5'-tnmetaphosphate phosphorylates а histidine residue nearby the initiating substrate binding site of Escherichia coli DNA-dependent RNA-polymerase // FEBS Lett. 1982. V. 137 P. 89-94.

12. Grachev MA, Kolocheva TI, Lukhtanov EA, Mustaev A A Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. Highly selective affinity labelling by analogues of initiating substrates // Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 113-121.

13. Mustaev A, Kashlev M, Zaychikov E, Grachev M, Goldfarb A Active center rearrangement in RNA polymerase initiation complex // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19185-19187.

14. Грачев MA, Лухтанов EA, Мустаев А А, Абдукаюмов MH, Рабинов ИВ, Рихтер В А., Скоблов Ю С. Локализция остатка гистидина в области связывания инициирующего субстрата РНК-полимеразы Е coli II Биоорган, химия. 1987. Т. 13. С. 992-995.

15. Mustaev А, Kashlev М, LeeJY, Polyakov А, Lebedev A., Zalenskaya К., Grachev М„ Goldfarb А, Nikiforov V. Mapping of the priming substrate contacts in the active center of Escherichia coli RNA polymerase//! Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 23927-23931.

16. Кочетков С Н, Габибов А Г, Северин ЕС Механизмы переноса фосфорильной группы в ферментативных реакциях // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. С. 1301-1325.

17. Kenyon GL, Reed GH. Creatine kinase, structure-activity relationships // Adv. Enzymol. Relat Areas Mol Biol. 1983. V 54. P 367-426.

18. Козицына JIА, Куплетская HБ Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии // М.: Высшая школа. 1971. С. 243.

19. Невинский Г А, Доронин С В, Подуст В Н, Лаврик О И Эффективность комплексообразования нуклеотидов с ДНК-полимеразой а человека поданным модификации фермента их реакционноспособными аналогами // Мол. биология. 1987. Т. 21. С. 1070-1079.

20. Doromn S V, Lavrik О I, Nevinsky G А, Podust VN The efficiency of dNTP complex formation with human placenta DNA polymerase alpha as demonstrated by affinity modification//FEBS Lett 1987. V. 216. P. 221-224.

21. Невинский Г A, Доронин С В, Лаврик О И ДНК-полимераза I Е coli: зависимая от праймер-матричного комплекса инактивация фермента имидазолидами дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов // Биополимеры и клетка. 1985. Т. 1. С. 247253.

22. Доронин С В, Невинский ГА , Хомов В В, Лаврик О И Аффинная модификация ДНК-полимеразы I из Escherichia coli и ее фрагмента Кленова имидазолидами нуклеотидов // Мол. биология. 1991. Т. 25. С. 358-367.

23. Joyce С М., Ollis D L, Rush J, Sieiiz T.A, Konigsberg WH, Grindley ND F// UCLA Symp. on Molecular and Cellular Biology / D. Oxender, ed. N.-Y.: Liss, 1986. P. 197205.

24. Joyce СМ., Kelley WS, Grindley ND Nucleotide sequence of the Escherichia coli polA gene and primary structure of DNA polymerase I // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1958-1964.

25. Argos P A sequence motif in many polymerases // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16 P. 9909-9916.

26. Mustaev A A , Godson G N Studies of the functional topography of the catalytic center of Escherichia coli primase //J. Biol. Chem. 1995 V. 270. P. 15711-15718.

27. Tougu K, Peng H, Marians К J Identification of a domain of Escherichia coli primase required for functional interaction with the DnaB helicase at the replication fork // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 4675-4682.

28. Sun W, Tormo J, Steitz ТА, Godson GN Domains of Escherichia coli primase: functional activity of a 47-kDa N-terminal proteolytic fragment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11462-11466.

29. Stamford N P, Lilley P E, Dixon N E Enriched sources of Escherichia coli replication proteins. The dnaG primase is a zinc metalloprotein // Biochim. Biophys Acta. 1992. V. 1132. P. 17-25

30. Bernstein J A, Richardson CCA 7-kDa region of the bacteriophage T7 gene 4 protein is required for primase but not for helicase activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 396-400.

31. Бунева В H, Годовикова Т С, Зарытова В Ф Модификация РНКазы 5'-фосфо-^ метилимидазолидными производными ди- и олигодезоксирибонуклеотидов // Биоорган химия. 1986. Т. 12. С. 906-910.

32. Барам Г И, Бунева В Н, Добрикова Е Ю, Петров В Н Множественность аффинной модификации РНКазы при алкилировании ее реакционноспособным аналогом 5'-дезоксирибонуклеотида// Биоорган, химия. 1986. Т. 12 С. 613-620.

33. Grachev MA, Zaychikov E F Initiation by Escherichia coli RNA-polymerase: transformation of abortive to productive complex // FEBS Lett. 1980. V.l 15. P. 23-26.

34. Seroz T, Perez С, Bergmann E, Bradsher J, Egly JM// p44/SSLl, the regulatory subunit of the XPD/RAD3 helicase, plays a crucial role in the transcriptional activity of TFIIH. J. Biol. Chem 2000. V. 275. P. 33260-33266.

35. Кузнецова С А, Ивановская МГ, Шабарова ЗА Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах. IX Направленное введение замещенных пирофосфатных связей в структуру ДНК // Биоорган химия. 1990. Т. 16. С. 219225.

36. Kuznetsova SA, Ivanovskaya MG, Shabarova ZA Design of new DNA duplexes containing chemically cleavable internucleotide bonds // Nucl. Acids Res. 1991. № 24, Symp Ser, P 235.

37. Козлов И А, Кубарева И А, Ивановская МГ, Шабарова ЗА Определение положения контактов фактора транскрипции NF-kB с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания // Мол. биология 1997. Т. 31. С. 6373.

38. McClarin J A, Frederick С A, Wang ВС, Greene P, Boyer HW, Grable J, Rosenberg J.M Structure of the DNA-£coRI endonuclease recognition complex at 3 A resolution//Science. 1986. V. 234 P 1526-1541.

39. Lenardo M, Pierce JW, Baltimore D Protein-binding sites in lg gene enhancers determine transcriptional activity and inducibility // Science. 1987. V. 236 P. 15731577.

40. Ghosh G, van Duyne G, Ghosh S, Sigler P В Structure of NF-kappa В p50 homodimer bound to a kappa В site // Nature. 1995. V. 373: P. 303-310.

41. Muller С W, Rey FA, Sodeoka M, Verdine G L, Harrison S С Structure of the NF-kappa В p50 homodimer bound to DNA. Nature. 1995. V. 373. P. 311-317.

42. Meisenheimer KM, Koch TH Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins//Cnt. Rev. Biochem. Mol. Biol 1997 V. 32. P 101-140.

43. Danenberg P V Thymidylate synthetase a target enzyme in cancer chemotherapy // Biochim Biophys Acta 1977 V 473. P. 73-92.

44. Langenbach RJ, Danenberg PV, Heidelberger С Thymidylate synthetase: mechanism of inhibition by 5-fluoro-2'-deoxyuridylate // Biochem Biophys Res Commun. 1972 V.48.P 1565-1571.

45. Wataya Y, Santi D V, Hansch С Inhibition of Lactobacillus casei thymidylate synthetase by 5-substituted 2'-deoxyundylates Preliminary quantitative structure-activity relationship//J Med. Chem. 1977. V. 20. P. 1469-1473.

46. Pougeois R, Lauquin GJ Further investigations on the inorganic phosphate binding site of beef heart mitochondrial Fi-ATPase // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 1020-1024.

47. Pougeois R, Lauquin G J, Vignais P V Interaction of 4-azido-2-nitrophenyl phosphate, an inorganic phosphate photoreactive analogue, with chloroplast coupling factor 1 // Biochemistry. 1983. V. 22 P. 1241-1245

48. Pougeois R, Lauquin GJ, Vignais P V Evidence that 4-azido-2-mtrophenylphosphate binds to the phosphate site on the p-subunit of Escherichia coli BFi-ATPase // FEBS Lett. 1983. V 153. P. 65-70.

49. Tommasino M, Prezioso G, Palmieri F Photoaffmity labeling of the mitochondrial phosphate carrier by 4-azido-2-nitrophenyI phosphate I I Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 890. P. 39-46.

50. Michel L, Garin J, Girault G, Vignais P V. Photolabeling of the phosphate binding site of chloroplast coupling factor 1 with 32P.azidonitrophenyl phosphate // FEBS Lett. 1992. V.313.P. 90-93.

51. Lacapere J J, Garin J Interaction of 4-azido-2-nitrophenyl phosphate, a pseudosubstrate, with the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase // Biochemistry. 1994 V. 33. P 2586-2593.

52. Tran CM, Farley R A Photoaffinity labeling of the active site of the Na+/K+-ATPase with 4-azido-2-mtrophenyl phosphate // Biochemistry 1996 V. 35. P. 47-55.

53. Michel L, Garin J, Issartel JP, Vignais PV Synthesis and properties of azidonitrophenyl pyrophosphate, a photoaffinity probe of the nucleotide binding sites of mitochondrial Fi-ATPase // Biochemistry. 1989. V. 28 P 10022-10028.

54. Michel L, Garin J, Vincon M, Gagnon J, Vignais P Mapping of the pyrophosphate binding sites of beef heart mitochondrial Fj-ATPase by photolabelling with azidonitrophenyl a-32P.pyrophosphate // Biochim Biophys. Acta. 1995. V. 1228 P 67-72.

55. Abrahams JP, Leslie A G, Lutter R, Walker JE Structure at 2.8 A resolution of Fj-ATPase from bovine heart mitochondria//Nature 1994. V. 370. P 621-628.

56. Wieland T, Pattermann F Modellreaktion zur oxydativen Phosphorylierung // Angew. Chem. 1958. V. 70 P 313-314.

57. Lapidot A, Samuel D The points of bond fission in the hydrolysis of quinol phosphates using 180 as tracer//Biochim. Biophys Acta 1962 V.65 P 164-166

58. Durckheimer W, Cohen LA The Oxidative Conversion of Hydroquinone Monophosphates to Quinone Ketals // Biochemistry. 1964. V. 3. P 1948-1952.

59. Todd A Some aspects of phosphate chemistry // Proc. Natl. Acad Sci U.S A. 1959. V. 45 P. 1389-1397.

60. Cramer F, Winler M Imidoesters, IV Katalytische Wirkung von Dimethylformamid bei Reactionen von Phosphorsaureester-chlonde // Chem. Ber. 1961. V. 94. P 989-996.

61. Ratz R, Sweeting О J Some Chemical Reactions of 3,9-Dichloro-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro5.5.undecane 3,9-Dioxide // J. Org Chem. 1963. V. 28. P. 1608-1612.

62. Tomasi GE, Dallam D The phosphorylation reaction that accompanies the nonenzymic oxidation of 2-methyl-l,4-naphthohydroquinone diphosphate // J Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 1604-1613.

63. Cohen JS. Lapidot A Proof of the imidoil phosphate intermediate for oxidativef бphosphorylation in 0.dimethilformamide solution // J. Chem. Soc. (C). 1967. P 1210-1213.

64. Bayley, H, Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier-North Holland Biomedical Press 1983.

65. Schuster G В, Platz MS Photochemistry of phenyl azide // Adv. Photochem. 1992. V. 17 P. 69-143

66. Liang T Y, Schuster G В Photochemistry of 3- and 4-nitrophenyl azides- detection and characterization of reactive intermediates // J. Am. Chem Soc. 1987. V. 109. P 7803-7810.

67. Горяйнова T Ф, Ершов Ю A, Лившиц P M Фотохимические превращения органических азидов // Химия высоких энергий 1975 Т. 9 С. 99-117.

68. Грицан Н П, Притчина Е А Механизм фотолиза ароматических азидов // Успехи химии. 1992. Т. 61. С. 910-939.

69. Fleming SA Chemical Reagents in Photoaffinity Labeling // Tetrahedron 1995. V. 51. P. 12479-12520

70. Soundararajan N, Platz MS Descriptive photochemistry of polyfluorinated azide derivatives of methyl benzoate// J. Org Chem 1990. V. 55. P 2034-2044.

71. Рое R, Schnapp K, Young M JT, Grayzar J, Platz MS Chemistry and kinetics of singlet (pentafluorophenyl)nitrene // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 5054-5067.

72. Karney W. L., Borden W. T. Why does o-fluonne substitution raise the barrier to ring expansion of phenylmtrene 7 // J. Am. Chem. Soc 1997 V. 119 P 3347-3350.

73. Reiser A, Leyshon L Correlation between negative charge on nitrogen and the reactivity of aromatic nitrenes // J. Am. Chem. Soc. 1970. V. 92. P 7487.

74. Leyva E, Young M JT, Platz M S High yields of formal CH insertion products in the reactions of polyfluorinated aromatic nitrenes // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 8307-8309

75. Abramovitch R.A, Challand S R, Scriven E F. V. On the mechanism of intermolecular aromatic substitution by arylnitrenes // J. Am. Chem. Soc. 1972. V 94. P. 1374-1376.

76. MarcinekA, Platz MS, ChanS Y, Floresca R, Rajagopalan К, GolinskiM WattDS Unusually long lifetimes of the singlet nitrenes derived from 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamides // J. Phys. Chem. 1994. V. 98. P. 412-419.

77. Gritsan NР, Zhai НВ, Yuzawa Т, Karweik D, Brooke J, Platz MS Spectroscopy and kinetics of singlet perfluoro-4-biphenylnitrene and singlet perfluorophenylmtrene // J. Phys. Chem. A. 1997 V 101 P. 2833-2840

78. Польшаков ДА, Центалович ЮП, Грицаи НП Изучение бимолекулярных реакций фторзамещенных синглетных арилнитренов методом лазерного импульсного фотолиза//Кинетика и катализ. 2001. Т 42. С 664-670.

79. Gritsan NР, Platz MS Kinetics and spectroscopy of substituted phenylnitrenes // Adv. Phys. Org.Chem. 2001 V. 36. P. 255-304.

80. Engelking PC, Lineberger WC Laser photoelectron spectrometry of NH": Electron affinity and intercombination energy difference in NH // J. Chem. Phys. 1976. V. 65 P. 4323-4323.

81. Michl J, Bonacic-Koutecky V Electronic aspects of organic photochemistry. Wiley,. New York, 1990. P. 149.

82. Leopold DG, Murray K.K., Miller AES Methylene: A study of the 3Bi and a !Ai states by photoelectron spectroscopy of CH2" and CD2~// J. Chem. Phys. 1985. V. 83. P. 4849-4865.

83. Salem L, Rowland С The electronic properties of diradicals // Angew. Chem. Int. Ed. Engl 1972. V 11 P 92-111.

84. McGlynn, S P, Azumi, T, Kinoshita, M Molecular Spectroscopy of the Triplet State // Prentice Hall: Englewood Cliffs. 1969

85. Kim S-J, Hamilton TP, Schaefer HF Phenylmtrene: Energetics, vibrational frequencies, and molecular structures // J. Amer. Chem Soc. 1992 V. 114. P. 53495355.

86. Hrovat DA, Waali EE, Borden WT Ah Initio calculations of the singlet-triplet energy difference in phenylmtrene // J. Am Chem. Soc. 1992. V. 114 P 8698-8699

87. MarcinekA, Platz MS Deduction of the activation parameters for ring expansion and intersystem crossing in fluorinated singlet phenylmtrenes // J Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 12674-12677

88. Liang T Y, Schuster G В Photochemistry of 3- and 4-nitrophenyl azides: detection and characterization of reactive intermediates I I J. Am Chem Soc. 1987. V. 109. P. 78037810

89. Черноловская ЕЛ, Черепанов П П, Горожанкин АВ, Добриков МИ, Власов В В, Кобец Н Д Взаимодействие фотоактивных производных олиготимидилата с хроматином клеток HeLa//Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 889-893.

90. Laletina Е, Graifer D, Malygin A, Ivanov A, Shatsky I, Karpova G Proteins surrounding hairpin IHe of the hepatitis С virus internal nbosome entry site on the human 40S ribosomal subunit//Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P 2027-2036.

91. Keana JFW, Cai SX New reagents for photoaffinity labeling: synthesis and photolysis of functionalized perfluorophenyl azides // J. Org Chem. 1990. V. 55 P. 3640-3647.

92. Левина AC, Васильева ТВ, Зарытова ВФ Синтез производных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих перфторарилазидную группу при С8-атоме дезоксиаденозина и фотомодификация ими фрагментов ДНК // Биоорган, химия. 1999. Т. 25. С. 56-61.

93. Кобец НД, Горожанкин А В, Годовикова Т.С, Сильников ВН., Кнорре ДГ Аффинная модификация хроматина фотореакционноспособными производными олиготимидилата // Докл. АН. 1996 Т. 349 С 822-825.

94. WlassoffW А , Kimura М, Ishihama A Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe RNA polymerase II // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 P. 5104-5113.

95. Doronin S V., Dobrikov MI, Lavrik OI Photolabeling of DNA polymerase a DNA primase complex based on catalytic competence of a dNTP reactive analog // FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 31-33.

96. Doronin S.V, Dobrikov MI., Buckle M., Roux P., Buc H, Lavrik O.I // Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs//FEBS Lett. 1994. V. 354 P 200-202.

97. Lavrik 01, Prasad R, Sobol RW, Horton JK, Ackerman EJ, Wilson SH Photoaffinity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate Hi Biol. Chem 2001. V. 276. P. 25541-25548.

98. Lebedeva N A , Kolpashchikov DM, Rechkunova N I, Khodyreva SN, Lavrik OI.A binary system of photoreagents for high-efficiency labeling of DNA polymerases // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2001. V. 287. P. 530-535

99. Богачев ВС. Исследование реакции трифторуксусного ангидрида с тимидин-5'-фосфатом // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 212-217.

100. Богачев ВС Синтез дезоксинуклеотид-5'-трифосфатов с использованием в качестве активирующего реагента трифторуксусного ангидрида // Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 699-705.

101. Богачев ВС, Уланов ПА. Исследование взаимодействия ангидридов и галогенидов тригалогенуксусных кислот с тимидин-5'-фосфатом: путь к новымактивирующим реагентам в реакциях фосфорилирования для нуклеотидов // Биоорган, химия. 2003. Т. 29. С. 64-74.

102. Corbett J.F. Benzoquinone imines Part II. Hydrolysis of p-benzoqumone mono-imine and p-benzoqumone di-imine, J Chem. Soc. (B). 1969. V. 3 P. 213-216.

103. Лебедев А В, Резвухин А И Закономерности изменених химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р-ЯМР производных нуклеотидов // Биоорган химия 1983 Т. 9. С. 149-185.

104. Гордон А , Форд Р Спутник химика // Перевод с английского М: "Мир". 1976. С. 200-234.

105. The Sadtler standard infrared grating spectra, Philadelphia, PA, 1980

106. Sadtler Collection of Standard NMR Spectra, Philadelphia, PA, 1980

107. Berger St, Richer A Zur Kenntnis des Chinoiden Zustandes XIX. 13C-Founer-transform-Spektroskopie von orto- und para-Benzochinonen / {Correlation zwischen chemischer Verschiebung und anderen Molekuldaten, Tetrahedron 1972. V. 28 P. 31233139.

108. J.F. Corbett, Benzoquinone imines Part I. p-Phenylenediamine-ferricyanide and p-aminophenol-femcyanide redox systems, J. Chem. Soc. (B) 1969. V. 3. P. 207-212.

109. FallerJW Determination of organic structures by physical methods. Ed Nachod FC, ZuckermanJJ Academic Press. 1973. V 5. P 75.

110. Norm R K, Sternhell S N M.R. spectra of "p-mtrosophenol" and its methyl derivatives //Austr. J. Chem. 1966 V. 19. P. 841-860.

111. Kramer DN, Gamson RM, Miller F M A Study of the Physical and Chemical Properties of the Esters of Indophenols I. Preparation // J. Org. Chem. V 1959. V. 24. P. 1742-1747.

112. Tong LKJ, Glesmann MС The mechanism of dye formation in color photography. III. Oxidative condensation with /7-phenylenediamines in aqueous alkaline solutions // J. Am. Chem. Soc. 1957. V. 79. P. 583-592.

113. Tong LKJ, Glesmann MC, Bent RL The mechanism of dye formation in color photography. VII. Intermediate bases in the deamination of quinonediimines // J. Am. Chem. Soc. 1960. V. 82. P. 1988-1996

114. Tong LKJ, Glesmann CM Kinetics and mechanism of oxidative coupling of p-phenylenediamines // J. Am. Chem. Soc. 1968. V. 90. P. 5164-5173.

115. Tong L KJ, Baetzold R.C. Kinetics of dye formation by flash photolysis. In 1-octanol // J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 1394-1399.

116. Heyrowsky M, VavrickaS, Exner 0 Charge-transfer interaction in complexes between acids and their anions // Collection Czechoslov. Chem. Commun. 1972. V 37. P 28582863.

117. Wallwork S С, Harding T T. Molecular Compounds of the Quinhydrone Type // Nature. 1953.V 171. P 40

118. Гордон A, Форд P Спутник химика // Пер с англ М.: Мир. 1976. С. 437-444

119. Hashimoto М, Mukaiyama Т Phosphorylation by oxidation-reduction condensation: preparation and reaction of S-(2-pyndyl)phosphorothioates // Tetrahedron Lett. 1971 № 26 P 2425-2428

120. Годовикова ТС, Березовский MB, Кнорре ДГ Фотоаффинная модификация производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 858-867.

121. Коваль В В, Максакова ГА, Федорова О С Фотомодификация ДНК перфторарилазидопроизводным олигонуклеотида // Биоорган, химия. 1997. Т. 23 С 266-272.

122. Общая органическая химия, под ред. Н. К. Кочеткова / Химия. М. 1985. Т. 8. С. 490.

123. Millie Р, Malrieu JP, Benaim J, Lallemand J Y, Julia M Researches in the indole series. XX. Quantum mechanical calculations and charge-transfer complexes of substituted indoles. //J. Med. Chem. 1968. V. 11. P 207-211.

124. Аврамчук ТВ Механизмы фотоиндуцированных реакций л-нитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков // Дис. канд. хим. наук. ИХБФМ СО РАН. 2005. С. 94-99.

125. Зарытова ВФ., Иванова ЕМ, Романенко В П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 516-521.

126. Calvert J G, Pitts J N Photochemistry / Wiley New York 1966 P. 780

127. Cantor CR, Tinoco IJr Absorption and optical rotatory dispersion of seven trinucleoside diphosphates//J Mol Biol 1965 V 13 P 65-77.

128. The Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Nucleic Acids / Ed ТЕ Fasman Cleveland CRC Press, 1975 P 589

129. Cornell WD, Cieplak P, Bayly CI, Gould IR, Merz KM, Ferguson DM. Spellmeyer DC, Fox T, Caldwell JW, Kollman PA A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules // J Am Chem Soc 1995 V 117 P 5179-5197

130. Гершкович A A , Кибирев В К Синтез пептидов Реагенты и методы / Киев Наук думка 1987 С 123