Изучение теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

□□3484693

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВА ДАРЬЯ МИХАЙЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ТЕЛОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА ДРОЖЖЕЙ БасскаготусеБ сегехтае

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 с ;-;ол ?ос9

Москва - 2009

003484693

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

кандидат химических наук, Зверева Мария Эмильевна;

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Туницкая Вера Леонидовна;

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Тоневицкий Александр Григорьевич

Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 8 декабря 2009 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 3 ноября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На концах линейных хромосом эукариот находятся теломеры - ДНК-белковые структуры, которые защищают концы хромосом от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Репликативный аппарат клетки не обеспечивает полную репликацию концов. У большинства организмов основным механизмом поддержания длины теломер является достраивание теломерных повторов ДНК ферментом теломеразой. Этот фермент представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс. Коровый фермент включает в себя теломеразную обратную транскриптазу и теломеразную РНК, содержащую матричный участок для удлинения ДНК. В теломеразный комплекс входит еще целый ряд вспомогательных компонентов, необходимых для функционирования теломеразы in vivo.

Нарушения в работе теломеразы и теломер приводят к целому ряду возрастных патологий человека (повреждение костного мозга, остеопороз, фиброз легких, цирроз печени и др.). Активация теломеразы наблюдается в большинстве опухолевых клеток млекопитающих и иммортализованных клеточных линиях. Поэтому изучение строения, состава и механизмов функционирования теломеразных комплексов различных организмов и их сравнение, помимо фундаментального, имеет и важное прикладное значение. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.

Несмотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не известен точный состав теломеразного комплекса. Опубликованные данные о четвертичной структуре теломеразы дрожжей противоречивы. Данная работа посвящена изучению структуры и состава теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса.

Цель работы. Одной из основных задач работы было изучение вопроса о том, в какой форме - мономерной или димерной - функционирует теломераза дрожжей. Для этого необходимо было разработать метод выделения теломеразы дрожжей с помощью аффинной хроматографии с использованием аптамерной вставки в теломеразной РНК (TLC1 РНК), а также создать систему для удобного тестирования функциональности TLC1 РНК с аптамерной вставкой и проверки возможности димеризации активной теломеразы. Еще одной задачей работы было изучение обнаруженного взаимодействия теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae с биотинилированным компонентом.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе был разработан метод выделения теломеразы дрожжей с помощью аффинной хроматографии с

использованием РНК-аптамерной вставки в TLC1 РНК. При этом использовалась вставка в TLC1 РНК, являющаяся аптамером к стрептавидину. Эта вставка была введена в два различных района в TLC1 РНК. В работе была создана система для тестирования функциональности модифицированной теломеразной РНК на основе метода замены плазмид в дрожжах, подходящая для изучения возможности димеризации теломеразы. Показано, что теломераза, содержащая TLC1 РНК с одной из вставок, функциональна in vivo и может быть выделена in vitro. В препарате теломеразы, полученной из штамма, экспрессирующего две различающиеся молекулы TLC1 РНК (с аптамерной вставкой и без нее), обнаружен активный фермент, содержащий только TLC1 РНК со вставкой. Таким образом, в работе показано, что теломераза дрожжей активна in vitro в мономерной форме.

В работе впервые показана возможность вхождения биотинилированного компонента в состав теломеразного комплекса дрожжей. Теломераза, содержащая биотинилированный белок, активна in vitro. Она составляет менее половины общего количества активной теломеразы, выделенной из клеток, а именно, легкую фракцию теломеразных комплексов.

Таким образом, в данной диссертационной работе получены важные результаты, позволяющие делать выводы о строении и составе теломеразного комплекса дрожжей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: международные конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2005», 12 - 15 апреля, г. Москва, Россия, 2005 и «Ломоносов-2008», 9-10 апреля, г. Москва, Россия, 2008; 8th International Engelhardt Conference On Molecular Biology «RNA-protein interactions», 19-24 августа, г. Сергиев Посад, Россия, 2006; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая, г. Новосибирск, Россия, 2008; ЕМВО conference «Replication and Segregation of Chromosomes», 16-20 июня, г. Гейло, Норвегия, 2008.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 352 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение возможности димеризации теломеразы дрожжей S. cerevisiae.

Теломеразы различных организмов могут функционировать как в виде димера, так и в виде мономера. Интерес исследователей вызывает вопрос, отличается ли какими-либо характеристиками работа ферментов-димеров от ферментов-мономеров. Ранее предполагали, что димеризация теломеразы может обеспечивать ее процессивность, т. е. способность добавлять несколько теломерных повторов за один раунд удлинения субстрата, или обеспечивать скоординированное удлинение двух сестринских хроматид in vivo. Однако в настоящее время показано, что процессивность теломеразы не связана с димеризацией. Ответ на вопрос о том, является ли димером или мономером активная теломераза, необходим для понимания механизма работы фермента.

Для изучения вопроса о том, в димерной или мономерной форме функционирует теломераза дрожжей S. cerevisiae, мы предложили подход с использованием аффинной хроматографии, основанной на взаимодействии теломеразной РНК с сорбентом. Для этого необходимо было ввести в TLC1 РНК аптамерную вставку. Такая вставка в РНК дает возможность специфично выделять теломеразный комплекс с помощью аффинной хроматографии. Далее необходимо было проверить функциональность полученной модифицированной TLC1 РНК, разработать методику выделения активной теломеразы. И, наконец, необходимо было проверить гипотезу о димеризации теломеразы дрожжей, выделяя теломеразу с помощью разработанного метода из штамма, содержащего одновременно TLC1 РНК со вставкой и без нее. Аптамерная вставка позволяет контролировать присутствие двух различающихся молекул TLC1 РНК в выделенном на аффинном сорбенте теломеразном комплексе.

Преимущество предложенного нами подхода состоит в возможности выделения теломеразного комплекса за счет сродства к аффинному носителю компонента корового фермента, а также возможности использовать штамм дрожжей, содержащий две экспрессирующиеся в одинаковых условиях, но различающиеся молекулы компонента корового фермента, только одна из которых специфически взаимодействует с аффинным носителем.

1.1. Создание дрожжевых штаммов, экспресснрующих TLC1 РНК с аптамерной вставкой, а также системы для тестирования функциональности модифицированной TLC1 РНК и изучения возможности димеризации теломеразы.

Мы выбрали для введения в TLC 1 РНК аптамерную вставку к белку стрептавидину (рис. 1А), так как метод аффинной хроматографии с использованием этого аптамера с успехом применяется в нашей лаборатории для выделения рибонуклеопротеидных (РНП) комплексов в мягких условиях, предотвращающих диссоциацию и деградацию компонентов. Место для введения аптамерной вставки в молекулу TLC1 РНК должно было быть выбрано так, чтобы не нарушить функциональность молекулы и структуру самой аптамерной вставки. Кроме того, для успешного выделения комплекса с использованием аффинной хроматографии необходимо, чтобы аптамерная вставка находилась на поверхности РНП. Ранее было показано, что введение аптамерной вставки путем замены на аптамер петли, замыкающей одну из несущественных для функции рибосомной РНК спиралей, позволяет с высокой эффективностью получать биологически активные субчастицы рибосомы. На основе анализа моделей вторичной структуры TLC1 РНК, полученных с помощью филогенетического подхода и частично подтвержденных биохимически, мы выбрали для введения аптамера районы 1005 - 1019 н.о. (вставка 1) и 1056 - 1068 и.о. (вставка 2). Они показаны на модели вторичной структуры TLC1 РНК на рис. 1. Места введения вставки не перекрываются с известными районами взаимодействия белков Est2p (теломеразная обратная транскриптаза), Estlp, Ku70/Ku80 и Sm-белков.

Рис. 1. Аптамерные вставки 1 и 2 во вторичной структуре ТЪС1 РНК. А - Вторичная структура артамерной вставки к стрептавидину. Б - Места введения вставки 1 и вставки 2 во вторичной структуре ТЬС1 РНК, предложенной Д. Заппулла и Т. Чехом. В - Места введения вставки 1 и вставки 2 в терминальной ветви ТХС1 РНК в увеличенном виде.

На первом этапе работы в выбранные районы гена TLCI с помощью сайт-направленного мутагенеза были введены сайты рестрикции XmalII и Kpnl, что позволило ввести фрагмент ДНК, кодирующий аптамерную вставку. Затем ген со вставкой был введен соответственно в центромерный вектор с маркером TRPI и получены плазмиды pTLCinsl и pTLCins2, с которых TLC1 РНК со вставками 1 и 2 соответственно (рис.1 Б) экспрессируется под контролем эндогенных промотера и терминатора. Эти конструкции были получены с использованием плазмиды pSD107, содержащей ген TLCI с эндогенными промотером и терминатором, любезно предоставленной доктором Гогтшлингом (США). Нуклеотидная последовательность полученных в работе конструкций была подтверждена секвенированием.

Для изучения влияния аптамерной вставки на функциональные свойства теломеразной РНК были получены штаммы S. cerevisiae, в которых экспрессировалась только TLC1 РНК с соответствующей вставкой. Мы сконструировали штамм, в котором ген TLC1 на хромосоме заменен на ген KAN, a TLC1 РНК экспрессируется под контролем эндогенных промотора и терминатора с центромерной плазмиды pTLC_URA с URA3 маркером. Эта плазмида была заменена на плазмиды pTLCinsl и pTLC¡ns2, и получены штаммы {tlclAr.KAN, pTLCinsl) и (tlc¡A::KAN, pTLCins2), экспрессирующие TLCI РНК с аптамерной вставкой. В контрольных экспериментах использовали штамм (tlclA::KAN, pSD107), экспрессирующий TLCI РНК дикого типа, и штамм (tlclA::KAN, pRS314) без TLCI РНК.

Замена гена TLC.1 на ген KAN на хромосоме подтверждена с помощью анализа геномной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров в соответствии со схемой, показанной на рис. 2А. Полученные ПЦР-продукты, разделенные в агарозном геле, показаны на рис. 2Б. Видно, что результаты эксперимента подтверждают замену гена на хромосоме, так как ПЦР-продукты в дорожках геля соответствуют ожидаемым.

Экспрессия соответствующей TLC1 РНК (дикий тип или со вставкой) или ее отсутствие в полученных штаммах подтверждено с помощью метода обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР анализ). Праймеры для ОТ-ПЦР комплементарны областям гена TLC1 с двух сторон от вставки, поэтому продукт ОТ-ПЦР с TLC1 РНК со вставкой получается на 50 пар оснований длиннее продукта, полученного с TLC 1 РНК дикого типа. Результат ОТ-ПЦР анализа суммарной РНК из штаммов показан на рис. 2В. Видно, что в случае, когда экспрессируется TLC1 РНК дикого типа, наблюдается соответствующий продукт ОТ-ПЦР (рис. 2В, дорожка 2). Более длинный продукт появляется в случае штамма с экспрессией TLC1 РНК со вставкой (рис. 2В,

дорожки 6 и 8). Продукт ОТ-ПЦР не детектируется в случае отсутствия TLC1 РНК (рис. 2В, дорожка 4). В качестве внутреннего контроля был проведен ОТ-ПЦР-анализ с ген-специфичными праймерами к scRl РНК (компонент сигнал-узнающей частицы SRP), не связанной с функционированием теломеразы, с использованием того же количества суммарной клеточной РНК, что и для ОТ-ПЦР анализа экспрессии TLC 1 РНК (рис. 2Г). Также для всех образцов были проведены контрольные реакции ПЦР без предварительной обратной транскрипции (рис. 2В, Г). Отсутствие продукта свидетельствует о том, что в образце нет ДНК, которая могла бы приводить к появлению ложноположительного сигнала в ОТ-ПЦР.

А Т4.

-F-d-

D

-á-TLC1

А В

—RzJ-

С D

rj tlc1A::KAN

KAN

пары продукты

праймеров ПЦР

А+В tlc1A::KAN А+Т4 TLC1

C+D tlc1A::KAN

длина

403 829 442

Wt

А+В А+Т4

C+D

250 500

М

1500

1 wt 2 3 1 wt 2 3 1 wt 2 3

mm

P*

M 1 23456789 10 11 12

В

Oy . + - + . + - +

500 ^^ ^.

400 300

M 1 2345678

Г

wt A ¡1 ¡2

от -+-+-+-+

300 100

M 1 2345678

Рис. 2. Характеристика полученных штаммов, экспрессирующих TLCl РНК со вставкой. А -Схема анализа геномной ДНК дрожжей с помощью ПЦР для подтверждения замены гена TLCl на ген KAN на хромосоме. Показаны длины ожидаемых продуктов ПЦР. Б - Продукты ПЦР с геномной ДНК, выделенной из штамма дикого типа и полученных колоний штамма (tlclA::KAN) (wt - штамм дикого типа; I - 3 - полученные колонии). Дорожка М - Маркер молекулярных масс; дорожки 1 - 4 - ПЦР-анализ геномной ДНК для штаммов 1, wt, 2, 3 соответственно с парой праймеров А+В; дорожки 5 - 8 - то же с парой праймеров А+Т4; дорожки 9 - 12 - то же с парой праймеров C+D. В - ОТ-ПЦР Анализ суммарной клеточной РНК, выделенной из полученных штаммов с ген-специфичными праймерами к TLC1 РНК. ОТ- и ОТ+ - ОТ-ПЦР анализ без реакции обратной транскрипции и с ней соответственно. Дорожка М - Маркер молекулярных масс; дорожки 1,2- ОТ-ПЦР анализ для штамма (,tlc¡A::KAN, pSD107), экспрессирующего TLCl РНК дикого типа (wt); дорожки 3, 4 - то же для штамма (tlclA::KAN, pRS314), не экспрессирующего TLC1 РНК (Д); дорожки 5, 6 - то же для штамма (tlc¡A::KAN, pTLCinsI), экспрессирующего TLCl РНК со вставкой 1 (il); дорожки 7, 8 - то же для штамма (t!clA::KAN, pTLCins2), экспрессирующего TLCl РНК со вставкой 2 (Í2). Г - ОТ-ПЦР Анализ суммарной РНК, выделенной из тех же штаммов, что и в (В) с ген-специфичными праймерами к scRl РНК, с тем же количеством РНК в реакции. Подписи к дорожкам такие же, как и в (В).

Созданная нами система с использованием замены плазмид в дрожжах представляет собой очень полезный инструмент для изучения теломеразы. Она дает возможность

достаточно удобно получать штаммы дрожжей, экспрессирующие различные варианты ТЪС1 РНК с мутациями (например, штамм (йс1А::КАИ, рТЬСшэ), экспрессирующий ТЬС1 РНК с аптамерной вставкой, рис. 3), и тестировать ТЬС1 РНК с мутациями на функциональность. Для решения поставленной в работе задачи эта система также подходит, так как позволяет не заменять плазмиду, а ввести в клетку две плазмиды и, таким образом, получить штамм дрожжей (11с1А::КАЫ, рТЪС_1ЖА + рТЬСлпз) (рис. 3), содержащий две различающиеся молекулы ТЬС1 РНК, экспрессирующиеся в одинаковых условиях.

Рис. 3. Система, созданная в работе для проверки функциональности TLC1 РНК с аптамерной вставкой, а также для проверки возможности димеризации теломеразы дрожжей. (tlclAr.KAN, pTLC_URA) - штамм, в котором ген TLC.1 удален с хромосомы, а с центромерной плазмиды с маркером URA3 экспрессируется TLC1 РНК дикого типа; (tlcIA::KAN, pTLCURA + pTLCins) - штамм, в котором ген TLC1 удален с хромосомы, а с центромерных плазмид с маркерами URA3 и TRP1 экспрессируются соответственно TLC1 РНК дикого типа и TLC1 РНК с аптамерной вставкой; (tlclA::KAN, pTLCins) - штамм, в котором ген TLC1 удален с хромосомы, а с центромерной плазмиды с маркером TRPI экспрессируется TLC1 РНК с аптамерной вставкой; 5-FOA - 5-фтороротовая кислота, используемая для контрселекции плазмиды с маркером URA3.

1.2. Тестирование фукциональной активности TLC1 РНК с аптамерной вставкой in vivo.

Для проверки функциональности in vivo теломеразы, содержащей модифицированную TLC1 РНК, был проведен анализ фенотипа дрожжей в ряду поколений методом высаживания на чашки последовательных разбавлений культуры.

Известно, что инактивация теломеразы приводит к сенессенсу (клеточному старению), который наступает примерно через 50 поколений после потери плазмиды, кодирующей TLC1 РНК. Мы проанализировали рост клеток в ряду поколений для

следующих штаммов: (tlclA::KAN, pSD107), который содержит TLC1 РНК дикого типа, (tlclA::KAN, pRS314) без TLC1 РНК, (tlclA::KAN, pTLCinsl) и (tlclA::KAN, pTLCins2), которые экспрессируют TLC1 РНК с соответствующей вставкой. На рис. 4А показана чашка Петри с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течение 30 поколений после потери плазмиды pTLCJURA, кодирующей TLC1 РНК дикого типа. Колонии клеток в последовательных разведениях выглядят одинаково для всех штаммов. На рис. 4Б показана чашка Петри с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течение 70 поколений после потери плазмиды pTLC_URA. При этом колонии для штаммов, содержащих TLC1 РНК со вставкой, похожи на колонии клеток штамма с TLC1 РНК дикого типа и отличаются от колоний штамма без TLC1 РНК, у которого наступает сенессенс. Таким образом, можно сделать вывод, что обе введенные вставки заметно не влияют на функциональные свойства TLC1 РНК in vivo.

А Б

30 поколений 70 поколений

разбавления клеток

последовательные разбавления клеток

Рис. 4. Фенотип полученных штаммов, экспрессирующих TLC1 РНК со вставкой. Серия разбавлений равного количества клеток разных штаммов была высеяна на чашки Петри со средой SC-Trp (Synthetic Complete, без триптофана). А - Чашка с клетками, высеянными после 30 поколений роста после потери плазмиды pTLC_URA, кодирующей TLC1 РНК дикого типа, wt -Штамм (tlclA::KAN, pSD107), экспрессирующий TLC1 РНК дикого типа, А - штамм (tlclA::KAN, pRS314) без TLC1 РНК, ¡1 и ¡2 - штаммы (tIc]A::KAN, pTLCinsl) и (tlcIA::KAN, pTLCins2), экспрессирующие TLC1 РНК со вставками 1 и 2 соответственно. Б - То же, что в позиции (А) после 70 поколений роста.

1.3. Аффинное выделение теломеразы за аптамерную вставку в TLC1 РНК.

Методика аффинного выделения теломеразы была разработана с учетом недавних исследований, посвященных стратегии выделения интактных и активных рибонуклеопротеидов дрожжей. Для снижения вероятности деградации компонентов теломеразного комплекса клеточные экстракты получали путем механического

разрушения клеток, замороженных в жидком азоте, затем полученный порошок размораживали во льду холодным буфером, содержащим ингибиторы протеаз и РНазы А. Полученные экстракты, очищенные от дебриса с помощью центрифугирования, инкубировали с авидином куриного яйца для предотвращения связывания с сорбентом биотинилированных белков из экстракта. Затем экстракты инкубировали с аффинным сорбентом (стрептавидин-сефарозой), который после связывания тщательно промывали и использовали для дальнейшего анализа. Выделенную РНК анализировали методом ОТ-ПЦР. В качестве контрольного эксперимента проводили инкубацию со стрептавидин-сефарозой клеточных экстрактов из штамма, экспрессирующего TLC1 РНК дикого типа. Результаты ОТ-ПЦР-анализа приведены на рис. 5А. Видно, что с сорбентом связывается значительное количество TLC1 РНК со вставкой 1 по сравнению с TLC1 РНК дикого типа (рис. 5А, дорожки 6 и 12). Также на стрептавидин-сефарозе детектируются лишь следовые количества не связанной с теломеразой scRl RNA (контроль специфичности) (рис. 5Б, дорожка 6). Следовательно, связывание TLC1 РНК с аптамерной вставкой 1 на стрептавидин-сефарозе специфично.

На следующем этапе была протестирована активность выделенной теломеразы в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TEL 11 с последовательностью теломерной ДНК в присутствии dTTP и радиоактивно меченого [cc-3:P]dGTP. На рис. 5Г показана авторадиография 15% полиакриламидного геля, в котором разделены продукты удлинения. В качестве положительного контроля были проанализированы полученные по классической методике с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе фракции, содержащие теломеразу. В качестве отрицательного контроля для каждой реакции параллельно проводили ту же реакцию, но с предварительной обработкой РНКазой А. Такая обработка разрушает теломеразную РНК и делает теломеразу неактивной. Отсутствие продуктов такой реакции свидетельствует о том, что в образце отсутствует примесь ДНК-зависимой полимеризующей активности. Теломеразная активность не детектируется в случае обработки сорбента экстрактом из штамма с TLC1 РНК дикого типа (рис. 5Г, дорожка 4). Характерные продукты удлинения TEL11 теломеразой видны при связывании экстракта из штамма, содержащего TLC1 РНК со вставкой 1 (рис. 5Г, дорожка 6). Теломераза, выделенная за счет сродства аптамерной вставки в TLC1 РНК к стрептавидин-сефарозе, как и теломераза, выделенная с помощью ионообменной хроматографии, добавляет не более одного теломерного повтора при удлинении (рис. 5Г, дорожка 2).

Отметим, что в случае TLC1 РНК со вставкой 2 мы не детектировали специфического связывания TLC1 РНК с аффинным сорбентом. Хотя TLC1 РНК с этой

вставкой функционально активна, аптамер в ней, по-видимому, экранирован в составе РНК-белкового комплекса либо не образует необходимую структуру для связывания на аффинном сорбенте.

1.4. Анализ димеризации теломеразы.

Для проверки возможности димеризации теломеразы мы создали штамм, в котором одновременно и в одинаковых условиях экспрессируются TLC1 РНК дикого типа и TLC1 РНК с аптамерной вставкой. Для этого штамм (llclA::KAN, pTLC_URA) с TLC1 РНК дикого типа был трансформирован плазмидой pTLCinsl, кодирующей TLC1 РНК со вставкой. Полученный штамм (t!clA::KAN, pTLC_URA + pTLCinsl) содержал одновременно оба гена TLC1 со вставкой и без нее на центромерных плазмидах под эндогенными промотором и терминатором, что должно обеспечивать одинаковый уровень экспрессии теломеразных РНК. Действительно, оба типа TLC1 РНК могут быть детектированы в клеточном экстракте из штамма в сравнимых количествах (рис. 5В, дорожка 2). Теломераза из этого штамма была выделена на стрептавидин-сефарозе, как описано выше. Присутствие двух типов TLC1 РНК было проанализировано методом ОТ-ПЦР. Уже в несвязавшейся фракции видно различие в количествах TLC1 РНК со вставкой и TLC1 РНК дикого типа (рис. 5В, дорожка 4). В связавшейся фракции детектируется только TLC1 РНК со вставкой (рис. 5В, дорожка 6). Надо отметить, что даже с помощью такого чувствительного метода, как ОТ-ПЦР, способного детектировать несколько молекул в пробе, TLC1 РНК дикого типа не детектируется на аффинном сорбенте. Активность выделенного с помощью аффинной хроматографии теломеразного комплекса была протестирована в реакции удлинения TEL11, как описано выше. Видно, что выделенная теломераза активна (рис. 5Д, дорожка 3).

А В

wt ¡1 Wt+И

_Э__П__С__Э__П__с_ JL _П__

от -+-+-+-+-+-+ от -+.+-+

500 ^^ __ 500 - ^

400 —— 400 в-

300 300

М 1 23456789 10 11 12 М 1 2 3 4 5 6

Б _э_ _п__с_

ОТ -+- + - +

500 --*•: :

400

300

200

М 1 2 3 4 5 6

г Д Е

wt ¡1 wt+¡1 ДЭАЭ

РНКаза А + - + - + - + -

ТЕШнфф <•»

1 2 3 4 5 6 1 2 3 1 2

Рис. 5. Выделение теломеразного комплекса на стрептавидин-сефарозе из полученных штаммов. А - ОТ-ПЦР Анализ образцов, полученных при выделении теломеразы, с помощью ген-специфичных праймеров к TLC1 РНК. ОТ- и ОТ+ - ОТ-ПЦР Анализ без реакции обратной транскрипции и с ней соответственно, wt - ОТ-ПЦР Анализ РНК из штамма (tlclA::KAN, pSD 107), экспрессирующего TLC! РНК дикого типа. Дорожка М - Маркер молекулярных масс; дорожки i, 2 - ОТ-ПЦР анализ РНК, выделенной из исходного дрожжевого экстракта (Э); дорожки 3, 4 - то же из несвязавшейся фракции (П); дорожки 5, 6 - то же из связавшейся фракции (С), il - ОТ-ПЦР Анализ РНК из штамма (tlclA::KAN, pTLCinsl), экспрессирующего TLC1 РНК со вставкой 1. дорожки 7 - 12 - То же, что и дорожки 1 - 6. Б - ОТ-ПЦР Анализ образцов, полученных при выделении теломеразы из клеток штамма (ílclAr.KAN, pTLCinsl), экспрессирующего TLCf РНК со вставкой 1, с помощью ген-специфичных праймеров к scRl РНК. Дорожки 1 - 6 - То же, что в позиции (А) (дорожки 1 - 6). В - ОТ-ПЦР Анализ образцов, полученных при выделении теломеразы из клеток штамма (tlclA::KAN, pTLCinsl + pTLC_URA), экспрессирующего одновременно TLC1 РНК дикого типа и TLC1 РНК со вставкой 1, с помощью ген-специфичных праймеров к TLC1 РНК. Дорожки 1 - 6 - То же, что в позиции (А) (дорожки 1 - 6). Г - Анализ активности теломеразы, выделенной на стрептавидин-сефарозе, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TEL11. РНКаза А+ и РНКаза А- - реакция с предварительной обработкой РНКазой А и без нее соответственно. Дорожка 1 - 5'-[,:!Р]-фосфорилированный олигодезоксирибонуклеотид TEL 11; дорожка 2 - пустая; дорожки 3, 4 - продукты удлинения TEL11 теломеразой из штамма (tlclA::KAN, pSDi07), экспрессирующего TLC1 РНК дикого типа; дорожки 5, 6 - то же из штамма (tlclA::KAN, pTLCinsl), экспрессирующего TLC1 РНК со вставкой 1. Д-То же, что и в позиции (Г) для теломеразы из штамма (tic 1 A::KAN. pTLCinsl + pTLCJURA), экспрессирующего TLC1 РНК дикого типа и TLC1 РНК со вставкой 1. Дорожка 1 - 5'-['2Р]-

фосфорилированный TEL11; дорожки 2, 3 - продукты удлинения TEL11 теломеразой. Е - Анализ активности теломеразы, выделенной из исходного штамма DBY-746 с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TEL11. РНКаза А+ и РНКаза А— то же, что и в позиции (Г). Дорожки 1,2- Продукты удлинения TEL11 теломеразой.

Тот факт, что из штамма, содержащего равные количества TLC1 РНК дикого типа и TLC1 РНК с аптамерной вставкой, может быть выделена активная теломераза, в состав которой входит только TLC1 РНК с аптамером, свидетельствует о том, что, по крайней мере, in vitro теломераза функционирует как мономер. Можно предположить, что введенная в РНК вставка препятствует димеризации теломеразы. Однако это предположение никак не противоречит сделанному выше выводу.

Мы не исключаем возможности того, что в определенных условиях теломераза дрожжей может образовывать димеры. Например, из известных данных можно предположить, что димеры теломеразы могут образовываться на определенной стадии процессинга TLC1 РНК, так как показано, что на разных этапах клеточного цикла меняется состав холофермента теломеразы. При активации теломеразы в поздней S-фазе клеточного цикла не исключена ее димеризация за счет белок-белковых взаимодействий непосредственно на теломере.

Полученные нами данные не позволяют делать выводы о том, как теломераза функционирует in vivo, но однозначно свидетельствуют о том, что для функциональной активности теломеразы дрожжей in vitro димеризация не требуется.

2. Изучение обнаруженного взаимодействия теломеразного комплекса дрожжей с биотинилированным белком.

В состав теломеразного комплекса дрожжей помимо обратной транскриптазы Est2p и теломеразной РНК TLC1 входит ряд вспомогательных белков, необходимых для работы теломеразы ¡n vivo (Estlp, Est3p, Sm-белки, гетеродимер Кц-белков и др.). Для функционирования теломеразы необходимы другие белки, взаимодействующие с компонентами теломеразы, но не входящие в ее состав, например, Cdcl3p. Найден целый ряд белков (шаперон Hsp82p и др.), для которых было показано взаимодействие с отдельными компонентами теломеразного комплекса. Возможно, такие белки необходимы для сборки комплекса или входят в состав теломеразы на определенных этапах регуляции. Сложная организация теломеразного комплекса связана со сложной регуляцией теломеразы in vivo. Целостной картины функционирования теломеразного комплекса со всеми известными компонентами и их функциями пока нет. Обнаружение новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса и новых посттрансляционных модификаций белков, участвующих в работе теломеразы, а также выяснение их роли поможет лучше понять процесс функционирования теломеразы в клетке.

Результаты предварительных экспериментов показали возможность того, что в состав теломеразного комплекса входит биотинилированный белок. В рамках данной диссертационной работы была поставлена задача изучить возможность вхождения биотинилированного белка в состав теломеразного комплекса, а также охарактеризовать комплексы, в которые этот белок входит.

2.1. Обнаружение биотинилированного компонента в составе теломеразного комплекса.

Известно, что детектировать активную теломеразу непосредственно в дрожжевом экстракте, полученном при разрушении клеток дрожжей, не удается. Это возможно только при обогащении теломеразного комплекса или с помощью специфического связывания на аффинном сорбенте компонентов комплекса (Estlp, Est2p, Est3p, TLC1 РНК в данной работе), или с помощью обогащения всего комплекса с помощью анионообменпой хроматографии.

Мы обнаружили, что при связывании дрожжевого экстракта из [«модифицированного штамма дрожжей S. cerevisiae со стрептавидин-сефарозой на аффинном сорбенте детектируется активная теломераза (рис. 6А, дорожка 2), если не блокировать взаимодействие биотинилированных белков со стрептавидин-сефарозой

предварительной обработкой авидином. Такая обработка использовалась в методике по выделению теломеразы за аптамерную вставку в TLC1 РНК для предотвращения связывания с сорбентом биотинилированных белков из экстракта. Теломеразную активность тестировали, как и ранее, в реакции удлинения олигодезоксинуклеотида TEL11. Обнаруженная активность свидетельствует о том, что на аффинном сорбенте теломераза концентрируется, так как в исходном экстракте активности нет. Такое концентрирование происходит за счет взаимодействия компонента теломеразного комплекса со стрептавидином. Выделенная на стрептавидин-сефарозе теломераза, как и теломераза, выделенная с помощью анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, добавляет лишь один теломерный повтор в реакции in vitro (рис. 6А, дорожки 2 и 4).

Для проверки того, что наблюдаемое связывание со стрептавидин-сефарозой является результатом взаимодействия «биотин-стрептавидин» (константа диссоциации для взаимодействия «биотин-стрептавидин» Ка = 10"14 М) мы провели связывание с предварительной обработкой экстракта авидином (константа диссоциации для взаимодействия «биотин-авидин» Кл= 10'15М). Авидин, связавшись с биотипом в белках, должен полностью блокировать связывание теломеразы с сорбентом, если оно обусловлено взаимодействием «биотин-стрептавидин». Действительно, экстракт, предварительно обработанный авидином, с сорбентом не связывается (рис. 6Б, дорожка 2). Этот результат свидетельствует о специфичности взаимодействия. Связывание на стрептавидин-сефарозе и предотвращение этого связывания добавлением авидина также подтвержено для TLC1 РНК с помощью ОТ-ПЦР анализа (рис. 6В, дорожки 6 и 13).

сорбент ДЭАЭ РНКаза А + - + - авидин

В

12 3 4

-авидин

И

ОТ -

п

1 2

1000 500

£ ■ ---

1 2 3 4

+ЗВИДИН

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 6. Выделение теломеразы дрожжей с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе. А - Анализ активности теломеразы, выделенной на стрептавидин-сефарозе из экстракта, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TEL11, II н.о. — позиция на геле 5'-[32Р]-фосфорилированного TEL11. РНКаза А+ и РНКаза А— - реакция с предварительной обработкой РНКазой А и без нее соответственно. Дорожки 1, 2 — продукты удлинения TEL 11 теломеразой, выделенной с помощью хроматографии на стрептавидин-сефарозе; дорожки 3, 4 - то же для теломеразы, выделенной с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Б - То же, что и в (А) с добавлением авидина и без. Авидин+ и Авидин- - реакция с предварительной обработкой авидином и без нее соответственно. Дорожки 1, 2 - то же, что в позиции (А) (дорожки I и 2). В -ОТ-ПЦР анализ TLC1 РНК в образцах, полученных при выделении теломеразы на стрептавидин-сефарозе в присутствии авидина и без него. ОТ- и ОТ+ - ОТ-ПЦР анализ без реакции обратной транскрипции и с ней соответственно. Дорожки 1,2 — продукты ОТ-ПЦР при анализе исходного дрожжевого экстракта (И); дорожки 3, 4 - то же из несвязавшейся фракции (П) при связывании без добавления авидина; дорожки 5, 6 — то же из связавшейся фракции (С) при связывании без добавления авидина; дорожка 7 - Маркер молекулярных масс; дорожки 8 - 13 - то же, что и дорожки 1 — 6 при связывании с добавлением авидина. Г - Анализ активности теломеразы, выделенной на стрептавидин-сефарозе из ДЭАЭ-фракции. Дорожка 1 — 5'-[32Р]-фосфорилированный олигодезоксирибонуклеотид TEL) 1; дорожка 2 - продукты удлинения TEL11 теломеразой в исходной ДЭАЭ-фракции (И); дорожка 3 - то же в несвязавшейся фракции (П); дорожка 4 - то же в связавшейся фракции (С), взятой в четырехкратном избытке.

Известно, что стрептавидин взаимодействует с рядом пептидов, не содержащих биотин. Эти пептиды («strep-tags») используются в качестве аффинных эпитопов для очистки и детекции искусственно слитых с ними белков. В нашем случае можно было бы предположить, что связывание теломеразного комплекса со стрептавидином происходит посредством взаимодействия подобного пептида в составе комплекса. В пользу того, что

связывание теломеразы реализуется через взаимодействие с биотинилированным белком, говорит ряд фактов. Во-первых, известные пептидные последовательности, хоть и взаимодействуют со стрептавидином в том же районе, что и биотин, не взаимодействуют с авидином. Мы же наблюдаем блокирование авидином связывания теломеразы со стрептавидин-сефарозой (рис. 6Б, дорожки 1 и 2; рис. 6В, дорожки 6 и 13). Во-вторых, константы диссоциации для взаимодействия известных стрептавидин-связывающих пептидов со стрептавидином значительно больше константы диссоциации для взаимодействия «стрептавидин-биотин», что позволяет элюировать комплексы, содержащие пептиды, разбавленным раствором биотина. В наших экспериментах не удавалось элюировать комплекс биотином. Все это позволяет считать наиболее вероятным, что наблюдаемое связывание теломеразного комплекса со стрептавидином реализуется посредством взаимодействия «стрептавидин-биотин» за счет входящего в состав комплекса биотинилированного белка.

На следующем этапе было проведено связывание с аффинным сорбентом теломеразы, обогащенной и частично очищенной с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Проведенные эксперименты показали, что со стрептавидин-сефарозой действительно связывается активная теломераза, но лишь часть от ее общего количества (рис. 6Г). Это свидетельствует о том, что только часть теломеразных комплексов содержит биотинилированный белок в своем составе.

2.2. Анализ фракционированных по массе теломеразных комплексов па присутствие биотинилированного белка.

Имея данные, указывающие на то, что биотинилированный белок входит лишь в часть комплексов, мы решили провести фракционирование препарата теломеразы по массе с тем, чтобы получить серию образцов, отличающихся по составу теломеразных комплексов и их проанализировать. Для этого было проведено фракционирование дрожжевого Б100 экстракта, а также теломеразы, очищенной на ДЭАЭ-целлюлозе, в градиенте масс с помощью ультрацентрифугирования. Центрифугирование обоих типов проб было проведено одновременно и в одинаковых условиях. Полученные фракции были протестированы на наличие ТЬС1 РНК, теломеразной активности, а также биотинилированных белков (рис. 7, рис. 8). На рис. 7А и рис. 7В показано распределение активной теломеразы по фракциям, в которых она детектировалась, а на рис. 7Б и рис. 7Г - распределение ТЬС1 РНК во всех полученных фракциях. Таким образом, активные теломеразные комплексы были разделены на более тяжелые и более легкие фракции (рис. 7А и рис. 7В).

S100 экстракт

тяжелая легкая фракция фракция

Б S100 экстракт

фракции 1-10 фракции 11 - 22

г л„- •

1000500-п.о.

1 23456789 10 11

гЩ- фг

11 н.о.-»- i

12 345 6789

® ДЭАЭ-фракция

тяжелая легкая фракция фракция

ДЭАЭ-фракция фракции 1-10 фракции 11 - 20

1000« 500-п.о.

123456789 10

-

12345 6 7 8 9

Рис. 7. Анализ фракций, полученных при ультрацентрифугировании в глицериновом градиенте (всего было получено 22 фракции с одного градиента). А - Анализ активности теломеразы во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта, в реакции удлинения олигодезоксирибонуклеотида TELU. Дорожки I - 9 - продукты удлинения TELII теломеразой во фракциях I - 9 соответственно. Б - ОТ-ПЦР анализ TLC1 РНК во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта. Дорожки I - 11 - продукты ОТ-ПЦР при анализе фракций 1 - 22 соответственно, по две соседние фракции в каждой позиции (дорожка 1 - фракции 1 и 2, дорожка 2 -фракции 3 и 4 и так далее). В - То же, что и в позиции (А) для фракций, выделенных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции. Г - То же, что и в позиции (Б) для фракций, выделенных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции.

Биотинилированные белки в исходном дрожжевом экстракте (рис. 8А) и исходной ДЭАЭ-фракции (рис. 8Б), а также их распределение по фракциям после ультрацентрифугирования (рис. 8В и 8Г) были детектированы с помощью Вестерн-блоттинга. При анализе исходного экстракта и обогащенной на ДЭАЭ-целлюлозе фракции на мембране были детектированы три наиболее яркие полосы, соответствующие белкам с массами около 47, около 120 и более 200 кДа (рис. 8А и 8Б). Эти полосы согласуются с описанными в литературе и соотвествующими известным биотинилированным белкам дрожжей: Acclp (250 кДа), Hfalp (242 кДа), Pyclp (130 кДа), Рус2р (130 кДа), Durl,2p (202 кДа, обычно детектируется как слабая по интенсивности полоса) и Arclp (42 кДа). В

образцах детектируются также менее яркие полосы (рис. 8А), которые могут соответствовать еще не описанным биотинилированным белкам, но могут быть обусловлены и неспецифическими сигналами.

В случае фракционирования обогащенной на ДЭАЭ-целлюлозе теломеразы видно, что вместе с комплексом комигрирует и обогащается биотинилированный белок с массой в районе 50 кДа. Это видно при сопоставлении рис. 7В и рис. 8Г. В случае фракционирования исходного экстракта провести соотнесение наличия теломеразной активности в конкретной фракции с наличием биотинилированного белка не представлялось возможным из-за того, что во всех фракциях на Вестерн-блоттинге детектируется серия полос, соответствующих всем возможным биотинилированным белкам, аналогичная серии полос в исходном экстракте.

А Б В

тяжелая легкая 3100 экстракт ДЭАЭ фракция фракция

200 > 120"

47-кДа '

12 3 12

123456789

Рис. 8. Вестерн-блоттинг анализ биотинилированных белков в исходных в 100 экстракте, ДЭАЭ-фракции и фракциях, полученных при ультрацентрифугировании в глицериновом градиенте. А - Вестерн-блоттинг анализ белков в исходном ЭЮО экстракте. Дорожки 1 - 3 -биотинилированные белки в раститровке экстракта в уменьшающихся количествах от позиции 1 к позиции 3. Б — биотинилированные белки в ДЭАЭ-фракции. Дорожки 1,2- биотинилированные белки в раститровке ДЭАЭ-фракции в уменьшающихся количествах от позиции 1 к позиции 2. В — Вестерн-блоттинг анализ белков во фракциях, полученных при ультрацентрифугировании ДЭАЭ-фракции. Дорожки I - 8 - биотинилированные белки во фракциях 1 - 8 соответственно; дорожка 9 - биотинилированные белки в исходной ДЭАЭ-фракции. Г - То же, что и в позиции (В) при короткой экспозиции на пленку.

Мы показали, что в состав теломеразного комплекса дрожжей входит биотинилированный белок, Из-за малого количества теломеразы в клетке (известно, что на клетку гаплоидных дрожжей приходится примерно 29 молекул) и того факта, что не все теломеразные комплексы содержат биотинилированный белок, а также неэффективности элюции со стрептавидин-сефарозы из-за большой прочности

взаимодействия наши попытки идентифицировать искомый белок с помощью МАЬ01-ТОР спектрометрии не увенчались успехом.

Из рис. 7В и рис. 8Г очевидно, что обнаруживаемый биотинилированный белок комнгрирует с легкой фракцией теломеразных комплексов. И легкие, и тяжелые теломеразные комплексы содержат компоненты корового фермента теломеразы, которые и обеспечивают активность у/7го. Набор белков, входящих во фракционированные комплексы должен отличаться, так как комплексы отличаются по массе. Существование таких различающихся теломеразных комплексов объяснимо, так как известно, что некоторые белки теломеразного комплекса входят в его состав лишь временно, на определенной стадии клеточного цикла. Поэтому наблюдаемый факт того, что биотинилированный компонент входит в состав только части активных теломеразных комплексов (рис. 6Г), также может быть объяснен различием этих комплексов. Если обнаруживаемый нами белок с массой около 50 кДа является искомым биотинилированным компонентом теломеразы, то тогда теломеразные комплексы, содержащие этот белок, должны оказаться среди легкой фракции комплексов, полученных при фракционировании.

Мы проверили это предположение для фракций, полученных при ультрацентрифугировании Б100 экстракта. Две активные тяжелые фракции (рис. 7А, дорожки 2 и 3) были объединены, две легкие (рис. 7А, дорожки 4 и 5) также были объединены. Далее было проведено связывание фракций со стрептавидин-сефарозой и детекция теломеразной активности в связавшихся фракциях. Было обнаружено, что, действительно, активная теломераза из тяжелых фракций не связывается на стрептавидин-сефарозе (рис. 9, дорожки 3 и 4), тогда как из легких фракций - связывается (рис. 9, дорожки 7 и 8). Наше предположение подтвердилось. Мы получили свидетельство тому, что обнаруженный белок с массой около 50 кДа (рис. 8Г) является вероятным кандидатом на роль искомого биотинилированного компонента теломеразы.

Полученный результат также свидетельствует о том, что негомогенность теломеразных комплексов по содержанию биотинилированного белка не является результатом того, что биотинилированный компонент «теряется» при очистке на ДЭАЭ-целлюлозе. Ведь и без очистки с помощью анионообменной хроматографии лишь часть теломеразных комплексов содержит биотинилированный белок.

тяжелая легкая фракция фракция

И С И С

РНКаза А + ~ — + - - -

» * •

№. . HM ж

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 9. Анализ связывания со стрептавидин-еефарозой тяжелой (2 и 3 фракции на рис. 7А) и легкой (4 и 5 фракции на рис. 7А) фракций, полученных при ультрацентрифугировании S100 экстракта в глицериновом градиенте. РНКаза А+ и РНКаза А- - реакция удлинения TELU с предварительной обработкой РНКазой А и без нее соответственно. Дорожки I, 2 - продукты удлинения TEL11 теломеразой в исходной тяжелой фракции (И); дорожки 3, 4 - то же в связавшейся фракции (С), взятой в четырехкратном и десятикратном избытке соответственно; дорожки 5 - 8 - то же, что и дорожки 1 - 4 для легкой фракции.

Из полученных нами данных и сведений из литературы можно сделать предположение о природе биотинилированного белка и его функции.

Среди известных биотинилированных белков по молекулярной массе только Arclp находится ближе других к найденному белку. Интересно, что Arclp не содержит канонической последовательности для биотинилирования биотин-лигазой и биотинилирование не является важным для выполнения белком своих функций как кофактора аминоацил-тРНК-синтетаз. Как РНК-связывающий белок (связывает тРНК) и белок, связывающий квадруплексы ДНК, Arclp кажется вероятным кандидатом на роль биотинилированного компонента теломеразы. Возможно, что в состав теломеразы входит белок, для которого еще не показано биотинилирование, взаимодействующий, как и Arclp, с биотин-лигазой Bpllp и также не имеющий канонической последовательности для биотинилирования.

Интересен вопрос о возможной функции биотинилированного компонента в теломеразном комплексе. Мы обнаружили, что только легкая фракция теломеразных комплексов содержит в своем составе биотинилированный белок. Известно, что основными компонентами теломеразы, которые осуществляют реакцию удлинения теломерной ДНК, являются теломеразная обратная транскриптаза Est2p и теломеразная РНК TLC1, а остальные компоненты необходимы для регуляции, сборки, созревания и деградации комплекса. Некоторые из них входят в состав теломеразы лишь временно, на определенной стадии клеточного цикла. Например, необходимые для функционирования

теломеразы in vivo белки Estlp и Est3p входят в состав комплекса только в поздней S/G2 фазе клеточного цикла. Полученные нами результаты указывают на то, что биотинилированный белок не является постоянным компонентом теломеразного комплекса, а входит в его состав лишь временно, на определенном этапе сборки, регуляции или деградации теломеразы, и, возможно, принимает участие в этих процессах.

ВЫВОДЫ

1. Созданы штаммы дрожжей S. cerevisiae, экспрессирующие TLC1 РНК с РНК-аптамерной вставкой к стрептавидину.

2. Разработан метод выделения теломеразы с помощью аффинной хроматографии с использованием РНК-аптамерной вставки в TLC1 РНК.

3. Теломераза дрожжей S. cerevisiae активна in vitro в мономерной форме.

4. В состав легкой фракции активных теломеразных комплексов входит биотинилированный белок массой около 50 кДа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щербакова Д.М., Зверева М.Э., Шпанченко О.В., Донцова О.А. Теломераза: строение и свойства фермента, особенности теломеразы дрожжей (2006). Молекулярная биология, т. 40, № 4, с. 1-15.

2. Щербакова Д.М., Соколов К.А., Зверева М.Э., Донцова О.А. Теломераза дрожжей Saccharomyces cerevisiae активна in vitro в мономерной форме. (2009). Биохимия, т. 74, вып. 7, с. 923-932.

3. Щербакова Д.М., Зверева М.Э., Донцова О.А. Биотинилированный компонент входит в состав теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae (2009). Acta Naturae, № 2, с. 92-97.

4. Щербакова Д.М., Соколов К.А., Зверева М.Э., Донцова О.А. Новый метод выделения теломеразы S. cerevisiae для изучения ее структуры и функционирования. (2005) Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2005», 12-15 апреля, Москва, Россия, сборник тезисов, с. 128.

5. Shcherbakova D.M., Sokolov К.А., Zvereva M.I., Dontsova О.А. A possibility of yeast telomerase dimerization (2006) 8th International Engelhardt Conference On Molecular Biology "RNA-protein interactions", 19-24 August, Sergiev Posad, Russia, abstract book, p. 77

6. Щербакова Д.М., Соколов K.A., Зверева М.Э., Донцова О.А, Аптамерные вставки в теломеразной РНК для выделения и изучения теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. (2008) Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008», 9-10 апреля, Москва, Россия, сборник тезисов, с. 310.

7. Щербакова Д.М., Соколов К.А., Зверева М.Э., Донцова О.А. Использование аптамерной вставки в теломеразной РНК для выделения и изучения теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. (2008) IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая, г. Новосибирск, сборник тезисов, с. 87.

8. Shcherbakova D.M., Sokolov К.А., Zvereva M.I., Dontsova О.А. Streptavidin aptamer tag in telomerase RNA as a tool for isolation and study of telomerase from Saccharomyces cerevisiae. (2008) EMBO conference "Replication & Segregation of Chromosomes", 16-20 June, Geilo, Norway, abstract book, p. 143.

Заказ № 164-а/10/09 Подписано в печать 30.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

Х^рчч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

) ) www.cfr.ru ; е-таП: info@cfr.ru

Содержание.

1. Введение.

2. Обзор литературы. Теломеразный комплекс: структура и функции.

2.1. Введение. Теломераза - сложный РНГГ комплекс.

2.2. Теломераза как фермент.

2.3. Основные компоненты теломеразного комплекса - TER и TERT.

2.3.1. Теломеразная обратная транскриптаза (TERT).-.

2.3.2. Теломеразная РНК (TER).

2.4. Функционирование теломеразы in vivo. Вспомогательные белки теломеразного комплекса.

2.4.1. Защитная функция теломеразы.

2.4.2. Координация удлинения теломер тсломеразой и других процессов in vivo.

2.4.3. Субстрат теломеразы - теломера.

2.4.4. Локализация теломеразы в зависимости от стадии клеточного цикла.

2.4.5. Вспомогательные белки теломеразного комплекса дрожжей Estlp и Est3p. Регуляция теломеразы в клеточном цикле.

2.4.6. Удлинение теломер теломеразой in vivo.

2.4.7. Регуляция количества теломеразы. Деградация компонентов теломеразы.

На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Аппарат репликации клетки не в состоянии обеспечить полную репликацию концов. У большинства организмов основным механизмом поддержания длины теломер является достраивание теломерных повторов ДНК ферментом теломсразой [1]. Этот фермент удлиняет З'-конец хромосомы, а комплементарную цепь достаивается ДНК-полимеразами. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс [2]. Коровый фермент включает в себя теломеразную обратную транскриптазу и теломеразную РНК, содержащую матричный участок для удлинения ДНК. В теломеразный комплекс входит еще целый ряд вспомогательных компонентов, необходимых для функционирования теломеразы in vivo. Часть из них необходима для посадки теломеразы на теломеру в определенное время при прохождении клетки по клеточному циклу [3], часть для регулирования ее активности [4], также некоторые белки необходимы для созревания теломеразного комплекса и для деградации его компонентов [5]. Тонко регулируется количество теломеразы в клетках различного типа [6, 7]. Это необходимо, ведь в человеческих клетках укорочение теломер и, в конечном итоге, сспессенс ведут к ограничению потенциала деления клетки и предотвращению развития рака [8]. С другой стороны, слишком короткие теломеры также могут привести к возникновению опухоли [8]. Теломераза активна в клетках, обладающих потенциалом к неограниченному делению. Она активна в 85% типов раковых опухолей (в остальных 15% действуют другие механизмы поддержания длины теломер, основанные на рекомбинации) [9]. Теломераза функционирует в клетках одноклеточных эукариот, таких как простейшие [1] и дрожжи [10]. Изучение принципов работы теломеразы в различных организмах, сравнение, выявление общих закономерностей и различий поможет в изучении работы теломеразы. Это представляет интерес, так как имеется достаточное количество фактов, свидетельствующих о том, что нарушение функционирования теломеразы и теломер (генетические дефекты, ответственные за это) приводят к целому ряду возрастных патологий, таких как повреждение костного мозга, остеопороз, фиброз легких, цирроз печени и др. (ссылки в работе [11]). Активация теломеразы связана с развитием рака [12]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.

Несмотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не известен точный состав теломеразного комплекса. Опубликованные данные о четвертичной структуре теломеразы дрожжей противоречивы. Данная работа посвящена изучению структуры и состава теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса.

2. Обзор литературы. Теломеразный комплекс: структура и функции.

5. Выводы.

1. Созданы штаммы дрожжей S. cerevisiae, экспрессирующие TLC1 РНК с РНК-аптамерной вставкой к стрептавидину.

2. Разработан метод выделения теломеразы с помощью аффинной хроматографии с использованием РНК-аптамерной вставки в TLC1 РНК.

3. Теломераза дрожжей S. cerevisiae активна in vitro в мономерной форме.

4. В состав легкой фракции активных теломеразных комплексов входит биотинилированный белок массой около 50 кДа.

3.3. Заключение.

Данная работа посвящена изучению теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что теломераза дрожжей активна in vitro в мономерной форме. На основе литературных данных о теломеразах других организмов и полученных в работе результатов можно сделать вывод о том, что функциональность in vitro в виде мономера — это общее свойство теломераз различных организмов. Также в работе получены интересные данные о составе теломеразного комплекса. Впервые обнаружена возможность того, что в состав теломеразного комплекса входит биотинилированный белок. Этот белок массой около 50 кДа входит в состав легкой фракции теломеразных комплексов. Этот факт указывает на то, что обнаруженный биотинилированный белок не является постоянным компонентом теломеразного комплекса, а входит в его состав временно, на определенном этапе сборки, регуляции или деградации теломеразы, и, возможно, принимает участие в этих процессах. Таким образом, в представленной работе получены интересные результаты о строении и составе активного теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae.

4. Материалы и методы. 4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы.

В работе были использованы следующие реактивы и препараты: NaCl, NaOAc, Na2HP04, KH2P04, КС1, КОАс, MgCl2, Mg(OAc)2, CaCl2, MnCl2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, H3BO3, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;

SDS, акриламид, ]Ч,Н'-метилснбисакриамид, 1,4-дитиотреитол (DTT), Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия;

Д-глюкоза, 2-меркаптоэтанол, Ы,1Ч,]ЧГ,]ЧГ-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), РНазин, насыщенный ТЕ фенол, рибонуклеаза А фирмы Helicon, Россия уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон фирмы Химмед, Россия; водонасыщенпый фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия; этанол фирмы Ферейн, Россия; азотистые основания: аденин, урацил; аминокислоты: лейцин, триптофан, гистидпи, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин; сахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, стеклянные шарики диаметром 425-600 микрон, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза А фирмы Sigma, Германия; полиэтиленгликоль 6000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия; бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США; легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия; [a-32P]dGTP, [у-32Р]АТР фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США; олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия; циркониевые шарики фирмы BioSpec Products, США; Zymolyase фирмы Seikagatu, Япония; стрептавидин-сефароза (Streptavidin Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США; стрептавидин, конъюгировапный с пероксидазой хрепа, авидин куриного яйца фирмы Имтек, Россия; диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) (DE-52) фирмы Whatman BioSystems Ltd, США;

Ni-NTA агароза, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Qiagen, Германия; суммарная тРНК Е. coli, мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, фирмы Amersham-Pharmacia Biotech, США; набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Германия; фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta, Германия; 20 мл центриконы фирмы Sartorius, США;

ДНКаза I (DNase I, RNase-frce), Т4 ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа Т4, эндонуклеазы рестрикции Bell, Hpal, Ncol, Nsil, NotI, Xhol, BamHI, PstI, Xmalll, Kpnl и фирменные буферные растворы к ним фирм MBI Fermentas, Литва и Roche, Франция; штамм DBY-746 а был любезно предоставлен М.Д. Тер-Аванесяном (Москва); плазмида pSD107 была любезно предоставлена Д. Готтшлингом, США.

1. Greider С. W., Blackburn Е.Н. (1987) Cell, 51,887-98.

2. Shcherbakova D.M., Zvereva M.E., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A. (2006) Mol Biol (Mosk), 40, 580-94.

3. Osterhage J.L., Talley J.M., Friedman K.L. (2006) Nat Struct Mol Biol, 13, 720-8.

4. Hsu M., Yu E.Y., Singh S.M., Lue N.F. (2007) Eukaryot Cell, 6, 1330-8.

5. Gallardo F., Chartrand P. (2009) Med Sci (Paris), 25, 232-3.

6. Mozdy A.D., Podell E.R., Cech T.R. (2008) Mol Cell Biol, 28, 4152-61.

7. Cristofari G., Lingner J. (2006) Embo J, 25, 565-74.

8. Denchi E.L. (2009) DNA Repair (Amst), 8, 1118-26.

9. Bollmann F.M. (2007) Cancer Treat Rev, 33, 704-9.

10. Cohn M., Blackburn E.H. (1995) Science, 269, 396-400.

11. Chavez A., Tsou A.M., Johnson F.B. (2009) Biochim Biophys Acta, 1792, 329-40.

12. Janknecht R. (2004) FEBS Lett, 564, 9-13.

13. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. (1997) Science, 276, 561-7.

14. Chen J.L., Greider C.W. (2004) Trends Biochem Sci, 29, 183-92.

15. Osterhage J.L., Friedman K.L. (2009) J Biol Chem, 284, 16061-5.

16. Hayflick L. (1997) Biochemistry (Mosc), 62, 1180-90.

17. Olovnikov A.M. (1973) J Theor Biol, 41, 181-90.

18. Reddel R.R., Bryan T.M. (2003) Lancet, 361, 1840-1.

19. Theimer C.A., Feigon J. (2006) Curr Opin Struct Biol, 16, 307-18.

20. Autexier C., Lue N.F. (2006) Annu Rev Biochem, 75, 493-517.

21. Prescott D.M. (1994) Microbiol Rev, 58, 233-67.

22. Zappulla D.C., Cech T.R. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101, 10024-9.

23. Forstemann K., Hoss M., Lingner J. (2000) Nucleic Acids Res, 28, 2690-4.

24. Jacobs S.A., Podell E.R., Cech T.R. (2006) Nat Struct Mol Biol, 13, 218-25.

25. Bachand F., Kukolj G., Autexier C. (2000) Rna, 6, 778-84.

26. Licht J.D., Collins K. (1999) Genes Dev, 13, 1116-25.

27. Collins K. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 484-94.

28. Zappulla D.C., Goodrich K., Cech T.R. (2005) Nat Struct Mol Biol, 12, 1072-7.

29. Lendvay T.S., Morris D.K., Sah J., Balasubramanian В., Lundblad V. (1996) Genetics, 144, 1399-412.30.