Структурная организация 5S рРНК в рибосоме E. coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

0&

^^ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ШПАНЧЕНКО Ольга Валерьевна

УДК 576.85.48

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ 5Б рРНК В РИБОСОМЕ КсоВ.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Институте молекулярной генетики им. М. Планка, Берлин, Германия.

Научные руководители:

Научный консультант:

академик РАН, профессор A.A. Богданов, К.Х.Н., с.н.с. O.A. Донцова профессор К.Х. Ниерхаус

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор A.M. Гудков доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится " 26 " ноября 1996 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " ¿if« ОЛ27л5/-Я- 1996 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома - это молекулярная машина, предназначенная для синтеза полипептидных цепей. Она является сложным нуклеопротеидным комплексом, состоящим из двух субчастиц - большой и малой, каждая из которых построена из рибосомной РНК и определенного числа белков. 5S рРНК - компонент большой субчастицы рибосомы. Несмотря на многолетние интенсивные исследования, роль 5S рРНК в функционировании рибосомы остается невыяснешюй. Первьм шагом на пути решения этой проблемы является изучение пространственной организации молекулы 5S рРНК в рибосоме.

Цель работы. Изучите пространственной структуры 5 S рРНК в комплексе со специфическими рибосомными белками, в составе 50S рибосомной субчастицы, 70S рибосомы E.coli и в различных рибосомпых функциональных комплексах.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе в качестве основного метода исследования был выбран тиофосфатный метод анализа структуры нуклеиновых кислот, который позволяет не только определять сайты РНК-РНКовых и РНК-белковых взаимодействий, но и выявлять структурно и/или функционально важные фосфатные остатки, а также локализовать фосфатные остатки, участвующие в координации ионов магния.

Кроме того, в данной работе был использован метод фотоаффннной модификации, позволяющий выявить компоненты, расположенные в непосредственной близости друг от друга в структуре рибосомы, и метод сайт-направленного мутагенеза, дающий сведения о важности конкретного нуклеотадного остатка для функционирования рибосомы.

Полученные результаты позволили охарактеризовать участки взаимодействия сахарофосфатного остова 5S рРНК со специфическими рибосомными белками; выявить ряд фосфатных остатков, необходимых для встраивания 5S рРНК в рибосому и проследить за конформационной перестройкой молекулы 5S рРНК при переходе её от свободного состояния в растворе к структуре, в которой она существует в составе рибосомы.

Было показано, что 5S рРНК расположена в непосредственной близости от двух функционально важных доменов рибосомы.

На основе полученных в этой работе результатов и литературных данных предложена модель пространственной организации 5S рРНК в рибосоме.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "Структура и функция рибосомы" (Виктория, Канада, 1995), 1-ой ежегодной конференции "РНК-Общества" (Мэдисон, США, 1996), 3-ем Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия, 1995).

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на ^/'страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: обзор литературы (посвящен обсуждению структуры и функции 5S рРНК), результаты, обсуждение результатов, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 28 рисунками и 5 таблицами. Библиографический указатель включает 124 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Для изучения пространственной организации 5S рРНК в рибосоме в данной работе использовали два подхода: метод фотоаффинной модификации и тиофосфатный метод изучения структуры нуклеиновых кислот.

Общая схема проведения эксперимента включала в себя получелне модифицированных молекул 5S рРНК; реконструкцию in vitro 50S субчастиц рибосом или 70S рибосом, содержащих модифицированные молекулы 5S рРНК, и анализ полученных рибосом методами, соответствующими каждому из подходов.

1. Определение контактов между 5S рРНК и 23S рРНК методом фотоаффинной

модификации.

Требуемые для работы модифицированные 5S рРНК E.coli получали с помощью транскрипции РНК-полкмеразой фага Т7. Реакцию транскрипции проводили в присутствии a-[32P]UTP и 4-тиоуридинтрифосфата (sUTP). Нерадиоактивный UTP был добавлен в реакционную среду до молярного соотношения UTP/sUTP равного 1:4. Включение 4-тиоуридина составляло примерно 18%.

Для получения 50S субчастиц рибосом использовали стандартную двухстадийную схему реконструкции с незначительными изменениями. 23 S рРНК, 5S рРНК и суммарный белок большой субчастицы рибосомы (ТР50) брали в реконструкцию в эквимолярных количествах.

Полученные 50S субчастицы рибосом очищали от несвязавшейся 5S рРНК центрифугированием в градиеите концентрации сахарозы. Выход 50S субчастиц рибосом, определенный по включению в них радиоактивной метки, составлял 4050%.

Активность реконструированных 50S субчастиц рибосомы, содержащих модифицированную 5S рРНК, в ро1у(и)-зависнмой системе синтеза poly(Phe) составляла 45% от активности природных 50S субчастиц рибосом; при этом активность 50S субчастиц рибосом, полученных в контрольном эксперименте при реконструкции из неразделенных природных (23+5)S рРНК составляла 65% от нативной 5 0S субчастицы.

50S субчастицы рибосом, реконструированные в присутствии 5S рРНК, содержащей остатки тиоуридина, облучали УФ-светом с длиной волны 330 нм (т.е. в условиях, исключающих инактивацию рибосом). Сшитую с 5S рРНК 23S рРНК выделяли центрифугированием в градиенте сахарозы, в условиях полного разрушения нековалентных РНК-белковых комплексов, при этом примерно 7-10% радиоактивной метки оставались связанными с 23 S рРНК. С учетом того, что содержание тиоуридина в 5S рРНК составляло 18%, выход сшивки был 40-55%.

Для анализа сшивок был использован подход, основанный на гидролизе РНКазой Н 23S рРНК, ковалентно связанной с 5S рРНК, в присутствии двух олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных определенным участкам 23 S рРНК, расположенным на расстоянии 150-200 нуклеотидов друг от друга. Такой гидролиз приводит к образованию фрагментов 23S рРНК разной длины, которые можно разделить электрофорезом в 4% ПААГ. Так, например, если 200-членный фрагмент 23 S рРНК окажется связанным с радиоактивной 5S рРНК в результате образования сшивки, то на радиоавтограмме появится полоса, соответствующая такому ковалентному комплексу. Использование целого набора пар олигодезоксирибонуклеотидов позволяет протестировать на наличие сшивок с 23S рРНК по всей её длине. Продукты гидролиза для каждой пары нуклеотидов наносили на гель в отдельную дорожку.

Такое сканирование показало существование двух сшивок между 23 S рРНК и 5S рРНК: одна расположена в районе между нуклеотидами 850-1050, другая —

2400-2600.

Для более точной идентификации района 23S рРНК, ковалентно связанного с 5S рРНК, повторяли гидролиз РНКазой Н в присутствии олигодезокси-рибонуклеотидов, комплементарных области пришивки, уменьшая расстояние между ними до 15-70 нуклеотидов.

На рисунке 1 представлен результат такого анализа для пришивки к району 850-1050. Видно, что фрагмент, вырезаемый РНКазой Н в присутствии олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных участкам "943" и "1044"

1 2 3 4 5 6 7 8

*

1-' у

л:

s;a

»es I

«?$ 10,»S »90

1.

2.

3.

4.

5.

6.

.„Ш

=J2>

U—

Рис.1. Гидролиз РНКазой Н 235рРНК, сшитой с 55 рРНК. Полосы на каждой дорожке на радиоавтограмме

представляют собой результат гидролиза в присутствии двух олигодезоксирибонуклеотидов (см. схему). Цифра рядом с полосой указывает размер (в нт.) полученного фрагмента 23 Б рРНК. Фигурной скобкой отмечен фрагмент 23Б рРНК, сшитой с 5Б рРНК. Дорожки 7 и 8 - сравнение относительных интен-сивностей сшибок между 58 рРНК и спиралями 89 и 39 238 рРНК. Дорожка 7 -гидролиз с использованием олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных участкам "2426" и "2511". Дорожка 8 -такой же гидролиз, как в дорожке 1.

(нумерация по номеру нуклеотида в молекуле 23S рРНК, комплементарного центральному основанию олигонуклеотида), сшивается с 5SpPHK (дорожка 1), а участкам "990" и "1044" — нет (дорожка 6). Таким образом, район пришивки расположен между нуклеотидами 943 и 990 23 S РНК. Использование олигодезоксирибонуклеотндов, комплементарных участкам "878" и "975", в присутствии которых РНКаза H вырезает фрагмент, сшитый с 5S рРНК (дорожка 4), позволяет ограничить район пришивки нуклеотидами 943 и 975.

Для определения нуклеотида 23S рРНК, сшитого с 5S рРНК, использовали метод обратной транскрипции. Для этого фрагмент 943-1044 23SpPHK, сшитый с 5S рРНК, элюировали из геля и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. В качестве контроля использовали свободный фрагмент 23 S рРНК, который вырезали из того же геля. Обратную транскрипцию инициировали с праймера, комплементарного району 997-1013 23SpPHK. На рисунке 2 видно, что обратная транскриптаза имеет несколько стоп-сигналов в районе нуклеотида 960 (дорожки "х"), этот эффект является обычным при анализе сшивок методом обратной транскрипции. Однако, воспроизводимый и самый яркий стоп-сигнал всегда наблюдается на С961, следовательно, 5S рРНК сшивается с нуклеотидом А960 23S рРНК.

A G С Т ХКХК

•es«*-

950—

Рис.2. Определение нуютеотидного остатка 238 рРНК, сшитого с 53 рРНК, при помощи реакции обратной транскрипции. А, Э, С, Т - сиквенсные дорожки. X и К - сшитый и контрольный образцы, соответственно.

Для идентификации остатка уридина в 5 Б рРНК, который сшивается с 23Б рРНК, очищенный сшитый комплекс 5Б рРНК с небольшим фрагаентом 23 й рРНК, полученный после гидролиза РНКазой Н, подвергали исчерпывающему гидролизу РНКазой Ть Полученные при этом олигонуклеотиды разделяли двумерной хроматографией на РЕ1-целлюлозе.

Поскольку 5 Б рРНК содержит радиоактивный уридин и 4-тиоуридин, а пришивка происходит только при фотоактивации последнего, то пятно на двумерной хроматограмме, содержащее пришивку к 23 Б рРНК, должно исчезать, если в соответствующем олигонуклеотиде не содержится радиоактивного фосфата, или изменять свою подвижность, если он есть.

На рисунке 3 представлены фингерпринты гидролизатов 5Б рРНК в свободном состоянии (А) и после ее сшивания с нуклеотидом А960 23Я рРНК (В). Пятно, соответствующее олигонуклеотиду иСиССССАивр (район 87-96 5Б РНК), указанное стрелкой на рис. 4А исчезает, а два новых пятна, соответствующие сшитому олигонуклеотиду, появляются (рис. 4В) (появление двух пятен отражает, как предполагается, гетерогенность пришивки). Эти три пятна были экстрагированы с хроматографических пластин и подвергнуты гидролизу РНКазой А. При таком гидролизе олигонуклеотида исиССССАНЮр (район 87-96), полученного из

с X / / 'V

Рис.3. Определение нуклеотидного остатка 58 рРНК, сшитого с 23Б рРНК. Гидролиз РНКазой Т, свободной (А) и сшитой (В) 5 Б рРНК. Пятна, изменившие подвижность, обозначены стрелками. Вторичный гидролиз РНКазой А (С) пятна, отмеченного стрелкой на (А), и (Б) пятен, отмеченных стрелками на (В).

Д,

с.

8.

О.

*

свободной 5S рРНК, радиоактивная 3'-фосфатная группа остается у остатков С и А (рис. 4С). Исчезновение радиоактивного пятна Ср (рис. 4D) при гидролизе сшитого фрагмента свидетельствует об участии нуклеотида U89 в сшивке.

Аналогичный анализ, проведенный для пришивки к району 2400-2600 23 S рРНК, позволил определить ее как сшивку между нуклеотидами С2475 23S рРНК и U89 5S рРНК, ранее уже идентифицированную в нашей лаборатории.

Один и тот же нуклеотид в молекуле 5SpPHK может быть сшит с двумя районами 23S рРНК. Выход пришивки (рис. 1) к каждому из этих двух районов 23S рРНК зависит от условий выделения 23S рРНК и ТР50, что, в свою очередь, отражается на конформации и, по-видимому, биологической активности полученных 50S субчастиц. Эта зависимость свидетельствует об определенной подвижности этих районов 50S субчастицы. Такая подвижность не обязательно должна быть большой, поскольку для 4-тиоуридина отклонения на 1-2Á и даже меньше могут оказаться достаточными для изменения места пришивки.

Опыты по сайт-специфическому мутагенезу 5S рРНК показали, что нуклеотид U89, расголожешгый в ее петле D, действительно важен для включения молекулы 5S рРНК в 50S субчастицу в ходе её реконструкции и функционирования рибосомы. Активность полученных субчастиц в ро!у(и)-зависимом синтезе poly(Phe) существешю ниже в случае замены U89 на пургаювые нуклеотндные остатки.

Хотя механизм фотохимических реакций 4-тиоуридина с основаниями нуклеиновых кислот изучен недостаточно полно, известно, что с цитозином он образует устойчивый аддукт только в том случае, если эти основания в РНК находятся в стакинг-конформации, а атом серы 4-тиоуридина перекрывается с С5С6 двойной связью цнтозина. Аналогичное перекрывание атома серы с гетероциклом, по-видимому, необходимо для образования сшивки 4-тиоуридина и с другими основаниями РНК.

Можно предположить, что нуклеотид U89 5S рРНК находится в стекинг-конформации с С2475 и А960, расположенными, соответственно, в спиралях 89 и 39 23S рРНК. При этом замена U89C практически не влияет на реконструкцию и активность полученных субчастиц рибосом. Замена же пиримидинового остатка на более объемный пуриновый, по-вцдимому, ведет к существенному нарушению

контакта 5S рРНК с 23 S рРНК, что значительно ухудшает включение мутантной 5S рРНК в рибосомную субчастицу.

На основании пришивки, образованной между нуклеотидами U89 5S рРНК и С2475 23S рРНК, было постулировано ранее, что домен IV-V молекулы 5S рРНК направлен к негггидшпрансферазному центру, расположенному в основании центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы. Пришивка между U89 в петле D 5S рРНК и А960 в спирали 39 23S рРНК подтверждает такое расположение спирали IV,

2. Анализ структуры 5S рРНК тиофосфатным методом.

Реакцию транскрипции для получения модифицированных молекул 5S рРНК проводили параллельно в 5 пробах. В четырёх из них 20% одного из нуклеотидов (ATP, GTP, СТР или UTP) были замещены соответствующим тиофосфатным производным (aS-ATP, aS-GTP, aS-CTP или aS-UTP), что приводило к включению тиофосфатных остатков в цепь молекулы РНК. Т7 транскрипция в пятой пробе, проводимая в отсутствие тиофосфатов, давала немодифицированнуто 5SpPHK, которую использовали в дальнейшем для контроля устойчивости немодифицированных фосфатных связей к воздействию иода в условиях эксперимента.

После дефосфорилирования полученную 5SpPHK радиоактивно метили при помощи Т4 полинуклеотидкиназы в присутствии у-[Р32]-АТР. Модифицированные радиоактивно меченные молекулы 5S рРНК использовали для формирования 5S рРНК-белковых комплексов, 50S субчастиц рибосомы или 70S рибосом.

Для образования комплекса с одним белком (L18 или L25) было выбрано соотношение 5S рРНК и белка 1:3, так как при таком соотношении комплексообразование достигает 80% и при дальнейшем увеличении избытка белка выход РНК-белкового комплекса не увеличивается. При образовании комплекса с 5S рРНК с тремя белками соотношения 5S рРНК и белков было выбрано 1:1,5, так как при комплексообразовании 5S рРНК с тремя белками связывание происходит кооперативно и концентрация белков может быть снижена. Кроме того, белки в высокой концентрации при нагревании в таких условиях склонны к агрегации, а

5S pPHK н её комплексы могут соосаждаться с белками.

Реконструкцию 5 0S субчастиц рибосом проводили так, как это описано в разделе 1. Для получения 70S рибосом реконструировашгые 50S субчастицы рибосом инкубировали с 30S субчастицами в буфере для ассоциации.

Полученные 70S рибосомы или 50S субчастицы очищали от нес вязавшейся 5 S pPHK центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. Профили сахарозного градиента были идентичны для всех модифицировашмх 5S рРНК и выход 50S рибосомных субчастиц или 70S рибосом, определенный по включению в них радиоактивной метки, составлял 40-50%.

Реконструированные 50S субчастицы рибосом были биологически активны. Так, в ро1у(и)-зависимой системе синтеза poly(Phe) активность частиц, содержащих модифицированную 5S рРНК, была такой же как и в случае природной 5S рРНК, выделенной из 50S субчастиц, или транскрипта, не содержащего модификаций, и составляла 40-50% от активности природных 50S субчастиц рибосом.

Расщепление модифицированной 5S рРНК проводилось с помощью 50мМ раствора иода в этаноле в течение двух минут при 4°С. Время реакции было подобрано так, чтобы добиться равномерного расщепления по всей длине. Реакцию останавливали добавлением равного реакционной смеси объема фенола, насыщенного водой; 5SpPHK осаждали из водной фазы этанолом. Полученные фрагменты анализировали в 12% ПААГ. Для того, чтобы иметь возможность сравнивать интенсивности полос, полученных после расщепления свободной 5S рРНК и 5S рРНК в комплексе с белками или в рибосоме, в каждую дорожку геля наносили пробы с одинаковой радиоактивностью.

В качестве примера такого анализа на рисунке 4 приведен автограф ПААГ после разделения фрагментов РНК, полученных при расщеплении иодом молекулы 5S рРНК в составе 70S рибосомы. В специальных опытах с немодифицированной 5S рРНК было показано, что обычные фосфатные связи устойчивы к воздействию иода в выбранных условиях (рис. 4, блок К). Неспецифические места расщепления выявляли при обработке контрольных проб этанолом (рис. 4, дорожки 1,3).

к

и

12345 12345 1 2 345 12345 12345

» - «Р - '§/# * *

~ **

■ во - 70

> 0 | п. 4»

» « ^

1 л ф

& » £

; V г

Рис.4. Радиоавтограф 12% сиквенсного геля после разделешм фрагментов РНК, полученных при расщеплении иодом 5Б рРНК в составе 70Б рибосомы. К-немодифидированный транскрипт. А, О, С, и - 5Б рРНК, транскрибированная в присутствии тиофосфатного производного соответствующего нуклеотида. Дорожка 1-55 рРНК в растворе в отсутствие иода. Дорожка 2-58 рРНК в растворе в присутствии иода. Дорожка 3-55 рРНК, полученная после фенольной депротеинизации 705 рибосомы, в отсутствие иода. Дорожка 4-58 рРНК, полученная после фенольной депротеинизации 708 рибосомы, в присутствии иода. Дорожка 5-58 рРНК в составе 705 рибосомы в присутствии иода.

Результаты нескольких независимых экспериментов по расщеплению 5S рРНК в комплексе с белками L5, L18 и L25, в составе 50S субчастиц рибосом и 70S рибосом суммированы, соответственно, на рисунках 5, 6.

Молекула 5S рРНК в растворе не образует сильных трепетных контактов, так как атаке иодом одинаково доступны все тиофосфатные остатки, кроме одного. Фосфатный остаток нуклеогида А73, который частично защищается от расщепления (рис. 4, А2), вероятно, может принимать участие в неких третичных взаимодействиях.

Есть основания рассматривать 5S рРНК-белковый комплекс как самостоятельный структурный домен рибосомы, и предполагается, что формирование структуры 5SpPHK, способной встраиваться п большую субчастицу рибосомы, происходит уже на стадии взаимодействия с рибосомными белками вне рибосомы. Поэтому исследование 5S рРНК-белкового комплекса было первым шагом на пути изучения структуры 5S рРНК в рибосоме.

В отличие от результатов, полученных традиционными методами футпринпшга, которые показывают, что связывание белков с 5S рРНК делает недоступными для химического и энзиматического пробинга большинство её гетероциклических оснований, тиофосфатиый метод выявил лишь ограниченное число РНК-белковых контактов в 5S рРНК-белковом комплексе. Это легко объяснить способностью тиофосфатного метода обнаруживать только полностью защищенные от растворителя фосфатные группы в РНК-белковых комплексах.

Нуклеотидные остатки G6, G7 и А34 (рис. 5), которые защищаются от расщепления в комплексе с белком L18, находится, соответственно, в спиралях I и Ш, формирующих, как известно из данных футпринтинга для этого комплекса, сайт связывания белка LI8 с 5S рРНК.

Район локализации белка L25 определен как спирали IV, V и петли D и Е. Наши данные показывают, что белок L25 защищает тиофосфатные остатки в районе спиралей I (нуклеотиды G6, G7, G9, G10), II (G20, G21, U22), IV (U80, U82, С90, С91). Нуклеотиды G6, G7, G9, G10, G20, G21, U22 в спиралях I и II не были определены ранее как сайт связывания 5S рРНК с белком L25. Однако, данные о важности спирали II для связывания рибосомного белка L25 подтверждаются также и методом мутагенеза. Наличие участков связывания белка L25 в спиралях I, II можно объяснить

гибкостью молекулы 5S рРНК, и, следовательно, дополнительным взаимодействием с этими спиралями, а так же тем, что полученные футпринтингом данные относятся только к гетероциклическим оснований 5S рРНК.

Результаты, полученные при изучении комплекса с тремя белками (рис. 5), невозможно объяснить только аддитивностью действия индивидуальных белков. С одной стороны, ряд фосфатных остатков защищаются только в комплексе с тремя белками (А39, А73, А99, А101). Появление дополнительных защищенных остатков может быть результатом как непосредственного взаимодействия с белком L5, так и стабилизации структуры комплекса при связывании белка L5 и фиксации взаимодействия А39 с белком L18, а А73, А99, А101 с белком L25.

С другой стороны, мы обнаружили фосфатные остатки, которые перестают защищаться при переходе к комплексу с тремя белками. Возможно, что G9, G10, G20, G21 являются местами неспецифического взаимодействия с индивидуальным белком

1 ** \ п 11 »* Гт* Г г*

• • 1 лСС11 л ■/■■ -пггг • pCí'C д до

UGCCUGGCGGC aGCGCGGUGGuc^üACCUGAC _ U-^

I II I I I I M I . I I Г II I I I в I II I С G

uacggaccg^c A cgaugccgcaAagugAagacuCaagCc

A G G- С --70 60 60

G-C

», A G

V и-А* G^U *A G »—G с G A c U * G A

G-U —во

A-U *

IV C_G ,v C-G ,C-G

so—C-G

"и и С D

Рис.5. Результаты расщепления иодом 5S рРНК в составе 5S рРНК-белковых комплексов, показанные на модели вторичной структуры: тиофосфатные остатки, защищенные в комплексе с белком L25 (И), L18(©), тремя белками (-к).

L25. Однако этн кошакгы нарушаются при появлении белка L18, специфически взаимодействующего с этим районом 5S рРНК. Потеря защиты С90 и С91 может быть объяснена конформационной перестройкой молекулы при взаимодействии с тремя белками.

Поскольку модифицированная 5S рРНК включается в состав рибосошюй субчастицы менее эффективно, чем "нормальная", в каждом эксперименте контролировали состав 5S рРНК в образовавшихся РНП-частицах. Для этого очищенные реконструированные 50S субчастицы и 70S рибосомы подвергали фенольной депротеиннзации и полученную РНК обрабатывали иодом. Если полоса, соответствующая какому-либо нуклеотиду, окажется слабее (например, G33 на рис. 4, дорожка G4), полосы, соответствующей этому же нуклеотиду, при расщеплении в контрольном препарате 5S рРНК в растворе (дорожка G2), значит замещение атома кислорода атомом серы у фосфатного остатка в этом месте препятствует включению 5S рРНК в рибосому. Усиление такой полосы (например, А39 на рис. 4, дорожка А4) говорит о предпочтительном отборе молекул 5S рРНК с замещением в этом месте при реконструкции рибосом.

Для проверки зависимости отбора фосфатных остатков от необходимости координации иона магния в данном положении реконструкцию проводили в условиях, когда половина мапшя в реакционной среде была замещена на марганец. Известно, что сродство Mg2* к сере в 31000 раз меньше, чем к кислороду, а Мп2+ -лишь в 150-200 раз, поэтому частичное замещение ионов магния ионами марганца могло, по крайней мере частично, подавить влияние тиофосфатных остатков в позициях, где они вовлечены в прямую координацию двухвалентных ионов металлов. Идентичность результатов, полученных при расщеплении 50S субчастиц рибосом, реконструированных в присутствии и отсутствие ионов марганца, позволяет предположить, что отбор фосфатных остатков не определяется в данном случае необходимостью координации двухвалентных ионов металлов.

Причиной предпочтения, отдаваемого фосфатным или тиофосфатным остаткам РНК при реконструкции 50S субчастиц рибосом, может быть легкость формирования конформации, присущей данному району, или более выгодное распределение зарядов.

1U| •• • I I ___ • •

III

» Ä

Gf

v

í i i Xu. и в iTT i с ..g

III

I

«сЩсЮс^

В I Л. I I

'V 8=1'

C-G'

so— С — G

и и С D

Рис.6. Результаты расщепления иодом модифицированной 5S рРНК в составе 50S субчастицы (а) к 70S рибосомы (б), показанные на модели вторичной структуры. Фосфатные остатки, отбирающиеся доя участия в реконструкции обведены кружком, тиофосфатные - квадратом. Защищенные фосфатные остатки отмечены стрелками; размер стрелки показывает силу эффекта. Длинные пунктирные стрелки - усиление доступности тиофосфатного остатка. Заштрихованная область - недоступный анализу район.

I

Из реконструкции 50S рибосомной субчастицы в значительной мере исключаются молекулы 5S рРНК, имеющие тиофосфатные остатки в положениях G9, А15, С19, С28, А29, U32, А50, А57, G54, С62, СбЗ, G64, G72, U80, G81, G96, G98, А99 и U103. Замена фосфатных остатков на тиофосфатные в положениях С36, С37, А39, G44 и G56 делает такие молекулы 5S рРНК предпочтительными в реконструкции. Интересно, что отбор тиофосфагных остатков происходит, в основном, в пределах петли С, которая, как предполагается, сильно структурирована за счет образования неканонических пар оснований (A-G, C-U, G-G, А-С, С-С). Остаток G56, единственный из остатков вне петли С, влияющий на реконструкцию, расположен рядом с U55, особая роль которого в структуре 5S рРНК будет обсуждена ниже.

При ассоциации 50S субчастиц рибосом в 70S рибосомы дополнительного отбора фосфатных или тиофосфагных остатков практически не происходит.

Число защищенных тиофосфатных остатков резко возрастает при переходе от комплекса 5S рРНК с тремя белками к 50S рибосомной субчастице, что свидетельствует о вовлечешюсти многих фосфатных групп 5S рРНК во внутририбосомные взаимодействия. При этом часть ранее существующих защит (А34, А73, U80, U82, А99) сохраняется; можно предположить, что это сайты прочного связывания фосфатных групп с белками. Некоторые га защит (U22, А39) пропадают при переходе от комплекса 5S рРНК с тремя белками к 50S рибосомной субчастице; возможно, это места менее прочных контактов, экранирование которых исчезает при структурной перестройке, происходящей в молекуле 5S рРНК при включении её в рибосому.

Следует так же отметить появление ряда положений, склонных к неспецифическому самопроизвольному расщеплению, иногда даже в отсутствие иода. Они расположены в местах соединения спиралей и петель (А15, А79, U89C90, район С110) или выпетливающегося нуклеотида (А104). Как будет показано ниже на модели пространственной структуры молекулы 5S рРНК в рибосоме, в этих местах, скорее всего, происходит резкий изгиб сахарофосфатного остова РНК.

На рисунке 6а обобщены результаты, полученные при расщеплении иодом модифицированной молекулы 5S рРНК в составе 50S рибосомной субчастицы. Они

показывают, в частности, что использованный метод действительно позволяет изучать структуру РНК с нуклеотидным разрешением, так как тиофосфатные группы даже у соседних нуклеотидов могут проявлять противоположные свойства при расщеплении иодом. Например, тиофосфатный остаток при С26 обладает повышенной доступностью, в то время как тиофосфатный остаток у соседнего нуклеотида С27 защищается от расщепления. Увеличение доступности фосфата, по-видимому, происходит за счет локальных конформационных изменений в полинуклеотидной цепи, облегчающих атаку иодом модифицированной группы и/или фиксирующих необходимую для завершения реакции ориентацию 2'-ОН группы. В молекуле 5S рРНК в составе 50S рибосомной субчастицы пять тиофосфатных остатков расщепляются легче, чем в свободной 5 S рРНК. Они расположены в петлевых районах - петля В (С26), петля С (С36, С37, С42) и петля Е (А78).

Сайга слабой и умеренной защиты распределены по всей молекуле 5S рРНК. Наиболее сильная защита наблюдается у нуклеотидов U83, U84 (спираль IV).

При переходе от 50S рибосомной субчастицы к 70S рибосоме (Рис. 66) происходят дальнейшие изменения в структуре 5S рРНК, о чем свидетельствует появление новых сайтов защиты (С38, А46, U48, U55, U74, С70, С71) и усиление ранее существующих (U40, С62, С63, G79, U80, U82, А101, G102). Наиболее сильное изменение доступности тиофосфатного остатка атаке иодом наблюдается у U55. Поскольку множественных прямых контактов между 5S рРНК и 30S субчастицей не существует, очевидно, что большинство этих эффектов сопряжено с конформационной перестройкой 50S субчастицы. При этом ряд слабо защищенных тиофосфатных остатков становятся доступными атаке иодом (G13, G16, С35, А50), некоторые умеренные защиты ослабляются (G18, А29, G33); исчезает повышенная доступность тиофосфатов в петлях С (С36, С37, С42) и Е (А78), но появляются три новых сайта с повышенной доступностью сахарофосфатного остова (G54, G85, G86).

Видно, что наиболее сильные изменения, происходящие в структуре молекулы 5 S рРНК при переходе от 50S рибосомной субчастицы к 70S рибосоме, локализованы в двух её участках - в петле В и спирали IV.

Район спирали IV, с одной стороны, становится более защищенным, с другой стороны, доступность тиофосфатных связей у нуклеотидов, соседствующих с петлей

D (G85, G86), возрастает. Возможно, изгиб сахарофосфатного остова в этом месте способствует фиксации нукпеотида U89 между двумя районами 23S рРНК, важность которой для реконструкции и функционирования рибосом уже обсуждалась выше.

Тиофосфатный остаток у нуклеотида U55 (петля В), доступный иоду в 50S рибосомной субчастице, становится защищенным в 70S рибосоме. Нельзя исключить, что этот нуклеотид является точкой контакта между центральным протуберанцем большой субчастицы и головкой малой субчастицы рибосомы.

3. Пространственная организация молекулы 5S рРНК в рибосоме.

Данные иммунной электронной микроскопии уже давно указывали на необходимость сворачивания ветви II (спираль II - петля В - спираль III - петля С) 5S рРНК в рибосоме.

Согласно данным по защите тиофосфатных остатков в молекуле 5S рРНК в рибосоме от атаки иодом сахарофосфатный остов петли В изогнут в районе нуклеотида U55. Повышенная доступность тиофосфатных остатков у нуклеотидов С26 и G54 подтверждает существование изгиба в этом районе.

Повышенной доступностью при расщеплении иодом обладают так же тиофосфатные остатки, связанные с 5'-положением рибозы нуклеотидных остатков СЗб, С37, G41 и А78 в 50S субчастице и G85 и G86 в 70S рибосоме. Эти остатки также расположены в местах изгиба цепи РНК.

Полученные в работе данные были использованы для моделирования структуры молекулы 5S рРНК в рибосоме с применением разработанной в Институте молекулярной генетики им. М. Планка (Берлнн, Германия) компьютерной программы "ERNA-3D". Эта программа позволяет перемещать двусгагральные участки РНК друг относительно друга. Односпиралъные участки, соединяющие перемещаемые спирали, остаются при этом связанными со спиралями, не допуская превышения максимально возможного межспирального расстояния. Результат такого моделирования структуры 5S рРНК представлен на рисунке 7. Спираль III была повернута относительно остальной молекулы так, чтобы расстояние между 5'-3'-концом и петлей С составляло примерно 50Ä, при этом односпиралъные участки РНК в районе петли В были изогнуты так, чтобы нуклеотид U55 находился на внешней стороне ветви молекулы.

Рис.7. Модель пространственной организации 5S рРНК в рибосоме, представленная в двух ориентациях (а и б). Указаны места повышенной доступности атаке иодом тиофосфатных остатков (заштрихованы) и защит (чёрный - сильная; тёмно-серый -умеренная; серый - слабая).

Тиофосфатные остатки молекулы 5S рРНК, защищающиеся от расщепления иодом в 50S субчастице рибосомы, образуют два кластера. Один из них расположен в узле структуры, включающем в себя спирали Л и Ш и петли А, В и С и лежащем в непосредственной близости от ветви V - Е - IV - D. Вероятно, это сайт связывания белка L18. Как известно из литературы, он включает в себя практически всю ветвь А -П - В - III - С, а ветвь V - Е - IV - D, хотя и не несёт нуклеотидных остатков, непосредственно защищающихся от химической модификации и ферментативного расщепления при связывании белка L18 с молекулой 5S рРНК, также важна для РНК-белкового взаимодействия.

Другой кластер защищенных тиофосфатных остатков локализуется на одной стороне ветви Ш (спираль V - петля Е - спираль IV -петля D) и может представлять собой сайт связывания белка L25, взаимодействие 5S рРНК с которым в рибосоме значительно упрочняется.

Защищенные тиофосфагные остатки, лежащие вне этих двух кластеров, вероятно, представляют собой места взаимодействия с другими компонентами рибосомы, например, с белком L5, сродство которого к 5S рРНК в присутствии белков L18 и L25 существенно возрастает, возможно, из-за формирования подходящей для комплексообразования конформации. Можно предположить, что белок L5, связываясь, фиксирует структуру 5S рРНК.

Полученная модель молекулы 5S рРНК хорошо вписывается в модель 70S рибосомы, полученную с помощью трехмерной реконструкции электронно-микроскопических изображений. При этом 5'-3'-конец молекулы в строгом соответствии с данными ИЭМ расположен на тыльной стороне центрального протуберанца 50S субчастицы, находящиеся в петле С нуклеотиды А39 и U40 - на стороне, обращенной к L1-выступу. Нуклеотид U55 находится в месте контакта двух субъедшшц рибосомы. Спираль V - петля Е - спираль IV - петля D направлены к основанию центрального протуберанца 50S субчастицы.

4. Возможная роль молекулы 5S рРНК в функционировании рибосомы.

В литературе неоднократно высказывалось мнение, что существование нескольких форм молекулы 5S рРНК может свидетельствовать о возможности конформационных переходов между ними в ходе работы рибосомы. Согласно нашим данным, связывание с рибосомой мРНК и первой тРНК (формирование инициаторного комплекса), а также второй тРНК (образование претранслокационного комплекса) не влияет на конформацию сахарофосфатного остова молекулы 5S рРНК. Структура 5S рРНК сохраняется неизменной и в постгранслокационном комплексе.

Жесткость структуры молекулы 5S рРНК в рибосоме и тот факт, что она, с одной стороны, имеет контакт с 30S субчастицей, а с другой стороны, контактирует с областями пептидилтрансферазного центра и сайта связывания фактора элонгации EF-G, позволяют предложить для молекулы 5S рРНК гипотетическую роль передаточного звена между различными функциональными центрами рибосомы.

выводы

1. Нуклеотид U89, расположенный в петле D 5SpPHK, образует сшивки с двумя нуклеотидами в молекуле 23 S рРНК, одни из которых - С2475 - находится в спирали 89, лежащей в непосредственной близости от пептидилтрансферазного центра, а другой - А960 - в спирали 39, расположенной рядом с сайтом связывания элонгационного фактора EF-G.

2. Замена нуклеотида U89 5S рРНК на пуриновые остатки приводит к потере рибосомами активности в ро1у(и)-зависимой системе синтеза poly(Phe).

3. При расщеплении 5S рРНК в растворе атаке иодом одинаково доступны все тиофосфатные остатки, кроме А73 (петля Е), который частично защищается от расщепления.

4. Только 10 из 120 нуклеотидов 5S рРНК защищаются от расщепления иодом при образовании её комплекса с рибосомными белками L5, L18 и L25.

5. Число защищенных тиофосфатных остатков резко возрастает при переходе от комплекса 5S рРНК с тремя белками к 50S рибосомной субчастице.

6. При реконструкции 50S рибосомной субчастицы происходит отбор молекул 5S рРНК, имеющих или не имеющих тиофосфатные остатки в определенных положениях.

7. Доступный атаке иодом в 50S рибосомной субчастице нуклеотид U55 становится защищенным в 70S рибосоме, являясь, по-видимому, местом контакта между центральным протуберанцем большой субчастицы и головкой малой субчастицы рибосомы.

8. Структура молекулы 5S рРНК в рибосоме не изменяется при формировании инициаторного, пре- и посттранслокационных комплексов.

9. На основании полученных результатов и литературных данных предложена модель пространственной организации молекулы 5S рРНК в рибосоме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bogdanov, A., Dontsova, О., Rinke-Appel, J., Dokudovskaya, S., Lavrik, I., Alekseeva, E., Shpanchenko, 0., Sergeev, P., Baranov, P., Shirokova, E., Nierhaus, K., Brimacombe, R. - "Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies", Nucleic Acids Symp. Ser. (1994) v.31, pp.273-274.

2. Bogdanov, A., Dontsova, 0., Rinke-Appel, J., Dokudovskaya, S., Lavrik, I., Alekseeva, E., Shpanchenko, O., Sergeev, P., Nierhaus, K., Brimacombe, R. - "Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies", Third international symposium on bioorganic chemistry, Dagomys, Russia (1995), Abstract book,

3. Bogdanov, A., Dontsova, O., Dokudovskaya, S., Shpanchenko, O., Brimacombe, R. - "5S rRNA topography in the ribosome", Frontiers in translation, An international conference on the structure and function of the ribosome, Victoria, Canada (1995), Abstract book, p. 61.

4. Dokudovskaya, S., Dontsova, O., Shpanchenko, 0., Bogdanov, A., Brimacombe, R. - "Loop IV of 5S rRNA has contacts both to domain II and to domain V of the 23S RNA", RNA (1996), v.2, pp.146-152.

5. Dontsova, O., Dokudovskaya, S., Baranov, P., Sergeev, P., Shpanchenko, O., Brimacombe, R_, Bogdanov, A. -"rRNA contacts inside the ribosome: cross-linking study", RNA'96, The first annual meeting of the RNA society, Madison, USA (1996), Abstract book, p. 175.

6. Дабровски, M., Юнеманн, P., Шафер, M. А., Шпан, К. M. Т., Ниерхаус, К. X., Алексеева, Е. В., Донцова, О. А., Шпанченко, О. В., Богданов, А. А. "Фосфатные участки РНК-лигандов, взаимодействующие с рибосомой на различных стадиях трансляции. Изучение с помощью тиофосфатного метода", Биохимия (1996), т.61, сс.1971-1982.

7. Shpanchenko, О. V., Zvereva, М. I., Dontsova, О. A., Nierhaus, К. Н., Bogdanov, А. А. - "5S rRNA sugar-phosphate backbone protection in complexes with specific ribosomal proteins", FEBS Lett. (1996), v.394, pp.71-75

p.4.