Применение новых фотоаффинных реагентов для исследования пространственной организации функциональных центров рибосомы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

• - ^ » * I •

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ Г О С УД Л Р СТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химическим факультет

На правах рукописи УДК 576.85 48

СЕРГИЕВ Петр Владимирович

ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ РИПОСОМЫ.

02 00 10 - бноорганмческая химия, химия природных и фичиологичсскп аьлшшых веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, п Институте молекулярной генетики им М. Планка, Берлин, Германия.

Научные руководители:

академик РАН, профессор A.A. Богданов, д.х и, профессор О А. Донцова

Научные консультанты:

профессор Р. Брнмакомб,

Официальные оппоненты:

доктор химических паук, профессор А.М. Гудков доктор химических наук, профессор С Н. Кочетков

Ведущая организация:

Институт биоорганическом химии им. ММ. Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Защита состоится 6 октября 1998 г. в 16 часов па заседании диссертационного совета Д 053.05.47 но химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В Ломоносова.

Автореферат разослан 3 сентября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И Г. Смирнова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лмуадьмосгь__проблемы. Одним из наиболее сложных функциональных

рибонуклеопротендных комплексов является рибосома. Она осуществляет ключевую стадию реализации генетической программы клетки - синтез белков, согласно информации, «кодированной в первичной структуре мРНК. В отличие от большинства молекулярных машин клетки, которые являются белками, для функционирования рибосомы важны взаимодействия как белков, так п РНК. Согласно гипотезе "РНК-мира", предположительно предшествовавшего современному "белковому миру", именно с появлением рибосомы связано возникновение жизни в ее современном виде, основанном на выполнении "центральной догмы" молекулярной биологии: "ДНК->Р11К->белок". Исследование структуры рибосомы важно для понимания не только процесса трансляции, но и общих принципов структурно-функциональных взаимодействий нуклеиновых кислот и белков. 11ель работы.

1 Исследование пространственного окружения мРНК в составе инициаторных комплексов рибосомы Е. coli с помощью фотоаффинного сшивания мРНК, содержащей остатки 6-тиогуанозина и диазиринового производного 5-ме1 иленаминоуридина.

2 Построение модели взаиморасположения элементов декодирующего центра рибосомы в пространстве.

3 Исследование пространственного окружения 5S рРНК в рибосоме с помощью фотоаффинного сшивания 5S рРНК, содержащей остатки диазириновых производных 5-метнленамнноуридина и 2'-дезокси-2'-аминоуридпна.

Научная новизна и практическая значимость В настоящей работе для исследования структуры нуклеопротеидных комплексов были применены фогоаффинные аналоги природных нуклеозидов - 6-тногуанозин и диазпрпновые производные 5-метиленаминоуридмна и 2'-дезокси-2'-ампноуридина. Впервые идентифицированы нуклеотпдные остатки 16S рРНК, кон (актирующие с положениями +2, +8 и +9 кодирующей области мРНК. Особенно интересной является пришивка диазиринового производного 5-мез иленаминоуридина, находящегося в нншшаторном AUG-кодоне мРНК, к нуклеотидному остатку G926 16S рРНК. Это первый случай ковалентного сшивания с рРНК нуклеогидного остатка мРНК, входящего в состав кодон-антнкодонового дуплекса. Подобный результат говорит о возможности применять производные 5-метнленампноуридина для исследования пространственного окружения РНК-дуплексов, а не только одноцепочечных участков РНК. Полученные в настоящей работе данные, а также данные о пространственном окружении мРНК в рибосоме, полученные ранее, позволили построить модель декодирующего центра рибосомы.

В отличие от малой субчастицы рибосомы, большая субчастица изучена гораздо хуже В результате исследования пространственного окружения 5S рРНК в 50S субчастице и 70S рибосоме были обнаружены три неизвестных ранее контакта 5S рРНК и 23S рРНК, а также выявлен ряд нуклеотидных остатков 5S рРНК, модификация которых . препятствует ассоциации рибосомных субчастнц. Нуклеотпдные остатки, сближеные, как было показано в данной работе, с 5S рРНК расположены в области, соединяющей "ОТРазный центр" с остальной частью 23S рРНК.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "Frontiers in translation", Виктория, Канада, 1995г., 3-ем Международном симпозиуме по бноорганической химии, Дагомыс, 1995г., 1-ом ежегодном съезде РНК-общества "RNA'96", Висконсин-Мэдисон, США, 1996г., 2-ом симпозиуме по биологии РНК "RNA: Tool and Target", Северная Каролина, США, 1997 г., 4-ой Международной конференции "Recognition Studies in Nucleic Acids", Шеффилд, Англия, 1998 г, Международной конференции "Biocatalysis-98", Пущино, Россия, 1998 г., Международной конференции "Gordon Conference or Nucleic Acids", Ныопорт, США. I99S г., Международной конференции "Structure Research oí' the Ribosome and its Functional Complexes", Ганновер, Германия, 1998 г.

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты н обсуждение, материалы и методы, выводы Материал иллюстрирован рисунками и таблицами. Библиографический указатель включает цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основной функцией малой субчастпцы рибосомы является декодирование, т.е. процесс точного прочтывашы кодирующей области мРНК с помощью антнкодонов тРНК. Основная функция большой субчастицы -катализ пептидилтрапсферазной реакции между аминокислотой, присоединенной к тРНК, находящейся в A-сайте рибосомы и растущей пептидной цепью, присоединенной к тРНК, занимающей Р-сайт рибосомы. Кроме того, обе субчастпцы должны участвовать в транслокации мРНК на 3 нуклеотндных остатка и тРНК из A-сайга в Р-сайт и из Р-сайта в Е-еайт. Транслокацию катализирует элонгационый фактор G, взаимодействующий с т.н. "ОТРазным" центром большой субчастпцы. Все эти события должны быть строго скоординированы. Пептидилтрансферазная реакция происходит только после того, как правильная тРНК заняла A-сайт, и, соответственно, транслокация мРНК и тРНК, освобождающая A-сайт для следующей тРНК, не должна происходить до пептидилтрансферазной реакции Таким образом, рибосома должна осуществлять передачу сигналов между иептидилтрансферазным, "ОТРазным" и декодирующим центрами.

Понимание механизма функционирования рибосомы невозможно без знания ее пространственной структуры. В последнее время разрешающая способность как рентгеноструктурного анализа (РСА), так и электронной микроскопии (ЭМ) рибосом достигла уровня 9Ä (Ban et al. Cell, 1998, v.93, pp. 1105-1115). Это позволило непосредственно наблюдать пространственное расположение многих рибосомных лигандов, рнбосомных белков и отдельных спиралей рибосомных РНК. Для соотнесения отдельных элементов вторичной структуры рРНК и элементов пространственной структуры, обнаруженных с помощью ЭМ и РСА, чрезвычайно важны данные о пространственной сближенности отдельных нуклеотидных остатков в рибосоме. Среди методов, позволяющих получать подобную информацию, особое место занимает метод фотоаффиннон модификации.

Сугь метода заключается во введении в определенные положения РНК, входящих в состав функциональных комплексов рибосомы, фотоаффинных аналогов природных нуклеогидов При облучении мягким ультрафиолетовым

(УФ) светом с длиной волны 310-350 нм, не затрагивающим природные иуклеотнды и аминокислоты, подобные фотоаффинные производные образуют ковалентиые связи с теми компонентами рибосомы, которые пространственно с ними сближены.

Большннс1во фотоаффинных реагентов малоселекггивно в отношении функциональных групп, с которыми они могуг образовывать ковалентиые связи Тем не менее, пространственная сближенность того или иного нуклеотндного остатка с фотоаффшшой группой не всегда приводит к образованию пришивки между ними при облучении УФ-светом. Только использование набора фотоаффинных реагентов с различными фотохимическими свойствами и различным положением фотоаффинной группы позволяет получить достаточно полные данные о пространственном окружении выбранного нуклеотндного остатка.

я

Рисунок 1. Фотоаффинные аналоги нуклеслндов, используемые в данной работе. I: 6-'Гиогуанозин. (синтезированный Е. Широковой н В. Власовым) 11: 5-Метиленампноурнднн. (синтезированный Т. Орецкой) 111 Ы-Гндрокснсукцннимидный эфир 4-(3-трнфторметил дч:нирни-3-ил) бензойной кислоты, использующийся для модификации (синтезированный А. Тошшым) З-мегп.аенамнноуридипа IV Диазириновое производное 5-метнленаминоуриднна. V. 2'-Дезокси-2'-амш10)ридш1 (сишезнрованный Е Романовой) VI. 4-(3-Трнфтормегил диазирнн-3-И.1) беншлпютпоцианат, использующийся для модификации 2'-де)оксн-2'-а.миноурвдина. (спшепфованный А Топнным) VII. Дназириноиос производное 2'-дезокси-2'-ампноуридина.

Исследование декодирующего центра рибосомы проводилось ранее с помощью 4-тиоуридина. Были обнаружены контакты спейсерной области мРНК с нуклеотидмыми остатками 1530, 665 и 1360, а также положений +4, -(6, + 7 и +11 кодирующей области мРНК с нуклеотидными остатками 1402 (спираль 44), 1052 (спираль 34), 1395 (спираль 28) и 532 (спираль 18) 168 рРНК соответственно. Несмотря на это, полученных данных было недостаточно для определения ориентации указанных спиралей относительно мРНК. В данной

с

работе для исследования непосредстценного пространС1вепного окружения отдельных нуклеотидов мРНК использовался 6-тпогуапознп, фотоаффипний реагент, также, как и 4-тиоуриднн, образующий пришивки "нулевой длины' -(рис 1(1)). Для обнаружения нуклеотндных остатков рРНК, удаленных от мРНК на расстояние до 1 мм применялось диазириновое производное 5-метиленаминоуриднна (рис. 1(11))

Ранее, для исследования пространственного окружения 58 рРНК в рибосоме, также применялся 4-тноуридин. Было обнаружено, что нуклеотндный остотк Ш9 58 рРНК пространственно сближен с абсолютно консервативными нуклеотидными остатками С2475 и А960 238 рРНК, что позволило предложить модель расположения О-петлн 5Э рРНК в рибосоме. Согласно этим данным, 58 рРНК сближена как со И, так п с V доменами 235 рРНК, образующими, соответственно, "СТРазный" и пептидилтрансферазный центры. Это позволило предположить, что шпильки 39 (содержащая А960) и 89 (содержащая С2475) 23Б рРНК, а также Ц-петля 58 рРНК, участвуют в передаче аллостерпческого сигнала от пептидилтрансферазиого к "ОТРазному" центру рибосомы. Для изучения механизма этого процесса было решено продолжить исследование пространственного окружения 58 рРНК в рибосоме методом фотоаффинной модификации, используя диазирнновые производные 5-метнленампноуриднна (рис. 1(11)) и 2'-дезокси-2'-аминоуридина (рис. 1(\')). Их фотоаффинные группы расположены на расстоянии около 1 им от С5 и С21 атомов уридпна, соответственно

«ВЕДЕНИЕ ФОТОАФФИННЫХ АНАЛОГОВ НУКЛЕОТИДОВ В РНК Для введения фогоаффинных реагентов в РНК применялся метод Т7-транскрипцин. Как б'О'ГР, так н 5'-трпфосфаты 5-метпленаминоуридина и 2'-дезокси-2'-ампноуридипа являются субстратами для Т7 РНК-полимеразы и встраиваются в РНК вместо гуанозина и уридпна, соответственно. После выделения транскрипта, аминогруппы остатков 5-метплепампноуридина модифицировались Ы-гидроксисукцннимидным эфиром 4-(3-трифторметил дназнрин-3-ил) бензойной кислоты (рис. 1(111)). Для модификации остатков 2'-дезокси-2'-ампноуридина использовался 4-(3-трифторметил диазирин-3-ил) бензилпзотиоцианат (рис. 1С VI)) Для дальнейших экспериментов использовались такие условия транскрипции, при которых получающиеся РНК содержали в среднем одну фотоаффинную группу на молекулу мРНК и 2 фотоаффинные группы на молекулу 58 рРНК. Для введения радиоактивной метки в мРНК и 58 рРНК транскрипция проводилась в присутствии а-[32Р]1_1ТР.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕКОДИРУЮЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМЫ С ПОМОЩЬЮ мРНК, СОДЕРЖАЩИХ ОСТАТКИ 6-ТИОГУАНОЗИНА И ДИАЗИРИНОВОГО ПРОИЗВОДНОГО 5-МЕТИЛЕНАМИНОУРИДИНА Для исследования пространственного окружения мРНК в рибосоме использовался набор модельных мРНК, содержащих природные сигналы инициации белкового синтеза - последовательность Шанна-Дальгарно и инициаторнын Аив-кодои Положение остатка фотоаффинного реагента в 3'-кодирующей области мРНК определялось ее первичной структурой (рис. 2). Так, например, мРНК 08,13 содержала остатки 6-тиогуанозина в положениях +8 и +13 З'-кодпрующей области мРНК, считая положением +1 А в АиС-кодоне. Всего использовалось 6 типов мРНК, содержащих остатки 6-

тиогулнозина и -) типа мРНК, содержащих остатки дназнринового ирошводнот о 5-метиленаминоуридпна (рис. 2).

мРНК, содержащие фотоаффиниые аналоги нуклеотидов, использовались для образования инициаторных комплексов 70S*mPHK и 7üStml'HK*i[1HKrNUl. Полученные комплексы облучались УФ-светом с длиной волны >300 мм в течении !0 минут. После облучения, рибосомы разделяли на субчастицы и отделяли от избытка мРНК с помощью ультрацентрифугнрования в градиете концет рации сахарозы. Часть мРНК оказывалась ковалентно связанной с 30S субчастицей. Для разделения ]6S рРНК и белков малой субчаспщы использовали второе центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы в денатурирующих условиях.

Для предварительного определения места пришивки, 16S рРНК, коваленпто связамую с мРНК, разрезали РНКазои Н в присутствии пар олигодезоксмрибонуклеотидов, комплементарных желаемым местам разрыва 16S рРНК Получаемые при таком гидролизе фрагменты I6S рРНК разделяли в -4% полиакрнлампдном геле. Фрагмент, содержащий ковалентно присоединенную радиоактивно меченную молекулу мРНК выявляли с иомощыо радиоавтографпи

G4 GGGAAGGAGGUUGUAUGGUCAACCAACACACAC

Gs,U) GGGAAGGAGGUUGUAUGAGUACUGAACACCACA

G6,l I GGGAAGGAGGUUGUAUGCUGACUCGACACCACA

G7,12 GGGAAGGAGGUUGUAUGCüCGAACUGCCACCAC

G8,I3 GGGAAGGAGGUUGUAUGAUUAGCUCCGACACCA

G9,U GGGAAGGAGGUUGUAUGAAUAAGCUCCGACACC

115 GGGAAGGAGGAAAAAAAUGCUCGAACGGAAACGACAG

1)7 GGGAAGGAGGAAAAAAAUGGAAUACCGGAAACGACAG

119 GGGAAGGAOGAAAAAAAUGGAAGAUCGGAAACGACAG

III 1 GGGAAGGAGGAAAAAAAUGGAACGGAUAGAACGACAG

Рисунок 2. Первичная структура модельных мРНК, использовавшихся в данной работе. Подчеркнуты последовательности Шайнп-Дальгарно и AUG кодон. Выделены "нуклеотидпые осг.пкн, чамешлемые фотоиффинными аналогами нуклеотидов. мРНК названы в соответствии с используемым аналогом нуклеотида (G или U) и положений, тннмаемым этим аналогом в мРНК.

Дли точного определения нуклеогидного остатка 16S рРНК, участвующего в пришивке, применялся метод обратной транскрипции. Поскольку обратная транскриптаза не могла встроить нуклеотидный остаток напротив места пришивки в I6S рРНК, удлинение праймера прекращалось за 1 нуклеотидный остаток до места пришивки.

Для определения нуклеотидного остатка мРНК, образовавшего пришивку, использовался метод Т1-фингерпринтов. мРНК, пришитая к фрагменту 16S рРНК, подвергалась гидролизу РНКазой Т1, вносящей разрывы в РНК с З'-стороны от остатков гуамозима. Получеттные фрагменты разделяли с помощью двумерной тонкослойной хроматографии. При этом фрагменты мРНК, содержащие радиоактивные атомы фосфора, выявляли с помощью радиоавтографпи. Фрагмент мРНК, пришитый к фрагменту рибосомнои РНК, обладает меньшей подвижностью на хроматограмме. Кроме того, РНКаза TI не

может гидролизовагь цепь РНК после остатка 6-тиогуанознна, образующего пришивку.

А.

1.2.3.1 23

65 —

35 —

Б.

то АСвУХК

В

•ПЯ)

Ш) II»)»

ш

1

(¡0

5

5'-СССАА06АС0*и1ю*иХиб ХИмв СиССв АСАССА

Рисунок 3. Анализ пришивки 6-тиогуанознна, находящегося в положении +8 кодирующей области мРПК, к нуклеотидному остатку А1|% 16Б рРНК. А: Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего фрагменты 16Б рРНК, сшитой с мРНК СК, 13. Н.1 схеме справа от радиоавтографа А. показаны места разрезание 165 рРНК РНКазой Н для каждой из дорожек. Стрелками показаны полосы, соответствующие фрагментам 165 рРНК, ковалентно связанным с мРНК п указана длина этих фрагментов. Б. Анализ пришивки с помощью обратной транскрипции. Буквами А.С.й и и показаны дорожки сиквснса 165 рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие продукты обратной транскрипции фрагмента 165 рРНК пришитого к мРНК 08,13 н свободного. Стрелкой показана полоса, соответствующая месту остановки обратной транскриптазы за один нуклеотидиый остаток до места пришивки. В. Т1-финтерпрннты (!) мРНК 08,13 в свободном виде и (И) ковалентно связанной с фрагментом 168 рРНК. 11а с.\еме под рисунком показана последовательность мРНК 08,13 и схема ее гидролиза РНКазой Т1. Радиоактивные фрагменты мРНК подчеркнуты и пронумерованы также, как соответствующие пятна на фингерлринте. Звездочками обозначены радиоактивные фосфатные группы. Стрелкой показано место нанесения образца. Первое направление двумерной хромагограммы справа налево, второе снизу вверх.

В результате, на радиоавтограмме отсутствуют пятна, соответствующие фрагментам мРНК, примыкающим к месту пришивки с 5' и З'-стороны. Вместо них присутствует менее подвижный ковалентный комплекс фрагмента мРНК и фрагмента 165 рРНК. В случае мРНК, содержащих остатки диазнринового производного 5-метиленаминоуридина, фрагмент мРНК, образовавший пришивку, оказывался нерадиоактивным. Он содержал только фотоаффииный аналог уридина и, таким образом, не мог содержать 32Р, источником которого был а-[32Р]иТР.

У

Все мРНК, содержащие остатки 6-тиогуанозина, образовывали пришивки к З'-концевому участку 16Б рРНК (нуклеогидные остатки 1530-1542), а также участкам, ограниченным нуклеотидными остатками 560-690 и 13051385 1 е>8 рРНК Т1-фингерпрннты этих пришивок совпадали с Т1-фпнгерпрпнтами мРНК-транскрипта, а это значит, что нуклеотидиые остатки, образующие эти пришивки, принадлежат одному из нерадиоактнвных фрагментов мРНК, расположенных в ее 5'-концевой части, одинаковой для всех используемых мРНК. Пришивки к нуклеотидным остаткам 665 и 1360 16Б рРНК наблюдались ранее для мРНК, содержащих 4-тиоуридин в спейсерной области между последовательностью Шайна-Дальгарно и АиО-кодоном. Таким оорлзим, применение 6-тногуанозина не позволило обнаружить неизвестные ранее элементы пространственного окружения 5'-нетранслируемой области мРНК, хотя и подтвердило ранее полученные данные.

Для кодирующей области мРНК, наоборот, было обнаружено несколко новых пришивок. мРНК 08,13 и 09,14 образовывали пришивку к участку 11451210 16Б рРНК (рис ЗА). Эта пришивка была характерна только для этих- двух мРНК п наблюдалась только в присутствии тРНКгм". Обратная транскрипция 165 рРНК останавливалась на нуклеотидном остатке 1197 16Б рРНК (рис. ЗБ). Следовательно, мРНК 08,13 и 09,14 образовывали пришивку к абсолютно консервативному нуклеотидному остатку А1196 16Б рРНК. Нуклеотндный остаток мРНК, образующий пришивку, был определен с помощью Т1-фннгерпрпнтов (рис. ЗВ). Отсутствие пятен, соответствующих фрагментам лиил'^р и, следующего за ним в первичной структуре, СиССОр свидетельствует о том, что пришивку образует нуклеотндный остаток +8. Аналогично, для мРНК 09,14 было выяснено, что пришивку к 16Б рРНК образует нуклеотндный остаток +9.

Специфичная, тРНКгМе' -зависимая, пришивка к району, ограниченному нуклеотидными остатками 525-550 16Б рРНК, была характерна для мРНК 07,12 (рис. 4А) Обратная транскрипция останавливалась на нуклеотидном остатке 531 16Э рРНК (рис. 4Б). Таким образом, в пришивке участвовал абсолютно консервативный нуклеотндный остаток 0530 16Б рРНК. На 'П-фингерпрннте пришивки мРНК 07,12 к 16Э рРНК отсутствовало пятно, соответствующее фрагменту ААСи"2Ор мРНК (рис. 4В). Таким образом, нуклеотндный остаток + 12 мРНК образовывал пришивку к нуклеотидному остатку 0530 16Э рРНК. Все иРИК, содержащие остатки диазиринового производного 5-метиленаминоуридина, образовывали тРНКгМс'-зависимую пришивку к району 168 рРНК, ограниченному нуклеотидными остатками 920-1055 (рис. 5А). Остановка обратной транскрипции происходила на нуклеотидном остатке 927 16Э рРНК (рис. 5Б) Следовательно, нуклеотндный остаток 0926 был ковалентно связан с мРНК. Только нуклеотндный остаток +2 (и в инициаторном АиО-кодоне) мог содержать остаток диазиринового производного 5-метиленаминоуридина во всех используемых мРНК. То, что именно этот остаток образует пришивку к нуклеотидному остатку 0926 16Э рРНК, было доказано с помощью Т1-фингерпринта. Пятно, соответствующее фрагменту мРНК ААААААА'2иОр, отсутствовало на фингерпринте пришивки (рис 5В)

Особенно интересным в данном случае является то, что нуклеотндный остаток +2, образующий пришивку, входил в состав кодон-антикодонового дуплекса Р-сайта. Подобная пришивка была бы невозможна для

фотоаффинпого реагента "нулевой длины". Структура диазиринового производного 5-мегиленаминоуридина позволяет фотоаффинной диазириновой группе, не нарушая комплементарных взаимодействий, выступать из большой бороздки кодон-антикодонового минидуплекса.

А.

1.2.3. 12з

Б.

В.

МП-

55 — 25--

асй т х.к.хзкз

25

500

№ - Г?1-:; 550 1,4

600

ь т *

(О

«4Г

4

(¡1)

5

* +12

12 3 4

5'-СССААССАСС*и1Ю*ЦАУС СиСй ААСЦС ССАССАС

Рисунок 4. Анализ пришивки 6-тиогуаношна, находящегося в положении + 12 кодирующей области мРНК к нуклеотидному остатку С530 16Б рРНК. А: Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего фрагменты 168 рРНК, сшитой с мРНК 07.12 На схеме справа от радиоавтографа А. показаны песта разрезания 165 рРНК РНКазой Н для каждой из дорожек. Стрелками покатаны полосы, соответствующие фрагментам 168 рРНК, ковалентно связанным с мРНК и указана длина этих фрагментов. Б. Анализ пришивки с помощью обратной транскрипции. Буквами А,С,в и II покачаны дорожки енквенса 165 рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие продукты обратной транскрипции фрагмента 165 рРНК приннггото к мРНК С7,12 к свободного. Стрелкой покачана полоса, соотвегств)ющая месту остановки обратной транскршгтазы за один нуклеотидный остаток до места пришивки В 'П-фингерпрннты (1) мРНК G7.ll в свободном виде и (11) ковалентно связанной с фрагментом 165 рРНК На сче.че под рисунком покатана последовательность мРНК й7,12 и cxc.ua ее гидролиза РНКазой 'П Радиоактивные фрагменты мРНК подчеркнуты н пронумерованы также, как соогветств)Юнше пятна на фннгерпрннте. Звездочками обозначены радиоактивные фосфатные группы Стрелкой покатано место нанесения образца. Первое направление двумерной хроматограммы справа налево, второе снизу вверх.

Таким образом, обнаружено 3 новых пришивки мРНК к 168 рРНК Нуклеотидный остаток +2 мРНК образует пришивку к нуклеотидному остатку в926 16Б рРНК. Нуклеотпдные остатки +8 и +9 мРНК, образуют пришивки к нуклеотидному остатку А1196 168 рРНК, а нуклеотидный остаток +12 мРНК образует пришивку к нуклеотидному остатку 0530 16Б рРНК (рис. 6)

А. Б. 1. 2.

А С G Т X К

В.

135

ми-

Ш)

2

1 2 *+2 *+7

5'-GGGAAGGAGG AAAAAAAUG G AAUACCG GAAACGACAG

Рисунок 5 Анализ пришивки диазирннового производного 5-метиленаминоурндина, находящегося в положении +2 кодирующей области мРНК к нуклеотидному остатку G926 16S рРНК. А- Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего фрагменты 16S рРНК, сшитой с мРНК U7 Места гидролиза 16S рРНК РНКазой Н одинаковы в обеих дорожках и приблизительно сооответствуют нуклеотндным остаткам 920 и 1055 16S рРНК. Стрелкой показана полоса, соответствующая фрагменту 16S рРНК с 920 по 1055 нуклеотидный остаток, ковалентно свя занному с мРНК U7. Первая дорожка сооветствуег комплексу рибосомы с мРНК н тРНКгМе', а вторая - комплексу в отсутстви тРНК Б Анализ пришивки с помощью обратной транскрипции. Б)кь«>мн А.С.П и U показаны дорожки сиквенса I6S рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие прод>кты обратной транскрипции фрагмента 16S рРНК пришитого к мРНК U7 и свободною Стрелкой показана полоса, соогветсгвующая месту остановки обратной транскриптазы за один нуклеотидный осгагок до места пришивки. В. Tl-фннгерпршггы (1) мРНК IJ7 в свободном виде и (И) ковалентно связанной с фрагментом 16S рРНК. На схеме под рисунком показана Поспеловагельностъ мРНК U7 и с.чема се гидролиза РНКазой Т1. Радиоактивные фрагмешы мРНК подмеркн)ты и пронумерованы также, как соответствующие пятна на фингерпринте. Звездочками обозначены радиоактивные фосфатные группы.Стрелкой показано место нанесении образца Первое направление двумерной хроматограммы справа налево, второе снизу вверх

МОДЕЛЬ ВЗАИМОРАСПОЛОЖЕНИЯ ЭЛЕМЕНТОВ ДЕКОДИРУЮЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМЫ В ПРОСТРАНСТВЕ Анализ даных о пространственном окружении отдельных нуклеотндпых остатков мРНК, полученных как в настоящей работе, так и ранее, а также данных о взаимодействии тРНК и рибосомных белков с 16S рРНК позволил предложить модель взаиморасположения элементов декодирующего центра рибосомы в пространстве (рис. 7).

Ш

2

Рисунок 6 Схема пришивок мРНК к компонентам декодирующего центра рибосомы. м('11К покаиша юрнюнталышн линией в центре рисунка. Курсивом выделена последовательность Шайна-Далыарно. Буквами AUG обозначен ишщнаторный кодии. Нуклеотидные ocraïKii кодирующей иоллстн пронумерованы, начиная с А в AUG-кодоне Черными квадратами отмечены пришивки, впервые полученные в дайной paôoie

Согласно данным электронной микроскопии, 5'-нетранслируемая область мРНК расположена между головой и "боковым выступом" малой субчастицы рибосомы Перед кодоном Р-сайга мРНК делает изгиб таким образом, что кодирующая область мРНК направляется в "туннель" в "шее" малой субчастицы. При этом кодон-антикодоновые дуплексы А и Р-сайтов находятся около входа в туннель со стороны межсубчастичмого пространства 11 области кодон-антпкодоновых дуплексов (нуклеотидные остатки +1 - +6 кодирующей области), мРНК должна быть направлена 5'-концом в сторону большой субчастнцы. Это требование обусловлено расположением нуклеотпдов антикодона тРНК

Пришивки спейсерной области мРНК к нуклеотидному остатку 665 IbS рРПК (рис. 6) и белкам "бокового выступа" S18, S21 и SU, описанные ранее длм мРНК, содержащих остатки 4-тноуридина и 5-йодуридина, подтверждают данные иммуноэлектронной микроскопии о локализации спейсерного участка мРНК между головой и "боковым выступом" малой субчастицы. При различном расстоянии между последовательностью Шайна-Дальгарно и иницнаторным AUG-кодоном более длинные спенсеры выпетливаются вверх, контактируя с пуклеотидным остатком 1360 16S рРНК и белком S7 (рис. 6) в "голове" малой субчастицы

Рисунок 7 Модель взаиморасположения элементов декодирующего центра рибосомы в пространстве. В представленной проекции "голова" малой субчастнцы находится сверху, большая субчастнца справа Черным цветом покачан антнкодон тРНК в Р-сапте В центре показана мРНК от 3' конца слева до 5' конца справа. Нуклеотиды мРНК и 16S рРНК, образующие пришивки занлрнчованы однотипно. Символами S2, S3, S5 и S7 отмечены примерные положения соответствующих рпоосомных белков Символами Н18, Н28, Н34 и Н44 показаны спирали I6S рРНК, обра}ующие декодирующий центр

Перед кодомом Р-сайта мРНК делает изгиб вокруг спирали 28, соединяющей "тело" и "голову" 30S субчастицы. При этом большая бороздка кодои-аитикодоиового дуплекса Р-сайза пространственно сближена с нуклеотидным остатком G926 спирали 28 (рис. 7) Ниже кодон-антикодонового дуплекса н примерно коакспально ему проходит спираль 44. Принадлежащий ей нуклеотидный остаток CI402 находится в контакте с нуклеотидным остатком -14 мРНК В то же время нуклеотидные остатки 1408-141 1 спирали 44 пространственно сближены с большой субчастицей Соединение спиралей 44 и 28 происходит дальше от 50S субчастнцы, в районе за нуклеотидным остатком +7 кодирующей области мРНК. Этот нуклеотидный остаток мРНК сближен с нуклеотидным остатком С1395 спирали 28 16S рРНК (рис. 7)

Еще дальше от большой субчастицы, в районе нуклеотндных остатков + 10 - +12 кодирующей области мРНК, расположена спираль 18 (рис. 7).

Сверху от мРНК, с З'-концевой стороны мРНК от колона А-сайта, расположена спираль 34 (рис. 7). Нуклеотидный остаток U1052, находящийся в этой спирали, пространственно сближен с нуклеотидным остатком +6 кодирующей области мРНК, а нуклеотидный остаток Al 196 - с +8 и +9 нуклеотидными остатками мРНК. Направление спирали 34 примерно

перпендикулярно мРНК, причем ее сторона, образованная нуклеотидпымн остатками 104fc>/1211 располагается ближе к "боковому выступу", а образованная нуклеотидными остатками 1067/1189 - на противоположной от "бокового выступа" стороне "головы" малой субчастицы (рис. 7). Подобное расположение спирали 34 позволяет предположить, что в процессе декодирования' спираль 34 фиксирует мРНК, обеспечивая точность трансляции Это предположение подтверждается литературными данными об эффекте мутации нуклеотидных остатков, принадлежащих этой спирали

При транслокацин, когда жесткая фиксация мРНК нежелательна, спираль 34 должна перемещагся наверх. Можно предположить, что именно такое перемещение и вызывается доменом !V EF-CJ, необходимым для траислокации и взаимодействующим с 30S субчастпцеи.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОГО ОКРУЖЕНИЯ 5S рРПК В РИЬОСОМЕ С ПОМОЩЬЮ ДИАЗИРИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 5-МЕТИЛЕНАМИ110УРИДИНА и 2'-ДЕЗОКСИ 2'-АМИНОУРИДИНА В отличие от малой субчастицы, структурная организация большой субчастнцы изучена гораздо хуже. Сравнительно мало известно о пространственном окружении 5S рРНК, которая вместе с белками L5, LIS н L25 входит и состав центрального протуберанца большой субчастицы Ранее, при использовании в качестве фотоаффииного реагента 4-т иоурндпна, были выявлены 2 нуклеотдных остатка 23S рРНК, пространственно сближенные с нуклеотпдным остатком U89 D-петлп 5S рРНК. Нуклеотиднып остаток А960 входит в состав домена 11 23S рРНК, содержащего т.н. "ОТРазный центр", а нуклеотидный остаток С2475 - принадлежит домену V, содержащему пептидилтрансферазнос "кольцо". Для получения дополнительной информации о пространственном окружении 5S рРНК в рибосоме было решено использовать диазириновые производные 5-метиленампноуридипа и 2'-дезокен-2'-аминоуридина.

После транскрипции и модификации, 5S рРНК, содержащая в среднем две фотоаффинные группы на молекулу, вместе с 23S рРНК и белками большой субчастнцы, использовалась для реконструкции 50S субчастиц и, при добавлении 30S субчастиц, 70S рибосом. Выход реконструкции, и особенно ассоциации субчастиц, был ниже, чем для немодифицированного 5S рРНК-транскрипта Известно, что химическая модификация определенных положении рРНК может препятствовать связыванию лигандов с рибосомой. Наличие дназириновых производных в 5S рРНК, реконструированной в 50S субчастпцу и 70S рибосому, было проверено с помощью обратной транскрипции (рис. 8)

Остатки диазиринового производного 2'-дезокс11-2>-амшюурпд1ша препятствовали обратной транскрипции, поэтому на радиоавтограмме, соответствующей модифицированной 5S рРНК, наблюдаются полосы, соответствующие остановкам обратной транскриптазы за один нуклеопщнын остаток до всех остатков уридина в 5S рРНК.

ACGU123

60 -

Рисунок 8. Анализ распределения остатков дназнринового производного 2'-дезокси-2,-аминоуридина в 5S рРНК с помощью обратной транскрипции. Дорожки, обозначенные буквами A,C,G и U, содержат продукты обратной транскрипции 5S рРНК в присутствии, соответственно, ddTTP, ddGTP, ddCTP и ddATP В дорожке I представлены продукты обратной транскрипции 5S рРНК, содержащей остатки дназнринового производного 2'-деюксп-2'-а.м!1ноурпдина, распределенного случайным образом по всем положениям 5S рРНК, занимаемым уриднном. Дорожки 2 и 3 соо i ветствуют 5S рРНК, реконструированной в 50S субчастицу (2) и 70S рибосому (3). Стрелками обозначены полосы, соответствующие ост;шовкам обратной транскриптазы la I нуклеотидный остаток до дназнринового производного 2,-дезокси-2,-аминоурнднна. Треугольниками постланы полосы, соответствующие тем положениям, где наличие диазнринового производного 2'-дезоксн-2'-амнноуриднна препятствует ассоциации субчастиц.

В дорожке, соответствующей 5S рРНК-транскрииту, реконструированному в 50S субчастицу, а затем выделенному из нее, полосы, соответствующие нуклеотидным остаткам U48, U55, имеют меньшую интенсивность. В случае 5S рРНК, выделенной из 70S рибосом, полностью отсутствуют полосы, соответствующие нуклеотидным остаткам U40, U48 и U55. Это значит, что реконструироваться в 50S субчастицу могут лишь те 5S рРНК (и, соответственно, ассоциировать с 30S субчастицен могут лишь те 50S субчастицы), в которых указанные нуклеотидные остатки не модифицированы. Эти данные хорошо коррелируют с данными о защите 30S субчастицей тиофосфатных групп при нуклеотидных остатках U48 и U55 5S рРНК в составе 50S субчастицы от расщепления йодом.

50S субчастнцы и 70S рибосомы, в состав которых входила радиоактивно меченная 5S рРНК, содержащая фотоаффинные группы, облучались мягким УФ-светом. После образования пришивок, 23S рРНК, коиалетно присоединенная к 5S рРНК, выделялась с помощью ультрацентрифугирования, аналогично 16S рРНК, ковалентно связанной с мРНК Анализ пришивок проводился с помощью гидролиза 23S рРНК РНКазой II в присутствии пары олигодезоксирнбонуклеотидов, комплементарных желаемым местам разрезания, метода обратной транскрипции и метода Т1-фингермринтов 5S рРНК, содержащие как дпазириновые производные 5-метнленамнноурндина, так и 2'-дезокси-2'-аминоуридина, образовывали пришивку к участку 23S рРНК, ограниченному нуклеотидными остатками 9401010 (рис 9А). Анализ места пришивки с помощью обратной транскрипции

m¡

I

показал, что пришивка происходит к нуклеотидиому остатку 11958 235 р1'11К (рис. 9Б). На Т1-фингерпринте 5Б рРНК, ковалентно связанной с 238 рРНК, снижалась подвижность фрагмента, содержащего О-петлю 58 рРНК (рис. 9В). Полученные данные подтверждают пространственную сближенность О-пигли 5Б рРНК и петли, замыкающей спираль 39 238 рРНК, впервые показанную с помощью 58 рРНК, содержащей остатки 4-тноуридина.

А. Б. В.

А С й и X К.

Рисунок 9. Анализ пришивки диазнринового производного 5-ме-гнленамнноурнднна, находящегося в петле Э 55 рРНК к нуклеотидиому остатку С}58 23Б рРНК. А: Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего радиоактивную 5$ рР11К, ковалентно свяшнную с фрагментом 235 рРНК с У40 по 1010 нуклеотидный остаток. Стрелками показаны полосы, соответствующие рРНК и 55 рРНК, новалешзю связанной 35-нуклеотидным фрагментол! 235 рРНК. Ь Анализ места пришивки с помощью удлпннення праймера обратной транскриптазой Буквами А,С,С! и и показаны дорожки сиквенса исследуемого фрагмента 23Б рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие продукты обратной транскрипции фрагмента 235 рРНК пришитого к 55 рРНК и свободного. Стрелкой покашна полоса, соответствующая месту остановки обратной транскрштгазы. В. Т1-фингерпринты (1) 5Б рРНК в свободном виде и (II) ковалентно свя шпион с фрагментом 23Б рРНК. На схеме под рисунком показана последовательность 55 рРНК и схема ее гидролиза РНКазой Т1. Первое направление двумерной хроматограммы справа налево, второе снизу вверх. Пятно, соответствующее фрагменту исиССССА11Ср, образующему Б-петлю 55 рРНК, обозначено буквой К. Менее подвижный ковалешный комплекс этого фрагмента с фрагментом 235 рРНК обозначен буквой X.

Кроме пришивкп к нуклеотидному остатку 958, 58 рРНК, содержащая диазириновые производные 5-метиленаминоуриднна, образовывала пришивки к участкам, ограниченным нуклеотидными остатками 1010-1045 (рис. 10А) и 1045-1250 (рис. НА) 238 рРНК. Обратная транскрипция останавливалась на нуклеотидных остатках 1139 и 1023 238 рРНК. Таким образом, 58 рРНК была ковалентно связана с нуклеотидными остатками 138 и А1022 23Я рРНК Как показал анализ с помощью Т1-фингерпринтов, эти пришивки также образовывала петля Р 58 рРНК.

Таким образом, были найдены пришивки петли О 58 р1'НК к нуклестшным остаткам 11958, А1022 и 01138 238 рРНК (рис. 12). Нуклеотндные остатки 1022 и 1138 принадлежат участкам домена II 235 рРНК, соединяющим т.н. "СТРазный центр" с остальной частью 238 рРНК. С "ОТРазным центром" взаимодействуют фактор элонгации в, катализирующий транслокацию, н ингибнрующий транслокацию антибиотик тиострептон. Кроме того, иуклеотиднын остаток 1138 входит в состав функционально важного псевдоузла, необходимого для ассоциации рибосомных субчстнц. - т

А. Б.

А С О и X, Хг X, X, К, К2

Рисунок И). Анализ пришивки дшпнринового производного 5-меткленам1шоуридина, па.чиднтсЕОсч в петле D 5S pi'HK к нуклеотидному остатку G1022 23S рРНК. А: Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего радиоактивную 5S рРНК, ковалентно связанную с фрагментом 23S рРНК 1011) по 10-15 иуклеотиднын остаток Стрелками показаны полосы, соответствующие 5S pi'HK ч 5S рРНК, ковлленто святимой СО-нуклсотндньш фрагментом 23S рРНК. Б. Анализ места пришивки с помощью удлиннения пранмера обратной транскригттазой. Буквами A,C,G и U показаны дорожки сиквенса исследуемого фрагмента 23S рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие продукты обра той транскрипции фрагмента 23 S рРНК приидггого к 5S рРНК И свободною. Стрелкой поклмна полоса, соответствующая месту остановки обратной транскршпаш

Не исключено, что нарушение структуры этого псевдоузла приводит к дефектам в связывании 5S рРНК, и, уже как следствие, влияет на ассоциацию субчастиц. В данной работе было показано, что модификация остатков U40, U48 и U55 58 рРНК препятствует ассоциации субчастиц. Из литературных данных известны также мутации 58 рРНК, имеющие сходный эффект (Goringer, Wagner Biol. Chem Hoppe Seyler, 1986, v 367, pp 769-780).

Ранее, с помощью 4-зпоуридпна, была доказана пространственная сближенность 5S рРНК с нуклеотндным остатком С2475, расположенном во вторичной структуре 23S рРНК рядом с пептидплтрансферазным центром Таким образом, 5S рРНК соединяет малую субчастицу рибосомы с двумя

функциональными центрами большой субчастицы Этт факт позволил предиолжить, что 5Б рРНК может участвовать в передаче аллостерическнх сигналов в рибосоме.

А. Б.

А С виКХ

Рисунок П. Анализ пришивки диазнрннового производного 5-метиленамптю)рпднна. находящегося в петле О 5Б рРНК к нуклеотидному остатку (¡113235 рРНК. А: Радиоавтограф 4% ПААГ, содержащего радиоактивную рРНК, ковалсктно связанную с фрагментом 2 рРНК с 1045 по 1250 нуклеотндный остаток. Стрелками показаны полосы, соответствующие рРНК и 58 рРНК, ковалентно связанной 205-нуклеотидиым фрагментом 235 рРНК. Б Ана/ш 1 места пришивки с помощью обратной транскрипции. Буквами А,С,в и и показаны дорожки сиквенса исследуемого фрагмента 235 рРНК. X и К обозначают дорожки, содержащие продукты обратной транскрипции фрагмента 23Я рРНК пришитого к 55 рРНК и свободною. Стрелкой покатана полоса, соответствующая месту остановки обратной транскриптазы.

Недавно в совместном работе с лабораторией Л. Далберга намн были получены убедительные результаты, подтверждающие функциональную важность петли спирали 39 238 рРНК. С помощью сайт-направленного мутагенеза было показано, что замены А960и и Д960С замедляют рост бактерий и вызывают изменение конформации пептидилтрансферазпого центра Полученные данные косвенно подтверждают, что шпилька 39 23Я рРНК участвует в передаче аллосгерпческого сигнала между пептпднлтрансферазным п "ОТРазпым" центрами рибосомы, осуществляемого после пептидилтраисферазной реакции и позволяющего связывание ЕР- О. Возможно, что в этом процессе принимает участие н 58 рРНК.

i а в м | с и ■ о-

'0„ССи. 20 г.ис,- 30 гсссА " "

5' иССС1ЮСССОс Асс ссссись С а с С и й А "

3' uacggaccguc

agg •с70

g •с

а • g

и • а v

g • и

а • g

100 g • g

е а • и

g •а

с • g

g • иво

и • g

а • и

с •g l v

с • g

с • g

90 с • g

и и

d , с

cgugccgc. .guggacur „с g v 60 a" ja-a50 j a*gc

5S рРНК

GCU°AUACCOCC II- I - I II I I I ССО и О и GG С О О

Смираль 89

Спираль 39

Рисунок 12 Схема пришивок 5S рРНК к 23S рРНК Сгрслкамн обозначены пришивки 5S рРНК к нуклеотидным остаткам 23S рРНК Черными квадратами отмечены пришивки, впервые полученные в данной рабооте. Велымн треугольниками показаны нуклеотндные остатки 5S рРНК. модификация которых ухудшает реконструкцию 5S рРНК в 50S субчасгицу Черными треуюлышками отмечены те положения 5S рРНК, где присутствие дна трипового производного 2'-лезоксн-2'-амнноурпднна препятствует ассоциации субчастпц.

ВЫВОДЫ

1. Найдены условия введения в РНК новых фотоаффинных реагентов: диазприновых производных 5-метнленамнпоуридина и 2'-дезокси-2'-амнноуриднна,

2. С помощью мРНК, содержащих остатки 6-тпогуанозина, установлена пространственная сближенность положений +8 и +9 мРНК и нуклеогидиого остатка Л1196 168 рРНК, а также положения +12 мРНК п нуклеотидного остатка Л530 168 рРНК в ннициаторном комплексе рибосомы с мРНК и тРНКЛ'.

3 С помощью мРНК, содержащих остатки диазнрниового производного 5-метнленамипоурпднна, установлена пространственная сближенность

положения +2 mI'HK и нуклеотндного остатка G926 16S pI'IIK в шпщнаторпом комплексе рибосомы с mI'HK и тРНК"1'.

4. На основании полученных данных, предложена модель пространственного взаиморасположения элементов декодирующего центра рибосомы.

5. Установлено, что замещение остатков урндина U40, U48 и U55 5S рРНК на остатки диазиринового производного 2'-дезоксн-2'-ампноуридппа препятствует ассоциации рпбосомных субчастиц.

6. С помощью 5S рРНК, содержащей остатки диазириновых производных 5-метиленаминоуриднна и 2'-дезоксн-2'-амииоуридипа, установлена пространственная сближенность D-петли 5S рРНК с пуклеотиднымн остатками U958, А1022 и Gl 138 23S рРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМИ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bogdanov A, Dontsova О., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S, Laviik 1., Alekseeva К , Spanchenko О., Sergiev P., Baranov P , Sliirokova E., Nierliaus K., and Brimacombe R. Thio-substitutcd derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies.//Nucl Acids Symp. Ser. - 1994 - v. 31. - p. 273-274. 2 Dontsova O.A., Dokudovskaya S.S., Lavrik I.N., Baranov P.V., Sergiev P.V., Bogdanova S.L., Bogdanov A.A , Rinke-Appel У and Biiniacombe R II Program of the International Conference on the Structure and Function of the Ribosome: Frontiers in Translation. - 1995 - Victoria. - Canada.

3. Bogdanov A., Dontsova O., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S., Laviik I , Alekseeva E., Shpanchenko O., Sergiev P , Nierliaus K. and Brimacombe R. Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies.// Third International Symposium on Bioorganic Chemistry. - 1995 - Dagomys. - Russia -Abstract book. - p.4,

4. Dontsova O., Dokudovskaya S , Baranov P., Sergiev P., Shpanchenko O., Brimacombe R. and Bogdanov A. rRNA contacts inside the ribosome: cross-linking study.// RNA'96 The First Annual Meeting of The RNA Society. - 1996 -Wisconsin-Madison. - USA. - Abstract book. - p. 175.

5. Sergiev P.V., Lavrik I N , Wlasoff V.A , Dokudovskaya S.S., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. and Brimacombe R. The path of mRNA through the bacterial ribosome: A site-directed cross-linking study using new pliotoreactive derivatives of guanosine and uridine // RNA. - 1997-v. 3. - p. 464-475.

6. Sergiev P.V., Dokudovskaya S.S., Topin A., Petrov A, Shpanchenko O.V., Dontsova O.A., Brimacombe R. and Bogdanov A.A. The environment of 5S rRNA in the Escherichia coli ribosome: a cross-linking study.// Nucl Acids Symp. Ser. -1997 - v. 36. - p. 181-183.

7. Baranov P.V., Sergiev P.V., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. and Brimacombe R. The Database of Ribosomal Cross links (DRC).// Nucl. Acids Res. - 1998- v 26 -p. 187-189

8. Sergiev P , Dokudovskaya S., Romanova E , Topin A , Bogdanov A., Brimacombe R. and Dontsova O. The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA.// Nucl. Acids Res. - 1998 - v. 26. - p. 2519-2525.

9. Сергиев П В , Лаврик H.H., Докудовская С.С., Донцова O.A. и Богданов A.A. Строение декодирующего центра рибосомы.// Биохимия - 1998 - т.63 - вып. 8.-с. 1129-1143.

Подписано в печать 0& 1998 года.

Заказ N? 73 . Формат 60 х 90/16. Усл. печ. л. /.2ö

Тисаж fOO экз. Отпечатано на ризографе.