Исследование взаимодействия тРНК с рибосомой методом импульсной фотоаффинной сшивки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

5 ЛН?

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БОЧКАРЕВ ДМИТРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

УДК: 547.953.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРНК С РИБОСОМОЙ МЕТОДОМ ИМПУЛЬСНОЙ ФОТОАФФИННОЙ СШИВКИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель

доктор химических наук А. С. Гиршович

Оффициальные оппоненты

доктор химических наук А. И. Копылов

кандидат биологических наук Е. К. Давыдова

В едущая -организ ация

Институт биоорганической химии РАН

Защита состоится «2.0ч й.^/1^») 1993г. в ^^ часов да заседании специализированного ученого совета Д 053.05. 47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория

5о1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан

го .

1993г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одних из важнейших аспектов в понимании

молекулярного механизма трансляции является изучение взаимодействия рибосомы с еб макромолекулярными лигандами ^ША, тЕМА, факторами трансляции и др.). Применение аффинных химических и фотохимических сшивок, иммунной электронной микроскопии и других подходов позволило к настоящему времени получить определённое представление о компонентах и локализации на рибосоме ей основных функциональных центров. Однако, постановка экспериментов с использованием этих подходов такова, что анализируется конечное состояние системы, уже пришедшей в состояние стационарного равновесия.

В то же время очевидно, что взаимодействие рибосомы, как и любой другой сложной биологической системы, со своими лигандами является динамическим процессом, проходящим, как правило, не в одну стадию. Поэтому изучение механизма трансляции требует получения информации о динанике функционирования рибосомы. В частности, необходимо знать каким путём (г.е. через какие промежуточные состояния) лиганд достигает участка рибосомы, в котором он осуществляет свою функцию. Очень важна информация о возникновении и природе транзитных взаимодействий лигандов друг с другом на рибосома, например, при образовании инициаторного комплекса и прохождении отдельных стадий элонгационного цикла.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы была разработка общего методического подхода к изучению динамики функционирования рибосомы и демонстрация первых результатов его использования. В конкретные задачи работы входило:

1) разработка и создание экспериментальной установки, сочетающей быстрое смешение компонентов исследуемой реакции, инкубацию реакционной смеси в течение точно задаваемого интервала времени и последующее облучение импульсом света большой мощности для быстрой ковалентной фиксации состояния реакционной смеси;

2) применение этого подхода для изучения динамики взаимодействия с различными функциональными участками рибосомы и влияния на этот процесс факторов элонгации.

Научная новизна. В работе проведено сравнение фотохимических свойств ряда фотоактивируемых арилтрифторметилдиазириновых реагентов - предшественников карбонов при облучении их обычно применяемых для этого источником света- не очень большой интенсивности и в импульсном облучателе большой мощности, а также показана применимость последнего для очень быстрого (0.4мс) импульсного фотолиза фотоактивируеиых реагентов. Разработаны методы получения и исследованы свойства фотоаффинных арилтрифторметилдиазириновых аналогов Phe-tRNA и Lys-tRHA. С применением этих аналогов исследована динамика взаимодействия tRNA с а- и р-участками рибосомы, а также влияние на этот процесс матричной РНК и факторов элонгации EF-Tu и EF-G.

Практическая ценность. Разработан общий методический подход, позволяющий расширить область применения метода фотоаффинного мечения для исследования динамики функционирования биологических макромолекул и их сложных комплексов в миллисекунднок и секундном временных диапазонах. Разработанный метод и экспериментальная установка могут быть использованы для наследования динамики функционирования не только рибосомы, но и других биологических объектов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывалась на 13-ом международном симпозиуме посвященном tRHA (Ванкувер, Канада, 1989); на международной конференции «Биосинтез белка» (Пущино, 1991); на семинаре Института молекулярной генетики общества Макса Планка (Берлин, ФРГ, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, специальный раздел, посвящённый терминологии, обзор литературы по методам исследования быстрых биологических процессов, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Диссертация изложена на 129 страницах, включает 2 таблицы и 31 рисунок. Список литературы включает 120 источ ников.

- 3 -

МЕТОД ИМПУЛЬСНОЙ ФОТОАФФИННОЙ сшивки.

Основная суть предлагаемого метода сводится к фиксации промежуточных состояний, возникающих в процессе взаимодействия биологических накронолекул друг с другом, таким способом, чтобы иметь возможность затем анализировать эти промежуточные состояния и на основе этого анализа делать выводы о возможных механизмах изучаемого процесса.

Так как биологические процессы обычно идут с очень большой скоростью, необходимо инеть возможность инициировать изучаемый процесс одновременно и достаточно быстро во всём объёме исследуеной реакционной смеси. Для этого вполне подходит быстрое и гомогенное смешивание отдельных компонентов, участвующих в исследуеном процессе, с помощью техники «остановленного потока» ("зЪэррей-Иоы").

Фиксировать промежуточные состояния исследуемого процесса лучше всего путём быстрого образования в нужный момент времени стабильных ковалентных связей между взаимодействующими компонентами, находящимися в этот момент времени в непосредственном контакте. Для этой цели подходит метод фотоактивируемых аффинных сшивок, так как облучая исследуемую реакционную смесь в нужный момент времени, мы будем ковалентно фиксировать состояние системы именно в этот момент времени. При этом, с одной стороны, время облучения исследуемой реакционной смеси должно быть минимальным, чтобы фиксируемое состояние было как можно более гомогенным, с другой стороны, облучение должно быть достаточно интенсивным, чтобы выход фиксируемого состояния был максимально возможным. Для выполнения этих условий необходим специальный импульсный облучатель большой мощности.

Третьим условием выполнения поставленной задачи является тщательный выбор фотоактивируемых реагентов. Большинство фотоактивируемых реагентов, применяемых в настоящее время, обладает рядом свойств, делающих невозможным их применение в методе быстрых фотосшивок. Это, во-первых, некоторая реакционная способность многих фотоактивируемых групп и без облучения, что может в некоторой степени фиксировать промежуточные состояния системы, существовавшие ещё до начала облучения; и во-вторых, медленные темновые реакции, характерные

также для многих фотоактивируемых групп, что может привести к фиксации промежуточных состояний системы, которые возникнут уже после окончания облучения, в начале 80-х годов в качестве фотоактивируемой группы для метода фотосшивок была предложена арилтрифторметилдиазириновая группа [Brunner et aj.(1980) J. Biol. Chem., 255, 3313-3318]. Эта фотоактивируемая группа полностью лишена упомянутых выше недостатков и в настоящее время кажется практически идеальной для фотосшивок вообще и для применения в методе быстрых фотосшивок в частности. Единственным недостатком арилтркфторметилдиазкринов является весьма сложный синтез реагентов, содержащих эту группу. Несмотря на трудности синтеза, к настоящему времени уже

£=^=3-4

таймер

блок управления смесителями

Рисунок 1.

Принципиальная схема установки облучения.

% ячейка для облучения Ь импульсные лампы С приёмник облучённой смеси М,0 смесители Г, Б газовые клапаны

быстрого смешения - импульсного

- электрические цели питания

—»— цепи синхронизации

- цепь поджига ламп

•= жидкостные коммуникации 1,2,3,4 шприцы для реагентов

синтезировано довольно иного как узкоспецифичных, так и достаточно универсальных фотоактивируекых реагентов на основе арилтрифторметилдиазириновой группы.

Для реализации метода импульсной фотоаффинной сшивки была создана экспериментальная установка, состоящая из блока быстрого смешивания, импульсного облучателя большой мощности и устройств, синхронизирующих их совместную работу, принципиальная схема установки показана на рис. 1. Установка имеет следующие технические параметры: время полного смешения равных объёмов растворов по 150мкл - 7нс; длительность импульса света на уровне 0.33 от максимальной интенсивности - 0.4мс; интервал времён задержки между окончанием смешивания и началом облучения, задаваемых таймером - от 1мс до 99.999с с шагом в 1кс.

Для контроля эффективности фотолиза при импульсном облучении проводилось сравнение УС-спектров поглощения продуктов фотолиза 4-(3-(трифторметил)диазирин-3-ил)бензойной кислоты при облучении непрерывным потоком света с длиной волны более ЗООнм и при облучении единичным импульсом света в импульсном облучателе, который является частью

экспериментальной установки. Результаты сравнения представлены на рисунке 2. Из рисунка видно, что одного импульса облучения достаточно для практически полного фотолиза фотореагента.

ТОВ

1 — Без облучения

Обычное облучение:

2 — 15 секунд

3 — 30 секунд

4 — 1 минута

5 — 2 л/инуты

Импульсное облучение: — — — один шипульс

з£о *6й

_ _ Алина Кол ни, нл

Рисунок 2.

Изменение спектров поглощения света при фотолизе раствора в метаноле 4-(3-Стрифторметил)диазирнн-3-ил)бензойной кислоты. Полоса поглощения с X - 350нм соответствует диазириновой группе. ***

10 15 20

Но/иера фракциа

з ЗООО'

о юоо

o.-fcfc*

Илпульсное облучение Обычное облучение Без облучения

TD0-DJ— ClPhe-tRNA Ас—lU-,4CJPhe—tRNA

5 10 15 . 20

Но/иера фракциа

Рисунок 3.

Профили радиоактивности во фракциях сахарозного градиента после ультрацентрифугирования рибосомных комплексов в условиях диссоциации субчастиц.

(A) Сравнение эффективности пришивки при обычном и импульсном облучении. Комплекс 70S-poly(U)-TDB-[U- C]Phe-tRNA облучали обычным способом, в импульсном облучателе (один импульс) или не облучали. Анализировали распределение [иС]-метки между рибосомнцми субчастицами.

(B) Отсутствие прямых индуцированных светом сшивок не обусловленных наличием фотоактивируемого реагента при импульсном облучении. Облучали одним световым импульсом комплекс '70S*poly(U)*TDB-[U- С]Phe-tRNA либо комплекс 70S-poly(U) 'Ас-[tí— С] Phe-tRNA.

Пунктирной линией (----) показана оптическая плотность.

Для проверки возможности использования импульсного облучения для сшивок, получали (без быстрого смешения) комплекс 70S-poly(U) •TDB-[14C]Phe-tRNA. Этот комплекс облучали как обычным методом, так и в импульсном облучателе, а затем анализировали для обоих случаев распределение пришивки между рибосомными субчастицами. Анализ проводили центрифугированием в сахарозном градиенте в условиях диссоциации субчастиц (рис. 3). Для контроля полноты диссоциации и отделения непришитой tRNA от субчастиц, центрифугировали такой же комплекс, но не подвергавшийся никакому облучению. Для контроля отсутствия темновых реакций, облучали раствор TDB-[14C]Phe-tRNA, к которому затем добавляли все остальные компоненты комплекса. Для контроля отсутствия прямых индуцированных светом сшивок (образующихся не за счёт фотометки), облучали комплекс 70S-poly (ü) •Ac-[14C]Phe-tRNA, в котором tRNA содержит вместо фотоматки ацетильную группу. Из рисунка 3 видно, что:

- пришивка идёт исключительно за счёт фотометки;

- непришитая tRNA полностью диссоциирут из рибосомы;

- эффективность пришивки при импульсном облучении практически

не отличается от эффективности пришивки при обычном облучении.

ДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ tRNA С РИБОСОМОЙ

Для изучения динамики взаимодействия tRNA с разными участками рибосомы в диапазоне малых времён, один шприц установки заполняли раствором рибосон (или требуемого рибосомного комплекса), а другой шприц - раствором какого-либо фотоактивируемого аналога tRNA (или его тройного комплекса с фактором элонгации EF-Tu и GTP). Равные объёмы растворов быстро смешивали в установке и, после инкубации при комнатной температуре в течение различных интервалов времени, смеси облучали единичным световым импульсом и затем анализировали распределение пришивки. Во всех описываемых далее экспериментах пришивка происходила в основном к 50S субчастице, а в составе 50S субчастицы - в основном к 23S RNA. Пришивка к SOS субчастице коррелирует с другими данными по расположению на ней пептидил-'трансферазного центра.

Динамика связывания ЬША в р-учаслюк рибосомы.

Анализ кинетических кривых нечения рибосом при связывании Т0В-[14С]Р11е^ШАр|1<> в диапазоне малых времён выявляет резкий эффект ро1у(и) на степень мечения р-участка (рис. 4): в присутствии матрицы отчетливо выявляется быстрая фаза с т1/г примерно 90мс, на которой в рибосому включается примерно половина всей потенциально включаемой метки. В опытах без ро1у(и) быстрая фаза отсутствует. При этом, ро1у(и)-независимое мечение р-участка представляет собой небольшую, но количественно детектируемую величину, нэ зависящую от времени инкубации вплоть до 5 с. Это позволяет предположить наличие еще одной, кинетически нами не регистрируемой и, по-видимому, первичной фазы связывания tRNA с р-участком рибосомы, проходящей за время менее 10 мс (время смешивания) и не зависимой от кодон-антикодоновых взаимодействий. При использовании ТОВ-[14С]РЬе^МА^ (то есть при наличии большого избытка посторонней деацилированной ЪЫШ характер

р-участок + poly(U) р-участок - poly(U) а—участок + poly(U)

2 Т

Время, с

Рисунок 4.

Кинетические кривые импульсной фото-пришивки к SOS субчастице при неэнзиматическом связывании TDB-[U-"c]Phe-tRNA с а- и р-участками рибосомы в миллисекундном и секундном диапазонах времён.

poly(U)-зависимого мечения практически не меняется, ро1у(и)-независимое мечение при этом практически исчезает. Совершенно аналогичная картина наблюдается и при связывании c-TDB-[14C]Lys-tRNA. Таким образон, первая фаза связывания tRNA с р-участкок является не только очень быстрой, но и неспецифической и, по-видимому, общей для всех tRNA. Вторая фаза связывания имеет чёткую зависимость от присутствия матрицы и также является весьма быстрой, однако всё-жэ доступной для регистрации нашим методом.

Динамика неэнзимотического связывания tRNA в a-участок рибосомы.

Мы исследовали динамику связывания TDB-[14C]Fhe-tRNA в а-участок рибосом. Для этого предварительно получали комплекс 70S*poly (U) 'tRKAPhe. Этот комплекс смешивали с

TDB-[I4C]Phe-tRNA в нашей установке и затем смесь облучали. Фиксировали кинетические точки в миллисекундном, секундном и минутном диапазонах времён и затем анализировали распределение

исуиок S.

инетические кривые импульсной фото-пришивки к 50S субчастице ри неэнзиматическом связывании TDB-[U-uC]Phe-tRNA с а- и -участками рибосомы в минутном диапазоне времён инкубации меси.

пришивки по рибосокным компонентам. В хиллисекунднон и секундном диапазонах времён кы не наблюдали практически никакого мечения ни одного из рибосонных компонентов. Однако, начиная со времени инкубации смеси примерно 30s, пришивка начинает появляться и постепенно нарастает вплоть до 20-минутного времени инкубации смеси (рис.Б). При этом степень пришивки становится практически равной степени пришивки в р-участок, однако, быстрая фаза связывания совершенно отсутствует. Хотя константа связывания №-ацил-производных аминоацил-tRNA и является достаточно высокой, а их комплекс с а-участком достаточно прочным, кинетически это состояние достигается очень медленно. Можно было бы предполагать, что столь медленная кинетика связывания в а-участок обусловлена тем, что кы использовали аналог не аннноацил-tRNA, а пептидил-tRNA. Однако, для e-TDB- [ 14С] Lys-tRNA, которая является аналогок аминоацил-tRNA, картина была практически такой же, но с несколько меньшим выходом пришивки, чем в случае TDB-[MC]Phe-tRNA. Таким образом, можно заключить, что отсутствие быстрой фазы связывания в а-участок не является следствием модификации а-аминогруппы в Phe^tRNA.

Динамика энзиматического связывания tRНА в a-участок рибосомы.

Кинетика связывания аминоацил-tRNA в а-участок рибосомы в диапазоне малых времён уже исследовалась методом быстрого смешения с детекцией изменения интенсивности флуоресценции [Wintermeyer et al.(1982) Biochemistry, 21, 2246-2252]. Для этого авторы кодифицировали tRNAPbs из дрожжей флуоресцентной меткой (профлавином) по минорному основанию в положении 37 антикодоновой петли. Затем такую tHNA аминоацилировали фенилаланином и исследовали кинетику её связывания в а-участок рибосомы. При неэнзииатическом связывании кинетика была такой же кедленной как и в нашем случае. Однако, если авторы добавляли к флуоресцентно-неченой Phe-tRNA фактор элонгации EF-Tu и GTP, скорость связывания сильно увеличивалась. При насыщающих количествах EF-Tu, кинетические параметры связывания аминоацил-tRNA в а-участок практически не отличались от параметров связывания в р-участок, то есть скорость связывания была очень высокой. С помощью нашего метода кы решили проверить

так же ли быстро взаимодействует акцепторный конец акиноацил^ВДА с а-участком рибосомы в присутствии ЕГ-Ти, как это было показано по изменению интенсивности флуоресценции для антикодоновой петли. Для наших целей мы могли использовать только е-ТОВ- [14С]Ьуз^ШТА и не могли использовать Ка-ацильные производные РЬе^Ю1А, так как они не образуют тройного комплекса с ЕГ-Ти и СТР.

Для исследования Ег-ти-зависимого связывания в один шприц заряжали коиплекс: 703-ро1у(А)-Ас [14С]LystENA. В другой шприц заряжали комплекс: ЕГ-Ти-СТР'С-ТЕВ- [14С] Ьуз1М№.. Комплексы быстро снешивали в установке и после инкубации при комнатной температуре в течение различных интервалов времени, смеси облучали единичным световым импульсом и затек анализировали распределение пришивки. Результат этого эксперимента оказался весьма неожиданным. При малых временах инкубации пришивки не наблюдалось ни к каким компонентам рибосомы (рис. 6, О). При больших временах инкубации, выход пришивки немного увеличивался, однако далеко не достигал того значения, которое наблюдалось при незнэхмагическок связывании этой-же ЬШТА в а-участок. Для тех же кинетических точек мы анализировали также наличие сшивки (и её изменение) между е-ТБВ-[14С]Ьуз-^ША и фактором ЕГ-Ти с помощью БОв-электрофореза в полиакриламидном геле. Оказалось, что пришивка к ЕГ-Ти происходит во всех кинетических точках. Более того, интенсивность пришивки сохраняется постоянной и нэ зависит от времени инкубации тройного комплекса с рибосомой (рис. 7). Возможно предложить два различных объяснения этим фактам.

1). Из-за модификации е-Т0В-[иС]Ьуз-1ЮГА утрачивает :пособность связываться с рибосомой, когда находится в составе тройного комплекса с ЕГ-Ти и СГР, но сохраняет эту способность 1ри неэнзиматическом связывании.

!). При ЕГ-Ти-зависимом связывании аминокислота и акцепторный гонец аниноацил^ША остаются в контакте с ЕГ-Ти и после :вязывания в а-участок декодирующей части контакта же с

акик-либо рибосомным компонентом у акцепторного конца миноацил-1М*А в составе нового комплекса не возникает.

Первое объяснение отсутствия пришивки к рибосоме казалось ам маловероятным. Мы решили попытаться проверить второе

предположение, то есть каким-либо образон показать, что c-TDB-['*C]Lys-tRNA в составе тройного комплекса всё-таки связывается с рибосомой, и достаточно быстро. Нам было известно, что если e-TDB-[I4C]Lys-tRNA находится в р-участке, то она пришивается к 50S субчастица, кроме того кинетика связывания этой tRHA в р-участок достаточно быстрая.

0.05 -т--—-—------

г

•3 0.04 -

Вре/ия, с

Рисунок 6.

Кинетические кривые пришивки к SOS субчастице при EF-Tu-зависимом связывании e-TDB-fU-1 C]Lys-tRNA. Равные объёмы растворов смешивали в установке и через заданные интервалы времени облучали единичным импульсом света.

Смесь в шприце 1 Смесь в шприце 2

70S complex GTP EF-G

О 70S-poly(A)•AczLystRNA + + EF-Tu-GTP*e-TDB-LystRNA

п 70S-poly(A)•AczLystRHA - - EF-TU'GTP-e-TDB-LystRNA

д 70S*poly(A)•AozLystRNA + EF-Tu • GTP • e-T DB-LystRNA + - EF-G + GTP

0 70S«poly(U)•Ac-PhetRNA + + EF-Tu'GTP* e-TDB-LystRNA

Для проверки нашего предположения, мы решили посмотреть, будет ли возникать пришивка при взаимодействии с рибосомой тройного комплекса ЕР-Ти-СТР*е-ТОВ-[14С]Ьуз-Ь11ИА в присутствии фактора элонгации ЕГ-в. Для этого в один шприц заряжали комплекс: ЕР-Ти-СТР-с-Т0В-[14С]Ьуэ11ША, а в другой шприц -комплекс 703-ро1у(А) ■Ac2[uC]LystШA в смеси с фактором элонгации ЕГ-в. СТР присутствовал в обоих шприцах в концентрации 50дМ. комплексы быстро смешивали в установке и, после инкубации при комнатной температуре в течение различных

1 - 1кс

2 - 20мс

3 - 40МС

4 - 80мс

5 - 160мс S - 400MC

7 - 1С

8 - 2. 5с

9 - 7.3С

EF-TU

'ясунок 7.

1ависимость импульсной фотосшивки E-TDB-[U-,4C]Lys-tRNA с >актором элонгации EF-Tu от времени инкубации тройного '.омплекса EF-Tu*GTP* е—TDB—[1 C]Lys-tRNA с рибосомным комплексом OS-poly(A) *Ac2I,ys-tRNA в отсутствии EF-G (А) и в присутствии í'-G (В); SDS-электрофорез, авторадиография.

нтервалов времени, смеси облучали единичным световын импульсом затем анализировали распределение пришивки между рибосокными омпонентами. Анализировали также и наличие сшивки между -TDB-[14C]Lys-tRNA и EF-Tu. Оказалось (рис. 6, О), что в эисутствии EF-G пришивка к SOS субчастице появляется и быстро фастает в миллисекунднок и секундном диапазоне времён «убации. Пришивка же к EF-Tu в том же диапазоне времён быстро [еньшается и затем совсем исчезает (рис. 7). Эти результаты 13воляют утверждать, что EF-Tu-зависимое связывание

£-TDB-[14C]Lys-tRNA в а-участок рибосомы происходит очень быстра С в отличие от неэнзиматхческого связывания), однако пространственное окружение акцепторного конца tRNA в комплексе с а-участкок в присутствии EF-Tu таково, что по-крайней мере боковая группа аминокислоты не имеет контакта ни с каким компонентом рибосомы. EF-Tu, по-видимому, является одним из компонентов пре-транслокационного комплекса и диссоциирует только после транслокации, вызванной фактором EF-G. Альтернативно, можно полагать, что EF-G просто вытесняет EF-Tu из пре-транслокационного комплекса. Акцепторный конец tRNA попав в р-участок после транслокации, входит в контакт с 50S субчастицей, что и вызывает возникновение пришивки.

Для контроля того, что взаимодействие

пре-транслокационного комплекса с EF-G является достаточно быстрым, мы проводили следующий эксперимент. Сначала получали отдельно комплексы 70S-poly(А)-Ас [14C]Lys-tRNA и

EF-Tu,GTP-e~TDB-[14C]Lys-tRNA. Затек эти комплексы смешивали и смесь заряжали в один шприц установки. В другой шприц заряжали фактор элонгации EF-G в присутствии 50дМ GTP. Растворы быстро смешивали в установке и, после инкубации при комнатной температуре в течение различных интервалов времени, смеси облучали единичным световым импульсом и затем анализировали распределение пришивки. Оказалось, что пришивка к 50S субчастице появляется в этом случае очень быстро (рис. Б, Д), принерно на порядок быстрее, чем при взаимодействии тройного комплекса с рибосомным комплексом (рис. 6,0). Поскольку эта реакция оказалась очень быстрой (ri/2<10ms), для контроля исходного уровня пришивки, облучали смесь комплексов, заряженную в один из шприцев без добавления EF-G. Достоверная пришивка к EF-Tu в этом случае наблюдается только для контрольной исходной точки, где EF-G не добавлялся и для первой кинетической точки (время смешения в установке + lms).

Для контроля того, что тройной комплекс взаимодействует с рибосомой специфично, исследовали его взаимодействие с рибосомой, когда кодон катркцы в а-участке не соответствует антикодону tRNA в тройном комплексе. Для этого в один шприц заряжали тройной комплекс EF-Tu-GTP-c-TDB-[14C]Lys-tRNA, a i другой шприц - комплекс 70S-poly(U) •Ac[14C]Phe-tRNA i

присутствии эквиколярного количества КР-в и 50^М СГР. Растворы быстро смешивали в установке и, посла инкубации при комнатной температуре в течение различных интервалов времени, смеси облучали единичным световым импульсом и затем анализировали распределение пришивки. Оказалось, что пришивки к рибосоме не происходит ни при каких временах инкубации Срис. В, ф), при этом пришивка к ЕР-Ти сохраняется и от времени также не зависит.

Полученные результаты находятся в некотором противоречии с классическими представлениями о взаимодествии рибосомы с и

факторами элонгации. Считается, что после узнавания кодона и антикодона, аниноацил^Ю)А оказывается связанной в а-участке рибосомы, а фактор ЕР-Ти, после гидролиза бТР, теряет сродство к рибосоме и диссоциирует. Затеи происходит пептидил-грансферазНая реакция и возникает пре-транслокационное состояние рибосомы, с которым взаимодействует фактор ЕР-С и вызывает транслокацию. Такое описание элонгационного цикла эибосомы сформировалось на основе изучения в бесклеточных :истемах отдельных стадий этого цикла. При этом обычно [сследуется взаимодействие между собой отдельных 1Ь!сокоочищенных компонентов системы трансляции. В реальной же :итуации, процессы на рибосоме идут, по-видимому, не юследовательно, а до некоторой степени параллельно. Кроме ого, факторы элонгации, видимо, работают не каждый сам по ебе, а они нужны друг другу для эффективного функционирования.

выводы

Разработан новый метод «¡импульсной фотоаффинной нивки» для исследования динамики функционирования рибосомы, а 1кже других биологических объектов в миллисекундном и гкундном временных диапазонах.

Для реализации нового метода создана лабораторная :спериментальная установка, сочетающая быстрое смешение .створов реагентов с импульсным облучением большой мощности.

3. Исследованы фотолитические свойства ряда фотоактивируемых арилтрифторметклдиазкриновых реагентов, потенциально применимых в новом нетоде, при атом показано, что механизм импульсного фотолиза диазиринов отличается от механизма фотолиза непрерывным светом не очень большой интенсивности.

4. Получены арилтрифторматилдиазириновые фотоаффинные аналоги РЪе^ША и Ьуе-ЬКМА, исследованы их свойства и показано, что они обладают функциональной активностью.

5. Исследована динамика незнзиматического и энзиматического связывания 1Ю1А с а- и р-участками рибосомы и влияние на этот процесс ЩША и факторов элонгации ЕГ-Ти и ЕР-в.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Бочкарёв, Д. Е. , Байдаков, С. Н. и Гиршович, А. С. (1987) Техника быстрого снешения и импульсного фотоаффинного мечения для изучения динамики функционирования рибосомы. Докл. Акад. Наук СССР 292, 241-245.

2. Girshovich,A.S. and Bochkariov,D.E.(1989) A Rapid Mixing-Pulse Photocrosslinking Technique to Study tRNA-Ribosome Interaction. I3th International tRl/A Workshop (Vancouver, Canada), Abstracts, TU-28.

3. Bochkariov,D.E. and Kogon,A.A. (1992) Application of 3-[3-(3-(Trifluoromethyl)diazirin-3-yl)phenyl]-2,3-dihydroxy-propionic Acid., Carbene-Genarating, Cleavable Cross-Linking Reagent for Photoaffinity Labeling. Analyt. Biochem. 204, 90-95

4.Kogon,A.A., Bochkariov,D.E., Baskunov,B.P. and Chepra)cov,A.V. (1992) 2,3-Dihydroxy-3-(3-[3-(trifluoromethy1)diaz irin-3-y1]-phenylJpropionic Acid. A Cleavable Carbene- Generating Reagent Used for Photocrosslinking. Liebigs Ann. Cheat. 1992, 879-881.