Количественные закономерности модификации одно- и двуцепочечных нуклеиновых кислот алкилирующими производными олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДНАЕНИН

Новосибирский институт биоорганической химии

На правах рукописи УДК 577.113.4/6

ПОДУСТ ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОДИФИКАЦИИ ОДНО- И ДВУЦЕПОЧЕЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ АЛКИЛИРУЮЩИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1994

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители: академик Кнорре Д.Г.

к.х.н. Федорова О.С.

Официальные оппоненты: д.х.н. Малыгин Э.Г.

к.х.н. Зенкова М.А.

Ведущая организация: МГУ, Институт физико-химической биологии

им. Белозерского.

Защита состоится _994 г. в ____часов на заседании

Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу. 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Автореферат разослан '^А." 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

О.С. Федорова

Актуальность проблемы. Исследования последних лет показали возможность направленного воздействия на нуклеиновые кислоты адресованными олигонуклеотидами и их производными. Основной целью такого воздействия является ген и в пределах этого гена должна быть выбрана последовательность, значимая с точки зрения его Функционирования. Воздействовать на генетический аппарат клетки можно гибридизуя одноцепочечный олигонуклеотид либо с комплементарной последовательностью мРНК или пре-мРНК, либо с последовательностью самого гена. Эти способы генетического контроля, получившие название антисмыслового и антигенного ингибирования, открывают большие возможности для развития биологических Функциональных исследований, диагностики и терапии. Любой из механизмов действия антисмысловых олигонуклеотидов и их производных предполагает гибридизацию с комплементарной последовательностью в составе мишени. Для того, чтобы антисмысловые олигонухлеотиды были инструментом, эффективно воздействующим на генетический аппарат клетки, комплексообразование должно протекать в условиях, обеспечивающих стабильность комплементарного комплекса. Кроме температуры и определенных концентраций одно- и двухвалентных катионов, стабильность комплементарного комплекса определяется нуклеотидным составом и длиной участка связывания, которая зависит в свою очередь от собственной вторичной и третичной структуры отдельных цепей. Исследование количественных характеристик модификации нуклеиновых кислот реакционно способными производными олигонуклеотидов в составе комплементарного комплекса дает информацию о стабильности комплекса олигонуклеотида с соответствующим участком нуклеиновой кислоты, что представляет существенный интерес для практической реализации антисмыслового и антигенного подходов. Кроме того, информация, полученная с помощью метода комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот в комплементарном комплексе с адресом реагента, позволяет делать выводы относительно особенностей строения этих комплексов и самих полинуклеотидных мишений, а также о влиянии особенностей структуры мишени на эффективность взаимодействия с антисмысловыми нуклеотидами.

цель работы, целью настоящей работы явилось исследование количественных закономерностей модификации одно- и двуцепочечных ЛНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, изучение влияния на эффективность модификации одноцепочечных ДНК таких

параметров, как длина олигонуклеотидной части реагента, длина и структура ДНК-мишени, оценка вклада неспеци$ической модификации.

Научная новизна. К моменту начала настоящей работы в литературе имелись лишь разрозненные сведения относительно эффективности воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты олигонуклеотидов и их реакционно способных производных. Полностью отсутствовали данные по воздействию реакционно способных производных олигонуклеотидов на двуцепочечные ДНК в составе трехцепочечных комплексов. В настоящей диссертационной работе проведено систематическое исследование количественных закономерностей модификации одно- и двуцепочечных ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. На серии ДНК-мишеней различной длины и структуры- синтетических олигонуклеотидах, односпиральном и двуспиральных фрагментах ДНК изучено влияние на эффективность модификации таких параметров, как длина олигонуклеотидного адреса реагента, длина и структура ДНК-мишени, а также условий проведения модификации: температуры, рН, солевого состава среды. На примере модификации олигодезоксирибонуклеотида рЩССССТСТТЮбС) алкилирующим производным некомплементарного ему олигонуклеотида рс!(ТТТ)ги выполнена оценка вклада неспецифической модификации для реакций, протекающих в комплексе. Показано, что даже в случае реагентов, обладающих низким сродством к мишени, модификация протекает в комплементарном комплексе с высокой селективностью. Выявлено сильное влияние собственной вторичной структуры мишени на положение точек модификации даже при модификации коротких олигонуклеотидов. На более длинных мишенях показано, что вовлечение участка связывания реагента в формирование вторичной и третичной структуры мишени оказывает сильное влияние на термодинамические параметры образования комплементарного комплекса. Впервые была проведена химическая модификация двойной спирали ДНК в составе тройного комплекса и исследована зависимость степени модификации от рН среды для комплексов состава РуРиРу.

Практическая ценность. Широкое применение в последние годы олигонуклеотидов и их производных для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты требует полной характеризации термодинамики процесса комплексообразования. Измерение константы связывания олигонуклеотида с индивидуальным участком связывания в пределах протяженной молекулы ДНК или РНК представляет собой первый шаг на этом пути. Выполненые в диссертации исследования показали, что из

полученных экспериментально кинетических кривых и изотерм модификации с помощью кинетических уравнений, описывающих процесс модификации, могут быть определены кинетические и термодинамические параметры процесса хомплексообразования, а также исследовано влияние на них различных факторов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на II Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Новосибирск, 1985), на III Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Тбилиси, 1987), на международном симпозиуме "Перспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклеотидных производных" (Новосибирск, 1988), на IVВсесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Киев, 1989), на 19-ом международном симпозиуме FEBS (Рим, Италия, 1 989), на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и области практического использования" (Москва, 1991), на 21-ом международном симпозиуме FEBS (Дублин, Ирландия, 1992), на 7-ом международном симпозиуме "Молекулярное узнавание" (Киото, Япония, 1992), на международном симпозиуме "Антисмысловые олигонуклеотиды и рибонуклеаза Н" (Франция, 1992), на международном симпозиуме "Антисмысловые нуклеиновые кислоты -методы специфического ингибирования экспрессии гена и терапевтические приложения" (Гармиш-Партенкирхен, Германия, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 142 наименований и содержит 6 таблиц и 35 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Кинетические закономерности адресованной модиаикации нуклеиновых кислот олигонуклеотидными производными ароматических 2-хлорэтиламинов.

Поскольку к моменту начала данной работы в литературе имелись отдельные сведения относительно Эффективности воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты олигонуклеотидов и их производных и полностью отсутствовали данные по воздействию на одноцепочечные ДНК в составе трехспиральных комплексов, задачей

настоящей работы явилось систематическое исследование количественных закономерностей адресованной модификации одно- и двуспиральной ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, а также изучение влияния на эффективность модификации одноцепочечных ДНК таких параметров, как длина олигонуклеотидной части реагента, длина и структура ДНК-мишени, оценка вклада неспецифической модификации.

В исследованиях, проведенных в данной работе на серии различных моделей, были использованы [Ы-(2-хлорэтил)^-метиламино]бензильные производные олигонуклеотидов. Реакция модификации нуклеиновой кислоты-мишени такими реагентами протекает по следующей схеме I (Кпогте & \Zlassov, 1989): Схема I.

рг

^ Р1

* . "К и

ко '» кз Р+Х -^ Р+1-Р+И

где Р - нуклеиновая кислота-мишень, X - реагент, I - промежуточный этилениммониевый катион, образующийся из реагента в лимитирующей стадии, Я - продукт побочного превращения реагента вне комплекса (в случае ароматических 2-хлорэтиаминов это в основном продукт гидролиза, содержащий вместо атома С1 оксигруппу), Рг - продукт модификации мишени, РХ, Р1 и РЯ - соответствующие комплексы с мишенью, Кх, К|и Кя-константы устойчивости комплексов РХ, Р1 и РЯ; ко, к1, кг, к|, к. |, к'г - константы скорости реакций, указанных на схеме.

Из приведенной схемы видно, что реагент расходуется на модификацию нуклеиновой кислоты в составе комплементарного комплекса РХ, а также в параллельных реакциях, гидролизуется водой, взаимодействует с нуклеофильными компонентами буфера и самой нуклеиновой кислоты мишени без предварительного образования комплекса. Из анализа кинетической схемы были получены кинетические уравнения (1) и (3), уравнение для параметра у (5) и предельной степени модификации, (2) и (4), в условиях, когда концентрация мишени намного превосходит начальную концентрацию реагента:

[Рг] /хо= ( [рг]0о/хоС1-ехр(-кв££С)Ь (1)

= кхро

хо = 1+Кхро _ (2)

а также когда концентрация реагента намного превосходит начальную концентрацию мишени:

[РИ1 /ро = 1-ехр{-у»(гКх*о [1-ехр (-)соЬ ) ] /(1+Кхх0) }■ (3)

[рг] „/ро»1-ехр С-уКхХо/ (1+кх*о) 1 . (4) Уравнение для коэффициента уимеет следующий вид:

7= (1+У1Уз) / (1+Уа). где (5)

У1=1с1к1/(к-гкгК*) ; У2=*-1/1ч- (6)

Видно, что из серии экспериментальных кинетических кривых и изотерм модификации, полученных при различных начальных концентрациях реагента и мишени, могут быть вычислены кинетические и термодинамические параметры процесса комплексообразования и исследовано влияние на них различных факторов.

Неадресованное алкилирование ароматическими 2-хлорэтиламинами характеризуется фактором конкуренции, р, представляющим собой отношение констанаты скорости реакции промежуточного этилениммониевого катиона I к удельной скорости гидролиза этого катиона. Эффективность адресованной реакции, /, может быть рассчитана как отношение скоростей адресованной и неадресованной реакций и описывается выражением (7):

Кх р-Р+1 = -Р+1>

1+КхР Р- Р -р (7)^

где ^ - предельная степень расходования реагента.

Проведенные в работе исследования были выполнены на ДНК-мишенях различной длины и структуры: синтетических олигонуклеотидах, односпиральном и двуспиральных Фрагментах ДНК.

2. Исследование комплементарно адресованного алкилирования олигодезоксирибонуклеотидов 2'.3'-0-{4-[Ы-(2-хлорэтил)-М-метиламиноПбензилиденовыми производными с коротким олигонуклеотидным адресом

С помощью реагентов с короткими олигонуклеотидными адресами в настоящей работе были исследованы количественные параметры

алкилирования додекадезоксирибонуклеотида йо(ССССТСТТббС), (М), Рис. 1.

5" рТСАвТСОТСОТАТТА 3- (t-II)

12 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12

5" рс с с с т а т т твое 3'

и-!)

I

3" С11114СН >гА С А Ар 5'

I

З1 С1К14СН > 0 С А Ар 5' 3" С1Л14СН > и 1 Т Тр 5'

(Г-1)

(Г-н)

(Г-Н!)

Рис. 1. Первичная структура мишеней (Ы) и (ЫО и олигонуклеотидных адресов реагентов (г-1) - (г-Ш). Выделена 4-мерная последовательность мишени (Ы), участвующая в связывании с реагентами. Мишень (М1) не содержит участков, комплементарных адресу реагентов. Стрелками обозначено место расположения кислотолабильной связи в реагенте. Символ "сГ перед дезоксирибонуклеотидами на рисунке опущен.

Для обеспечения более высокого уровня включения реагента в продукт эксперименты проводились с избытком олигонуклеотида-мишени. Обработка экспериментальных данных проводилась по уравнениям (1) и (2). Вычисленное значение кинетической константы модификации в комплексе ке«=6.01-Ю 6 с1 совпадает с величиной ко=6.3-Ю 6 с-1, вычисленной из данных (Власов и соавт., 1969) по ионизации СНЙС1-производных нуклеозидов и нуклеотидов. На Рис. 2 б в координатах хо/[Р2]„ 1/ро линеаризована зависимость предельной степени расходования реагента на алкилирование мишени от концентрации мишени. Из этой зависимисти вычислены константы связывания для двух реагентов (г-1) и (г-Н), равные, соответственно, 300 М-1 и 160 М"1. Видно, что замена в адресе реагента аденина на уридин лишь в два раза снижает сродство реагента к мишени. Из литературных данных известно, что удаление одной дополнительной пары А Т снижает константу связывания приблизительно на порядок. Таким образом, имеющий искаженную конформацию рибофуранозного остатка рибонуклеозидный фрагмент принимает незначительное участие в образовании комплементарного комплекса.

Ро'10э,М 1/р0-10"г,М"1

Рис. 2. Зависимость предельной степени расходования реагентов (г-1) и (г-И), [Рг]оо/хо. от концентрации мишени (Ы), ро- (1г-1)=1-Ю_ 4 М, [г-Ш=2.2'10'4 М) в прямых (а) и обратных (б) координатах.

Учитывая невысокое сродство к мишени реагентов с адресом длиной четыре нуклеотида, можно было ожидать заметного вклада неадресованного алкилирования. Для количественной оценки этого вклада было проведено алкилирование этого же 12-звенного олигонуклеотида, (Н), реагентом (г-Ш). Из Рис. 1 видно, что мишень не имеет комплементарного участка связывания для адреса этого реагента. В то же время адрес реагента (г-Ш) несет тот же отрицательный заряд, что и адреса реагентов (г-1) и (МО. Это является существенным моментом в связи со значительным вкладом электростатических эффектов в количественные характеристики алкилирования полинуклеотидов производными ароматических 2-хлорэтиламинов.

Неадресованное алкилирование ароматическими 2-хлорэтиламинами характеризуется фактором конкуренции, расчет которого проводили по формуле известной из (Беликова и соавт., 1969). При малых степенях модификации уравнение имеет следующий вид:

1т = р (1-еког )

хсро (8)

Фактор конкуренции, р, не зависел от температуры и составлял величину 30 М"1. Поскольку модифицируемый олигонуклеотид содержит три остатка гуаноэина, то в расчете на один остаток получается величина 10 М-1. Полученное значение хорошо согласуется с величинами Факторов конкуренции известными для реакции алкилирования тРНК

реакционно способными аналогами moho-, ди- и тринуклеотидов (Власов и соавт., 1970).

Эффективность неадресованной реакции для случая, когда концентрация мишени превосходит начальную концентрацию реагента, может быть расчитана по уравнению (7). При концентрации мишени ро=1-10 3 М величина этого параметра для реагентов (r-l) и (r-ll) оказалась равной 7.1 и 4.1, соответственно. Таким образом, 12% и 20% продуктов, соответственно, получено за счет неадресованной модификации.

Были определены точки модификации 12-звенного олигонуклеотида (t-l) реагентами (r-l)-(r-lll), а также соотношения Эффективностей модификации для каждого модифицируемого основания. Оказалось, что адресованные реагенты модифицируют преимущественно G10 основание мишени, что не может быть объяснено исходя из линейной структуры образующегося комплекса, при реализации которой реакционно способная группа реагента оказывается сближенной с 5'-концевыми нуклеотидными остатками, Рис. 1. Однако, если предположить, что олигонуклеотид ((-I) обладает собственной вторичной структурой (шпилька за счет двух GCnap),

А

с» ф.Л -5'

А» Т L 1 .,

c1rhc/ с;. g

с - g :: 5'- рс; с. с . -3'

то видно, что алкилирующая группа реагента оказывается сближенной с основаниями G10 и G11. Возможность образования олигонуклеотидом шпильки за счет двух GC пар была доказана в экспериментах с интеркалирующим красителем бромистым этидием, интенсивность флуоресценции которого значительно возрастает при связывании с двойной спиралью ДНК. В настоящей работе было показано, что при добавлении к бромистому этидию олигонуклеотида (t-l) интенсивность Флуоресценции красителя заметно увеличивалась, в то время как в присутствии олигонухлеотида (t-ll), не способного к образованию шпильки, этот эффект не наблюдался.

Итак, даже в случае реагентов с коротким олигонуклеотидным адресом, а, следовательно, и низким сродством к мишени, модификация протекает в комплементарном комплексе с довольно высокой селективностью. Однако, даже в случае коротких мишеней, собственная

вторичная структура мишени может сильно влиять на положение точек модификации.

3. Изучение эффективности модиаикации 302-звенного

одноцепочечного фрагмента ДНК г'.З'-О^^-Гг-хлорэтил)^-метиламино Пбензилиденовыми производными олигонуклеотидов

ааэличн<?й длины.

Следовало ожидать, что при использовании в качестве мишеней для направленного воздействия более длинных ДНК, обладающих более сложной структурой, качественная и количественная картина модификации будет усложняться, что и наблюдалось при модификации 302-звенного Фрагмента ДНК, (МИ), серией алхилирующих реагентов с различной длиной адреса, комплементарных участку 261-274 мишени, при различных температурах. Рис. 3.

230 240 290 300

I I I I

5'- -CCCGTGTGGTGCTTAAGGAATCTCCTGCAGGTCGACGGAT- 3'

АТ ТА

GC-280 GC

АТ d fpTGACCCTCTTCCC) rA>CHRCl GT

2 5 0—CG d (pACCCTCTTCCC)ГA>CHRC1 G G

T A d(pCCTCTTCCC)rA>CHRCl G С

С T d(pTCTTCCC)rA>CHRCl

С G T g-270 T O —* G A a g 260-A A T A g g

a

Рис. 3. Вторичная структура участка 302-мерного фрагмента ДНК, содержащего участок связывания с реагентами (r-IV)-(r-VII), и структура реагентов. Выделен участок комплементарного узнавания и связывания адреса реагента. Стрелхой обозначен ближайший к участку связывания сайт алкилирования.

Все реагенты осуществляли модификацию по остаткам G258h G179, а реагенты с длиной адреса 14 и 12 пар оснований, (r-IV) и (r-V), соответственно, при концентрации > 5-Ю'6 М модифицировали участок

(t-ni)

(г-IV) (r-V) (r-VI) (r-VII)

617-634 (участок С17-С34 на Рис. 3 не показан). Модификация этого участка, по-видимому, происходила в следствие образования комплекса, включающего ОС и в-Т пары между реагентом и участком 017-е34 днк-мишени (МП).

17 34 38

I I I

5' -ссоосоосссвввсссааттвс- з1

С1ЯСН<ГАа(СССТТСТСССА0Тр) 5' (г-IV)

Эксперименты по модификации мишени (1-111) проводились в условиях избытка алхилирующего реагента. Анализ количественных характеристик модификации проводили в соответствии со схемой I по уравнениям (3), (4). Следует отметить, что для анализа количественных характеристик связывания реагента с комплементарным адресу участком ДНК, учитывали как модификацию основания й258, так и С79, поскольку модификация этих двух остатков гуанина происходит, по-видимому, из одного и того же комплементарного комплекса. В таблице I представлены результаты количественной обработки экспериментальных данных. Из этих данных видно, что при 35°С константы связывания, Кх, реагентов с участком односпиральной ДНК падают с уменьшением длины нуклеотидного адреса. Уменьшение длины адреса на два нуклеотида ведет к уменьшению величины Кх в 1520 раз. При 25°С в поведении Кх появляются "аномалии". При уменьшении температуры значения К* должны увеличиваться, однако для реагентов с 10- и 8-звенным адресом они остались приблизительно теми же, что и при 35°С, а для реагента с 12-звенным адресом даже уменьшились. Только в случае реагента с 14-звенным адресом произошло увеличение Кх. Факт, что при 25°С Кх для реагентов с длиной адреса 10 и 12 оснований приблизительно одинаковы, может свидетельствовать об участии одного и того же числа нуклеотидных пар в образовании комплементарного комплекса между мишенью и адресом реагента. Такое "аномальное" поведение Кх при 25°0 может быть объяснено образованием при понижении температуры дополнительного участка стебля с неполным спариванием (Бросалина и соавт., 1986), Рис. 4.

В настоящей работе было проведено исследование вторичной структуры модифицируемого участка методом химической модификации комплексным соединением (Чи(Ьру)з3+. По-видимому, в процессе взаимодействия ДНК с комплексом Ви(Ьру)з3 + гетероциклические основания окисляются и последующая обработка пиперидином приводит к появлению разрывов в цепи ДНК. Из данных.

Таблица I. Количественные характеристики модификации 302-звенного Фрагмента ДНК реагентами (r-IV)-(r-VII). Концентрация Фрагмента ДНК при модификации реагентом (r-IV) составляла 1-10"9 М, во всех остальных случаях-МО-8 М.

Pea- [Реагент], к0, с-' [PZ258] [PZ'79] KX,M-1 yetf f

гент М ро ро

Т=35°С

IV

5-Ю"9 1.10-8 5-10-8 1.10-7 5. Ю-7 7.10"7

4.2-10"s

0.076

0.12

0.33

0.28

0.41

0.46

0.035 0.037 0.066 0.076 0.071 0.087

3.1-107 0.Í

1-Ю6

8.4-105 5.0-105 2.2-Ю5

6.5-Ю4 5.7-104

4.7-10-8 9.4*10-8 4.7-10"7 9.4-10"7 1.7-Ю-5 8.7-10-5

5.0-10-5

0.034 0.075 0.14 0.25 0.26 0.32

0.011 0.025 0.050 0.083 0.088 0.11

2.0-106

4.9 -104 5.6-104 2.2-104 2.1-1О4 1.3-103 3 .1-Ю2

VI 1-10-6 1.10-5 1-Ю-4 3-10"4

4.8-Ю-5

0.065 0.31 0.39 0.33

0.008 0.074 0.076 0.060

1.3-105 0.68

3.8-103 2.4-103 3.0-102 82

1

VII 5-10-5 1-Ю"4

3- ю-4 1-10-3

0.061 0.12 0.27 0.24

0.00 0.00 0.031 О.ОЗ

2.3-103 0.61

63

64 60 16

Таблица I. (продолжение)

Pea- [Реагент], к0, с ' [PZ258] [PZ"9j кх, М' yett гент М ро ро

Т=25°С

IV 4 .2- ю-» 9.5-10-« 0 14 0 074 1 6 ■108* 0.6 2 9 106

8 .3- Ю-9 0.20 0 091 2 1 106

4 .2- ю-8 0 24 0 .10 4 .9 ■ ю5

8 .3- Ю-8 0 34 0 14 3 9 -105

4 .2- ю-7 0 34 0 18 8 7 104

V 7 0- Ю-8 0 040 0 020 5 0 105 0.42 4 4 104

3 5- ю-7 0 058 0 043 1 5 105

7 0- ю-7 0 13 0 085 1 7 104

2 1- 10"6 0 11 0 096 5 5 103

3 5- 10"6 0 20 0 13 5 7 103

VI 1 10 -6 0 07 0 07 4 6 105 0.46 7 5 103

1 10 -5 0 15 0 014 1 7 103

1 10 -4 0 19 0 16 2 1 ю2

3 10 -4 0 17 0 14 62

VII 5 6. ю-5 0 051 0 051 2 0 103 1 96

8 4- 10-5 0 11 0. 066 89

1 1- ю-4 0. 073 0 077 92

1 4- 10"4 0 13 0 083 85

2 8- Ю-4 0. 21 0. 17 85

* - в данном случае в координатах, определяемых уравнением (31), зависимость не линейная, поэтому значения Кхи уе» имеют здесь приближенный характер.

Во всех приведенных в таблице случаях ошибка в определении Кх не превышала 30%.

230 240 I

I I -GGACGTCCAGCTGCCTAGp 5' (t-III)

-CCCGTGTGGTGCTTAAGGAATCTCCTGCAGGTCGACGGAT 3 • AT I I

ТА 290 300

GC—280 GC AT GT 250—CG G G ТА GC

т Рис. 4. Вторичная структура

cg 3'- и 5'-хонцевых областей 302-

cg -270 нуклеотидного фрагмента ДНК, (t-

tg III), вероятно имеющая место при

та пониженной (15-25°С),

g g температуре. Выделена

а а последовательность фрагмента

260-а а ЛНК, потенциально способная к

т g связыванию адреса реагентов (г-

gg IV)-(r-VII).

представленных на Рис. 5, видно, что расщепление происходит по остаткам гуанозина, причем затрагиваются преимущественно основания, находящиеся в одноцепочечных участках. Расщепление наибольшей интенсивности наблюдается для оснований в262, в263, Э264 и в267, находящихся, согласно предполагаемой структуре, в районе петли шпильки. Практически отсутствует расщепление по основаниям, образующим стебель шпильки, особенно по в246, в247, в249 и в253, в то время как основанию в251, не имеющему комплементарной пары в противоположной цепи, соответствует достаточно интенсивная полоса расщепления. Для оснований, находящихся в двуцепочечном участке, а именно О269, в270, в271, Э275 и С276, также наблюдается расщепление, но менее сильное, чем для оснований, расположенных в петле шпильки. Семнадцать оснований на З'-конце одноцепочечного фрагмента ДНК, находящиеся в комплементарном комплексе с 5'-концевыми нуклеотидами, также в значительной степени экранированы от воздействия комплексом Ви(Ьру)з3+ (данные не показаны).

Аффинный характер модификации в258, в179, а также участха в17-в34, был подтвержден вычислением величин отношений скоростей адресованной и неадресованной реакции. При использованных в работе концентрациях реагентов <1-10 3 М, степень модификации за счет неадресованной реакции по любому из остатков нуклеотидов должна

i г з

•f

фрагмент ДНК

-I

s:

_q258

.q267

246,247 249

Рис. 5. радиоавтограф геля после проведения электрофореза 10% ПААГ в 7 М мочевине. 1. Исходный 302-звенный фрагмент ДНК.

2. Модификация 302-звенного фрагмента ДНК комплексом Ни(Ьру)з3 + ([Ru(bpy)33+1=2.3-10-5 м; 1 М NaCI; рН 6.0; Т=15°С; 1=10 мин) с последующим расщеплением пиперидином.

3. Частичное расщепление 302-звенного фрагмента ДНК по остаткам гуанозина (Maxam & Gilbert, 1980).

составлять не более 1%, что существенно ниже величин, наблюдавшихся экспериментально. Величина параметра уец в большинстве случаев была меньше единицы, что свидетельствовало о том, что эффективность модификации ДНК в комплексе с ионизованным реагентом меньше единицы за счет диссоциации этого комплекса или гидролиза катиона I в комплексе PI.

Таким образом, количественные закономерности адресованной модификации односпиральных нуклеиновых кислот осложняются Формированием дополнительных структурированных областей с неполным спариванием. Значения констант связывания алкилирующих производных олигонуклеотидов с односпиральным фрагментом ДНК, оцененные из зависимостей степени модификации от начальной концентрации реагента, оказались на несколько порядков ниже

величин, ожидаемых на основании термодинамических параметров стабильности отдельных комплементарных пар.

4. Влияние длины мишени на эффективность модификации в

комплементарием комплекс? <; 5Ч4-М-(2-кл<?рэтил>-М-м<?тиламин<?]бензил*<?тмид<?м ,<?лиг<?нуклтида {ЦТСТТСССА].

Логично было проследить, как меняются количественные закономерности модификации по мере уменьшения способности нуклеотидной мишени к образованию структур типа "шпилька" и других в области комплексообразования с реагентом. Для этого были проведены исследования с олигонуклеотидными мишенями, являющимися отдельными элементами структуры односпирального фрагмента ДНК, (1-111), В качестве реагентов были использованы 5'-[4-М-(2-хлорэтил)-1Ч-метиламино]бензилфосфамиды 8-и 11-звенного олигонуклеотидов, Рис.б.

Мишени:

41-мер: 51 и-У)

22 -Мер: 5' и^п

ю-мер: 5' и-ущ

Реагенты:

(г-УНХ) (Г-1Х)

ИС1 =

Рис. 6. Первичные структуры мишеней: 41-мера, 22-мера, Ю-мера ((1-У)-((-\/11)) и реагентов: (гЛЛИ) и (г-1Х). Стрелкой обозначена позиция модифицируемого основания.

Если в нуклеотидной мишени участок комплементарного узнавания реагента занят в формировании вторичной и третичной

27

-I

ААТООАОССТОССТТвААТССЗОААСАООСТСАООТГССАТТ

I

ТТТСССТТСААТССОААСАСТТ

4

ТООСААСАвТ

3' асссттст-кс1 5* 3' сттасссттст-кс! 5"

С1СН2СН;

:нг у—л

СНзЛН-

енз >==/

структуры, то как в кинетическом уравнении (3), так и в уравнении для 7аи (5), величина Кх представляет собой комбинацию констант связывания реагента с линейной формой нуклеиновой кислоты-мишени и с ее структурированной формой, схема II, уравнение (9):

Схема II.

Линейная форма НК + Реагент ** Комплекс (Крх)

Аинейная форма НК м ** Структурированная форма НК (Кь)

к*-Кр*/(1+кь> (9)

Это приводит к уменьшению эффективной константы связывания, Кх, и, соответственно, к снижению степени модификации. В таблице II представлены результаты количественной обработки экспериментальных данных по модификации 41-, 22- и 10-звенных мишеней, (^-(ЬУП). Здесь же для сравнения приведены данные по модификации 302-звенного односпирального фрагмента ДНК, (МИ), реагентом с адресом, идентичным адресу реагента (г-VIII), но несущим алкилирующую группу на З'-конце.

Из таблицы II видно, что константы ассоциации для 22-мера и 10-мера с реагентом (гЛ/Ш) имеют одинаковые значения при одной и той же температуре. Их абсолютные значения падают с увеличением температуры, причем величина К* уменьшается приблизительно в 1.52.5 раза с увеличением температуры на 5°С. Одинаковые значения констант связывания реагента с этими мишенями могут означать, что. мишени не образуют вторичных структур , мешающих образованию комплекса с реагентом. По сравнению с данными для 22-мера и 10-мера зависимость константы ассоциации 41-мера с реагентом (г-УШ) от температуры имеет несколько иной характер. При 20°С значение константы связывания 41-мера с реагентом (гЛ/|11) в 20 раз ниже, чем для более коротких мишеней, 22-мера и 10-мера, причем при повышении температуры до 25°С значение Кх не меняется. При дальнейшем повышении температуры на 5°С величина Кх для 41 -мера уменьшается так же, как в случае с 22-мером и 10-мером, примерно в 2.5 раза, но ее абсолютное значение остается на порядок ниже, чем для 22-мера и 10-мера при той же температуре. Аналогичная картина имеет место при модификации 41-мера реагентом с длиной адреса 11 нуклеотидных

Таблица ».Расчетные значения констант ассоциации Кх реагентов (г-УШ) и (г-1Х) с ДНК-мишенями различной длины и значения параметров уе« при различных температурах.

10-мер 22-мер 41-мер 302-мер

Т, °С Кх'10'6, УеН Кх-Ю-6 Уе„ Кх-Ю-6 уе(| Кх-Ю-6

М-1 м-' М-1 М-1

Реагент (VIII) Реагент (VII)

2 0°С - - 3 .02 0 .74 0 .16 0 .60 -

±0. .81 ±0 .04 ±0. ,04 ±0. .05

2 5°С 1 .15 0 .67 1 .37 0. .58 0 .14 0. .55 0.002

±0 .31 ±0 .04 ±0. .36 ±0. .03 ±0. .04 ±0, .06

3 0°С 0. .57 0. .58 0. 50 0. .51 0. .06 0. .56 -

±0. .10 ±0. .03 +0. .07 +0. .02 ±0. 02 ±0. ,09

35°С 0. .36 0. .58 0. .36 0. 50 0.002

±0. 13 ±0. 06 ±0. 10 ±0. 05

Реагент(МХ)

2 0°С - 1.21 ±0.31 0 ±0. .79 .06

2 5°С 5 ±1 .87 .43 1 ±0 .00 .08 1.28 ±0.12 0. ±0. .59 .02

3 0°С 2 ±0. .21 .44 0, ±0. .90 ,06 -

3 5°С 2 ±1. .92 ,03 0. ±0. ,87 ,11 -

звеньев, (г-1Х). Изменение температуры от 20 до 25°С не приводит к уменьшению константы связывания

Значения Кх при разных температурах для 22- и 10-меров линейны в анаморфозе 1пКх + 1/Т, Рис. 7. Из этой зависимости были расчитаны значения дн°х и А3°х образования дуплекса между 8-звенным адресом реагента рс1(ТСТТСССА) с олигонуклеотидами длиной 10 и 22 оснований, равные -(23.7±1.6) ккал/моль и -<51.8±5.4) кал/моль-град, соответственно. Эти величины были сопоставлены с литературными данными по стабильности ДНК-дуплексов, так как основной вклад в сродство реагента к мишени вносит его олигонуклеотидная часть. Оказалось, что значения ДН°Х и Д8°х, вычисленные на основе термодинамических параметров отдельных пар оснований, существенно превышают экспериментально полученные величины. Причины такого расхождения между расчетными и экспериментальными величиными могут заключаться в том, что использованные в расчете значения термодинамических параметров соответствуют переходу между полностью разупорядоченной структурой и совершенным дуплексом. В то время как в эксперименте образование дуплекса происходило в изотермических условиях. Эти данные находятся в соответствии с предположением Бреслауэра (Вгез1аиег е1 а!., 1986), что собственная структура мишени при изотермическом образовании комплекса оказывает большое влияние на термодинамику процесса.

5. Комплементарно адресованная модификация двуцепочечной ДНК 5'-14-М-(2-хлорэтил)-1М-метиламино1бензил&осаамидами олигонуклеотидов в составе трехцепочечных комплексов.

Количественное исследование процесса направленной модификации, позволяющее получать данные о стабильности комплексов между олигонуклеотидами и комплементарными им

1/Т -10 3

Рис. 7. Зависимость 1п Кх от 1/Т для 22-мера, ((-VI), и Ю-мера,

ал/ю.

последовательностями в составе нуклеиновых кислот, а так же об особенностях строения этих комплексов, может быть проведено не только для одноцепочечных, но и для двуцепочечных ДНК. В настоящей работе было проведено исследование оптимальных условий модификации двуспиральной ДНК, содержащей в своей структуре участки состава PuPy, способные образовывать триплексы с поли(пиримидиновыми) олигонуклеотидами. Поскольку трехцепочечные структуры типа Ру»РиРу образуются не только для гомонуклеотидных поля (пурин)-поли(пиримидиновых) последовательностей, но и в случае последовательностей с чередующимися остатками G и А в одной цепи и С и Т, в двух других (Lee et al., 1974), то в качестве двуцепочечных ДНК-мишеней в настоящей работе были выбраны два двуспиральных фрагмента ДНК. Один, полученный на основе односпирального фрагмента ДНК длиной 302 п.о., содержащий гомонухлеотидный поли(пурин)-поли(пиримидиновый) участок d(pG)t8'd(pC)f8, (t-VIII), Рис. 8 б, и другой, длиной 120 п о., содержа-

а.

17 34

I I

-ACGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGC- 3' (t-III)

3' CCCCCCCCC-HNCH2RCl 5' (Г-Х)

3' CCCCCCCCCCCCCCC-HNCH2RC1 5' !r-XI)

б.

17 34

I I

3' -TGCACCCCCCCCCCCCCCCCCCAACG- 5' (t-VIII)

5' - aggtgggggggggggggggggottgc - 3'

5' СШСНгШ-рССССССССС 3' (г-Х)

5' СШСНгШ-рССССССССССССССС 3' (г-х1)

Рис. 8. а: Структуры участка 017-634 в составе односпиральной 302-эвенной ДНК-мишени (МП) и реагентов (г-Х)-(г-Х1), ориентированных антипараллельно по отношению к олиго(0-последовательности мишени. Выделена олиго(0-последовательность, способная образовывать комплементарный комплекс с адресом реагента за счет уотсон-криковских водородных связей, б: Структуры участка Э17-634в составе двуспиральной ДНК-мишени ОЛ/Ш) и реагентов (г-Х)-(г-Х1), ориентированных параллельно по отношению к олиго(в)-последовательности мишени. Выделена последовательность ДНК, -бная образовывать трехспиральный комплекс с адресом реагента •<л .'ч-т хугстиновсхих водородных связей.

щий участок с чередующимися остатками в и А в полипуриновой цепи и С и Т в полипиримидиновых - йрА(рврА)б'йрТ(рСрТ)б, (НХ), Рис. 11.

Модификацию мишени ((-VIII) проводили в интервале рН 4.0-7.5. Эксперименты с использованием реагента (г-Х1) показали, что двуцепо-

чечный фрагмент ДНК, 0-\/11), подвергается модификации при пониженных значениях рН. Из данных, представленных на Рис. 9. видно, что степень модификации проходит через максимум при изменении рН. Максимум степени модификации достигается при рН 4.5, близком к рК цитидина. В отличии от этих данных, степень модификации одноцепочечного Фрагмента ДНК, (НИ), монотонно падает при р Н < 5 . 5 . Из данных, представленных на Рис. 10, видно, что адрес реагента в составе дуплекса и триплекса имеет различную ориентацию - антипараллельную пуриновой цепи в случае модификации из двойного комплекса, и параллельную пуриновой цепи в случае модификации из тройного комплекса, см. также Рис. 8 а,б.

Зависимость степени модификации двуцепочечной ДНК от концентрации реагента имела гиперболический характер. При концентрациях >ЗЮ"5 М степень модификации реагентом (г-Х1) достигала предельного значения, равного 50%. Для реагента (г-Х) при этих же концентрациях получена величина предельной степени модификации 40%. Видно, что Эффективность связывания этих реагентов с участком двуспиральной ДНК приблизительно одинакова.

Аналогичные результаты были получены при модификации мишени ((-IX), содержащей в своем составе олиго(ОА)-олиго(ТС) участок, реагентом (г-ХИ),Рис. 11.

Кривая зависимости степени модификации мишени от рН также проходит через максимум, который, однако, сдвинут в более нейтральную область - рН 5.3. Ориентация третьей цепи в комплексе также параллельна пуриновой цепи дуплекса. Из зависимости предельной степени модификации от концентрации реагента были

рН

Рис. 9. Зависимость степени модификации одно-, (МП), и двуцепочечного, 0-\ЛП), Фрагментов ДНК реагентом (г-Х1), ([г-Х1]=6.8-10"6 М), от рН.

с" с*

12 3 4

м

5Рис. 10. Радиоавтограф ф^Щ электрофоретического разделения

продуктов модификации одно- и двуспирального фрагментов ДНК реагентом (r-XI>, ([r-XI]=6.8-10"8 М). 1. Одноцепочечный 302-звенный Фрагмент ДНК. 2. Частичное расщепление 302-звенного Фрагмента ДНК по остаткам гуанозина (Maxam & Gilbert, 1980). 3. Модификация двуцепочечного Фрагмента ДНК, (t-VIII), реагентом (r-XI) с последующим расщеплением пиперидином. 4. Модификация одноцепочечного 302-эвенного Фрагмента ДНК, (t-lll), реагентом (г-XI) с последующим расщеплением пиперидином.

(t-IX)

10 20 30 40 50 120

3' ! ill I 115'

Q^afiGGCGTAAGACCGTCGAGCACCTGCTTCTCTCTCTCTCTCTGGAGCGG- -GTTCGA^ GGATCCCGCATTCTGGCAGCTCGTGGACGAAGAGAGAGAGAGACACCTCGCC- -CAAGCTT 5 T 3'

5' ClRCH2NH-pTCTCTCTCTCTCT 3' (r-XII)

******

5' CIRCH2NH-PTCTCTCTCTCTCT 3' (r-XIII)

Рис. 11. Структуры 120-звенного двуспирального фрагмента ДНК (t-IX) и реагентов (r-XII) и (r-XIII) ориентированных параллельно по отношению к полипуриновой последовательности в составе ДНК-мишени. Выделена последовательность ДНК, способная образовывать трехспиральный комплекс с адресом реагента за счет хугстиновских водородных связей. Стрелками обозначены положения модифицируемых оснований в олигопуриновой (Т) и олигопиримидиновой (i) цепях Фрагмента ДНК. Звездочками отмечены позиции 5-метилцитидина в реагенте (r-XIII).

вычислены вличины Кх, и параметра уе«:

Кх=(0.95±0.03)-105 М-1; уен=0.53±0.02 Величина значения Кх свидетельствует о том, что сродство реагента (г-XII) к участку двойной спирали ДНК на несколько порядков ниже, чем величина, ожидаемая для сродства к одноцепочечной ДНК (Вгез!аиег е! а1., 1986). Отличие параметра от единицы указывает, вероятно, на наличие обмена между промежуточной частицей I, находящейся в растворе и в комплексе с ДНК-мишенью Р1.

Как было известно (1_ее е1 а1., 1984), трехцепочечные комплексы, включающие в себя тройки оснований т5С»6-т5С, способны образовываться в нейтральных средах. С целью выяснения возможности проведения модификации двуспиральной ДНК в нейтральных средах были проведены эксперименты по модификации мишени (МХ) в составе трехспирального комплекса с реагентом С1НСН2ЫНрТ(т5СТ)б,(г-ХШ), Рис. 11. В данном случае предполагаемые трехспиральные комплексы должны были включать тройки оснований ш5С»О С. В настоящей работе экспериментально было установлено, что модификация реагентом (г-ХШ) исследуемого двуспирального фрагмента ДНК протекает, однако зависимости степени модификации, [Р2]„/ро, от рН и концентрации реагента практически не отличаются от данных, полученных для неметилированного аналога.

ВЫВОДЫ.

1. На примере модификации олигодезохсирибонуклеотида рсЦССССТСТТЮСС) 2\3'-{0-4-[М-(2-хлорэтил)-М-метиламино]}-бензилиденовыми производными олигонуклеотидов рс!(ААС)гА и рЬ(ААС)и показано, что реакционноспособные производные коротких олигонуклеотидов способны проводить специфическую модификацию нуклеиновых кислот. Отношение скоростей специфической и неспецифической модификации составляет величину порядка 5-10. Показано, что даже в случае коротких олигонуклеотидов, вторичная струкрура мишени может иметь большое влияние на положение точек модификации адресованными аналогами ароматических 2-хлорэтиламинов.

2. Получены количественные характеристики модификации одно-цепочечного 302-нуклеотидного фрагмента ДНК 2',3'-{0-4-[М-(2-хлорэтил)-1М-метиламино]1бензилиденовыми производными олигонуклеотидов длиной 14, 12, 10 и 8 звеньев. Показано, что изменение эффективности модификации от длины

олигонухлеотидного адреса реагента имеет сложный характер: при 35°С эффективность модификации растет с увеличением длины олигонуклеотидного адреса реагента, а с понижением температуры до 25-20°С становится заметным влияние Формирования собственной пространственной структуры мишени, приводящее к уменьшению констант связывания реагентов с мишенью.

3. Проведено сопоставление эффективности модификации одной и той же последовательности ДНК в составе 10-, 22-, 41- и 302-звенных Фрагментов 5'-[4-М-(2-хлорэтил)-1\1-метиламино]бензилфосфамидным производным олигонуклеотида dp(TCTTCCCA) при 25°С. Показано, что с увеличением длины мишени константа связывания реагента с мишенью уменьшается, что, по-видимому, обусловлено вовлечением участка связывания реагента в формирование вторичной и/или третичной структуры. Определены значения ДН°Х и 4S°X образования дуплекса между 8-звенным адресом реагента pd(TCTTCCCA) с олигонуклеотидами длиной 10 и 22 оснований.

4. Показано, что алкилирующие производные олигонуклеотидов d(pC)9, d(pC)i5, 0[рТ(рСрТ)б] и d[pT(pm5CpT)6] способны проводить направленную модификацию двуспиральных ДНК в составе трехспиральных комплексов состава Ру»РиРу, при этом адрес реагента ориентирован параллельно пуриновой цепи дуплекса. Из зависимостей степени модификации мишени от концентрации реагента определены константы специфического связывания реагентов с участками двуспиральных ДНК. Показано, что зависимость степени модификации ДНК в составе трехспирального комплекса состава Ру«РиРу от рН проходит через максимум. Метилирование олигонуклеотидного адреса реагента по пятому положению остатков цитидина не приводило ни к существенной стабилизации триплекса, ни к сдвигу максимума кривой зависимости степени модификации от рН в нейтральную область.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в

следующих сообщениях:

1. Кнорре Д.Г., Кутявин И.В., Левина А.С., Пичко Н.П., Подуст Л.М.. Федорова О С. (1986). Исследование комплементарно адресованного алкилирования олигодезоксирибонуклеотидов 2',3'-0-{4-[N-(2-хлорэтил)-!Ч-метиламино1}бензилиденовыми производными с

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

коротким олигонуклеотидным адресом. Биоорган, химия 12, N 2, 230-239.

Власов В .В., Кнорре Д.Г., Кутявин И.В., Мамаев C.B., Додуст A.M.. Федорова ОС. (1987). Изучение эффективности модификации одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. Биоорган, химия 13, N 9,1221-1229. Кнорре Д.Г., Зарытова В.Ф., Подуст A.M.. Федорова О.С. (1988). Комплементарно адресованная модификация двуцепочечной ДНК в составе трехцепочечного комплекса. Докл. АН СССР 300, N 4,10061009.

Fedorova O.S., pndust L.M. (1988). Application of tris(2,2'-bipyridyl)rutenium (III) for the investigation of DNA spatial structure by a chemical modification method. J. Inorganic Biochemistry 34, 149-155.

Fedorova O.S., Knorre D.G., Podust L.M.. Zarytova V.F. (1988). Complementary addressed modification of double-stranded DNA within a ternary complex. FEBS Lett. 228, 273-276.

Vlassov V.V., Gaidamakov S.A., Zarytova V.F., Knorre D.G., Levina A.S., Nikonova A.A., Podust L.M.. Fedorova O.S. (1988). Sequence-specific chemical modification of double-stranded DNA with alkylating oligodeoxyribonucleotide derivatives. Gene 72, 273-276.

Подуст A M.. Гайдамаков СЛ., Абрамова T.B., Власов B.B., Горн B.B., Федорова О.С. (1989). Специфичная к последовательности модификация двуцепочечной ДНК алкилирующим производным олигодезоксирибонуклеотида рТ(СТ)в. Биоорган, химия 15, N 3,363369.

Подуст A.M.. Федорова О.С. (1989). Применение трис(2,2'-дипири-дил)рутения(Ш) для изучения пространственной структуры ДНК методом химической модификации. Изв. СО АН СССР, сер. хим.наук, ВЫП.1, 110-114.

Федорова О.С., Подуст A.M.. Горн В.В., Максакова Г.А. (1992). Строение одноцепочечной ДНК-мишени как фактор, влияющий на эффективность ее модификации в комплексе с комплементарным реагентом. Биоорган, химия 18, N 12,1496-1504. Fedorova O.S., Podust L.M.. Maksakova G.A., GornV.V., Knorre D.G. (1992). The influence of the target structure on the efficiency of alkylation of single-stranded DNA with the derivatives of antisense oligonucleotides. FEBS Lett.. 302, 47-50.