Новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с нуклеиновыми кислотами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПЫШИЫЙ Дмитрий Владимирович

НОВЫЙ ПОДХОД К ПОВЫШЕНИЮ СЕЛЕКТИВНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Зарытсва В.Ф. кандидат химических наук Иванова Е.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М. кандидиат химических наук Зенкова М.А.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии Государственного Научного Центра Вирусологии и Биотехнологии «Вектор» Российской Федерации (ГНЦ ВБ «Вектор»)

Защита состоится «_ 1998 г.

в часов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в

Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан « » 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук , Федорова О.С.

Актуальность проблемы. Олигонуклеотиды, их производные и аналоги находят широкое применение для создания на их основе молекулярных инструментов исследования НК-зависимых процессов, терапевтических препаратов для подавления экспрессии определенных генов, диагностики вирусных и наследственных заболеваний и т.д. Однако с тех пор как было показано, что олигонуклеотиды, благодаря своему уникальному и универсальному сродству к нуклеиновым кислотам, могут служить адресующей частью реагентов для направленной модификации НК [ВеИкоьа et а1., 1967], конструирование олигонуклеотидных производных остается одной из основных проблем биоорганической химии из-за того, что требования, предъявляемые к таким олигонуклеотидным конструкциям - одновременное сайт-специфичное, селективное и эффективное взаимодействие их с нуклеиновыми кислотами, являются частично взаимоисключающими друг друга. Эффективность и сайт-специфичность узнавания олигонуклеотидами определенных последовательностей в НК зависит от их комплексообразующей способности - чем больше нуклеотидных пар образуется при взаимодействии олигонуклеотидов с НК, тем эффективнее их связывание и ниже вероятность встречаемости комплементарных им сайтов в протяженных НК. Однако для повышения селективности связывания необходимо, напротив, использовать более короткие олигонуклеотиды, образующие с НК менее прочные комплексы, для которых появление одного нуклеотидного несоответствия в сайте связывания должно приводить при физиологических температурах к резкому падению их сродства к НК. Компромиссным вариантом решения этой комплексной проблемы могут быть тандемные системы на основе коротких олигонуклеотидов (эффектор+оли-гонуклеотид+эффектор), суммарная последовательность которых эквивалентна оптимальной длине олигонуклеотида, необходимой для сайт-специфичного связывания с НК.

Цель работы состояла в исследовании возможности повышения селективности взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью при физиологических условиях путем замены протяженных олигомеров на тандемы коротких олигонуклеотидов. Для ответа на вопрос, возможно ли селективное взаимодействие НК-мишеней с короткими олигонуклеотидами или их производными в составе тандемов, необходимо выяснить, а) как влияют эффекторы на комплексообразование олигонуклеотида в составе тандема при снижении гибридизационной способности олигомера за счет сокращения длины или введения в его структуру однонуклеотидного несоответствия с сайтом связывания в НК-мишени и б) какими должны быть компоненты тандема для осуществления селективного воздействия на НК в условиях, приближенных к физиологическим. Для решения поставленной задачи было проведено сравнительное исследование взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава путем установления закономерностей влияния эффекторов на термостабильность олигонуклеотидных комплексов и особенностей алкилирования мишени олигонуклеотидными

реагентами в правильных и несовершенных комплексах олигонуклеотид • ДНК-мишень.

Научная новизна работы. Работа представляет собой систематическое исследование взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава при формировании правильных и несовершенных комплексов мишень • олигонуклеотид. В результате проведенного термодинамического анализа образования тандемных комплексов с суммарной длиной в 16-20 нуклеотидных пар и изучения особенностей модификации ДНК-мишени алкилирующими производными олигонуклеотидов с различной комплексообразующей способностью в составе тандемов предложен новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью, основанный на использовании тандемов коротких олигонуклеотидов состава октануклетид+тетрануклеотид+октануклеотид, где тетрануклеотид и октамеры-эффекторы могут содержать, в зависимости от требований и условий, различные функциональные группировки.

Практическая ценность работы. На основании результатов исследования предложены и созданы тандемы коротких олигонуклеотидов, обладающих способностью подавлять экспрессию ВИЧ-1 в клеточных культурах (заявка на патент Кг 97108812 от 22.05.97), разработан новый метод выявления точечных мутаций в геномных ДНК методом лигирования тандемов трех коротких олигонуклеотидов (РСТ/1Ш9600087 от 11.04.1996). Предложенный в работе подход может быть использован для создания терапевтических препаратов ген-направленного действия, для диагностики наследственных и вирусных заболеваний, для разработки методов секвенирования нуклеиновых кислот. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-м Международном симпозиуме по биоорганической химии ШРАС (Россия, 1995), Международном симпозиуме «Нуклеиновые кислоты и родственные макромолекулы: синтез, структура, функции и применение» (Германия, 1997), 4-м Международном симпозиуме по биоорганической химии ШРАС (Франция, 1997), международной конференции «Детекция мутаций-97» (Чехия, 1997), международной конференции «Олигонуклеотидный синтез» (США, 1998). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей. Объем работы. Диссертационная работа изложена на 152 страницах, состоит из 3-х глав, введения, выводов, списка литературы из 214 наименований, приложения и содержит 9 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Селективность взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в составе тандемных комплексов

1.1. Комплексы двухкомпонентных тандемов

Взаимодействие ДНК-мишени (двадцатизвенного олигонуклеотида М) и олигонуклеотидов, обладающих различной гибридизационной способностью, в

составе тандемных комплексов мишень • эффектор+олигонуклеотид исследовали на модельной системе:

м

ССТАОТТССТС(5АСС5ТСССТр

рСАССТССАСССА РН12

рСАССТССА рСАСС

Е1 рССАТСААС

рССАТСААСр РъпЕРЬп ЬРЬп РйлЬ • 1

РЩ р",

РЬпЬ'- = -ОСН2СН2№!-.РЙл РЛпЬ- = РЛп-ЫН-СН2СН,СН,ЫН-

РЛл-

3

N

В качестве эффекторов использовали октануклеотид Е1 и его 5',3'-ди-Ы-(2-гидроксиэтил)-феназиниевое производное РЪпЕ^Кп.

Гибридизационные (комплексообразующие) свойства олигонуклеотидов, обусловленные их первичной структурой и характеризуемые совокупностью термодинамических параметров комплексообразования (ДН° и ДБ"), в первую очередь определяются длиной олигонуклеотидов. Поэтому в качестве олигонуклеотидов с различными гибридизационными свойствами использовали олигомеры разной длины - тетра- (рЛГД окта- (р^^ и додека- (рЛГ)г) -нуклеотиды.

Исследование проводили методом термической денатурации комплексов, определяя температуру их плавления, поскольку при сравнительном изучении в одинаковых концентрационных и буферных условиях именно температура плавления комплексов является прямой характеристикой их стабильности, обусловленной гибридизационной способностью олигонуклеотидов. За температуру плавления принимали значение температуры, при которой дифференциальная кривая денатурации комплекса достигает своего максимума (Т ).

у тпах'

При образовании тандемного комплекса с мишенью происходит возникновение дополнительного динуклеотидного стэкинг-взаимодействия между соседними дуплексами олигонуклеотида и эффектора (кооперативный контакт). Олигонуклеотиды рЛГ12 и pNs имеют одинаковую 5'-концевую последовательность (рСАСС), совпадающую с последовательностью рДГ(. При образовании тандемного комплекса с мишенью М они формируют с эффектором (Е или РкпЕ^Кп) один и тот же кооперативный динуклеотидный контакт (вС• 0-3'5'-С), вклад которого в энергию образования дуплексов М-р]\Гж одинаков для каждого типа эффекторов. Увеличение собственной гибридизационной способности олигонуклеотида приводит к уменьшению доли вклада этого контакта в энергетику образования дуплекса олигонуклеотид • мишень. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, в тандемных системах мишень • эффектор+олигонуклеотид эффектор вызывает возрастание стабильности дуплекса олигонуклеотид-мишень, регистрируемое в виде повышения его температуры плавления относительно «независимого»

Таблица 1. Температуры плавления комплексов мишени М с олигонуклеотидами и их производными и с двухкомпонентными тандемами олигонуклеотид+ эффектор

Независимое комплексообразование Тандемное комплексообразование

Комплекс т °с Система Комплекс т °с

М-Е, 33

м-е2 35

М-РЫЕ^Кп 53

М-РЫЕ2РЪ.п 55

М- рЛГ]2 56 М-(Е,+рЫ12) М-Е, М- рМ1г 44 50

М -(Р}1пЕ,РЬ.п+рМ12) М-РЬпЕ,РЬп M■pNl2 62 62

М-рЫ,2{а) 47 М -(РНпЕ,РНп+ рК12(а)) М-РНпЕ,РНп М-Ри,2(а) 56 56

М-р1У8 35 М -(Е,+рЫ8) М-Е, М-р1У8 38 38

М-(РЪ.пЕ,РНп+рЫц) М-РЪ. пЕ,РНп М-рЩ 55 50

М- рЩа) 10 М -(РЫЕ,РЫ+ рМ8(а)) М-РЫЕ,РЬ.п М-рЩа) 55 36

М-рЫ{ <7 М-(Е,+рЫ4) М-Е, М-рЛГ* 33

М-(р^+Е2) м-е2 М- рМ< 35

М-(РИпЕ,РПп+рЫ4) М -РНпЕ,РЬп M■pN^ 53 24

М -(р^+РНпЕ2РНп) М • РкпЕ2РЬ.п М-рЫ4 55 20

комплекса (т.е. в отсутствие эффектора). Стабилизирующее влияние максимально при использовании в качестве эффектора дифеназиниевого производного октануклеотида и уменьшается с увеличением собственной комплексообразующей способности олигонуклеотида. В присутствии одного эффектора {РКпЕ^кп или РНпЕгРЬп) даже тетрануклеотид, неспособный к независимому комплексообразованию, формирует с мишенью дуплекс, температура плавления которого составляет 24 и 20°С, соответственно.

Влияние эффектора (Ph.nEjPh.ri) на селективность взаимодействия олигонуклеотида с мишенью исследовали на той же модельной системе. Комплексы с мисматчем (несовершенные комплексы) получали, заменяя во всех исследуемых олигонуклеотидах Обоснование, образующее комплементарную пару с О'-основанием мишени М, на основание А. Введение однонуклеотидной замены в олигонуклеотид приводит к падению стабильности его независимого комплекса с мишенью, причем, как и следовало ожидать, уменьшение длины олигонуклеотида приводит к

И ■ (РЬпЕ^Ьп+рЯ^ (ж) )

3' ССТАСГТССТССАС СТСССТр

рСАСХТССАСССА рССАТСААвр

I РЛп рЬпЬ •

И■ (РЬпЕ^Ьп+рНц (х) )

3' ССТАСТТССГССАССГСССТр

рСАСХТССА рССАТСААСр

ЬРЛл

РЬпЬ'

Х=С рИп Х=А рЫп(а)

ДА^оМТ

Рис.1. Дифференциальные кривые термической денатурации независимых М-рМ1г(а) (1)иМ.рЛГ,2 (2), и тандемных М-(РкпЕ]Ркп+рМ]2(а)) (3) и М ■ (РЬпЕ^кп+фМ¡2) (4) комплексов в буфере: 10 мМ какодилат натрия (рН 7.3), 0.1 М ЫаС1, 1 мМ ЕЕГГА. Концентрации компонентов комплекса - 13 мкМ каждого.

повышению селективности его связывания с мишенью, т.е. к увеличению различия в температурах плавления правильного и несовершенного комплексов (табл. 1). В тандемных системах зффектор снижает селективность связывания оллгонуклеотида с мишенью, сближая температуры плавления правильного и несовершенного комплексов (например, рис. 1).

1.2. Комплексы трезскомпонентных тандемов

Эффективность образования дуплекса М-рЛГ^ в тандемных комплексах мишень • эффектор+олигонуклеотид+эффектор исследовали с использованием в качестве эффекторов нативных октануклеотидов Е1 и Ег, а также их 5'(3*)— моно- и 5',3'-дифеназиниевых производных:

и- р^+р^+гу

3 • ССГАСТТССТСС5АССТСССТр рСАСС

рССАТСААС рТССАСССА

И■ (РИп£1 ¿рЯ^Е^РЬа)

3•ССТАСТТССТССЛССТСССТр рСАСС

рССАТСААС рТССАСССАр ьрьп РЬПЬ1

м- (^Иш+рг^+рьпЕ^

21ССТАСТТССТССАССТСССТр рСАСС

рССАТСААСр рТССАСССА РЬпЬ' ЬРЬл

М- (ГЬШ^РКп-ЦЛ^+РЬпЕгРЬп)

3'ССТАСТТССТССАССТСССТр рСАСС

рССАТСААСр рТССАСССАр

ЬР/т P/JлL, ЬРЪп РЬпЬ'

и- гв1рьп+ря4+вгрьл;

3'ССТАСТТСетССА&ЗТСССТр рСАСС

рССАТСААСр рТССАСССАр РЛлЬ• РЛлЬ'

И■ (РЬпЕ^Я^РЪпЕ;)

3'ССТАСТТССТССАССТСССТр рСАСС

рССАТСААС рТССАСССА £РЛл 1РЛп

Температуры плавления комплексов мишень ■ эффекторная пара и дуплекса М ■ рЛ^ в составе тандемных систем приведены в табл. 2.

Возникновение в комплексах трехкомпонентных тандемов одновременно двух кооперативных контактов между дуплексами, образованными мишенью с тетрануклеотидом и эффекторами, существенно повышает способность тетрануклеотида связываться с мишенью. Даже в присутствии пары фланкирующих нативных октануклеотидов Е,+Е2, которые в двухкомпонентных системах М •(В,+рЛГ<) и М-(р^+Е2) не оказывают регистрируемого влияния на способность тетрануклеотида к комнлексообразованию, Т^ дуплекса М-р достигает 23°С. В комплексах М ■ (^Р/т+рЛ^+Р/тЕ^ и М ■ (РКпЕ ¡РНп+рН+ РНпЕгРНп), в которых остатки феназиния находятся вблизи кооперативных

Таблица 2. Температуры плавления независимых комплексов олигонуклеотидов и их производных с мишенью М и ее комплексов с трехкомпонентными тандемами

Система Комплекс Т °С

М -рЛ^рС/и <7

M^pN4pEst <7

М-Е,Ркп 44

М-ЕгРЫ 41

М-РкпЕ, 45

Ы-РкпЕг 48

М ■(Е1+рЫ4+Ег) МЧЕ1+Е2) 35

М-рЫ4 23

М ■ (РкпЕ,Ркп+р^+РкпЕгРкп) М -(РкпЕ^кп+РкпЕгРкп) 55

М-рЫ4 38

М -(РкпЕ,+р^+ЕгРкп) М-(РкпЕ,+Е2Ркп) 43

М- pN4 24

М-(Е,Ркп+р^+РкпЕ2) М • (Е^кп+РкпЕг) 48

М- р«4 37

М ■ (РкпЕ,+р^+РкпЕ2) М-(РкпЕ,+РкпЕ2) 48

M■pNí 29

М ■(E,Pkn+pN4+E2Pkn) М-(Е,Ркп+Е2Ркп) 43

М- рЫ4 33

М ■(E,+pN4pChs+E2) М-(Е,+Е2) 35

М-рЫ4рСкх 17

М-(Е,+рЛГ4рй>£+Е2) М-(Е,+Ег) 35

М-р 20

М • (РкпЕ,Ркп+рМ4рСкз+РкпЕ2Ркп) М-(РкпЕ^кп+РкпЕгРкп) 55

М-рЫ4рСЫ 32

М ■ (PhnE¡Phn+pN^pEst+PhnEгPhn) М-(РкпЕ^кп+РкпЕгРкп) 55

М -рЛ^рЕ 35

М ■(ChsE1Phn+pN^pChs+ChsEгPhn) М-(СкэЕ^кп+СкхЕгРкп) 47

М-рЫ4рСкэ 43

М ■ (С/1яЕ1РЛп+рЛ?<р£х1+СЬ5Е2Р/1п) М-(СкзЕ^кп+СШгРкп) 47

М-рЫ&Езг 43

М ■ (СкзЕ,Ркп+рМ4+СкзЕ2Ркп) М -(СкзЕ^кп+СкгЕгРкп) 47

М-рN4 31

контактов, наблюдается практически равная стабилизация дуплекса М ■ рЫ4 (Т^ 37 и 38°, соответственно) (табл. 2), хотя пара эффекторов Е1Ркп+Рк.пЕг образует менее стабильный комплекс с мишенью по сравнению с парой РкпЕ1РЬ.п+РЪлЕгРкп

(ДТ^-с).

Полученные результаты позволяют заключить, что эффективность стабилизации тетрануклеотидного дуплекса М-рЫ1 в составе тандема возрастает в ряду эффекторных пар:

Е1+Е2=РкпЕ1+Е2Ркп<РЪ.пЕ1+РЪ.пЕг<Е1Р}1п+ЕгР}1П<Е1Р}1п+Р}1пЕг= РкпЕ^кп+РкпЕ^кп и определяется не только термостабильностью комплексов мишень • эффектор-ная пара, но и наличием на стыке компонентов тандема группировок, изменяющих свойства кооперативного контакта.

Для реализации эффективного взаимодействия олигонуклеотидов или их производных с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами необходимо

обеспечить высокий уровень проникновения их через клеточные мембраны, что может быть достигнуто путем повышения гидрофобности олигонуклеотидов, например, введением в их структуру остатков стероидов.

Влияние остатков стероидов (£Т) - эстрона и холестерина, введенных в компоненты тандема эффектор+тетрануклеотид+эффектор, - на стабильность тандемного комплекса с мишенью М исследовали, используя З'-холесте-рин (или эстрон)-содержащий тетрануклеотид и 3'-феназиний,5'-холестерин-содержащие октануклеотиды в качестве эффекторов. Результаты приведены в табл. 2.

М- (ChsE^hn+pNjpEst+CbsEjPim)

3 'CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp

pCAGCp<Est) pGCATCAAGp pTCCAGGCAp

L"Chs PhnL' L"Chs PhnL'

M- (CbsEIPhn+pN4 +ChsEjPhnJ

31 CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp pCAGC

pGCATCAAGp pTCCAGGCAp

L"Chs

PhnL' L"Chs

PhnL•

И■ (ChsE^hn+pNjyCha+ChsEjPhn)

3' CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp

pCAGCp(Chs) pGCATCAAGp pTCCAGGCAp

L"Chs PhnL' L"Chs PhnL•

M- (PbnEjPbn+pNiPEat+PIwS^Pbn)

3' CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp

pCAGCp(Est) pGCATCAAGp pTCCAGGCAp

LPhn PhnL• LPhn PhnL'

Нативный тетрануклеотид pN4, несодержащий остаток стероида, в системе М - (ChsEjPhn+pNj+ChsE^hn) образует комплекс, температура плавления которого ниже, чем в системе М ■ (EtPhn+pN4+E2Phn). В то же время стероид-содержащие конъюгаты pN4pST в системах с гидрофобными эффекторами М ■ (ChsEjPhn+pNjpST+ChsE^hn) формируют самые прочные тетрануклеотидные дуплексы с мишенью (Ттах 43°С), что обусловлено реализацией гидрофобных взаимодействий между сближенными в тандемном комплексе стероидными остатками тетрануклеотидного производного pNtpST и эффектора STE2Phn [Denisov et al„ 1997].

Исследование селективности взаимодействия тетрануклеотида с мишенью

проводили с использованием комплексов, в которых мисматч формировали,

производя все возможные мононуклеотидные замены в структуре

тетрануклеотида. Правильный дуплекс Lphn phnL, Lphn phnL,

тетрануклеотида в тандемном комплексе pGCATCAAGp pTCCAGGCAp

образует два кооперативных контакта: 3 CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp

„ „ „,,-, ' pXAGC Х=Т, А, G

«сильныи» GC ■ G-3 5-С контакт с дуплексом pCXGC Х=Т, С, G

М • PhnEjPhn и «слабый» AG-C-3'5'-T - с рСАХС Х=т, А, С

дуплексом M-PhnE2Phn, и две внутренние pCAGX х=Т, А, G

пары Т-А И С • G, Которые также И-(PlmE^hn-tpU^xt+PhnE^hn)

0.008

0.004

Да26(Мт М-рНл (х2) Рис.2. Дифференциальные кривые

термической денатурации дуплексов М-рЫ4(хг): рСАСС (1), рСТСС (2), рСССС (3), рСССС (4); в составе комплексов М ■ (РкпЕ1РНп+рЫ4(х)+РНпЕ2РНп) в буфере 10 мМ какодилат натрия (рН 7.3), 0.1 М ШС1, 1 мМ ЕОТА. Концентрации компонентов комплекса - 13 мкМ каждого.

V 60 °С

существенно различаются по их вкладу в энергию образования комплекса. Как видно из данных, представленных в табл. 3, стабильность неправильного дуплекса М-рЫ4(х) в присутствии эффекторов зависит от положения мисматча; однако во всех случаях введение однонуклеотидной замены в последовательность тетрануклеотида вызывает существенную дестабилизацию дуплекса М ■ рЫ4 (например, рис. 2). При использовании трехкомпонентного тандема удается добиться избирательного связывания тетрануклеотида с НК-мишеныо в интервале физиологических температур, так как наличие даже одного комплементарного несоответствия структур тетрануклеотида и сайта НК-мишени приводит к резкому снижению вероятности формирования комплекса.

2. Термодинамический анализ образования тандемных комплексов

Термодинамический анализ взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в независимых и тандемных комплексах проводили на примере комплексов, образованных с участием двух 20-звенных олигонуклеотидов-

Таблица 3. Температуры плавления дуплексов М-р1У4(х) в составе тандемных комплексов М-(РНпЕ1РНп+р^\4(х)+РНпЕ2РЬп).

Система Комплекс Т °Р

М ■ (РНпЕ,Ркп+рЫ4+РНпЕгРЫ) М-рСАСС 38

М-(РНпЕ1РНп+рЫ4(х3)+РЫЕ2РНп) М-рСАТС <4

М - рСААС <4

М-рСАСС <4

М-(РНпЕ,РЬп+рИ4(хг)+РНпЕ2РНп) М-рСТСС 15

М-рСССС <6

М- рСССС 22

М ■ (Р1тЕ,РЫ+р^(х,)+Р}1пЕгРЫ) М-рТАСС 8

М ■ рААСС *

М-рСЛСС 8

М ■ (РкпЕ1РЫ+р^(х4)+РЬпЕгРЫ) М-рСАСТ 12

М-рСАСА 21

М-рСАСС 22

•-определить не удалось

мишеней МиМ,и октануклеотидов В, и Ег в качестве эффекторов:

М 3' CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp CGTAGTTCGTCTAGGTCCGTp Mt

рПг„ pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA

pGCATCAAGCAGATCCAGGCA р»г0 (a) pGCATCAAGCAGATCCAGGCA pGCATCAAGCAGC pW„ pCAGCTCCAGGCA

pCAGATCCAGGCA pN„(a) pCAGATCCAGGCA

pH> pCAGCTCCA

pCAGATCCA PH,(a) pCAGATCCA

pW4 pCAGC

pCAGA pN, (a4) pCAGA

P-V( (t<) pCAGT

pCGGC pN, fa*; pCGGA

pGCATCAAG pTCCAGGCA e2 Et pGCATCAAG pTCCAGGCA Ej i, fa5; pGCATAAAG

Эффективность взаимодействия олигонуклеотидов с мишенью оценивали по степени ассоциации (а) комплексов мишень • олигонуклеотид: в случае независимых комплексов -

а = 0.5 ■ [1 + у(1 +1 / (К-Lo))-т/(1 + тг(1 +1 /(К-Lo)))2-4у] (!)_ где a=ML/Mo - степень ассоциации мишени в независимом комплексе с олигонуклеотидом; Мо и Lo - начальные концентрации мишени и оллгонуклеотида; ML - концентрация комплекса в равновесной системе; у = LуМ0 - параметр, определяющий стехиометрическое соотношение начальных концентраций олигонуклеотида и мишени; К=ехр[(-ДН° + TAS0)/ RT] - равновесная константа ассоциации независимого олигонуклеотидного комплекса;

в случае тандемных комплексов мишень ■ зффектор+олигонуклеотид+ эффектор -

для дуплекса мишень ■ олигонуклеотид

(l-oci)(yi-ai)Mo

-=Ki

1 + ЮКиМоСуг- аг) + КзЮзМо(уз - аз)+ КгКпКзКпМо'Суг - аг)(у з- аз)

1 + КгМо(у2- аг) + КзМо(уз - аз) + К2К3М02 (уг - аг)(у J - аз)

для дуплексов мишень • эффектор

Г1 + KiKi2Mo(7i - m) + КзМо(у з - аз)+ККпКзКззМо' (yi - giXy) - аз)]

(1 - агХУг - аг)Мо [ I + KiMo(y i - ai)+КзМоф - ai) + KiKjKuMo^yi - aiXyj - а))

Г4]

(26), (2в),

аз _ Г1 + К1КпМо(у| - а.)+КгЩуг - аг) + ЮКззКзЮзМо^у! - а.Хуг -

(1-аз)(уз-аз)Мо~ [ 1 + К|Мо(у|-а|)+К2Мо(у2-а2)+К)К!К12Мо2(у1-а|)(у2-а2)

где а-степень ассоциации (заполнения) ]-го сайта мишени с соответствующим олигонуклеоггидным компонентом тандема Ц=1 для фланкированного олигонуклеотида -центрального компонента тандема, и ¿=2,3 для фланкирующих эффекторов); К, - равновесная константа независимого связывания )-го олигонуклеотидного компонента с соответствующим сайтом мишени; К1г, К13- константы кооперативного взаимодействия центрального компонента тандема с каждым из эффекторов при их совместном комплексообразовании с мишенью; у. -стехиометрический коэффициент, определяемый как отношение общей концентрации го олигонуклеотидного компонента (Ь. ) к общей концентрации мишени (Мо) (у1 — Ь]о/Мо)

Расчет степени ассоциации комплексов проводили с использованием термодинамических параметров независимого комплексообразования и кооперативного взаимодействия между дуплексами компонентов тандема, полученных на основе литературных [А11аю{ е£ аI., 1998, Santa.Lv.cia, 1998] и экспериментальных данных. Полученные на основе рассчитанных значений а дифференциальные кривые денатурации тандемных комплексов при у=1 хорошо согласуются с экспериментальными данными (например, рис. 3).

Анализ зависимости степени ассоциации а и температуры плавления Т (а(Тт)=0.5) как независимых, так и тандемных комплексов мишень • олиго-нуклеотид, от концентрации мишени при фиксированной концентрации олигонуклеотида Ьо, рассчитанной по уравнению

Тт=ДН7{ДЗ°+Шп(Ьо)-Мп(27)+К1п(2у-1)} (для назависимых комплексов) и методом численного решения системы уравнений 2а-в (для тандемных комплексов) показывает, что уменьшение концентрации мишени вызывает повышение ее степени ассоциации в комплексе (а) и, следовательно, Тт комплексов. Наиболее заметный рост величин а и Тга происходит при увеличении параметра у до 5 (например, рис. 4).

Селективность взаимодействия олигонуклеотидов с мишенью оценивали по параметру б(Т), который представляет собой произведение величины фактора дискриминации <*1(Х)/*х2(Т) и величины абсолютного различия в степени образования правильного и несовершенного комплексов а,(Т)-а2(Т) при определенной температуре:

С[(Т)

8<Т>= —-[«.ГО-а/Г)] «гГО

где а,(Т) и а2(Т) - степени ассоциации правильного и несовершенного комплексов соответственно, при одинаковых температурных и концентрационных условиях.

Рис. 3. Первые производные кривых термической денатурации дуплексов в составе тандемного комплекса М-(Е+рМ+Ег): М ■ (£,+рМ(+£2) (1), М-(Е+Ег) (2), М-рЫ1 (3); А) экспериментальные, Б) расчетные. ([М]=[рЛГ1]=[£1г]=1.3 10"5 М; 10 мМ фосфат натрия (рН 7.0), 0.1 мМ ЕЭТА, 1 М ИаС1).

Рис. 4. Зависимость степени ассоциации комплекса М-рв тандемной системе М {Е^рГ^+Ег) от температуры при снижении концентрации мишени М относительно [рМ4] = 1.3-10"5 М: [И] = 1.3-10"5 (7=1) (1), 0.8710"5 (7=1.5) (2), 2.610-6 (7=5) (3), 6.5-10"7 (7=20) (4) и 1.310-7 М (7=100) (5); различие степени ассоциации комплексов при 7=1 и 7=100 (6); [рЛГ4] = [М] = 6.510"7 М (7=1) (7); 10 мМ фосфат натрия (рН 7.0), 0.1 мМ ЕОТА, 1 М N301.

Параметр 5(Т) был рассчитан для дискриминации одиночного О ■ А мисматча как в независимых комплексах мишень ■ олигонуклеотид, так и в присутствии эффекторов, при уменьшении длины олигонуклеотида и при понижении концентрации мишени относительно олигонуклеотида в 100 раз (7=1 и 100).

Влияние эффектора Е, на селективность связывания мишени с олигонуклеотидом в составе двухкомпонентного тандема рассматривали на примере образования комплексов тетра-, окта- или додекануклеотидов.

Эффектор в тандемных комплексах приводит к снижению максимального значения параметра 5(Т) для дуплекса мишень-олигонуклеотид, причем негативное влияние эффектора на дискриминацию несовершенных комплексов существенно возрастает при уменьшении длины олигонуклеотида. Кроме того, эффектор вызывает смещение температурного интервала дискриминации в более высокую область. Как видно из рис. 5, дискриминирующая способность октануклеотида в присутствии эффектора выходит за пределы физиологических температур (45-53°С), в то время как максимальная селективность связывания тетрануклеотида с мишенью в этом случае сдвигается из области крайне низких

Рис. 5. Зависимость параметра селективности 5 от температуры при дискриминации одиночного СА мисматча олигонуклео-тидами различной длины при 7=100 в присутствии эффектора Е] (сплошная линия) и в его отсутствие (пунктирная линия). ([рЛГ4]=[В,,2]=1.3-10-5 М; 10 мМ фосфат натрия (рН 7.0), 1 М ЫаС1, 0.1 мМ ЕОТА).

М-Е^Н, и М-Е1+рП4 (а) М-Е^+рНц и М-Е1+рИа (а) И-Е^Я^ и М-Е1+рЩ2 (а)

температур (< 0°С) в более высокие (26°С).

16

Е1+рИ4(х)+Е2

РИ20 (х)

Рис. 6. Зависимость параметра селективности 5 от температуры при дискриминации одиночного мис-матча олигонуклеотидами при у=100: рN¡0 (СА-мисматч) при [рЛГи] = 1.3-10"5 М (1), [рЛи] = 1.3 • Ю~10 М (2); тетрануклеотид в составе тандема Е^рЛ^+Ег: ОА- (3), Тй- (4) и СГ-мисмат-чи (5) при [рЫ4] = 1.3 • Ю-5 М; 10 мМ фосфат натрия (рН 7.0), 1 М МаС1, 0.1 мМ ЕПТА.

В случае формирования комплексов трехкомпонентных тандемов с участием тетрануклеотидов М • (Е+рМ((х)+Ег) наблюдается аналогичная закономерность: происходит дополнительное снижение эффективности дискриминации тетрануклеотидного сайта в мишени и максимальное значение 8(Т) сдвигается в область еще более высоких температур (до 41 °С) по сравнению с комплексами М-(Е^р^х)) (рис. 6). Эффективность дискриминации мисматчей протяженным олигонуклеотидом такой же длины рЫго(х) сопоставима или ниже, чем трехкомпонентным тандемом Е1+р^(х)+Ег Кроме того, температурный интервал дискриминации 20-звенным олигонуклеотидом находится в области не ниже 70°С, причем даже значительное понижение концентрации мишени до 10"12 М и олигонуклеотида р!^2а(х) до 10"10 М снижает температурный интервал селективного взаимодействия только до 60°С (рис. 6).

3. Эффективность и селективность модификации ДНК-мишени алкилирующими производными олигонуклеотидов в составе тандемных комплексов

Закономерности влияния эффекторов на особенности химической модификации мишени М в правильных и несовершенных комплексах

исследовали с помощью алкилирующих производных олигонуклеотидов ИС1рЫп

в одинаковых концентрационных и буферных условиях ([М]=5 • 10"' М, [эффекторНреагент] =10"5 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), 0.1 М КтаС1, 1 мМ

ЕБТА). Анализ продуктов алкилирования [32Р]-меченой мишени М проводили электрофоретически в 20% денатурирующем полиакриламидном геле после

обработки реакционной смеси водным пиперидином. Модификацию мишени М

при постоянной температуре (20°С) проводили с использованием алкилирующих

производных различных олигонуклеотидов, которые, с одной стороны,

обеспечивают постоянство структурных элементов дуплекса вблизи реакционной

группировки (одинаковая 5'-концевая последовательность рСАй), с другой -широкий диапазон термостабильности комплексов мишень • реагент (Т 10-56°С). *тХ

ЬРЬп РЬпЬ' РЬпЕ^Ьп рССАТСААСр

М 3' СвТАСТТССТССАбСТСССТр (1С1)рСА(ЗС (ИС1) рСАСАТССА (МП)рСАбС

^ рТССАвСлСАр £РЛл РЬпЬ'

(КС!) рСАОАТССАр (Ь' РЬп) (КС1) рСА(ЗСТССА (Р.С1) рСАвСТССАр (Ь' РЬп) (КС 1) рС АСЗАТСС АС(ЗСЛ (1Ю1) рСАССТССАСССА

BClpUt

наряда)

ГЮрЫв(а)рРЪп КЦр», ЕСЗрг/^Иш (л)

парп^

КС1- =

СОН,»!;

СНгМ-

сн,

хйо

(РИп-)

РЬгй'- = -ОСНДУИ-РЙЛ РЬпЬ- ~ Рйп-М+СНгСЦгО^Н-

В качестве эффектора использовали дифеназиниевое производное октануклеотида РЬпЕ:Ркп, которое образует с мишенью дуплексную структуру, формирующую один и тот же кооперативный контакт с дуплексными участками всех выбранных реагентов со стороны реакционноспособной группировки.

Сравнение степени модификации мишени реагентами в комплексах М-ЙС/р^ как в отсутствие, так и в присутствии эффектора показало, что выходы продуктов алкилирования в ряде случаев не коррелируют с увеличением прочности комплексов мишень ■ олигонуклеотид (рис. 7). В отсутствие эффектора (рис. 7А) степень модификации мишени при 20°С возрастает с повышением способности олигонуклеотида к комплексообразованию в ряду:

ДСгрМ, < КС1рЫ/а) < ЯСгрЛ^+РЪп^РЬг < ДСгрЛГ/а;рСРЬп) < КС1рЛГ,, что, очевидно, связано с увеличением степени ассоциации соответствующего

степень модификации,% 100п д

Т,°С степень модификации,% 100 юо Б

80 80 60 60

40 40 20 20 0 0

т, С

- 100

80 60 40 20

Рис. 7. Степень модификации мишени М реагентами RClpNш при 20°С (столбики) ([М] = 510М, [реагент] =1С 'М, [эффектор] =10"5 М, 10 мМтрис-НС1 (рН*7.2), 0.1 М ЫаС1,1 мМ ЕОТА, 48 ч) и температуры плавления соответствующих комплексов М ■ pNn (линия): (Л) в составе независимых комплексов М • RClpNnг ЯС1 рЛ/, (1), КС!рЛГ,(а) (2), КСгрЛГ,(а)РНп (4),

11С1рЫг (5), RClpNtPhn (6), RClpN:2(л) (7), ЯС1рк1г (8), а также ЯС/рЛГ(+Р/тЕ2Р>т (3); (Б) в составе тандемного комплекса М ■ (PhnE¡Phn+pNJ: КЯрЛ^ (1), НСгрЛГ,(а)(2), КС!рЛ^+ РЫЕ^Ы (3), КСгрЛ?,(а)РЛп (4), КС! рЛГ, (5), КС1рЛГ,Рйп (6), ДСгрЛГ„(а) (7), ИОрГ/„ (8).

8

комплекса реагент-мишень. Дальнейший рост комплексообразующей способности олигонуклеотидов, обусловливающий полное связывание мишени реагентом при этой температуре, приводит к некоторому уменьшению степени модификации мишени реагентами в ряду:

КСгрЛГ, > RClpNspPhn > ИС^12(а) > №С1)рЫ1г.

В присутствии эффектора РЪ.пЕ}Р1гп увеличение степени модификации мишени происходит только при использовании реагентов со слабой способностью к комплексообразованию (RClpNi < 11С1рЫе(а) < RClpNt+PhnE2Phn).

В случае реагентов RClpNí/, КС1рЩа)рРкп, RClpNípPhn, RClpNJг(а) и RClpN¡2 добавление эффектора снижает выход модификации (рис. 7Б). Таким образом, эффектор может не только способствовать модификации мишени реагентами, стабилизируя слабые комплексы мишень • реагент, но и препятствовать ее осуществлению реагентами, полностью связывающими мишень.

Сравнение зависимости эффективности алкилирования мишени олигонуклеотидными реагентами с различными комплексообразующими свойствами от температуры как в отсутствие, так и в присутствии эффекторов Е1 и РкпЕ^кп проводили с использованием реагентов RClpN]г, RClpNs.

В отсутствие эффекторов, т.е. в независимых комплексах М ^RClpNn (п=8, 12), степень модификации мишени реагентом на основе октануклеотида, обладающего меньшими гибридизационными свойствами по сравнению с додекануклеотидом (35 и 56°С соответственно), коррелирует с термостабильностью комплекса (рис. 8). В то же время при использовании реагента RClpN¡2 максимум степени модификации наблюдается в области температуры плавления комплекса М-рЛ^2 (рис. 8А). При использовании реагентов М^С1рЫ (п=8, 12) модификация протекает

Л

3'ССТАСТТСбТССАСОГССбТр (ИС1)рСАССТССА

м-яарк^, 10, 1

3" ССТАСТТССГССАССГСССТр (НС1)рСАССТССАСССА

степень модификации, % 80

степень модификации,% £ 80 ■

ЯС1рПа

Рис. 8. Зависимость степени модификации мишени М реагентами (1), в присутствии

эффектора В, (2), в присутствии эффектора РЬпЕ^кп (3) от температуры: п=12 (А); п=8 (Б). [М] = 5-Ю"7 М, [реагент] = 10"5М, [эффектор] = 10"5 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), 0.1 М N301, 1 мМ ЕОТА.

степень модификации,% ^

50 -

М 11С1рИц

щ

ши

степень модификации,%

50 .

И-РЛлЕд РЪп+ПарКи

40

Ю

.а!

Ё

Рис. 9. Степень модификации оснований мишени С", С2, Сг* при разных температурах в комплексах в отсутствие эффектора (Л), в присутствии РНпЕ ¡РКп (Б) реагентом КС1рЛ?1г. [М]=5Ю"' М, [рсагент]=10-5М, [эффектор]=10"5 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), 0.1 М КаС1, 1 мМ ЕПТА.

с

с

по нескольким основаниям мишени - в основном по С13, С2 и С9, причем повышение температуры реакции вызывает перераспределение сайтов модификации мишени в пользу внутридуплексных более нуклеофильных оснований С9 и С2 (рис. 9).

Влияние эффекторов Е1 и РКпЕ^Кп на модификацию мишени этими реагентами носит однотипный характер. В присутствии эффектора происходит резкое падение степени модификации при температурах ниже температуры плавления комплексов М • эффектор+рЫ п (п=8, 12) (рис. 8), и основным сайтом модификации становится С-основание мишени, эффективность алкилирования которого увеличивается с повышением температуры (например, рис. 9). Влияние эффектора Е1 на падение степени модификации мишени выражено в меньшей степени по сравнению с эффектором РЪпЕ^Кп.

Тетрануклеотидный реагент RClpN4 модифицирует мишень в присутствии эффектора РЬпЕ^кп или РЬ.пЕгРЪ.п с близкой эффективностью (-24% при 20°С), и, в отличие от реагентов ЯС1рЫп (п=8, 12), только по й9- основанию мишени

В составе комплексов трехкомпо-нентных тандемов мишень • эффектор+ реагент+эффектор степень модификации мишени реагентом ЯС1рЫ4 резко возрастает, и при 37°С эффективность алкилирования мишени этим реагентом во всех случаях коррелирует со стабильностью комплекса М-рМ4 в присутствии соответствующей эффекторной пары (рис. 10).

Эта закономерность сохраняется и для «гидрофобного» тандема, компоненты которого - как эффекторы, так и тетрануклеотидный реагент, содержат в своей структуре остаток стероида (рис. 11). Низкая реакционная способность RClpN1pChs при наличии прочного комплекса с мишенью может быть обусловлена существенными искажениями в структуре дуплекса, вызываемыми объемным гидрофобным остатком холестерина [Денисов и др., 1996]. Однако, как видно из

И ■ Р1тЕ1РЬл+КС1рЫл |

10» 1 3 'СбТАСГТССГСС-АССТСССТр РЬпЕ1 РЪп (ИС1)рСАСС

М • ПСЛрН, -ЬРЬпЕ^РЪп I

10' 1 3' ССТАСТТССГСбАбСГСССТр

(КС1)рСЛССРЬп^№п

степень модификации»% 75

Рис. 10. Зависимость степени модификации мишени М реагентом КС1рЛ?4 (при 37°С) в присутствии пары эффекторов (столбики) от температуры плавления дуплекса М • рЛ'4 в составе соответствующих тандемных комплексов. Точки - температура плавления комплексов соответствующих эффекторных пар. [М]= 510-' М,

[реагснт]=[эффектор]= 10"5 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), С.1 М N301, 1 мМ ЕОТА.

рис. 11, для каждого типа реакционного производного на основе тетрануклеотида (RClpN1, RClpNipEst и RClpNipChs) сохраняется корреляция между стабильностью комплекса мишень •реагент, и степенью модификации мишени в тандемной системе.

Влияние эффекторов на модификацию мишени в несовершенных комплексах в зависимости от гибридизационных свойств олигонуклеотидных реагентов рассматривали при 20 и 37°С, используя эффектор РНпЕ^кп и алкилирующие производные додека- и октануклеотидов RClpNJx) (п=8,12), а также тетрануклеотидов КС1рЫ((х) в присутствии дополнительного дифеназиниевого эффектора РКпЕ2РКп. О селективности модификации мишени судили, определяя фактор дискриминации - отношение степени алкилирования мишени в правильном и несовершенном комплексах (ГБ) (рис. 12).

При температурах 20 и 37°С реагенты RClpN12(х) как в отсутствие, так и в присутствии эффектора, в несовершенных комплексах (при

РЬпЕ^Ьп 10 1

3' ССТАетТССТСбАСбТСССТр (ИС1)рСАСХТССАСССА (КС1)рСАСХТССА (КС1) рСР.СХ+РЬпЕ2РГт

ИС1рКа(х): Х=С КС1рНв

Х=А КС1рЯп(а)

степень модификации, % 50

РС1рЯ,рЕвЬ ВС1рЫ4рСЬз

Рис. 11. Степень модификации мишени реагентами НС1рП4рЕз^ КС^4рС1и и КСфЛ^при 37°С в присутствии пар эффекторов: Е]+£г (черные столбики), РЬпЕ^Кп+РЬпЕгРЬп (белые столбики) и СиэЕ^Ы+СЬзЕгР!т (серые столбики) и температуры плавления дуплексов М-рН^ЕьЬ, М-рЛ^рС/ы и М-рN4 (точки) в присутствии соответствующих эффекторных пар; [М]=510~7 М, [реагент] = [эффектор]=10"5 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), 0.1 М №С1, 1 мМ ЕОТА.

Рис. 12. Фактор дискриминации (КБ) комплекса с мисматчем реагентами КОрЛГ^х.), КСгрЛ^х) и КС\ри4(х)+РкпЕгРкп в отсутствие и присутствии эффектора РКпЕ^Нп при 20°С (темный столбик) и 37°С (незаштрихованный столбик); [М]=510~7 М, [реагент]= [эффектор]=105 М, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.2), 0.1 М ИаС!, 1 мМ ЕОТА.

без эффектора +РЬаВ1РЬп

Х=А) модифицируют мишень даже в несколько большей степени, чем в правильных (при Х=С). Октануклеотидный реагент ЯС1рМ Х(х) селективно модифицирует мишень в независимом комплексе. Однако в присутствии эффектора при 20°С модификация в несовершенном комплексе М^РНпЕ^Кп+В-арИ^а)) протекает более эффективно, чем в правильном М • (PhnE¡Phn+RClpN|) (53 и 33% соответственно). И только в случае тетрануклеотидного реагента ЯС1рМ4(х) пара эффекторов способствует селективной модификации мишени при 20-37°С (рис. 12).

При 25°С реагент на основе тетрануклеотида оказывается способным дискриминировать все возможные однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания мишени. Если степень модификации мишени реагентом (Г1С1)рСАСС в правильном комплексе достигает 55%, то при наличии мисматча в комплексахМ■ (ЯС1)рЫ4(х') наблюдается резкое падение степени модификации или ее полное отсутствие (табл. 4).

При увеличении температуры с 25 до 37°С степень алкилирования мишени в правильном комплексе М • (11С1)рСАСС снижается незначительно и составляет 44%. В то же время реагенты Т1С1р№¿х), содержащие однонуклеотидную замену, не модифицируют мишень при этой температуре (табл. 4).

Таким образом, использование тандемов типа РкпЕ ¡Phn+RClpN1+ РЪпЕ^Ьп обеспечивает высокоселективную модификацию мишени при физиологических температурах (37°С) и, тем самым, позволяет высокоэффективно дискриминировать все возможные однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания тетрануклеотидного реагента.

Несоответствие между стабильностью комплекса и степенью модификации мишени додекануклеотидным реагентом в случае полного насыщения мишени, а

го

каря, (х>

-400

а

20 С ИС1рН,г (х)

КС1 ри, (х) РЬпЕ ¿Р1ш

37С

ЯС1рЯ12 (X)

ХС1рЯ, (х)

Г~П , г-П ,

РЬпЬ' ЬР1т РЬпЬ' рССАТСААСр рТССАСвСАр 3'ССТАСГТССТСбАССГСССТр

(КС1)рХАСС Х=Т, А, Б (ИСИрОССС С, Б

(КСИрСАХС Х=Т, А, С (ЯС1)рСАСХ Х=Т, А, в М- (РЬпЕ^Ьп+иар^ (х*) +Р1тЕ2Ргт)

Таблица 4. Фактор дискриминации мисматчсй и степень модификации мишени реагентом КСЛрМ/х') в правильном и несовершенных комплексах в присутствии пары

Система Комплекс Степень ГБ*

модификации,%

25°С 37°С 25°С 37°С

М ■ (РНпЕ1Ркп+ М-ЯС1рСАСС 55 44

КС1рЛГ4+

РкпЕгРкп)

М-(РкпЕ,РНп+ М-ЯарСАТС 0 0 550 440

КС1рЩх3)+ М-НС1рСААС 0 0 550 440

РНпЕ2РЫ) М-ЯС1рСАСС 0 0 550 440

М-(РЫЕ, РЫ+ м - негрстсс 14 0 4 440

КС1рЛ^(хг)+ М-ПС1рСССС 5 0 11 440

РИпЕгРИп) м-нсгрссос 0 0 550 440

М-(РНпЕ,Ркп+ м-йсгртдсс 5 0 11 440

Б.С1рЫ4(хг)+ М -КС1рААвС 8 0 7 440

РкпЕгРкп) м-ксгрслсс 0 0 550 440

М ■ (РкпЕ1Ркп+ м ■перелет 2 0 28 440

11С1рЫ4(х4)+ М-НС1рСАСА 14 0 4 440

РкпЕгРкп) М -КС1рСАСС 6 0 9 440

* при отсутствии продуктов модификации мишени РБ рассчитывали, принимая степень алкилирования за 0.1%

также непредвиденное влияние эффекторов на алкилирование мишени реагентами на основе окта- и додекануклеотидов, приводящее к низкой селективности модификации мишени, может быть обусловлено «информационными особенностями комплексов мишень ■ реагент. Комплексы протяженных олигонуклеотидов с высокими гибридизационными свойствами и относительно большим числом внутренних пар обладают достаточно жесткой структурой, поскольку разрыхляющий вклад концевых пар несущественен. В то же время тетрануклеотидный комплекс, в котором соотношение внутренних и концевых пар одинаково, имеет более подвижную структуру.

Модификация мишени алкилирующим производным КСЛрМ может протекать из двух энергетически выгодных конформаций-«накопителей» с различной ориентацией реакционной группировки [Воробьев, 1990]. Конформация Т1 предполагает сближение реакционной группировки с первым неспаренным основанием одноцепочечного участка мишени и характеризуется низким энергетическим барьером перехода в предреакционное состояние.

Находясь в конформации Т2, реакционная группировка направлена в большую бороздку дуплекса и сближена с третьим или четвертым основанием мишени относительно 5'-конца реагента. Эта конформация выгоднее конформации Т1, однако переход в предреакционное состояние в этом случае требует больших энергетических затрат для обеспечения существенных изменений в структуре двойной спирали комплекса [Воробьев, 1990].

конформация Т1

= ЯС1

Т1

2 0°С

Т2

М ^ССТАСТТССГССАССГСССТр яарКн (кскрСАСстссасссд

ВС1рН, №С1)рСАССТССА

и з'ССТАСТТССТССАССГСССТр ЯС1рг1. (Р.СЦрСАСС

4 рТССАСбСАр

15 комплексах мишени с реагентами КОрЛ^ (п=8, 12) при температурах существенно ниже температуры перехода из двухцепочечного в одноцепочечное состояние (20-37°С) жесткая структура комплекса мишень ■ реагент приводит к реализации менее выгодной конформации Т1: модификации подвергается преимущественно основание С13. Перераспределение сайтов модификации в пользу

внутридуплексных оснований С2 и С при повышении температуры реакции обусловлено увеличением вероятности реализации конформации Т2.

Для самого слабого комплекса М • RClpNt (в присутствии З'-концевого эффектора) с подвижной структурой модификация протекает исключительно из конформации Т2 по С-основанию мишени.

Изменение направленности модификации мишени реагентами КС1рЫп (п=8, 12) с высокими гибридизационными свойствами в присутствии эффекторов Е, или РНпЕ^Ркп вызвано запрещением модификации С13-основания мишени из конформации Т1, в связи с формированием дуплекса мишень ■ эффектор по соседству с алкилирующей группировкой [Воробьев, 1991]. Однако из-за высокой кооперативное™ регулярной структуры протяженного дуплекса реакционная группировка этих реагентов "замораживается" в конформации-накопителе Т2, что приводит к низкой эффективности модификации мишени в тандемном комплексе.

В случае тетрануклеотида, образующего с мишенью минидуплекс с подвижной низкокооперативной структурой, конформация Т2 характеризуется низким барьером перехода в предреакциошюе состояние. Поэтому вероятность модификации по внутреннему основанию О9 высока и при низких температурах. Присутствие эффектора не препятствует модификации мишени реагентом ЯС1рЫ4, а наоборот, значительно усиливает ее за счет увеличения степени ассоциации мишени с тетрануклеотидом в тандемном комплексе.

ЬРЬп

РЬпЬ'

Аналогичное влияние эффектор оказывает и на модификацию мишени М в несовершенном комплексе реагентом НарИ/а) с низкой гибридизационной способностью, последовательность которого содержит основание А4, некомплементарное звену мишени С. Наличие в комплексе некомплементарной пары, вызывающей локальные нарушения в двойной спирали дуплекса, способствует эффективному алкилированию мишени в присутствии эффектора из конформации Т2, что и приводит к резкому падению фактора дискриминации мисматча при алкилировании октануклеотидным реагентом (с 7.2 до 0.62 при 20°С).

Наличие энергетического барьера алкилирования мишени реагентами с высокой комплексообразующей способностью в тандемных комплексах М-(РЬ.пЕ1Р11п+В.С1рЫп), результирующееся в низком выходе модификации мишени, должно приводить к эффективному протеканию побочных реакций в комплексе. С использованием поочередно 32Р-меченых мишени, реагента и эффектора были исследованы пути расходования реагента КС2р./У12 в растворе (в отсутствие мишени), в независимом комплексе с мишенью и в присутствии эффектора. На основании общего баланса были оценены доли продуктов модификации реагентом КС1рЛГ12 различных нуклеофильных центров (при 37°С и 10"5 М концентрации каждого из компонентов комплекса).

При алкилировании мишени в отсутствие эффектора 84% реагента расходуется в составе комплекса М • {1С1рЫп, из которых 58% идет на алкилирование оснований мишени, а 26% - на самоалкилирование реагента (по основанию С) и его гидролиз.

В составе тандемного комплекса М-(РЬ.пЕ1РЪ,п+КС1рМп) модификация [32Р]-мишени М протекает на 32% по Обоснованию и на 47.5% - по Обоснованию в последовательности самого реагента, т.е. в присутствии эффектора, по крайней мере, 79.5% реагента расходуется на модификацию нуклеофильных центров оснований, находящихся в структуре дуплексного участка мишень • реагент.

Распределение регистрируемых продуктов превращения реагента

М+ РЬпЕ1Р1т + (ИС!) рСАССТССАСССА

У

М • (РЫЕ1 РЛл+ (КС1) рСАССТССАСССА)

гидролиз

рСАССТССАСССА 3.1% (3.1)

самоалкилирование

рСАр 1.4% (1.4)

рСАССТССАр рСАСЗСТССАСр

1%(1)

модификация ыишени М

рСАвСТССАСвСА

гидролиз,

модификация эффектора

рСАССТССАСССА

саиоалкилирование рСАр

32%

15%

47.5%

Это подтверждает преимущественное пребывание дуплекса М- ИС1рМп в конформации Т2 в присутствии эффектора и свидетельствует о том, что наличие высокого энергетического барьера алкилирования мишени при формировании комплекса мишень • реагент с жесткой структурой способствует высокоэффективному самоалкилированию реагента в ущерб модификации мишени.

Таким образом, селективность воздействия на НК-мишень олигонуклеотидными реагентами может быть достигнута при соблюдении двух факторов. Во-первых, формирование совершенного комплекса мишень ■ реагент должно протекать максимально эффективно относительно несовершенного комплексообразования такого реагента. Во-вторых, эффективность модификации мишени в правильном комплексе с олигопуклеотидным реагентом не должна быть ниже, чем в случае формирования несовершенного комплекса. Проведенное сравнительное исследование свидетельствует о том, что этим требованиям в условиях, приближенных к физиологическим, отвечают тандемы коротких олигонуклеотидов эффектор+тетрануклеотид(реагент)+эффектор. Появление мисматчей в структуре комплекса М • рМ4(к) в присутствии эффекторов во всех случаях приводит к его дестабилизации, а эффективность модификации мишени тетрануклеотидным реагентом во всех рассмотренных случаях определяется, главным образом, термостабильностью комплекса мишень-реагент, и подвижная структура тетрамерного дуплекса в составе тандемного комплекса позволяет избежать конформационных затруднений при химической модификации мишени.

ВЫВОДЫ

Предложен новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью, основанный на использовании тандемов коротких олигонуклеотидов состава окта-нуклетид+тетрануклеотид+октануклеотид, где тетрануклеотид и октамеры-эффекторы могут содержать, в зависимости от требований и условий, различные функциональные группировки.

I. Проведено сравнительное исследование влияния эффекторов - окта-нуклеотидов и их производных - на стабильность (температуру плавления) правильных и несовершенных комплексов 20-звенной ДНК-мишени с додека-, окта- и тетрануклеотидом в тандемных комплексах мишень - олиго-нуклеотид+ эффектор(ы) в одинаковых буферных условиях при концентрации компонентов комплекса 13 мкМ каждого. Показано, что: 1) влияние эффекторов (октануклеотида и его 5',3'-ди-Ы-(2-гидрокси-этил)феназиниевого производного) на стабильность дуплекса мишень ■ олигонуклеотид увеличивается с сокращением длины олигонуклеотида или при введении в его структуру однонуклеотидной замены, причем

стабилизирующее влияние эффекторов тем выше, чем ниже собственная гибридизационная способность олигонуклеотидов;

2) максимальная стабилизация дуплекса мишень • тетрануклеотид, сформирующегося в отсутствие эффекторов, может быть достигнута в присутствии пары фланкирующих эффекторов, которые обеспечивают реализацию в тандемных комплексах двух кооперативных контактов:

а) в случае нативного тетрануклеотида - с парой феназиний-содержащих эффекторов, обеспечивающих локализацию феназиниевых группировок на стыках дуплексов мишень-тетрануклеотид и мишень-эффектор-,

б) в случае производного тетрануклеотида, несущего на 3'-конце остаток стероида (холестерина или эстрона) - с парой 5'-холестерил,3'-феназиний-содержащих эффекторов, обеспечивающих создание гидрофобной «скрепки» между З'-концевым остатком стероида в структуре тетрануклеотида и 5'-концевым - в структуре эффектора;

3)из всех рассмотренных олигонуклеотидов максимальной селективностью связывания с мишенью в тандемных комплексах при 37°С обладает тетрануклеотид в составе тандема эффектор+тетрануклеотид+ зффектор.

II. Исследовано влияние эффекторов на модификацию 20-звенной ДНК-мишени в правильных и несовершенных комплексах алкилирующими хлорэтил-К-метиламино)бензилметилфосфамидными производными олигонуклеотидов с различной гибридизационной способностью (додека-, окта-и тетрануклеотидов и их производных) в присутствии эффекторов, локализующихся в тандемном комплексе мишень - эффектор+реагент вблизи реакционной группировки олигонуклеотидного реагента (в одинаковых буферных условиях при концентрации мишени 5-10'' М, реагента и эффектора(ов) - 1 ■ 10"5 М каждого). Показано, что:

1) усиление гибридизационной способности олигонуклеотидного реагента может приводить не только к повышению степени модификации мишени благодаря увеличению степени ассоциации мишени с реагентом, но и к понижению эффективности алкилирования мишени, вследствие затруднений локальных перестроек жесткой структуры дуплекса вблизи реакционного центра, определяющих направленность химического превращения в составе комплекса мишень • реагент;

2)эффектор снижает эффективность модификации мишени олигонуклеотидным реагентом, образующим прочный дуплекс с жесткой структурой (например, додекануклеотидный реагент), и всегда способствует увеличению степени алкилирования мишени реагентом, обладающим низкой гибридизационной способностью и образующим слабые рыхлые комплексы с мишенью;

3)в тандемных комплексах алкилирующие производные окта- и додекануклеотидов малоэффективно дискриминируют комплексы с

мисматчем, поскольку модификация мишени в составе их неправильных комплексов более эффективна благодаря нарушению регулярной структуры дуплекса, вызываемой наличием мисматча; 4) реагент на основе тетрануклеотида в присутствии пары дифеназиниевых октануклеотидных эффекторов высокоселективно модифицирует мишень, дискриминируя все возможные однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания тетрануклеотидного реагента.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Пышный Д.В., Пышная И.А., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. I. Влияние различных типов эффекторов на алкилирование ДНК-мишеней. Биоорган, химия. 1995. Т. 21. № 9. С. 709-716.

2. Pyshnii D.V., Pyshnaya I.A., Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Ivanova E.M., Zarytova V.F. New approach to enhancing the efficiency and specificity of interaction in duplexes by the use of tandem structure. Pure Appl. Chem. 1996. V. 68. № 6. P. 1321-1328.

3. Пышный Д.В., Подыминогин M.A., Пышная И.А., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с ну келейно выми кислотами. II. Тандем коротких олигонуклеотидов -высокочувствительная система к однобуквенной замене в ДНК-мишени. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. № 7. С. 561-568.

4. Пышный Д.В., Пышная И.А., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. IV. Высокая селективность модификации ДНК алкилирующим реагентом тетрануклеотида или его зстронового эфира в присутствии эффекторов. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. № 11. С. 895-902.

5. Pyshnyi D.V., Pyshnaya IA., Lokhov S.G., Ivanova E.M., Zarytova V.F. Miniantisense oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides. 1997. V. 16. № 7-9. P. 15651570.

6. Пышный Д.В., Лохов С.Г., Иванова E.M., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. VII. Влияние конформационных изменений структуры дуплекса на направленность и эффективность модификации ДНК-мишени алкилирующими производными олигонуклеотидов. Биоорган, химия. 1998. Т. 24. № 2. С. 132-138.

7. Пышный Д.В., Лохов С.Г., Иванова Е.М., Зарытова В.Ф. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. VIII. Особенности модификации БзДНК-мишени в тандемных комплексах алгмлирующими производными олигонуклеотидов. Биоорган, химия. 1998. Т. 24. № 3. С. 201-210.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Новосибирский институт биоорганической химии

На правах рукописи

ПЫШНЫЙ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

НОВЫЙ ПОДХОД К ПОВЫШЕНИЮ СЕЛЕКТИВНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук Зарытова В.Ф.

кандидат химических наук Иванова Е.М.

НОВОСИБИРСК -1998

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ б

1. МАЛОБОРОЗДОЧНОЕ И ИНТЕРКАЛЯЦИОННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ 8 НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С

ДВУХСПИРАЛЬНЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (Обзор литературы)

1.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 9

1.2. ИНТЕРКАЛЯЦИЯ 11

1.2.1. Типы интеркаляции 13

1.2.2. Формирование интеркаляционного комплекса 15

1.2.3. Влияние структуры НК на интеркаляцию 17

1.2.4. Сайт интеркаляции 19

1.2.5. Специфичность интеркаляции 21

1.2.6. Термостабильность интеркаляционных комплексов 22

1.3. ВНЕШНЕЕ СВЯЗЫВАНИЕ 23

1.3.1. Специфичность связывания малобороздочных лигандов 25

1.3.2. Размер сайз?а связывания 28

1.3.3. Стехиометрия связывания 29

1.3.4. Влияние структуры лиганда на связывание 31

1.3.5. Кинетика и термодинамика малобороздочного ком- 33 плексообразования

1.4. ДРУГИЕ ТИПЫ СВЯЗЫВАНИЯ . 34

1.5. КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ 40

1.5.1. Конъюгаты олигонуклеотидов с малобороздочными ли- 40 гандами

1.5.2. Конъюгаты олигонуклеотидов с интеркалирующими ли- 45 гандами

1.5.3. Феназиниевые производные олигонуклеотидов - эф- 50 фекторы модификации мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов

2. СЕЛЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ 53 АЛКИЛИРУЮЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ С ДНК-МИШЕНЬЮ В СОСТАВЕ

ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ (Результаты и обсуждение)

2.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГО- 53

НУКЛЕОТИДОВ С ДНК-МИШЕНЬЮ В СОСТАВЕ ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.1.1. Термостабильность комплексов олигонуклеотид•ми- 54 шень

2.1.2. Термостабильность комплексов олигонуклео- 55 тид-мишень в тандемных системах

2.1.3. Термостабильность комплексов мишени и тетрамера в 60 составе трехкомпонентных тандемов

2.1.3.1. Влияние эффекторов - нативных октануклеотидов и 60 их дифеназиниевых производных на термостабильность комплекса мишени и тетрануклеотида

2.1.3.2. Влияние расположения остатков феназиния эффек- 63 торов в трехкомпонентном тандеме на термостабильность дуплекса тетрануклеотида с мишенью

2.1.3.3. Термостабильность комплексов стероидсодержащих 65

трехкомпонентных тандемов

2.1.4. Селективность взаимодействия олигонуклеотидов с 67

ДНК-мишенью в составе тандемных комплексов

2.1.4.1. Влияние эффектора на селективность взаимодейст- 67 вия мишени с олигонуклеотидами в зависимости от

их длины

2.1.4.2. Стабильность комплексов мишени с тетрануклеоти- 7 0 дом, содержащим все возможные однобуквенные замены,г в составе трехкомпонентных тандемов

2.2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЛИЯНИЯ ЭФФЕКТОРОВ НА СЕЛЕКТИВНОСТЬ 7 4 УЗНАВАНИЯ ДНК-МИШЕНИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ В ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСАХ ПО ДАННЫМ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА РАВНОВЕСНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМ

2.2.1. Определение термодинамических параметров незави- 7 6 симого комплексообразования

2.2.2. Определение термодинамических параметров коопера- 77 тивного взаимодействия в тандемных комплексах

2.2.3. Зависимость температуры плавления и степени ассо- 78 циации комплекса мишень•олигонуклеотид от стехио-метрического соотношения его компонентов

2.2.4. Независимое и тандемное комплексообразование 83

2.2.4.1. Независимое и тандемное комплексообразование в 83 составе тандемных систем

2.2.4.2. Специфичность связывания олигонуклеотидов в со- 85 ставе тандема

2.2.5. Селективность взаимодействия олигонуклеотидов 88 разной длины с ДНК-мишенью в тандемных комплексах

2.3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ МОДИФИКАЦИИ ДНК-МИШЕНИ 94 АЛКИЛИРУЮЩИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В СОСТАВЕ ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.3.1. Влияние комплексообразующей способности олигонук- 94 леотидных реагентов на эффективность модификации

мишени в независимых и тандемных комплексах при постоянной температуре

2.3.1.1. Влияние комплексообразующей способности олиго- 96 нуклеотидных реагентов на эффективность модификации мишени в независимых комплексах

2.3.1.2. Влияние комплексообразующей способности олиго- 97 нуклеотидных реагентов на эффективность модификации мишени в тандемных комплексах

2.3.2. Зависимость эффективности модификации мишени ал- 98 килирующими производными олигонуклеотидов в независимых и тандемных комплексах от температуры

2.3.2.1. Модификация мишени додекануклеотидным реагентом 98 в независимом и тандемных комплексах

2.3.2.2. Модификация мишени октануклеотидным реагентом в 101 независимом и тандемных комплексах

2.3.3. Зависимость эффективности модификации мишени тет- 103 рануклеотидным реагентом в тандемных комплексах

от типа используемых эффекторов

2.3.3.1. Модификация мишени тетрануклеотидным реагентом 104

в составе комплексов двухкомпонентных тандемов

2.3.3.2. Модификация мишени тетрануклеотидным реагентом 105 в составе комплексов трехкомпонентных тандемов

2.3.3.3. Зависимость эффективности модификации мишени 107 тетрануклеотидным реагентом от локализации фе-назиниевых остатков эффекторов в структуре тан-

демных комплексах

2.3.3.4. Влияние остатков стероидов, введенных в компо- 108 ненты тандема, на модификацию мишени алкилирую-

щим реагентом на основе тетрануклеотида и его гидрофобных производных

2.3.4. Зависимость фактора дискриминации мисматча при 111 модификации мишени в тандемных комплексах от гиб-ридизационной способности олигонуклеотидных реагентов

2.3.5. Зависимость эффективности модификации мишени в 114 тандемных комплексах от конформационных особенностей дуплексов мишень-реагент

2.3.6. Параллельные пути расходования реагента при моди- 117 фикации мишени

2.3.7. Селективность модификации мишени тетрануклеотид- 121 ным реагентом в составе тандемных систем

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 128

3.1. ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ 128

3.2. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ РАБОТЫ 129 ВЫВОДЫ 134 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136 ПРИЛОЖЕНИЕ 151

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие сокращения:

НК нуклеиновая кислота

РНК рибонуклеиновая кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

N нуклеотидное звено

Ри пуриновый нуклеозид

Ру пиримидиновый нуклеозид

pNn 5'-фосфорилированный олигонуклеотид

poly(N) полирибонуклеотид

poly(dN) полидезоксирибонуклеотид

Acr 2-метокси, б-хлоро, 9-аминоакридин

Phn остаток N-(2-гидроксиэтил)феназиния

Chs остаток холестерина

Est остаток эстрона

RC1 остаток 4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензилметиламина

Ах оптическое поглощение раствора на длине волны X

Sx молярный коэффициент поглощения

Ст суммарная концентрация олигонуклеотидов в растворе

а степень ассоциации олигонуклеотидов в дуплексной форме

Тт температура, при которой степень ассоциации комплекса

олигонуклеотидов равна 0.5 Ттах температура максимума первой производной зависимости Ах

от температуры раствора АН0, AS0 энтальпия, энтропия образования комплекса олигонуклеотидов, рассчитанные по уравнению Вант-Гоффа

Префикс «с1» при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезоксирибо-ряда для краткости написания опущен.

ВВЕДЕНИЕ

Олигонуклеотиды, их производные и аналоги находят широкое применение для создания на их основе молекулярных инструментов исследования НК-зависимых процессов, терапевтических препаратов для подавления экспрессии определенных генов, диагностики вирусных и наследственных заболеваний и т.д. Однако с тех пор как было показано, что олигонуклеотиды, благодаря своему уникальному и универсальному сродству к нуклеиновым кислотам, могут служить адресующей частью реагентов для направленной модификации НК [1], конструирование олигонуклеотидных производных остается одной из основных проблем биоорганической химии из-за того, что требования предъявляемые к таким олигонуклеотидным конструкциям - одновременное сайт-специфичное, селективное и эффективное взаимодействие их с нуклеиновыми кислотами - являются частично взаимоисключающими друг друга.

Эффективность узнавания олигонуклеотидами определенных последовательностей в НК напрямую зависит от их комплексообразующей способности - чем больше нуклеотидных пар образуется при взаимодействии олигонук-леотидов с НК, тем эффективнее их связывание. Сайт-специфичность -взаимодействие только с заранее заданной и уникальной последовательностью - также определяется числом образуемых комплементарных пар, поскольку вероятность встречаемости в протяженных НК конкретных последовательностей убывает с увеличением их длины. Селективность взаимодействия определяется как способность олигонуклеотидов образовывать только правильные комплексы с мишенью, дискриминируя последовательности, отличающиеся от сайта связывания хотя бы одним нуклеотидом. Если для усиления сайт-специфичности и эффективности взаимодействия с НК необходимо использовать олигонуклеотиды с протяженностью сайтов узнавания примерно в 20 мономеров, которые обладают высокой комплексообразующей способностью, то для повышения селективности при физиологических температурах необходимо, напротив, использовать олигонуклеотиды, обладающие слабой гибридизационной способностью, для которых появление одного нуклеотидного несоответствия в сайте связывания должно приводить к резкому падению их сродства к НК.

Компромиссным вариантом решения этой комплексной проблемы могут быть тандемные системы, т.е. наборы коротких олигонуклеотидов, имеющих в последовательности НК прилегающие сайты связывания, суммарная протяженность которых обеспечивает сайт-специфичное связывание с НК. Тандемы, предложенные для направленной модификации нуклеиновых кислот, содержат реакционноспособное производное короткого олигонуклеотида (реагент), эффективность модификации НК которым повышается в присутст-

вии олигонуклеотидных эффекторов благодаря возникновению в тандемном комплексе кооперативных взаимодействий между дуплексными участками эффектора и олигонуклеотидного реагента [2,3]. Действие эффекторов, фланкирующими реагент при их совместном связывании с НК, усиливается введением в них Ы-(2-гидрокси-этил)феназиниевых группировок, повышающих комплексообразующую способность олигонуклеотида [4] . В присутствии дифеназиниевых эффекторов даже реагент на основе такого короткого олигонуклеотида как тетрамер [5-8] способен модифицировать ДНК-мишень сайт-специфично [5-8], т.е. только в пределах того участка, который представляет один непрерывный сайт связывания полного тандема [5].

Поскольку короткие олигонуклеотиды неспособны образовывать прочные несовершенные комплексы с мишенью, можно предполагать, что узнавание сайта связывания реагента на основе короткого олигонуклеотида в составе тандема может быть не только сайт-специфично и относительно эффективно, но также и высокоселективно, что позволит дискриминировать в НК-мишени сайты связывания, содержащие однонуклеотидные несоответствия .

Цель данной работы состояла в исследовании возможности повышения селективности взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК мишенью при физиологических условиях путем замены протяженных олигомеров на тандемы коротких олигонуклеотидов. Для ответа на вопрос, возможно ли селективное взаимодействие НК мишеней с короткими олигонуклеотидами или их производными в составе тандемов, необходимо выяснить а) как влияют эффекторы на комплексообразование олигонуклеотида в составе тандема при снижении гибридизационной способности олигомера за счет сокращения его длины или введения в его структуру однонуклеотидного несоответствия с сайтом связывания в НК-мишени и б) какими должны быть компоненты тандема для осуществления селективного воздействия на НК в условиях, приближенных к физиологическим. Для решения поставленной задачи было проведено сравнительное исследование взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава путем установления закономерности влияния эффекторов на термостабильность олигонукле-отидных комплексов и особенности алкилирования мишени олигонуклеотид-ными реагентами в правильных и несовершенных комплексах олигонуклео-тид■ДНК-мишень.

«...as usual, the simplicity or complexity depends on the point of view of observer and the methods used for observation» Dietmar Porschke. Biochemistry. 1993.

1. МАЛ0Б0Р03Д0ЧН0Е И ИНТЕРКАЛЯЦИОННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С ДВУХСПИРАЛЬНЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

(Обзор литературы) Процессы, связанные с взаимодействием низкомолекулярных органических лигандов с нуклеиновыми кислотами, представляют одно из наиболее интенсивно исследуемых направлений в современной биоорганической химии. Существует много причин, определяющих повышенный интерес к этой области, основными из которых являются, во-первых, выявление фундаментальных принципов, обеспечивающих специфическое связывание лигандов с биомолекулами и, во-вторых, создание соединений, обладающих направленной биологической активностью, с целью получения новых эффективных терапевтических препаратов. Кроме того, накапливающаяся в результате исследований информация расширяет представления о принципах структурной организации природных и синтетических биополимеров. В данном обзоре рассмотрены работы, направленные на изучение взаимодействия различных органических соединений с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами.

К настоящему времени изучено взаимодействие нуклеиновых кислот с чрезвычайно широким спектром низкомолекулярных органических лигандов. Эти соединения можно условно разделить на два основных класса по типу их связывания с двухцепочечными НК. К первому классу относятся соединения, взаимодействие которых с биополимером происходит при полном или частичном встраивании между парами оснований внутри двойной спирали НК. Такие соединения характеризуются внутренним типом связывания и их принято называть интеркаляторами. Во втором классе объединяются соединения с внешним типом связывания, молекулы которых локализуются на поверхности двухцепочечной НК и эффективно взаимодействуют с элементами структуры полимера, экспонированными в среду. Как тип связывания, так и специфичность последнего зависят от структуры лиганда, которая определяет возможные варианты взаимодействия и относительную их эффективность в составе межмолекулярного комплекса, при этом наиболее эффективно взаимодействие в комплексе достигается при реализации принципа структурной комплементарное™ между молекулами «гостя» и «хозяина». В связи с этим очевидно, что нуклеотидная последовательность НК и связанные с ней принципиальные особенности строения биомолекулы также играют важную роль в процессах межмолекулярного узнавания.

1.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Образование межмолекулярного нековалентного комплекса приводит к изменению тех или иных физико-химических характеристик взаимодействующих молекул. Это обстоятельство играет основополагающую роль для изучения процессов межмолекулярного взаимодействия. Существует целый спектр экспериментальных методов, разработанных для описания процессов взаимодействия лигандов с нуклеиновыми кислотами, которые позволяют избирательно следить за состоянием как лиганда, так и заполняемой им двухцепочечной НК.

К наиболее часто используемым методам регистрации межмолекулярных взаимодействий органических лигандов с НК относятся:

1.Различные типы спектрофотометрии

* спектроскопия электронного поглощения (ЦУ-УТБ);

* спектрофлюорометрия;

* спектрополяриметрия.

2.Вискозиметрия.

3.Различные типы калориметрии (дифференциальная сканирующая калориметрия, калориметрия смешения).

4.Химическая или ферментативная модификация (футпринтинг). 5.10 и 2Б-ЯМР спектроскопия.

6.Рентгеностуктурный анализ.

Как правило, первоначальное описание системы взаимодействующих компонентов проводится с использованием методов, дающих некоторые комплексные характеристики равновесных процессов, что позволяет делать выводы об эффективности комплексообразования и дает предварительную информацию о характере связывания лиганда с биополимером.

Оптические методы являются наиболее часто используемыми для регистрации связывания лигандов с нуклеиновыми кислотами. Как интеркаля-ция, так и малобороздочное связывание органических соединений с НК в большинстве случаев характеризуют