Кооперативные взаимодействия олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

■•'■л •

На правах рукописи

АДИНА-ЗАДА Абдуссалам

КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НА КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганическои химии СО РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

д.х.н. О. С.Фёдорова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

д.х.н., проф. О.И. Лаврик д.х.н., проф. Э.Г. Малыгин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт химической кинетики и горения СО РАН

Защита состоится диссертационного

а(г

у ча

1998 года в у часов на заседании совета 003.52.01 в Новосибирском институте

биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск 90, просп. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан "_

X/

1998 года.

Учёный секретарь, диссертационного совета

д.х.н. О.С.Фёдорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИС ТИКА РАБОТЫ.

:туальность проблемы. Кооперативные взаимодействия лнгамдов с ополимерами играют важную роль в функционировании живых систем, шболее характерны кооперативные эффекты для белковых молекул, ких, например, как аллостерические ферменты. Однако они оявляются и в нуклеиновых кислотах и имеют существенное значение в ханизмах матричного биокатализа. Нуклеозиды и олигонуклеотиды ми могут могут образовывать тандемные структуры на мплементарных последовательностях нуклеиновых кислот благодаря оперативному взаимодействию, вызванному стэкингом гетероциклов седних нуклеотидов.

Как и любое другое фундаментальное явление, кооперативное аимодействие олигонуклеотидов может быть использовано в различных икладных молекулярно-биологических задачах, таких как диагностика юмных последовательностей с целью выявления одиночных мутаций и направленное воздействие на нуклеиновые кислоты с помощью акционноспособных производных олигонуклеотидов. Поэтому изучение оперативных взаимодействий олигонуклеотидов является актуальной учной задачей.

:ль работы заключалась в получении количественных характеристик оперативных взаимодействий дезоксирибоолигонуклеотидов на мплементарных последовательностях ДНК и исследовании влияния на и характеристики структуры области контакта олигонуклеотидов.

1учпая новизна и практическая ценность. Для получения параметров оперативных взаимодействий олигонуклеотидов в настоящей работе ервые применен метод, основанный на комплементарно-адресованной »дификации нуклеиновых кислот реакционноспособными производными игонуклеотидов. Показано, что с помощью данного метода можно ходить характеристики не только контактных взаимодействий игонуклеотидов, но и неконтактных, опосредованных изменением руктуры нуклеиновой кислоты при образовании комплексов с игонуклеотидами. Исследовано влияние на эффективность оперативных взаимодействий присутствия в области контакта игонуклеотидов на мишени некомплементарных или химически >дифицированных нуклеотидов.

^бликации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы i статьях и 3-х тезисах докладов. Результаты работы были доложены на эм международном совещании по биохимической стереодинамике лбани, CUJA, 1995), на международном совещании "Нуклеиновые

кислоты и подобные молекулы" (Ульм, Германия, 1997), российск французском совещании по матричному биокатализу (Новосибирск, 199' Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключени выводов и списка литературы. Она изложена на 120 стр. и включает рисунков. 16 таблицы и список цитируемой литературы из Ь наименований.

Содержание работы

I. Теоретические основы метода метода комплементарно-адресованио модифицирующего титрования (KAMT).

В серии работ Новосибирского института биоорганической xiimi СО РАН было показано, что величины констант ассоциащ олигонуклеотидов с комплементарными участками нуклеиновых кислот образованием дуплексов и триплексов могут быть получены зависимостей предельных степеней модификации нуклеиновых кист адресованными реагентами от концентрации реагентов. Наибол детально этот подход был отработан на производных олигонуклеотидс несущих Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламинофенильную группу RC1. Сам подх! к специфичной к последовательности модификации нуклеиновых кислот помощью реакционноспособных производных олигонуклеотидов бь впервые предложен H.H. Гриневой и назван "комплементарн адресованной модификацией". Поэтому определение констант ассоциащ производных олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами зависимости степени модификации нуклеиновых кислот от концентрат этих производных может быть названо методом "КОМПЛЕМЕНТАРН» АДРЕСОВАННОГО МОДИФИЦИРУЮЩЕГО ТИТРОВАНИЯ" и. сокращенно KAMT.

Ранее в работах В. Ф. Зарытовой с сотр. (1988) было показано, ч при направленной модификации нуклеиновых кисл реакционноспособными производными олигонуклеотидов в присутств: дополнительных олигонуклеотидов-эффекторов повышает

эффективность и селективность реакции. Олигонуклеотиды-эффектор связываясь с реагентами на соседних участках мишени, способь увеличивать константы ассоциации с мишенью отдельных компонент тандема за счет кооперативного эффекта. Параметры кооперативност являющиеся количественной характеристикой кооператива взаимодействий, могут быть рассчитаны, как отношения конста ассоциации реакционноспособных производных олигонуклеотидс найденных в условиях, когда мишень полностью насыщена эффектором, константам ассоциации в отсутствие эффекторов.

В методе KAMT для определения констант ассоциащ олигонуклеотидов с' мишенями используется кинетическая cxei

модификации нуклеиновой кислоты-мишени алкилирующ!

эоизводным олигонуклеотида, предложенная ранее Д. Г. Кнорре (1978), вторая нами была дополнена равновесиями с участием эффекторов. Если доводить модификацию в присутствии двух эффекторов Е| и Е:, которые ¡язываются с мишенью со стороны 5'- и З'-концов реагента (В.Ф. фытова и сотр., 1990), то в кинетической схеме необходимо учесть ^вновесия 1)-7).

В условиях квазиравновесия, когда скорость модификации мишени значительно ниже скорости установления

равновесия было получено выражение для предельной по времени степени модификации мишени Р реагентом X в присутствии эффекторов Е|, и Ез с образованием продуктов РЪ (ур. (1)). Это уравнение существенно упрощается при дая различных предельных по концентрациям эффекторов случаям: в отсутствие эффекторов, в присутствии насыщающей концентрации одного из эффекторов, в

р

5' г

1 II 1 1 1 И и 1 II 1 II II И И II и 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ....... 1 1 1 1 1

3' 3' 3' .5' 3' .5'

Е1 X Е2

1) Р + ХоРХ (Кх)

>) Р +

Р + Е2с=>РЕ2 (Ке2)

1) Р + Е! + Е2«РЕ1Е2 (КеП)

>) Р+Е + Х<=> РХЕ | (Кхе1 )

5) Р+Е? + X о РХЕ2 (Кхе2)

0Р + Е,+.Е2 + Х«РХЕ,Е2 (КхеП)

рисутствии обоих эффекторов (ур. (2)-(5)).

_ 1 _ (_ Ге/_КхХ° +Уе/\КХе]Х0ех+уе/2Кхе1Х0е2+у^\2КхеПЧе\е2 1 (1) Ро Л 1 + КхХ0 + клех + ке2е2 + КХеХ*0е\ + Кхг2*ое2 + Кхе\1Че\е2 )

1е х0 > РО >е01 <е02 ' исходные концентрации X, Р, Е[ и Е2, ютветственно.

е01 =°^02 =°

гг]а

РО

= I - ехр

У о

1

КхЧ

е02 =0, е01 ->со рг 7а

Ро

= 1 - ехр

1 +

71 __

Кхе1х0 )

= 1 - ехр

(2)

П

1 +

1

Р,Кхх0

(3)

3. C'Q] = 0,CQ2 >

l PZ]* Po

1 - exp

\

72

]+ ке2

V Kxc2x0

= I - exp

72

1 +

ß2Kxx0

(4)

4. e0l > 00

[PZL

PO

= 1-

exp

1 +

712 _ _ _ KcjKe2

Kxel2x0

1 - exp

712

1 +

ßl2Kxx0

(5)

Степень модификации должна возрастать с ростом концентрации реагент до значения, определяемого величинами у. Из этих зависимости' используя значения констант ассоциации реагента с мишенью в отсутстви эффектора методом нелинейной регрессии можно найти параметр! кооперативное™ р, и р 12, характеризующие изменение констан ассоциации реагентов с мишенями в комплексе с одним эффектором Е, ил с двумя эффекторами Е| и Ез, соответственно:

Кхе,

кхке

и ßl2 =

Кхе12 KxKelKe2

(6).

II. Определение параметров кооперативного взаимодействи олигонуклеотидов методом комплементарно-адресованног

модифицирующего титрования (KAMT).

Ранее в работе В. Ф. Зарытовой, И. В. Кутявина и др. (1990) был показано, что если фланкировать реагент на мишени с обеих сторон помощью олигонуклеотидов-эффекторов, то достигается почт количественная модификация 302-звенного одноцепочечного фрагмент ДНК. Представлялось интересным получить для этой системы детальны количественные характеристики кооперативных взаимодействий. Дл этой цели в качестве мишени нами был использован 26-звенны дезоксирибоолигонуклеотид, содержащий участок 253-276 302-звенног фрагмента ДНК. 26-мер pTTGCCTTGAATGGGAAGAGGGTCATT (Т26 содержал участки связывания реагента X, эффекторов Ei и Е: фланкирован с двух сторон (Т)г Модификацию проводили 4-(N-2 хлорэтил-М-метиламино)бензил-5'-фосфамидным производньи

олигонуклеотида dpTTCCCA (Х6) в присутствии в качестве эффекторо производных олигонуклеотидов Phn-L-d(pTTCAAGGCp)-L-Phn (Е |) Phn-L-d(pTGACCCTCp)-L-Phn (Е2), где Phn - N-(2 гидроксиэтил)феназиниевый остаток, L - этилендиаминовый cneficej:

ффекторы Е], Е2 и реагент X образовывали тандемные комплексы РХЕ], ХЕ? и РХЕ]Е2, в которых Е] расположен с З'-стороны и Е? с 5'-сторопы

^агента на мишени (Рис. 1).

Использование в наших экспериментах достаточно короткой 26-¡енной мишени, а не 302-звенного фрагмента ДНК, было обусловлено гобходимостыо избежать возможных искажений количественных днных, вызываемых неспецифической деградацией длинных ДНК при Зработке в 1М пиперидине при 95°С, проводимой для расщепления по одифицированным остаткам гуанина. Модификацию проводили при >°С в буфере: 0.16 М NaCl, 0.02 М NaíHPO-i, 1 мМ ЭДТА, рН=7.5. гакционную смесь инкубировали до полной ионизации связи С-С1 в гагенте в течение времени, в 5 раз превышающем время полупревращения реакции ионизации связи С-С1 реагента.

Эффектор Е| Эффектор Ej

Phn-L Phn-L L-Phn L-Phn

lili P P P P

3 ' ' ' 5' 3' ' '5'

CGGAACTT CTCCCAGT

5' 3

pTTGCCTTGAATGGGAAGAGGGTCATT

ACCCTT 3' | У

P

C1RCH ÍIH 2

Реагент X6

де:

СИ, CH2CH2OH

I I

= —¿ \—N- CH .-CU - Cl

2 2

Phn =

-nh-ch2ch2nh-

o

1С. 1. Структура тандемного комплекса между мишенью (Т26), реагентом 6 и олигонуклеотидными эффекторами Е[ и Ез.

В отсутствие эффекторов реагент модифицировал мишень эеимущественно по остатку с образованием продукта сшивки,

обавление эффектора Е] не изменяло положения модифицируемого :нования. Однако при увеличении концентрации эффектора Е2

зоисходило уменьшение степени модификации по остатку о'^ с

параллельным увеличением степени модификации по остаткам с'^-О'^ что согласуется с полученными ранее данными Зарытовой и сотр. (1990; При проведении расчетов мы определяли суммарную степен модификации.

На рис. 2 и 3 представлены зависимости степени модификации о концентрации эффекторов Е| и Ез для разных концентраций реагента.

lpzl JР О

0.7-,

0.60.5 0.4 0.3 0.2

0.10.0

[PZ]o0/Pc 0.6

0.5

0.4

0.3

-8.0

-7.0

-6.0 -5.0 1 g(e1,M)

-4.0

0.2.

0.1

О.О

-8.0

-7.0

-6.0 1 g(ez,M)

-5.0

Рис. 2. Зависимость предельной степени модификации [/>2]э0 / ра при I—>оо мишени Т26 от логарифма начальной концентрации

эффектора Е|, ]), при разных начальных концентрациях реагента Х6 х0: • - Ы0"6М (кривая 1)> -5-10"6М (кривая 2), ■ - 8.23-10"6М (кривая 3){р0 = 510"9М,25°С).

Рис. 3. Зависимость предельно степени модификации [PZ]^ / pt при t—>со мишени Т26 от логарифм начальной концентраци

эффектора Е2, lg(c?2), при разны начальных концентрациях реагент Х6 х0: ■ - 5-10"6М (кривая 1), □ -

•10"5М (кривая2), • - 4.3-10"5! (кривая 3), О -8.610-5М (кривая 4

Т -1.3-10"4М (кривая 5) (р0 = 10'9М, 25°С).

Видно, что эти зависимости достигают платового значени которое растет с концентрацией реагента. На рис. 4 изображен зависимости Платовых значений от концентрации реагента. Видно, чт максимально достижимая степень модификации соответствует примерь 60 %. Из этих зависимостей были определены параметры кооперативное] р, равные 31 для взаимодействия реагента с 1-ым эффектором, 1.9 д.1 взаимодействия со 2-ым эффектором и 272 для одновременно! взаимодействия с обоими эффекторами. Если бы взаимодействие бьи аддитивным, то произведение Р1ХР2 было бы равно Р12. Фактически, эт произведение меньше в 4.5 раза.

[ргк / р„

О . 8

0.6 -

0.4

0.2

0.0 0.0

о/ • ■ ■ 1

Г2

■ • ^4

I / п^а

О . 1

0.2

0.3

Хп, мМ

ис. 4. Зависимость предельной гепени модификации мишени (Т26) PZ]r0 / ра при I—>со от начальной онцентрации реагента Х6 х0:

ривая 1-^=1-10-%,^= 1.3810"5М О); кривая 2 - е;=1-10-5М, е,=0 (■); ривая 3 -е2 =1.38-10'5 М, е,=0 (•); ривая 4 -<?,=0, е2=0 (□), Ро= 5-10-9М).

1Сходном буфере, в котором [Ыач]=0.2 лочевины, разрушающей вторичную 1редставлены в Таблице 1.

Таблица 1. Степени самомодификации

Такое различие может быть объяснено существованием не только прямого кооперативного взаимодействия, обусловленного контактом эффекторов и реагента на мишени, но и косвенным неконтактным взаимодействием, возникающем вследствие

воздействия олигонуклеотидов на пространственную структуру мишени.

Для того, чтобы подтвердить возможность образования 26-мером различных

пространственных структур в отсутствие и в присутствии эффектора Ег, нами было синтезировано производное 26-мера, несущее на 5'-концевом фосфате алкилирующую группу СЖСНгМН-, и были определены степени самоалкилирования

различных нуклеотидных остатков. Эксперименты проводились как в М, так и в присутствии 7М структуру 26-мера. Данные

Полученные данные о распределении сайтов внутримолекуляр ного алкилиро-вания по нуклео-тидным звеньям С2, С3, С4 и С7

) составе СШСНз^-^'-фосфамидного производного (Т26) согласуются с :уществованием следующих структур мишени:

Условия реакции С3 С СЧЗ14 С7

7М мочевина 14.7 3.4 0 0

Буфер 17.1 4.0 4.0 9.0

Буфер + Ег 25.5 3.4 35.7 0

С-С-С-А-А-С-А-С-С-С-Т-С-А-Т-Т

с-с-в-т-т

„^С-С-С-Т-Т С-Т-С-С-С-А-С-Т-р-Ь-РЬп

I

р-Ь-РЬп

Структура(1)

Структура (2)

В структуре (1) имеется шпилька, содержащая в стебле ¿ канонические и 1 неканоническую пару, а петля состоит из 5-ti нуклеотидов. В присутствии эффектора Е? образуется структура (2) i длинным стеблем, в котором Е: находится в тандеме со стеблеобразующт 5'-концом мишени. Такая структура может привести к низкому параметр; кооперативности, когда исследуется взаимодействие только с эффекторол Е2. Очевидно, что наблюдаемая в эксперименте модификация звена G наблюдается как в обычных, так и в денатурирующих условиях. В то ж< время модификация остатка G17 наблюдается только в отсутстви эффектора Ез.

Чтобы найти параметры кооперативности, вызванньг контактным и неконтактным взаимодействиями, была проведен; модификация укороченных мишеней (TIO), (Т22) и (Т'22): pTTGCCTTGAATGGGAAGAGGGTCATT (Т26)

pTTTGCCTTGAATGGGAAGAGTT (Т'22)

pTGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT (Т2 2)

pTGGGAAGAGT (TIO)

Мишень (Т'22) содержала область связывания лишь эффектора Е и реагента Х6. Мишень (Т22) содержала область связывания реагента соответствующую району 11-16 основной 26-звенной мишени, ш лишенную способности образовать шпильку из-за отсутствия част: области 3-10, а также область связывания эффектора Ез. Соответстующи константы ассоциации приведены в Таблице 2.

Сравнивая результаты, полученные дл мишени Т26 i двух укороченны мишеней (Т22) ; (Т10), легю

видно, чт<

величины Кх дл

коротких мишеней выше

два раза. Видно также, что сродство реагента Х6 к (Т22) в присутствии Е

на порядок выше, чем к Т26. Это означает, что в составе длинной мишен Т26 участок связывания реагента вовлекается в формирование вторично структуры, что препятствует ассоциации с реагентом.

В этом случае эффектор Ei выполняет двоякую функцию образует дуплексную структуру с участком мишени, препятству вовлечению этого участка в образование стебля шпильки, и контактируе с 5'-концом реагента, упрочняя его связь с матрицей за счет контактно кооперативности.

Таблица 2. Константы ассоциации реагента (Х6) с

мишенями различной длины.

Мишень Эффектор К,, М"'

(Т26) - (2.2±0.4) 104

(Т10) - (4.2+0.7)-104

(Т22) - (4.2±0.7)-104

(Т22) Е2 (4.2±0.7)-105

(Т'22) El (6.1±1.6)105

Влияние эффектора Г; 2 выражается, с одной стороны, в

бразовании с мшненыо новой структуры, не способной связываться с еагентом, а с другой стороны, в возможности кооперативного вязывания реагента X и эффектора П2 с мшненыо. При одновременном рисутствии обоих эффекторов мишень находится в линейной форме и оступна для ассоциации с реагентом.

Таким образом, определяемый нами параметр кооперативности вляется произведением двух величин: контактной кооперативности а, и еконтактной кооперативности 5. Из полученных значений констант ссоциации для длинной и укороченных мишеней можно рассчитать онстанты равновесия структурных переходов мишени (Т26) и параметры онтактной и неконтактной кооперативности. Константа равновесия К^ , арактеризующая переход между линейной и шпилечной формами [пшени, рассчитывается из константы ассоциации реагента с короченными мишенями, которая соответствует связыванию с линейной

юрмой длинной мишени Кх, и с длинной мишенью Кх ■

Р!«РЬ (К/,)

Р| + Х» Р[Х (К^) Кх = К'х (7)

В результате

находим, что КН = К!Х/КХ- 1 = (4.2±0.7> 104/(2.2±0.4)-

04-1 = 0.9±0.1. То есть, при 25°С почти половина мишени находится в тпилечной форме. Параметры прямой или контактной кооперативности 2/ рассчитывается из величины ассоциации реагента с длинной мишенью, аходящейся в комплексе с Е1 (Кхе!) и константы ассоциации с короткой шшенью (к'х):СС1 = К^/(Ке1К1) = (6.7+0.1) •105М-|/(4.2±0.7) -Ю^М*1 = 16.0 0.1, а параметр косвенной или неконтактной кооперативности равен 5| =(1 +А:а)= 1.9 ±0.1.

При взаимодействии эффектора Ег с мишеныо образуются омплексы Р)Е2 и Р|тЕ2, имеющие линейную и шпилечную структуру, оответственно. Реагент ассоциирует только с линейной формой Р]Е2 + X

;> Р1ХЕ2 (Кхе2). Константа равновесия перехода Р]Е2 <=> РьЕ2 равна

Кш = К'Х1л / Кхс2 -1 = (4.2+0.7)-105/(4.2±0.3)-104-1 =9.0+0.1. Её величина значает, что комплекс РЕ2 на 90% находится в форме шпильки Р]1Е2. 1араметры кооперативности описываются уравнениями (20)-(23) и равны Ч = кхс2 / =(4.2±0.7)-105/(4.2±0.7)-104= 10.0Ю.З, 82= (1 + А"/,)/(1 + К,к2)

9

= 0.2. Как видно из структур использованных систем, параметр прямо! кооперативности ai соответствуют контакту немодифицированного (3') концевого аденозина с (5') Phn-L-pC (реагент и эффектор Ei), а а2 контакту (5')Tp-NHCIl2RCI и (3')Phn-L-pC (реагент и эффектор Ез).

III. Влияние модифицированных концевых нуклеотидов в области контакт; олигонуклеотидов в тандемном комплексе и структуры мишени н: величины параметров кооперативности.

Представляло интерес применить метод KAMT для получени параметров кооперативности на других типах контактов, в том числе установить влияние неканонических пар оснований на параметрь кооперативности. Последнее имело бы значение для решения вопроса i повышении специфичности узнавания нуклеиновых кисло олигонуклеотидами и их производными.

Было проведено исследование кооперативных взаимодействий возникающих на различных типах контактов, а именно: 1) между двум немодифицированными нуклеотидами, 2) между немодифицированным! нуклеотидами, один из которых на контакте не образует каноническо: Уотсон-Криковской пары с мишенью, 3) между ЫНСШКО-радикалом спаренным немодифицированным нуклеотидом и 4) между остатком Phn L- и неспаренным немодифицированным нуклеотидом (рис. 5).

В качестве мишеней были использованы следующи олигонуклеотиды (Т22), (Т'22), (Т10), а в качестве реагентов - CIRCH2NH dpTTCCCA (Х6), - ClRCH2NH-dpTCTTCCCA (Х8) и - CIRCH2NH dpTCTTCCCT (X8m). Первые два имели сайты связывания на всех тре мишенях. Реагент Х8т образовывал неканоническую пару TT с 5 концевым нуклеотидом сайта связывания Х8. В качестве второг компонента тандема использовали эффекторы Ei и Ез, содержащие несодержащие остатки К-(2-гидроксиэтил)феназиния.

Насыщающие концентрации эффекторов Е] и Е2 был определены методом KAMT для образования следующих четыре комплексов: (T26)Ei, (Т26)-Ез, (T'22) Ei, и (Т22)Е2. Для этого был получены зависимости предельных степеней модификации мишене [PZJoo / р0 при t—соответствующих мишеней при фиксированно концентрации реагента Х6 от концентрации эффекторов в интервале от до 510 4 М. (Аналогичные зависимости для эффекторов E[Phen,E2Phen был

получены ранее и представлены в разделе И). С ростом концентраци эффекторов эти зависимости достигали предельных значений (рис. 6 А, В что свидетельствовало насыщении мишеней соответствующим эффекторами. Как видно из рис. 6, изменения в величинах степене модификации носят различный характер, хотя насыщение мишене наступает примерно при одинаковых концентрациях эффекторов E¡ an

Е2 , равных ~ 1.0-10 5М.

Т10

I I I 11 u I 11 I I I I I IT

T '22

[lili II

I I 4 I I I I I IJ I I I

I I I I I I I I I I I I : i*

El

X6

T'22

N I I l I I I I I I I II II I IJ I I I X I I I I I I I I I I I I ij

,Phn

X6

Т10

П7

I ' I I I i м

X8

T'22

I I I I I I I I I I I I I II I i i I I I I

I I II I IJ I I I I I I ff

El

X8

T * 22

И I I I M I I M | I I II | I I l.l í ,1 I I i i I I i I II I I N l|

ь r,Phn щ, xs

Т10

I I I I I I I 1,1 I

V-b

I I l.l

X8

T'22

lili IIIIilJJIIillII.il I I 1^1 I I I y) I i i II ij

' " XSm

y_

I I I I I

T'22

. . I I M I I I II II II l.l í f i i i i i i i yj M I I I

* FPhP XS"1

T22

I II IJ I I I I I I I И II i i i |Д i i i 1111

Хб

E2

T22

Г1 I II I I I I IJ I I I I I I I M l"¡ I I I I I ifl I I I I I I 1

X6

*> Phn »

2

Рис. 5. Схематическое изображение комплексов реагентов с укороченными мишенями. Алкилирующая группа СШСЬ^ЬШ- изображена стрелкой;

РЬп- группа изображена символом

Для эффекторов Е1 Р|,еп и Е2 Р|,см соответствующие насыщающие концентрации, были равны ~ 1.0-КИМ.

[Щ

'00

о

0.60

0.40

0.20

0.00

А

.......... 1

□

■о 2

.--а' °

• •о

......в......." •...... 3

" °----°° „..... 4

-8.00 -6.00 -4.00 ^[эффектор]

[рг]

оо

0.60

0.40-

0.20

Чв

«V

О

0.00-

' о -о

В

□____П......-а 6

-7.00 -5.00 -3.0

^[эффектор]

Рис. 6. Зависимости предельных по времени степеней модификации в составе комплексов (Т'22)ЕГХ6, (Т22) Хб-Е2 (А) и (Т26)ЕГХ6, (Т26)Х6Е2 (В) от концентраций эффекторов Е( и Е2 при 25°С. Кривые 1,2,5,6 -зависимости [Рг]„/р0 (при 1->оо) от логарифма начальной концентрации эффектора Е|, /£(<?/) . Кривые 3,4,7,8 - зависимости [Р2].Л/р0 (при I—>к>) от логарифма начальной концентрации эффектора Е2, Две

параллельные серии экспериментов были проведены при двух фиксированных концентрациях реагента Х6: ■,•- 1.9-10"5М,П,0-3.8-10"6М(^о <510"9М).

Полученные значения констант ассоциации реагентов с мишенями приведены в Таблице 3. Здесь же приведены значения уес, которые не превышали единицы.

Таблица 3. 'Значения констант ассоциации Л" и параметров ус/ для

взаимодействия мпшень»реагент при 25°С.

Комплекс Консгаига ассоциации А'при 25"С, М-1 УеЛ

1. Т10.Х6 К1б (4.2±0.7)104 0.8+0.1

2 Т10Х8 к'' (1.1 ±0.3) 1 ол 0.7+0.1

3. Т10.Х81" ¡А,т л'8 (3.4+0. !)■ 105 0.6+0.1

4. Г22.Х6 (1.1±0.3)104 1.1±0.1

5. Т22«Х6 ,/гт КхЬ (4.2+0.7)-104 0.8+0.1

6. Т26.Х6 Кхв = 4б / (•+ (2.2±0.4)104 0.8+0.1

7. Т'22«Е|»Х6 Кх6с1 =а16'Кх6 (2.2+0.5)-1 0.810.1

8. Т'22«Е1Р|,С" «Х6 г/,/'/ш _ „Р1т Г1 Л'6с'1 -а16 -Кх6 (6.8±0.1)105 1.0+0.1

У. Т'22.Е|.Х8 Кх8е\ = а\8'КхЯ (4.0+0.1)106 0.710.1

10. Г22.Е|Р||И>.Х8 1А,Ркп „РИп ,А .т8с1 — 18 ' .т8 (1.5+0.4)-107 0.810.1

11. Т'22«Е]»Х8'" ,А.т т л8<?1 ~ 18 ' (3.3+0.1) 105 0.610.1

12. Т'22«Е|РЬс" «Х8т т,1,т,Р1т т,Р1т т^Кт д'8е1 — 18 ' х8 (3.710.2)-10й 0.610.1

13. T22.X6.E2 Кх6е2 = а26 ' К'хЬ (4.0±0.6)-104 0.810.1

14. Т22»Х6.Е2р|и'п к1,Р1т _ „РИп „1 х6с2 - а26 " кх6 (4 2+0.7) 105 1.010.1

15. Т26«Е]«Х6 Кх6е\ = Р\Ь ' Кх6 (6.8+2.3)104 0.8+0.1

16. Т26»Е]Р|1СП «Х8 , РИп рР/'П хве\ ~ Р\Ь ~Кх6 (6.8+0.1) 105 1.0Ю.1

17. Т26.Х6«Е2 К'хбс2 = Аб ' (7.9+2.8)10^ 0.810.1

18. Т22«Х6.ЕР|1СП 2 Кхве2 ~ Р26 ' Кх6 (4.2+0.3) 104 1.010.1

19. Т26»Е|.Х6«Е: Кх6с\2 = а\2в'Кх6 (2.3+0.47)-105 0.910.1

20. Т26.Е1.Х6.Е2Р1,СП г^/, РИп _ РИп гА л"6е12 ~~ 126 ' Ах6 (5.9+1.0)10^ 1.010.1

В таблице 4 представлены и структуры узлов в области контакта компонентов тандема и значения параметров прямой кооперативности, полученные для всех исследованных комплексов.

Таблица 4. Структуры узлов в области контакта компонентов тандема и значения параметров контактной кооперативное!и а__

Комплекс Структура узла на стыке а

Т'22*Е|*Х6 -А—Т--Т А- 5.2

Т'22»Е1*Х8 И — ■■-■ || 3.6

Т,22*Е1Р1,СП»Х6 -А—Т- -Т А- 1 С—РЬп 16.2

Т'22*ЕР1,еп1*Х8 II-II 13.6

Т'22»Е|»Х8т -А—Т--Т Т- 0.97

Т'22*Е|Р1,еп«Х8т -А—Т--Т Т-1 1_—РЬп 10.8

Т22»Х6*Е2 -А—СЗ- —'Т С — 1 N4 1 СН—КС1 0.95

Т22*Х6*Е2Р|,еп -А— в--Т С-1 1 МН РЬп 1 СНу-КС! 10.0

Из приведенных данных вытекает несколько следствий. Во-первых, наличие на стыке нуклеотида, содержащего остаток феназиния, существенно усиливает кооперативность. Во-вторых, присутствие концевого мисмэтча полностью элиминирует кооперативные взаимодействия с ^модифицированным нуклеотидом. В то же время достаточно сильное взаимодействие между остатком нуклеотида в составе мисмэтча и остатком нуклеотида, модифицированным феназинием, сохраняется. То же имеет место и при наличии в области контакта реакционноспособной группы -МНСШКО, то есть взаимодействие с немодифицированным остатком нуклеотида элиминируется, но досточно сильное взаимодействие с остатком феназиния остается. При этом следует оговориться, что эти следствия основаны на данных, полученных для определенных пар нуклеотидов, контактирующих в тандеме, и степень их общности может быть установлена только систематическим исследованием всех комбинаций нуклеотидных остатков на контактах.

В таблице 5 представлены в совокупном виде сведения о рассчитанных с помощью метода КАМТ величинах параметров контактной, неконтактной и полной кооперативности. Как видно из этих данных, связывание эффекторов Е| и Е|Р|,е" с мишенью (Т26), способной образовывать шпилечную структуру, характеризуется положительной неконтактной кооперативностью с параметрами 5| и 5|Р,1СП, равными 2.0± 0.1. Эти эффекторы предотвращают образование шпилечной структуры (Т26) и способствуют связыванию реагентов Х6 и Х8 (Схемы 1 и 2). Результирующий параметр полной кооперативности, поэтому выше, чем параметры контактной кооперативности, возникающие благодаря прямому стэкингу концевых оснований тандема. В противоположность этому, эффекторы Е2Р|1СП и Ег стабилизируют шпилечную структуру (Т26), препятствуя связыванию реагента Х6 (Схема 3). Это приводит к отрицательной неконтактной кооперативности. Как видно из таблицы 5, параметр полной кооперативности в этом случае мал, р2р|'т = 1.9±0.1, для тандемной последовательности Х6-Е2Р|,еп на мишени (Т26), или меньше единицы, = 0.4±0.1, для тандемной последовательности Х6-Е2. Отрицательная кооперативность в последнем случае означает уменьшение стабильности комплекса мишень-реагент в присутствии эффектора Е2

вследствие того, что эффектор Е2 стимулирует образование шпилечной структуры мишени и приводит к уменьшению кажущегося значения константы ассоциации реагента.

Схема 1:

Т26

(4.) Х61

Хб

Схема 2:

Т26

Р1т '

хбе! 1

Х6

Ч1 Т26

Хб

Р1ш Ке1Ь =°

К о^-

Схема 3:

Т26

г l,Phn, (Кх6е2) Х6

Г

,РЬп

Х6

Phn Ke2h

Т26

st

»Ж

В Таблице 6 приведены значения параметров дискриминации, рассчитанные из величин констант ассоциации олигонуклеотидов с комплементарными ДНК-мишенями.

Таблица 6. Параметры дискриминации, рассчитанные для нетандемного комплекса и двух тандемных, содержащих эффекторы Е| и Е|Р''е" *

Совершенный комплекс Несовершенный комплекс Параметры дискриминации, V

(Т10)-Х8 (Т10) • X8m к-1 v = ;8 Кх$ 3.1±0.4

(Т22) Е, • Х8 (Т22)Е, • Х8т 1 ~ vl,m ~ т „Lili 12.0+0.1

(Т'22) • E('he" ■ Х8 (Т'22) ■ E,/fe" ■ Х8Ш ,J,Phn Phn ,J,Phn у Phn 'VI.vS_____«KS ' лд8 ' ,J,m,Phn m,Phn ,A,m,Phn Ke\x% a18 ~ax8 4.1 ±0.2

* Нижний индекс "8" в обозначениях констант ассоциации реагента и параметров кооперативное™ указывает, что данные относятся к реагенту Х8.

На примере комплексов (Т10)-Х8 и (Т10) Х8т видно, что концевая неканоническая пара Т-Т уменьшает константу ассоциации олигонуклеотида лишь в 3.1 раза. Если же неканоническая пара находится в области стыка олигонуклеотидов в тандеме, но это приводит к различию констант ассоциации в 12 раз (комплексы Т'22*Е|*Х8 и Т'22*Е1»Х8т , коэффициенты кооперативное™ которых составляют, соответственно, 3.6 и 0.97), и 4.1 раза в случае комплексов Т'22*Е|Р1,т*Х8 и Т22*Е|Р|'е» «Х8га, для которых коэффициенты кооперативное™ равны, соответственно, 13.6 и 10.8. Видно, что параметр дискриминации значительно возрастает при использовании тандема олигонуклеотидов, причем стабилизирующая дуплекс феназиниевая группировка на концевом нуклеотиде уменьшает параметр дискриминации.

Table 5. Параметры контактной, неконтактной и полной кооперативности при 25°С*.

Комплекс Параметр контактной кооперативности а Параметр неконтактной кооперативности 8 Параметр полной кооперативности /3

(T26)Ei-X6 «16 5.Ш.1 ^6 = 1 + Kh 2.0±0.1 Аб = «16-^6 10.0+2.4

(T26)-EiPhcn-X6 ЯЙ/7 «16 16.0+2.2 s&hn = \ + Kh 2.0±0.1 о Phn „ Phn sPhn Pl6 =«16 '¿16 31.314.9

(Т26)Х6Е: «26 1.0+0.1 $2 l + Kh 1 + Ke2h 0.410.2 PIG = «26 ■ 0.410.1

(T26)-X6-E:phen Phn «26 9.910.2 P,m 1 + Kh "u vphn 1 + Ke2h 0.210.1 nPhn „Phn sPhn P26 = «26 " ¿26 1.910.1

* Нижний индекс "6" в обозначении параметров кооперативности указывает, что данные относятся к реагенту Х6.

выводы

В настоящей работе исследованы количественные характеристики кооперативных взаимодействий олигонуклеотидов в тандемных комплементарных комплексах. Результаты проделанной работы можно сформулировать следующим образом:

1. Для определения параметров кооперативного связывания олигонуклеотидов в комплементарных комплексах впервые применен метод комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT), основанный на определении констант ассоциации реакционноспособных производных олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами (мишенями) из зависимостей степеней модификации от концентрации реагентов.

2. При исследовании модификации в составе 20-ти различных комплементарных комплексов, включая тандемные комплексы, состоящие из олигонуклеотида-мишени длиной 10, 22 и 26 звеньев, алкилирующих производных 6-ти или 8-ми звенных дезоксирибоолигонуклеотидов и фланкирующих их с 3' и/или 5'-концов двух 8-звенных олигонуклеотидов-эффекторов, как немодифицированных, так и несущих остатки N-(2-гидроксиэтил)феназиния, определены параметры контактной кооперативное™, обусловленной прямым взаимодействием олигонуклеотидов в тандемном комплексе, и неконтактной кооперативности, связанной с воздействием олигонуклеотидов на вторичную структуру мишени. Возможность образования 26-звенным олигонуклеотидом-мишенью вторичной структуры типа "шпильки" было дополнительноподтверждено с помощью реакции самомодификации.

3. Исследовано влияние структуры области стыка олигонуклеотидов в тандемном комплексе на величины параметров контактной кооперативности. Показано, что наличие на стыке нуклеотида, содержащего остаток феназиния, существенно усиливает кооперативность. Присутствие концевой неканонической пары TT или реакционноспособной группы -NHCH2RCI полностью элиминирует кооперативные взаимодействия с немодифицированным нуклеотидом, но сохраняет достаточно сильное взаимодействие между остатком нуклеотида в составе мисмэтча и остатком нуклеотида, модифицированным феназинием. На примере пары TT установлено, что тандемные комплексы лучше дискриминируют ошибочные основания, чем обычные дуплексы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорова О.С., Одинаев А.Д., Горн В.В., Максакова Г.А., Перебоева О.С., Кнорре Д.Г. Количественные характеристики модификации нуклеиновых- кислот алкилирующими производными олигонуклеотидов в присутствии олигонуклеотидных эффекторов. Биоорган, химия. 1994. Т. 20. N 8-9. С. 932-945.

2. Адина-зада А., Федорова О.С. Изучение кооперативных взаимодействий производных дезоксирибоолигонуклеотидов при связывании с ДНК методом химической модификации. Биоорган, химия. 1995. Т.21. № 9. С. 703-708.

3. Fedorova O.S., Adeenah-Zadah А., Кпогге D.G. Cooperative Interactions in the Tandem of Oligonucleotide Derivatives Arranged at Complementary Target. Quantitative Estimates and Contribution of the Target Secondary Structure. FEBS Lett. 1995. V. 369. № 1/2. P. 287-289.

4. Fedorova O.S., Adeenah-Zadah A., Bichenkova E.V., Knorre D.G. Thermodynamic and Structural Features of Cooperative Interactions in Tandem Oligonucleotide Derivatives Arranged at the Complementary Template. Chemical Modification Data. J. Biomol. Struct. Dyn. 1995.V. 13. № 1. P. 145-166.

5. Кнорре Д.Г., Адина-Зада А., Коваль В.В., Федорова О.С. Кинетика химических превращений в высоко организованных биологических системах. Химические превращения в системах, основанных на Уотсон-Криковских взаимодействиях в дуплексах. В: "Химическая физика на рубеже 21 века. К 100-летию академика Н.Н.Семёнова". М.: Наука. 1996. С. 199-212.

6. Биченкова Е.В., Адина-Зада А., Фёдорова О.С. Изучение вторичной структуры одноцепочечного фрагмента ДНК с использованием реакции самомодификации. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. № 1. С. 21-32.

7. Adeenah-Zadah А., Кпогге D. G., Fedorova О. S. Cooperative Interactions of the Oligodeoxyribonucleotides on the Complementary Template. The Influence of Chemical Groups and Mismatched Nucleotides at the 5'- and З'-ends of Oligonucleotides on the Parameters of Cooperativity. Journal Biomol. Struct. Dyn. 1997. V. 15. N 2. 369-380.

8. Кнорре Д.Г., Адина-Зада А., Федорова О.С. Кооперативные взаимодействия в тандемах олигонуклеотидов и их производных на комплементарной матрице. Молекулярн. биология. 1998. Т. 32. № 1. С. 141-147.