Синтез и свойства олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих нуклеозиды с обращенной конфигурацией гидроксильных групп углеводного фрагмента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

-а 41 в

п г

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.963.32 677.113.4+6

ХАССАН КАМЕДЬ ХАССАН ИБРАГИМ

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА СШСГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ НУКЛЕОЗВДЫ С ОБРАЩЕННОЙ КОНФИГУРАЦИЕЙ ГИДРОКСИЛЬНЫХ ГРУШ УГЛЕВОДНОГО ФРАГМЕНТА,

02.00.10 - Еиоорганичаекая химия, химия природных и физиологически активных-веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре шш природных соединений химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор ШАБАРОВА S.A.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ОРЕЦКАЯ Т.С.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, ПОТАПОВ В.К.

кандидат химических наук,

ВЕЙКО В.П.

МИТХТ им. М.Р. Ломоносова (Федеральная академия)

Защита состоится 1993 г. в часов

на заседании Специализированного Совета Д 053.05.47 по химическим на/кам при Московском государственном университете им. Ы.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория -§(¿2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химтчЬсцрго факультета МГУ.

Автореферат разослан " 0» НО&Щ>£ 1993

г.

Ученый секретарь • Специализированного совета, кандидат химических наук С ^^^ И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи со способностью олн. онук-леотидов к комплементационшш взаимодействиям эти соединения кироко используются в самых различных областях молекулярной биологии, биохимии и медицины. Их применяют в научных исследованиях в качества праймеров, зондов, линкеров и т.д. Олигонук-леотиды способны ингибировать экспрессию вирусных РНК и синтез вирусных белков по так называемому, "антисенсовому механизму", что в перспективе может привести к созданию лекарственных препаратов и терапевтических средств на олигонуклеотидной основе. Целенаправленная модификация зондов позволит придать им желаемые свойства: устойчивость к нуклеазной деградации, возможность проникновения через клеточную мембрану, повышение стабильности комплексов зонд - мишень.

Широкое применение. модифицированных олигонуклеотидов стимулирует интерес исследователей к совершенствованию методов .синтеза этих соединений и изучении их свойств.

Целью настоящей работы являлась разработка методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих нуклеозиды с обращенной конфигурацией гидроксильной группы у С2'- и СЗ'-атомов углеводного остатка. Задачей данного исследования бьло получение модифицированных нуклеозидов и их нуклеотидных производных, которые могут быть включены в любое заданное положение олигонуклеотидной цепи с использованием стандартной методологии амидофосфит-ного синтеза. Наряду с этим неотъемлемой частью работы било изучение устойчивости полученных модифицированных олигонуклеотидов к действию ряде ферментов, а также стабильности дуплексов, включающих эти олигомеры.

Научная новизна и практическая ценность работа. В последние годы антисенсовые олигонуклеотиды начали использоваться в диагностических и терапевтических целях. Одной из проблем, воз-шкаодих при работе с такими структурами, является гидролиз олигонуклеотидов при действии на них клеточных р'—пваз. Наиболее часто используемый подход к решению этой пр^-лемы - химическая модификация олигомеров. Описанные в литературе' способы модификации олигонуклеотидов могут Сыть разделены на две основные группы: модификация 3'- и 5'-концевых фосфатных групп п мо' дифжащад по мэянуклеотадным фосфатам. Оба типа описанных пиве

конструкций модифицированных антисенсовых зондов, устойчивых к клеточным нуклеазам, как правило, предполагают введение в оли-гонуклеотид чужеродных химических группировок.

В настоящей работе предложен новый от олигонуклеотидов, устойчивых к действию экзонуклеаз: олигомвры, содержащие на 3'-и 5'-концах цеш 1-((3-Ю-2'-дэзокси-ирее .энтофуранозил)тимин и 1-ф-Б-З'-дезонси-ярео-пвнтофуранозиЛ)пиришдкны, отличающиеся от природных нуклвозидав обращением конфигурации гидроксильной группы у атомов С2' и СЗ'. Такие олигонуклеотида могут быть получены прямым автоматическим синтезом лишь с незначительным изменением регламента синтетического цикла. Основанием для создания и изучения такого типг. модифицированных олигонуклеотидов послужили полученные данные о повышенной эксснуклеазной устойчивости дануклеозидфэсфатов, содержащих сахара с инвертированными гидроксильютми грушами в 2' и 3'-положениях.

Результатом представленных исследований явился синтез более 20 функционально значимых и модальных олигонуклеотидов с ...»данными модификациями углеводного фрагмента.

Показано, что наличие модификаций на концах олигонуклеотидов существенно нэ влияет на их способность к образованию устойчивых дуплексов с фрагментами ДНК или РНК. Включение модификаций внутрь олигомарной цепи образованных ими дуплексов поникает температуру плавления дуплексов и оказывает влияение на их субстратные свойства.

В лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ проводятся работы по- изучению взаимодействия НК— дуплексов с ферментами нуклеинового обмена, результаты которых продемонстрировали, что предложенные мо/йфякации стали необходимыми и удобными инструментами этих исследований. ";'..

Публикации и апробация работы. По материалам диссертаций принята к публикации 1 работа. Результаты исследований Оылй. представлены на 3-м Международном Симпозиуме "Синтетические. олигонуклеотида и их аналога" (Англия, Кембридж, сентябрь'*-1993).

Структура а объем работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной часта, выводов, списка цитируемой литературы ( ссылок), содераит рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРИШЕ РАБОТЫ

Проблема синтеза модифицированных олигонуклвотидов н<-зави-симо от природа требуемой модификации представляет собой следующий комплекс задач.

1. Выбор метода синтеза модифицированного нуклеозида и защита его функциональных груш.

2. Получение на основе аномального нуклеозида нуклеотидно-го компонента, пригодного для встраивания в олигомерную цепь по возможности с минимальными изменениями стандартного регламента олигодезоксирибонуклеотидного синтеза (подготовка синтонов).

3. Подготовка необходимых полимерных носителей для автоматического олигонуклеотидаого синтеза.

4. Разработка регламента и осуществление синтеза модифицированных олигонуклвотидов.

5. Выбор способов удаления защитных групп с олигомг.ров, содержащих модифицированные звенья, и их выделения.

6. Подтверждение структуры синтезированных одигомеро' ц наличия заданной модификации в определенном положении олигонук-леотидной цепи.

Неотъемлемой частью работы является изучение химических и физико-химических свойств полученных соединения.

Все эти аспекты будут рассмотрены при обсуждении результатов настоящей диссертационной работы.

1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с ыодафицярованиыш углеводными фрагментами

Уникальна роль заместителя (Н или ОН) при С2'-атоме углеводных фрагментов нуклеиновых кислот, определяющего основное различие мекду ДНК и РНК. Этот факт вызывает появление многочисленных исследований свойств нукпеозидон и олигонуклвотидов, содержащих различных заместители в этом положении.

Метоксигруппа и галоид в 2'-положении (аналогично 2'-гидроксилу) придают значительную кэстког-т. СЗ'-эндо (И)-конформащш сахарного кольца, что в значительной степени определяет крнфэрмацию поли- и олигонуклеотидов и обусловливает существование дуплекса (ила его локальных участков) в А-форде.

С другой стороны такие 2*-заместителя (в отличий от 2'-гидроксила) обеспечивают устойчивость олигонуклвотидов при

нейтральных и щелочных значениях рН, а также к рибонуклеазам, что упрощает синтез олигомеров и работу с ними. Наличие аминогруппы в 2*-положении сахарного остатка позволяет получать производные олигодезоксирибонуклеотидов с молекулами балков, маркеров и др.

Результаты, полученные в лаборатс ш химии нуклеиновых кислот химфака МГУ при использовании олигонуклеотидов, содержащих 2'-фтор-2'-дезоксинуклеозида, для региоспецифичного расцепления РНК РНКазой Н из E.coli еще более обострили проблему роли заместителя при С2'-атомэ в процессе НК-белковых взаимодействий. С этой точки зрения сохранение гидроксильной группы при С2*-атоме, но изменение ее конфигурации - использование в зонде вместо 2*-фторнуклеозидов арабинонуклеозидов - было бы крайне интересно. Кроме того »ведение модифицированных нуклео-зидов по 3'- и 5'-концам олигодезоксирибонуклеотидов позволит проследить влияние модификаций на гидролитическую устойчивость олигомеров.

1.1. Синтез модифицированных нуклеозидов и блокирование их функциональных груш

Задача включения в олигоде?оксирибонуклеотидную цепь ара-бинонуклеозвдов предполагает решение дополнительной проблемы -защита 2'-гидроксила в арабдаонуклеозиде. to решили использовать предложенный ранее в лаборатории химии НК метод введения 1-(р-Б-арабинофуранозил}урацила (aU) на 3'-конец олигснуклеоти-да в ходе амидофосфитного синтеза в виде 02,2'-ангидропроиз-водного уридина. Тагам образом решается проблема защиты 2'-гидроккша. При аммиачной обработке полученного олигонуклео-тида наряду с удалением защитных групп ангидроцикл раскрывается с образованием арабиноуркдана.

В литературе описаны методики получения ангидропроизводно го из уридина с использованием как дифенилкарбоната, так и дру- . гих химических агентов. Однако в большинстве указанных работ'-целевой продукт приходилось выделять из водной среда, содержащей соли, и это приводило к потерям искомого соединения. Замыкание ангидроцюсла в 5'-0-даметоксттрг.тилированном уридане (2) повышает эффективность реакции: ангидроуридан (3) выделяется путем его экстракции хлороформом с последующей адсорбционной колоночной хроматографией на силикагеле.

о

ига

(4)

В ряду нуклэозидов с обращенной конфигурацией гидроксиль-ншс груш углеводного фрагмента б'-О-мономэтокситритальное производное 1-(р-0-2'-двзЗкси-трео-тантофуранозил)тамина (8) было получено из б'-О-тритилированного тямидина (5> по методике, разработанной Фоксом н Миллером, то следующей схеме.

о о

Лг-

ММТгО-

'£¡£¡£¡¡22^

МоОН ИМТП

'Л экв..

(Т)

лГ

он

У.

(8)

Синтез 1 -(Э-В-Э'-дезокси-трео-пентофуранозил)пиримидинов (ги и ЪС> описан в работе японских ученых (В.Кавана и др., 1989), но задача получения соответствующих им компонентов оли-гонуклеотидного синтеза и вклвчения их в олигонуклеотидную цепь не ставилась.

Нуклеозиды с инвертированной гидронсильной группой у С2'-атома при отсутствии ее у СЗ'-атома были получены в соответствии со схемой.

ОН ОН (9)

1.Р1тС1

2.ЫЗС1

* ИгО О? (10)

1.ЫаБНч (МеОН)

2.КОН (МеОН)

____Д1д/

Оч Тт

Ые^Х) к

№

.о. ;

£11)

В а а) ига, б) Сз

В

Бензоилировакие экзоциклической аминогруппы соединения (116), а также. тритилированив 5'-0-гидроксильных групп производных З'-дезокся-трео-пента^анозялпиримидашов проходит по стандартным методикам Оез ослокнений. Структуру полученных соединений подтверждали данными 1 К-ШР-спектров.

1.2. Получение модифицированных нуклеотидных компонентов аыидофосфитного олигонуклеотвдного синтеза Фосфитилирование 5' -О ,N-3 аэдцвгамх модифицированных нук-,-эозидов проводшш (М.Н-диизопропиламидо )-р-цианэтилхлорфосфи-том в присутствии диизопропилэтилаиина или оисДОД-даизопропил-амидо)метилфосфитом, используя в качестве катализатора днизо-пропиламмонийную соль тетразола. Нике для примера приведена схема получения нуклеотидных производных Ш и гс.

Рут

б) Руг => ЪгСу!

Структуры полученных нуклеотидных синтонов представленц в таблице 1. Во всех рассмотренных ниже случаях проводили 'ГСХ-контроль полноты прохождения реакции.

Время фосфнтилирования защищенных модифицированных нуклео-зидов возрастало до 5 часов, что обусловлено, по-видимому, пространственной затрудненностью гидроксильной группы для элвктро-фильной атаки фосфитилируюцшл агентом. Вихода соединений (13) составили 90-95Х.

Во всех приведенных примерах искомый 3'-амидофэсфит был выделен экстракцией хлористым метиленом с посл&дувдим высвыканием в титан.

Таолица 1.

олигодезоксьриоонуклэотида, содержаще нукпеозида с аномальными углеводными фрагментами

Структура сзштона

Олигонуклеотиды

омт

, (А».) я=-р-ои»

м(<рг)3 (А2) К=-Р-О(сн,)ясм

аШ

СТАСаИСаШОС

СТАСаиСаПССгС

САСТаиСаиСгА

САСаиаЦСаШгА

САСаЧаШТОА

(I)

(II)

(III)

(IV)

(V)

онтп

1Та

(В)

гирг, гире, гирл, гире

гит, тил

та гита IV!)

ттпегг (VII)

щсасттстоасют (VIII)

гиассасосссст (IX)

-шссттсстсстссассААти (X)

гиссттсгасстсссоааахигш; (XI) Д

(XII).

састисшсга (ПН)

сасписгисасги (XIV)

Таблица 1 (продолжение)

Префикс "d" (дезокси) при написании З'-дезоксинуклесзидоа опущен; ail - 1-(р-0-арабинофуранозил)урацил;

tU - 1-(р~В-3'-дезокси-ирео-пвнтофуранозил)урацил; tC - 1-(р-Б-3'-дезокси-ирео-пентофуранозил)цитозин: хТ - 1 - (p-D-S' -дезокси-ярео-пентофуранозил )гм.

1.3, Ашдофосфитньй синтез олигокуклеотидов с аномальными углеводный« фрагментами Олигонуклеотиды с направленными модификациями в заданных полокениях олигомерной цепа представляется возможным использовать при решении широкого круга вопросов, среди которых выделим проведение химического тестирования механизма НК-ОедксЕих взаимодействий, в том числе изучение устойчивости олигонукдао-тадных зондов к действию гидролизувдих ферментов.

Структуры представленных в настоящей раооте молшфлдарован-иых олигонуклеотадов (таблица 1) определялись этими задачами.

Олигонуклеотида (I, V. VIII, IX, XVII) комплементарны участкам 49-":6 и 95-105 5S РНК рибосом E.coll, олигонуклеотида (XII, XIX) использовались для изучения механизма действия РНКазы Н, олигонуклеотида (X, XI, XVIII) содержат последовательности, комплементарные РНК вируса герпеса.

ДНК-фрагменхы с аномальными звеньям' становятся доступными и удобкы./д инструментами исследования- благодаря современным эффективным методам химического олигонуклеотидного синтеза.

Для синтеза олигонуклеотидов с направленными модификация;,га был выбран амидофосфитаый подход, хорошо зарэкомандовавший себя при получении олигодезоксирибонуклеотидов с использованием автоматического ген-синтезатора applied 31osyatenia 380В.

Мономернае модифицированные синтоны, предложенные и используемые в данной работе, позволяли въсдить их в олигонуклео-тиднах статез на любой стадии, сохраняя реагенты и растворители, стандартно применяемые при синтезе олигодезоксирибонуклеотидов, и существенно не изменяя регламента (варьировалось лишь Ерэмя стадии когденсгции).

Нами отмечено, что используемые при получении олигодезоксирибонуклеотидов полимерные носители (CPG-500) вполне фигодны v для синтеза олигонуклеотидов с аномальными звеньями. Модификацию полимерных носителей проводили по методикам, разраоотан-ным в лаборатории химии НК Химфака МГУ. В большинстве случаев анализ и выделение олигонуклеотидов, содержащих 5'-концевую мо~ нометокси- шш даматокситритильнув'' группу, проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя гидрофобные свойства тритиль-ных групп.

Подтверждение нуклеотидаой последовательности и наличия аномальных звеньев в заданных положениях олигонуклеотидов проблема, по важности равноценная включению модификации в оли-* гомер. Первичную структуру модифицированных олигонуклеотидов* подтвераадали секвенированием по методу Ыаксама-Гилберта. Нук-г леозидный состав onpeflej иж исчерпывающим гидролизом до пуклео-> задов смесь» фосфомоноэ j те р азы и фосфодиастеразы змеиного яда о последующим анализом -гидролизата ВЭЯХ и сравнением с контрольной смесью нуклеозидов.

1.3.1. Синтез олигодезоксирибонуклеотадов, содержащих 1-(ß-D-арабинофуранозил)урацил

При попытке применить предложенный ранее в лаооратц.ин химии НК ' метод синтеза олигонуклеотидов (1-У), содержащих 1-(р-0-арабинофуранозил)урацил (aU), используя его 2* ,0"-- ан~ гидропроизводаое (А1) (см.таблицу 1), оказалось, что при встраивании его в любое заданное положение олигонуклеотидной цепи получается набор олигонуклеотидов нужной длины, но разного состава.

Мы предположили, что это можат быть связано с возможностью раскрытия ангвдроцикла при постсинтетической обработке тиофено-лят-ионом. Мы использовали в синтезе амидофосфят ангвдроуридине с защитной метальной группой по атому фосфора. Для исключения возможности протекания. этой реакции ш получили и применили в олиговукдеотидном синтезе ß-вданэтиламидофзсфит ангидроуридана (Ag). В этом случае обработка тиофенолом не куша.

Однако и при использовании новой -сомпонента олигоцуклеота-да, гомогенные в ион-парной ВЗЖХ, оказываются негомогенньми при анализе обращенно-фазовай ВЭКК (см.рио. 1 а,б). Нам удалось для олигонуклеотидов (Г, III( V) выделить абсолютно чистые вещества

£йо.1. Анализ чистоты выделенного олигонуклаотида OACaüHUOTCA (V) после удаления 5 '-0-ВМТг-заяштт группы (а) ион-парная хроматография; (б) обрап-енно-фазовая В£:-л; (в) обршдснно-фазовая ВЭЗКХ после повторной очистки.

.1.1

.Анализ их нуклеозидаого состава путем исчерпывающего ферментативного гидролиза смесью' ферментов ФДЭ и щелочной фосфата-зы полностью соответствует предполагаемому.

При таком же гидролизе смеси веществ, полученных посла выделения с использованием гидрофобных 'свойств тритильной группы, в реакционной смеси изменяется соотношение пиков all и dC При гель-электрофорезе в ПААГ обнаруживается несколько полос. Вещества, соответствующие какдой из полос, били проанализированы по методу Максама-Гилберта . Если в искомом соединении в месте модификации радиоактивность отсутствует во всех 4-х колонках геля (уридан плохо взаимодействует с перманганатом натрия), то в других олигонуклеотидах в месте модификации расщепление наблюдалось во всех 4-х положениях.

Изменение соотношения в гидролизате количестве aU и йС в пользу clC, место выхода которого при условиях данной хроматографии совпадает с гУ, а также картина радиоавтографа при сек-венировании, характерная для анализа олигонуклеотидов с включением рибозвеньев, дает основание полагать, что при раскрытии ангидроцикла атака гидроксила идет не только по 2-ому Положению гетероциклического основания, но и по С2'-сахарного остатка с образованием рибоуридина. Тем нэ менее вероятность сохранения смешанного рибо-дезоксирибонуклеотида в результате аммиачной обработки в течение 16 часов при 50°С вряд ли существует. Цри-рода модификации для нас до конца не ясна.

Динукльозидфосфат аОТ получался бе в проблем и анализ его ферментативным гидролизом показывал наличие двух веществ - aU и т.

. По-видимому, модификация ангидроуридина происходит во вре^' мя наращивания олигонуклеотидной цепи и такой метод синтегА олигонуклеотидов, содержащих a'J применим лишь для введения его. на 5'-конец олигонуклеотида.

1.3.2. Получение олигодезоксирибонухлеотидов о включением 1-((3-0-3'-дезокси-трео-пант оф.,ранозил)пиримидинов и

1-((3-В-2,-дезокси-трео-пентофуранозил)тишна ' •

Синтез олигодезокоирибонуклеотидов, содержащих 1-((3-В-3'-двзокси-трео-шнтофурнаозил)пиримидины (ги и гС) и 1 — (0-Ю-2* — дезокси-трео-пентафуранозил)тамин (хТ) (см.таблицу 1) проводили по стандартной методике с увеличением времени присоединения модифицированного звена до 15 мин.

Степень прксоед^ения модифицированного звена ниже, как правило, на 3-4% по сравне?пш с нвмодифицарованным. Это может бить связано, как с пространственным строением соединения, так . и с тем, что мы используем амидофосфитн модифицированных нук-леозидов (В, С, В) (табл. 1) ' без дополнительной очистки.

Олигонуклеотиды выделяли методом обращэнно-фазовой ВЭЖХ используя гидрофобные свойства Б'-О-диметокситритильной группы, и затем детрйтилировали.

В жестких условиях (50°С, 5-часов, высокая концентрация ■ ферментов) возможно осуществить гидролиз олигонуклеотидов с такими модификациями до нуклеозидов и, проводя анализ гидролизата ВЭЖХ и сравнение с контрольной смесью, подтвердить тагом образом нуклеозидаый состав (рис. 2).

Олигонуклеотиды, содержащие Ш, Ю и хТ, обладают рядом интересных свойств: при попытке анализа нуклэотидной последовательности по методу Максама-Гилберта оказалось,• что некоторые олигонуклеотиды (VIII, X, ХУ11, XVIII) не являются субстратами Т4-полинуклеотадюшазы и б'-конец профосфорилировать невозможно. Другие (IX, -XI) фосфорилируштся нормально. Модификация внутри нуклеотидаой цепи при секвэнировании не прочитывается. Радиоактивность отсутствует во всех 4-х колонках геля (рис. 3).

Таким образом, при использовании полученных амидофосфитных компонентов,предложенные модификации могут быть включены в любое заданное положение олягонуклеотидной цепи и в любом количестве.

Рйс. 2. -НЩ-анализ продуктов исчерпывавдего ферментативного. гидролиза олигонуклеотидов, содвркащих Ш или 10. ' . (а) шасютсаоют (VIII) (<5) ШССАССССОСША (IX) ■' (в)' гболссюссгст дат

'1 е а т с

1 е ат с

е с

а с

Ш

-дд*-

Ч

и,

V

IV

I

р '-

1 ч1

л

■ ад

¿ни*

г,

V

VI I .

V

с

3 т с

ст с . с

т

?

* I?

Ш

г" ^ ъ;

<а>

М)

т

Рис. 3. Анализ нуклеотидной последовательности по методу Макса- ' на-Гилберта олигонуклеотидов

(а) тОСАССОССбША (IX)

__ (бмисатаоотсстессасААтш; _ (хг) ■ дорожка Т- обработка пиперидином 15

2. Физико-химические свойства модифицированных НК-дуплексов

Применение антисенсовых олигонуклеотидов предполагает образование устойчивых дуплексов с НК-мишенями. В олигонуклеотидных дуплексах, содержащих хТ, Ш к tG по обоим концам олигомер-ной цепи (см.таблицу 2), в большинства случаев возможна нвком-плементарнооть концевых модифицированных звеньев по отношению к ДНК- или РНК-мишени. Поэтому необходимо было определить влияние этих модификаций на термическую устойчивость соответствующих дуплексов. Термическая устойчивость дуплексов была изучена методом плавления с регистрацией по УФ-поглощению в буферном растворе (рис. 4). Для сравнения с модифицированными дуплексами параллельно исследовались немодифицированные комплементарные дуплексы, образованные темл же ДШС-матрицрми и природными оли-тонуклеотвдами той же длины, что и модифицированные. В табл. 2 приведены' структуры.дуплексов с участием олигонуклеотидных зондов и юс температуры плавления.

.0.00— 0.005 0.00 - 0.003 -0.02 ~ 0.0Т -0.02 - 0.025

ДЛЯ /

Ш (£) Ш

ТСГ за' 50 70°с

•Рис. 4. Кривые температурной зависимости УФ-поглощения.

(Х2б0 нм). олигонуклеотидных дуплексов Ш (II) Ш) СЮ Щ в йЗС-буфере (0,15 Ц ЫаС1, 0,015 И штрат натрия, . рН 7,25). -

Таблица 2.

Некоторые характеристики модюГгадарованных ДНК-дуплексов

Шифр ДНК-дуплекс , T.пл., °G (±1) h, *• (±1).

<Â) 3'- AGTGAAGACTC-AA 5'-tUCACTTCTGAGtUT 45 18

(Ш 3'- AGTGAAGACTCAA 5'- ÏCACTTCTGAGÏT' 48 23

(Ш 2'- CCT-GGTGGCGC-GAGTG 5'- tCCAGCGCGtCT 55 12

(D 3'- CCTGGTGGCGCG-ACTG 5'- tUACCACCGCGCtUA 58 16

• (Ю 3'- CCTGGTGGCGCGAGTG 5'- ACCACCGCGCT 63 .14 •

(I) 3'- GTTGGAAGGAGGACGCCCTTTGCC 5 ' - tUCCTjCCCTCCTGCGGGAAtirtU 65 12

QÜ 3*- GTTGCAAGCAGGACGCGCTTTCCC 5*- tUCGTTCCTCCTCCGGGAAtUtüT 65 14

(3) 3'- GTTGCAAGGAGGACGCCCTTTCCG 5'- CGTTCCTCCTGCGGGAAAG ТО 25

(Ю 3'' r(AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA) 5' tumumumumumirra 33 8

(К) 3' Г(АААААААААААААААААА) 5' сстиоттаии'ги'т'гтт 46 22

ш' 3' Г(AAA-AAA-AAA-AAÂ-AAA-AAA) 5* xTTTxrmTTTxrarxTTTxïTT 35 26

Наблюдаемое незначительное понижение температуры плавления модифицированных, дуплексов (A, _В_, _Г) в сравнении с немодафщи-рованным дуплексом (Б, £) обусловлено, вероятно, дестабилизацией, вносимой на комплементарными "свисающими" концами и ослабленным взаимодействием между концевыми нуклеозидами.

Наличие в олигонуклеотндной цепи множественных модификаций приводит к значительному понижению стабильности модифицированного гибридного дуплекса. Т^ модифицированного дуплекса снижается на 13°0 по сравнению о немодифицированным (сравн. iL J.C JJ-

. При изучении термической устойчивости ДНК-дуплексов,' содержащих в одной из цепей арабшюуридан было обнаружено, что наличие данной модификации приводит к понижению температуры плавления и сникёнию гипохромин. Олигонуклеотиды (III, Y) с 'комплементарными матрицами дуплексов не образуют вовсе. По-Еидимому, арабиноуридиновые звенья действу m как дестабилизиру-хгдий фактор при образовании ДНК-дуплексов.

■ Для оценки характера локальных изменений в структуре ДНК, которые вызывает замена йТ на tu, было проведено сравнение спектров КД динуклеотида tUpdï и смеси нуклеозида tu и нуклео-твда рйТ в натрий-фосфатном буфере (pH 7,3). Как видно спектр динуклеотида аналогичен спектру смеси tu и рей), хотя и положительные, и отрицательные полосы КД этих образцов отличаются по амплитуде. На наш взгляд, эти данные свидетельствуют о том, что в динуклеотиде tUpdî макплоскостные ("стэкинг") взаимодействия существенно ослаблег '. Практически полное совпадение спектров КД tUpdr в натрий-фосфатном буфере и в 70%-ном водном растворе этанола подтверждает этот вывод. Известно, что "стэкингп-взаимодействие -нарушается при добавлении к водным растворам . олигонуклеотидов органических растворителей. Данные спектров КД . модифицированных дуплексов также свидетельствуют о конформаци- • онных изменениях, индуцированных введением вставок в олитонук-■леотидаый зонд.

Как у&о отмечалось; олкгонуклэо'тида (I, V) комплементарны участкам. 5S РНК рибосом из E.coll и, образуя ç ней дуплекс, должны являтся субстратом для РШазы H из E.colí. Эффективность гидролиза дуплекса с участием олигонуклеотида (I ) сравнима с тако.вой для немодифвдированного, субстрата, однако появление множественны не специфических .точек расщепления говорит о воз-

мокности образования коротких РНК-ДНК дуплексов из-за нестабильности целевого контакта. Олигонуклеотид (V) прочного дуплекса не образует и гидролиз РНКазой Н в этом случае не наблюдается.

3. Изучение гидролитической устойчивости модифицированных олигонуклеотидов

Наш предварительно было изучено влияние хГ- и ги-звеньев на устойчивость к действию фосфодиэстеразк (ФДЭ) змеиного яда в серии модифицированных динуклеозидфосфатов (табл.3). Продукта гидролиза разделяли с помощью тонкослойной хроматографии. Дя-нуклеозидфосфата, содержащие хТ и Ю на 5'-конце, как следует из приведенных в табл. 3 данных, под действием ФДЭ змеиного яда гидролизуются медленнее, чем немодафщироват'вде. Так, через 3 ч. динуклеозвдфосфат ТрА обнаружить в реакционной смеси не удается, в то время как 40% содержания хГрА остается без изменений. Гидролиз хГрА протекает только на 60%.

Таблица 3.

Степень гидролиза модифицированных динуклеозидфосфатов' в присутствии ФДЭ змеиного яда (37°0)

Динуклеозидфосфаг Гидролиз, %

I час 3 часа

ТрА 70 100

хТрА 50 , 60

хГрТ 60 60

ЩТ 51

£ОрО 54

ШрА1 49 •

шрс 59

Закономерности гидролиза олигонуклеотидов под действием ФДЭ змеиного яда более подробно изучались на примера соединений (VIII, X, XI и XVIII), отличающихся сиквенсом и количеством модифицированных звеньев на 3*-конце олигомеров. В качестве контроля использовали ' немодафщированный алигонуклеотид COTTCCTCCTGCGGGAMG (XX).

Анализ, реакционных смесей олигснукльитидов с ФДЭ змеиного яда проводился с помощью ион-парной ВЭЖХ.

• Количественные характеристики гидролиза определяли по со-отношшга площадей пиков гадролиэуемого соединения и внутреннего-стандарта, в качестве которого использовали уридин.

s/so= (Aol* 4 A0I^

где S/S0 - степень гидролиза олигонуклеотида;

и Aq1- площади пиков олигонуклеотидов в начальный и текущий момент времени, соответственно;

А^ и Ац - соответствующие площади пглов уридина.

Рис,5. Кинетические кривые гидролиза модифицированных (VIII, X, XI, mil) . и ' ^модифицированного (CGTTCCTCCTGCGGGAAAG) »(XX) олигонуклеотидов фосфодаэстеразой змеиного яда.

Временная зависимость концентрации исходных олигонуклеоти-дов, как модифицированных, так и природного, в ходе гидролиза под действием фосфодиэстзразн змеиного яда приведена на рис.5 и имеет экспоненциальный характер. График построенный в полулогарифмических координатах позволяет рассчитать начальную скорость гидролиза, которая для субстрата VIII оказалась в 3 раза меньше, чем для ^модифицированного субстрата (И); для субстрата XI - в 4 раза меньше, для субстрата XVIII - в 15 раз, а для субстрата X - в 18 раз. Время полупревращения (t1/2) в выбранных одинаковых условиях (температура, концентрация субстратов и фермента) составило соответственно 24, 32, 113 и 137 минут (для ^модифицированного олигонуклеотида - 7,7 мин). Анализ данных ион-парной хроматограф.и в ходе ферментативного гидролиза показывает, что для субстратов VIII и XI убыль концентрации исходного олигонуклеотида сопровождается накоплением олягонуклеоти-дов, укороченных только на одно звено. При гидролизе немодифи-цирсванного олигонуклеотида (XX) образуется большое число продуктов гидролиза , а при гидролизе субстрата X и XVIII накопление частично гидролизованных продуктов на наблюдается (рис.6). Учитывая строение олигонуклеотидов VIII и XI, содержащих на 3'-конце немодйфицированное звено, их стабильность к действию ФДЭ должна оцениваться по убыли концентрации к"к исходного, так н укороченного на одно звено олигонуклеотидов. В этом случае время полупревращения олигонуклеотидов VIII и XI составлет 52 и 89 мин, а начальная скорость их гидролиза меньше скорости гидролиза немодафицироэнного олигонуклеотида в 7 и 12 раз соответственно. •

Таким образом, более устойчивые к действию ФДЭ змеиного яда оказаш-jb олигонуилеотиды, содержащие на'3'-конце два модифицированных звена. Если после двух модификаций присутствует один.природный нуклеозид (например, олигонуклеотида XI, XVIII) скорость, гидролиза несколько выше, чем при наличии двух концевых модифицированных звеньев (олигонуклеотид X).

Рис.6. Контроль методой ион-парной ВЭНХ процесса гидролиза фос-. фодаэст&разои зманого яда (а) олигонуклеотида • (СаТТССТССТйСОССШЛ) (XX); СО) модифицированного олиго-йуклеотида (К).

вывода

1. Разработаны эффективные методы, множественна включений в алигодезокс;тркбонуклеотидо нукле-зидов с обращенной конфигурацией гидроксильной группы у С2'~ и 03' -атомов углеводного фрагмента.

2. Впервые получены олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие 1-(0-В-3'-дезокси-трео-пентофуранозил)пиршиди1ш. Показана устойчивость предложенных модификаций при проведении олигонуклео-тидного синтеза и постсинтетических обработок.

3. Использование амидофосфтга 02,2'-ангидроуридина-для получения олигонуклеотидов, содержащих 1-(р-Б-арабушофуранозил)-урацил приводит к смеси олигомеров, выделение из которой целевого продукта затруднительно.

4. Наличие в одном из тяжей модифицированных ДНК-дуплексов концевых модификаций незначительно снижает их термодинамическую устойчивость. Присутствие в олигонуклеотидлой цепи множественных модификаций приводит к существенной дестабилизации модифицированных дуплексов.

Б. Показано, что наличие 1-(р-В-2'-дезокси-дрео-пентофура- • . нозил)тимина и 1 -(р-В-З'-дезокси-трео-пентофуранозил)пиримиди-нов на 3*- и 5'-концах олигонуклеотидов повышает их устойчивость к действию ФДЭ змеиного яда. Полученные соединения перспективны для использования в антасенсовой биотехнологии.

Основные результаты диссертации изложены в публикациях:

1. T.S.Oretskaya, E.A.Romanova, I.M.VolkoY, N.F.Krynetskaya, H.K.H.IbratUm, O.N.Kuroleva, V.N.Taahlltel&, Z.A.Shabaroya. . Oligonucleotides with, modifications In the sugar moiety. 3rd Cambridge Symposium "Synthetic Oligonucleotides and Analogues". Cambridge, England. September 1993.

2. Н.Ф.Крынецкая, О.А.Чеботарь, Х.К.Х.Ибрагим, Е.А.Романова, В.Н.Ташлицкий, .С.Орецкая, Н.И.Соколова, З.А.Шабарова. Анти-сенсовые олигонуклеотиды, содержащие по 3'- и 5'-концам

1-(0-D-2'-дезокси-трео-пептофуранозил )тамин. // Биоорганическая ■ химия. 1994. В печати.