Синтез новых производных мио-инозита и других полиолов с целью поиска соединений с антивирусной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ТУЧНАЯ ОЛЬГА АНАТОЛЬЕВНА

СИНТЕЗ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ лио-ИНОЗИТА И ДРУГИХ ПОЛИОЛОВ С ЦЕЛЬЮ ПОИСКА СОЕДИНЕНИЙ С АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА, 2005

Работа выполнена на кафедре Биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова

11аучный руководитель: Академик РАМП,

доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Преображенская Мария Николаевна

кандидат химических наук Ьсипов Дмитрий Станиславович

Ведущая организация: ЦХЛС - ВНИХФИ

Защита состоится в ^^"часов на заседании Диссертационного

Совета Д 212 120.01 при Московской государа венной академии тонкой химической технологии им МВ Ломоносова по адресу. 119571, Москва, пр Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «Л^ » ^^-¿уЬ^Р 2005 г.

Ученый секретарь Диссерхационного Совета, кандида: химических наук,

старший научный сотрудник и / Лютик А И

<// /[¿¿¿«-ч._

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. Расширение знаний по молекулярной биологии различных вирусных инфекций и постоянный поиск эффективной химиотерапии для их лечения позволяют находить новые подходы к созданию лекарственных препаратов с высокой антивирусной активностью, действие которых направлено на специфические и критические процессы жизненного цикла вирусов, а также к улучшению фармаколог ических свойств применяемых в медицинской практике соединений.

Так, превращение неприродных нуклеозидов, таких как азидотимидин (А7,Т), 2',3'-дидезоксиинозин (<М), 2\3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин (с!4Т) и др., являющихся по механизму действия ингибиторами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в их липофильные производные позволяет преодолеть недостатки данных нуклеозидов, связанных с их высокой токсичностью и слабой способностью к преодолению клеточных мембран и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Наряду с работами в области противовирусных соединений нуклеозидной природы в последние годы широко развиваются исследования различных по структуре полианионсодержащих веществ (сульфатов полисахаридов, поликарбоксилатов козалана, производных дистамицина и др.), выступающих в качестве ингибиторов адсорбции вирусной частицы на клеточной поверхности. Но такие соединения обладают рядом фармакокинетических и токсикологических недостатков, которые ставят под угрозу их клиническое использование. Поэтому необходим постоянный поиск новых полианионных соединений с целью получения препаратов с высокой антивирусной активностью и с улучшенными свойствами к биотранспорту

Создание лекарственных препаратов на основе природного шесгаатомного циклического спирта л/ио-инозита представляется перспективным направлением в конструировании и модификации фармакологически активных соединений. Интерес к химии производных мио-инозита обуславливается их высокой биоло! ической активностью. Установлено, что 1.4,5-трифосфат-яи-л!«о-инозита, являясь вторичным мессенджером, обеспечивает передачу и усиление клеточного сигнала в процессе высвобождения кальция из внутриклеточных источников. Известно также, что и сам мио-ииозит обладает витаминной активностью и оказывает гиполипидемическое,

* В руководстве работой принимала участие доц., к х н Шастина Н С

Сокращения А7.Т - З'-азидо-З'-дезокситимидин, <МТ - 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин, <М -2',3'-дидезоксиинозин, ВИЧ - вирус иммуннодефицита человека, ГЭБ - гематоэнцефапический барьер, ОСС - ^,>4'-диииклогексилкарбодиимид, ОМАР - 4-М,Ы-диметиламинопиридин, Рк'С1 пивапоилхлорид, />-Т8А - и-толуолсульфокислота, ТСХ - тонкослойная хроматография, П|Ьа1-Н диизобутилалюмогидрид, №ВН. - боргидрид натрия, 'ВиООН - тирете-бутилгидроперекись.

1'и1| - шиАлирид -фосфора, 1т - имидазол, РОС. НЛЦИОКАЛЬЬ ,

библиотека

с.1 99

С-Пегеяй^г ЧЧО ЪфлштГГУ

липотропное, противоопухолевое действие. Кроме того, фосфоииозитиды являются минорными компонентами клеточных мембран и принимают активное участие в процессах клеточной регуляции. Поэтому, можно ожидать, что создание на их основе липофильных производных антивирусных нуклеозидов позволит улучшать фармакокинетические свойства, проницаемость через биологические мембраны, пролонгировать действие и способствовать направленному транспорту нуклеозидов в клетки-мишени.

Кроме того, молекула мио-инозита, в состав которой входят шесть гидроксильных групп, является удобной матрицей для введения различных ионогенных группировок при создании новых противовирусных полианионных соединений. При эюм мио-инозит может снижать отрицательное побочное воздействие препарата на организм, не изменяя его терапевтических свойств.

Таким образом, создание новых фармакологически активных соединений с улучшенным спектром терапевтического действия, в том числе и на основе мио-инозига, является актуальным направлением биоорганической и медицинской химии

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-856 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсоничсских средств» и по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ (№ НШ-2329.2003.4 и № РИ-112/001/609), Минобразования РФ по поддержке научно-исследовательской работы аспирантов ВУЗов (А03-2 11-385). Международного научно-технического центра (№ проекта 1781)

Цель работы. Целыо работы явилось исследование путей синтеза новых соединений нуклеозидной и ненуклеозидной природы на основе гидрофобных полиольных, в том числе инозитсодержащих, молекулярных транспортных систем с целью поиска препаратов с потенциальной противовирусной активностью. Были поставлены следующие задачи- 1) разработать эффективный метод препаративного получения замещенного фосфатидилинозита; 2) осуществить синтез новых липофильных производных анги-ВИЧ-активных нуклеозидов и фосфатидилинозита; 3) разработать метод и получить липофильные, в том числе инозитсодержащие, производные антивирусных нуклеозидов, содержащие в своей структуре несколько остатков активного фармакофора; 4) разработать метод получения димерного аналога фосфатидилинозита; 5) разработать методы синтеза иолианионных производных на основе полигидроксилытых соединений.

Научная новизна. С использованием Н-фосфонатного подхода разработан упрощенный и эффективный метод синтеза замещенного фосфатидилинозита. Использование данного метода фосфорилирования в синтезе частично замещенного фосфатидилинозита позволило сократить число синтетических стадий при получении подобных глицерофосфолипидов. Осуществлен синтез новых липофильных инозитсодержащих производных фармакологически активных нуклеозидов (<34Т и А7.Т). Предложено использовать гидрофобные сс,со-диольные соединения в качестве молекулярных транспортных систем для одновременной доставки двух остатков анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с целью увеличения их внутриклеточной концентрации. На их основе получено пять новых динуклеозидсодержащих конъюгатов. Впервые осуществлен синтез димерного аналога фосфатидилинозита, в котором два циклитных кольца мио-инозита связаны между собой липофильным шестиатомным спейсером. Синтезированы новые полианионные соединения на основе а,т-диольных соединений, а также на основе димерного аналога фосфатидилинозита.

В ходе работы получено новых соединений. Чистоту полученных производных подтверждали данными ТСХ, структуру доказывали с помощью физико-химических и спектральных методов.

Практическая ценность работы. Показано, что более мягкой процедурой синтеза фосфатидилинозитсодержащих производных антивирусных нуклеозидов является первоначальная обработка частично замещенного фосфатидилинозита ацилирующим агентом, позволяющая практически полностью заместить свободную ОН-группу на сукцинильный остаток, и последующее взаимодействие промежуточного сукцинильного эфира фосфатидилинозита с нуклеозидным компонентом.

Отмечено, что синтезированные на основе тетрабензилового производного идита дипуклеозидсодержащие конъюгаты представляют интерес не только с точки зрения улучшения транспортных характеристик и одновременной доставки двух остатков аши-ВИЧ-активных нуклеозидов, но и в плане потенциального проявления ими двойной противовирусной активности, направленной на различные стадии репликативного цикла вируса. Это обуславливается возможным образованием при внутриклеточном гидролизе данных соединений двух остатков активного нуклеозида (ингибитора обратной транскриптазы) и производного идита с ионногенными группами (фосфатной и сукпинильной), являющегося структурным аналогом замещенного 1,2,5,6-тетра-О-бензил-Э-маннита - известного ингибитора протеазы ВИЧ.

Продемонстрирована возможность использования димерного аналога фосфатидилинозита и а,со-диолов для получения новых полианионных соединений. Отмечено, что все синтезированные производные могут выступать ингибиторами

адсорбции различных вирусов на клеточной поверхности, обладая улучшенной биодоступностью за счет сложного баланса их гидрофобно-гидрофильных свойств, а также, что сульфатное, фосфатное и карбоксиметильное производные тетрабензшшдита являются потенциальными антивирусными агентами, действие которых может быть направлено еще и на ингибирование протеазы ВИЧ.

Таким образом, разработка новых подходов для структурной модификации применяемых в медицинской практике анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и получения новых соединений с определенной биологической активностью предоставляют возможность потенциального выхода на эффективные противовирусные препараты.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации было опубликовано 5 печатных работ. Результаты диссертации были представлены на следующих научных конференциях: 2-ом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (г. Москва, 2003), на 10-ой Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии" (г. Волгоград, 2004), на 3-ем Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (г. Москва, 2005), на 1-ой Научно-технической конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова «Наукоемкие химические технологии» (г. Москва, 2005).

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Разработка методов синтеза исходных гидроксильных соединений для конструирования новых веществ с потенциальной антивирусной активностью. Синтез частично замещенных производных фосфатидилинозита. Синтез а,со-диольных молекулярных транспортных систем;

2) Структурная модификация анти-ВИЧ-активных нуклеозидов. Синтез новых липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных антивирусных нуклеозидов;

3) Разработка подходов к синтезу новых полианионных соединений -эффективных ингибиторов вирусной адсорбции. Синтез димерного аналога фосфатидилинозита. Получение различных ионогенных производных на основе а,со-диольных соединений, a также на основе димера фосфатидилинозита.

Структура и объем работы Диссертация изложена на/У Страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Диссертация содержит^'рисунков,/^схем и £ таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез исходных соединений для конструирования новых веществ с потенциальной антивирусной активностью.

1.1. Разработка метода синтеза производных частично замешенного фосфатидилинозита.

Ввиду низкого содержания фосфоинозитидов в природных источниках, за исключением фосфолипидной фракции дрожжей и мозга млекопитающих, выделение их в препаративных количествах сопряжено с рядом затруднений. Для систематических исследований взаимоотношений структура-свойство-функции, как правило, требуются соответствующие производные различного типа, получение которых в случае фосфоинозитидов возможно только методами химического синтеза. Для направленного получения инозитсодержащих производных нуклеозидов необходимо наличие частично замещенных фосфатидилинозитов, которые имеют в определенном положении циклитного кольца свободную гидроксильную группу, открытую для последующего связывания с нуклеозидом. Поэтому на первом этапе исследования нами был разработан простой метод синтеза защищенного фосфоинозитида (3).

Большинство ранее выполненных синтезов фосфатидилинозитов включает многостадийное получение защищенного ЬО-фосфата-от-жио-инозита*, который затем конденсируют с 1,2-диацшкш-глицерином с образованием требуемой фосфодиэфирной структуры липида. Реализован также обратный порядок соединения структурных фрагментов синтезируемого фосфоинозитида - первоначальное фосфорилирование 1,2-диацшмл-глицерина и конденсация полученного фосфорного соединения с пентазамещенным производным мио-инозита (незамещенный гидроксил находится в положении 1 циклитного кольца). В последние годы по второму варианту синтез сложных инозитсодержащих липидов и гликолипидов природной и модифицированной структуры был осуществлен с использованием соединений трехвалентного фосфора. Н-фосфонатные и амидофосфитные производные диацилглицерина являются удобными ключевыми соединениями при получении данного класса фосфолипидов, обладая высокой реакционной способностью по отношению к пространственно затрудненным вторичным гидроксилам л<ш-инозита.

Традиционный подход к синтезу пентазамещенных производных лшо-инозита базируется на использовании 1(3),4(6),5,6(4)-тетразамещенного мио-инозита (наиболее часто для этой цели использовали тетрабензиловый эфир (Швец ВИ, 1987)), из которого путем поочередного блокирования - деблокирования гидроксигрупп в

' Для асимметрично замещенных производных лшо-инозита и глицерина использована номенклатура стереоспецифических соединений.

положениях 1(3) и 2 получают 2,3(1),4(6),5,6(4)-пентазамещенное производное, далее обычными методами создают фосфодиэфирную структуру фосфоинозитида.

Недостатки этого подхода заключаются в существенной трудоемкости и многостадийности превращений исходного тетразамещенного производного, поскольку селективное блокирование аксиально ориентированной гидроксигруппы в положении 2 практически невозможно осуществить в присутствии значительно более реакпионноспособной экваториальной ОН-группы в положении 1 циклитного кольца.

Развитие синтетических исследований инозитсодержащих фосфолипидов и их конъюгатов с биологически активными соединениями вызывает необходимость поиска новых, более простых в исполнении препаративных методов синтеза промежуточных фосфодиэфирных производных лшо-инозита. В настоящей работе нами изучен упрощенный путь к синтезу таких соединений - прямое фосфорилирование тетразамещенного производного мио-инозита (1) Я-фосфонатом 1,2-диацил-гдс-глицерина (2) (Схема 1), использующее известные различия в реакционной способности гидроксигруш! в асимметрично замещенных мио-шюттах. В качестве исходного тетразамещенного производного мио-инозита использован 1,2(3),4(6),5-ди-0-изопропилиден-.5я-л<«о-инозит (1)

он 0+ Ра,"°П о\ Я ОН ОН м

I- о ра1-о- о 1.Р1УС1/РУ 1-1Н1 Ао-Р-Рп

3,+ Ц-««, ЪнТо-Ра,—.оно; -0-Ра1

12 3 4

Схема 1. Синтез частично замещенного фосфатидилинозита.

Взаимодействие диизопропилиденового кеталя ти «о-инозита (1) с триэтиламмониевой солью 1,2-дипальмитоил-гае-глицеро-З-Н-фосфоната (2), полученной по описанному методу (ЫпйИ I., 1989), в присутствии пивалоилхлорида в безводном пиридине (10-15 мин при 20°С) и последующее окисление продукта конденсации (без выделения) водно-пиридиновым раствором йода (5 мин при 20°С) приводили, после обработки и колоночной хроматографии на сшгакагеле, с выходом 86% к защищенному фосфоинозитиду (3). Строение соединения подтверждали данными !Н- и 31Р-ЯМР-спектроскопии, а также путем превращения в монофосфоинозитид (4) заведомой структуры: при кипячении соединения (3) с 50% уксусной кислотой, после обычной обработки был выделен свободный монофосфоинозитид (4), физико-химические константы которого соответствовали литературным данным. Это свидетельствовало о селективном фосфорилировании гидроксигруппы в положении 1 тетразамещенного производного (1) при его взаимодействии с Н-фосфонатом (2).

Также мы предложили использовать молекулу частично замещенного фосфатидилинозита (5) в качестве молекулярной транспортной системы для направленной доставки нескольких остатков антивирусного нуклеозида (А2.Т).

Для этого на следующем этапе работы нами был получен замещенный фосфатидилинозит (5) (Схема 2) с тремя свободными гидроксильными группами, открытыми для дальнейшей функционализации при взаимодействии с анти-ВИЧ-активным нуклеозидом.

Схема 2. Синтез монокетального производного фосфатидилинозита.

Селективное удаление трдис-кетальной защитной группы проводилось кипячением пентазамещенного производного ,иио-инозита (3) с и-толуолсульфокислотой в хлороформе: в условиях реакции цис-кетальная группа оставалась устойчивой. После обработки реакционной массы и колоночной хроматографии на силикагеле выход целевого монокетального производного фосфатидилинозита (5) составил 53%. Структуру полученного соединения (5) подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии.

1.2. Синтез липофильных а,со-диольных соединений.

Показано, что антивирусная эффективность соединения зависит не только от способности лекарственного препарата ингибировать действие фермента, но также от концентрации активного вещества внутри клетки-мишени. Поэтому при использовании полигидроксильных соединений в качестве липофильных молекулярных транспортных систем для одновременной доставки нескольких остатков антивирусных нуклеозидов в инфицированные клетки возможно ожидать увеличения внутриклеточной концентрации и антивирусной эффективности фармакологически активного соединения за счет улучшения транспортных свойств вследствие структурной аффинности липофильного компонента к липидному матриксу клеточных мембран.

Так, а,ш-диольные соединения являются удобными матрицами для получения пролекарственных биоконъюгатов, что позволяет одновременно вводить по два остатка фармакологически активного соединения, а также изменять в ту или иную сторону липофильные свойства получаемых производных путем предварительного введения гидрофобных или гидрофильных заместителей в связующий фрагмент и изменения его длины.

С этой целью, исходя из доступною 1,4,5,6-тетра-О-бензилзамещенного производного л(мо-инозита с помощью периодатного окисления и последующего воссшновления нами был получен 2,3,4,5-тетра-0-бснзил-В,Ь-идит (6) (Рис.1), физико-химические характеристики которого совпадали с литературными данными.

Рисунок 1. 2,3,4,5-Тетра-0-бензил-В,Ь-идит.

В качестве другой молекулярной транспортной системы для структурной модификации антивирусных нуклеозидов мы предложили использовать алифатический диол (9), который получали двухстадийным восстановлением соответствующего динитрила (7) (Схема 3)

N0 (СН2), ^СЫ -► ОНС (СН2), ХНО-1*- НОН2СГ (СНг)8 СН2ОН

Схема 3. Синтез 1,12-додекандиола.

1,12-Додекандиаль (8) получали восстановлением динитрила (7) с помощью 1,5 М раствора БЛа!-Н в гептане. Реакция проводилась в атмосфере инертного газа в эфире при охлаждении, последующее разложение интермедиатного комплекса и обработка реакционной смеси приводили к диальдегиду (8), структуру которого подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии и качественной реакцией с 2,4-динитрофенилгидразином на карбонильные соединения. В спектре наблюдали наличие сигнала альдегидных протонов в области 9.72 м.д. и сигналов метиленовых протонов алифатической цепи - 1.11-1.63 м.д. Последующее восстановление 1,12-додекандиаля (8) осуществляли боргидридом натрия в водном диоксане. Обработка реакционной смеси приводила к алифатическому диолу (9) с выходом 69%, структуру которого также доказывали 'Н-ЯМР-спектроскопией.

Таким образом, на данном этапе работы нами были разработаны подходы и осуществлен синтез исходных полиольных соединений (3, 5, 6, 9) для дальнейшей структурной модификации антивирусных нуклеозидов и получения новых соединений с потенциальной антивирусной активностью.

7

8

9

2. Синтез липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов.

2.1. Синтез конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и фосфатидилинозита.

Фосфоинозитиды, являясь минорными компонентами клеточных мембран, принимают активное участие в процессах клеточной регуляции. За счет конъюгировапия их с антивирусными аналогами нуклеозидов возможно ожидать появления у производных способности проникать через клеточную мембрану и концентрироваться в клетках-мишенях. Кроме того, известно о существовании липидпереносящих белков, имеющих большое сродство к фосфолипидам. Следовательно, представляло интерес исследовать путь синтеза подобных соединений с целью улучшения транспортных свойств фармакологически активных нуклеозидов и возможности их более эффективного проникновения в клетку (при расщеплении конъюгатов мембранными ферментами, либо за счет рецепторно-опосредованного транспорта этих веществ внутрь клетки).

Для этого синтезированный ранее частично замещенный фосфатидилинозиг (3) использовали для получения липофильного производного <14Т по его свободной гидроксильной группе (Схема 4)

о о

но-с-сн2-снг-с-о-(«

,13) 0Н ¡-О-СОСиНл

Г° -........ \ /=\

3 13

11 Янтарный ангидрид | 2 Е^Ч ОМАР

О-СОС^Нз,"1-1"имяг о*\—Г 1

[)СС, ОМАР

? \ о

01? х —

сн.

о с

О-С0С„Н3, 2 4ННН4ОН £<?н /ш, £ |-0-СОС,5Н„ О-СОСцН,, 0 £ ОЬ

СН2 10 14,15 ¿Н* 16,17

ОС \ /=\ ?"« О¿ 2

он 0 6« о

гТ :Ощ

11,13,14,16: —| 0° I 12,15,17: Я =о Г

^ ХУ

и,

Схема 4. Синтез конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов фосфатидилинозита.

Сначала остаток янтарной кислоты, выбранный нами в качестве удобного бифункционального и биодеградируемого спейсера между гидрофобной и гидрофильной частями целевого конъюгата (16), вводили действием янтарного ангидрида на соединение (3) в присутствии диметиламинопиридина. Полученное полностью замещенное производное .мио-инозита (10) было охарактеризовано с помощью ЯМР-спектроскопии: в 'Н-ЯМР-спекгре соединения (10) появились сигналы метиленовых протонов в области 2.60-2.82 м.д. Последующую этерификацию сукцинильного эфира фосфатидилинозита (10) с!4Т (11) проводили при активирующем воздействии дициклогексилкарбодиимида. Продукт реакции (14), выделенный колоночной хроматографией на силикагеле, был получен с 67% выходом. Структуру соединения (14) подтверждали спектральными данными (Табл.1).

Второй вариант синтеза фосфолипидного производного Л4Т (14) заключался во взаимодействии дикеталя фосфоинозитида (3) с синтезированным сукцинильным эфиром (13) нуклеозида. После проведения реакции в описанных для первого варианта условиях из реакционной смеси хроматографией выделяли с выходом 61% соединение (14), физико-химические характеристики которого совпадали с таковыми для аналогичного производного, синтезированного выше описанным способом.

На заключительном этапе синтеза фосфатидилинозитсодержащего конъюгата <14Т (16) действием 50% водной уксусной кислоты проводили гидролиз изопропилиденовых групп в соединении (14). Целевой продукт (16) выделяли в виде аммониевой соли, ее выход составил 45%. Структуру полученного конъюгата (16) однозначно подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии (Табл.1) и масс-спектрометрии.

Сравнивая два изученных варианта синтеза конъюгата (16), можно отметить, что более мягкой процедурой является первоначальная обработка производного фосфатидилинозита (3) ацилирующим агентом, позволяющая практически полностью заместить свободную гидроксильную группу на сукцинильный остаток, и последующее взаимодействие промежуточного сукцинильного эфира (10) с нуклеозидным компонентом (11). Последнее превращение с участием первичного гидроксила нуклеозида (11) протекает быстрее и с большей степенью конверсии, нежели по второму варианту конъюгирования, где моносукцинат нуклеозида (13) реагирует по вторичному, пространственно затрудненному гидроксилу защищенного лшо-инозита (3).

Поэтому для синтеза липофильного инозитсодержащего производного А2Т (17) мы использовали стратегию, основанную на взаимодействии нуклеозида (12) и сукцинильного производного фосфатидилинозита (10) в условиях, аналогичных получению соединения (14) по первому варианту конъюгирования. При этом достигался 34% выход защищенного конъюгата (15), выделенного колоночной хроматографией на силикагеле. Последующий гидролиз изопропилиденовых групп в соединении (15)

осуществляли в мягких условиях нагреванием при 50°С со смолой Ооууех 50\ух2. Выход целевого фосфолипидного производного А7Т (17) составил 38%. Структуру

полученного соединения подтверждали спектральными данными (Табл.1).

Таблица I. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии для соединений 10,14-17,19, 20.

Соединение

Группа 10 14 15 16 17 19 20

а 6* в « в в в

Инозитный фрагмент

1 СИ 3.51-3.64 3 88-4 67 3.33-3.51 3.66-3 88 3.81-4.09 3 88-4.17

2 СН 3.54-4.48 3.55-4.41 3 52-4 90 4 41-4 57 3 67-3 83

3 СН 3.48-3.86 3.47-3.66

4 СН 5 09-5 33 5 01-5 33 5.05-5.14 5 01-5 33 5.06-5 14 5 09-5 27 5 12-5.31

5 СН 3 54-4 48 3.51-3 64 3.55-4.41 3.33-3 51 3 52-4 90 3.48-3.86 3.47-3.66

6 СН 3.88-4.67 3.66-3.88

СН,-изопропил 1 14-1.46 1.39-1 67 1 31-1.58 - - 1.09-1.28 -

СН2-сукцинил 2 60-2.82 2.55-2.81 2.55-2.72 2.76-2 91 2 54-2 66 2.52-2.70 2.51-2.72

ОН - - - 1.75, 1 91 не опр. - не опр.

Остаток глицерина

1,3 сн2 3.54-4 48 3 88-4 67 3.55-4 41 3.33-3.51 3.52-4.90 4.16-4.3 6 3.88-4.17

2 СН 5 09-5.33 5.01-5 33 5.05-5.14 5.02-5.31 5.06-5.14 5.09-5.27 5.12-5.31

<хСНг пальмит. 2.27-2.48 2 20-2.36 2.20-2.39 2.25-2.32 2.20-2.37 2.19-2.42 2.19-2 40

рсн,- пальмит. 1.50-1.63 1.73-1 88 1.61-1.76 1.71-1.83 1 60-1.76 1.39-1.57 1.41-1 50

сн2- пальмит. 1.14-1.46 1.09-1.61 1.16-1.31 1.06-1.35 1.12-1.60 1.09-1.28 1.07-1.26

СНГ пальмит. 0.85 0.83 0.86 0.83 0.86 0 83 0.83

Остаток нуклеозида

Г СН - 6.97 6.22 6.96 6.14 6.12 6.13

2' СН - 5.92 - 5.95 - - -

2' СН2 - - 2.20-2.39 - 2.20-2.37 2.19-2.42 2.19-2.40

3' СН - 6.27 3.55-4.41 631 3.81-4.12 3.88-4.17

4' СН - 5 01-5.33 4.42-4 50 3.96 3.52 4.90 4.39-4.57 4.38-4.54

5' СН2 - 3 88-4 67 3.55-4.41 3.59 4.17-4.34 4.20-4.36

3NH - 8 15 11.35 ^ 8.17 11.32 11.32 11.30

5СН3 - 1 93 1.82 1 79 1.82 1.80 1.78

6 СН - 7 24 7.45 7.11 7.45 7.43 7.45

Остаток DMAP

2,6 СН 8 11 - - - - - -

3,5 СН 6.68 - - - - - -

NMe2 2.96 - - - - - -

а - CDCl3. CD3OD, б - CDCI3, в - DMSO-d6

На следующем этапе исследования мы предложили использовать молекулу фосфатидилинозита (5), имеющую в своей структуре три свободных гидроксильных группы, в качестве удобной матрицы для одновременного введения нескольких остатков AZT.

Взаимодействие монокетального производного фосфатидилинозита (5) (Схема 5) с 6-кратным избытком сукцинильного эфира А7Т (18) при активирующем воздействии дициклогексилкарбодиимида приводило к образованию динуклеозидсодержащего фосфоинозитида (19), выход которого после выделения колоночной хроматографией составил 98%. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии (Табл.1) подтвердили структуру полученного соединения (19). В 'Н-ЯМР-спектре наблюдали требуемое соотношение протонов фосфолипидного фрагмента и двух нуклеозидных остатков.

X О «X о он он о

9 О II ЛЛ г,лг ? о и I_I о-Р-Оп ' ' )-10-Р-0-1 ЕХжвхНМ

7 ЧГ 4 -0-Ра1^"<0К2 X, Ън

ОН Ли

КЗ, ОН

ьо-ра! 7'т №н;

О-Р-О-1

ОН '-О-Ра! О^ ОЯз '-О-Ра! 01*, 0Н3

5 0 19 смесь изомеров 20 смесь изомеров

нц->Ч-сн» Яиз = 5исс-АгТилиН к1.2,з= бисс-АГГ или Н

0-Ра1 О-Ра!

о о

О

18 = Н0-С-СНг-СН,-С-0, ^.О.

Схема 5. Синтез динуклеозидфосфолипида.

Удаление гумс-кетальной защитной группы соединения (19) осуществляли мягким кислотным гидролизом - нагреванием при 50°С со смолой Бо\уех 50\ух2. Динуклеозидфосфолипид (20) получили с выходом 30%, структуру которого подтверждали 1 Н-ЯМР-спектроскопией (Табл.1).

Таким образом, на данном этапе работы нами были разработаны подходы и осуществлен синтез новых липофильных инозитсодержащих производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов (А2Т и ё4'Г).

2.2. Синтез конъюгатов антивирусных нуклеозидов с липофильными а,ш-диольными соединениями.

Одним из перспективных направлений структурной модификации антивирусных нуклеозидов является получение их липофильных биоконъюгатов, содержащих различное количество остатков активного соединения.

Поэтому, на данном этапе работы мы синтезировали пять новых нуклеозидных конъюгатов, в которых два остатка анти-ВИЧ-активного нуклеозида связаны одним гидрофобным фрагментом.

Структурная модификация и синтез пролекарственных форм фармакологически активных соединений предполагает высвобождение лекарства в результате внутриклеточной биотрансформации, поэтому связь между фармакофорным фрагментом и гидрофобным транспортным звеном должна быть биодеградируемой.

Применение сложноэфирной связи для соединения молекулярных фрагментов при синтезе подобных производных возможно, так как последняя легко разрушается эстеразами с высвобождением лекарства.

Таким образом, в качестве связующего спейсера между гидрофобной и гидрофильной частями динуклеозидсодержащих производных (21-24) (Схема 6) нами был выбран остаток янтарной кислоты.

ОВг! 0821 0№ ОВД

„СНг-0Н 13 или 18 _ -А. /к /сн2"?

НО-СН, V Т^--*" о-сн2 Y у С=0

BzlO OBzl DCC-DMAP 0--С OBzl OBzl (¿H¡¡)2

6 (¿HA 21,22 <r=0

O0--C O

¿ R

13 или 18 /N.

HOH,C (CH,). CH,OH -► O-CH, (CH,). CH,-0

2 2 " 2 DCC, DMAP I 2

9 0=C „ C=0

i 23,24 7

<ch2)2 (ch2)2

o=c c=o

S ™ X CH. o o

R

iT ü4 *

21, 23: Rя п o 7 22,24: R

Схема 6. Синтез липофилыгах динуклеозидсодержащих конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и а,са-диольных соединений.

Синтез соединений (21-24) осуществляли взаимодействием тетрабензилидита (6) и додекандиола (9) с сукцинильными эфирами нуклеозидов (d4T (13) и AZT (18)) при активирующем действии дициклогексилкарбодиимида. Липофильные конъюгаты (2124), выделяли колоночной хроматографией на силикагеле с количественными выходами (55%, 56%, 54% и 61% соответственно). Структуры соединений (21-24) однозначно доказывали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии (Табл.2). В 'Н-ЯМР-спектрах полученных производных наблюдали требуемое соотношение протонов спейсерных цепей и двух нуклеозидных остатков.

Для получения динуклеозидсодержащего конъюгата другого типа мы синтезировали липофильное производное AZT, в котором гидрофобный транспортный фрагмент и два остатка фармакологически активного нуклеозида связаны между собой фосфодиэфирными связями.

Начальное фосфорилирование является лимитирующей стадией во внутриклеточном метаболизме неприродных нуклеозидов, поскольку часть из них имеет

низкое сродство к нуклеозидкиназам Кроме того, активность нуклеозидкиназ некоторых клеток, таких как моноциты/макрофаги, может быть недостаточна для удовлетворительного фосфорилирования даже аналогов нуклеозидов, имеющих высокое сродство к ферменту (например, AZT). Поэтому одним из подходов для решения проблемы инициации фосфорилирования является превращение противовирусных нуклеозидов в пролекарственные формы, содержащие в 5'-положении нуклеозида фосфо- или фосфонатэфирные фрагменты, что позволяет в результате внутриклеточного гидролиза получить монофосфатную форму нуклеозида.

Для синтеза бисфосфодиэфирного производного AZT (26) (Схема 7), включающею два остатка антивирусного нуклеозида, связанных фосфодиэфирными связями с гидрофобным транспортным фрагментом, мы использовали Н-фосфонатный метод фосфорилирования.

OBzl OBzl ОВг) OBzl О

/Ч. ^Ч. ^СН2 ОН PCIj. Im, Et,N 9 jL i. CH2-O-P-O"

HO-CH2 T^ - o'-P-O-CHj ^y^ Л EtjNH*

BzIO BzIO Et3NH* (!) BzIO BzIO

6 25

1. Piv-CI, AZT (8) 2 l/H,0/Py

О '1

HN'A]|'CHi OBzl OBzl О

Bz, = R = "1 >fJ »Л-П-СИ^^Ч/0"2-0^-OR

BzIO BzIO OH

26

Схема 7. Синтез бисфосфодиэфира 2,3,4,5-тетра-0-бензил-В,Ь-идита и З'-азидо-З'-дезокситимидина.

Сначала тетрабензилидит (6) подвергали фосфорилированию триимидазолилфосфитом, полученным т эНи, в присутствии триэтиламина, взаимодействие проходило при -10°С с последующим разложением реакционной массы водой. Образующийся ди-Н-фосфонат (25) выделяли хроматографией на силикагеле в виде аморфной триэтиламмониевой соли с выходом 74%. Структуру соединения (25) подтверждали данными 3|Р- и 'Н-ЯМР-спектроскопии. Наряду с протонами Вг1-групп, метиленовых и метановых протонов спейсерной цепи, спектр содержал сигналы протонов Р-Н связей в области 6.43 м.д. с характерной константой спин-спинового взаимодействия (^ц 790,0 Гц). В 31Р-ЯМР-спектре наблюдали характерный для Н-фосфонатной группы сигнал в области 3.62 м.д.

Последующую конденсацию фосфорсодержащего интермедиата (25) и А7Т (8) проводили в пиридине при активирующем действии пивалоилхлорида, промежуточный Н-фосфонатдиэфир без выделения окисляли раствором йода в смеси тетрагидрофуран-

пиридин-вода После обработки и очистки реакционной массы бисфосфодиэфир (26) выделяли с выходом 78%. Данные 'Н-ЯМР-анализа подтвердили структуру полученного коньюгата (26) и показали необходимое соотношение протонов гидрофобного

фрагмента и двух нуклеозидных остатков (Табл.2).

Таблица 2. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии для соединений 6, 9,13,18, 21-24,26.

Группа Соединение

13 Г 18 6 9 21 22 23 1 24 26

б' б а б б б б | а а

Гидрофобный фрагмент

-сн2о- - - 3 623.69 3.393.43 3 773.89 3.763.90 1.481.58 1.50-1.70 3.02-3.28

РЬСН2- - - 4.634.71 - 4.074.64 4.554 69 - - 3.78-4.86

-сн- аром - - 7.227.38 - 7.247.36 7.237 39 - - 7 08-7.32

-СН-цепи - 3.943.96 4.474.52 - 4.074.64 4.244.35 - - 2.22-2.47 3.02-3.28

-СН2-цепи - - - 1.221 30 1.351.43 - - 1.201.35 1.14-146 -

Спейсер

-СН2- 2.452.52 2.372.53 - - 2.542.62 2.49- | 2,482.70 | 2.65 2 57-2.72 -

Остаток нуклеозида

ген 6 80 6.016.22 - - 6.81 6.096.14 6.796.85 6.08-6.18 5 98-6 22

г сн 5.99 - - - 5.97 - 5.986.03 - -

ген, - 2.372.53 - - - 2.282.38 - 2.26-2.49 2.22-2 47

з-сн 6 38 3 924.00 - - 6 36 3.944.07 6.366.43 3.98-4.11 3.78-4.86

4' СН 4.96 4.364.53 - - 4.96 4.404.51 4.965.00 4.45-4.53

5СН2 4.124 34 4.144.31 - - 4.074 64 4.144.21 3.944.03 4.18-4.37

ЗШ 11.36 11.31 - - 11.36 11.30 11.36 9.08 11.30

5 СНз 1.78 1.75 - - 1.78 1.80 1.78 1.93 1.73

6СН 7 27 7 43 - - 7.276 7.43 7.27 7.31 7 08-7 32

Остаток ОМАР

2,6 СН 8.09 - - - - - - - -

3,5 СН 6 69 - - - - - - - -

1ЧМе2 2.96 - - - - - - - -

а - СОС13; б-йМ80-(16 Интересно отметить, что синтезированные нами на основе тетрабензилового

производного идита (6) коныогаты (21, 23 и 26) представляют интерес не только с точки зрения улучшения транспортных характеристик и одновременной доставки двух остатков анти-ВИЧ-активных нуклеозидов, но и в плане потенциального проявления

ими двойной противовирусной активности, направленной на различные стадии репликативного цикла вируса. Это обуславливается возможным образованием при внутриклеточном гидролизе данных конъюгатов двух остатков активного нуклеозида (ингибитора обратной транскриптазы) и производного идита с ионногенными группами (фосфатной и сукцинильной), являющегося структурным аналогом замещенного 1,2,5,6-тетра-О-бензил-В-маннита - известного ингибитора протеазы ВИЧ.

3. Синтез новых полианионных соединений с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции.

3.1. Синтез димерного аналога фосфатидилинозита.

Димерные производные фосфатидилинозита, состоящие из двух циклитных колец мгю-инозита, связанных фосфодиэфирными связями с одним гидрофобным спейсером, могут служить удобными синтонами для введения ионогенных группировок, что позволит получить различные инозитсодержащие полианионные соединения с потенциальной антивирусной активностью. Предполагается, что с помощью длинноцепочечного связующего фрагмента синтезированные производные смогут легче преодолевать клеточные мембраны и концентрироваться в клетках-мишенях. Варьируя длину гидрофобного спейсера и количество ионогенных групп, возможно изменять гидрофобно-гидрофильные свойства молекулы, и, следовательно, модулировать различные характеристики соединений на их основе, в том числе способность к биотранспорту и противовирусную эффективность.

Для направленного введения гидрофобных спейсерных фрагментов в определенные положения циклитного кольца мио-инозита с целью синтеза димерных полиольных аналогов необходимо располагать наличием соответствующих асимметрично замещенных производных мио-инозита. Поэтому, сначала нами было синтезировано бензоилпрогшоновое производное лшо-инозита (27), которое получали взаимодействием дикеталя лгио-ипозита (1) и (3-бепзоилпропионовой кислоты в присутствии дициклогексилкарбодиимида.

Дальнейшую конденсацию ди-Н-фосфоната (25) с пентазамещенным производным лшо-инозита (27) (Схема 8) проводили в пиридине при активирующем действии пивалоилхлорида, промежуточный бис-Н-фосфонатдиэфир без выделения окисляли раствором йода в смеси тетрагидрофуран-пиридин-вода до бисфосфодиэфирного производного (28) После выделения и очистки колоночной хроматографией, выход защищенного димерного аналога фосфатидилинозита составил 58%. Структура полученного димера была доказана 'Н-ЯМР-спектроскопией (Табл.3).

1. Гидразин гидрат, Ру-АсОН; 2.2,4-ле«таидион

В210 ОВг1 29

Схема 8. Синтез димерного аналога фосфатидилинозита.

Последующим гидразинолизом осуществляли удаление бензоилпропионильных блокирующих группировок соединения (28) и получали димерный аналог фосфатидилинозита (29) с выходом 51%. Структуру соединения (29) доказывали спектральными методами. В 'Н-ЯМР-спекгре соединения (29) (Табл.3) отсутствовали сигналы, характерные для протонов бензоилпропионильной группы.

Таблица 3. Данные 1 Н-ЯМР-спектроскопии для соединений 28, 29.

о

Группа Соединение

28 29

ОМвО-с!« ОМБО-ф,

Инозитный фрагмент

-СН-инозита 3.50-3.62; 3 88-4.22; 5.08-5.15 3.70-4.09; 4.35-4.71

СНз-изопропилиден. 1.05-1.42 1.12-1.38

-СН2С(0)СбН5 3.21-3 29 -

-0С(0)СН2- 2.73-3.02 -

-с6н5 7.55-8.00 -

Гидрофобный спейсер

-сн2о- 3.21-3.29 3.08-3.21

-СНг-РИ 4.50-4.75 4.35-4.71

-СН-аром. 7.20-7.31 7.12-7.29

-СН-цепи 3.88-4.22; 4.50-4.75 3.70-4.09

Таким образом, на данном этапе работы нами был получен димерный аналог фосфатидилинозита (29), дальнейшая функционализация свободных гидроксилов

которого ионогенными группами позволит получить ряд полианионных производных. Селективное или полное удаление изопропилиденовых защитных группировок циклитных колец соединения (29) даст возможность получать димерные матрицы с различным числом свободных гидроксилов, что позволит варьировать количество вводимых ионных групп и, следовательно, изменять гидрофобно-гидрофильные свойства получаемых на их основе полианионных соединений.

3.2. Синтез различных полианионных производных на основе а,<в-диольных соединений и димерного аналога фосфатидилинозита.

Наряду с димерным аналогом фосфатидилинозита (29), а,со-диольные соединения (6) и (9) также были предложены нами к использованию в качестве удобных синтонов для введения различных ионогенных групп с целью получения новых полианионных производных, которые благодаря наличию в структуре гидрофобных и гидрофильных фрагментов смогут служить потенциальными антивирусными соединениями с улучшенной способностью к биотранспорту через плазматическую мембрану.

3.2.1. Синтез сульфатных производных.

Синтез сульфатов диольных соединений (6), (9) и (29) (Схема 9) осуществляли по ранее описанному методу. Сульфатирование проводили в пиридине с помощью комплекса серная кислота-уксусный ангидрид, полученного непосредственно перед реакцией, при этом достигался 64%, 61% и 42% выход дисульфатов (30), (31) и (32) соответственно.

Структуры всех полученных производных подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии, элементного анализа и качественной реакцией на сульфогруппу.

Следует отметить, что использование данного метода сульфатирования оказалось весьма эффективным для получения соответствующих производных различных диотьных соединений, в том числе имеющих вторичные пространственно затрудненные гидроксильные группы инозитсодержащего димера (29). В ходе синтеза не затрагиваются функциональные связи и защитные группы исходных спиртов. Достаточно высокие выходы целевых сульфатов, несложное разделение реакционных смесей и очистка продуктов реакции делают этот метод перспективным для получения различных сульфатных производных.

0В21 ОВг\

НО-СН

о

СН,-ОН 1 н,зо.,Ас,о,Ру,1 ||

-** О—Я—О-СН

* ыо ВгЮ

0Вг1 0Вг1 О

СН2-0—в—О"

ь мН;

о о

1 Нг50),Лсг0,Ру,1 . II 11

НОН2С (СН2)8 СН2ОН 0-8-0-СН, (СНг)8 СНГ0-8-0

9 N"4 О 31 О Мн4

„X О

? ? 0-8 О'

Динерный аналог 1 н^о„дсго,Ру,| ^ > Ч | ¿

фосфатидилинозита г. 25* аояный раствор мн, (\|\ /т

о=Р-о-снг ^ Т^ но 0

0В21 Вг10

ПХ О о О 0-8-0'

он

32

Схема 9. Синтез дисульфатных производных соединений (6), (9) и (29).

3.2.2. Синтез фосфатных производных.

В последнее время в биоорганической химии для синтеза различных фосфорсодержащих соединений все чаще применяются методы фосфорилирования с использованием соединений трехвалентного фосфора. Поэтому для синтеза дифосфатного производного тетрабензилового диола (35) (Схема 10) мы использовали фосфиттриэфирный метод фосфорилирования.

ОВ21 ОВ21 ^

ВйО ВгЮ °

^ 11 1 н-таграэал, Ру 33

(г.'ВиООН

ОВг1 0В21 О с„

И Л^Л/СН.-О-У-О^

о-р-о-сн2 У ¿-^сн

аммонал из

СН2-0-Р-0"| пМН4

ОВг1 ВгЮ 0

35

Схема 10. Сшиез дифосфата 2,3,4,5-тетра-0-бензил-П,Ь-идита.

В качестве несложно получаемого и удобного в применении реагента трёхвалентного фосфора мы предложили использовать ди(2-цианэтил)хлорфосфит (33). Его синтезировали первоначальным взаимодействием 3-гидроксипропионитрила с триметилхлорсиланом в присутствии триэтиламина. Далее проводили реакцию взаимодействия 3-(триметилсютилокси)пропионитрила с трихлоридом фосфора в ацетонитриле. Целевой хлорфосфит (33), содержащийся в полученной смеси в количественном соотношении 75% согласно данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, использовали далее без дополншельной очистки.

Реакцию фосфитилирования гидроксильного соединения (6) хлорфосфитом (33) проводили в пиридине при активирующем воздействии УЯ-тетразола (Схема 10). Окисление промежуточного дифосфиттриэфира до соответствующего дифосфаттриэфира (34) осуществляли раствором трет-бутилгидроперекиси в декане. Обработка реакционной смеси и очистка защищенного дифосфата (34) колоночной хроматографией на силикагеле приводили к 38% выходу целевого дифосфатного производного (34). Сфуктура полученного дифосфата (34) была подтверждена 'Н-ЯМР-спектроскопией' в спектре наряду с сигналами протонов бензильных групп и протонов углеводородной цепи спирта наблюдали сигналы метиленовых протонов четырех цианэтильных групп в областях 3.97-4.15 и 2.47-2.63 м.д.

Удаление цианэтильных защит с фосфорных центров соединения (34) проводили в условиях исчерпывающего аммонолиза действием 25%-ного водного аммиака в метаноле при нагревании до 56°С в течение 48 ч. Однако определенные трудности возникли на стадии выделения свободного дифосфата (35), связанные в первую очередь с его высокой гидрофильностью, что сильно сказалось на выходе этого соединения. В результате выделения и очистки полученного дифосфата (35) методом препаративной ТСХ выход целевого соединения в виде аммониевой соли составил 30%. Структуру дифосфата (35) подтверждали данными 'Н- и 31Р-ЯМР-спектроскопии. 3)Р-ЯМР-спектр содержал характерный для фосфатной группы сигнал в области -2.75 м.д.

3.2.3. Синтез карбоксиметильных производных.

Следующей задачей нашей работы являлось исследование подходов к синтезу карбоксиметильных производных с использованием диолов (6) и (9) в качестве исходных /

соединений. Реакцию получения карбоксиметильных производных спиртов предпочтительнее проводить с использованием галогенпроизводных сложных эфиров уксусной кислоты с последующим омылением сложных эфиров, так как применение галогенпроизводных самой уксусной кислоты приводит к образованию большого количества побочных продуктов.

Введение карбоксиметильных групп осуществляли с использованием двух алкилирующих реагентов: этилхлорацетата (36) и трем-бутилбромацетата (41) (Схема 11) В результате реакции гидроксильных компонентов (6) и (9), активированных предварительно гидридом натрия, с этилхлорацетатом происходило образование соответствующих ди- (37, 39) и монозамещенных (38, 40) ацильных производных, которые были выделены и охарактеризованы спектральными методами.

ОВг1 ОВ21 Р

О

ОВг! ОВг1 11

НО-СН2

„СН2-ОН

сн2-с-о-сн2

сн2-о-с-сн2 37

ВгЮ ВгЮ

гтилхлорацвгат (3$)

С1

ВгЮ ВгЮ

+

ОВг| ОВг!

С1

О

И

НОН2С (СН2), СН2ОН 9

зтилхлорацеют (36) ЙаН

сн2-о-с-сн2 зв но-сн2 ^ Т ЧС1

ВгЮ ВгЮ

СН2-С-0-СН2 (СН2), сн2о-с-сн2 сГ ЧС1 39

НО-СН2 (СН2), сн2 о-с-сн2

40

С1

ОВг! ОВг!

НО-СН2

ВгЮ ВгЮ 6

трег№бутмлбромацетат (41) ЫаН

ОВг| ОВг| О 0Вг1 ОВг1 О

сн2-о-сн2 сч + Д. сн2-о-сн2-сч

С-СН2-0-СН2 ^Г ^Т 0К1 но-сн2

Я, о' ВгЮ ВгЮ

-те. V ч - I

[ОН1

О

|!

О

с-сн2-о-сн2

но' ВгЮ ВгЮ

44

,СН2-0-СН2-С + сн2-о-сн2-с

ОН НО-СН2 ^у^

Схема 11. Синтез карбоксиметильных производных.

При использовании алкилирующего реагента с более объемным заместителем карбоксильной группы (41) нам удалось сместить направление реакции в сторону образования простых эфирных производных. Так при действии на тетрабензилидит (6) в аналогичных условиях 10-кратным избытком тяретя-бутилбромапетата (41) получали дизамещенное производное (42), выход которого составил 15%, и монозамещенное производное (43) с выходом 34%. Структуры полученных соединений однозначно подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии: в спектрах наблюдали требуемое

соотношение сигналов гидрофобного фрагмента, сигналов метиленовых протонов (3.97 мд.) и протонов wpem-бутильной группы (1.40 м.д.) для моно- и дизамещенного продуктов соответственно.

Последующее омыление сложных эфиров соединений (42) и (43) осуществляли водно-этанольным раствором щелочи. Монокарбоксиметильное производное (45) было выделено колоночной хроматографией на силикагеле с выходом 68%, а дикарбоксиметильное соединение (44) - препаративной ТСХ с выходом 61%. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии дикарбоксиметильного производного (44) показали отсутствие в спектре синглета протонов, соответствующих mpem-бутилыюй группе в области сильного поля и наличие синглета протонов метиленовой группы в области 3.97 м.д.

Таким образом, нами были разработаны подходы и осуществлен синтез новых полианионных соединений, в том числе на основе димерного аналога фосфатидилинозита. Все эти производные могут выступать потенциальными ингибиторами адсорбции различных вирусов на клеточной поверхности, обладая улучшенной биодоступностью за счет сложного баланса их гидрофобно-гидрофильных свойств. Интересно отметить также, что синтезированные нами новые полианионные соединения (30, 32, 35, 44), содержащие липофильный шестиатомный фрагмент, представляют собой потенциальные антивирусные агенты, действие которых может быть направлено еще и на ингибирование протеазы ВИЧ.

С целью изучения биологической активности и закономерности структура-противовирусная эффективность все синтезированные соединения были переданы для дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1 С использованием Н-фосфонатного подхода разработан упрощенный и эффективный метод синтеза замещенного фосфатидилинозита, а именно 2,3(1),5,6(4)-ди-0-изопропилиден-1(3)-0-(гас-дипальмитоилглицерофосфо)-5И-л4Ш-инозита. Применение данного метода фосфорилирования позволило сократить число синтетических стадий при получении подобных глицерофосфолипидов. 2. Исследованы различные подходы к синтезу липофильных фосфатидилинозитсодержащих производных антивирусных нуклеозидов (d4T и AZT). Осуществлен синтез конъюгатов d4T, AZT и фосфатидилинозита, при этом установлено, что взаимодействие сукцинильного производного фосфоинозитида и нуклеозида является предпочтительным. Осуществлен синтез конъюгата AZT и фосфатидилинозита, содержащий в своей структуре два остатка активного фармакофора.

3. Предложено использовать гидрофобные а,со-диольные соединения в качестве молекулярных транспортных систем для доставки двух остатков антивирусных нуклеозидов в клетки-мишени. Получены новые конъюгаты d4T и AZT с 2,3,4,5-тетра-0-бензил-0,Ь-идитом и 1,12-додекандиолом. С использованием Н-фосфонатного метода фосфорилирования синтезирован бисфосфодиэфир 2,3,4,5-тетра-0-бензил-0,Ь-идита и AZT.

4. Разработан метод синтеза димерного аналога фосфатидилинозита, в котором два циклитных кольца мио-инозита связаны фосфодиэфирными связями с липофильным шестиатомным фрагментом.

5. Осуществлен синтез различных сульфатных, фосфатных и карбоксиметильных производных на основе диольных соединений с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Шастана Н.С., Тучная O.A., Эйнисман Л.И., Каширичева И.И., Степанов А.Е., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследования в области производных асимметрично замещенного лшо-инозита. XXXIX. Синтез конъюгата 2\3'-дидегидро-3'-дезокситимидина с фосфатидилинозитом, нового нуклеозидфосфолипида с потенциальной анти-ВИЧ-активностью.// Биоорганическая химия.-2003.-Т.29.-№3.-С.296-302.

2. Тучная O.A., Шастина Н.С., Швец В.И. Исследование путей синтеза и свойств конъюгатов фосфатидилинозита и неприродных аналогов нуклеозидов.// II Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития».-Москва.- 2003,-Тезисы докладов.-Т.1.-С. 115-116

3. Елизарова С.Н., Тучная O.A., Шастина Н.С., Юркевич A.M. Исследование путей синтеза фосфодиэфирных производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и фосфатидилинозита.// X Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии»,- Волгоград.- 2004,- Тезисы докладов.- Т.1.-С. 194-197

4. Тучная O.A., Шарикова С.А., Лившиц В.А., Шастина Н.С., Швец В.И. Синтез липофильных производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с полигидроксильными соединениями.// III Международный конгресс «Биотехнология, состояние и перспективы развития».- Москва.- 2005,-Тезисы докладов.-Т. 1.-С. 137

5. Тучная O.A., Лившиц В.А., Горлачук О.В., Шастина Н.С. Синтез дисульфатов различных полиолов с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции.//1 Научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова «Наукоемкие химические технологии» - Москва.- 2005.- Тезисы докладов.- С 31-33

Принято к исполнению 18/10/2005 Заказ № 1136

Исполнено 19/10/2005 Тираж- 100 эм

ООО «11-й ФОРМАТ » ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975 78-56 (095) 747-64-70 \ууу\у. айкает ги

№ 1 9 4 5 7

РНБ Русский фонд

2006-4 17665

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ

1.2. Синтетические подходы к структурной модификации нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ

1.2.1. Подход к созданию prodrug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ

1.2.1.1. Липофильные производные анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с гидрофобными соединениями

1.2.1.2. Пролекарственные производные анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с активными транспортными системами

1.2.1.3. Липофильные анти-ВИЧ-активные пронуклеотидные производные

1.2.2. Подход к созданию double drug на основе нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с использованием комбинированной антивирусной терапии

1.2.2.1. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ

1.2.2.2. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с полисахаридами

1.2.2.3. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с пептидами

1.2.2.4. Комбинированные системы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ с бицикламами

1.3. Полианионные соединения - ингибиторы вирусной адсорбции

1.3.1. Сульфатированные полисахариды

1.3.2. Синтетические полианионные производные полисахаридов

1.3.3. Полианионные соединения белковой природы

1.3.4. Полианионные ПАВ

1.3.5. Поликарбоксилатные аналоги козалана

1.4. Подходы к синтезу фосфоэфирных производных мио-инозита

1.4.1. Н-фосфонатный метод 44 1.4.1.1.Использование Н-фосфонатного метода для синтеза инозитсодержащих фосфолипидов

1.4.2. Амидофосфитный метод

1.4.2.1.Использование амидофосфитного метода для синтеза фосфоэфирных производных мио-инозита

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Синтез исходных соединений для конструирования новых веществ с потенциальной антивирусной активностью

2.1.1. Разработка метода синтеза производных частично замещенного фосфатидилинозита

2.1.2. Синтез липофильных а, ш - диольных соединений

2.2. Синтез липофильных, в том числе инозитсодержащих, производных анти-ВИЧ-активных нуклеозидов

2.2.1. Синтез конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов и фосфатидилинозита

2.2.2. Синтез конъюгатов антивирусных нуклеозидов с липофильными а, ю - диольными соединениями

2.3. Синтез новых полианионных соединений с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции

2.3.1. Синтез димерного аналога фосфатидилинозита

2.3.2. Синтез различных полианионных производных на основе а, ю - диольных соединений и димерного аналога фосфатидилинозита

2.3.2.1. Синтез сульфатных производных

2.3.2.2. Синтез фосфатных производных

2.3.2.3. Синтез карбоксиметильных производных

3. Экспериментальная часть 77 Выводы 91 Список литературы 92 Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ас - ацетил

AZT - Зч-азидо-Зч-дезокситимидин Bzl - бензил

СС50 - средняя цитотоксическая концентрация: концентрация, вызывающая гибель 50% клеток

CCR5 - хемокиновый рецептор макрофаготропных штаммов ВИЧ

СЕМУТК" - СЕМ-клетки, обедненные тимидинкиназой

CXCR4 - хемокиновый рецептор Т-тропных штаммов ВИЧ d4T - 2\ Зч-дидегидро-2\Зч-дидезокситимидин

DCC - Г^ЬГ-дициклогексилкарбодиимид ddC - 2\34-дидезоксицитидин ddl - 2\Зч-дидезоксиинозин

DibAl-H - диизобутилалюмогидрид

DMAP - 4-диметиламинопиридин

DMSO - диметилсульфоксид

DS - степень сульфатирования

ЕС50 - средняя эффективная концентрация: концентрация, которая уменьшает на 50% индуцируемый вирусом цитопатический эффект Et - этил

HIV - вирус иммунодефицита человека

HCMV - цитомегаловирус человека

HAS - человеческий сывороточный альбумин

HSV - простой вирус герпеса

1ш - имидазол

Рг- изопропил

UAIH4 - литийалюмогидрид m-CPB А - .ие/яа-хлорнадбензойная кислота

Pal - пальмитоил

Piv - пивапоил p-TSA - иара-толуолсульфокислота RSV - респираторно-синциальный вирус SFV - лесной вирус Semliki SI - индекс селективности (СС50 / ЕС50) Succ - сукцинил lBu - mpem-бутил

TEAB - триэтиламмоний-бикарбонатный буфер Thy - тимин

TPS - 2,4, 6 - триизопропилбензосульфохлорид

VS V - везикулярный вирус стоматита

ХЕРА - 2-диэтиламино-5,6-бензо-1,3,2-Диоксафосфепан

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ГФИ - гликозилфосфатидилинозит

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ДМФА - М,М-диметилформамид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИАДРЭП - ионизация при атмосферном давлении распылением в электрическом поле

ПАВ - поверхностно-активные вещества

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Расширение знаний по молекулярной биологии различных вирусных инфекций и постоянный поиск эффективной химиотерапии для их лечения позволяют находить новые подходы к созданию лекарственных препаратов с высокой антивирусной активностью, действие которых направлено на специфические и критические процессы жизненного цикла вирусов, а также к улучшению фармакологических свойств применяемых в медицинской практике соединений.

Так, превращение неприродных нуклеозидов, таких как азидотимидин (AZT), 2\3Ч-дидезоксиинозин (ddl), 2\Зч-дидегидро-2ч,Зч-дидезокситимидин (d4T) и др., являющихся по механизму действия ингибиторами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в их липофильные производные позволяет преодолеть недостатки данных нуклеозидов, связанные с их высокой токсичностью и слабой способностью к преодолению клеточных мембран и гематоэнцефалического барьера.

Наряду с работами в области противовирусных соединений нуклеозидной природы в последние годы широко развиваются исследования различных по структуре полианионсодержащих веществ (сульфатов полисахаридов, поликарбоксилатов козалана, производных дистамицина и др.), выступающих в качестве ингибиторов адсорбции вирусной частицы на клеточной поверхности. Но такие соединения обладают рядом фармакокинетических и токсикологических недостатков, которые ставят под угрозу их клиническое использование. Поэтому необходим постоянный поиск новых полианионных соединений с целью получения препаратов с высокой антивирусной активностью и с улучшенными свойствами к биотранспорту.

Создание лекарственных препаратов на основе природного шестиатомного циклического спирта мио-инозита представляется перспективным направлением в конструировании и модификации фармакологически активных соединений. Интерес к химии производных лшо-инозита обуславливается их высокой биологической активностью. Установлено, что 1,4,5-трифосфат-.ш-лшо-инозита, являясь вторичным мессенджером, обеспечивает передачу и усиление клеточного сигнала в процессе высвобождения кальция из внутриклеточных источников. Известно также, что и сам мио-инозит обладает витаминной активностью и оказывает гиполипидемическое, липотропное, противоопухолевое действие. Кроме того, фосфоинозитиды являются минорными компонентами клеточных мембран и принимают активное участие в процессах клеточной регуляции. Поэтому, можно ожидать, что создание на их основе липофильных производных антивирусных нуклеозидов позволит улучшать фармакокинетические свойства, проницаемость через биологические мембраны, пролонгировать действие и способствовать направленному транспорту нуклеозидов в клетки-мишени.

Кроме того, молекула мио-инозита, в состав которой входят шесть гидроксильных групп, является удобной матрицей для введения различных ионогенных группировок при создании новых противовирусных полианионных соединений. При этом лшо-инозит может снижать отрицательное побочное воздействие препарата на организм, не изменяя его терапевтических свойств.

Таким образом, создание новых фармакологически активных соединений с улучшенным спектром терапевтического действия, в том числе и на основе лшо-инозита, является актуальным направлением биоорганической и медицинской химии.

В связи с этим целью работы явилось исследование путей синтеза новых соединений нуклеозидной и ненуклеозидной природы на основе гидрофобных полиольных, в том числе инозитсодержащих, молекулярных транспортных систем с целью поиска препаратов с потенциальной противовирусной активностью.

1. ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР

выводы

1. С использованием Н-фосфонатного подхода разработан упрощенный и эффективный метод синтеза замещенного фосфатидилинозита, а именно 2,3(1),5,б(4)-ди-0-изопропилиден-1(3)-0-(гас-дипальмитоилглицерофосфо)-.ш-лшо-инозита. Применение данного метода фосфорилирования позволило сократить число синтетических стадий при получении подобных глицерофосфолипидов.

2. Исследованы различные подходы к синтезу липофильных фосфатидилинозитсодержащих производных антивирусных нуклеозидов (d4T и AZT). Осуществлен синтез конъюгатов d4T, AZT и фосфатидилинозита, при этом установлено, что взаимодействие сукцинильного производного фосфоинозитида и нуклеозида является предпочтительным. Осуществлен синтез конъюгата AZT и фосфатидилинозита, содержащий в своей структуре два остатка активного фармакофора.

3. Предложено использовать гидрофобные а,а)-диольные соединения в качестве молекулярных транспортных систем для доставки двух остатков антивирусных нуклеозидов в клетки-мишени. Получены новые конъюгаты d4T и AZT с 2,3,4,5-тетра-0-бензил-0,Ь-идитом и 1,12-додекандиолом. С использованием Н-фосфонатного метода фосфорилирования синтезирован бисфосфодиэфир 2,3,4,5-тетра-0-бензил-0,Ь-идита и AZT.

4. Разработан метод синтеза димерного аналога фосфатидилинозита, в котором два циклитных кольца лшо-инозита связаны фосфодиэфирными связями с липофильным шестиатомным фрагментом.

5. Осуществлен синтез различных сульфатных, фосфатных и карбоксиметильных производных на основе диольных соединений с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции.

1. Е. De ClercqvAntivirals and antiviral strategies.// Microbiology, 2004, v. 2, p. 704-720.

2. P. Huang, D. Farquhar, W. Plunkett .Selective action of 3v-azido-3v-deoxythymidine 5V-triphosphate on viral revers transcriptases and human DNA polymerases. // J. Biol. Chem., 1990, v. 264, p. 11914-11918.

3. D. M. Huryn, M. Okabe AIDS-driven nucleoside chemistry. // Chem. Rev., 1992, v. 92, p. 1745-1768.

4. E.T. Hall, J.-P. Yan, P. Melancon, R.D. Kuchta^ 34-Azido-34-deoxythymidine potently inhibits protein glycosylation. // J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 14355-14358.

5. E. De Clercq Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for intervention with HIV infections. // J. Med. Chem., 1995, v.38, iss. 14, p. 2491-2517.

6. B. Macchi, A. Mastino Pharmacological and biological aspects of basic research on nucleoside-based reverse transcriptase inhibitors.// Pharmacol.Res., 2002, v. 46, № 6, p. 473482.

7. N. Sluis-Cremer, D. Arion, M.A. Parniak. Molecular mechanisms of HIV-l resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs).// CMLS, Cell.Mol.Life Sci., 2000, v. 57, p. 1408-1422.

8. M. H. St. Clair, J.L. Martin, G. Tudor-Williams, M.C. Bach, C.L. Vavro, D.M.King, P. Kellam, S.D. Kemp, B.A. Larder Resistance to ddl and sensitivity to AZT induced by a mutation in HIV-l reverse transcriptase. // Science, 1991, v. 253, p. 1557-1559.

9. S.F. Lacey, B.A. Larder Novel mutation (V75T) in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase confers resistance to 2\34-didehydro-2\34-dideoxythymidine in cell culture. // Antimicrob. Agents Chemother., 1994, v. 38, p. 1428-1432.

10. K. Parang, L.I. Wiebe, E.E. Knaus Novel approaches for designing 5v-0-ester prodrugs of 3N-azido-2\3N-dideoxythymidine (AZT).// Curr.Med.Chem., 2000, v. 7, p. 995-1039.

11. J. Zemlicka Lipophilic phosphoramidates as antiviral pronucleotides.// Biochim.Biophys.Acta, 2002, v. 1587, p. 276-286.

12. T. Kawaguchi, K. Ishikawa, T. Seki, K. Juni Ester prodrugs of Zidovudine.// J. Pharm. Sci., 1990, v. 79, p. 531-533.

13. Т. Seki, Т. Kawaguchi, К. Juni Enhanced delivery of Zidovudine through rat and human skin via ester prodrugs.// Pharm. Res., 1990, v. 7, p. 948-952.

14. T. Kawaguchi, T. Endoh, T. Seki, K. Juni Plasma concentration of Zidovudine in rats via oral administration of its ester prodrugs. // J. Pharm. Sci., 1991, v. 80, p. 404-405.

15. K. Parang, L.I. Wiebe, E.E.Knaus In vitro anti-hepatitis В virus activities of 54-0 myristoyl analogue derivatives of 3N-fluoro-2\3v-dideoxythymidine (FLT) and 34-azido-2\3v-dideoxythymidine (AZT). // J. Pharm. Pharm. Sci., 1998, v. 1, p. 108-114.

16. D.F. Horrobin, J.C.M. Stewart, M.D. Winther Preparation of fatty acid derivatives of nucleosides or acylic nucleosides as antiviral agents: EP 393920,1990.

17. M.B. Yatvin, M.H. Stowell Covalent polar lipid conjugates with antimicrobial and antineoplastic drugs for targeting to biological protected sites: WO 0033883,2000.

18. E.JI. Водовозова, Ю.Б. Павлова, M.A. Полушкина, A.A. Ржанинова, M.M. Гараев, Ю.Г. Молотковский Новые фосфолипиды ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность. // Биоорган, химия, 1996, т. 22, № 6, с. 451-457.

19. К.Y. Hostetler, L.M. Stuhmiller, H.B.M. Lenting, H. van den Bosch, D.D. Richman Synthesis and antiretroviral activity of phosphplipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides. //J. Biol. Chem., 1990, v. 265, iss. 11, p. 6112-6117.

20. S.K. Agganval, S.R. Gogu, S.R.S. Rangan, K.C. Agrawal Synthesis and biological evaluation of prodrugs of zidovudine.// J.Med.Chem., 1990, v. 33, p.1505-1510.

21. D.M. Mastrianni, N.M. Tung, D.G. Tenen Acute myelogenous leukemia: current treatment and future directions. // Am. J. Med., 1992, v.92, p. 286-295.

22. J.M. Bailey, K.A. Nelson, M. Lightfoote, R.A. Mook Antiviral action and tissue uptake of AZT-sterol dicarboxylates.// Biochem.Soc.Trans., 1998, v. 26, p. S390.

23. K. Agrawal AZT analogs for treatment of retrovirus infections: WO 9004969,1990.

24. B.M. Tadayoni, P.M. Friden, L.R. Walus, G.F. Musso Synthesis, in vitro kinetics and in vivo studies on protein conjugates of AZT: Evaluation as a transport system to increase brain delivery.// Bioconjugate Chem., 1993, v. 4, p. 139-145.

25. P.M. Friden, L. Walus, G. Musso, M. Taylor, B. Malfroy, R. Starzyk Anti-transferrin receptor antibody and antibody-drug conjugates cross the blood-brain barrier.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1991, v. 88, p. 4771-4775.

26. S. Pochet, V. Kansal, F. Destouesse, S.R. Sarfati Alkylglycoside carbonates of 3N-azido-3v-deoxythymidine.// Tetrahedron Lett., 1990, v. 31, № 42, p. 6021-6024.

27. R.J. Jones, N. Bischofberger Minireview: nucleotide prodrugs. // Antiviral Res., 1995, v.27, p. 1-17.

28. C. Meier, M. Lorey, E. De Clerq, J. Balzarini cryc/oSal-2\34-dideoxy-2\3N-didehydrothymidine monophosphate (cyc/oSal-d4TMP): synthesis and antiviral evaluation of a new d4TMP delivery system. // J. Med. Chem., 1998, v. 41, p. 1417-1427.

29. D. Bonnaffe, B. Dupraz, J. Ughetto-Monfrin, A. Namane, Т.Н. Dinh Synthesis of acyl pyrophosphates. Application to the synthesis of nucleotide lipophilic prodrugs.// Tetrahedron Lett., 1995, v. 36, № 4, p. 531-534.

30. D. Bonnaffe, B. Dupraz, J. Ughetto-Monfrin, A. Namane, Y. Henin, Т.Н. Dinh Potential lipophilic nucleotide prodrugs: synthesis, hydrolysis and antiretroviral activity of AZT and d4T acyl nucleotides.// J.Org.Chem., 1996, v. 61, p. 895-902.

31. N. Mourier, C. Trabaud, J.C. Graciet, V. Simon, V. Niddam, P. Faury, A.S. Charvet, J.-C. Chermann, J.L. Kraus Peptide-nucleoside conjugates: synthesis and anti-HIV activities.// Nucleosides & Nucleotides, 1995, v. 14, №6, p. 1393-1402.

32. Y. Gao, K. Katsuraya, Y. Kaneko, T. Mimura, H. Nakashima, T. Uryu Synthesis of azidothymidine-bound curdlan sulfate with anti-human immunodeficiency virus activity in vitro.ll Polymer Journal, 1998, v. 30, p. 31-36.

33. В.В. Ряховский, С.И. Малекин, В.М. Носова, А.В. Кисин, Ю.Л. Кругляк, В.К. Курочкин Коньюгаты 2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидина с тимогеном. Синтез, анти-вич-активность. // Биоорган, химия, 1999, т. 25, № 7, с. 499-504.

34. J. Dessolin, P. Galea, P. Vlieghe, J.-C. Chermann, J.-L. Kraus New bicyclam-AZT conjugates: design, synthesis, anti-HIV evaluation, and their interaction with CXCR-4 coreceptor. //J. Med. Chem., 1999, v. 42, p. 229-241.

35. T. Uchiyama, H. Yoshino, M. Takemoto, K. Achiwa Synthesis of the 2\3V-dideoxynucleosides derivatives of the specific binding peptide part of CD4.// Chem. Pharm. Bull., 1991, v. 39, p. 3091-3093.

36. M. Luscher-Mattli Polianions a lost chance in the fight against HIV and other virus diseases?// Antiviral Chem. Chemother., 2000, v. 11, p. 249-259.

37. Y. Gao, K. Katsuraya, Y. Kaneko, T. Mimura, H. Nakashima and T. Uryu Synthesis, enzymatic hydrolysis and anti-HIV activity of AZT-spacer-curdlan sulfates.// Macromolecules, 1999, v. 32, p. 8319-8324.

38. Y. Gao, K. Katsuraya,' Y. Kaneko, T. Mimura, H. Nakashima and T. Uryu Synthesis of azidothymidine-bound sulfated alkyl oligosaccharides and their inhibitory effects on AIDS virus infection in vitro J I Polymer Journal, 1998, v. 30, p. 243-248.

39. K. Katsuraya, H. Nakashima, N. Yamomoto, T. Uryu. Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti-HIV activity and the relationship between activity and chemical structure// Carbohydr. Res., 1999, v.315, p.234-242.

40. J.S. McDougal, M.S.Kennedy, J.M. Sligh, S.P. Cort, A. Mawle, J.K.A. Nicholson Binding of HTLV-III/LAV to T4+ T cells by a complex of the 110K viral protein and the T4 molecule.// Science, 1986, v. 231, p. 382-385.

41. E. De Clercq, N.Yamamoto, J. Balzarini, R. Pauwels, M. Witvrouw, G. Henson, M. Abrams Highly potent and selective inhibition of human immunodeficiency virus by the bicyclam derivative JM 3100. // Antimicrob. Agents Chemother., 1994, v. 38, p. 668-674.

42. D. Schols, J.A. Este, G. Henson, E. De Clerq Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4.// Antiviral Res., 1997, v. 35, p. 147-156.

43. J.-M. Daoudi, J. Greiner, A.-M. Aubertin, P. Vierling New bicyclam-GalCer analogue conjugates: senthesis and in vitro anti-HTV activity. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, v. 14, p. 495-498.

44. M. Witvrouw, E. De Clercq Sulfated polysaccharides extracted from sea algae as potent antiviral drugs.// Gen. Pharmacol., 1997, v. 29, p. 497-511.

45. D.C. Chan, P.S. Kim HIV entry and its inhibition.// Cell, 1998, v. 93, p. 681-684.

46. E. De Clercq New developments in anti-HTV chemotherapy.// Biochim. Biophys. Acta, 2002, v. 1587, p. 258-275.

47. M. Ito, M. Baba, A. Sato, R. Pauwels, E. De Clercq, S. Shigeta Inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on the replication of human immunodeficiency virus (HTV) in vitro.// Antiviral Res., 1987, v. 7, p. 361-367.

48. K.J. Lorentsen, C.W. Hendrix, J.M. Collins, D.M. Kornhauser, B.G. Petty, R.W. Klecker, C. Flexner, R.H. Eckel, P.S. Leitman Dextran sulfate is poorly absorbed after oral administration.// Ann. Intern. Med., 1989, v. Ill, p. 561-566.

49. N.L. Hartmann, D.G. Johns, H. Mitsuya Pharmacokinetic analysis of dextran sulfate in rats as pertains to 1st clinical usefulness for therapy of HIV infection.// AIDS Res.Hum.Retroviruses, 1990, v. 6, p. 805-812.

50. R. Mehvar, T.L. Shepard Molecular-weight-dependent pharmacokinetics of fluorescein-Jabeled dextrans in rats.//J.Pharmaceut.Scien., 1992, v. 81, p. 908-912.

51. T. Uryu, N. Ikushima, K. Katsuraya, T. Shoji, N. Takahashi, T. Yoshida, K. Kannno, T. Murakami, H. Nakashima, N. Yamamoto. Novel chitin sulfates: specific anti-HIV-l agents// Biochem. Pharmacology, 1992, v.43, p.2385-2392.

52. D. Yang, Y. Ohta, Sh. Yamaguchi, Y. Tsukada, Y. Haraguchi, H. Hoshino, H. Amagai, I. Kobayashi. Sulfated colominic acid: an antiviral agent that inhibit the human -immunodeficiency virus type 1 in vitro// Antivir. Res., 1996, v.31, p.95-104.

53. A. Handa, H. Hoshimo, K. Nakajima, M. Adachi, K. Ikeda, K. Achiwa, T. Itoh, Y. Suzuki. Inhibition of infection with human immunodeficiency virus type 1 by sulfated gangliosides// Biochem. Biophis. Res. Commun, 1991, v.175, p.1-9.

54. J. Ni, S. Singh, L.-X. Wang Improved preparation of perallylated cyclodextrins: facile synthesis of cyclodextrin-based polycationic and polyanionic compounds.// Carb. Res., 2002, v. 337, p. 217-220.

55. J. Neyts, D. Reymen, D. Letourneur, J. Jozefonvicz, D. Schols, J. Este, G. Andre, P. McKenna, M. Wivrouw, S. IKEDA, J. Clements, E. De Clercq. Differential antiviral activity of derivatized dextrans// Biochem. Pharmacol., 1995, v.50, №6, p.743-751.

56. P.J. Swart, L. Beljars, M.E. Kuipers, C. Smit, P. Nieuwenhuis, K.F. Meier. Homing of negatively charged albumins to the lymphatic system// Biochem. Pharm., 1999, v.58, p. 14251435.

57. P. Schoen, J. Corver, K.F. Dirk, J. Wilschut, P.J. Swart. Inhibition of influenza virus fusion by polyanionic proteins// Biochem. Pharm., 1997, v.53, p. 995-1003.

58. A. Leydet, Ph. Barthelemy, B. Boyer, G. Lamaty, J.P. Roque Polianion inhibitors of human immunodeficiency virus and other viruses. 1. Polymerized anionic surfactants.// J.Med.Chem., 1995, v. 38, p. 2433-2440.

59. M. Cushman, Sh. Insaf, J.A. Ruell, C.A. Schacffer, W.G. Rice. Synthesis of a cosalane analog with an extended polyanionic pharmacophore conferring enhanced potency as an anti-HIV agent// Bioorg.Med.Chem.Let, 1998, v.8, p.833-836.

60. C. Schultz Prodrugs of biologically active phosphate esters.// Bioorg.Med.Chem., 2003, v. 11, p. 885-898.

61. Y. Watanabe Synthetic Strategies based on Phosphite Chemistry Aiming at Efficient Synthesis of Inositol Phospholipids. // J. Synth. Org. Chem., 2000, v. 58, № 11, p. 10571065.

62. M.J. Berridge, P. Lipp, M.D. Bootman The versatility and universality of calcium signalling.//Nature Rev.MoI.Cell Biol., 2000, v. 1, p. 11-21.

63. В.И. Швец, A.E. Степанов, B.H. Крылова, П.В. Гулак // лшо-Инозит и фосфоинозитиды. М., Наука, 1987, 248 с.

64. А.Ю. Замятина, А.С. Бушнев, В.И. Швец Фосфиттриэфирный и Н-фосфонатный методы в синтезах фосфолипидов.// Биоорган, химия., 1994, т.20, № 12, с. 1253-1296.

65. Da.-Sh. Wang, Ch.-Sh. Chen Synthesis and Biological Evalution of L-a-Phosphatidil-D-3-deoxy-3-heteromethyl-myo-inositols as Phosphoinositide 3-Kinase Inhibitors.// Bioorgan.Med.Chem., 2001, v. 9, p. 3165-3172.

66. L.W. Leung, C. Vilcheze, R. Bittman Synthesis of fluorescent phosphatidylinositols using a novel inositol H-phosphonate.// Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, p. 2921-2924.

67. Lindh, J. Stawinski A general method for the synthesis of glycerophospholipids and their analogues via H-phosphonate intermediates. // J. Org. Chem., 1989, v. 54, p. 1338-1342.

68. M. Vieira de Almeida, J. Cleophax, A. Gateau-Olesker, G. Prestat, D. Dubreuil, S.D. Gero Synthesis of deoxyphosphatidylinositol analogues and phosphonate isosters of Ins(l,4,5)P3.// Tetrahedron, 1999, v. 55, p. 12997-13010.

69. C.N. Borissow, Т.К. Smith, M.A.J. Ferguson, J.S. Brimacombe Synthesis of 3'-, 4'- and 6'-deoxy and other analogues of D-dlucosaminylphosphatidylinositol.// Tetrahedron Lett., 2001, v. 42, p. 121-123. >

70. Н.С.Шастина, Л.И. Эйнисман, И.И. Каширичева, А.Е.Степанов, В.И. Швец. Исследования в области производных асимметрично замещённого мио-инозита. XXXVII Синтез производных гликозилфосфатидилинозита.// Биоорган. Химия, 1995, т.21, №8, с. 641-650.

71. V. Ozola, С.В. Reese, Q. Song Use of ammonium aryl H-phosphonates in the preparation of nucleoside H-phosphonate building blocks.// Tetrahedron Lett., 1996, v. 37, № 47, p. 8621-8624.

72. I. Kers, J. Stawinski Aryl H-phosphonates. 10. Synthesis of nucleoside phosphoramidate and nucleoside phosphoramidothioate analogues via H-phosphonamidate intermediates.// Tetrahedron, 1999, v. 55, p. 11579-11588.

73. D.V. Yashunsky, A.V. Nikolaev Hydrogenphosphonate synthesis of sugar phosphomonoesters.// J.Chem.Soc.Perkin Trans., 1,2000, p. 1195-1198.

74. G. Anilkumar, M.R. Gilbert, B.F.raser-Reid Regioselective mannosylation routes to the antigenic myo-inositol component of Mycobacterium tuberculosis.// Tetrahedron, 2000, v. 56, p. 1993-1997.

75. J. Chen, A.A. Profit, G.D. Prestwich Synthesis of Photoactivatable l,2-0-Diacyl-^n-glycerol Derivatives of l-L-Phosphatidyl-D-nryo-inositol 4,5-Bisphosphate (PtdlnsPa) and 3,4,5-Trisphosphate (PtdInsP3).//J.Org. Chem., 1996, v. 61, p. 6305-6312.

76. Y. Watanabe, M. Nakatomi Synthesis of Р1(3,4,5)Рз with unsaturated and saturated fatty acid chains.// Tetrahedron, 1999, v. 55, p. 9743-9754.

77. M. Leuck, К. E. Vagle, J. S. Roach, A. Wolter A novel reagent for the chemical phosphorylation of oligonucleotides.//Tetrahedron Lett., 2004, v. 45, p. 321-324.

78. P.R.J. Gaffney, C.B. Reese Synthesis of naturally occurring phosphotidilinositol 3,4,5-trisphosphate PtdIns(3,4,5)P3. and its diastereoisomersio.// J.Chem.Soc.Perkin Trans., 1, 2001, p. 192-205.

79. J.R. Falck, U.M. Krishna, J.H. Capdevila A synthesis of L-a-phosphatidyl-D-myo-inositol 4,5-bisphosphate (4,5-PIP2) and glyceryl lipid analogs.// Tetrahedron Lett., 1999, v. 40, p. 8771-8774.

80. J.R. Falck, U.M. Krishna, K.K. Reddy, J.H. Capdevila, E.T. Ulug Concise synthesis of L-a-phosphatidyl-D-myo-inositol 3-phosphate (3-PIP), 5-phosphate (5-PIP), and 3,5-bisphosphate (3.5-PIP2).//Tetrahedron Lett., 2000, v. 41, p. 4271-4275.

81. K.K. Reddy, J. Rizo, J.R. Falck Concise Synthesis of L-a-Phosphatidyl-D-myo-inositol 3,4-Bisphosphate, An Intracellular Second Messenger.// Tetrahedron Lett., 1997, v. 38, № 27, p. 4729-4730.

82. G. Home, S. J. Mills, В. V. L. Potter First derivatives of wyo-inositol 1,4,6-trisphosphate modified at positions 2 and 3: structural analogues of D-wyo-inositol 1,4,5-trisphosphate.// Carbohydrate Res., 2004, v. 339, p. 51-65.

83. E. V. Lipovtsin, M. P. Koroteev, L. K. Vasyanina, E. E. Nifant'ev Directed phosphorylation of 2-C-hydroxymethyl-2,3:5,6-di-0-isopropylidene-D-mannofuranose. // Russ.Chem.Bull., Int.Ed., 2003, v. 52, № 9, p. 2070-2072.

84. Y. Watanabe, H. Munetsugu, M. Hayashi Comparison of Cyclic and Acyclic Phosphites by Selective Phosphorylation. Synthesis of Phosphatidylinositol 4-Phosphate. // Chem. Letters, 2002, p. 292-293.

85. Y. Watanabe, H. Hirofuji, S. Ozaki Synthesis of a phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate.//Tetrahedron Lett., 1994, v. 35, p. 123-124.

86. F. Han, M. Hayashi, Y. Watanabe Regioselective phosphorylation of vicinal 3,4-hydroxy myoinositol derivative promoted practical synthesis of D-Ptdlns(4,5)2 and D-Ins(l,4,5)P3.// Tetrahedron, 2003, v. 59, p. 7703-7711.

87. M. Jones, K.K. Rana, J.G. Wart, R.C. Young Improved synthesis of inositol phospholipid analogues.// Tetrahedron Lett., 1989, v. 30, No. 39, p. 5353-5356.

88. N. Moitessier, F. Chretien, Y. Chapleur, C. Humeau Synthesis and Biological Activities of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Mimics Related to Xylopyranosides.// Tetrahedron Lett., 1995, v. 36, № 44, p. 8023-8026.

89. G.M. Salamonczyk, K.M. Pietrusiewicz Expedient Synthesis of D-myo-Inositol 1,4,5 -Trisphosphate and D-wyo-Inositol 1,4 Bisphoshate.// Tetrahedron Lett., 1991, v. 32, № 43, p. 6167-6170.

90. Y. Watanabe, H. Ishikawa Synthesis of dipalmitoyl-phosphatidylinositol 5-phosphate and its modified biological tools.//Tetrahedron Lett., 2000, v. 41, p. 8509-8512.

91. H. Sun, G.B. Reddy, C. George, E.J. Meuillet, M.Berggren, G. Powis, A.P. Kozikowski Synthesis and biological activity of 3-hydroxy(phosphono)methyl-bearing phosphatidylinositol ether lipid analogues.// Tetrahedron Lett., 2002, v. 43, p. 2835-2838.

92. A.M. Riley, V.L. Potter L-a-Phosphatidyl-D-myo-inositol 3,5-bisphosphate: total synthesis of a new inositol phospholipid via myo-inositol orthoacetate.// Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, p. 6769-6772.

93. K.K. Reddy, M. Saady, J.R. Falck Intracellular mediators: synthesis of L-a-phosphatidyl-D-myo-inositol 3,4,5-trisphosphate and glyceryl ether analogs.// J.Org.Chem., 1995, v. 60, p. 3385-3390.

94. O. Thum, J. Chen, G.D. Prestwich Synthesis of a photoaffinity analogue of phophatidylinositol 3,4-bisphosphate, an effector in the phosphoinositide 3-kinase signaling pathway.//Tetrahedron Lett., 1996, v. 37, № 50, p. 9017-9020.

95. S. Ozaki, Y. Kondo, N. Shiotani, T. Ogasawara, Y. Watanabe Synthesis and Some Properties of D-myo-Inositol l,4,5-Tris(dihydrogen phosphate).// J.Chem.Soc.Perkin Trans., 1,1992, p. 729-737.

96. К. Fukase, Y. Aoki, I. Kinoshita, Y. Suda, M. Kurosawa, U. Zahringer, E.T. Rietschel, S. Kusumoto Synthesis Route for 14C-labeling of a Bioactive Lipid A Analogue.// Tetrahedron Lett., 1995, v. 36, № 47, p. 8645-8648.

97. Y. Watanabe, Y. Komoda, K. Ebisuya, S. Ozaki An efficient phosphorylation method using a new phosphitylating agent, 2-diethylamino-l,3,2-benzodioxaphosphepane.// Tetrahedron Lett., 1990, v. 31, № 2, p. 255-256.

98. B.A. Klyashchitskii, V.I. Shvets, N.A. Preobrazhenskii On the nomenclature of asymmetrically substituted myoinositol derivatives with particular reference to phosphatidylinositols.//Chem.Phys.Lipids, 1969, v. 3, p. 393-400.

99. IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature (CBN) // Eur.J.Biochem., 1967, v. 2, p. 127.

100. V.I. Shvets, B.A. Klyashchitskii, A.E. Stepanov, R.P. Evstigneeva Resolution of asymmetrically substituted myoinositols into optical antipodes.// Tetrahedron, 1973, v. 29, p. 331-340.

101. E.M. Орехова, И.Н. Грачева, Б.А. Клящицкий, A.E. Степанов, В.И. Швец Синтез и некоторые свойства функционализированных производных адипинового диальдегида из тетразамещенных лшо-инозитов.// ЖОХ, 1993, т. 29, № 11, с. 1754-1757.

102. Н. Mitsuya, S. Broder Strategies for antiviral therapy in AIDS.// Nature, 1987, v. 325, p. 773-778.

103. C. McGuigan, R.N. Pathirana, N. Mahmood, K.G. Devine, A.J. Hay Aryl phosphate derivatives of AZT retain activity against HIV1 in cell lines which are resistant to the action of AZT.// Antivir. Res., 1992, v. 17, № 4, p. 311-321.

104. M.J. Berrige Inositol triphosphate and diacylglycerol: two interacting second messendgers.// Ann.Rev.Biochem., 1987, v. 56, p. 159-193.

105. A.E. Степанов, В.И. Швец Синтез инозитсодержащих гликофосфолипидов.// Биоорган.химия, 1998, т. 24, с. 731-746.

106. P. Buchwald, N. Bodor Physicochemical aspects of the enzymatic hydrolysis of carboxylic esters.// Pharmazie, 2002, v. 57, № 2, p. 87-93.

107. N.M. Mahfouz, M.A. Hassan Synthesis, chemical and enzymatic hydrolysis, and bioavailability evaluation in rabbits of metronidazole amino acid ester prodrugs with enhanced water solubility.// J. Pharm. Pharmacol., 2001, v. 53, № 6, p. 841-848.

108. G.A. Bouzide, G. Sauve, J. Yelle Sevigny 1,2,5,6-tetra-O-benzyl-D-mannitol derivatives as novel HTV protease inhibitors. // Bioorg.Med.Chem.Lett., 2003, v. 13, № 20, p. 36013605.

109. Ю.Э. Андия-Правдивый, C.B. Буреева, А.П. Каплун, В.И. Швец Синтез и антигемолитическая активность дисульфатов бис-фенолов и ряда дикарбоновых кислот.// Хим.-фарм.жур., 2004, т. 38, № 3, с. 9-12.

110. J. Gigg, R. Gigg, S. Payne, R. Conant (±) 1,2:4,5-Di-O-isopropylidene-myo-inositol. // Garbhydr. Res., 1985, v. 142, № 1, p. 132-134.

111. Yu. Berezovskaya, M. Chudinov, Yu. Kirilova, N. Shastina, V. Shvets, A. Yurkevich Design of the new molecular transport systems for the nucleosides pharmacophores carrying. //Nucleosides nucleotides, 1998, v. 17, p. 2127-2133.

112. Beilstein. Berlin, 1944, v. 10, 696.1. БЛАГОДАРНОСТИ