Синтез и исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов

Баранова, Елена Олеговна

Синтез и исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Баранова, Елена Олеговна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов"

005001935

На правах рукописи

БАРАНОВА ЕЛЕНА ОЛЕГОВНА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ДИМЕРНЫХ АНАЛОГОВ ИНОЗИТСОДЕРЖАЩИХ ФОСФОЛИПИДОВ

02.00.10 -Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 КОЯ 2011

МОСКВА-2011

005001935

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Шастина Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Безуглов Владимир Виленович

кандидат химических наук, доцент Братина Наталья Александровна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства РФ

Защита диссертации состоится « » {[Л 2011 г. в /3 ч 00 мин на

заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при 'Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86). С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru

Автореферат разослан « ^ » И-Р^ЦлХ- 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник /(уи^уГ*^*.----А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, одобрены 27 противовирусных препаратов, некоторые из них могут также использоваться для лечения инфекций таких вирусов, как вирусы гепатита В, гриппа, простого герпеса, цитомегаловирус. Применение антиретровирусной терапии привело к значительным успехам в улучшении и продлении жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, необходимость непрерывного применения терапевтических препаратов и связанные с этим токсичность и возникновение резистентности требует разработки новых агентов с новыми механизмами действия. Большинство из применяемых анти-ВИЧ-агептов нацелены на вирусные ферменты: обратную транскриптазу и протеазу, однако они не способны предотвращать проникновение вируса в клетку, что повышает внимание к первым стадиям жизненного цикла ВИЧ, процессам адсорбции и слияния мембран.

Одним из дополнительных преимуществ ингибиторов проникновения является возможность их совместного использования с другими агентами. Важно, что многие ингибиторы проникновения вируса в клетку замедляют общую скорость внедрения ВИЧ, что делает вирус более чувствительным к другим ингибиторам.

Препараты, способные блокировать проникнойение ВИЧ в клетку, известные под общим названием "ингибиторы внедрения", представляют собой группу агентов с различными механизмами действия, что отражает многоступенчатый процесс проникновения ВИЧ в клетку-мишень: присоединение к поверхности клетки-хозяина и связывания с С04-рецептором, взаимодействие с ко-рецепторами и слияние мембран. Таким образом, возможна разработка препаратов, нацеленных на различные функциональные компоненты: два вирусных гликопротеина, §р120 и яр41, соответствующий клеточный рецептор СБ4 и ко-рецепторы ССЯ5 и СХСИ4. Вмешательство в функционирование любого из этих компонентов будет препятствовать проникновению ВИЧ в клетку и эффективно блокировать репликацию и распространение вируса. На сегодняшний день для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов из данной группы ингибиторов были одобрены только препараты, которые блокируют связывание с ССК5 (Маравирок) и слияние мембран (Энфувиртид), хотя разрабатываются ингибиторы других мишеней проникновения вируса в клетку.

Список используемых сокращений: ВИЧ ~ вирус иммунодефицита человека, ВПГ - вирус простого герпеса, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ТСХ - тонкослойная хроматография, 'ГЦИД - тканевая цитопагшческая инфекционная доза, ЦМВ - цитомегаловирус, ЦПД - цтопатическое действие, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, Ас - ацетил, 'Ви - тре/я-бутил, Bz - бензоил, Bzl - бензил, CCR5 - хемокиновый рецептор макрофаготропных штаммов ВИЧ, CD4 -клеточный рецептор, CXCR4 - хемокиновый рецептор Т-тропных штаммов ВИЧ, DMF -диметилформамид, Et - этил, gp - гликопротеин, 1ш - имидазол, тСРВА - jw-хлорнадбензойная кислота, Me - метил, МТ-4 - Т-лимфоидные клетки человека, Piv - пивалоил, pTSA - п-толуолсульфокислота, Ру - пиридин, TEA - триэтиламин, TFA - трифторуксусная кислота, VBS -вероналовый буферный раствор.

Ранее было показано, что репликация ВИЧ in vitro ингибируется полианионами, как полимерной природы, так и низкомолекулярными, которые способны вмешиваться во взаимодействие вирусного gpl20 и клеточного рецептора. Однако полимерные агенты обладают таким недостатком, как низкая биодостуиностъ, связанная с большим молекулярным весом и высокими отрицательными зарядами, легкость деградации in vivo, антикоагулянтные свойства. Поэтому актуален поиск низкомолекулярных полианионных агентов, содержащих в структуре гидрофобные фрагменты, что позволит таким соединениям лучше проникать через биологические барьеры и при этом проявлять высокую противовирусную активность.

Инозитсодержащие фосфолипиды являются биологически активными соединениями, широко распространенными в природе. Их участие в метаболических процессах, проявление антигенных свойств и ключевая роль в фосфоинозитидном цикле обуславливают внимание к подобным фосфолипидам и их аналогам как основе для создания фармакологически активных веществ. Возможность селективного введения функциональных групп в кольцо мио-инозита делает эти фосфолипиды перспективными соединениями для поиска веществ с противовирусной активностью.

Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009-2011 гг.» (проект № 2.1.1/2715), а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 14.740.11.0120).

Цель работы заключалась в разработке путей синтеза новых димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов как потенциальных ингибиторов вирусной адсорбции и исследовании их свойств. Были поставлены следующие задачи:

- Синтез ключевых синтонов для получения димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов.

- Разработка методов и осуществление синтеза фосфорсодержащих димерных производных мио-инозита, получение на их основе полианионпых фосфолипидов.

- Исследование противовирусных свойств полученных соединений и их влияния на компоненты крови. Получение липосом на основе незамещенных димерных полиолов.

Научная новизна. Разработана стратегия и метод синтеза димерных инозитсодержащих фосфолипидов с применением Н-фосфонатного подхода. Осуществлен синтез новых димерных производных лшо-инозита с различным количеством и региорасположением отрицательно заряженных групп (фосфатных, сульфатных, карбоксиметильных) направленным введением анионных заместителей путем селективного блокирования-деблокирования гидроксильиых групп циклитных колец лшо-инозита. Впервые получен аналог инозитсодержащих фосфолипидов, модифицированный по фосфорному центру остатком аминокислоты.

В ходе работы получено 27 новых соединений. Структуру полученных димерных фосфолипидов доказывали с помощью физико-химических, хроматографических и спектральных методов.

Практическая ценность. Разработан наиболее эффективный путь создания фосфодиэфирной связи в ряду димерных инозитсодержащих фосфолипидов с использованием Н-фосфонатного подхода - с первоначальным получением фосфорсодержащих тетраэфирных производных альдитов и последующей их конденсации с пентазамещенными соединениями лшо-ипозита.

Исследование противовирусных свойств полианионных димерных фосфолипидов выявило соединения, обладающие высокой ингибирующей активностью. Дальнейшее изучение их медико-биологических свойств позволит разработать препараты с высокой эффективностью терапевтического действия и пониженным побочным влиянием на организм.

Проведена оценка влияния димерных инозитсодержащих фосфолипидов и их предшественников на систему комплемента и их действия на эритроциты. Последующее изучение свойств данных фосфолипидов открывает перспективные направления синтеза новых соединений, обладающих иммуномодулирующими эффектами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Синтез исходных соединений для конструирования новых димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции. Синтез Н-фосфонатов асимметрично замещенных производных мио-инозита и тетразамещенных эфиров идита.

2) Разработка методов синтеза димерных инозитсодержащих фосфолипидов. Сравнение двух стратегий синтеза димерных производных лшо-ииозита с использованием Н-фосфонатного метода образования фосфодиэфирной связи.

3) Получение димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов с отрицательно заряженными группами: незамещенных полиолов, их сульфатных, фосфатных и карбоксимстильных производных. Синтез димерного аналога инозитсодержащих фосфолипидов, модифицированного по фосфорному центру остатком аминокислоты.

4) Исследование противовирусной активности полученных соединений, определение их влияния на активность системы комплемента, изучение действия данных соединений на эритроциты, получение липосом на основе незамещенных димерных полиолов.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 6 тезисов. Результаты диссертации были представлены на следующих международных научных конференциях:

• IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и

перспективы развития», 2007 г.

• V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2009 г.

• Московская международная иаучно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов», 2010 г.

* XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2010», 2010 г.

* VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011 г.

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на {0Ь страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего источника. Диссертация иллюстрирована ,ЬЦ рисунками и содержит схем и таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из стадий жизненного цикла вирусов, которая представляет интерес в качестве цели для терапевтического вмешательства, является процесс проникновения в клетку. Полианионные соединения, способные блокировать функциональные компоненты клеток и гликопротеины вирусного капсида и препятствовать проникновению в клетку вирусного генома, могут рассматриваться как потенциальные кандидаты для поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции. Наряду с такими достоинствами, как низкая цитотоксичность, малая степень возникновения резистентных штаммов, широкий спектр противовирусной активности, который включает такие вирусы, как ВИЧ, ВПГ, ЦМВ, вирус гриппа А и другие, полианионы обладают существенным недостатком — низкой биодоступностыо, обусловленной их полярностью. Преодолеть этот недостаток можно введением в состав анионных соединений гидрофобных группировок, увеличивающих сродство к биологическим мембранам и тем самым улучшающих транспортные свойства и повышающих противовирусную активность.

Изучение соотношения структура-активность анионных агентов показало, что свойства полианионов обуславливаются не только типом заряженных групп и плотностью зарядов, но и строением других составных частей молекулы. Так, низкомолекулярные соединения, имеющие в своем составе гидрофобные фрагменты и жесткие связи, обладают большей противовирусной активностью и повышенной биодоступностью.

Так как фосфодиэфиры являются одними из наиболее распространенных в природе анионных соединений, в качестве возможных ингибиторов вирусной адсорбции нами были предложены димерные аналоги инозитсодержащих фосфолипидов, состоящие из двух колец лшо-инозита, соединенных между собой замещенным альдитным спейсером через фосфодиэфирную связь. Наличие

Х - гидроксипьные или анионные группы (СНгСООН, БО^Н, Р03Н2) Спейсер - тетраалкильный или тетраарильиый эфир альдита Рисунок 1. Димерные аналоги инозитсодержащих фосфолипидов.

гидрофобного спейссрного фрагмента может способствовать увеличению сродства к биологическим мембранам.

В данной работе исследовались подходы к получению полианионных производных димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов для поиска эффективных ингибиторов проникновения вирусов в клетку (рис. 1). Такая структура молекулы позволяет варьировать количество, расположение и тип отрицательно заряженных групп в кольце мио-инозита. Изменение гидрофобности молекулы может осуществляться посредством использования различных заместителей альдитного спейсера (алкильных, арильных и др.). Возможны также модификации по фосфорным центрам, например, получение амидофосфатов модифицированных фосфолипидов с различными аминокислотами, что позволит вводить дополнительные анионные группы.

1. Синтез ключевых синтонов для получения димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов

1.1. Синтез частично замещенных производных .лшо-инозита и идита

Для конструирования димерных аналогов фосфолипидов используются производные лшо-инозита, которые позволяют направленно вводить функциональные группы в циклитное кольцо. Поэтому первоначальный этап работы состоял в синтезе исходных пентазамещеиных соединений мио-инозита 1 и 2, содержащих селективно удаляемые защитные группы. В качестве спейсерных матриц были получены производные идита 3 и 4 с алкильными и арильными заместителями, которые устойчивы в ходе всего синтеза и будут способствовать увеличению гидрофобности синтезируемых димерных соединений (рис. 2).

Бензоилпропионилыюе производное лшо-инозита 1 было синтезировано по модифицированному методу Гнгга (Gigg et. al., 1985). Взаимодействие мио-инозита с 2,2-диметоксипропаном приводило к образованию смеси изомерных дикеталей. Для быстрого выделения 1(3),2;4(6),5-дикеталя из реакционной массы эта смесь подвергалась бензоилированию, дибензоильное производное этого соединения как наименее растворимое выпадало в осадок и отделялось фильтрованием. Удалением сложноэфирных защитных групп из данного дибензоата получали целевой дикеталь, взаимодействием которого с (З-бензоилпроионовой кислотой при конденсирующем действии дициклогексилкарбодиимида с последующим хроматографическим разделением смеси на силикагеле получали пентазамещенное производное 1.

Синтез соединения 2 осуществляли исходя из лшо-инозита первоначальным взаимодействием с триметилортоформиатом в присутствии безводной «-то лу о л су л ь ф о к и с лоты {Praven et. al., 2001). Промежуточный продукт без выделения подвергали реакции ацилирования с использованием бензоилхлорида, в результате чего получали целевое пентазамещенное производное лшо-инозита 2.

Тетрабензильный эфир идита 3 получали из 1(3),2-0-изопропилиден-да-л(ио-инозита в четыре стадии по описанному ранее методу (Орехова и др., 1993). Алкилирование изопропилиденового кеталя приводило к получению полностью замещенного производного лшо-инозита, которое без выделения подвергали кислотному гидролизу с получением тетрабензильного эфира, последующим периодатным окислением и восстановлением которого был получен 2,3,4,5-тетра-О-бензил-О.Ь-идит 3.

Для синтеза тетрагексильного производного идита 4 на первой стадии проводили алкилирование монокеталя лшо-инозита 5 гексилбромидом в присутствии гидрида натрия (схема 1). Полученное полностью замещенное соединение 6 без выделения в индивидуальном состоянии вводили в реакцию кислотного гидролиза с помощью

Н(

1(3)

С6Н13Вг

NaH

DMF

1(3)

6% HCI (МеОН)

81.1%

с6н13<

ОН он

он

ОС6Н,з

СбН|3 ОС6Н13

С6Н,з ОС6Н,з

Схема 1. Синтез тетрагексильного производного идита.

6%-ного раствора HCl в метаноле в течение 6 ч. Выделение с помощью флэш-хроматографии на силикагеле приводило к 81.1% выходу соединения 7.

Далее тетрагексильный эфир мио-инозита 7 окисляли периодатом натрия в течение суток, после обработки реакционной смеси осуществляли восстановление синтезированного гександиаля 8 действием боргидрида натрия. Очистка реакционной смеси флэш-хроматографией дала 95.1% выход целевого производного идита 4. Структуры соединений 7, 8 и 4 подтверждались с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, с высокими выходами осуществлен синтез исходных частично замещенных соединений мио-инозита и идита.

1.2. Синтез Н-фосфонатных производных замещенных .мио-инозита и идита

Создание фосфодюфирных связей в ряду природных и модифицированных липидов может осуществляться с использованием соединений пятивалентного и трехвалентного фосфора. Хотя производные трехвалентного фосфора часто используются в синтезе соединений данного класса, высокая реакционная способность промежуточных производных приводит к их спонтанному окислению даже кислородом воздуха и гидролизу при хранении. В противоположность этому соединения пятивалентного фосфора стабильны при хранении и с ними удобно работать, однако к их недостаткам относят недостаточную эффективность в синтетических превращениях, так как они реагируют значительно медленнее, чем соединения трехвалентного фосфора, даже при активации конденсирующими агентами. Н-фосфонатные соединения, являющиеся четырехкоординационными формами соединений трехвалентного фосфора, сочетают в себе преимущества обоих классов фосфорилирующих соединений - устойчивость к спонтанному окислению и высокую реакционную способность, что делает их перспективными соединениями для фосфорилирования пространственно затрудненных вторичных гидроксильных групп лшо-инозита. Другими достоинствами Н-фосфонатного подхода являются доступность реагентов и простота экспериментального осуществления, возможность проведения реакций без выделения и очистки интермедиатов.

Синтез Н-фосфоната 9 (схема 2) осуществлялся воздействием на исходное частично замещенное производное лшо-инозита 2 трис(имидазолил)фосфина, полученного in situ из трихлорида фосфора с имидазолом, с последующим гидролизом промежуточного бис(имидазолил)фосфина до соединения 9, выделенного с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с 84.4% выходом.

В аналогичных условиях действие фосфорилирующего агента трис(имидазолил) фосфина на соединение 4 с последующим гидролизом промежуточного продукта позволило получить водородфосфонат 10 с 72.3% выходом.

Структура соединений 9 и 10 была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии: в спектре появился дублет Н-фосфонатных протонов с характерной константой спин-спинового взаимодействия, наличие Н-фосфонатной связи в соединениях подтверждалось также данными 31Р-ЯМР-спектроскопии (рис. 3).

РС1зЛт

ТЕА, н20

844%

К—Р=0 OBz I

ОН ■ NE(,

С6Н,30 ОС6Н13 pciyim Н С6Н130 ОС6Н13

С6Н130 ОС6Н,3 С6Н130 ОС6Н13 о

4 10

Схема 2. Синтез Н-фоефонатмоноэфирных производных.

Рисунок 3.31Р-ЯМР-спектры Н-фосфонатов: а) замещенного лто-инозита 9; б) тетразамещенного производного идита 10.

Синтез ди-Н-фосфоната гетрабензильного эфира идита 11 осуществлялся согласно описанному ранее методу на основе замещенного диола 3 (Тучная и др., 2006).

Таким образом, были получены ключевые синтоны для последующего синтеза димерных инозитсодержащих фосфолигшдов.

2. Синтез фосфо- и Н-фосфонатдиэфирных димерных производных лто-инозита

Следующий этап работы заключался в разработке эффективных подходов к образованию фосфодиэфирной связи в димерных аналогах инозитсодержащих фосфолипидов.

Синтез димерного фосфолипида III может осуществляться двумя путями - с первоначальным получением фосфорсодержащего производного хио-инозита I и последующей его конденсацией с тетразамещенным идитом II или введением функциональной фосфорной группировки в альдитный спейсерный фрагмент и дальнейшим взаимодействием образовавшегося продукта V с пентазамещенным соединением лмо-инозита IV (схема 3).

( инозит!—0-® + НО—f Спейсер!—ОН + ©-Он инозит) —^ I II I —'

е м ©

о о

инозит |—О—Р—О—[ Спейсер ]—О—Р—О—( инозит |

О О

III

I инозитj—ОН + (Р>—О—[спейсер)—О—(Р) + НО—(инозит)

V^7 ,v v

Схема 3. Две стратегии синтеза димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов.

Для синтеза фосфодиэфирного производного мио-инозита 12 по первому пути Н-фосфонат 9 конденсировали с производным идита 3 в пиридине при активирующем действии пивалоилхлорида, промежуточный бис-Н-фосфонатдиэфир без выделения окисляли 0.2 М раствором йода в смеси пиридин - вода до бисфосфодиэфирного производного 12 (схема 4). В качестве активирующего агента для синтеза фосфодиэфиров использовался пивалоилхлорид, применение которого позволяет достичь высокой скорости протекания реакции (10-15 мин) при образовании незначительного количества побочных продуктов. После выделения с помощью колоночной хроматографии на силикагеле выход защищенного димерного аналога инозитсодержащего фосфолипида 12 составил 21.0%. Структура полученного димсра 12 была доказана 'Н-ЯМР-спектроскопией: в спектре появились сигналы протонов идитного спейсера с бензильными группами, исчез сигнал протона РН-связи в 4(6)-положении кольца лшо-инозита. Образование фосфодиэфирных связей также подверждалось данными 31Р-ЯМР-спектроскопии: в спектре присутствовали сигналы в области -4.77 м.д и -4.95 м.д.

При использовании второго пути для синтеза фосфодиэфира 12 проводили взаимодействие пентазамещенного производного мио-тюзта 2 с ди-Н-фосфонатом идита 11 в аналогичных условиях при активирующем действии пивалоилхлорида. Очистка реакционной смеси с помощью колоночной хроматографии позволила выделить соединение 12 с выходом 71.8%.

Сравнение двух вариантов получения инозитсодержащего фосфолипида 12 показало, что использование второго пути дает более высокий выход целевого продукта и приводит к более полной конверсии ключевых фосфорсодержащих соединений, для получения которых требуется осуществление большего количества синтетических стадий.

ОВг

ВгЮ ОВг!

1(3) +

НО.

он

0=р-н ОВг

ОН - £

ВгЮ ОВг1

ВгЮ ОВг!

НО

ОЯ

ВгЮ ОВг| О

11 = —р-ОН-МВ3 _н_

1. Р!уС1, Ру

2. ¡2, Ру/Н20 71.8%

1. Р1уС1, Ру

2. ¡2, Ру/Н20

21.0%

й30 Ой2

\-1

/ ОЯ" У 1(3)

оя5

яэо он2

/—I ОР1

/ Ой4 >1(3)

оя5

ВгЮ ОВг1

НО-Р-О

«Л ОС

О г-- С^ гсГ г}1

Ч—_______ ___________

a) рТЭА

b) 0.1МНС1 (МеОН), 1°

Ю-Р-ОН ВгЮ ОВг! О

-12 й1,й3, Я" = Я2 = Я5 = Вг

a) 0.2н МеОМа

b) NHз, МеОН, 1°

31Р-ЯМР-спектр димерного инозитсодержащего фосфолипвда 12

13 в1 = н3 = в4 = н Я2 = [?5 = Вг

14 И1, И3, П4 = -^СН Я2 = Я5 = Н

Схема 4. Получение частично замещенных димерных фосфолипидов.

Селективное удаление ортоэфирной защиты димера 12 проходило в смеси растворителей хлористый метилен - метанол (1:1) при каталитическом действии я-толуолсульфокислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 80 ч, гидроксилсодержащее соединение 13 было выделено с помощью адсорбционной хроматографии на силикагеле с выходом 50.2%. В 'Н-ЯМР-спектре полученного соединения 13 исчезли сигналы протонов ортоэфирных групп. Для увеличения конверсии исходного димера в целевой продукт 13 и уменьшения времени протекания реакции производное 13 было получено кипячением полностью замещенного димерного соединения 12 в 0.1 М растворе НС1 в метаноле в течение 2 ч, его физико-химические характеристики соответствовали полученному ранее образцу. По данным ТСХ-анализа конверсия исходного соединения 12 в данных условиях составила около

80%, продукт 13 возможно ввести в дальнейшую реакцию удаления бензоильных групп без выделения в индивидуальном состоянии.

Удаление бензоильных групп димера 12 проводили двумя способами. При использовании первого метода реакцию проводили действием 0.2 М метилата натрия в смеси абсолютного диэтилового эфира и абсолютного метанола (1:1), после очистки колоночной хроматографией на силикагеле соединение 14 выделяли с 69.4% выходом. При деацилировании соединения 12 кипячением в смеси 25% водный аммиак -метанол (1:1) в течение 4 ч выход соединения 14 составил 54.3%. Таким образом, при использовании метилата натрия достигается большая селективность реакции относительно целевого продукта, однако недостатком данного метода является необходимость точного соблюдения безводных условий в ходе реакции. В 'Н-ЯМР-епектре вещества 14 исчезли сигналы протонов четырёх бензоильных групп в кольцах мио-инозита.

Аналогичным образом, согласно предпочтительной стратегии для получения димерного соединения 15 проводили конденсацию Н-фосфоната 10 и пентазамещенного производного мио-инозита 1 при активирующем действии пивалоилхлорида с последующим окислением промежуточного Н-фосфонатдиэфира (схема 5), реакционную смесь обрабатывали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле, в результате чего выделяли целевое соединение 15 с выходом 76.8%. Структура соединения 15 была подтверждена спектральными характеристиками: в 'Н-ЯМР-спектре наблюдалось необходимое соотношение сигналов протонов, наличие фосфодиэфирной группы было подтверждено данными 31Р-ЯМР-спектроскопии - в спектре присутствовал сигнал в области -0.95 м.д. (рис. 4а).

Удаление бензоилпропионилыюго остатка в фосфолипидном аналоге 15 проводили гидразинолизом. Для связывания избытка гидразингидрата реакционную смесь обрабатывали 2,4-пентандионом, после чего продукт 16 выделяли с помощью хроматографии на силикагеле с 94.4% выходом. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии удовлетворительно подтверждали структуру соединения: в спектре исчезли сигналы протонов бензоилпропионильной группы.

Для последующей функционализации по фосфорному центру нами был получен димерный Н-фосфонат 17. Для этого проводили взаимодействие дифосфоната идита 11 и гидроксилсодержащего производного лшо-инозита 1 при действии пивалоилхлорида в течение 15 мин, после чего реакционную смесь обрабатывали и очищали с помощью колоночной хроматографии, получая целевой димерный продукт 17 с выходом 59.9%. Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии подтвердили ожидаемую структуру соединения: в спектре присутствовали сигналы протонов лшо-инозита и его защитных групп, сигналы протонов идитного остова с гексильными группами, а также сигналы двух протонов при атомах фосфора с характерной константой спин-спинового взаимодействия (6.90 м.д., 735 Гц). В 3,Р-ЯМР-спектре присутствовали сигналы, соответствующие диастереомерным формам двух атомов фосфора 9.72 и 9.91 и 11.36 и 11.71 м.д. (рис. 46).

Димерпый фосфодиэфир 20 был получен из пентазамещенного производного мио-инозита 1 и ди-Н-фосфоната идита 11 по описанной ранее методике (Тучная и др., 2006).

" 17 П = СОСН2СНгСОС6Н5

Схема 5. Синтез димерных аналогов инозитсодержащих фосфолинидов.

б)

18 1Е 14 12

Рисунок 4.3|Р-ЯМР-спектры: а) димерного инозитсодержащего фосфолипида 15; б) димерного Н-фосфонатдиэфирного производного лшо-инозита 17,

Таким образом, было показано преимущество применения Н-фосфонатного метода образования фосфодиэфирных связей, который в ряду аналогов инозитсодержащих фосфолипидов позволяет осуществить синтез фосфодиэфирных и Н-фосфонатдиэфирных димерных соединений с высокой эффективностью. Данные структуры служили основой для дальнейшего введения дополнительных анионных группировок.

3. Синтез различных анионных производных димерных инозитсодержащих фосфолипидов

Различно замещенные производные л«ю-инозита дают возможность получения ряда соединений, отличающихся но региорасположеншо анионных групп, что может влиять на проявление ингибиторных свойств в процессе вирусной адсорбции.

3.1. Синтез незамещенных димерных полиолов

Димерный полиол 18 может быть получен удалением бензоильных групп фосфолипида 13 или деблокированием инозитсодержащего димера 14 (схема 6). Деацилирование аналога 13 осуществляли кипячением в смеси 25% водный аммиак -метанол (1:1), последующая очистка целевого димера 18 с помощью колоночной хроматографии привела к 58.4% выходу. Удаление ортоэфирных групп частично замещенного соединения 14 раствором трифторуксусная кислота - вода (4:1) и

к_о-Р-О.

он В210 ОВг1

он

о-р-о-я

ВгЮ 0Вг1 О 13,14,

НО ОВг

)-"I ОН ^е0Н /-

но он / \?н т?ш2о

ОВг

1(3)

51.0%

14 И:

ОН

ио С6Н130 ОС6Н13

но—р—о

с6н13о ос6н13 о

16, 19

оя "О-Р-ОН

Оомех Н+

16 Я =

19 Й =

ОН ОН

ОН

Схема 6. Синтез незамещенных димерных полиолов. 15

последующее разделение реакционной смеси с помощью колоночной хроматографии позволили получить целевой продукт 18 с выходом 51.0%.

Кислотный гидролиз частично замещенного производного лшо-инозита 16 с использованием ионообменной смолы Dowex Н+ привел к образованию полигидроксильного димерного фосфолипида 19, который был выделен с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с 73.3% выходом.

Структуры полученных полиолов 18 и 19 подтверждали данными масе-спектрометрии.

3.2. Синтез карбоксиметильных производных

Для введения карбоксиметильных группировок в положение 1(3) инозитных колец димера 20 нами использовалась реакция алкилировапия с помощью трет-бутилбромацетата (схема 7), что позволяет избежать побочной реакции переэтерификации. Наибольшая конверсия исходного спирта 20 в целевой продукт 21а была достигаута при использовании 20 экв алкилирующего агента. Возможно, для повышения эффективности конверсии исходного вещества необходимо использовать больший избыток гидрида натрия и меньшие объемы растворителей. После обработки и очистки реакционной смеси с помощью колоночной хроматографии на силикагеле был выделен целевой полностью замещенный димер 21а с выходом 28.5% и продукт монозамещения 21Ь с выходом 49.9%.

Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии подтвердили ожидаемые структуры соединений 21а и 21Ь: в спектре наблюдались сигналы протонов всех структурных фрагментов.

Удаление защитных групп димеров 21а и 21Ь проводили кипячением в 50%-ной уксусной кислоте в течение 3 ч. Соединения 22а и 22Ь были выделены с помощью ВЭЖХ с выходами 48.8% и 45.6% соответственно (рис. 5). Структуры соединений 22а и 22Ь подтверждали данными масс-спектрометрии.

BrCH2C02'Bu NaH 28.5% (21а) 49.9% (21Ь)

20 R1 = R2 = H

22а R1 = R2 = СН2СООН

22b R1*2' = СН2СООН, RW = H

21а r1,r5 = ch2c02'bu

21b r1(2> = ch2c02'bu, r«1) = h

Схема 7. Получение карбоксиметильных соединений.

a) mV 70 - | б) 70 -

60 - Н 60

50 - 50-

40 - о m 40 - л

30 - Ii" 30 - 7 £

20 • 10 - U 1 20 -10 - Д Г| is! ГМ 01 - --

—1 i f г 1 | г"» т 1 у 1 г 1—1—i—1—г г"

12 16 20 24 28 32 36 мин

12 16 20

28 32 36 мин

Рисунок 5. Хроматограмма разделения реакционной смеси синтеза: а) соединения 22а (т 17.10 мин) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации метанола в 0.1 М ацетате аммония от 25% до 95% за 35 мин; б) соединения 22Ь (т 14.29 мин) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации метанола в 0.1 М ацетате аммония от 50% до 90% за 35 мин.

3.3. Синтез сульфосодержащих димерных фосфолипидов

Для получения сульфатных производных на базе синтезированных ранее структур 13, 14 и 16 применялся метод сульфатирования, заключающийся в использовании комплекса серной кислоты с уксусным ангидридом в пиридине (схема 8). Использование данного подхода весьма эффективно для получения сульфопроизводных различных полиолов, в том числе имеющих вторичные гидроксильные группы, поскольку в ходе синтеза не затрагиваются функциональные связи и защитные группы исходных спиртов.

Обработка димерных полиолов 13 и 14 комплексом серная кислота - уксусный ангидрид в пиридине при нагревании привела к образованию сульфатов 23, 25. После очистки с помощью колоночной хроматографии выходы соединений составили 78.8% и 53.9% соответственно. Проведение ВЭЖХ-анализа продемонстрировало индивидуальность синтезированных сульфосодержащих димеров. Реакцию удаления

б)

70О 600 500400 300200 100

л О) j ii

10 12 14 16 18 20 22 24 кик

10 12 14 16 18 20 22 24 i

Рисунок 6. Хроматографический анализ: а) соединения 24 (т 12.70 мин); б) соединения 26 (т 15.51 мин). Обращенно-фазовая ВЭЖХ в градиенте концентрации метанола в 0.1 М растворе ацетата аммония от 5% до 95% за 25 мин.

Й-О-Р-О.

ОН ВгЮ ОВг1

ОН О-Р-О-Я

ВгЮ ОВг! О 13,14,23-26

НО ОВг НО,80 ОВг Н03Б0 ОН

ЛЛ?Н Н250^у/Ао20 )—V?5'^ МНз^еОН ^-\оЗОэН

13 * лж_У,<3) 23 в ЪГу ™ 24*

ОВг ОВг ОН

ЦЗ)

/о 7НЗ) \| / 96.3%

1ЛЛ. N-У

Ооиех Н+ МеОН

ОН

ОЭОзН

НО Э03Н ОН

26 й = /он N 1(3)

>лллл> N /

0Э03Н

НО с6Н130 ОС6Н13

ОН

Я—О—Р—0^

II ^^ ^ О-Р-О-Я

С6Н130 ОС6Нп О 16,27,28

16 Я =

НгЭО^у/АсгО

1(3) --»- 27 Я =

73.9%

030,Н

' 3 50% АсОН

90.9%

28 Я =

Схема 8. Синтез сульфосодержащих димерных фосфолипидов.

бензоильных групп сульфата 23 проводили аммонолизом при 56°С в течение 5 ч, после разделения реакционной смеси с помощью ВЭЖХ в градиенте концентрации метанола в 0.1 М ацетате аммония 5-95% (рис. 6а), выход димера 24 составил 53.7%.

Для удаления ортоэфирных защит сульфопроизводного инозитсодержащего димера 25 использовали 0.1 М раствор соляной кислоты в метаноле. Продукт 26 выделяли с помощью ВЭЖХ в градиенте концентрации метанола в 0.1 М ацетате аммония 5-95% (рис. 66). В выбранных условиях реакции выход димера 26 составил 16.9%. При использовании для деблокирования смолы Бо\уех Н+ выход целевого соединения 26 достигал 95.3%.

Сульфатирование димерного производного 16 в аналогичных условиях привело к соединению 27, выделенному колоночной хроматографией с выходом 73.9%. Последующее удаление изопропилиденовых защитных групп фосфолипида 27 осуществляли кипячением в 50%-ной уксусной кислоте в течение 3 ч с получением целевого сульфопроизводного димерного фосфолипида 28 с выходом 90.9%.

Структуры соединений 23-28 подтверждались с помощью масс-спектрометрии.

3.4. Синтез фосфатов

Одной из проблем, встречающихся в синтезе инозитсодержащих фосфолипидов и фосфатов лшо-инозита, является фоефорилирование вторичных гидроксильных групп в циклитном кольце ввиду их низкой реакционной способности. Циклический амидофосфит ]\[,М-диэтиламино-5,6-бензо-1,3,2-диоксафосфепан хорошо зарекомендовал себя как эффективный фосфитилирующий агент, который успешно применяется в химии лжо-инозита для образования фосфомоно- и фосфодиэфирных связей.

Фосфитилирование димерного производного жмо-инозита 16 осуществляли действием избытка Ы,Ы-диэтиламино-5,6-бензо-1,3,2-диоксафосфепана при активирующем действии 1Я-тетразола (схема 9). Когда ТСХ-анализ показал наибольшую конверсию соединения 16 в соответствующий фосфиттриэфир, реакционную смесь при охлаждении до -78°С окисляли избытком л/-хлорнадбензойной кислоты тСРВА. Соединение 29 выделяли колоночной хроматографией на силикагеле, выход составил 48.6%.

Данные 'Н-ЯМР-спектра соединения 29 свидетельствовали о появлении сигналов протонов, соответствующих защитной ксилиленовой группе атома фосфора, данные 3,Р-ЯМР-спектроскопии подтвердили наличие в соединении 29 фосфодиэфирных и фосфотриэфирных группировок (рис. 7).

Удаление изопропилиденовых групп фосфолипида 29 осуществляли действием ионообменной смолы Оодуех Н+ в метаноле при нагревании в течение 3 ч, после

с6Н130 ОС6Н,э О 16 ^30

он

>1(3)

он он он

16 Я =

1М-тетразол ^ /

2. шСРВА, |\|\

-78°С,

1. Оо\пех Н+

2. Нг, Рй/с

92.8%

30 И =

48.6%

ОН

Схема 9. Получение фосфатного производного димерного инозитсодержащего

фосфолипида.

Рисунок 7. 31Р-ЯМР-спектр димерного фосфолипида 29.

обработки и концентрирования в вакууме без дополнительной очистки вводили в реакцию удаления ксидиленовой защитной группировки гидрогенолизом на палладиевом катализаторе в течение 3 ч, смесь очищали методом препаративной ТСХ, получая соединение 30 с выходом 92.8%. Данные масс-снектрометрии подтверждали структуру соединения 30.

3.5. Синтез конъюгата аминокислоты и димерного аналога инозитсодержащего фосфолипида

Введение в молекулу димерного производного мио-инозита остатков аминокислоты позволяет получить модифицированные по фосфорному центру полианионные соединения с дополнительными отрицательно заряженными группами.

Получение амидофосфатного соединения осуществляли взаимодействием ди-Н-фосфоната 17 с гидрохлоридом трет-бутилового эфира ¿-лейцина при 0°С в смеси растворителей триэтиламин - четыреххлористый углерод - вода - ацетонитрил (схема 10). Разделение реакционной смеси с использованием колоночной хроматографии на силикагеле привело к 76.1% выходу соединения 31. Доказательством строения явились данные !Н-ЯМР-спектроскопии: в спектре присутствовали сигналы протонов альдитного спейсера, двух колец л/мо-инозита с защитными группами и двух остатков лейцина с /и/;е/и-бутильной защитой. Данные 31Р-ЯМР-спектроскопии также подтвердили ожидаемую структуру.

9с(сн2>2сс6нб

о ВгЮ ОВг! 0 8г!0 ОВг! О

О ОН ОН

ОС(СН2)2СС6Н5 \-1 ОН

1.м2н4-н2о ((он 7'(3)

Ру/АсОН

2. 1ТА, МеОН 1°,31.7%

он

Н I Ш-Р-О.

ВгЮ ОВг!

ОН ОН

ГД он

/он >1(3)

он

? н

'О—Р—N.

ВгЮ ОВг1

г— 17 Я — Н 1.еиО*Ви ■ НС1Г

76.1% 1^31 В = МНСН(С001Ви)СН2СН(СН3)2

Схема 10. Синтез конъюгата инозитсодержащего фосфолипида с аминокислотой.

Последовательное удаление бензоилпропионильной защитной группы синтезированного конъюгата 31 и кислотный гидролиз с использованием 5%-ной трифторуксусной кислоты в метаноле привели к получению димерного инозитсодержащего фосфолипида 32, который был выделен флэш-хроматографией с выходом 31.7%, структура соединения была подтверждена данными масс-спектрометрии.

Таким образом, были синтезированы новые аналоги инозитсодержащих фосфолипидов для поиска эффективных ингибиторов процесса вирусной адсорбции. Дальнейшее изучение зависимости противовирусных свойств полученных соединений от характера, количества и расположения отрицательно заряженных групп может способствовать определению модификаций, перспективных для синтеза новых эффективных ингибиторов проникновения вируса в клетку.

4. Исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов

4.1. Изучение противовирусной активности1

В качестве источника вируса использовали штамм ВИЧ-1899А из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России. Исследования проводили на перевиваемых лимфобластоидных клетках человека МТ-4. Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.

Исследование противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток в пластиковой 24-луночной панели. К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0.01 ТЦИД5о/клетка, соединения вносили за 1 ч до заражения клеток. Культуры клеток инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СОз и 98% влажности в течение 5-7 дней. Исследование репродукции ВИЧ проводили с помощью оценки вирусиндуцированного цитоиатического действия в культурах клеток. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью 0.4% красителя Трипанового синего и световой микроскопии, а также окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя со спектрофотометрией.

Среди исследованных соединений наибольшей противовирусной активностью обладали димерный полиол 18 и сульфатированные димеры 23 и 24, синтезированные на основе тетраарилзамещенной идитной матрицы. Сочетание в структуре гидрофобных и гидрофильных фрагментов, необходимых для эффективного вмешательства в процесс вирусной адсорбции, может обусловливать высокую активность соединений 23 и 24, а увеличение полярности при удалении бензоильных

1 Данная работа выполнена сотрудниками ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России.

групп соединения 23 может быть причиной снижения активности димера 24. При максимальных исследованных концентрациях протестированных веществ 50 мкг/мл наблюдалась некоторая токсичность (7-14%). Для наиболее активных соединений 18, 23 и 24 токсичность составила 10.4%, 9.3% и 13.7% соответственно.

Таблица 1. Исследование противовирусной активности.

Соединение Концентрация ЦПД*, Зашита**, Соединение Концентрации ппд '{¡пцита,

мкг/мл + % мкг/мл •+ • %

14 50.0 3 16 16 50.0 3 15

25.0 3 31 25.0 3 19

10.0 3 25 10.0 3 23

5.0 4 11 5.0 3 30

1.0 4 7 1.0 4 21

0.5 4 2 0.5 4 5

18 50.0 0 80 20 50.0 3 31

25.0 0 98 25.0 4 18

10.0 0 54 10.0 4 13 .

5.0 2 35 5.0 4 13

1.0 3 27 1.0 4 11

0.5 3 24 0.5 4 11

22а 50.0 4 23 22Ь 50.0 4 1

25.0 4 20 25.0 4 5

10.0 4 18 10.0 4 7

5.0 4 17 5.0 4 12

1.0 4 10 1.0 4 14

0.5 4 5 0.5 4 12

23 50.0 0 85 24 50.0 0 81

25.0 0 99 25.0 0 81

10.0 4 12 10.0 3 26

5.0 4 15 5.0 3 23

1.0 4 15 1.0 4 20

0.5 4 12 0.5 4 18

25 50.0 3 17 26 50.0 3 8

25.0 4 19 25.0 4 24

10.0 4 18 10.0 4 20

5.0 4 18 5.0 4 20

1.0 4 20 1.0 4 19

0.5 4 6 0.5 4 18

* ++++ - 100%-ная гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение, +++

- 75%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, ++ - 50%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, + - 25%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, н— начало дегенерации,

- отсутствие цитодеструкции.

* * Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле:

А - число жизнеспособных клеток в опытной группе; % защиты = А "В . 100% В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса);

К - В К - то же в унифицированной культуре (контроль клеток).

4.2. Использование димерных инозитсодержащих фосфолипидов для приготовления липосомальных препаратов

Дальнейшим направлением исследований свойств синтезированных соединений в модельных системах может являться получение липосомальных форм на их основе. Преимуществом данного подхода является снижение токсичности данных веществ, солюбилизация ограниченно растворимых в воде соединений, широкие возможности по обеспечению их адресной доставки, что в свою очередь может приводить к снижению эффективной дозы фармакологически активного соединения.

На основе синтезированных соединений 18 и 19 были приготовлены смешанные липосомы в водной среде с различным соотношением фосфатидилхолин - димер (1:1, 3:1, 5:1, 7:1, 10:1; масс. соот.).

Липосомальные формы на основе производного мио-ииозита с арилзамещенным спейссром проявили устойчивость при всех исследуемых соотношениях, при этом размер частиц составлял 160-200 нм. Наносуспензии на основе соединения 19 были стабильны при содержании димера менее 20%, размер частиц составил 80-110 нм. Возможно, это обуславливается пространственной структурой молекулы соединения 19. Компьютерные расчеты с использованием программы Avogadro, находящейся в открытом доступе, показали, что оба димерных полиола принимают форму шпильки, однако для соединения 18 характерно более компактное расположение молекулы в пространстве, чем для соединения 19, что вероятно может объяснять его лучшее встраивание в липосомальные мембраны.

4.3. Влияние на компоненты крови2

Для фармакологически активных веществ, разрабатываемых для использования в терапии инфекционных патологий, помимо определения их противовирусной активности должны быть проведены исследования их токсических свойств. Так как многие полианионные соединения обнаруживают гемолитическую активность, было изучено воздействие некоторых фосфорсодержащих соединений на компоненты крови.

4.3.1. Исследование влияния соединений 10, 11 и 18 на систему комплемента

Исследование влияния фосфорсодержащих соединений 10, 11 и 18 на систему комплемента проводили in vitro в гемолитической системе, содержащей бараньи эритроциты, кроличью гемолитическую сыворотку (титр 1:3000), вероиаловый буфер VBS2+ (рН 7.4), комплемент морской свинки и раствор исследуемого вещества в различных концентрациях. При этом было показано, что дифосфонат тетрабензилидита 11 и димер 18 не влияли на активность системы комплемента, в то время как дифосфонат тетрагексилидита 10 приводил к усилению гемолиза эритроцитов. Изучение механизма действия соединения 10 показало, что усиление гемолиза связано с прямым литическим действием данного соединения на эритроциты,

2 Работа выполнена совместно с к.х.н. Шойбоновым Б.Б., Научно-исследовательский институт патологии и патофизиологии РАМН.

причем 50%-ный лизис наблюдался при концентрации дифосфоната равной 39.1мкг/мл.

4.3.2. Реакция гемагглютинации

Классическая реакция прямой гемагглютинации представляет собой образование агглютинатов эритроцитов в присутствии антител к эритроцитам. В практике чаще используют непрямую реакцию гемагглютинации, т.е. предварительно с эритроцитами барана связывают различные антигены, а затем выявляют наличие специфических антител в биологических жидкостях.

Учитывая природу тестируемых соединений, были проведены исследования по определению их гемагглютинирующей способности с использованием эритроцитов барана (Ебар), фиксированных формальдегидом, а также Ебар, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека (ЕбарАчел). Результаты исследования гемагглютинирующей активности соединений 10, 11 и 18 показали, что дифосфонаты идита 10 и 11 способны вызывать гемагшютинацию как просто эритроцитов, так и эритроцитов, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека. Значения единиц гемагглютинации составили для соединения 10 250 мкг/мл и 7.8 мкг/мл, а для соединения 11313 мкг/мл и 1.2 мкг/мл с Ебар И Ебар Ач ел соответственно. Таким образом, соединения 10 и 11 вызывали гемагглютииацию эритроцитов, несущих иммунные комплексы (ЕбарАчел), при меньших концентрациях (в 32 и 261 раз меньше, соответственно), чем просто Ебар.

Для дальнейших исследований были использованы фиксированные эритроциты человека, содержащие естественные иммунные комплексы. Единицы гемагглютинации для соединений 10 и 11 составили 9.8 мкг/мл, однако при концентрациях Н-фосфоната

10 выше 78 мкг/мл наблюдалось взаимодействие вещества с эритроцитами.

Для изучения природы гемагглютинирующей активности были проведены исследования по влиянию ионной силы раствора на взаимодействие соединений 10 и

11 с иммунными комплексами. Тест гемагппотинации проводили в отсутствии NaCl, что создает условия с минимальными гидрофобными взаимодействиями. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с уменьшением ионной силы раствора реакции гемагглютинации не наблюдается.

4.3.3. Реакция торможения гемагглютинации

Оценка влияния различных компонентов на гемагглютинирующую активность соединения 11 проводилась в тесте торможения гемагглютинации в присутствии иммуноглобулинов человека нативных и агрегированных, а также бычьего сывороточного альбумина. Результаты исследований показали, что ингибирование гемагглютинации происходило при концентрациях иммуноглобулинов человека нативных 1.03 мкг/мл, иммуноглобулинов человека агрегированных - 0.13 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина - 0.81 мкг/мл. Из чего можно сделать вывод, что взаимодействие с агрегированными иммуноглобулинами более специфичное, чем с

иммуноглобулинами нативными (ингибирующис концентрации различаются в 10 раз) и альбумином.

Дальнейшее исследование связывания соединения 11 с иммуноглобулинами в составе иммунных комплексов открывает перспективные направления синтеза новых соединений, обладающих иммуномодулирующими эффектами: 1) препаратов, ингибиругощих взаимодействие иммунных комплексов с системой комплемента (профилактика реперфузионного синдрома при остром инфаркте миокарда, инсультах мозга); 2) препаратов, усиливающих связывание иммунных комплексов с системой комплемента (иммуностимуляция при хронических инфекциях, связанных с низкой комплементактивирующей функцией иммуноглобулинов).

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез Н-фосфонатов замещенных производных производных мио-инозита и тетразамещснных эфиров идита - ключевых интермедиатов для получения димерных анионных фосфолипидов.

2. Исследованы различные подходы к получению димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов с использованием Н-фосфонатного метода. Установлено, что наиболее эффективным является использование подхода, основанного на первоначальном получении фосфорсодержащих производных альдитов и последующей их конденсации с пентазамещенными производными мио-инозита. С помощью данной стратегии осуществлен синтез замещенных димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов с высокими выходами.

3. Разработаны методы получения различных полиольных димеров, их сульфатных, фосфатных и карбоксиметильных производных, а также димерного анионного фосфолипида, модифицированного по фосфорной группе остатком аминокислоты.

4. Проведены исследования противовирусных свойств синтезированных соединений в условиях in vitro и определены их ингибирующие концентрации в отношении штамма ВИЧ-1899А. Изучено влияние некоторых соединений на активность системы комплемента и их действие на эритроциты. На основе димерных незамещенных полиолов получены смешанные липосомы с различным соотношением фосфатидилхолин-димер, определены их размеры и устойчивость.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1) Баранова Е.О., Данг Т.Ф.Л., Еремин C.B., Есипов Д.С., Шастана Н.С., Швец В.И.. Синтез новых производных димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов как потенциальных ингибиторов вирусной адсорбции.// Хим.-фарм. журн. - 2011. - Т. 5, № 3. - С. 114-121.

2) Баранова Е.О., Шастина Н.С., Швец В.И.. Полианионные ингибиторы адсорбции ВИЧ.// Биоорган, химия. - 2011. - Т. 37, № 5. - С. 592-608.

3) Д.В. Лоншаков, Е.О. Баранова, А.И. Лютик, Н.С. Шастина, В.И. Швец. Синтез глицеролипидных производных З'-азидо-З'-дезокситимидина и исследование

их свойств.// Хим.-фарм. жури. - 2010. - Т. 44, № 10. - С. 27-34.

4) Шастина Н.С., Баранова Е.О., Дьякова Л.Н., Лоншаков Д.В., Швец В.И.. Липидная стратегия повышения биодоступности нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.// Вестник МИТХТ. - 2011. - Т. 6, № 2. - С. 7180.

5) Томилина (Баранова) Е.О., Горлачук О.В., Шастина Н.С., Швец В.И.. Использование Ы,Ы-диэтиламино-5,6-бензо-1,3,2-диоксафосфепана в синтезе фосфоэфирных производных лшо-инозита.// Тезисы к Юбилейным чтениям, посвященным 110-летию со дня рождения профессора H.A. Преображенского. -Москва,2006.-С. 87.

6) Шастина Н.С., Томилина (Баранова) Е.О., Горлачук О.В., Швец В.И.. Новые фосфоэфирные производные мио-инозита как модуляторы активности ферментов сигнального каскада.// IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2007. - Т. 1. -С. 133.

7) Баранова Е.О., Шастина Н.С.. Синтез карбоксиметильных производных димерных аналогов фосфатидилинозита с целью поиска эффективных ингибиторов вирусной адсорбции.// V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2009. - Т. 1. — С. 114-115.

8) Баранова Е.О., Шастина Н.С.. Синтез сульфопроизводных димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов.// Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов». -Москва, 2010. - С. 450-451.

9) Баранова Е.О., Шастина Н.С.. Компьютерный скрининг анионных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов на противовирусную активность.// XIII Международная научо-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2010». - Суздаль, 2010. - С. 199.

Ю)Баранова Е.О., Шастина Н.С.. Синтез аналогов инозитсодержащих фосфолипидов и их использование для получения липосомальиых препаратов.// VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2011. -Т. 1. - С. 413-414.

Подписано в печать:

16.11.2011

Заказ № 6276 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Баранова, Елена Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Полианионные ингибиторы адсорбции ВИЧ

1.1. Агенты, препятствующие взаимодействию гликопротеина gpl20 с СБ4-рецептором

1.2. Агенты, препятствующие слиянию вируса с клеткой через прямое воздействие на

§р

1.3. Ингибиторы хемокиновых рецепторов

2. Современные методы создания фосфодиэфирных связей в ряду природных фосфоэфиров

2.1. Н-фосфонатный метод

2.2. Амидофосфитный метод 40 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Синтез ключевых синтонов для получения димерных аналогов инозитсодержащих соединений

1.1. Синтез частично замещенных производных мио-инозита и идита

1.2. Синтез Н-фосфонатных производных замещенных мио-инозита и идита

2. Синтез фосфо- и Н-фосфонатдиэфирных димерных производных мио-инозита

3. Синтез различных анионных производных димерных инозитсодержащих фосфолипидов

3.1. Синтез незамещенных димерных полиолов

3.2. Синтез карбоксиметильных соединений

3.3. Синтез сульфосодержащих димерных фосфолипидов

3.4. Синтез фосфатного производного димерного фосфолипида

3.5. Синтез конъюгата аминокислоты и димерного аналога инозитсодержащего фосфолипида

4. Исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов

4.1. Изучение противовирусной активности

4.2. Использование димерных инозитсодержащих фосфолипидов для приготовления липосомальных препаратов

4.3. Влияние на компоненты крови

4.3.1. Исследование влияния соединений 10, 11 и 18 на систему комплемента

4.3.2. Реакция гемагглютинации

4.3.3. Реакция торможения гемагглютинации 71 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 73 ВЫВОДЫ 91 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека, ВПГ - вирус простого герпеса,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

ДИПАТ - диизопропиламмонийтетразолид,

ДМФА - 1Ч,]\1-диметилформамид,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

ПКМК - периферические кровяные мононуклеарные клетки,

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита,

ТСХ - тонкослойная хроматография,

ТЦИД - тканевая цитопатическая инфекционная доза,

ФМК — фосформолибденовая кислота,

ЦМВ - цитомегаловирус,

ЦПД - цитопатическое действие,

ЯМР — ядерный магнитный резонанс,

Ас - ацетил,

Аг - арил,

AZT - З'-азидо-З'-дезокситимидин,

BSTFA - бис(триметилсилил)трифторацетамид, lBu - трет-бутип,

Bz - бензоил,

Bzl - бензил,

CCR5 - хемокиновый рецептор макрофаготропных штаммов ВИЧ, CD4 - клеточный рецептор, СЕ - цианэтил,

CXCR4 - хемокиновый рецептор Т-тропных штаммов ВИЧ,

DAB - диаминобутан,

DIBAL-H - диизобутилалюминий гидрид,

DMF - Ы,ТЧ-диметилформамид,

DS - декстрансульфат,

Et - этил,

FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США),

GalCer - галактозилцерамид, gp - гликопротеин,

GSL - гликосфинголипид,

HAART — высокоэффективная антиретровирусная терапия, HIV — вирус иммунодефицита человека,

IC50 — средняя эффективная концентрация: концен трация, которая уменьшает на 50% индуцируемый вирусом цитопатический эффект, Im - имидазол, mCPBА - .w-хлорнадбензойная кислота,

Me - метил,

MOM - метоксиметил,

МТ-4 — Т-лимфоидные клетки человека,

NPC1 - 5,5-диметил-2-оксо-2-хлор-1,3,2-диоксофосфоринан,

РАМАМ - полиамидоамин,

Piv — пивалоил,

РМВ - п-метоксибензил, pTS А - и-толуолсульфокислота,

PS-ON - олигонуклеотидтиофосфат,

Рг - изопропил,

Ру — пиридин, rgp — рекомбинантный гликопротеин,

SCOS - сульфатированное производное хитоолигосахарида,

TBAF - фторид тетрабутиламмония,

TBDPS - т/?ет-бутилдифенилсилил,

TEA - триэтиламин,

TES — триэтилсилил,

TFA - трифто'руксусная кислота,

TMS - триметилсилил,

VBS - вероналовый буферный раствор,

ХЕРА - о-ксилилсн-Ы^-диэтиламидофосфит.

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез и исследование свойств димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов"

В настоящее время для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, одобрены 27 противовирусных препаратов [1], некоторые из них могут также использоваться для лечения инфекций таких вирусов, как вирусы гепатита В, гриппа, простого герпеса, цитомегаловирус. Применение антиретровирусной терапии привело к значительным успехам в улучшении и продлении жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, необходимость непрерывного применения терапевтических препаратов и связанные с этим токсичность и возникновение резистентности требует разработки новых агентов с новыми механизмами действия [2, 3]. Большинство из применяемых анти-ВИЧ-агентов нацелены на вирусные ферменты: обратную транскриптазу и протеазу, однако они не способны предотвращать проникновение вируса в клетку, что повышает внимание к первым стадиям жизненного цикла ВИЧ, процессам адсорбции и слияния мембран [4].

Препараты, способные блокировать проникновение ВИЧ в клетку, известные под общим названием "ингибиторы внедрения", представляют собой группу агентов с различными механизмами действия, что отражает многоступенчатый процесс проникновения ВИЧ в клетку-мишень: присоединение к поверхности клетки-хозяина и связывания с С04-рецептором, взаимодействие с корецепторами и слияние мембран [6]. Таким образом, возможна разработка препаратов, нацеленных на различные функциональные компоненты: два вирусных гликопротеина, gp 120 и gp41, соответствующий клеточный рецептор CD4 и корецепторы CCR5 и CXCR4. Вмешательство в функционирование любого из этих компонентов будет препятствовать проникновению ВИЧ в клетку и эффективно блокировать репликацию и распространение вируса. На сегодняшний день для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов из данной группы ингибиторов были одобрены только препараты, которые блокируют связывание с CCR5 (Маравирок) и слияние мембран (Энфувиртид), хотя разрабатываются ингибиторы других мишеней проникновения вируса в клетку [7, 8].

Ранее было показано, что репликация ВИЧ in vitro ингибируется полианионами, как полимерной природы, так и низкомолекулярными, которые способны вмешиваться во взаимодействие вирусного gpl20 и клеточного рецептора [9]. Однако полимерные агенты обладают таким недостатком, как низкая биодоступность, связанная с большим молекулярным весом и высокими отрицательными зарядами, легкость деградации in vivo, антикоагулянтные свойства. Поэтому актуален поиск низкомолекулярных полианионных агентов, содержащих в структуре гидрофобные фрагменты, что позволит таким соединениям лучше проникать через биологические барьеры и при этом проявлять высокую противовирусную активность.

Инозитсодержащие фосфолипиды являются биологически активными соединениями, широко распространенными в природе. Их участие в метаболических процессах, проявление антигенных свойств и ключевая роль в фосфоинозитидном цикле обусловливают внимание к подобным фосфолипидам и их аналогам как основе для создания фармакологически активных веществ [10, 11]. Возможность селективного введения функциональных групп в кольцо лшо-инозита делает эти фосфолипиды перспективными соединениями для поиска веществ с противовирусной активностью.

- Синтез ключевых синтонов для получения димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов.

Разработка методов и осуществление синтеза фосфорсодержащих димерных производных лшо-инозита, получение на их основе полианионных фосфолипидов.

Научная новизна. Разработана стратегия и метод синтеза димерных инозитсодержащих фосфолипидов с применением Н-фосфонатного подхода. Осуществлен синтез новых димерных производных лшо-инозита с различным количеством и региорасположением отрицательно заряженных групп (фосфатных, сульфатных, карбоксиметильных) направленным введением анионных заместителей путем селективного блокирования-деблокирования гидроксильных групп циклитных колец лшо-инозита. Впервые получен аналог инозитсодержащих фосфолипидов, модифицированный по фосфорному центру остатком аминокислоты.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

1. Осуществлен синтез Н-фосфонатов замещенных производных лшо-инозита и тетразамещенных эфиров идита - ключевых интермедиатов для получения димерных аналогов анионных фосфолипидов.

3. Разработаны методы получения различных полиольных димеров, их сульфатных, фосфатных и карбоксиметильных производных, а также димерного аналога анионного фосфолипида, модифицированного по фосфорной группе остатком аминокислоты.

4. Проведены исследования противовирусных свойств синтезированных соединений в условиях in vitro и определены их ингибирующие концентрации в отношении штамма ВИЧ-1899А- Изучено влияние некоторых соединений на активность системы комплемента и их действие на эритроциты. На основе димерных незамещенных полиолов получены смешанные липосомы с различным соотношением фосфатидилхолин-димер, определены их размеры и устойчивость.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Баранова, Елена Олеговна, Москва

1. http://www.hivandhepatitis.corn/hivandaids/hivtreat.html

2. V. Briz, Е. Poveda, V. Soriano. HIV entry inhibitors: mechanisms of action and resistance pathways. // J. Antimicrob. Chemother. — 2006. — V. 57. P. 619-627.

3. S. Pohlmann, J.D. Reeves. Cellular entry of HIV: evaluation of therapeutic targets. // Curr. Pharm. Des. 2006. - V. 12. - P. 1963-1973.

4. J. Steijovski, M.J. Churchill, S.L. Wesselingh et. al. HIV-1 entry inhibitors: classes, applications and factors affecting potency. // Curr. HIV Res. 2006. -V. 4, No. 4. - P. 387-400.

5. J.C. Tilton, and R.W. Doms. Entry inhibitors in the treatment of HIV-1 infection. // Antiviral Res. 2010. - V. 85. - P. 91-100.

6. J.T. Leonard, K. Roy. The HIV entry inhibitors revisited. // Curr. Med.f Chem. 2006. -V. 13.-P. 911-934.

7. E. De Clercq. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of HIV. // In. J. Antimicrob. Agents. 2009. - V. 33. - P. 307-320.

8. S. Liu, S. Wu, S. Jiang. HIV entry inhibitors targeting gp41: from polypeptides to small-molecule compounds. // Curr. Pharm. Des. 2007. - V. 13. - P. 143-162.

9. S. Rusconi, A. Scozzafava, A. Mastrolorenzo et. al. An update in the development of HIV entry inhibitors. // Curr. Top. Med. Chem. 2007. - V. 7. - P. 1273-1289.

10. Y. Watanabe, H. Ishikawa. Synthesis of dipalmitoyl-phosphatidylinositol 5-phosphate and its modified biological tools. // Tetrahedron Lett. 2000. - V. 41. - P. 8509-8512.

11. E. De Clercq. New approaches toward anti-HIV chemotherapy. // J. Med. Chem. -2005.-V. 48, No. 5.-P. 1297-1313.

12. J. A. Este, A. Telenti. HIV entry inhibitors. // Lancet. 2007. - V. 370, No. 9581. -P. 81-87.

13. H. J.-P. Ryser, R. Fluckiger. Progress in targeting HIV-1 entry. // Drug Discov. Today. -2005.-V. 10,No. 16.-P. 1085-1094.

14. C.S. Adamson, E.O. Freed. Novel approaches to inhibiting HIV-1 replication. // Antiviral. Res. 2010. - V. 85. - P. 119-141.

15. S. Orsega. Treatment of adult HIV infection: antiretroviral update and overview. // JNP. -2007.-V. 3,No. 10.-P. 612-624.

16. J.A. Turpin. The next generation og HIV/AIDS drug: novel and developmental antiHIV drugs and targets. // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2003. - V. 1, No. 1. - P. 97-128.

17. K. Vermeire, D. Schols, T.W. Bell. Inhibitors of HIV infection via the cellular CD4 receptor. // Curr. Med. Chem. 2006. - V. 13. - P. 731 -743.

18. O.A. Тучная, O.B. Горлачук, B.A. Лившиц, и др. Синтез анионных производных мио-инозита и других полиолов и исследование их антивирусной активности. // Хим,-фарм. журн. -2008. V. 42, No. 1. - Р. 65-71.

19. J. Lopez-Aldeguer, К. Aguirrebangoa, J.R. Arribas et. al. New targets and new drugs in the treatment of HIV. // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2005. - V. 23, No. 2. - P. 33-40.

20. E. De Clercq. Toward improved anty-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for intervention with HIV infection. // J. Med. Chem. 1995. -V. 8, No. 14. - P. 2491-2517.

21. K.E. Gantlett, J.N. Weber, Q.J. Sattentau. Synergistic inhibition of HIV-1 infection by combinations of soluble polyanions with other potential microbicides. // Antiviral Res. — 2007. — V. 75.-P. 188-197.

22. S.M. Wolinsky, R.S. Veazey, K.J. Kunstman et. al. Effect of a CCR5 inhibitor on viral loads in macaques dual-infected with R5 and X4 primate immunodeficiency viruses. // Virology. -2004. V. 328.-P. 19-29.

23. S. Liu, H. Lu, Q. Zhao et. al. Theaflavin derivatives in black tea and catechin derivatives in green tea inhibit HIV-1 entry by targeting gp41. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. -V. 1723.-P. 270-281.

24. H. Haim, Z. Si, N. Madani et. al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. // PLoS Pathog. 2009. - V. 5, No. 4.-P. 1-13.

25. J. A. Este. Virus entry as a target for anti-HIV intervention. // Curr. Med. Chem. — 2003.-V. 10.-P. 1617-1632.

26. M. Witvrouw, E. De Clercq. Sulfated polysaccharides extracted from sea algae as potential antiviral drugs. // Gen. Pharmacol. 1997. - V. 29, No. 4. - P. 497-511.

27. T. Ghosh, K. Chattopadhyay, M. Marschall et. al. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: from structure-activity analysis to clinical evaluation. // Glycobiology. 2009. -V. 19, No. 1.-P. 2-15.

28. E. De Clerq. New developments in anti-HIV chemoterapy. // Curr. Med. Chem. 2001. -V. 8.-P. 1543-1572.

29. R.D. Kensinger, B.J. Catalone, F.C. Krebs et. al. Novel polysulfated galactose-derivatized dendrimers as binding antagonists of human immunodeficiency virus type 1 infection. //Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - V. 48, No. 5. - P. 1614-1623.

30. M. Witvrow, J. Desmyter, E. De Clercq. Polysulfates as inhibitors of HIV and other enveloped viruses. //Antivir. Chem. Chemother. 1994. -V. 5, No. 6. - P. 345-359.

31. I. Wijesekara, R. Pangestuti, S.-K. Kim. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae. // Carbohydr. Polym. 2011. -V. 84, No. l.-P. 14-21.

32. M. Leuscher-Mattli. Algae, a possible source for new drugs in the treatment of HIV and other viral diseases. // Curr. Med. Chem. 2003. -V. 2. - P. 219-225.

33. T.-S. Vo, S.-K. Kim. Potential anti-HIV agents from marine resources: an overview. // Mar. Drugs.-2010.-V. 8, No. 12. P. 2871-2892.

34. T. Yamada, A. Ogamo, T. Saito et. al. Preparation of O-acylated low-molecular-weight carrageenans with potent anti-HIV activity and low anticoagulant effect. // Carbohydr. Polym. -2000.-V. 41,No. 2.-P. 115-120.

35. E.B. Damonte, M.C. Matulewicz, A. S. Cerezo. Sulfated Seaweed Polysaccharides as Antiviral Agents. // Curr. Med. Chem. 2004. - V. 11. - P. 2399-2419.

36. L.-A. Tziveleka, C. Vagias, V. Roussis Natural Products with Anti-HIV Activity from Marine Organisms. // Curr. Top. Med. Chem. 2003. - V. 3. - P. 1512-1535.

37. M. Artan, F. Karadeniz, M.Z. Karagozlu et. al. Anti-HIV-1 activity of low molecular weight sulfated chitooligosaccharides. // Carbohydr. Res. 2010. - V. 345. - P. 656-662.

38. M. Liiscer-Mattli. Polyanions a lost chance in the fight against HIV and other virus diseases? //Antivir. Chem. Chemother. - 2000. - V. 11, No. 4. - P. 249-259.

39. S. Rusconi, M. Moonis, D. R Merrill. Naphtalene sulfonate polymers with CD4-blocking and anti-human immunodeficiency virus type 1 activities. // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. -V. 40, No. 1. - P. 234-236.

40. J. Rojo, R. Delgardo. Glycodendritic structures: promising new antiviral drugs. // J. Antimicrob. Chemother. 2004. - V. 54. - P. 579-581.

41. A. N. Vzorov, D. W. Dixon, J. S. Trommel et. al. Inactivation of human immunodeficiency virus tupe 1 by porphyrins. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - V. 46, No. 12.-P. 3917-3925.

42. J. Dairou, C. Vever-Bizet, D. Braulta Interaction of sulfonated anionic porphyrins with HIV glycoprotein gpl20: photodamages revealed by inhibition of antibody binding to V3 and C5 domains. // Antiviral Res. 2004. - V. 61. - P. 37-47.

43. S. Bour, R. Geleziunas, M. A. Wainberg. The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) CD4 receptor and its central role in promotion of HIV-1 infection. // Microbiol. Rew.1995.-V. 59, No. 1.-P. 63-93.

44. Q. Yang, A. G. Stephen, J. W. Adelsberger et. al. Discovery of small-molecule human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors that target the gpl20-binding domain of CD4. // J. Virol. -2005.-V. 79,No. 10.-P. 6122-6133.

45. C. Udata, J. Patel, D. Pal et. al. Enhanced transport of a novel anti-HIV agent-cosalane and its congeners across human intestinal epithelial (Caco-2) cell monolayers. // Int. J. Parm. -2003.-V. 250.-P. 157-168.

46. S. Venkatesh, J. Li, Y. Xu et al. Intrinsic solubility estimation and pH-solubility behavior of cosalane (NSC 658586), an extremely hydrophobic diprotic acid. // Pharm. Res. —1996.-V. 13, No. 10.-P. 1453-1459.

47. A. Casimiro-Garcia, E. De Clercq, C. Pannecouque et. al. Synthesis and anti-HIV activity of cosalane analogues incorporating nitrogen in the linker chain. // Bioorg. Med. Chcm. -2000.- V. 8.-P. 191-200.

48. M. Cushman, W.M. Golebiewski, Y. Pommier et. al. Cosalane analogues with enhanced potencies as inhibitors of HIV-1 protease and integrase. // J. Med. Chem. — 1995. V. 38. - P. 443-452.

49. G.C. Paul, E. De Clercq, C. Pannecouque et.al. Identification of optimal anion spacing for anti-HIV activity in a series of cosalane tatracarboxylates. // Bioorg. Med. Chem.- Lett. -2000.-V. 10.-P. 2149-2152.

50. M. Cushman, S. Insaf, G. Paul et. al. Extension of the polyanionic pharmacophore as a strategy for increasing anti-HIV potency. // J. Med. Chem. 1999. -V. 42. - P. 1767-1777.

51. K.C. Santhosh, G.C. Paul, E. De Clerq et. al. Correlation of anti-HIV activity with anion spacing in a series of cosalane analogues with extended polycarboxylate pharmacophores. // J. Med. Chem. 2001. -V. 44. - P. 703-714.

52. K.C. Santosh, E. De Clercq, C. Pannecouque et. al. Anti-HIV activity of a series of cosalane amino acid conjugates. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. - V. 10. - P. 2505-2508.

53. R.F. Keyes, W.M. Golebiewski, M. Cushman. Correlation of anti-HIV potency with lipophylicity in a series of cosalane analogs having normal alkenyl and phosphodiester chains as cholestane replacements. // J. Med. Chem. 1996. - V. 39. - P. 508-514

54. M. Zaitseva, K. Peden, H. Golding. HIV coreceptors: role of structure, posttranslation modifications, and internalization in viral-cell fusion and as target for entry inhibitors. // Biochim. Biophys. Acta-2003.-V. 1614. -P/51-61.

55. S. Jiang, A.K. Debnath. A salt bridge between an N-terminal coiled coil of gp41 and an antiviral agent targeted to. the gp41 core is important for anti-HIV-1 activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 270, No. 1. - P. 153-157.

56. M. Armand-Ugon, I. Clotet-Codina, C. Tintori et. al. The anti-HIV activity of ADS-J1 targets the HIV-1 gpl20.//Virology.-2005.-V. 343.-P.'141-149.

57. S. Liu, S. Lu, S. Jiang. HIV entry inhibitors targeting gp41: from polypeptides to small-molecule compounds. // Curr. Pharm. Des. — 2007. — V. 13. — P. 143-162.

58. K. Liu, H. Lu, L. Hou et. al. Design, synthesis, and biological evaluation of N-carboxyphenylpyrrole derivatives as potent HIV fusion inhibitors targeting gp41. // J. Med. Chem. 2008. -V. 51, No. 24. - P. 7843-7854.

59. Y. Wang, H. Lu, Q. Zhu et. al. Structure-based design, synthesis and biological evaluation of new N-carboxyphenylpyrrole derivatives as HIV fusion inhibitors targeting gp41. // Bioorg. Med. Chem. 2010. -V. 20. - P. 189-192.

60. A. Vaillant, J.-M. Juteau, H. Lu et al. Phosphorothioate oligonucleotides inhibit human immunodeficiency virus type 1 fusion by blocking gp41 core formation. // Antimicrob. Agents Chemother.-2006.-V. 50,No. 4.-P. 1393-1401.

61. O.M.Z. Howard, T. Korte, N.I. Tarasova et. al. Small molecule inhibitor of HIV-1 ccll fusion blocks chemokine receptor-mediated function. // J. Leukoc. Biol. — 1998. — V. 64. — P. 6-13.

62. J.J. Hale, R.J. Budhu, S.G. Mills et.al. 1,3,4-Trisubstituted pyrrolidine CCR5 receptor antagonists. Part 3: polar functionality and its effect on anti-HIV-1 activity. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. - V. 12, No. 20. - P. 2997-3000.

63. C.L. Lynch, C.A. Willoughby, J.J. Hale et. al. 1,3,4-Trisubstituted pyrrolidine CCR5 receptor antagonists: modifications of the arylpropylpiperidine side chains. // Biorg. Med. Chem. Lett.-2003.-V. 13,No. l.-P. 119-123.

64. A. Mastrolorenzo, A. Maresca, S. Rusconi et. al. Update on the Development of HIV Entry Inhibitors. // Future HIV Ther. 2008. - V. 2, No. 5. - P. 479-507.

65. C. Watson, S. Jenkinson, W. Kazmierski et. al The CCR5 receptor-based mechanism of action of 873140, a potent allosteric noncompetitive HIV entry inhibitor. // Mol. Pharmacol. — 2005.-V. 67,No. 4.-P. 1268-1282.

66. T. Wang, Y. Duan. Binding modes of CCR5-targeting HIV entry inhibitors: partial and full antagonists. // J. Mol. Graph. Model. 2008. -V. 26, No. 8. - P. 1287-1295.

67. N.K. Kamisetty, S.P. Pack, M. Nonogawa et. al. Synthesis and application of new amine-modified oligonucleotides using H-phosphonate chemistry. // Nucleic Acids Symp. Ser. № 50. -2006.-V. 50, No. l.-P. 171-172.

68. K. Pongracz, S. M. Gryaznov. a-Oligideoxyribonucleotide N3'—>P5' phosphoramidates: synthesis and duplex formation. // Nucleic Asids Res. 1998. - V. 26, No. 4. -P. 1099-1106.

69. C.B. Reese, Q. Song. The H-phosphonate approach to the synthesis of oligonucleotides and their phosphorothioate analogues in solution. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. — 1999. V. 11. -P. 1477-1486.

70. Lindh, J. Strawinski. A general method for the synthesis of glycerophospholipids and their analogues via H-phosphonate intermediates. // J. Org. Chem. 1988. - V. 54. - P. 1338-1342.

71. D.V. Yashunsky, A.V. Nikolaev. Hydrogenphosphonate synthesis of sugar phosphomonoesters. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2000. - V. 8. - P. 1195-1198.

72. R.H. Michell. Inositol lipids and phosphates. // Curr. Opin. Cell Biol. 1989. - V. 1. -P. 201-205.

73. G.D. Ainge, J. Hudson, D.S. Larsen et. al. Phosphatidylinositol mannosides: synthesis and suppression of allergic airway disease. // Bioorg. Med. Chem. 2006. - V. 14.- P. 5632-5642.

74. P. Somasundar, D.R. Riggs, B.J. Jackson et. al. Inositol hexaphosphate (IP6): a novel treatment for pancreatic cancer. // J. Surg. Res. 2005. - V. 126. - P. 199-203.

75. X. Liu, E.C. Moody, S.S. Hecht et al. Deoxygenated phosphorotioate inositol phosphate analogs: synthesis, phosphatase stability, and binding affinity. // Bioorg. Med. Chem. -2008. V. 16.-P. 3419-3427.

76. C.N. Borissov, Т.К. Smith, M.A.J. Ferguson et. al. Synthesis of 3'-, 4'- and 6'-deoxy and other analogues of D-glucosaminylphosphatydilinositol. // Tetrahedron Lett. 2000. - V. 42. -P. 121-123.

77. C.B. Reese. The chemical synthesis of oligo- and poly-nucleotides: a personal commentary. // Tetrahedron. 2002. - V. 58. - P. 8893-8920.

78. C.B. Reese. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. // Org. Biomol. Chem. 2006. -V. 3. - P. 3851-3868.

79. А.Ю. Замятина, A.C. Бушнев, В.И. Швец. Фосфиттриэфирный и Н-фосфонатный методы в синтезах фосфолипидов. // Биоорган, химия. — 1994. — Т. 20, No. 12. — С. 1253-1296.

80. Y. Watanabe. Selective reactions and total synthesis of inositol phosphates. // Studies in Natural Products Chemistry. 1996. - V. 18. - P. 391-456.

81. J. Stawinski, A. Kraszewski. How to get the most out of two phosphorus chemistries. Studies on H-phosphonates. // Acc. Chem. Res. 2002. - V. 35, No. 11. - P. 952-960.

82. M.V. de Almedia, J. Cleophax, A. Gateau-Olesker et al. Synthesis of deoxy phosphatidylinositol analogues and phosphonate isosters of Ins(l,4,5)P3. // Tetrahedron. — 1999. -V. 55.-P. 12997-13010.

83. N.N. Dioubankova, A.D. Malakhov, D.A. Stetsenko et al. Phosphoramidites and solid supports based on N-substituted 2,4-dihydroxybutyramides: universal reagents for synthesis of modified oligonucleotides. // Tetrahedron. 2006. —V. 62. - P. 6762-6773.

84. A.M. Sorensen, K.E. Nielsen, B. Vogg et al. Synthesis and NMR-studies of dinucleotides with conformationally restricted cyclic phosphotriester linkages. // Tetrahedron. — 2001.-V. 57.-P. 10191-10201.

85. A. Ohkubo, Y. Noma, H. Taguchi et. al. Development of an N-unprotected phosphoramidite method for the chemical synthesis of aminoacylated RNAs. // Nucleic Acids Symp. Ser. № 51. 2007. -V. 5, No. 1. - P. 1-2.

86. F. Bergmann, E. Kueng, P. Iaiza et. al. Allyl as internucleotide protecting group in DNA synthesis to be cleaved off by ammonia. // Tetrahedron. 1995. - V. 51, No. 25. - P. 6971-6976.

87. A. Sakakura, Y. Hayakawa. A novel synthesis of oligonucleotide-peptide conjugates with a base-labile phosphate linker between the two components according to the allyl-protected phosphoramidite strategy. // Tetrahedron. 2000. - V. 56. - P. 4427-4435.

88. T.S. Elliot, J. Nemeth, S.A. Swain et. al. A synthesis of dioctanoyl phosphatidylinositol. // Tetrahedron: Asymmetry. 2009. - V. 20, No. 24. - P. 2809-2813

89. U.M. Krishna, M.U. Ahmad, I. Ahmad. Phosphoramidite approach for the synthesis of cardiolipin. // Tetrahedron Lett. 2004. - V. 45. - P. 2077-2079.

90. M. Lalanne, A. Paci, K. Andrieux et. al. Synthesis and biological evaluation of two glicerolipidic prodrugs of didanosine for direct lymphatic delivery against HIV. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. - V. 17. - P. 2237-2240.

91. M.A. Russell, A.P. Laws, J.H. Atherton et. al. The mechanism of the phosphoramidite synthesis of polynucleotides. // Org. Biomol. Chem. 2008. - V. 6. - P. 3270-3275.

92. J.E. Browne, M.J. Driver, J.C. Russell et al. Preparation of phospholipid analogues using the phosphoramidite route. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2000. — V. 5. - P. 653-657.

93. H. Zhang, Y. Xu, N. Markadieu et. al. Synthesis and biological activity of phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphorothioate. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. - V. 18. -P. 762-766.

94. Y. Watanabe. Synthetic strategies based on phosphite chemistry aiming at efficient synthesis of inositol phospholipids. // J. Synth. Org. Chem., Jpn. 2000. - V. 58, No. 11. - P. 1057-1065.

95. S. Ozaki, Y. Kondo, N. Shiotani et. al. Synthesis and some properties of D-myo-inositol l,4,5-tris(dihydrogen phosphate). // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1992. - V. 6. - P. 729-737.

96. Y. Watanabe, H. Munetsugu, M. Hayashi. Comparison of cyclic and acyclic phosphites by selective phosphorylation. Synthesis of phosphatidylinositol 4-phosphate. // Chem. Lett. 2002. -V. 31, No. 3. - P. 292-293.

97. M.Y.K. Leung, F.S. Cohen. Increasing hydrophobicity of residues in an anti-HIV-1 Env peptide synergistically improves potency. // Biophys. J. — 2011. —V. 100. — P. 1960-1968.

98. J. Gigg, R. Gogg, S. Payen et al. (±)-l,2:4,5-Di-0-isopropilidene-myo-inositol. // Carbohydr. Res. 1985. -V. 142, No. 1. - P. 132-134.

99. T. Praven, M.S. Shashidhar. Convenient synthesis of 4,6-di-O-benzoyl-myo-inositol and wyo-inositol 1,3,5-orthoesters. // Carbohydr. Res. 2001. -V. 330. - P. 409-411.

100. В.И. Швец, Р.П. Евстигнеева. О номенклатуре и изображении рацемических асимметрично замещенных производных мио-инозита. // Журн. орган, химии. 1972. — Т. 8, No. 7. - С. 550-552.

101. ИЗ. Б.А. Клящицкий, В.И. Швец, Н.А. Преображенский. О номенклатуре оптически активных производных асимметрично замещенного .ш/о-инозита. // Журн. орган, химии. -1969.-Т. 5, No. 1.-С. 192-193.

102. Е.М. Орехова, И.Н. Грачева, Б.А. Клящицкий и др. Синтез и некоторые свойства функционализированных производных адипинового диальдегида и тетразамещенных мио-инозитов. // Журн. орган, химии. 1993. - Т. 29, No. 11. - С. 1754-1757.

103. О.А. Тучная, С.Н. Елизарова, С.А. Шарикова и др. Синтез конъюгатов анти-ВИЧ-активных нуклеозидов с липофильными диольными соединениями. // Хим.-фарм. журн. 2006. - Т. 40, No. 5. - С. 95-99.

104. P. Westerduin, Н.А.М. Willems, С. A. A. van Boeckel. Synthesis of analogues of myoinositol 1,4,5-triphosphate that contain sulfonamide, sulfate, methylphosphonate, and carboxymethyl groups. // Carbohydr. Res. 1992. -V. 234. - P. 131-140.

105. Ю.Э. Андия-Правдивый, С.В. Буреева, А.П. Каплун и др. Синтез и антигемолитическая активность дисульфатов бис-фенолов и ряда дикарбоновых кислот. // Хим.-фарм. журн. -2004. Т. 38, No. 3. - С. 9-12.

106. Н.С. Шастина, Л.И. Эйнисман, И.И. Каширичева и др. Исследования в области производных асимметрично замещенного лшо-инозита. XXXVII Синтез производных гликозилфосфатидилинозита. // Биоорган, химия. 1995. - Т. 21, No. 8. - С. 641-650.