2-(Алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3H)-оны тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный технический университет»

На правах рукописи ^■е^усГГ-

Бабушкин Александр Сергеевич

2-(Алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(ЗД)-оны: синтез и исследование физико-химических свойств и энантиоселективности противовирусного действия

02.00.03 - Органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

6 НОЯ 2014

Волгоград - 2014

005554590

Работа выполнена на кафедре «Органическая химия» Волгоградского государственного технического университета.

Защита состоится «23» декабря 2014 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.028.01, созданного на базе Волгоградского государственного технического университета по адресу: 400005, Волгоград, проспект Ленина, 28, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного технического университета и на сайте www.vstu.ru по ссылке http://vstu.ru/nauka/dissertatsionnye-sovety/zaschita/babushkin-aleksandr-sergeevich.html

Автореферат разослан «23» октября 2014 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

Научный руководитель доктор химических наук, доцент

Навроцкий Максим Борисович.

Научный консультант академик РАН, доктор химических наук

Новаков Иван Александрович. Официальные оппоненты: Злотин Сергей Григорьевич,

доктор химических наук, профессор, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, заместитель директора; Озеров Александр Александрович, доктор химических наук, профессор, Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармацевтической и токсикологической химии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО "Северо-Кавказский федеральный

университет", г. Ставрополь

кандидат химических наук, доцент

ВВЕДЕНИЕ1

Актуальность темы. Производные 6-бензнлшфтп1днн-4(ЗЯ)-она, содержащие различные гетерофуикционалыше группы в положении 2 пиримидинового гетерощжла, бьиш впервые получены и охарактеризованы Marino Artico и соавторами, как анти-ВИЧ-1 агенты в 1993 году. Начиная с этого момента был выполнен целый ряд химических модификаций отдельных представителей этого класса соединений, направленных на оптимизацию их структуры, повышегше противовирусной активности и безопасности. В результате было показано, что наиболее высокий уровень противовирусной активности соответствует веществам, содержащим 2,6-дигалогенбензилъный радикал в положении 6 пиримидинового гетерощпсла, являющихся формальными производными 2-тиотимина и изоцитозина. Первоначально считалось, что наибольшей активностью обладают 2,6-дифтор-замещенные производные. В 2004 году на примере производных 2-{[(мет1тсульфанш1)метил]сульфашо}шфишвдш-4(ЗЯ)-она было впервые показано, что несимметричное замещение ароматического ядра и переход к 2-фтор-б-хлор-замещенным производным является предпочтительным. Позднее, аналогичная закономерность подтвердилась в случае функциональных производных 2-тиоурацила, несущих фрагмент ацетофенона или ацетанилида при атоме серы, а также - для производных 2Чдимепоамшго)шфи\гидин-4(ЗЯ)-она. Несмотря на это, открытым остался вопрос о противовирусных свойствах производных 6-(2-фтор-6-хлорбензил)-2-тиоурацила, содержащих гомоалкильный фрагмент при атоме серы. Основываясь на установленной ранее высокой противовирусной активности конформациошю ограниченных хиральных производных 6-бензилгпфИМИД1ш-4(3//)-она, содержащих две метальные группы в a-положении бензильного радикала и положещш С5 пиримидинового гетерощпсла, виделось оправдагшым исследовшше соответствующих соединений, содержащих 2-фтор-б-хлорбензильньш фрагмент. В свете изложенного выше, была сформулирована цель и задачи настоящей работы.

1 Автор выражает глубокую признательность директору ЦКП «ФХМИ», д.х.н., профессору Орлинсону Б.С. и доценту кафедры «Органическая химия». к.х_н. Брунилиной Л.Л. за участие в обсуждении результатов работы.

Цель: разработка эффективных путей сшггеза новых производных 2-(атютсулъфшпш)-6-(2,6-д11гатогенбего1и)тфгападш-4(ЗЯ)-она, исследование их физико-химических свойств и энантиоселективности биологического действия. Задачи:

1. Разработка структур новых функциональных производных 2-(алкилсульфа1пи)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)шфтп1Дин-4(3^/)-она, как вероятных ингибиторов репликации ВИЧ-1 ненуклеозидной природы.

2. Синтез и исследование физико-химических свойств целевых соединений и ключевых интермедиатов их получения.

3. Сравнительная оценка противовирусной активности и цитотоксичности полученных соединении с использованием инфицированных диким штаммом и клинически релевантными мутантными штаммами ВИЧ-1 и квази-инфицированиых колоний клеток лимфоидной ткани.

4. Изуче1ше молекулярного механизма действия полученных соединений на основе э1Пимологнчеси1Х исследовшшй с использованием рекомбинантного гетеро дилера ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и её изоформ.

5. Разработка методов разделешм веществ-лидеров на отдельные энантиомеры и сравшггельная оценка их биологической активности.

6. Установление взаимосвязей химической структуры и биологической активности полученных веществ. Рационализация установленных закономерностей через построение модели взаимодействия веществ лидеров с биологической мишенью.

Научная новизна работы. Впервые с использованием спектроскотш кругового дихроизма и эффекта Коттона выполнено отнесение стереоконфигурации хирального бензильного атома углерода в индивидуальных энантиомерах производных 2-(алишсул1фашш)^-[1-(2-фтор-6-хлорфешш)атк1и1]гоф1пп1Д1ш-4(ЗЯ)-оиа, и показано, что повышению уровня анти-ВИЧ-1 активности соответствует Реконфигурация этого центра, в то время как Б-изомеры - менее активны.

Впервые с использованием сопоставления результатов молекулярного докинга и констант ингабировшшя рекомбинантной ревертазы ВИЧ, вьптолнено отнесе1ше конфигурации хиральных центров в аисилсульфанилъных группах новых производных 2-(алкилсульфа1пш)-6-(2-фтор-6-хлорбе1В1и)пирш1П1Д1П1-4(3//)-она. Установлена связь угла вращения плоскости поляризации в этих

веществах с абсолютной конфигурацией стереогенных центров в этих соедашещих.

С использованием реакций региоселекпшного а-С-алкнлирования 2-(2,6-днгалогенфенил)уксусных кислот в присутствии системы диизопропиламид лития -1,3-д1гмепи1-1,3-пропиленмочев1ша, с высоким выходом получены исходные вещества для сшггеза новых производных 2-(алкилсульфанид)-6-(2-фтор-6-хлорбензнл)пиримндин-4(3#)-она - 2-(2,6-дигалогенфенил)алкановые кислоты.

На основании реакции ацилировання монокалиевых солей алкилмалоновых кислот 2-(2,6-дигалогенфе1шл)алкановыми кислотами в присутствии модифицированной системы Ратке (хлорид маппы - Л'Л-;иппопрош1л-Лг-тп1лашш) и Л',Л'-карбонилдиимидазола, в качестве конденсирующего агента, с высоким выходом и чистотой получены ключевые шггермедиаты синтеза новых производных 2-(ат1Килсульфаши)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)шфилп1Дин-4(ЗЯ)-она -этиловые эфнры 4-(2,6-дигалогенфенил)-3-оксобутановых кислот.

С помощью методов молекулярного моделирования установлена взаимосвязь стереоконфигурации хнралыюго центра алифатического радикала при атоме серы и полученных производных 2-{алюшсульфшпи)-6-(2-фтор-6-хлорбенз1ш)тф11-чидин-4(ЗЯ>она с способностью к связыванию с аллостерическим участком ревертазы ВИЧ-1, объяснены пуш взаимодействия полученных соединений с этой биомишенью.

Праьлтпеская значимость работы. Разработаны эффективные способы получения новых функциональных производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)тфимидш1-4(3//)-она, обладаюгщгх противовирусными свойствами, на основе 2-(2-фтор-6-хлорфеши)уксусной кислоты.

С использованием нормалыгофаювой Х1фальной пренарапивной хроматографии разработан метод разделения рацемических смесей новых производных 2-(а!шисульфанил)-6^2ч|ггор-6-х11орбе131И^11ф1с>01Д;пь4{ЗН)-01т. Получены стереоизомеры наиболее активных синтеяфоиашгых соединешш и установлена взаимосвязь сгереоконфигурацци >афатьных цаггров их молекул с уровнем противовирусной акгнвности. Установлено, что правовращающие эншггиомеры являются более активными прсгпжляфусными агатами, чем их левоврашдющне оптические шпиподы

Впервые получены вещества, превосходящие по уровню анти-ВИЧ-1 активности (дикий штамм ВИЧ-1 N1,4-3) невирапин в 4000, а ифавиренц - более чем в 200 раз, при значительно более низком уровне цнтотоксичности.

Показано, что 2-(изопропилсульфанил)- и 2-(циклопентилсульфанил)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-хлорфегаш)этил]п1фгоп1Д1ш-4(ЗЯ)-оны могут

рассматриваться как прототипы для получения новых производных этого ряда, имеющих реальную перспективу применения в составе комбинированной высокоэффективной противовирусной терапии.

Личный вклад автора. Соискателем проведено выполнение химических экспериментов в часта получения, анализа и подтверждения чистоты синтезированных соединений, в том числе, получено 46 соединений, не описанных ранее, обобщение и анализ литературных дшшых по проблеме диссертационного исследования, диссертация и автореферат написаны самостоятельно.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической химии - 2014. МедОргБиоХим-2014 (пос. Новый Свет (Крым), 2014 г.), Уральском научном форуме "Современные проблемы органической химии" (Екатеринбург, 2014 г.), а также ежегодных научных сессиях Волг!'ГУ.

Публикации. По содержанию диссертации опубликовано 2 статьи в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ, и 2 тезиса научных докладов.

Струюура и объем работы. Диссертация состоит го введения, обзора лигерапуры, посвященного взаимосвязи химической структуры и свойств биологически активных производных 6-бензилгпф1вп1дин-4(3/У>она, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена ш 145 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, 7 рисунков, 182 литературные ссылки.

Настоящая работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых ученых - докторов наук МД-1658.2014.3 и Минобразования России в рамках базовой части государственного задания (проект ЛЬ2896), в целях реализации программы стратегического развития ФГБОУВПО ВолгГТУна 2012-2014 годы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Производные бентл1шр1тцдн11-4(ЗД)-о11а: химическая структура, сшггез и биологические свойства

б

Проанализированы литературные данные по взаимосвязи химической структуры и свойств биологически активных функциональных производных 6-беюилпиримидин-4(3Щ-сш.

Глава 2. Результаты и их обсуждение

2.1. Получение полупродуктов синтеза и целевых производных 2-(алкилсульфанил)-6-[1-(2,6-дигалогенфеннл)алкил]пиримцдин-4(ЗЯ)-она

Целевые производные 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)шфимидин-4(3//)-она (7-12) были синтезированы наряду с производными 2-(алкилсульфашл)-6-(2,6-дифторбензил)пиримвдин-4(ЗЯ)-она (13-15), исходя из соответствующих 2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот (1,2). Все полученные производные 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбешил)пиримидин-4(ЗД)-она были получены впервые, в то время как некоторые из стандартов сравнения - производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-дифторбешил)пиримидин-4(3//)-она были описаны в литературе ранее.

Синтез данных веществ осуществляется через следующие стадии: 1) а-С-алкилировании исходных 2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот (1,2) йодистым метилом или этилом, с использованием лития диизопропиламида в качестве основания (схема 1); 2) применении полученных 2-(2,б-дигалогенфенил)алкановых кислот (3-6, выход - 65-80%) для ацилирования калия З-оксо-З-этоксипропаноата, с использованием модифицированной системы Ратке (хлорид магния - ДЛ'-диизопрогшл-А'-этиламин) и Л^-карбонилдиимидазола в качестве конденсирующего агента, с образованием соответствующих 3-оксоэфиров (17, выход - 65-78%) (схема 2); 3) циклоконденсации полученных 3-оксоэфиров с тиомочевиной в основной среде и получении производных 2-тиоурацила (18, выход - 49-69%) (схема 3); 4) ¿"-алкилировании производных 2-тиоурацила галогеналканами в присутствии безводного калия карбоната с образованием целевых веществ (7-15, выход - 65-89%) (схема 4).

Схема 1

1,2 3-6

где:

И., = С1 (1,3,4), Р (2,5,6); = СН3 (3,5), С2Н5 (4,6). ОМРи -1,3-даметатгексагвдх)пиримвдин-2-он.

Характерной особенностью ■ метода получения (2,6-

дигалогенфенил)алкановых кислот является использование в качестве

7

сорастворителя и комплехсообразующего агента 1,3-диметилгекса-гидропиримидин-2-она, который позволяет обеспечить повышение региоселективности процесса и выхода искомых продуктов моноалкилирования за счет повышения растворимости промежуточного соединения - реактива Иванова, а также эффекта специфической сольватации переходного комплекса.

Выделение целевых веществ (3-6, соединение 4 является новым) проводилось с использованием кислотно-щелочной экстракции, а их дополнительная очистка - методом колоночной хроматографии. Аналитические образцы твердых продуктов были получены путем кристаллизации из пентана (до постоянной температуры плавления).

R, = CI (1, 3, 4, 17а-0, F (2, 5, 6, 17g, 17h, 171); R2 = Н (1, 2, 17а, 17b), СН3 (3, S, 17с, 17d, 17е, 17g, 17h), C2HS (4,6,17f, 17i); R3 = H (17a, 17c), CH3 (17b, 17d, 17f, 17g, 17i), C2HS (17e, 17h).

Технические продукты, полученные после простой экстрактивной обработки реакционной массы, имели достаточную для последующих превращений степень чистоты. Дополнительная очистка полученных соединений (3-оксоэфиры 17a-i, из которых 17е и 17f - новые) выполнялась методом колоночной хроматографии (в случае твердых продуктов - с дополнительной кристаллизацией из гексана).

Следует отметить, что этот модифицированный способ синтеза 3-оксоэфиров имеет ряд важных особенностей. С одной стороны, он реализуется по "бесхлорному" варианту, позволяя миновать стадию образования хлорангидрида кислоты. Ацилирующий агент - 1-ацил-1Я-имидазол получается in situ из исходной кислоты и ДЛГ-карбонилдиимидазола, причем единственным газообразным побочным продуктом является углекислый газ. Также, немаловажно отметить, что этот метод синтеза исключает применение пожароопасных металлических оснований, таких как реактивы Гриньяра или гидриды щелочных металлов.

Схема 2

1-6

17a-i

где:

Применение же ДтУ-диизопропил-Л-этиламина в сочетании с хлоридом магния, позволяет повысить выход целевых веществ на 10-15%, по сравнению с использованием классической системы Ратке, содержащей триэтиламин.

R, = CI (17a-f, 18a-f), F (17g, 17h, X7i, 18g, 18h, 18i); R2 = H (17a, 17b, 18a, 18b), CH3 (17c, 17d, 17e, 17g, 17h, 18c, 18d, 18e, 18g, 18h), C2H5 (17f, 17i, 18f, 18i); R3 = H (17a, 17c, 18a, 18c), CH3 (17b, 17d, 17f, 17g, 17i, 18b, 18d, 18f, 18g, 18i), C2HS (17e, 17h, 18e, 18h).

Выделение и очистка целевых веществ (2-тиоурацилы 18a-i, из которых 18c-f и 18h - новые) были выполнены путем осаждения уксусной кислотой из водно-щелочного раствора. Для получения аналитических образцов вещества дополнительно очищались перекристаллизацией из полярных органических растворителей.

Следует отметить, что для некоторых 3-оксоэфиров протекание этой реакции было осложнено экранированием кето-группы алифатическими радикалами. В этой связи, продукты синтеза первоначально выделялись в виде масла, а процедура их очистки дополнялась колоночной хроматографией с гравитационным элюированием в градиенте этилацетата в петролейном эфире (40-70°С).

Реакция £-алкилирования полученных производных 2-тиоксо-2,3-дигидропиримидин-4(1//)-она разнообразными йодистыми алкилами легла в основу получения целевых структур, представляющих практический интерес с точки зрения противовирусной активности и изучения энантиоселективности действия. Эта реакция проводится с использованием карбоната калия в качестве основания, в среде безводного ДМФА, в соответствии со следующим уравнением:

Схема 3

Н5С20(0)С * р

17a-i

18a-i

где:

Схема 4

о

о

'SH

KjCOJ - DMF

AlkHal

'SAlk

18a-i

7-15a-e

где:

Ri = C1 (7-12a-e, 18a-f), F (13-15a-e, 18g, 18h, 18i); R2 = H (7-8a-e, 18a, 18b), CH3 (9-lla-e, 13-14a-e, 18c, 18d, 18e, 18g, 18h), C2H5 (12a-e, 15a-e, 18f, 18i); R3 = H (7a-e, 9a-e, 18a, 18c), CH3 (8a-e, lOa-e, 12a-e, 13a-e, 15a-e, 18b, 18d, 18f, 18g, 18i), C2H5 (lla-e, 14a-e, 18e, 18h); Alk = i-C3H7 (7a-12a), n-C3H7 (7b-12b), i-C4H, (7c-12c), n-C<H, (7d-12d), c-C5H9 (7e-12e).

Полученные соединения (7-15a-e, из которых 7-12a-e, 13b, 14a-e, 15b, 15d -всего 38 - не описаны ранее в литературе) были выделены путем экстрактивной обработки реакционной массы, с последующей хроматографической очисткой и перекристаллизацией из углеводородных растворителей или ацетонитрила.

Химическая структура и чистота полученных веществ определялись с использованием комплекса методов: тонкослойной хроматографии, 'Н-ЯМР-спсктроскопии, масс-спектрометрии и элементного анализа. Содержание основного вещества было установлено на основании данных ВЭЖХ с УФ-детектором (>.=260 нм).

Было установлено, что при регистрации масс-спектров в режиме ионизации электроспреем (МС-ЭСИ) для всех полученных веществ характерным является ион М+1. При анализе спектров 'Н-ЯМР отмечен ряд характеристических групп сигналов, которые условно можно разделить на сигналы атомов водорода бензильного положения, заместителя при С5 пиримидинового гетероцикла, группы IV3 ff, алифатического радикала при экзоциклическом атоме серы, заместителя при бензильном углероде и атомов водорода ароматического ядра.

Основным признаком, позволяющим различить между собой производные, содержащие 2-фтор-6-хлорфенил и 2,6-дифторфенил, является различие характера и взаимного расположения атомов водорода в ароматическом ядре. В области 6.806.90 м.д. в структуре производных 6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(ЗЯ)-она характерным триплетом проявляется сигнал атома водорода положения 4 ароматического ядра, в то время как атомы водорода в положения 3 и 5 дают

мультиплетный сигнал в области 7.10-7.30 м.д. В 2,6-дифтор-замеще1шых соединениях наблюдается обратный порядок взаимного расположения этих сигналов, а имешю: в области 6.80-6.90 м.д. в форме мультиплета регистрируются снгпалт,I атомов водорода при С'3 и С'5 бензольного ядра, а сигнал атома водорода при С* ароматического ядра также дает мультиплетный сигнал в области 7.10-7.30 м.д. Мультиплетность сигналов в этих соединениях в значительной сплюни объясняется их расщеплением на ядрах атома (или атомов) фтора, а взаимное расположение -существенным различием констант Гаммета для атомов фтора и хлора.

2.2. Разделение энантиомеров некоторых производных 2-(алк11лсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфеш1л)эт11л]п1ф11мид1ш-4(ЗД)-оиа и отнесение стереоконфигурацин при бензильном атоме углерода2

С целью изучения взаимосвязи между конфигурацией стереогенных центров, оптической и биологической активностью, для некоторых из наиболее активных производных 2-(алкилсульфшпш)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)гаф1шидш1-4(3#)-она, выявленных в ходе биологических исследований (см. разделы 2.3. и 2.4.), а имешю 2-(етор-бутилсульфанил)-6-[ 1 -(2-фтор-6-хлорфешш)этил]гпфимидин-4(3#)-она (9с), 2-{изопропилсульфанил)-5-метга-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]п1филп1Д1П1-4(3//)-опа (Юа) и 2-(в/иор-бутилсульфаши1)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-хлорфешт)этил]пиримидин-4(ЗЯ)-она (10с) (схема 5), было выполнено разделение последшк на отдельные оптические изомеры:

С1 сн3 (?, где:

= Н; Яг = СН3 (9с) (2 хиральных центра). = СНз; ^ = Н (10а) (1 хиральный центр). К[ = СН3; ^ = СН3 (Юс) (2 хиральных центра)

2 Автор выражает глубокую признательность Cirilli R. (Istituto Superiore di Sanita, Dipartimento del Farmaco) за проведение исследований с помощью хиральной ВЭЖХ.

Схема 5

Для этого была использована полупрепаративная нормальнофазовая жидкостная хроматография на хираяьной фазе СМга1рак 1А с использованием двухканального КД/УФ-детектора. Характерный вид хроматограммы приведен ниже:

>

гС

400200

S 300-,

6J3

^ 150

400 -| 2000

140 -700

0

ее>99% de>99%

—1-Г~

ее>99% de=99%

ее=99% de>99%

—1-Г"

ее>99% de>99%

IL

~г

4

—г 8

—г~ 12

I

16

X

А-

Л

yJkA

(SRH-KC

20

Elution time (min)

Рисунок 1 - Хроматограмма, показывающая разделение ±2-(етср-бугилсульфанил)-6-[1-(2-фгор-6-хлорфенил>гал]1шримидин-4<ЗЯ)-она (9с) с одновременным УФ- (черная кривая) и КД-детектированием (оранжевая кривая). (Ниже приведены кривые контроля чистоты при полупрепаративном разделении, где "ее" - степень энантаомерного обогащения, а "de" - степень диастереомерного обогащения.)

Ввиду того, что спектры кругового дихроизма структурно родственных соединений зависят, в большей степени, от конфигурации хирального бензильного атома углерода, было выполнено сравнение КД-спектров отдельных энантиомеров

полученных веществ и соединений сравнения - (БЛУ и (ДЯ)-диастереомеров 2-(егиор-бутилсульфанил)-6-[ 1 Ч2,6-дихлорфенил)нропил]-5-мепшпиримидин-4(ЗЯ)-она. На основе сопоставления спектров кругового дихроизма отдельных энаютгомеров разделяемых соединений со спектром кругового дихроизма вещества сравнения, руководствуясь эффектом Котгона, был сделан вывод о конфигурации бензильного атома углерода. Соответствующие кривые приведены ниже:

270

Wavelength (nm)

Рисунок 2 - Сопоставление спектров кругового дихроизма отдельных энантиомеров изученных веществ 9с, 10а, «Ос и двух диастереомеров 2-(втср-бутилсульфаннл)-6-[1-(2,6-ДИхлорфенил)пропил]-5-метилпиримидин-4(3#)-она (в этаноле), в координатах эллиптичность (градусы по оси ординат) и длина волны (нм, по оси абсцисс).

Таким образом, было показано, в частности, что правовращающей форме соответствует 2-(изопропилсульфанил)-5-метил-6-[(Ш>1-(2-фтор-6-

хлорфешт)этнл]1шримидин-4(ЗЯ)-он, а левовращающей - 5-изомер этого соединения. Аналогичным образом выполнены отнесения дня веществ 10а, Юс.

23. Биологические исследования рацемических форм полученных

производных 2-(алкилсульфа11Ш1)-6-(2,6-днгалогенбенз11л)пнр1Ш11ДШ1-4(ЗД)-011а

.. J

с использованием инфицированных и квюм-ппфнцпрованпых колонии клеток

Исследования противовирусной активности и цитотоксичности полученных соединений были выполнены с использованием колоний клеток МТ-4, жизнеспособность которых оценивалась с использованием МТТ-метода. Для каждого из веществ были определены значения ЭК5о - 50%-ной эффективной концентрации (приводящей к подавлению цитопатических эффектов ВИЧ-1 в культуре клеток на 50%), ЦК50 - 50%-ной цитотоксической концентрации (приводящей к гибели 50% клеток в контрольной группе) и их соотношение (ЦК50/ЭК50), характеризующее индекс селективности (ИС) вещества. Данные этих исследовашш по веществам-лидерам в сравнешш со стандартами - невирапином (Вирамун) и ифавиренцом (Стокрин) приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Противовирусная активность веществ-лидеров в отношении дикого штамма Ш1Ч-1

10а, 10Ь, 10е Певирапин Пфавиренц

Вещество Alk ЭК50, пмоль ЦК50, пмоль Индекс селективности

10а /-С3Н7 40 >15*10° >375000

10Ь И-С3Н7 50 >15*10ь >30000

10е С-С5Н9 30 >15*10° >500000

Невирапин 120000 >7*10° >62

Ифавирснц 7000 >3*10° >429

3 Автор выражает глубокую признательность Este J. А. (IrsiCaixa, Hospital Universitär! Germans Trias i Pujol, Universität Autönoma de Barcelona) за проведение биологических исследований.

Из данных таблицы видно, что полученные соединения-лидеры с существенным отрывом опережают два ненуклеозидных ингибитора ВИЧ-1, широко применяемых в России.

Аналогичные исследования были проведены также для панели клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ-1. В данном случае, однако, наиболее перспективными оказались и некоторые другие, из числа полученных веществ. • Соответствующие данные приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Противовирусная активность веществ-лидеров в отпошепии клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ-1

Вещество 1*1 »2 А1к ЭК5о, нмоль

КЮЗК У181С У188Ь

10е С1 Н с-С5Н9 93 230 2900

15а Б СНз ¡-С3Н7 530 750 270

15с Б СН3 5-С4Н9 200 300 900

Невирапин 5600 >7000 >7000

Ифавиренц 340 13 1970

В данном случае, с уверенностью можно сказать, что полученные соединения составляют серьезную конкуренцию невирапину, как потенциальные импорт-замещающие средства. В то же время, по совокупности данных, их нельзя назвать безоговорочными лидерами по сравнению с ифавиренцом, который также весьма активно подавляет репликацию рассмотренных мутантных штаммов ВИЧ-1. Таким образом, можно заключить, что несимметричное замещение бензольного ядра в указанных производных обеспечивает соединениям уверенный рост противовирусного действия в отношении дикого штамма ВИЧ-1, в то время как для

достижения широкого спектра действия вещества этого может оказаться недостаточно.

2.4. Этимологические исследования рацемических форм новых производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензнл)пирнмндин-4(ЗЯ)-она4

Ввиду того, ЧТО обратная транскриптаза ВИЧ-1 рассматривается как одна из основных биологических мишеней полученных веществ в жизненном цикле ВИЧ-1, полученные соединения были изучены, как ингибиторы обратной траснкриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и клинически значимых изоформ этого фермента. Эффективность веществ характеризуется величиной ИК50 - концентрацией вещества, приводящей к 50%-ному подавлению активности ревертазы ВИЧ-1. Полученные данные для веществ-лидеров и стандартов приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Ингибирующая активность веществ-лидеров в отношении обратной транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ

Вещество Ri R2 Alk ИК50, мкмоль

wt K103N Y181I L100I

Юс С1 СНз Í-C4H9 3*1(Г4 1.75 35.0 75*10"3

13е F СН3 С-С5Н9 5*10'J 3*10"¿ 0.9 0.3

15с F с2н5 Í-C4H9 6* КГ1 0.14 4.0 4840"'

Невирапин 0.4 7.0 35.0 9.0

Ифавиренц ЗЧО"2 3.0 0.08 ■

Таким образом, можно сделать вывод о том, что наиболее активные из полученных веществ не уступают невирапину, однако несколько проигрывают ифавиренцу в отношении изоформы фермента Y181I. Кроме этого, отчетливо видно, что способность блокировать активность ревертазы у полученных веществ заметно ниже, чем собственно противовирусная активность. Нет также и сильной корреляции между этими двумя параметрами. Это приводит к заключению о том, что полученные соединения оказывают влияние на целый набор биологических

* Автор выражает глубокую признательность начальнику исследовательского отдела Instituto di Genética Molecolare IGM-CNR G. Maga за проведение этимологических исследований.

16

мишеней в жизненном цикле вируса, то есть представляют собой multi-target анти-ВИЧ-1 агенты.

2.5. Биологические {in vitro) и докинговые (in silico) исследования энантиоселективности действия некоторых новых производных 2-

(алкилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин-4(ЗЯ)-она5

Вещества 9с, 10а, Юс, выделенные методом полупрепаративной ВЭЖХ, были исследованы на предмет энантиоселективности действия с использованием инфицированных и квазн-инфицированных колоний клеток МТ-4, а также -рекомбинантной ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ. Данные исследований на колониях клеток суммированы в таблице 4.

Таблица 4 - Противовирусная и цитотокспческая активность соединений 9с, 10а, 10с в отношении дикого и клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ-1

Вещество ЭК<(|, мкмоль ЦК50 ИС (wt)

NL4-3 wt K103N Y181C Y188L

9с (рацемат) 4*10J 1.3 2.3 19.2 >73 >18250

(Я,5)-(+>9с' 11*10° 1.22 1.24 7.4 >39 >3545

(S,S)-(+)-9c" 0.144 7.64 >73.3 >73.3 >73 >507

(R,R)-(-)-9c" З'Ю"4 0.2 0.58 0.86 >31 >103333

(£Я)-(-)-9с' 47*10"J 5.56 13.2 51.6 >52 >1106

10а (рацемат) IMO"1 0.22 0.99 6.3 >73 >730000

(Д)-(-)-10а 3*10s 0.01 0.15 0.35 >23.5 >783333

(5)-(+>10а 0.22 >36.9 >36.9 >36.9 >36.9 >168.7

10с (рацемат) 9*10"* 0.06 0.41 2.1 >70.4 >78222

(Ä,Ä)-(-)-10C 6*10"5 15*10"J 87*10° 0.39 >70.4 >1733333

(£Д)-(-)-10с" H'IO"4 0.15 0.89 3.3 >70.4 >50285

СУ,5)-(+)-Юс" 3.66 3.66 >47 >47 >47 >12.8

(Я,5)-(+)-10с' 43.9 >70 64 >70 >70.4 >1.6

Невирапип 0.12 5.6 >7 >7 >7 >62

Ифавиренц 7* 10° 0.34 13*10° 1.97 >3 >429

5 Автор выражает глубокую признательность Prof. R. Ragno (Rome Center for Molecular Design, Dipartimento di Chimica e Tecnologie del Farmaco, Universitär degli Studi di Roma "La Sapienza") за проведение докинговых исследований и Este J. А. (IrsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universität Autönoma de Barcelona) за проведение биологических исследований.

Из приведенной таблицы отчетливо заметна выраженная связь

противовирусной активности с конфигурацией бензильного атома углерода.

Меньшее влияние оказывает конфигурация стереогенного центра етрр-бутильного б

радикала при атоме серы .

При изучении способности тех же веществ ингибировать активность обратной транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ, были получены результаты, суммированные в таблице 5.

Таблица 5 - Ингибирующая активность соединений 9с, 10а, 10с в отношении обратной транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ

Вещество ик50

K103N У1811 Ы001

9с (рацемат) 13*10'' 10.2 >20 0.13

(Я,5)-(+)-9с' 27*10'' 6.16 >20 0.65

(£5)-(+)-9с" 0.55 >20 >20 2.22

(£Д)-(-)-9с" 38* 10'4 1.61 14.11 69*10"'

(£Д)-(-)-9С 41*10"' 14.8 >20 0.15

10а (рацемат) 15*10'' 3.20 >40 0.50

(Д)-(-)-Юа 9*10"' 0.61 21.19 0.18

(5)-(+)-10а 3.35 >40 >40 1.49

Юс (рацемат) 11*10"' 12.43 >40 0.38

(£ДИ-)-10с' 1*10"' 0.1 3.55 41*10"'

(£Д)-(-)-10с" 14*10"' 0.97 >40 0.52

(£5Н+)-Юс" 4.66 >40 >40 0.91

(£5)-(+)-10с' 5.92 >40 >40 0.60

Невирапин 0.4 7.0 35.0 9.0

Нфавиренц 0.03 3.0 0.08 -

Представленные в таблице результаты, демонстрируют энантиоселективность действия полученных веществ в их способности связываться

6 Конфигурации стереогенных центров, выделенные подчеркиванием, были определены на основе данных исследований по молекулярному моделированию, которые приведены ниже.

с аллостсрическим участком обратной транскриптазы. В данном случае, важный вклад дает как конфигурация бензильного атома углерода, так и стереогенного центра заместителя при атоме серы. Кроме этого, сопоставлехше этих результатов с соответствующими данными по прямой противовирусной активности, еще больше указывают на то, что для этих соединений существуют и другие, не менее значимые биологические мишени ВИЧ-1.

В таблице 6 представлены данные о соотношениях десятичных антилогарифмов величин ИК50, полученные путем расчета и на основе эксперимента. Расчет, направленный на построение модели комплекса биологической мишени - обратной транскриптазы ВИЧ-1 с ингибитором, был выполнен с использованием протокола COMBINEr, при помощи программного пакета Vina Autodock.

Таблица б - Соотношение антилогарифмов расчетных 11 экспериментальных значении нпгнбмрующш концентрации соединении 9с, 10а, Юс в отношении обратной транскрнитазы

дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых нзоформ

Вещество wt K103N Y181I L100I

эксп. выч. эксп. выч. эксп. выч. эксп. выч.

6.262 9.035 4.699 4.531 4.699 5.847 5.654 4.822

(¡£,Л>(+)-9с" 7.570 9.029 5.211 4.69 4.699 6.004 6.188 5.138

ULR)<-> 9с" 8.425 9.277 5.792 5.362 4.850 5.793 7.163 6.932

7.392 9.029 4.83 4.69 4.699 6.596 6.829 7.134

№«)-(-)-Н)с' 9.000 9.299 6.996 7.182 5.450 5.358 7.387 8.514

7.854 9.323 6.012 6.001 4.398 5.665 6.281 6.840

5.331 5.623 4.398 6.000 4.398 5.355 6.040 5.137

5.228 5.204 4.398 5.457 4.398 5.570 6.225 5.357

Дмшые, пр1шедеииые в таблице говорят о хорошей сходимости значений антилогарифмов ингибирующих концентращш, определенных экспериментально и установленных с использованием компьютерного моделирования. Иными словами, эти значения являются мерой констант связывашм или констант устойчивости комплекса фермента с шпибшором. Хорошая сходимость теоретических и

экспериментальных значений, в свою очередь, свидетельствует об адекватности примененной модели, что позволило использовать структуру рассчитанных комплексов для отнесения абсолютной конфигурации стереогенного центра в структуре заместителя при атоме серы. На рисунке 4 представлено графическое соотношение между расчетными и экспериментальными значениями антилогарифмов ингибирующих концентраций.

10,00 <*>И УК1031Ч А11811 »Ь1001

♦ Ф Ф

9,00 Ф ФФ

ч*

г?'8,00

4,00

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Experimental pIC50

Рисунок 3 - Графическое отображение соотношений антилогарифмов расчетных (по оси ординат) и экспериментальных (по оси абсцисс) значений ингибирующих концентраций диастереомеров веществ 9с, 10с.

Структуры комплексов аллостерического участка связывания с двумя оптическими изомерами 2-(втор-бутилсульфашш)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-хлорфеню1)этил]пиримидин-4(ЗЯ)-она, различающимися стереоконфигурацией хирального центра в структуре заместителя при атоме серы приведены на рисунке 4. Для сравнения представлена также структура комплекса ненуклеозидного ингибитора обратной транскрштгазы ВИЧ-1 - делавирдина с аллостерическим участком связывания (экспериментальные данные).

20

(Я.ЙН-И ОС (ЗДК-О-МС Делавирдин

(оранжевый) (голубой) (пурпурный)

Рисунок 4 - Сравнение моделей связывания стереоизомеров (Л.й)-10с' (оранжевый) и 10с" (голубой) с аллостерическим участком связывания (серый) ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 (слева). Комплекс молекулы делавирдина (пурпурный) с аллостерическим участком связывания (серый) ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 (справа).

Для молекулярного моделирования была использована экспериментальная структура комплекса аллостеричеекого участка связывания обратной транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1, представленная в Protein Data Bank под кодом 1KLM. Из этого комплекса была удалена молекула делавирдина, а взамен нее вписана молекула одного из исследуемых веществ, с предварительной оптимизацией геометрии последней. После этого, было выполнено докинговое исследование, которое было направлено на оптимизацию геометрии комплекса, с минимизацией его свободной энергии. В результате, было установлено, что изомер (ДЯХ->«»С обладает гораздо большим сродством к аллостерическому связыванию фермента, чем изомер (S,ftX-)-10c\ В эксперименте это выражается

снижением ингибирующей концентрации в 14 раз. На рисунке 4 хорошо заметна различная ориентация втор-бутильной группы при атоме серы, связанная с абсолютной конфигурацией атома С2 в структуре этого радикала. В свою очередь, такое репозициошфование в/яор-бутила отвечает за увеличение ингибирующей активности вещества.

Глава 3. Экспериментальная часть

Содержит подробное описание методов синтеза полупродуктов и целевых соединений, выделения индивидуальных энангиомеров некоторых из них, а также -информацию о биологических исследованиях полученных веществ.

Выводы

1. Разработан и синтезирован ряд функциональных производных 2-(алишсульфашш)-6-(2,6-дигал0генбенз1ш)шфила1д1ш-4(3я>0на. На примере оптических изомеров некоторых из этих веществ выполнено о тнесение абсолютной конфигурации стереогенных центров их молекул и показана её взаимосвязь с углом вращешм плоскости поляризации и биологическими свойствам! соответствующих энангиомеров.

2. Предложен эффективный и простой метод региоселективного а-С-моноалкилирования 2-(2,6-дигалогенфешш)уксусных кислот с использованием системы лития диизопропиламид - 1,3-диметилгексагидропиримидин-2-он.

3. Усовершенствован способ синтеза этиловых эфиров 4-(2,6-дигалогенфенил)-3-оксобутановых кислот, с использовшшем моноацилирования монокалиевых солей этиловых эфиров 2-алкилмалоновых кислот свободными 2-(2,6-дигалогенфенил)уксусными кислотами, в присутствии модифицированной системы Рапсе (безводный хлорид магния - ЛГЛЧщшзопропил-Т^-этиламин) и Л'.А?'-карбошшдиимидазола, в качестве конденсирующего агента, позволивший в мягких условиях с хорошим выходом получать целевые 3-оксоэфиры.

4. Предложен метод установления абсолютной конфигурации асимметрического атома углерода а-замещешюго 2-фгор-б-хлорбензильного радикала в новых производных 2-(алкилсульфанил>6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(ЗЯ)-она, путем соотнесения спектров кругового дихроизма получешгых соединений со стандартным веществом, выполнено

отнесение, и установлено, что максимум противовирусного действия ассоциируется с Д-конфигурацией этого хирального центра.

5. С использованием программного пакета Autodock Vina и протокола COMBINEr, установлена абсолютная стереоконфигурация хирального алифатического заместителя при атоме серы и её влияние на способ взаимодействия вещества с биологической мишенью. Показан высокий уровень сходимости расчетных и экспериментальных данных о способности вещества к ингибированию обратной транскриптазы ВИЧ-1.

6. На основании данных энзимологических исследований установлено, что основной биологической мишенью действия этих веществ является обратная транскричтаза ВИЧ-1. Модель взаимодействия этих веществ с субстратом реконструирована с использованием подходов молекулярного докинга.

7. Впервые получены вещества, превосходящие по уровню анти-ВИЧ-1 активности невирапин в несколько тысяч, а ифавиренц - в несколько сот раз, при условии сопоставимой или более низкой цитотоксичности. Полученные соединения могут рассматриваться как прототипы при создании новых высокоэффективных противоретровирусных агентов.

Основные публикации по теме диссертации Публикации в журналах, включенных в перечень ВАК

1. Convenient Synthesis of Building-Blocks for Pyridine / Piperidine-Decorated Crown Ethers (Усовершенствованный синтез билдинг-блоков для получения краун-эфиров с пиридиновыми или пиперидиновыми фрагментами) / Навроцкий М.Б., Горбунов Е.Б., Бабушкин A.C., Ручко Е.А., Русинов Г.Л., Чарушин В.Н., Новаков И.А. // Макрогетероциклы = Macroheterocycles. - 2014. - Т. 7, № 1. - С. 18-22.

2. Exploring the Role of 2-Chloro-6-fluoro Substitution in 2-Alkylthio-6-benzyl-5-alkylpyrimidin-4(3#)-ones: Effects in HIV-1-Infected Cells and in HIV-1 Reverse Transcriptase Enzymes / D. Rotili, D. Tarantino, M.B. Nawrozkij, A.S. Babushkin, G. Botta, В. Marrocco, R. Cirilli, S. Menta, R. Badia, E. Crespan, F. Ballante, R. Ragno, J.A. Esté, G. Maga, A. Mai // Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - Vol. 57, No. 12. -P. 5212-5225.

I ь

Тезисы докладов

3. Синтез и сравнительная оценка противовирусной активности конформационно ограниченных карбоаналогов умифеновира / Новаков И.А., Каменева И.Ю., Захарова Е.К., Бабушкин A.C., Навроцкий М.Б. // Междисциплинарный симпозиум по медицинской, органической и биологической химии - 2014. МедОргБиоХим-2014 (МС)БИ-Хим2014), пос. Новый Свет (Крым), 25-28 мая 2014 г. : сб. тез. / МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет [и др.].-[М.], 2014.-С. 104-105.

4. Синтез, цитотоксическая и противовирусная активность новых производных 6-[1-(2,6-дифторфенил)циклопропил]-2-тиотимина / Balzarini J., Бабушкин A.C., Ручко Е.А., Захарова Е.К., Новаков И.А., Навроцкий М.Б. // Уральский научный форум "Современные проблемы органической химии" : сб. тез. (в рамках XVII молодёжной школы-конференции по органической химии, Екатеринбург, 8-12 июня 2014 г.) / Уральский федеральный ун-т [и др.]. - Екатеринбург, 2014. - С. 45.

Подписано в печать 22.10.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 652.

Типография ИУНЛ Волгоградского государственного технического университета. 400005, г. Волгоград, просп. им. В.И. Ленина, 28, корп. №7.