Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правахрукописи

Агапкина Юлия Юрьевна

ИНТЕГРАЗА ВИЧ-1: ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК-СУБСТРАТА НА АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИИ З'-КОНЦЕВОГО ПРОЦЕССИНГА

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН, в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, в.н.с.

Готтих Марина Борисовна

доктор биологических наук, в.н.с. Шугалий Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор Кочетков Сергей Николаевич

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Ведущая организация: Институт химической биологии и

фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится 27 апреля 2004 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 22 марта 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из необходимых для жизненного цикла вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) этапов является интеграция вирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Этот процесс протекает при участии вирусного фермента -интегразы (ИН). Интеграза связывается с определенными последовательностями, расположенными на концах и3 и и5 участков длинных концевых повторов вирусной ДНК, и катализирует две последовательные реакции: З'-концевой процессинг и перенос цепи. Первая реакция происходит в цитоплазме и заключается в отщеплении динуклеотидов ОТ с З'-концов обеих цепей вирусной ДНК. Вторая реакция осуществляется в ядре клетки и представляет собой встраивание процессированной вирусной ДНК в клеточную. Таким образом, для осуществления интеграции ИН должна одновременно связать две молекулы ДНК: вирусную (субстрат) и клеточную (мишень), причем первая из них связывается сиквенс-специфично, а связывание второй не зависит от ее нуклеотидной последовательности. Ингибирование любой из указанных стадий интеграции полностью подавляет развитие вируса. Важно, что ИН не имеет клеточных аналогов и не участвует в процессах жизнедеятельности клетки, поэтому в настоящее время она является одной из основных мишеней для создания новых специфичных препаратов против ВИЧ-1. Однако, процесс создания ингибиторов ИН осложняется недостатком знаний о структуре самой интегразы, её комплекса с ДНК, а также о механизме функционирования этого фермента. Исследование механизма узнавания вирусной ДНК интегразой и механизма ее действия позволит более системно и рационально подойти к созданию ингибиторов этого фермента и в конечном итоге создать эффективный и специфичный ингибитор. Цель работы состояла в выявлении элементов структуры вирусной ДНК, которые определяют специфичность ее взаимодействия- с ИН ВИЧ-1. Для этого использовались рекомбинантный фермент и ДНК-дуплексы, последовательность которых соответствовала сайту узнавания ИН в и5-участке вирусной ДНК, содержащие модифицированные звенья в одной или двух цепях.

В работе решались следующие задачи: (1) изучение влияния модификаций субстрата на его связывание ИН и осуществление З'-концевого процессинга; (2) выяснение зависимости между активностью ИН и дестабилизацией двойной спирали ДНК в районе расщепляемой связи и (3) исследование роли консервативного динуклеотида СА в специфическом взаимодействии субстрата с ИН. Научная новизна и практическая значимость. Синтезирована серия ДНК-дуплексов - аналогов и5-участка ДНК вируса иммунодефицита человека, содержащих в различных положениях одной и/или двух цепей 2'-аминонуклеозиды или остатки 1,3-пропандиола, и изучено их взаимодействие с вирусной ИН.

1 РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА

Обнаружено, что интеграза с одинаковой скоростью и аффинностью связывается с природным Ш-субстратом и модифицированными ДНК-дуплексами. Вместе с тем, использованные модификации значительно влияют на скорость З'-концевого процессинга ДНК. Предложена модель взаимодействия ИН с вирусной ДНК, в соответствии с которой основной вклад вносят контакты ИН с углеводофосфатным остовом первых девяти нуклеотидов ДНК-субстрата, а специфичность взаимодействия, в первую очередь, определяется наличием в структуре ДНК последовательности 5'-СА -3' в 3-ем и 4-ом положениях от З'-конца процессируемой цепи. Показано, что ИН образует контакты с атомом N7 и экзоциклической аминогруппой аденина в 3-ем положении процессируемой цепи субстрата. Предложен метод получения дуплексов с ковалентно связанными цепями на основе олигонуклеотидов, содержащие концевые 2-аминонуклеозиды. С использованием такого дуплекса показано, что расплетание цепей вирусной ДНК не является необходимым условием З'-процессинга. В то же время, для эффективного 3*-процессинга ДНК-субстрата необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой связью. Выявлены различия в формировании активного центра интегразы в присутствии разных кофакторов — Мп2+ или Mg2+, установлено, что специфичность взаимодействия ИН с субстратом существенно выше в присутствии ионов Mg2+, чемИ2о.лученные в работе результаты позволят более грамотно подойти к разработке методов тестирования анти-интегразной активности различных соединений и созданию ингибиторов ИН ВИЧ-1.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 2nd International Conference on Retroviral Integrase, a novel target for the treatment of AIDS, Paris, France, October 28-30 (2001), Ш-ий съезд российского биохимического общества, Санкт-Петербург, июнь-июль (2002), Biophysical society, 48th annual meeting, Baltimore, USA, February 14-18 (2004)

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован ^ff рисунками и таблицами. Библиографический указатель включает в себя ^^цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для изучения взаимодействия ИН с ДНК-субстратом in vitro используют рекомбинантный фермент и синтетические, как правило, 21-звенные ДНК-дуплексы, последовательности которых соответствуют концевым участкам фрагментов U3 или U5 из длинных концевых повторов вирусной ДНК:

2

115-дуплекс Ш-дуплекс

В-цепь 5' -СТСТССААААТСТСТАССАСТ-З' 5' -САСТСААТТАССССТТССАСГ-З' А-цепь 3'-САСАССТТТТАСАСАТССТСА-5' 3'-СТСАСТТААТССССААССТСА-5'

В настоящее время более активно изучается взаимодействие ИН с ДНК-субстратом, представляющим собой и5-концевой участок вирусной ДНК, для этого используют так называемый и5-дуплекс. Та цепь дуплекса, которая подвергается 3'-концевому процессингу, называется процессируемой или В-цепью. Комплементарная ей цепь — непроцессируемая или А-цепь.

1. Дизайн модифицированных аналогов Ш-субстрата интегразы ВИЧ-1

Для изучения взаимодействия ИН с ДНК в настоящей работе были использованы аналоги и5-участка вирусной ДНК, содержащие замены природных нуклеозидов на ненуклеозидные вставки (остатки 1,3-пропандиола) или на 2'-аминонуклеозиды. Известно, что наличие 2'-аминонуклеозида вызывает локальное нарушение структуры ДНК из-за того, что гетероциклическое основание аминонуклеозида выведено из стэкинга с соседними гетероциклическими основаниями. Можно предположить, что это нарушение стэкинга обусловлено тем, что гетероциклическое основание повернуто или отклонено от своего нормального положения в структуре ДНК. Тем не менее, основание присутствует в составе дуплекса и, следовательно, сохраняется возможность образования, по крайней мере, части контактов между ним и белком. При введении ненуклеозидной вставки происходит полное удаление функциональных групп основания, способных взаимодействовать с ИН, и одновременно нарушается локальная структура ДНК, что приводит к нарушению ДНК-белковых взаимодействий и, следовательно, влияет на связывание ДНК и/или осуществление ферментативной реакции.

Необходимо отметить, что литературные данные о влиянии нуклеозидов в различных положениях Ш-субстрата на каталитическую активность ИН часто противоречат друг другу. По разным данным для ИН важны нуклеозиды, расположенные в 3-7-ом, а также в 12-ом положениях Ш-субстрата. Нумерация нуклеозидов Ш-субстрата показана на рисунке 1. Однако, однозначно можно сказать только, что пара С/О, расположенная в 4-ом положении 115-субстрата абсолютно необходима для осуществления интеграции, поэтому 4-е положение мы не исследовали.

Мы заменили природные нуклеозиды в 3-ем, в 5-9-ом и 12-ом положениях ДНК на ненуклеозидную вставку - остаток 1,3-пропандиола (Р). Кроме того, в положения У5-субстрата 3, 6, 7 и 9 были введены 2'-аминонуклеозиды, при этом тимидин

заменялся на 1-(Р-О-2-амино-2-дезоксирибофуранозил)урацил (UN). а 2'-дезоксиаденозин - на 9-(Р^-2-амино-2-дезоксиарабинофуранозил)аденин, ацилированный по 2'-аминогруппе 3-аминопропановой кислотой (aAN) (рис. 1).

р= °"L 1С аА» =

О о NHj TÖ

остаток 1 l-(ß-D-2-aMHHO-2- 9-ф-0-2-амино-2-

1,3-пропандиола дезоксирибофуранозил)урацил дезоксиарабинофуранозил)аденин

12 9 8 7 6 5 3 В-цепь 5' GTGTGGAAAATCTCTAGCAGT 3'

Л-цепь 3' CACACCTTTTAGAGATCGTCA 5'

12 9 17 6 5 3

Рис. 1. Структуры модифицированных звеньев и нумерация нуклеозидов в и5-субстрате ИН.

Необходимо отметить, что замена тимидина на 2'-аминоуридин не должна была повлиять на гидрофобные контакты Ш-субстрата с ИН, поскольку известно, что замена остатков тимидина на 2'-дезоксиуридин в Ш-субстрате практически не влияет на эффективность процессинга [Mazumder, A., et al. 1995].

Для того, чтобы получить полную картину взаимодействия ИН с обеими цепями дуплекса, модифицированы были как процессируемая, так и непроцессируемая цепи. Были получены дуплексы, содержащие модификацию в определенном месте в одной или в обеих цепях 05-субстрата, а также аналог природного субстрата ИН - дуплекс U5B/U5A, не содержащий модификации. Кроме того, был синтезирован дуплекс случайной последовательности (ND), не содержащий сайт узнавания ИН, который можно рассматривать как аналог ДНК-мишени:

5' -GGAATCTAGCGGCGCATAGGT-3' 3' -CCTTAGATCGCCGCGTATCCA-5'

Немодифицированный дуплекс, представляющий собой и5-субстрат ИН, в дальнейшем называется U5B/U5A, при этом U5B - процессируемая цепь или В-цепь, a U5A - непроцессируемая или А-цепь. В названиях модифицированных дуплексов отражается тип и место введения модификации. При этом ненуклеозидная вставка обозначается Р, а 2'-аминонуклеозид - N. Номер в названии цепи (А или В) обозначает положение модификации. Так, например, дуплекс U5B/AP3 - это дуплекс, в котором процессируемая цепь немодифицирована, а нуклеозид в 3-ем положении

непроцессируемой цепи заменен ненуклеозидной вставкой. В дуплексе BN6/AN6 в 6-ое положение обеих цепей введены остатки 2'-аминонуклеозидов.

В первую очередь мы убедились в том, что все синтезированные дуплексы устойчивы в условиях проведения реакции 3'-концевого процессинга: температура 37°С, 20 мМ HEPES, рН 7.2, 7.5 мМ MgCl2. Были получены кривые термической денатурации и определены температуры плавления. Оказалось, что используемые модификации ДНК действительно нарушают её локальную структуру и вызывают уменьшение термической устойчивости на 2,5 - 8,5°С в зависимости от положения и типа модификации, однако в условиях проведения реакции 3'-концевого процессинга все модифицированные дуплексы устойчивы.

2 . Используемая в работе интеграза

Многие исследования подтверждают, что ИН функционирует как мультимер, однако, до сих пор точно не известно, в каком мультимерном состоянии - она находится в природе. В экспериментах in vitro ее мультимерное состояние во многом определяется методом выделения. Большинство описанных в литературе исследований, в которых изучалось влияние структуры Ш-субстрата на его взаимодействие с ИН, проводилось с использованием рекомбинантного фермента, выделенного в присутствии детергентов. Такой способ выделения ИН обусловлен ее высокой склонностью к агрегации. Полученная в присутствии детергента ИН способна связывать и процессировать ДНК-субстрат только при наличии в растворе ионов в качестве кофактора и неактивна или мало активна в присутствии ионов Вместе с тем, именно магний, очевидно, является основным кофактором ИН in vivo. Известно также, что природная ИН связывает один ион Zn2*.. Недавно была разработана методика получения ИН без детергентов в присутствии Такой

фермент способен эффективно • связывать ДНК и осуществлять З'-концевой процессинг в присутствии ионов Мg2+ [Leh, #., et al. 2000]. В настоящей работе для получения рекомбинантной ИН была использована именно эта методика.

3. Связывание интегразы с различными ДНК-дуплексами

Известно, что при проведении реакции интеграции in vitro происходит встраивание субстрата самого в себя, т.е. дуплексы, являющиеся ДНК-субстратами, выступают также в роли ДНК-мишени. Следовательно, Ш-субстрат может взаимодействовать с обоими сайтами связывания ДНК в структуре фермента, связываясь с одним из них как субстрат (специфический комплекс), а со вторым - как мишень (неспецифический комплекс). В настоящей работе, используя модифицированные субстраты, мы попытались изучить, какие нуклеотиды определяют специфичность связывания ИН с вирусной ДНК. Для этого мы

использовали методы торможения в геле, поляризации флюоресценции и фотоиндуцируемого присоединения. Необходимо отметить, что получение количественных характеристик связывания ИН с ДНК затруднено тем, что: 1) неизвестна точная концентрация активных молекул белка, 2) неизвестно точное мультимерное состояние ИН и 3) возможно одновременное образование как специфического, так и неспецифического комплекса ИН с ДНК.

3.1. Изучение связывания интегразы с ДНК методом торможения в геле

Для комплекса ИН, выделенной в присутствии Хп2* и с Ш-субстратом И= 40нМ [Бергв1, Е. & а1, 2004]. Мы исследовали формирование комплексов ИН, взятой в концентрации от 10 до 300 нМ, с 5 нМ дуплексами- модифицированными аналогами Ш-субстрата. Обнаружено, что все модифицированные субстраты способны связываться с ИН, причем картина связывания для всех дуплексов, включая немодифицированный Ш-субстрат, была одинакова. Построенные на основании полученных данных кривые связывания для всех дуплексов совпадали. Кроме того, мы провели конкурентное связывание ИН с Ш-субстратом в присутствии дуплексов U5B/U5A и ND. Оказалось, что образование комплекса ИН с субстратом одинаково подавляется как в присутствии специфического (U5B/U5A), так и неспецифического (ND) конкурента. Следовательно, аффинность ИН ко всем ДНК-дуплексам: модифицированным и немодифицированным субстратам и аналогу ДНК-мишени -оказалась практически одинакова. Однако, поскольку ИН способна связывать свой субстрат как специфически, так и неспецифически, а связывание дуплексов U5B/U5A и ND с ИН одинаково, мы не можем говорить о том, что при связывании субстрата и его аналогов мы наблюдаем именно специфический комплекс.

3.2. Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции Поскольку оказалось, что модификации Ш-субстрата не влияют на его

аффинность к ИН, мы попытались выяснить, оказывают ли они влияние на скорость связывания ДНК ферментом. Для этого был использован метод поляризации флюоресценции. Исследовали связывание 200 нМ ИН с 4 нМ ДНК-дуплексами. Были получены кривые зависимости изменения поляризации флюоресценции от времени, характеризующие связывание ИН с природным и модифицированными субстратами, а также с дуплексом случайной последовательности ND, содержащими флюоресцеин в одной из цепей. На основании полученных кривых связывания рассчитывали равные произведению константы скорости связывания на концентрацию ИН. Оказалось, что все дуплексы связываются с ИН практически с одинаковой скоростью. Различия в их оказались незначительными и находились в пределах ошибки эксперимента.

Таким образом, мы показали, что модификации Ш-субстрата не влияют и на скорость его связывания с ИН.

3.3. Изучение связывания интегразы с ДНК методом фотоаффинной модификации.

Для изучения связывания ИН с ДНК мы также использовали метод фотоаффинной модификации. В качестве фотореагента был выбран арил(трифторметил)диазирин (АТФМД), который при облучении светом с А.=360 нм генерирует высокоактивный карбен, способный реагировать с любой близлежащей группировкой. Были использованы аналоги Ш-участка вирусной ДНК, содержащие АТФМД-группу в составе ненуклеозидной вставки в 3-ем, 5-8-ом и 12-ом положениях или в составе гетероциклического основания в 3-ем положении А-цепи и в 7-ом положении В-цепи.

Образование конъюгатов наблюдалось во всех случаях, с использованием АТФМД-субстратов и неспецифического дуплекса (ND), содержащего АТФМД, однако, эффективность их образования не превышала 3 %. Низкая эффективность образования конъюгата ИН с АТФМД-олигонуклеотидами не позволила нам выделить продукт фотоприсоединения для определения пептида, участвующего в специфическом и неспецифическом связывании ДНК.

Таким образом, мы показали, что используемые нами модификации Ш-субстрата не влияют ни на аффинность, ни на скорость его связывания с ИН. Однако, мы не можем однозначно утверждать, что комплекс ИН/ДНК, фиксируемый нами с помощью доступных нам методов, является специфическим комплексом ИН с ДНК-субстратом. Поэтому в дальнейшем для характеристики взаимодействий ИН с субстратом мы ввели понятие специфической активности, которая подразумевает способность ИН связывать субстрат и осуществлять 3'-концевой процессинг. Мы исследовали влияние модификаций на осуществление первой стадии интеграции, не дискриминируя, на что влияет модификация, на каталитическую активность ИН или на специфическое связывание Ш-субстрата.

4. Влияние модификаций субстрата на специфическую активность интегразы.

Основным этапом нашей работы была оценка влияния структуры Ш-субстрата на способность ИН осуществлять первую стадию интеграции - 3'-концевой процессинг вирусной ДНК. Для того, чтобы строго оценить влияние модификаций ДНК-субстрата на его взаимодействие с ИН, в настоящей работе все эксперименты проводились в присутствии как ионов так и Мп2*.

На 5'-конец 21-звенной процессируемой цепи всех аналогов субстрата вводилась радиоактивно меченая фосфатная группа и проводился З'-процессинг за разные

промежутки времени (0, 5, 10, 15, 20, 30, 45 и 60 минут). Продукты реакции анализировались с помощью электрофореза в ПЛАГ в денатурирующих условиях. Об эффективности реакции в присутствии ионов Мп2+ или М§2+ судили по образованию укороченного 19-звенного олигонуклеотида. На основании полученных данных строили кривые зависимости эффективности реакции от времени и определяли начальные скорости реакции как тангенс угла наклона касательной к начальному участку кривой. Все эксперименты воспроизводились как минимум три раза.

Следует еще раз отметить, что поскольку мы не могли выяснить, на что влияет модификация субстрата, на его специфическое связывание или на каталитическую активность ИН, мы не ставили перед собой задачи определить кинетические параметры реакции, такие как ккат и Км. Мы исследовали, как влияет модификация и5-субстрата ИН на скорость З'-процессинга по сравнению с З'-процессингом немодифицированного субстрата, скорость расщепления которого была принята за 1.

Анализируя полученные результаты, можно выделить пять участков в структуре субстрата, модификация которых по-разному влияет на специфическую активность ИН.

4.1. Модификации нуклеозидов в 3-ем положении У5-субстрата

Мы обнаружили, что замена третьего аденозина в процессируемой цепи дуплекса (В-цепь, рис. 1) на ненуклеозидную вставку (дуплекс ВР3/и5А) приводит к

полному ингибированию З'-процессинга.

Таблица 1. Влияние модификаций 3-го положений Ш-субстрата на относительную начальную скорость З'-процессинга в присутствии ионов Мп2+ или Mg2\ Скорость З'-процессинга U5B/U5A принята за 1.

как в присутствии ионов (табл. 1). Напротив, при введении ненуклеозидной вставки в 3-е положение А-цепи скорость З'-концевого процессинга увеличивалась по сравнению с немодифицированным субстратом.

Введение 2'-аминонуклеозида в 3-е положение В-цепи (дуплекс ВК3/ША) практически не сказывалось на скорости реакции З'-концевого процессинга в присутствии ионов (табл. 1). Однако в присутствии ионов введение 2'-

аминонуклеозида в это положение практически полностью ингибировало З'-концевой процессинг. Замена на 2'-аминонуклеозид в А-цепи (дуплекс ШВ/АШ), также как и замена на ненуклеозидную вставку (дуплекс ШВ/АР3) приводила к стимуляции З'-концевого процессинга в присутствии ионов обоих металлов.

Название Уо отн

Ш2' W*2'

BP3/U5A 0 0

U5B/AP3 1,28 ±0,07 1,31 ±0,08

ВРЗ/АРЗ 0 0

BN3/U5A 0,86 ± 0,08 0,12 ±0,01

U5B/AN3 1,27 ±0,09 1,25 ±0,07

BN3/AN3 2,14 ±0,11 0

На основании полученных данных можно сделать ряд важных выводов. Во-первых, гетероциклическое основание в 3-ем положении В-цепи вирусной ДНК абсолютно необходимо для осуществления 3'-концевого процессинга, поскольку его удаление (дуплекс U5A/BP3) критично для специфической активности ИН. Во-вторых,. обнаружено, что введение 2'-аминонуклеозида в 3-е положение В-цепи влияет на активность ИН только в присутствии ионов и практически не влияет при использовании в качестве кофактора ионов Мп2+. Эти данные подтверждают высказанное ранее в литературе предположение о разной структуре активного центра ИН в присутствии ионов Мпг* и [Esposito, Б. et al, 1998]. Необходимо

подчеркнуть, что ион металла координируется аминокислотами DDE-мотива ИН, необходимыми для проявления каталитической активности [Ки1^ку, 7. et а1, 1992; Оо^иг, У. et а1, 1998]. Как было описано в разделе 1, при введении 2'-аминонуклеозида, происходит локальное нарушение структуры дуплекса, в результате чего, некоторые из атомов, с которыми могут взаимодействовать аминокислотные остатки ИН, оказываются выведенными из обычного положения. В присутствии ионов когда активный центр фермента более подвижен, он может

подстроиться под новую структуру субстрата и восстановить необходимые контакты. В присутствии активный центр фермента строго организован и не может

"узнать" модифицированный субстрат. Все эти данные свидетельствуют о том, что в этом месте осуществляется важный для специфической активности ИН контакт с гетероциклическим основанием.

Следующий важный вывод связан с наблюдаемой нами стимуляцией процессинга при модификации А-цепи дуплекса. Этот результат, прежде всего, указывает на то, что гетероциклическое основание в этом положении никак-не взаимодействует с ИН. Кроме того, известно, что участки

увеличивают локальную конформационную подвижность ДНК и вызывают изгиб двойной спирали, что может играть существенную роль в ДНК/белковом узнавании. Динуклеотид СА является консервативным среди ДНК-субстратов различных интеграз, поэтому можно предположить, что изгиб ДНК рядом с точкой гидролиза фосфодиэфирной связи важен для успешного протекания реакции, катализируемой ИН. Следовательно, модификации ДНК, которые увеличивают ее подвижность и возможность такого изгиба, должны увеличивать каталитическую активность ИН. Обе используемые нами модификации вызывают локальную дестабилизацию дуплекса. Именно этим можно объяснить стимуляцию процессинга, обнаруженную нами для дуплексов U5B/AP3 и U5B/AN3.

4.2. Модификации нуклеозидов в 5-ом и 6-ом положениях Ш-субстрата

По нашим данным, модификации нуклеозидов в 5-ом и 6-ом положениях U5-субстрата одинаково влияют на специфическую активность ИН. Удаление гетероциклических оснований путем замены нуклеозидов на остатки 1,3-пропандиола резко снижало скорость З'-процессинга (табл. 2). Замена природных нуклеозидов в 6-ом положении на 2'-аминонуклеозиды также снижала скорость З'-процессинга, хотя и несколько в меньшей степени. В результате анализа данных, полученных в нашей работе и опубликованных в литературе, можно сделать следующий вывод: чем сильнее нарушение структуры двойной спирали в положениях 5 и 6, тем сильнее ингибируется З'-процессинг. Негативное влияние на активность ИН оказывают не только те модификации, которые нарушают уотсон-криковские взаимодействия, но и те, при которых комплементарные пары сохраняются, но меняется тонкая структура двойной спирали. Например, замена 5-ой пары G/C на Т/А, а 6-ой пары А/Т на C/G существенно снижает эффективность З'-процессинга, в то время как их замена на аналогичные, но инвертированные пары (G/C на C/G, а А/Т на Т/А) не оказывает

значительного влияния [Scottoline, B.P. et al, 1996; Esposito, D andCraigie, Я, 1998].

Важно, что в U5- и Ш-субстратах 5-я и 6-я пары нуклеотидов инвертированы (AG/CT в U5 и TC/GA в U3), таким образом, можно предположить, что в районе 5-го и 6- -го положений субстрата ИН узнает не гетероциклические основания, а некую тонкую структуру углеводофосфатного остова ДНК, которая обеспечивается наличием пары G/C (или C/G) в 5-ом положении и пары А/Т (или Т/А) в 6-ом. Тот факт, что модификации А-цепи сильнее влияли на З'-процессинг, чем модификации В-цепи (табл. 2), позволяет нам предположить, что ИН взаимодействует с непроцессируемой цепью субстрата в

Также важно, что влияние модификаций субстрата сильнее сказывалось в присутствии ионов Mgi+, ч е м(¥а б л . 2). Такой же эффект мы обнаружили для 3-го положения В-цепи субстрата (раздел 4.1), которое, по литературным данным [Jenkins, T.M. et al, 1997], взаимодействует с каталитическим доменом,

Таблица 2. Влияние модификаций 5-го и 6-го положений Ш-субстрата на относительную начальную скорость З'-процессинга в присутствии ионов Мл2* или Mg2*. Скорость З'-процессинга U5B/U5A принята за 1.

Название Vo отн.

Мп" м**

BP5/U5A 0,31 ±0,02 0,1 ±0,01

U5B/AP5 0,11 ±0,02 0

ВР5/АР5 0,09 ±0,01 0

BP6/U5A 0,34 ±0,04 0,21 ±0,03

U5B/AP6 0,18 ±0,02 0

ВР6/АР6 0,21 ±0,04 0

BN6/U5A 0,46 ±0,06 0,29 ±0,03

U5B/AN6 0,41 ±0,03 0

BN6/AN6 0,19 ±0,03 0

большей мере, чем с процессируемой.

координирующим ион металла в активном центре ИН. Аналогичная зависимость ингибирующего влияния модификаций 3-его, 5-го и 6-го положений субстрата от природы металла-кофактора позволяет нам предположить, что все они взаимодействуют с каталитическим доменом ИН.

4.3. Модификации нуклеозидов в 7-ом и 8-ом положениях Ш-субстрата

В работе [Esposito, D and Craigie, Я, 1998] показано, что нуклеотидные замены в 7-ом и 8-ом положениях при сохранении комплементарности ДНК не оказывали практически никакого влияния на протекание З'-процессинга ни в присутствии Мп2+, ни Mg2+, из чего можно сделать вывод о том, что ИН не взаимодействует с гетероциклическими основаниями в этих положениях вирусной ДНК.

В нашей работе обнаружено, что замена 7-го и 8-го нуклеозидов В-цепи на ненуклеозидную вставку (дуплексы BP7/U5A и BP8/U5A) не значительно сказывалась на скорости З'-концевого процессинга (табл. 3). Вместе с тем, ненуклеозидная вставка в тех же положениях А-цепи дуплекса (дуплексы U5B/AP7, U5B/AP8) заметно снижала скорость реакции. Замена 7-го нуклеозида в А-цепи на 2'-аминонуклеозид (дуплекс U5B/AN7) также снижала скорость З'-процессинга (табл. 3). Поскольку гетероциклические основания не взаимодействуют с ИН, полученный результат позволяет предположить, что для ИН важны контакты с углеводофосфатным остовом А-цепи Ш-субстрата. Используемые нами модификации ДНК повышают конформационную подвижность углеводофосфатного остова и мешают

формированию контактов ИН с

Таблица 3. Влияние модификаций 7-го и 8-го положений U5-cy6crpaxa на относительную начальную скорость З'-процессинга в присутствии ионов Мп3+ или Mg2*. Скорость З'-процессинга U5B/U5A принята за 1.

Название Го отн

Мп2* мг

BP7/U5A 0,83 ± 0,08 1,10 ± 0,12

U5B/AP7 0,41 ±0,03 0,43 ± 0,04

ВР7/АР7 0,44 ±0,07 0,69 ±0,11

BN7/U5A 1,52 ±0,10 1,81 ±0,13

U5B/AN7 0,57 ±0,10 0,73 ± 0,08

BN7/AN7 1,24 ±0,08 1,58 ±0,11

BP8/U5A 0,93 ± 0,07 0,92 ±0,08

U5B/AP8 0,68 ± 0,06 0,44 ±0,08

ВР8/АР8 0,81 ±0,09 0,79 ±0,07

фосфатными группами.

Необходимо также отметить, что, в отличие от модификаций положений 3, 5 и 6, модификации 7-ого и 8-ого положений Ш-субстрата оказывали приблизительно одинаковое влияние на специфическую активность ИН в присутствии ионов обоих металлов (табл. 3). Это указывает на то, что эти положения ДНК взаимодействуют не с каталитическим доменом ИН, структура которого зависит от металла-кофактора, а с другим доменом, не связывающим металл. Действительно, ранее методом фотоиндуцируемого присоединения ИН к субстрату, содержащему в 7-ом

положении В-цепи 2'-дезокси-5-йодуридин, был обнаружен контакт с С-концевым доменом HH[Esposito, D andCraigie, R., 1998].

В связи с этим интересен еще один результат, полученный в нашей работе. Оказалось, что 2'-аминонуклеозид в седьмом положении В-цепи субстрата (дуплекс BN7/U5A) стимулировал реакцию З'-концевого процессинга (табл. 3). Этот эффект можно объяснить следующим образом. Находящаяся в 2'-положении нуклеозида аминогруппа может формировать дополнительный контакт с ИН, стимулирующий специфическую активность последней. Такой контакт могла бы образовать карбоксильная группа остатка Asp или Glu в С-концевом домене. Действительно, в литературе высказывается предположение о том, что остаток Glu246 расположен рядом с 7-ым положением ДНК-субстрата [Podtelezhnikov, АЛ. et ai, 2002]. Для того, чтобы проверить, действительно ли обнаруженная стимуляция З'-процессинга вызвана присутствием 2'-аминогруппы, мы обработали олигонуклеотид BN7, содержащий 2'-аминоуридин янтарным ангидридом. При этом был получен олигонуклеотид BN7ac, у которого в 2'-положении фуранозного кольца 7-го нуклеозида содержалась карбоксильная группа:

Понятно, что эта группа уже не может формировать электростатический контакт с 01и246. Мы провели реакцию З'-концевого процессинга в дуплексе ВК7ас/ША. Оказалось, что этот дуплекс процессировался с той же скоростью, что и немодифицированный субстрат. Таким образом, было показано, что стимуляция З'-концевого процессинга субстрата, содержащего 2'-аминонуклеозид в седьмом положении В-цепи, действительно вызвана наличием аминогруппы в 2'-положении фуранозы. Важно также отметить, что 2'-аминогруппа располагается в малой бороздке ДНК, следовательно, ИН взаимодействует с вирусной ДНК в районе 7-го положения со стороны малой бороздки.

4.4. Модификации нуклеозидов в 9-ом положении У5-субстрата

Необходимо отметить, что в 9-ом положении и5- и Ш-субстратов находятся разные пары нуклеотидов, следовательно, контакты гетероцикличесих оснований в этом положении с ИН маловероятны.

BN7

BN7-ac

5' GTGTGGAAAATCTCO-AGCAGT 3' 5' GTGTGGAAAATCTCtr-acAGCAGT 3'

О

О

В нашей работе было показано, что как 2'-аминонуклеозид, так и ненуклсозидная вставка, введенные в 9-е положение Ш-дуплекса снижали скорость З'-концевого процессинга (табл. 4). Причем, одинаковое влияние наблюдалось и для В-, и для А-цепи. Кроме того, ненуклеозидная вставка снижала скорость процессинга сильнее, чем 2'-аминонуклезид. При введении модификаций в обе цепи дуплекса (дуплексы АР9/ВР9 и ДМ9/ВК9) происходило еще большее снижение скорости реакции. Следует отметить, что введение модификаций в 9-е положение вирусной ДНК оказывало одинаковое влияние на протекание реакции З'-концевого

процессинга как с участием ионов

Таблица 4. Влияние модификаций 9-го положения 115-субстрата на начальную скорость З'-процессинга в присутствии ионов Мп2* или Скорость З'-процессинга 115В/и5А принята за 1.

Название Уо отн

Ш2' мк"

ВР9/115А 0,59 ± 0,05 0,62 ± 0,08

ШВ/АР9 0,62 ± 0,09 0,61 ±0,05

ВР9/АР9 0,48 ± 0,04 0,53 ± 0,05

ВМ9/и5А 0,92 ±0,10 0,94 ± 0,09

и5В/А№ 0,83 ± 0,03 0,79 ±0,07

В№/А^ 0,54 ± 0,04 0,67 ±0,10

марганца, так и магния.

В нашей работе использовались модификации, вызывающие локальное нарушение структуры дуплекса. Вероятно, наблюдаемое нами уменьшение начальной . скорости 3'-процессинга связано с нарушением структуры ДНК. Именно поэтому скорость З'-процессинга сильнее снижается при замене нуклеозидов на ненуклеозидные вставки, сильнее нарушающие структуру, чем 2'-аминонуклеозиды. По этой же причине модификация обеих цепей дуплекса, которая приводит к большей дестабилизации двойной спирали, оказывает большее влияние на взаимодействие с ИН.

Таким образом, полученные результаты позволяют нам утверждать, что ИН взаимодействует с 9-ым положением и5-субстрата. Очевидно, формируются контакты между С-концевым доменом белка и углеводофосфатным остовом ДНК, при этом, в отличие от 7-го и 8-го положений, для специфической активности ИН одинаково важны контакты и с А-, и с В-цепью. 4.5. Модификации нуклеозидов в 12-ом положении У5-субстрата

В нашей работе введение ненуклеозидных вставок в 12-ое положение вирусной ДНК никак не сказывалось на специфической активности ИН. Скорость реакции З'-концевого процессинга дуплексов ШД/ВР12, АР12/ШВ и АР12/ВР12 не изменялась по сравнению с немодифицированным субстратом ни в присутствии ионов марганца, ни в присутствии ионов магния.

Таким образом, на основании полученных нами результатов и анализа литературных данных, можно предложить следующую модель образования активного

комплекса, в котором ИН может осуществлять З'-процессинг. ИН взаимодействует, по крайней мере, с первыми девятью нуклеотидами ДНК-субстрата, причем основной вклад в это взаимодействие вносят ее контакты с углеводофосфатным остовом. Что касается гетероциклических оснований ДНК, то однозначно можно утверждать, что с ИН взаимодействуют основания нуклеотидов из обеих цепей в 4-ом положении субстрата и аденин в 3-ем положении В-цепи. С положениями 3-6 взаимодействует каталитический домен ИН, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен. Необходимо также отметить, что гетероциклические основания из 1-ого и 2-ого положений субстрата, очевидно, не взаимодействуют с ИН, поскольку замены концевых нуклеотидов на другие нуклеотиды, приводящие к нарушению комплементарности, стимулируют З'-процессинг [Scottoline, В P. et al., 1996]. В положениях 5-6 необходимо наличие последовательности 5'-AG/CT-3' или 5'-TC/GA-3\ однако ИН взаимодействует не с гетероциклическими основаниями, а с углеводофосфатным остовом вирусной ДНК. Из этой модели следует, что специфичность взаимодействия ИН с вирусной ДНК, в первую очередь, определяется наличием в структуре последней последовательности 5'-СА -3' в 3-ем и 4-ом положениях от З'-конца В-цепи.

5. Влияние дестабилизации двойной спирали ДНК в районе расщепляемой связи на активность интегразы Последовательность CA/TG присутствует в структуре субстратов всех вирусных интеграз и большинства транспозаз [Lee, I. and Harshey, R.M., 2003] и именно она, в первую очередь, необходима для эффективного З'-процессинга вирусной ДНК. Однако, остается непонятным, почему ИН расщепляет ДНК только около СА последовательности на конце вирусной ДНК и не способна катализировать гидролиз межнуклеотидных связей в ее внутренней части. Существует гипотеза, согласно которой необходимым условием З'-процессинга является предварительное разрушение комплементарных пар оснований на конце ДНК-субстрата [Scottoline, В P. et al, 1996]. Для того чтобы проверить правильность указанной гипотезы, в настоящей работе было предложено использовать аналог 05-субстрата, содержащий ковалентную связь между цепями ДНК в концевой паре нуклеотидов. Такая связь должна стабилизировать двойную спираль и препятствовать "раскрытию" концевых пар нуклеотидов. Понятно, что, если ИН способна процессировать такой субстрат, то можно однозначно утверждать, что "расплетание" двойной спирали на конце ДНК не является обязательным. И наоборот, отсутствие З'-процессинга ковалентно связанного субстрата будет свидетельствовать в пользу того, что ИН способна

гидролизовать фосфодиэфирную связь только в том случае, если комплементационные взаимодействия на конце ДНК нарушены.

Для получения аналога субстрата с ковалентно связанными цепями (ВМас-) использовали ДНК-дуплекс ВМас/АМ, содержащий в В-цепи З'-концевой остаток 2'-аминоуридина, в котором аминогруппу ацилировали янтарным ангидридом (цепь ВМас), а в А-цепи - 5'-концевой остаток 2'-аминоарабиноаденозина (цепь А№) Аминную и карбоксильную группы конденсировали под действием водорастворимого 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимида.

Продукт выделяли с помощью электрофореза в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Эффективность образования сшитого дуплекса ВМас-АМ составила 37%

Существенным моментом являлось то, что ковалентное соединение цепей осуществлялось непосредственно в структуре ДНК-дуплекса. Это значит, что "сшивка" не могла вызывать дополнительных искажений в геометрии двойной спирали по сравнению с теми, что уже имелись в структуре исходного модифицированного аналога и5-субстрата. Следовательно, отсутствие 3'-процессинга в том или ином случае могло быть связано именно с невозможностью "расплетания" цепей, а не с дополнительным нарушением структуры ДНК в результате их соединения.

Мы проверили, как влияет введение модификаций, необходимых для получения ковалентно связанного дуплекса, и дальнейшее соединение цепей на специфическую активность ИН. Оказалось, что модификации в обеих цепях снижали скорость З'-концевого процессинга дуплекса ВМас/АМ по сравнению с немодифицированным субстратом и5В/и5А (рис. 2). Ковалентное соединение цепей (дуплекс ВМас-АМ) еще сильнее снизило скорость реакции, однако этот дуплекс процессировался (рис. 2) Полученный результат однозначно указывает на то, что «расплетание» концов вирусной ДНК не является обязательным условием З'-концевого процессинга.

Снижение эффективности расщепления дуплекса ВМас-А№, в котором ковалентное соединение цепей стабилизировало двойную спираль, по сравнению с исходным дуплексом ВМас/А№, указывает на то, что некоторая дестабилизация ДНК, тем не менее, необходима для нормального протекания З'-процессинга. Этот

факт, а также обнаруженное нами увеличение скорости З'-процессинга при модификации 3-его положения А-цепи (раздел 4.1) указывают на то, что для З'-процессинга необходима локальная дестабилизация ДНК в районе расщепляемой связи. Неспособность ИН катализировать гидролиз межнуклеотидных связей около динуклеотида СА во внутренней части ДНК, скорее всего, объясняется тем, что на концах двойной спирали пары оснований менее стабильны, чем внутри дуплекса.

А.

Дуплекс ' BN13C-AN1

Б.

-21-зв. -19-зв.

123 43(789

Дуплекс U5B/U5A BNlac/ANl BNlac-ANl

Эффективность З'-процессинга, % 1ч 12,6 ±0,6 8,4 ±0,5 3,2 ±0,7

2ч 19,4 ±0,8 12,0 ± 0,6 53 ±0,6

Рис. 2. Влияние модификаций конца US-субстрата на эффективность 3'-концевого процессинга. А. Анализ продуктов З'-процессинга в денатурирующем 20% ПААГ. Субстрат U5B/U5A после инкубации с ИН в течение 1 ч (дорожка 2) и 2 ч (дорожка 3); дуплекс BN1-ac/ANl после инкубации с ИН в течение 1 ч (дорожка 5) и 2 ч (дорожка 6) и сшитый дуплекс BN1-AN1 после инкубации с ИН в течение 1 ч (дорожка 8) и 2 ч (дорожка 9). Дуплексы без ИН U5B/U5A (дорожка 1), BNl-ac/ANl (дорожка 4), BN1-AN1 (дорожка 7). Б. Эффективность З'-процессинга исследуемых дуплексов после 1 и 2 часов инкубации.

6. Изучение контактов аденина в третьем положении процессируемой цепи с

интегразой

Для эффективного процессинга субстрата ИН, в первую очередь, важно именно локальное нарушение его структуры в районе расщепляемой связи, которое в случае вирусной ДНК обеспечивается за счет повышенной конформационной подвижности CA/TG участка. Вместе с тем, важность последовательности СА для эффективного З'-процессинга вирусной ДНК нельзя объяснить только изгибом двойной спирали. Предполагается, что Lysl59 из каталитического домена ИН взаимодействует с N7-атомом 2'-дезоксиаденозина из этой последовательности [Jenkins, Т.М. et al, 1997]. Этот контакт важен для активности ИН, поскольку замена аденина на 7-деазааденин приводит к трехкратному снижению эффективности З'-процессинга [Wang, Т. et al, 1999]. Кроме того, в нашей работе аналог 05-субстрата, не содержащий аденина (дуплекс BP3/U5A) и, следовательно, неспособный образовать водородные связи с

ИН, вообще не процессировался (раздел 4.1). Вместе с тем, аналог Ш-субстрата, содержащий вместо 2'-дезоксиадеиозииа в 3-й позиции В-цепи апуринизованный остаток нуклеозида, в присутствии Мп2+ процессировался также эффективно, как немодифицированный субстрат[Mazumder,A. and Pommier, Y., 1995].

Для того, чтобы более подробно исследовать взаимодействие ИН с аденином из консервативной последовательности СА, мы провели З'-процессинг аналогов U5-субстрата, содержащих в 3-ем положении процессируемой цепи вместо 2'-дезоксиаденозина остатки других нуклеозидов. Дуплексы BG3/AP3, ВТЗ/АРЗ и ВСЗ/АРЗ содержали в качестве гетероциклического основания в 3-ем положении В-цепи гуанин, тимин и цитозин соответственно. В качестве непроцессируемой цепи во всех случаях использовался олигонуклеотид АРЗ. Скорости З'-процессинга этих дуплексов сравнивались с субстратом U5B/U5A Общей чертой всех модифицированных дуплексов являлось отсутствие комплементарной пары в 3-ем положении. Оказалось, что в присутствии ионов Mg2+ дуплексы, не содержащие аденин, BG3/AP3, ВТЗ/АРЗ и ВСЗ/АРЗ, плохо подвергались З'-процессингу. В то же время, в присутствии ионов ИН гидролизовала все аналоги субстрата, и

скорость их З'-процессинга зависела от природы основания, заменяющего аденин (рис. 3). А.

м92+ МП*

О 20 40 60 80 о 20 40 60 80

время, мин время, мин

Б.

Дуплекс U5B/U5A BG3/AP3 ВСЗ/АРЗ ВТЗ/АРЗ

Уо отн. (Mg1*) 1,00 0,21 ±0,05 0,19 ±0,07 0,29 ±0,06

Vo отн. (Мп2*) 1,00 0,62 ±0,10 0,51 ±0,04 0,88 ± 0,07

Рис. 3. З'-процессинг аналогов Ш-субстрата, содержащих нуклеотидные замены в 3-ем положении процессируемой цепи в присутствии ионов Mg2+ или Мп2+. А. Кинетические кривые З'-процессинга. Б. Значения относительных начальных скоростей З'-процессинга.

Для того чтобы объяснить полученные результаты мы проанализировали, какие водородные связи может формировать с ИН остаток аденина в структуре U5-субстрата, и сравнили их с тем, какие водородные связи могут образовывать С, G и Т, а также 7-деазааденин (7-деазаА) и апуринизованный остаток нуклеозида (АН) (рис. 4). В структуре 115-субстрата 3-ий аденин способен взаимодействовать с ИН со стороны большой бороздки за счет атома N7 (акцептор протона) и экзоциклической аминогруппы (донор протона). Также возможны контакты со стороны малой бороздки (N3 - донор протона). В случае 7-деазаА контакт с N7 отсутствует, что снижает эффективность З'-процессинга в присутствии ионов Мп2+ на 70-75% [Wang, Т. et al, 1999]. В случае АН возможно формирование двух водородных связей с ИН за счет альдегидной группы при С1' (акцептор протонов) и гидроксильной группы при С4* (донор протонов) (рис. 4).

Рис. 4. Водородные связи, которые могут образовывать различные гетероцикличиские основания с аминокислотами интегразы. Стрелкой указано направление от донора протона к акцептору.

Поскольку АН-содержащий субстрат процессировался с той же эффективностью, что и природный [Mazumder, A. and Pommier, Y., 1995], можно предположить, что для формирования активного фермент-субстратного комплекса достаточно двух водородных связей, т.е. основные контакты осуществляются ИН со стороны большой бороздки ДНК. Ранее взаимодействие ИН с консервативным аденином со стороны большой бороздки ДНК было показано в работе [Wang, Т. et al, 1999]. В этом случае остатки цитозина и гуанина могут образовать только по одной водородной связи (N7 в G и NH2 в С, рис. 4). Соответственно скорость З'-процессинга

дуплексов ВСЗ/ЛРЗ и BG3/AP3 составляет 50-60% (Мп2+) от природного субстрата U5 (рис. 3), а эффективность (20-25% за 1ч) сравнима с эффективностью 3'-процессинга субстрата, содержащего 7-деазаА [Wang. Т. et ai, 1999]. Остаток тимина, участвующий в образовании комплементарной пары, не может формировать водородные связи с белком со стороны большой бороздки. Соответственно, ИН не процессирует дуплекс, содержащий пару Т/А вместо АУТ в 3-ем положении [Scottoline, В.P. et al, 1996]. Однако, если комплементарной пары нет, возможно формирование такой же пары водородных связей, как и в случае аденина. В качестве акцептора протона в тимине может выступать карбонильная группа при С4, а в качестве донора иминная группа (рис. 4).

Понятно, что геометрия всех контактов, которые могут образовать с активным центром ИН остатки G, С, Т и АН, существенно отличается от геометрии контактов, образуемых аденином. В присутствии ионов активный центр ИН жестко

организован (раздел 4.1.) и не способен узнать модифицированный субстрат, поэтому З'-процессинг идет плохо. В присутствии же ионов Мп2+ структура активного центра более гибкая и подвижная, он способен подстроиться к измененной структуре субстрата и осуществить гидролиз межнуклеотидной связи. Таким, образом, получение результаты еще раз показали, что специфичность ИН по отношению к субстрату существенно выше, если в качестве кофактора используется ион

Таким образом, на основании анализа всех полученных нами результатов и литературных данных, мы можем сделать вывод о том, что во взаимодействии с ИН принимает участие не только N7-aTOM консервативного аденина из последовательности СА, но и его экзоциклическая аминогруппа.

ВЫВОДЫ

1. Синтезирована серия ДНК-дуплексов - аналогов и5-участка ДНК вируса иммунодефицита человека, содержащих в различных положениях одной и/или двух цепей 2'-аминонуклеозиды или остатки 1,3-пропандиола, и изучено их взаимодействие с вирусной ИН. Установлено, что использованные модификации не влияют на связывание ДНК-субстрата интегразой, но значительно влияют на скорость его З'-концевого процессинга.

2. Показано, что специфичность взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом существенно выше в присутствии ионов магния, чем марганца.

3. Предложена модель взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом, согласно которой:

• интеграза взаимодействует, по крайней мере, с первыми девятью нуклеотидами ДНК, причем основной вклад в это взаимодействие вносят ее контакты с углеводофосфатным остовом;

• специфичность взаимодействия определяется последовательностью нуклеозидов в 3-6 положениях от З'-конца процессируемой цепи, и в первую очередь динуклеотидом СА;

• во взаимодействии с интеграза участвуют К7-атом и экзоциклическая аминогруппа консервативного аденина из последовательности СА;

• с положениями 3-6 взаимодействует каталитический домен интегразы, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен.

4. Установлено, что для З'-концевого процессинга вирусной ДНК необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой межнуклеотидной связью и не требуется полного разрушения комплементарных пар на конце ДНК.

1

2

3

4

5

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Ю.ЮАгапкина. Д.ВАгапкин, А.В.Загородников, Я.И.Алексеев, Г.А.Коршунова, М.Б.Готтих. Синтез олигонуклеотидных производных, содержащих 1-(4-(3-(трифторметил)-3Н-диазирин-3-ил)бензамидо)-2,3-

пропандиол, для фотоаффинной модификации белков и нуклеиновых кислот. // Биоорганическая химия. 2002. Т.28. С. 324-331.

МА. Смолов, Ю.Ю. Агапкина, Е.М. Зубин. Новый подход к синтезу ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. // ДАН. 2003. Т. 390. С. 783-786. Agapkina J., Smolov M., Zubin E., Mouscadet J.-F., Gottikh M. HIV-1 integrase can process a З'-end crosslinked susbtrate: Implications of DNA end fraying during the 3f-processing reaction // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 205-211. Agapkina Y.. Zagorodnikov A., Gottikh M., Mouscadet J-F. Interaction of HIV-1 Integrase with photo-reactive analogs of the viral DNA. // 2nd International Conference on Retroviral Integrase, a novel target for the treatment of AIDS. October 28-30, 2001. Paris, France.

Агапкина Ю.Ю.,. Смолов MA, Приказчикова Т.А., Зубин Е.М., Готтих М.Б. Взаимодействие интегразы вируса иммунодефицита человека с модифицированными аналогами вирусной ДНК // III съезд российского Биохимического общества. 26.06.-1.07.2002. Санкт-Петербург, Россия.

№ - 6 5 3 О

Подписано в печать 19 марта 2004 г. Заказ 403. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф. Москва, Б. Якиманка, 13, оф. 410. Тел. 778-97-47

Список принятых сокращений.

Введение.

I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧобзор литературы).

1.1. СТРОЕНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

1.1.1. Строение каталитического домена.

1.1.2. Строение N-концевого домена.

1.1.3. Строение С-концевого домена.

1.1.4. Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы.

1.1.5. Мультимерная организация интегразы.

1.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

1.2.1. Реакции, катализируемые интегразой.

1.2.2. Связывание ДНК интегразой.

1.2.3. Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК.

1.2.4. Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК.

1.2.5. Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК.

1.2.5.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата на каталитическую активность интегразы.

1.2.5.2. Моделирование предпочтительной нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата.

1.2.6. Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК.

I.3. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ФЕРМЕНТА И ЕГО КОМПЛЕКСА С ДНК.

II. ИНТЕГРАЗА ВИЧ-1: ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК-СУБСТРАТА НА АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИИ З'-КОНЦЕВОГО ПРОЦЕССИНГА

Результаты и обсуждение).

II.1. ДИЗАЙН МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ Ш-СУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

II.2. ТЕРМИЧЕСКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ

АНАЛОГОВ Ш-СУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

113. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В РАБОТЕ

ИНТЕГРАЗЫ.

11.4. СВЯЗЫВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ С РАЗЛИЧНЫМИ

ДНК-ДУ ПЛЕКС АМИ.

11.4.1. Изучение связывания интегразы с ДНК методом торможения в геле.

11.4.2. Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции.

11.4.3. Изучение связывания интегразы с ДНК методом фотоаффинной модификации.

11.5. ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИЙ и5-СУБСТРАТА

НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ.

II.5.1. Модификации нуклеозидов в 3-ем положении и5-субстрата.

9 IL5.2. Модификации нуклеозидов в 5-ом и 6-ом положениях Ш-субстрата.

11.5.3. Модификации нуклеозидов в 7-ом и 8-ом положениях Ш-субстрата.

11.5.4. Модификации нуклеозидов в 9-ом положении Ш-субстрата.

11.5.5. Модификации нуклеозидов в 12-ом положении Ш-субстрата.

II.6. ВЛИЯНИЕ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ДНК В РАЙОНЕ РАСЩЕПЛЯЕМОЙ СВЯЗИ НА АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ.

11.6.1. Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями.

11.6.1.1. Синтез субстрата интегразы

А с ковалентно связанными цепями.

11.6.1.2. Реакция 3 '-концевого процессинга субстрата с ковалентно связанными цепями.

11.6.2. Процессинг субстратов, в которых консервативный динуклеотид

СА расположен во внутренней части дуплекса.

11.7. ИЗУЧЕНИЕ КОНТАКТОВ АДЕНИНА

В ТРЕТЬЕМ ПОЛОЖЕНИИ ПРОЦЕССИРУЕМОЙ ЦЕПИ и5-СУБСТРАТА С ИНТЕГРАЗОЙ.

11.8. МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК-СУБСТРАТОМ.

III. Экспериментальная часть.

III. 1. Реактивы и материалы.

III.2. Методы.

Ш.2.1. Изучение связывания интегразы ВИЧс ДНК-дуплексами.

Ш.2.2. Изучение влияния модификаций Ш-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1.

Ш.2.3. Синтез дуплексов с ковалентно связанными цепями.

Выводы.

Вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), относящийся к классу ретровирусов, поражает иммунную систему организма человека и вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) [1]. Для лечения этого опасного заболевания в настоящее время применяется комплексная терапия, основанная на использовании ингибиторов двух ферментов ВИЧ-1: обратной транскриптазы и протеазы [2]. Однако эта терапия не приводит к полной остановке репликации вируса, а позволяет лишь подавлять ее до низкого уровня, продлевая жизнь ВИЧ-инфицированным пациентам [3, 4]. В связи с этим внимание ученых сосредоточено на поиске новых мишеней и новых ингибиторов репликации вируса. Одной из самых привлекательных и актуальных мишеней на сегодняшний день является третий вирусный фермент - интеграза (ИН). Она катализирует одну из ранних стадий репликативного цикла ВИЧ - встраивание вирусной ДНК в клеточную [5]. Понятно, что подавление этого ключевого для развития вируса процесса должно необратимо привести к полной остановке репликации ВИЧ. Важно, что ИН не участвует в процессах, необходимых для жизнедеятельности самой клетки, поэтому её ингибирование является одним из наиболее перспективных приемов селективного подавления репликации на раннем этапе развития вирусной инфекции.

Однако создание эффективных ингибиторов ИН во многом тормозится из-за того, что ИН является наименее изученным ферментом ВИЧ-1. Известно, что она узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3'-концов каждой цепи. Это - первая стадия интеграции, она называется 3'-концевой процессинг [6]. Далее ИН осуществляет перенос цепи - встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК. Однако детальный механизм, по которому ИН взаимодействует с вирусной и с клеточной ДНК, не известен. До настоящего времени не известна полная структура ни всего фермента, ни его комплекса с ДНК-субстратом, поскольку не удается закристаллизовать полноразмерный каталитически активный белок и сделать его рентгеноструктурный анализ или ЯМР. Понятно, что выяснение механизма узнавания вирусной ДНК интегразой и дальнейшей ее интеграции в клеточную ДНК позволит более системно и рационально подойти к созданию ингибиторов этого фермента.

В настоящее время для изучения взаимодействий ИН с ДНК in vitro используется рекомбинантный фермент и модифицированные аналоги вирусной ДНК. Необходимо отметить, что ИН активна только в присутствии кофактора - иона двухвалентного металла. Природным кофактором является Mg2+, in vitro чаще используется ион Мп2+, поскольку в его присутствии активность ИН выше. Однако в последнее время установлено, что субстратная специфичность ИН и ее ингибирование различными соединениями зависят от природы используемого кофактора. Так ряд ингибиторов ИН, активных in vitro в присутствии Мп2+, не ингибируют этот фермент в присутствии ионов Mg2+ и, следовательно, оказываются неактивными в экспериментах на клеточных культурах [7, 8].

В связи с этим в настоящей работе взаимодействие ИН с ДНК изучалось в присутствии обоих кофакторов: и Мп2+, и Mg2+. Целью нашей работы было изучить влияние структуры вирусной ДНК на специфичность ее взаимодействия с ИН ВИЧ-1 и выявить те структурные элементы, которые определяют эту специфичность. Для этого использовались ДНК-дуплексы, последовательность которых соответствовала последовательности сайта узнавания ИН в Ш-участке длинного концевого повтора ДНК ВИЧ-1. Природные нуклеозиды в определенных положениях дуплекса заменяли на ненуклеозидные вставки (остатки 1,3-пропандиола) или 2'-аминонуклеозиды и изучали связывание модифицированных дуплексов с ИН и их 3'-концевой процессинг. Оказалось, что введение модификаций в структуру субстрата ИН не влияет на его связывание ферментом, но оказывает очень сильное воздействие на скорость 3'-концевого процессинга.

На основании полученных результатов предложена модель взаимодействия ИН с вирусной ДНК. В соответствии с этой моделью, основной вклад вносят контакты ИН с углеводофосфатным остовом первых девяти нуклеотидов ДНК-субстрата, а специфичность взаимодействия, в первую очередь, определяется наличием в структуре ДНК последовательности 5'-СА -3' в 3-ем и 4-ом положениях от 3'-конца процессируемой цепи, причем со стороны аденина из этой последовательности с ИН взаимодействуют Ы7-атом и экзоциклическая аминогруппа. Также предполагается, что с положениями 3-6 в составе субстрата взаимодействует каталитический домен ИН, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен фермента. Впервые обнаружено, что в положениях субстрата с 5-ого по 8-ое ИН взаимодействует с непроцессируемой цепью субстрата в большей мере, чем с процессируемой. Помимо этого установлено, что модификации субстрата с положениях с 3-его по 6-ое оказывают значительно более сильное влияние на активность ИН в присутствии ионов Mg2+, чем Мп2+.

Введение 2'-аминонуклеозидов в терминальные положения U5-субстрата позволило нам получить аналог вирусной ДНК с ковалентно связанными на конце цепями. С использованием такого дуплекса показано, что «расплетание» цепей вирусной ДНК не является необходимым условием З'-процессинга. В то же время, для эффективного З'-процессинга ДНК-субстрата необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой связью.

Работа включает обзор литературы, посвященный строению и функциям интегразы ВИЧ-1.

I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 /обзор литературы/

Вирус иммунодефицита человека принадлежит к классу ретровирусов, и его репликативный цикл включает в себя стадию встраивания провирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Этот процесс осуществляется вирусным ферментом -интегразой (ИН). Известны два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома [9, 10]. Интегразы обоих типов вируса очень близки по структуре и функциям, а поскольку ВИЧ-1 является более патогенным и широко распространенным типом вируса, в дальнейшем мы будем рассматривать вопросы, касающиеся ИН именно ВИЧ-1.

ИН ВИЧ-1 относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят такие ферменты как транспозазы и ретровирусные ИН, а также РНКаза Н и резолваза Ruv С [11, 12]. Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению ДНК или ее фрагментов внутри генома, либо между геномами. Следует отметить, что данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энергии и, в конечном итоге, без изменения числа фосфодиэфирных связей. Кроме того, для ретровирусных интеграз характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНК-субстратом. Однако катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК [13].

ИН ВИЧ-1 осуществляет перенос молекулы ДНК вируса в геном зараженной клетки (рис. 1). Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3'-концов каждой цепи. Это - первая стадия интеграции, она называется 3'-концевой процессинг. Далее ИН осуществляет перенос цепи -встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК (рис.1) [6]. Для осуществления 3'-концевого процессинга и переноса цепи ИН необходим кофактор; л I in vivo роль кофактора играют ионы Mg , in vitro реакции могут проходить также в присутствии ионов Мп [14]. Помимо описанных выше двух реакций, in vitro ИН способна катализировать еще одну, называемую дезинтеграцией [15]. По существу она является обратной реакции интеграции.

4 дкп Вирусная ДНК ACTGGAA>——--'

I GTACCTT \ J / из N

ДКП / 3' \

TAGCAGT |

ATCGTCA /

U5

ИНТЕГРАЗА

ИНТЕГРАЗА

З'-концевой процессинг 5'

ACTGGAA АССТТ дкп Вирусная ДНК из дкп / N jTAGCA |

-Jatcgtca J У перенос цепи

У* * 5'

Вирусная ДНК

Клеточная ДНК репарация ДНК

Рис. 1. Интеграция ДНК ВИЧ-1 в геном клетки.

Для осуществления стадии переноса цепи ИН необходимо связать сразу две молекулы ДНК: вирусную и клеточную. Соответственно, встраиваемую вирусную ДНК называют субстратом ИН, а клеточную ДНК - мишенью. Взаимодействие ИН с ДНК-субстратом носит строго си квенс-спе пифический характер, в то время как мишень связывается ферментом неспецифически. Все ретровирусные ИН высоко консервативны и обладают гомологией между собой, а также с множеством транспозаз [13]. Рассмотрим строение ИН ВИЧ-1.

выводы

1. Синтезирована серия ДНК-дуплексов - аналогов 115-участка ДНК вируса иммунодефицита человека, содержащих в различных положениях одной и/или двух цепей 2'-аминонуклеозиды или остатки 1,3-пропандиола, и изучено их взаимодействие с вирусной интегразой. Установлено, что использованные модификации не влияют на связывание ДНК-субстрата интегразой, но значительно влияют на скорость его З'-концевого процессинга.

2. Показано, что специфичность взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом существенно выше в присутствии ионов магния, чем марганца.

3. Предложена модель взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом, согласно которой:

• интеграза взаимодействует, по крайней мере, с первыми девятью нуклеотидами ДНК, причем основной вклад в это взаимодействие вносят ее контакты с углеводофосфатным остовом;

• специфичность взаимодействия определяется последовательностью нуклеозидов в 3-6 положениях от 3'-конца процессируемой цепи, и в первую очередь динуклеотидом СА;

• во взаимодействии с интегразой участвуют N7-aTOM и экзоциклическая аминогруппа консервативного аденина из последовательности СА;

• с положениями 3-6 взаимодействует каталитический домен интегразы, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен.

4. Установлено, что для З'-концевого процессинга вирусной ДНК необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой межнуклеотидной связью и не требуется полного разрушения комплементарных пар на конце ДНК.

1. Kaufmann G. R., Cooper D. A. (2000) Antiretroviral therapy of HIV-1 infection: established treatment strategies and new therapeutic options. Current Opinion in Microbiology 3, 508-514;

2. Geist A., BouHamdan M., Nunnari G., Pomerantz R.J., Kulkosky J. (1999) HIV-1 DNA integration: advancing anti-HIV-1 gene therapy approaches by blocking and modulating the process. Gene Ther. Mol. Biol. 4,133-141;

3. Brown P. O. (1990) Integration of retroviral DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 157,19-48;

4. Neamati N, Lin Z, Karki RG, Orr A, Cowansage K, Strumberg D, Pais GC, Voigt JH, Nicklaus MC, Winslow HE, Zhao H, Turpin JA, Yi J, Skalka AM, Burke TR Jr, Pommier Y. (2002) J. Med. Chem. 45, 5661-5670;

5. Marchand С, Johnson AA, Karki RG, Pais GC, Zhang X, Cowansage K, Patel ТА, Nicklaus MC, Burke TR Jr, Pommier Y. (2003) Mol. Pharmacol. 64, 600609;

6. Clavel F., Guyader M., Guetard D., Salle M., Montagnier L., Alizon M. (1986) Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature 324 (6098), 691-695;

7. Essex M. (1999) Human immunodeficiency viruses in the developing world. Adv. Virus Res. 53, 71-88;

8. Dyda F., Hickman В., Jenkins T.M., Engelman A., Craigie R., Davies D.R. (1994) Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. Science 266 (5193), 1981-1986;

9. Ariyoshi M., Vassylyev D. G., Iwasaki H., Nakamura H., Shinagawa H., Morikawa K. (1994): Atomic structure of the RuvC resolvase: a holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell 78 (6), 1063-1072;

10. Rice P.A., Baker T.A. (2001) Comparative architecture of transposase and integrase complexes. Nat. Struct. Biol. 8 (5), 302-307;

11. Haren L., Ton-Hoang В., Chandler M. (1999): Integrating DNA: Transposases and Retroviral Integrases. Annu. Rev. Microbiol. 53,245-281;

12. Chow S.A, Vincent K.A., Ellison V., Brown P.O. (1992): Reversal of integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus. Science 255, 723-726;

13. Kulkosky J., Skalka A.M. (1994): Molecular mechanism of retroviral DNA integration. Pharmacol. Ther. 61, 185-203;

14. Vink C., Groeneger A.A., Plasterk R. (1993) Identification of the catalytic and DNA-binding region of the human immunodeficiency virus type 1 integrase protein. Nucleic. Acids Res. 21 (6), 1419-1425;

15. Bushman F.D., Engelman A., Palmer I., Wingfield P., Craigie R. (1993) Domains of the integrase protein of the human immunodeficiency virus type 1 responsible for polynucleptidyl transfer and zinc binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (8), 3428-3432;

16. Lee S. P, Xiao J., Knutson J. R., Lewis M. S., Han M.K. (1997): Zn2+ promotes the self-association of human immunodeficiency virus type-1 integrase in vitro. Biochemistry 36 (1), 173-180;

17. Engelman A., Craigie R. (1992) Identification of conserved amino acid residues critical for human immunodeficiency virus type 1 integrase function in vitro. J. Virol. 66 (11), 6361-6369;

18. Polard P., Chandler M. (1995) Bacterial transposases and retroviral integrase. Mol. Microbiol. 15 (1), 13-23;

19. Leavitt A.D., Shiue L., Varmus H.E. (1993) Site-directed mutagenesis of HIV-1 integrase demonstrates effects on integrase functions in vitro. J. Biol. Chem. 268 (3), 2113-2119;

20. Yang W., Steitz T.A. (1995) Recombining the structure of HIV-1 integrase, RuvC and RNase H. Structure 3, 131-134;

21. Goldgur Y., Dyda F., Hickman A.B., Jenkins T.M., Craigie R., Davies D.R. (1998) Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 95 (16), 9150-9154;

22. Lovell S., Goryshin I. Y., Reznikoff W.R., Rayment I. (2002) Two-metal active site binding of a Tn5 transposase synaptic complex. Nature Struct. Biol. 9 (4), 278-281;

23. Mizuuchi K. (1997) Polynucleotidyl transfer reaction in site-specific DNA recombination. Genes Cells 2, 1-12;

24. Andrake M.D., Skalka A.M. (1996) Retroviral integrase, putting the pieces together. J. Biol. Chem. 271, 19633-19636;

25. Rice P., Craigie R., Davies D.R. (1996) Retroviral intergases and their cousins. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 76-83;

26. Mizuuchi K. (1992) Polynucleotidyl transfer reaction in transpositional DNA recombination. J. Biol. Chem. 267,21273-21276;

27. Mizuuchi K., (1992) Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of mu and other elements. Annu. Rev. Biochem. 61,1011-1051;

28. Vincent K.A., Ellison V., Chow S.A., Brown P.O. (1993) Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Integrase expressed in Escherichia coli and analysis of variants with amino terminal mutations. J. Virol. 67 (1), 425437;

29. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. (1996) Zinc folds the N-terminal of HIV-1 integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (24), 13659-13664;

30. Woerner A.M., Marcus-Sekura C.J. (1993) Characterization of a DNA binding domain in the C-terminus of HIV-1 integrase by deletion mutagenesis. Nuc. Acids Res. 21 (15), 3507-3511;

31. Katzman M., Sudol M. (1998). Mapping Viral DNA specificity to the central region of integrase by using functional human immunodeficiency virus type 1/ Visna virus chimeric proteins. J. Virol. 72 (3), 1774-1753;

32. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Graigie R., Clore G.M., M.Granenborn A.M. (1997) Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase. Nature Struct. Biol. 4 (7), 567-577;

33. Puras Lutzke R.A., Vink C., Plasterk R. (1994) Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein. Nuc. Acids Res. 22 (20), 4125-4131;

34. Lodi P.J., Ernst J.A., Kuszewski J., Hickman А.В., Engelman A., Craigie R. Clore G.M., Gronenborn A.M. (1995) Solution structure of the DNA-binding domain of HIV-1 integrase. Biochemistry. 34 (31), 9826-9833;

35. Chen J.C.-H., Krucinski J., Miercke L.J.W., Finer-Moore J.S., Tang A.H., Leavitt A.D., Stroud R.M. (2000) Crystal structure of the HIV-1 integrase catalytic and C-terminal domains: a model for viral DNA binding. Biochemistry. 97 (15), 8233-8238;

36. Wang J.-Y., Ling H., Yang W., Graigie R. (2001) Structure of a two-domain fragment of HIV-1 integrase: implications for domain organization in the intact protein. EMBO J. 20 (24), 7333-7343;

37. Esposito D., Craigie R. (1999) HIV integrase structure and function. Adv. Virus Res. V 52. P. 319-333;

38. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese В., Van Beeumen J., Engelborgh Y., De Clercq E., Debyser Z. (2003) HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. J. Biol. Chem. 278 (1), 372-381;

39. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J.-F., Auclair C., Brochon J.-C. (2000) Oligomeric state of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy. Biochemistry. 39 (31), 9275-9284;

40. Brown P.O., Bowerman В., Varmus H.E., Bishop J.M. (1987) Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356;

41. Bukrinsky M.I., Sharova N., Dempsey M.P., Stanwick T.L., Bukrinskaya A.G., Haggerty S., Stevenson M. (1992) Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(14), 6580-6584;

42. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. (1997) Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71 (7), 5382-5390;

43. Farnet C.M., Bushman F.D. (1997) HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. Cell. 88 (4), 483-492;

44. Bushman F.D. (1999) Host proteins in retroviral cDNA integration. Adv. Virus Res. 52, 301-317;

45. Carteau S., Hoffmann C., Bushman F. (1998) Chromosome structure and human immunodeficiency virus type 1 cDNA integration: centromeric alphoid repeats are a disfavored target. J. Virol. 72 (5), 4005-4014;

46. Appa R.S., Shin C.G., Lee P., Chow S.A. (2001) Role of the nonspecific DNA-binding region and alpha helices within the core domain of retroviral integrase in selecting target DNA sites for integration. J. Biol. Chem. 276 (49), 45848-45855;

47. Goulaouic H., Chow S.A. (1996) Directed integration of viral DNA mediated by fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and Escherichia coli LexA protein. J. Virology. 70 (1), 37-46;

48. Bushman F.D, Miller M.D. (1997) Tethering human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes to target DNA promotes integration at nearby sites. J. Virology. 71 (1), 458-464;

49. Coffin J. M., Hughes S. H., Varmus H. E. (1998) Retroviruses. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press. 161-203;

50. Brin E., Yi J., Skalka A., Leis J. (2000) Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275 (50), 3928739295;

51. Bushman F. D., Craigie R. (1992) Integration of human immunodeficiency virus DNA: adduct interference analysis of required DNA sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3458-3462;

52. Bushman F. D., Craigie R. (1991) Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,1339-1343;

53. Vink C., van Gent D.C., Elgersma Y., Plasterk R.H. (1991) Human immunodeficiency virus integrase protein requires a subterminal position of its viral DNA recognition sequence for efficient cleavage. J. Virol. 65, 4636-4644;

54. Katzman M., Mack J.P.G., Skalka A.M., Leis J. (1991) A covalent complex between retroviral integrase and nicked substrate DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4695-4699;

55. Engelman A., Mizuuchi K., Craigie R. (1991) HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell, 67, 1211-1221;

56. Katzman M., Sudol M. (1996) Nonspecific alcoholysis, a novel endonuclease activity of human immunodeficiency virus type 1 and other retroviral intergases. J. Virol. 70, 2598-2604;

57. Tramontano E., Colla P.L., Cheng Y.C. (1998) Biochemical characterization of HIV-1 integrase 3'-processing activity and its inhibition by phosphorothioate oligonucleotides. Biochemistry 37, 7237-7243;

58. Gerton J.L., Herschlag D., Brown P.O. (1999) Stereospecifity of reactions catalyzed by HIV-1 integrase. J. Biol. Chem. 274, 33480-33487;

59. Mumm S. R., Grandgenett D. P. (1991) Defining nucleic acid-binding properties of avian retrovirus integrase by deletion analysis. J. Virol. 65, 1160-1167;

60. Khan E„ Mack J. P. G„ Katz R. A., Kulkosky J., Skalka A. M. (1991) Retroviral integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences. Nucleic Acids Res. 19, 851-860;

61. Yoshinaga Т., Kimura-Ohtani Y., Fujiwara T. (1994) Detection and characterization of a functional complex of human immunodeficiency virus type 1 integrase and its DNA substrate by UV cross-linking. J. Virol., 68, 5690-5697;

62. Hazuda D. J., Wolfe A. L., Hastings J. C., Robbins H. L., Graham P. L., LaFemina R. L., Emini E. A. (1994) Viral long terminal repeat substrate binding characteristic of the human immunodeficiency virus type 1 integrase. J. Biol. Chem. 269, 3999-4004;

63. Vink C., Lutzke R. A., Plasterck R. H. (1994) Formation of a stable complex between the human immunodeficiency virus integrase protein and viral DNA. Nucleic Acids Res. 22,4103-4110;

64. Woerner A. M., Klutch M., Levin J. G., Marcus-Sekura C. J. (1992) Localization of DNA binding activity of HIV-1 integrase to the C-terminal half of the protein. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8,297-304;

65. Vora A. C., Grandgenett D. P. (1995) Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J. Virol. 69, 7483-7488;

66. Mazumder A., Neamati N., Pilon A.A., Sunder S., Pommier Y. (1996) Chemical trapping of ternary complexes of HIV-1 integrase, Me and DNA substrates. J. Biol. Chem. 271, 27330-27338;

67. Ellison V., Brown P.O. (1994) A stable complex between integrase and viral DNA ends mediates human immunodeficiency virus integration in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7316-7320;

68. Hazuda D. J., Felock P. J., Hastings J. C., Pramanik В., Wolfe A. L. (1997) Differential divalent cation requirements uncouple the assembly and catalytic reactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase. J. Virol. 71, 70057011;

69. Bugreev D.V., Baranova S., Zakharova O.D., Parissi V., Desjobert C., Sottofattori E., Balbi A., Litvak S., Tarrago-Litvak L., Nevinsky G.A. (2003) Biochemistry 42 (30), 9235-9247;

70. Heuer T.S., Brown P.O. (1997) Mapping features of HIV-1 integrase near selected sites on viral and target DNA molecules in an active enzyme-DNA complex by photo-cross-linking. Biochemistry. 36 (35), 10655-10665;

71. LaFemina R.L., Callahan P.L., Cordingley M.G. (1991) Substrate specifity of recombinant human immunodeficiency virus integrase protein. J. Virol. 65, 56245630;

72. Engelman A., Hickman А. В., Craigie R. (1994) The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 each contribute to nonspecific DNA binding. J. Virol. 68, 5911-5917;

73. Gerton J. L., Brown P. O. (1997) The core domain of HIV-1 integrase recognizes key features of its DNA substrates. J. Biol. Chem. 272, 25809-25815;

74. Shibagaki Y., Holmes M. L., Appa R. S., Chow S. A. (1997) Characterization of feline immunodeficiency virus integrase and analysis of functional domains. Virology 230, 1-10;

75. Katzman M., Sudol M. (1995) Mapping domains of retroviral integrase responsible for viral DNA specificity and target site selection by analysis of chimeras between human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases. J. Virol. 69, 5687-5696;

76. Jenkins T.M., Esposito D., Engelman A., Craigie R. (1997) Critical contacts between HIV-1 integrase and viral DNA identified by structure-based analysis and photo-crosslinking. EMBO J. 16, 6849-6859;

77. Esposito D., Craigie R. (1998) Sequense specifity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein DNA interactions. EMBO J. 17, 5832-5843;

78. Gao K., Butler S.L., Bushman F. (2001) Human immunodeficiency virus type-1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes. EMBO J. 20, 3565-3576;

79. Withka J.M., Wilde J.A., Bolton P.H., Mazumder A., Gerlt J.A. (1991) Characterization of conformational features of DNA heteroduplexes containing aldehydic abasic sites. Biochemistry 30, 9931-9940;

80. Sherman P.A., Dickson M.L., Fyfe J.A. (1992) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein: DNA sequence requirements for cleaving and joining reaction. J. Virol., 66, 3593-3601;

81. Katzman M., Katz R. A., Skalka A. M., Leis J. (1989) The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J. Virol. 63, 5319-5327;

82. Mazumder A., Pommier Y. (1995) Processing of deoxyuridine mismatches and abasic sites by human immunodeficiency virus type-1 integrase. Nucl. Acids. Res. 23,2865-2871;

83. Scottoline B.P., Chow S., Ellison V., Brown P.O. (1997) Disruption of the terminal base pairs of retroviral DNA during integration. Genes & Development 11,371-382;

84. Whitcomb J. M., Hughes S. H. (1991) The sequence of human immunodeficiency virus type 2 circle junction suggests that integration protein cleaves the ends of linear DNA asymmetrically. J. Virol. 65, 3906-3910;

85. Randolph C. A., Champoux J. J. (1993) The majority of simian immunodeficiency virus/Mne circle junctions result from ligation of unintegrated viral DNA ends that are aberrant for integration. Virology 194, 851-854;

86. Sherman P., Fyfe J. A. (1990) Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5119-5123;

87. Katzman M., Sudol M. (1996) Influence of subterminal viral DNA nucleotides on differential susceptibility to cleavage by human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases. J. Virol. 70, 9069-9073;

88. Mazumder A., Gupta M., Pommier Y. (1994) Methylphosphonodiester substitution near the conserved CA dinucleotide in the HIV LTR alters both extent of 3'-processing and choice of nucleophile by HIV-1 integrase. Nucleic Acids Res. 22, 4441-4448;

89. Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1997) Functional identification of nucleotides conferring substrate specifity to retroviral integrase reactions. J. Virol. 71, 10251035;

90. Wang Т., Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1999) Major and minor groove contacts in retroviral integrase LTR interactions. Biochemistry 38, 3624-3632;

91. Zhou H., Rainey G.J., Wong S.-K., Coffin J.M. (2001) Substrate sequence selection by retroviral integrase. J. Virol. 75,1359-1370;

92. Shih C.-C., Stoye J. S., Coffin J. M. (1988) Highly preferred targets for retrovirus integration. Cell. 53, 531-537;

93. Withers-Ward E. S., fCitamura Y., Barnes J. P., Coffins J. M. (1994) Distribution of targets for avian retrovirus DNA integration in vivo. Genes Dev. 8, 1473-1487;

94. Farnet С. M., Wang В., Lipford J. R., Bushman F. D. (1996) Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9742-9747;

95. Miller M. D„ Bor Y.-C., Bushman F. (1995) Target DNA capture by HIV-1 integration complexes. Curr. Biol. 5, 1047-1055;

96. Kitamura Y., Lee Y. M. H., Coffin J. M. (1992) Nonrandom integration of retroviral DNA in vitro: Effect of CpG methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5532-5536;

97. Pryciak P. M., Varmus H. E. (1992) Nucleosomes, DNA-binding proteins, and DNA sequences modulate retroviral integration target site selection. Cell 69, 769780;

98. Bor Y.-C., Miller M. D., Bushman F. D., Orgel L. E. (1996) Target-sequence preferences of HIV-1 integration complexes in vitro. Virology 222,283-288;

99. Fitzgerald M. L., Grandgenett D. P. (1994) Retroviral integration: In vitro host site selection by avian integrase. J. Virol. 68,4314-4321;

100. Hong Т., Murphy E., Groarke J., Drlica K. (1993) Human immunodeficiency virus type 1 DNA integration: Fine structure target analysis using synthetic oligonucleotides. J. Virol. 67, 1127-1131;

101. Muller H.-P., Varmus H. E. (1994) DNA bending creates favored sites for retroviral integration: An explanation for preferred insertion sites in nucleosomes. EMBO J. 13,4704-4714;

102. Pruss D., Reeves R., Bushman F. D., Wolffe A. P. (1994) The influence of DNA and nucleosome structure on integration events directed by HIV integrase. J. Biol. Chem. 269,25031-25041;

103. Bushman F. D. (1994) Tethering human immunodeficiency virus 1 integrase to a DNA site directs integration to nearby sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9233-9237;

104. Craigie R. (1992) Hotspots and warm spots: integration specifity of retroelements. Trends Genet. 8, 187-190, Review;

105. Katz R.A., Gravuer К., Skalka A.M. (1998) A preferred target DNA structure for retroviral integrase in vitro. J. Biol. Chem. 273, 24190-24195;

106. Pribil P.A, Haniford D.B. (2003) Target DNA bending is an important specificity determinant in target site selection in TnlO transposition. J Mol Biol. 330(2), 247259;

107. Kalpana G.V., Marmon S., Wang W„ Crabtree G.R., Goff S.P. (1994) Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5. Science 266, 2002-2006;

108. Podtelezhnikov A.A., Gao K., Bushman F.D., McCammon J.A. (2003) Modeling HIV-1 integrase complexes based on their hidrodynamik properties. Biopolymers 68(1), 110-120;

109. De Luca L., Pedretti A., Vistoli G., Barreca M. L., Villa L., Monforte P., Chimirri A. (2003) Analysis of the full-length integrase-DNA complex by a modified approach for DNA docking. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 310, 10831088;

110. Heuer T. S., Brown P. O. (1998) Photo-cross-linking studies suggest a model for the architecture of an active human immunodeficiency virus type 1 integrase-DNA complex. Biochemistry 37, 6667-6678;

111. Gerton J.L., Ohgi S., Olsen M., DeRisi J., Brown P.O. (1998) Effects of mutations in residues near the active site of human immunodeficiency virus type 1 integrase on specific enzyme-substrate interactions. J Virol. 72(6), 5046-55;

112. Adesokan A. A., Roberts V. A., Lee K. W., Lins R. D„ Briggs J. M. (2004) Prediction of HIV-1 integrase/viral DNA interactions in the catalytic domain by fast molecular docking. J. Med. Chem. 47 (4), 821-828;

113. Engelman A., Craigie R. (1995) Efficient magnesium-dependent human immunodeficiency virus type 1 integrase activity. J. Virol. 69, 5908-5911;

114. Gelfand, C.A., Plum, G.E., Grollman, A.P., Johnson, F., Breslauer K.J. (1998) Thermodynamic consequences of an abasic lesion in duplex DNA are strongly dependent on base sequence. Biochemistry. 37, 7321-7327;

115. Zubin EM, Romanova EA, Volkov EM, Tashlitsky VN, Korshunova GA, Shabarova ZA, Oretskaya TS. (1999) Oligonucleotide-peptide conjugates as potential antisense agents. FEBS Lett. 456(1), 59-62;

116. Кузнецова Л.Г., Волков E.M., Романова E.A., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. (1991) Биоорган, химия. 17 (9), 1289-1291;

117. Pemberton I.K., Buckle M., Buc H. (1996) The metal ion-induced cooperative binding of HIV-1 integrase to DNA exhibits a marked preference for Mn(II) rather than Mg(II). J Biol Chem. 271(3),1498-506;

118. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochon J.C., Le Bret M., Mouscadet J.F. (2004) Mechanism of HIV-1 integrase inhibition by styrylquinoline derivatives in vitro. Mol. Pharmacol.65(l), 85-98;

119. Bayley H. (1983) Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology. Eds. Work Т., Burdon R. Amsterdam, New York, Oxford: Elsevier 12, 187;

120. Dickerson, R.E. (1998) DNA bending: the prevalence of kinkiness and the virtues of normality. Nucleic Acids Res. 26, 1906-1926;

121. Packer, M.J., Dauncey, M.P., Hunter, C.A. (2000) Sequence-dependent DNA structure: dinucleotide conformational maps. J. Mol. Biol. 295, 71-83;

122. Bertrand, H., Ha-Duong, Т., Fermandjian, S., Hartmann, B. (1998) Flexibility of the B-DNA backbone: effects of local and neighbouring sequences on pyrimidine-purine steps. Nucleic Acids Res. 26,1261-1267;

123. Dickerson, R.E., Chiu, Т.К. (1997) Helix bending as a factor in protein/DNA recognition. Biopolymers. 44,361-403;

124. Jones, S., van Heyningen, P., Berman, H.M., Thornton, J.M. (1999) Protein-DNA interactions: A structural analysis. J. Mol. Biol. 287, 877-896;

125. Lee I., Harshey R. M. (2003) Patterns of sequence conservation at termini of long terminal repeat (LTR) retrotransposons and DNA transposons in the human genome: lessons from phage Mu Nucleic Acids Res. 31(15), 4531 -4540;

126. Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Vasser M., Shabarova Z.A. (1996) Synthesis and properties of cross-linked DNA duplexes. FEBS Lett. 15, 224-226 ;

127. Krzyzosiak W.L., Biernat J., Ciesiolka J., Gornicki P., Wiewiorowski M. (1979) Chemical modification of N6-(N-threonylcarbonyl)adenosine. Part II. Condensation of the carboxyl group with amines. Nucl. Acids Res. 7, 1663-1674;

128. Verheyden J.P., Wagner D., Moffatt J.G. (1971) Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. J. Org. Chem. 36, 250-254;

129. Корана Г. Новые направления в химии биологически важных эфиров фосфорной кислоты. М., Изд-во "Мир", 1964, 146-149.