Синтез и биологические свойства аминокислотных и пептидных производных катехоламинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РГб ОД

На правая? ^

, Мирзорахимов Курбонали Каримович

Синтез и биологические свойства аминокислотных и пептидных производных катехоламинов

0.2.00.03 - органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Душанбе - 2000

Работа выполнена в Технологическом университете Таджикистана на кафедре «Инженерная химия», Таджикском государственном национальном университете на кафедре «Органическая химия» и Институте химии имени В.И. Никитина АН Республики Таджикистан в лаборатории «фармакология»

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент. Юсупов Т.Ю.,

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Халиков Ш.Х.,

Защита диссертации состоится «1 » ноября 2000 г. в 9°° часов на заседании диссертационного совета Д 013.02.01 в Институте химии

им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, Республика Таджикистан, г.Душанбе, ул.Айни, 299/2

E-mail: kotibilm@akademy. tajik, net. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химии им. В. И. Никитина АН Республики Таджикистан Автореферат разослан «30 » сентября 2000 года. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, с.н.с. Смотров С.П.

Ведущая организация:

кандидат химических наук, с.н.с. Касымова Г.Ф. Таджикский Государственный Педагогический Университет им. К.Ш. Джураева

доктор химических наук

Абулхаев В.Д.

Г2 33.2,0

П о Г, i\7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из задач современной органической ;имии, является разработка путей синтеза новых лекарственных препаратов. В юследние десятилетия бурное развитие получила химия пептидов, что связано с иироким спектром биологической активности, проявляемой соединениями гептидной природы, которые при введении в структуру лекарственных препаратов 'лучшают их фармакологические характеристики: растворимость в воде, фолонгированность действия.

В последние годы увеличивается количество исследований, посвященных ^пользованию катехоламинов в качестве лекарственных препаратов. При низком юдержании в организме катехоламинов используется предшественник этих •гоноаминов - 3,4-диоксифенилаланин, непосредственно участвующий в 5иосинтезе катехоламинов. Однако эти соединения часто не оказывают желаемого терапевтического эффекта. Поэтому поиск новых препаратов как усиливающих, гак и снижающих фармакологический эффект катехоламинов, является жтуальным. Одним из способов снижения концентрации в организме нежелательных биологически активных соединений является применение зысокоспецифичных антител к этим соединениям. В связи с этим проблема поиска :оединений, с помощью которых можно получать высокоспецифичные антитела к катехоламинам и методов их синтеза, является весьма актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является синтез аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, получение коньюгатов их с белковыми носителями, изучение их антигенных и фармакологических свойств.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие

задачи:

разработать методики синтеза аминокислотных и пептидных производных катехоламинов;

изучить физико-химические свойства соединений;

синтезировать коныогаты полученных производных с белковыми носителями; изучить антигенные и фармакологические свойства полученных соединений.

Научная новизна. Впервые получены пролиновые, фенилаланиновые, moho-, ди-, триглициновые и аланил-фенилаланиновые производные 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина. Впервые синтезированы конъюгаты полученных производных катехоламинов с бычьим сывороточным альбумином и тиреоглобулином. Установлено, что наиболее удобным для получения коньюгатов аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями является использование в качестве сшивающего агента глутарового альдегида.

Выявлена зависимость между специфичностью антител и длиной глицинового мостика.

Практическая значимость. Предложен способ синтеза аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, и способ получения белковых конъюгатов производных катехоламинов. Полученные конъюгаты могут быть использованы для получения высокоспецифичных антител к 3,4-диоксифенилаланину.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского государственного национального университета (Душанбе, 1998г.), конференции молодых ученых и специалистов Республики Таджикистан (Душанбе, 19851989г.), третьей региональной конференции по реактивам (Ташкент, 1990г.) и на конференции биохимического общества Республики Таджикистан (Душанбе, 1998г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, и списка литературы, включающего 132 источника.

Основное содержание работы 1. Синтез аминокислотных и пептидных производных катехоламинов.

В качестве Ы-защитной группы использована карбобензоксигруппа (СЬо), которую вводили с использованием карбобензоксихлорида по стандартной методике. Карбоксильные группы защищены сложноэфирной бензильной (- ОВг1) группой, которую вводили с использованием хлористого тионила или солеобразованием с №ОН.

Карбобензокси и бензильную группы удаляли каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле.

Пептиды получены методами активированных (п-нитрофениловых) эфиров и смешанных ангидридов с использованием в качестве конденсирующего агента изобутилхлорформиата, (время активации карбоксильного компонента 2 мин., наращиванием пептидной цепи от 1Ч-конца к С-концу). Конденсацию

1минокислот и пептидов с 3,4-диоксифенилаланином и норадреналином )существляли методом смешанных ангидридов в атмосфере азота. При получении 1роизводных норадреналина приборы затемнялись. Сохранность гидроксильных рупп контролировалась спектрофотомегрически. Для очистки свободных фоизводных катехоламинов использовали высокоэффективную жидкостную (роматографию.

2. Получение коныогатов производных катехоламинов с белковыми носителями

В качестве белковых носителей использовали бычий сывороточный альбумин и тиреоглобулин. Конъюгаты получали по реакции Манниха, с использованием конденсирующего агента глутарового альдегида. Концентрацию оелка в конъюгатах определяли по методу Лоури в модификации Хабера с использованием в качестве стандартов для построения калибровочных кривых исходные нативные белки.

Содержание катехоламинов оценивали фотометрическим по методу Доти.

3 Иммунологические исследования.

Исследования проводились на кроликах породы шиншилла массой 2,5-Зкг обоих полов, содержавшихся на стандартной лабораторной диете. В качестве антигена использовали смесь равных объемов раствора конъюгата (1мг/мл) и адъюванта Фрейнда. Первую инъекцию 0,1 мл смеси ПАФ осуществляли в подколенном лимфатическом узле. Через 3 недели вводили 0,5 мл этой эмульсии внутрикожно во множество точек в область шеи и через 2 недели 1 мл внутримышечно в бедренную мышцу. Последующую инъекцию (1 мл смеси с неполным адьювантом Фрейнда) проводили через 2 недели также внутримышечно. Через 7 дней осуществляли пробный забор крови. По окончании основного цикла проводили курс поддерживающей иммунизации (0,5 мл смеси с НАФ внутрикожно с месячным интервалом). Через 7 дней после каждого введения антигена, определяли титр специфических антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа.

Антитела выделяли с помощью аффинной хроматографии с использованием иммуносорбента на основе бромциансефарозы 4В. Перекрестную реактивность антител определяли радиометрическим методом.

Адреномиметическую активность исследовали на изолированной полоске селезенки кролика. Сокращение полосок селезенки регистрировали на кимографе.

4. Синтез производных 3,4-диоксифенилаланина

Роль катехоламинов в функционировании симпато-адреналиновой системы организма хорошо изучена. Внимание исследователей привлекают производные этих соединений, в частности, 3,4-диоксифенилаланин и норадреналин. Одним из способов повышения специфической активности катехоламинов является модификация их молекул путем присоединения к аминокислотам, пептидам и белкам. Подобные конъюгаты могут быть использованы не только как самостоятельные терапевтические препараты, но и для получения высокоспецифичных антител к катехоламинам, которые применяются для изучения метаболизма катехоламинов в организме и снижения их содержания при гиперкатехоланемии. Первым этапом проведения наших исследований в этом направлении является синтез аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина.

Для получения этих соединений первоначально необходимо синтезировать бензиновый эфир пара-толуолсульфонат-3,4-диоксифенилаланина, фОРЬА), который был получен методом азеотропной перегонки в атмосфере инертного газа. Выход бензинового эфира 3,4- диоксифенилаланина составил 60%.

Для синтеза аминокислотных производных 3,4-диоксифенилаланина (ООРИА) использован метод смешанных ангидридов. Конденсацию проводили с использованием в качестве конденсирующего реагента изобутилхлорформиата. Оптимальное время активации карбоксильного компонента составляло 1-2 минуты при температуре -10 до - 15°С. Для связывания выделяющегося хлористого водорода и снятия п - толуолсульфокислоты с аминогруппы бензинового эфира ООРИА использовали 2 эквивалента Ы-метилморфолина.

По этой методике синтезированы СЬо-С1у-БОРЬА-01Ы, СЬо-Рго-ООРЬА-ОВг1 и СЬо-РЬе-ООРЬА-ОВг1. Для примера на рис.1 приведена схема синтеза Н-Рго-БОРЬа-ОН. Выход СЬо-С1у-ООРЬа-ОВг1 составил 68,3% СЬо-Рго-БОР11а-ОВг1-70%, СЪо-РЬе-БОР1т-ОВг1-63%.

На следующем этапе работы было необходимо синтезировать пептидные производные 3,4 - диоксифенилаланина, которые получали методом активированных эфиров.

Этот метод был выбран в связи с тем, что синтез с помощью активированных эфиров стал одним из основных методов ступенчатого синтеза после введения п-нитрофениловых эфиров. Высокая эффективность этого метода была впервые продемонстрирована при синтезе окситоцина и 27-ми членного гормона - секретина свиньи.

Использование активированных эфиров при ступенчатом синтезе пептидов дает возможность применять минимальную защиту боковых групп. Кроме того, избыток активированного эфира и соль третичного основания могут

5ыть удалены с помощью растворителя, в котором основной продукт реакции не растворяется . Методом тонкослойной хроматографии можно наблюдать за ходом реакции, оценить количество образовавшегося пептида или освободившегося п-штрофенола. Все эти преимущества обусловливают широкое применение ступенчатого синтеза пептидов с помощью метода активированных эфиров.

На первом этапе получен СЬо-Иу-СЖр и СЬо-А1а-(Жр по известной методике. Активированные эфиры обычно получают конденсацией 5ащищенной кислоты с использованием дициклогексилкарбодиимида или методом смешанных ангидридов. Однако, в зависимости от выбора метода создания пептидной связи, эти методы используются в ограниченном виде. Мы выбрали метод смешанных ангидридов. Этот метод имеет некоторые преимущества по сравнению с карободиимидным методом. При использовании карбодиимидного метода образуется промежуточное соединение дициклогексилмочевина, которую грудно отделить от активированного эфира. В методе смешанных ангидридов в качестве побочных продуктов образуются спирт, оксид углерода (IV) которые удаляются путем упаривания. В связи с этим при синтезе активированных эфиров аминокислот мы использовали метод смешанных ангидридов.

Для синтеза в растворе пептидов, содержащих в своем составе остатки более двух аминокислот (три-, тетрапептидов), возможно использование одного из грех путей синтеза: ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца, ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с И-конца и блочной конденсации.

В нашем случае был использован метод ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с И-конца. Это связано с тем, что С-концевым остатком в данном случае является 3,4-диоксифенилаланин. Эта аминокислота в бензольном кольце содержит две гидроксильные группы, которые склонны к окислению. При ступенчатом наращивании с Ы-конца 3,4-диоксифенилаланин вступает в реакцию конденсации один раз, с С-концевым два раза. Следовательно, при использовании ступенчатого наращивания с М-конца потери конечного продукта от окисления 3,4-диоксифенилаланина при синтезе его дипептидных производных снижаются в два раза, по сравнению со ступенчатым наращиванием пептидной цепи С-конца. В связи с этим, мы остановились на использовании ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с И-конца. Для примера синтез аминокислотных производных 3,4-диоксифенилаланина показан на схеме 1.

Защищенные дипептиды СЬо-С1у-С1у-ОН и СЬо-А1а-РЬе-ОН были получены конденсацией СЬо-01у-СЖр и СЪо-А1а-(Жр с альфа-СООН группами, которые были защищены глицином и фенилаланином путем солеобразования в присутствии одного эквивалента КаОН.

Рго

БОРЬА

СЬо

СЬо

Н

ОН

Тоэ : Н

ОВг!

ОВг1

ОН

Схема 1. Синтез Н-Рго-БОРЬА-ОН

Конденсация проведена в растворе диметилформамида. Выделившийся п-нитрофенол удаляли экстракцией эфиром из водного раствора реакционной смеси. Основной продукт был выделен экстракцией бутанолом из подкисленного водного раствора. Очистку основного продукта осуществляли путем перекристаллизации из эфира.

При синтезе трипептидных производных 3,4-диоксифенилаланина синтезированСЬо-С1у-01у-01у-ОН. Для этого из дипептида СЬо-С1у-С1у-ОН каталитическим гидрированием удаляли карбобензоксигруппу, а затем полученный свободный дипептид конденсировали с п-нитрофениловым эфиром карбобензоксиглицина. Выход защищенного трипептида составил 71,2%. Конденсацию карбобензоксиглицина с 3,4-диоксифенилаланином осуществляли методом смешанных ангидридов с использованием в качестве конденсирующего реагента изобутилхлорформиата. (Схема. 1,2)

Выход продуктов на каждой стадии конденсации и физико-химические характеристики синтезированных защищенных пептидов приведены в табл. 1. Для примера на схеме 2 приведен синтез Н-С1у-01у-01у-В0РЬа-0Н Деблокирование защищенных пептидов осуществляли каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле.

Очистку свободных пептидов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Иу

&у

ау

БОРЬА

СЬо"

СЬо

СЬо-

СЬо"

Н

ОН СЬсг

СЬо"

СЬо-

ONp Н

ОН

ОЫр Н"

ОН

ОН

ОН

ОН Тоб:Н-

ОВг1

ОН

ОН

Схема 2. Синтез Н-ау-ау-^у-БОРИА-ОН

Аминокислотный состав синтезированных пептидов был подтвержден данными аминокислотного и элементного анализов. Физико-химические характеристики свободных пептидов также приведены в таблице 1.

Таблица 1. Синтезированные соединения и их константы

№ п/п Название соединения Выход % Т.пл М

А Б В Г Д

1. СЬо-ау-Яу-ОН 85,4 172-174 0,81 0,94 0,41

2. СЬо-А1а-Р11е-ОН 78,5 118-122 0,78 0,67 0,80 0,95

3. СЬо-01у-01у-01у-С)Н 71,2 184-186 0,53 0,94 0,43 0,21

4. СЬ0-01у-Б0Р11А-0Вг1 68,3 Масло 0,79 0,66 0,73

5. СЬо-РЬе-БОРЬА-ОВг1 63,5 Аморф 0,83 0,91 0,85 0,90

6. СЪо-Рго-ООРЬА-ОВг! 70,2 Аморф 0,70 0,64 0,83 0,95

7. СЪо-ВОРЬА-^у-ОВг! 58,7 Аморф 0,98 0,81 0,95 0,96

8. СЬо-ау-ау-БОРЬА-ОВг! 76,1 Аморф 0,77 0,37 0,73 0,91

9. СЬо-С1у-С1у-С1у-ООРЬА-ОВ21 75,4 Аморф 0,93 0,92 0,94 0,88

10. СЬо-АЬ-РЬе-БОРИА-ОВг! 73,3 Аморф 0,89 0,89 0,98

11. Н-Иу-БОРЬА-ОН 81,2 160-162 0,19 0,04 0,42 0,01

12. Н-Рго-ООРЬА-ОН 78,2 178-180 0,28 0,08 0,25

13. Н-РЬе-БОРИА-ОН 83,8 150-152 0,45 0,00 0,00 0,08

14. Н-ВОР11А-С1у-ОН 68,9 196-198 0,35 0,00 0,00 0,03

15. Н-Иу-Иу-ВОРЬА-ОН 74,5 178-180 0,19 0,03 0,35 0,03

16. Н-С1у01у-С1у-Б0РЬА-0Н 88,8 188-190 0,29 0,02 0,16 0,08

17. Н-АЬ-РЬе-БОРЬА-ОН 72,6 140-142 0,50 0,00 0,00 0,05

5. Синтез аминокислотных и пептидных производных норадреналина

Другим катехоламином, играющим большую роль в организме является норадреналин (1-(3,4-диоксифенил) -2-аминоэтанол). Его действие в организме в основном направлено на альфа-адренорецепторы и он является медиатором (передатчиком) нервного возбуждения в нервной симпатической системе.

Исходя, из этого определенный интерес представляет изучение реакции взаимодействия норадреналина с аминокислотами и пептидами.

Для получения производных норадреналина необходимо было синтезировать ряд исходных и промежуточных соединений: СЬо -Иу-ОН, СЬо -А1а-ОН, СЬо-Б-А1а-ОН, СЬо -РЬе-ОН, СЬо -Туг (г)-ОН, НС1:Н-Туг-ОВг1, СЬо -С1у-(Жр, СЪо-Б-А1а-(Жр, СЬо-А1а-ОМр, которые были получены методом активированных (п-нитрофениловых) эфиров и их выход составил соответственно 73,3, 68,0,73,3%.

Затем аминокислоты и дипептиды были присоединены к молекуле норадреналина по аминогруппе, находящейся в боковой цепи. В результате были получены соединения общей формулы

где, И. - остаток аминокислоты или пептида

Синтез осуществлен методом смешанных ангидридов с использованием в качестве конденсирующего реагента изобутилхлорформиата и в качестве основания - триэтиламина.

Следует отметить, что в связи с наличием в молекуле норадреналина двух фенольных гидроксильных групп, склонных к оксилению, все синтезы проводили в атмосфере азота. Кроме того, при получении производных норадреналина приборы затемнялись.

Ход реакций конденсации и чистоту полученных соединений контролировали тонкослойной хроматографией и ИК - спекиральным анализом.

В ИК-спектрах полученных веществ обнаружены полосы поглощения групп, входящих в состав этих соединений.

Физико-химические характеристики полученных соединений также приведены в таблице 2.

ОН

Таблица 2: Выход и физико-химические характеристики синтезированных пептидов и производных норадреналина

№ п/п Соединение Выход % Т.пл °С Хроматографическая подвижность, R

Б В Е Ж

1. Cbo-Ala-Phe-OH 73,3 73-74 0,58 — 0,77 0,71

2. Cbo-Phe-Ala-OH 68,0 Масло 0,47 0,44 0,51 0,60

3. Cbo-D-Ala-Phe-OH 73,3 73-74 0,58 — 0,71 0,47

4. Cbo-Ala-Phe-ONp 75,5 Масло 0,91 — 0,87 0,92

5. Cbo-Phe-Ala-ONp 82,6 Масло 0,87 — 0,33 0,93

6. Cbo-Gly-Nor 78,4 Масло 0,60 — 0,52 —

7. Cbo-D-Ala-Nor 86,0 Масло 0,51 — 0,46 0,62

0. Cbo-Phe-Nor 64,2 Масло 06,4 — 0,62 0,73

9. Cbo-Tyr-Nor 80,2 Масло 0,39 — 0,35 —

10. Cbo-Phe-Nor 80,0 Масло 0,44 — 0,45 —

11. Cbo-Tyr(z)-Nor 86,5 Масло 0,76 — 0,63 —

12. Cbo-D-Ala-Phe-Nor 81,0 Масло 0,60 — 0,57 0,68

13. Cbo-Ala-Phe-Nor 80,3 Масло 0,67 — 0,68 0,83

6. Получение конъюгатов производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями

Получение антител к DOPhA важно для выяснения их роли в патогенезе целого ряда заболеваний. В современной литературе описано получение антител к DOPhA, которые могут быть использованы для определения содержания катехоламина в крови и тканях.

В результате проведенных ранее исследований Мива (Miwa А., 1977) и Динером (Diner U., 1980) было установлено, что антитела с катехоламинами обладают различной специфичностью, которая зависит от вида применяемого конъюгированного антигена. При этом основное внимание авторами уделялось способу конъюгации катехоламина с носителем. Специфичность антител к гаптенам зависит также и от ряда других факторов, к которым относятся: количество гаптена, ковалентно связанного с антигенным носителем, вид этого носителя.

В этой работе мы попытались получить специфические антитела к DOPhA. При этом мы основывались на сведениях о существовании определенной зависимости между специфичностью, титром индуцируемых антител и способами конъюгации, видом входящего в состав конъюгата гаптена и количеством присутствующего в антигене гаптена.

Так имеются данные, свидетельствующие о том, что с удлинением "ножки", связывающей гаптен и носитель, возрастает специфичность антител к гаптену (Grata L.J., 1976). На наш взгляд, применение сочетающего реагента, позволяющего создать такую "ножку", может определенным образом повлиять на эту характеристику антител к DOPhA. Возможно, этим объясняется неудачная попытка получения специфических антител к катехоламинам, предпринятая Спектором, который осуществил связывание катехоламина с белком путем непосредственного взаимодействия алифатической аминогруппы НА с карбоксильными группами носителя с образованием пептидной связи.

Далее, мы также попытались оценить влияние различных антигенных носителей, входящих в состав конъюгированного антигена, на иммунохимические параметры индуцируемых антител к DOPhA аминокислотными и пептидными производными DOPhA. Из литературных источников (Spector S., 1971, Смотров С.П. 1984,) известно, что применение в качестве носителя белков с разной молекулярной массой приводит к получению антител с неодинаковой специфичностью.

В связи с этим нами были использованы BSA и Туг, отличающиеся по молекулярной массе и антигенной активности. Кроме того, эти белки, имея определенную первичную структуру, содержат разное количество тех аминокислотных остатков, к которым ковалентно присоединяются молекулы гаптена.

На схемах 3 и 4 приведен синтез таких антигенов двумя различными способами. При этом один из способов основан на использовании такого сочетающего бифункционального реагента как глутаровый альдегид, а другой - на реакции Манниха. Синтезированные конъюгированные антигены после очистки диализом анализировали на содержание связанного белком DOPhA.

Полученные конъюгаты отличались друг от друга по содержанию DOPhA, которое мы выражали в виде молярного соотношения DOPhA/белок. Как видно из табл. 3 наибольшее количество DOPhA связывается BSA (от 15 до 20 молей DOPhA на 1 моль белка) и несколько меньше Туг (от 7 до 10 молей на 1 моль белка).

Исходя из этого, можно заключить, что наибольшие изменения в химической структуре претерпевает BSA за счет его модификации DOPhA.

Таблица 3. Характеристика антител к DOPhA

№ Молярное Титры Сродство Перекре

п/п соотношение антител к антител к стная

Вид антигена белок-DOPhA DOPhA DOPhA,Касс, в м"1 реактив -ность антител

1. BSA-DOPhA 1:18 1:512 4.82+0,09х108 12,6

2. BSA-Gly-DOPhA 1:15 1:512 6,31+0,22х108 6,8

3. BSA-Gly-Gly-DOPhA 1:17 1:2048 8,73+0,27х108 1,3

4. BSA-Gly-Gly-Gly-DOPhA 1:20 1:8192 1,13+0.18х109 0,8

5. Туг-DOPhA 1:7 1:64 1,77+0,17x107 11,9

6. Tyr-Gly-DOPhA 1:8 1:32 2,40+0,09x107 5,9

7. Tyr-Gly-Gly-DOPhA 1:8 1:128 5,94+0,11х107 2,7

8. Tyr-Gly-Gly-Gly-DOPhA 1:10 1:256 1,36+0,27х108 1,2

7. Иммунохимические исследования полученных конъюгатов Полученные конъюгаты на основе BSA и Тут были использованы для иммунизации лабораторных животных. В зависимости от типа конъюгированного антигена, кролики были разбиты на 8 групп по 4 животных в каждой. В работе в качестве стимулятора антигеногенеза мы использовали адъювант Фрейда. По мере проведения курса иммунизации с месячным интервалом у всех животных из 8 групп производили забор крови. Полученные сыворотки от каждого кролика исследовали с использованием иммуноферментного анализа (И.Ф.А.).

Для выбора оптимального антигена предварительно осуществляли иммунизацию кроликов двумя конъюгатами BSA-DOPhA, полученными двумя способами: с использованием ГА и по реакции Манниха. В таблице 3 приведена динамика антителообразования при иммунизации кроликов полученными конъюгатами.

Из таблицы 3 видно, что введение конъюгата BSA-DOPhA, полученного с помощью ГА, индуцирует большее количество антител к DOPhA (титр по истечении 12 месяцев, составляет 1:512), нежели введение конъюгата,

полученного по реакции Манниха (титр 1:64)рис.1. В связи с этим мы эстановились только на антигенах, полученных с помощью ГА, и дальнейшие исследования проводились только с этими антигенами.

Э^ а О О ИаВН,

ТС —СН —ИЕ + >С — (СНг)э — С<С ~^С — СН —И = СН — (СНгЬ — СН = И- белок -

у' I I Н Н НО /

с

но он но он

г к ч

,5 КД = н, С1у. С1у - С1у, С1у— С1у - С1у.

Схема 3. Синтез конъюгата с помощью глутарового альдегида

но I I

-Ш^-ВвА

'о

/у\

0,01 в НС1

-со-сн=сн-с: -*

"""-■ОН 48ч,23°С

Н2-Ш-вза

НО ОН

но^ТТ

СН2 В.

СН2-Ш-В5А

НО ОН

0,01а НС1 О^

С-СН-Ы — СО — СН = СН — СГ -* ^С-СН-Ш

НО-/ I I "^ОН 48 ч; 23 °С НО"' | |

сн2 ь сн2 к

1

\Ш2 —Ш-Туч

но он но он

Где В.11=Н, С1у, С1у-С1у.С1у-С1у—С1у

Схема 4. Синтез конъюгата по реакции Манниха

Последующие исследования по определению качественных характеристик, полученных антител, осуществлялись по истечении 12 месяцев от начала иммунизации.

Для определения специфичности применялся метод подавления связывания антисыворотками 3Н-БОРЬА с возрастающими количествами таких сходных по структуре, ближайших родственных соединений БОРЬА, как НА, А, НМН и МН.

Сыворотки, разбавленные до определенного титра, позволяющего связывать лишь 50% меченного БОРЬА, использовали для оценки перекрестной реактивности. Из результатов перекрестной реактивности (таблица. 3) видно, что связывание 3Н-ЭОРЬА зависит от вида добавляемых нативных катехоламинов. Приведенные результаты свидетельствуют о низкой перекрестной реактивности полученных антител при взаимодействии с А, НМН и МН (от 0,1 до 4,1 %). Вместе с тем наблюдается незначительная перекрестная реакция с НА (12%). Это говорит о том, что антитела к БОРЬА способны "узнавать" структурные изменения в молекуле катехоламина, как в ароматической ее части, так и в

«посредственной близости от нее. Наряду с этим, антитела не обладают такой }ысокой специфичностью для заместителей при аминогруппе и а - углеродном номе алифатической части, которые имеются в молекуле А и НА. Наибольшая перекрестная реактивность антител по отношению к НА, вероятно, вызвана эольшим структурным сходством БОРЬА с НА (Рис.2).

Рис.2. Перекростная реактивность антител

Таким образом, как видно из результатов экспериментов, при сравнительном анализе специфичности антител существенных различий между антисыворотками, полученными при использовании двух разных белков-носителей не наблюдалось, в то же время отмечалось увеличение специфичности антител при увеличении длины мостика от в1у до 61у-01у-01у.

Взаимодействие БОРИА с антителами можно оценить путем инкубации соответствующих антисывороток с 3Н-ООРЬА. Метод сатурационного анализа позволяет рассчитывать константы, характеризующие сродство антител к антигенам. Расчет этих констант мы производили, основываясь на анализе Скэтчарда.

В таблица 3 приведены параметры, характеризующие связывание 3Н-ООРЬА антисыворотками, полученными к соответствующим коньюгатам. Можно видеть, что 3Н-ООРЬА связывается антисыворотками, с высоким сродством.

Наибольшее значение кажущейся равновесной константы ассоциации (Касс) получено в случае иммунизации антигеном В8А-С1у-С1у-С1у-ВОРЬА и приблизительно равно 1,13 х 109 м"1. Наряду с этим, Касс для антител, индуцированных к конъюгатом ВБА-Иу-Иу-ВОРЬА и ВЗА-БОРЬА несколько ниже по величине и соответствует значениям 8,73 х 108 и 4,82 х 108 м'1,

соответственно. Это говорит о том, что антигены, содержащие Gly, Gly-Gly и Gly-Gly-Gly, вызывают индукцию антител с меньшим сродством к DOPhA, по сравнению с антителами, полученными к BSA-Gly-Gly-Gly-DOPhA. Значения этих констант очень высоки, что свидетельствует о высоком сродстве связывающего сывороточного фактора к DOPhA. Аналогичная картина наблюдается в случае исследования антител, индуцированных к конъюгатам, где в качестве белка-носителя был использован Туг. Здесь также можно отметить, что наибольшим сродством к DOPhA обладают антитела, полученные при иммунизации кот.югатом Tyr-Gly-GIv-Glv-DOPliA (Касс = 1,36 х 108 м"1) по сравнению с Tyr-Gly-Gly-GIy-DOPhA (Касс = 5,94 х 108 м"1) и Tyr-Gly-DOPhA (I'acc _ :,!0х 10\м-'), а также исходным Tyr-DOPhA (Касс = 1,77 х 108 м-1).

Tai,им образом, данные, полученные путем применения метода сатурационного анализа, позволяют заключить, что введение в антиген, содержащий DOPhA и белок, трех аминокислотных остатков Gly-Gly-Gly приводит при последующей иммунизации к индукции антител, обладающих наибольшим сродством к DOPhA по сравнению с антигеном содержащим два аминокислотных остатка Gly-Gly и один Gly.

ТвИФА

500

/

400

300

-1-3-!-§-То-iT* Время в месяц

1.БСА-ДОФА(ГА)

2. БСА- ДОФА (Маниих)

Рис. 1. Динамика образования антител

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы синтеза аминокислотных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина методом активированных эфиров, позволяющих получать конечные продукты с выходом 63.5-83.3%. Показано, что проведение реакции конденсации в атмосфере азота позволяет предохранить гидроксильные группы ароматического кольца от окисления.

2. Установлено, что применение метода смешанных ангидридов для конденсациии ди и трипептидов с катехоламинами позволяет получать конечные продукты с выходом 72.6-88.3%, при использовании карбодиимидного метода выход продукта 50.5-63.5%.

3. Изучены различные способы конъюгации катехоламинов, их аминокислотных и пептидных производных с белковыми носителями и определено, что наибольшая степень конъюгации достигается при использовании в качестве носителя бычьего сывороточного альбумина и производного с тремя остатками глицина.

4. Показано, что лучшими антигенными свойствами обладают конъюгаты 3,4-циоксифенилаланина и его моно-, ди —и триглициновых производных с BSA, полученные с помощью глутарового альдегида. Титр специфических антител при этом достигает уровня 1:512-1:8192.

5. Установлено, что специфичность антител к 3,4 - диоксифенилаланину зависит эт длины глицинового мостика и повышается с удлинением мостика от Gly до Gly-Gly-Gly.

5. Высокая специфичность антител, вырабатываемых организмом животных при иммунизации полученными конъюгатами, позволяет использовать последние для эпределения содержания катехоламинов в организме.

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:

I. Мирзорахимов К.К. Синтез некоторых производных норадреналина ; аминокислотами. //Республиканская научно-практическая конференция молодых ученных и специалистов. Часть 1,- Душанбе:-1985.-С.112. >. .Мирзорахимов К.К. Синтез аланин-содержащих пептидов производных горадреналина. //Республиканская научно-практическая конференция молодых /ченых и специалистов секции химических наук.- Душанбе: -1987.-С.53 !. Мирзорахимов К.К. Синтез модифицированных ДОФА. //Республиканская тучно-практическая конференция молодых ученых и специалистов секции [имических наук. - Душанбе:-1989. - С.67.

к .Мирзорахимов К.К.,Зегельман А.Б.,Смотров С.П. Биологически активные фоизводные катехоламина. //Третье региональное совещание республик Средней ^зии и Казахстана по химическим реактивам. -Ташкент: - 1990.-С.105.

5. Мирзорахимов К.К.,Зегльман А.Б. Синтез аминокислотных и пептидных производных норадреналина деп.2.02.90 № 15 ( 650) 76-90 — Душанбе- 1990.11С.

6. Мирзорахимов К.К., Шарипова И.Н., Смотров С.П., Юсупов Т. Ю. Получение антител к дигидрооксифенилаланину и изучение их иммунохимических свойств.//Труды первой научной конференции биохимического общества РТ. Проблемы биохимии. - Душанбе:-1990.-С.79

7. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Зельгман А.Б., Смотров С.П. Синтез аминокислотных и пептидных производных норадреналина. //Вестник Таджикского Государственного Университета №4 серия химия, биология.-Душанбе:- 1991.-С.71-76

8. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю. Синтез пептидов на основе катехоламинов. //Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава ТГНУ. Серия естественных наук,-Душанбе:-1994-С.95.

9. Мирзорахимов К.К., Рахимов И.Ф., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П. Пептидные производные 3,4-диоксидениапанина и их фармакологические свойства. //Труды Республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского Национального Университета «Физиолого-Биохимические основы продуктивности растений» - Душанбе: - 1998. С.46-47.

10. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П. Синтез и изучение трипептидов, включающих норадреналин и 3,4-диоксифенилаланина. //Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Технологического Университета Таджикистана. - Душанбе: -1996. С.55-63.

11. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П. Синтез ди- и трипептидов, включающих остатки катехоламина. //Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Технологического Университета Таджикистана. - Душанбе: - 1996. С.63-68.

12. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П. //Материалы Юбилейной научно-теоретической конференции посвященной 50-летию Университета. -Душанбе: - 1998. С.84.

13. Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П. Получение специфических антител к глицил-глицил 3,4-диоксифенилаланину. //Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Технологического Университета. - Душанбе; - 1999. С.-59-61.

14.Мирзорахимов К.К., Юсупов Т.Ю., Смотров С.П., Рахимов И.Ф. Адренолитические исследования глицил-глицил 3,4-диоксифенилаланина. //Материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Технологического Университета Таджикистана. -

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Катехоламины и возможность получения лекарственных препаратов на их основе.

1.2. Использование методов органической химии для получения конъюгатов.

1.3. Антитела к катехоламинам как инструмент исследования нейромедиаторов.

Глава II. Обсуждение результатов.

2.1. Синтез аминокислотных и пептидных производных

3,4 - диоксифенилаланина (DOPhA).

2.2. Синтез аминокислотных и пептидных производных норадреналина

2.3. Очистка синтезированных пептидов с использованием ВЭЖХ.

2.4. Получение конъюгатов производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями.

2.5. Иммунохимические исследования полученных конъюгатов.

2.6. Фармакологические исследования аминокислотных и пептидных производных 3,4 - диоксифенилаланина.

Глава III. Экспериментальная часть.

Выводы

Актуальность проблемы. Одной из задач современной органической химии, является разработка путей синтеза новых лекарственных препаратов. В последние десятилетия бурное развитие получила химия пептидов, что связано с широким спектром биологической активности, проявляемым соединениями пептидной природы, которые при введении в структуру лекарственных препаратов улучшают их некоторые фармакологические характеристики: растворимость в воде, про-лонгированность действия.

При низком содержании в организме катехоламинов используется предшественник этих моноаминов - 3,4-диоксифенилаланин, непосредственно участвующий в биосинтезе катехоламинов. Однако, эти соединения часто не оказывают желаемого терапевтического эффекта. Поэтому поиск новых препаратов как усиливающих, так и снижающих фармакологический эффект катехоламинов, является актуальным. Одним из способов снижения концентрации в организме нежелательных биологически активных соединений является применение высокоспецифичных антител к этим соединениям. В связи с этим проблема поиска соединений, с помощью которых можно получать высокоспецифичные антитела к катехолами-нам и методов их синтеза, является весьма актуальной.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является синтез аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, получение коньюгатов производных с белковыми носителями, изучение их антигенных и фармакологических свойств.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать методики и синтезировать аминокислотные и пептидные производные катехоламинов;

- изучить физико-химические свойства полученных соединений;

- синтезировать конъюгаты полученных производных с белковыми носителями;

- изучить антигенные и фармакологические свойства полученных соединений. Научная новизна. Впервые получены пролиновые, фенилаланиновые, моно-, ди-, триглициновые и аланил-фенилаланиновые производные 3,4-диоксифенил-аланина и норадреналина. Впервые синтезированы конъюгаты, полученных производных катехоламинов с бычьим сывороточным альбумином и тиреоглобули-ном. Установлено, что наиболее удобным для получения коньюгатов аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями, является использование в качестве сшивающего агента глутарового альдегида. Выявлена зависимость между специфичностью антител и длиной глицинового мостика.

Практическая значимость. Разработан способ синтеза аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, и способ получения белковых коньюгатов производных катехоламинов. Синтезированные коньюгаты могут быть использованы при получении высокоспецифичных антител к 3,4-диоксифенилаланину.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского государственного национального университета (Душанбе, 1998г.), конференции молодых ученых и специалистов Республики Таджикистан (Душанбе, 1985-1989г.), третьей реги-нальной конференции по реактивам (Ташкент, 1990г.) и на конференции биохимического общества Республики Таджикистан (Душанбе, 1998г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах мшинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, и списка литературы, включающго 132 источника.

выводы

1. Разработаны способы синтеза аминокислотных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина методом активированных эфиров, позволяющих получать конечные продукты с выходом 63.5-83.3%. Показано, что проведение реакции конденсации в атмосфере азота позволяет предохранить гид-роксильные группы ароматического кольца от окисления.

2. Установлено, что применение метода смешанных ангидридов для конден-сациии ди и трипептидов с катехоламинами позволяет получать конечные продукты с выходом 72.6-88.3%), при использовании карбодиимидного метода выход продукта 50.5-63.5%).

3. Изучены различные способы конъюгации катехоламинов, их аминокислотных и пептидных производных с белковыми носителями и определено, что наибольшая степень конъюгации достигается при использовании в качестве носителя бычьего сывороточного альбумина и производного с тремя остатками глицина.

4. Показано, что лучшими антигенными свойствами обладают конъюгаты 3,4-диоксифенилаланина и его моно-, ди -и триглициновых производных с BSA, полученные с помощью глутарового альдегида. Титр специфических антител при этом достигает уровня 1:512-1:8192.

5. Установлено, что специфичность антител к 3,4 - диоксифенилаланину зависит от длины глицинового мостика и повышается с удлинением мостика от Gly до Gly-Gly-Gly.

6. Высокая специфичность антител, вырабатываемых организмом животных при иммунизации полученными конъюгатами, позволяет использовать последние для определения содержания катехоламинов в организме.

1. Матлина Э.Ш, Меньшиков В.В. Клиническая биохимия катехоламинов.-

2. М.: Медицина, 1967. 307 с.

3. Говырин В.А., Леонтьева Г.Р. Катехоловые амины и симпатические нервысердца. В кн.: Адреналин и норадреналин. М.: Наука,- 1964, с. 72-75.

4. Gorin F.A., Balasubramanian Т.М., Barry C.D., Marshall G.R. Synthesis, analy-etic activity and physical dependence capacity of 5 phenyl - 6,7-benzomophan derivatives.//J. Supramol.- 1978. - v.9. - p. 27-39.

5. Саидов С.С. Синтез и анальгетическая активность новых димерных аналоговбета казомарфина-3 и бета - казомарфина - 5. :Дис.канд. хим. наук. Душанбе. 1997. - 110 с.

6. Voigt В.,Wagner G.Synthese von N -a-(benzoylglycyn) and N- a- (benzyloxycarbonylgycyl)-4-amidinophenylalaninamides als Thrombinihibitozen.// J. Phaz-mazie. 1985. - v.40.-№8.-p. 527-529.

7. Федотов В.П., Камолов И.С., Бушуева Г.И., Батрамеева Л.А., Иванова А.И.

8. Синтез и свойства урацилаланинового аналога тиреолиберина //Ж. Общ. химия-1985. Т 57.-№ 3-е. 712-713.

9. Abiko Т., Onodera J., Sekino Н. Synthesis and immunological effects of thymosin , and its frog ments on inhibitory factor in minimal changes ntphrotic syndrome. //Chem. Pharm. Bull. Tokyo. - 1980. - v.28. - p. 3542.

10. Atassi M., Webcter R., Localization, synthesis and actirlity of an antigenic suteon influenza virus Htmagglutinin. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. - v. 80. - p. 840 - 844.

11. Avery M., Verlanden M.S., Goodman M. Synthesis of ring alkylated isoprotenolderivativas. //J.Org. Chem. -1981. v. 46.-№ 24,- p. 4859-4863.

12. Voigt В., Wagner G. Synthese von N- a -(Benzoy eglycye) und N- a -(Benzyloxycarbonylgycye)-4-amidinophenyl-alaninamiden a Is thrombinhibitozen// J. Pharm. 1985. - v.40.- № 8.- p. 527-529.

13. Deruiter J., Swearingtn B.E., Wandrecar V., Mayfield C.A. Synthesis and invutro aldose reductare inhibitory activity of compounds containingan N -aclylglycine moiety. //J. Med. Chem. 1989. - v.32.- p. 1033 - 1038.

14. Юсупов Т.Ю., Кимсанов Б.Х., Гоффер И.Я. Исследования в области органической химии. Душанбе: Дониш, 1981. - с. 43-51.

15. Verlander M.S., Jacobson А.К., Rozenkranz R.P., Melmon K.L. Some novel ap-proachts to the gesugn and synthesis of peptide catecholamine.//! Biopol.-1983.- v.22.- p.531-545.

16. Modilevery L., Sefcchip. //J. Med.clin.-1978.- v.38.- p.27-30.

17. Ройтруб Б.А., Олешко Н.Н.//Физиология животных. 1979. - Т.25. №3.-с.239-241.

18. Allain H.//J.Phychophormocolosi. -1979.- v.61.-p. 197-202.

19. Крис E.E., Волченскова И.И., Бударен Л.И. Координационные соединения ме-талов с лекарстваминовые эффективные терапевтические агента // Коорд. химия. 1990.-т.16.-вып. 1.-с. 11-21.

20. Петров Р.В. Иммуналогия. -М., Медицина, 1987.-415с.

21. Landsteine К. The specifity of serological reaction. Cambridge: Harvard., 1944

22. Yshirawa E., Yoshitake S. A general and Mild procedure for the purification of rabbit Fab"- antibodies// J/ Ymmunol. Meth.-1980.-v.38.-p.l 17-123.

23. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. Ensyme Ymmunnnoassay in duagnostic Medicine// Bull. WHO.-1976.-v.53.p.55-65

24. Pain D., Surolia A. Preparation of protein A-peroxidase monoconjudate usin a luterobifunctional readent, and its use in enzyme immunoassay// J. Ymmunol. Meth.-1981.-v.40.-p.219-230.

25. Мешандин А.Г., Шмакова C.B. Хамосорбция в синтезе твердофазных биоли-гандов для гетерогенного иммуноферментного анализа// Биотехнология.- 1994.-№4.-с. 31-36.

26. Шмакова С.В., Мешандин А.Г. Связь между строением химических модификаторов и свойствами пластиковых сорбентов для твердофазного иммунифермент-ного анализа// Биотехнология.-1994.- №4 .-с.37-39.

27. Wilkins S.P., Kelso D.M. Estimation of the protein. Binding capacuty of microplate wells using sequental ELISAS// J. Ymmunol. Meth.-1995.-v.l78.-№l.-p.59-70.

28. Aman I.M. Development of a new method for deyection of AFM1. in cheece and yodhurt by bead-elisa. Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. -1994.-v.l6.-№5-6.-p.l84-186.

29. Periara J., Brahmbhatt N.D., Matraj. U. Improved presentation of antigenic sites in enzyme-linked immunosorbent assay: antigenicity of reduced carboxymethyletecl ribo-blavin carrier protein// indian J.Biochem. and Biophys.-1993.-v.30.-№4.-p.209-213

30. Джафарова А.Н.,Скоробогатько О.В.,Степанова Е.В.,Яронолов А.И. Иммуно-ферментный анализ на основе лаккацных коньюгатов с флуфиметрической детекцией продукта ферментативный реакции// Прикл. Биохимия и микробиология. 1995.-т.31-№1-с 128-133.

31. Петров Р.В., Кабанов В.А. Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины// Иммунология.-1998.- №1. -с.5-24.

32. Дмитриев Б.А. Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин// Иммунология-1986.- №1-с.24-29.

33. Sela М. Vaccins sunthetriques: unzeve or une realite // Bull just. Pasteur.-1974.-v.72.-№l.-p.73-86.

34. Audrbern F., Jolivel M., Chedid L., Arnon R., Sela M. Successful immunization with a totally synthetic diphtheria vaccine// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1982. -v. 79- №16.-p. 5042-5046.

35. Miller G.M. Shapira M., Arnon R. Anti-influence response achieved by immunization with a synthetic conjugate// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1982. -v. 79.- №1.p. 569-573.

36. Валиев P. Синтез олиго- полипентидов фрагментов гемаглютинина и иммуноглобулина G1h изучение их антигенных и иммуногенных свойств: Дис. канд. хим.наук.- Душанбе 1988.-133с.

37. Bittle J.L. Houghten R.A., Alexander Н. etal. Protection against foot and mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence//Nature.-1982. -v. 289.-p. 30-33.

38. Мудрак H.C. Антигенные и иммуногенные свойства синтетических пептидов вируса ящура А22: автореф дис. канд. биол. наук. Владимир, 1993.

39. Вальнина О.М. Теоретические и практические подходы к созданию искусственной противоящурной вакцины на основе синтетических пептидов. Дис. док. хим.наук в форме научн.докл.-Москва, 1992.

40. Халиков Ш.Х., Шахматов А.Н. Вирус ящура и проблема создания синтетических вакцин// Иммунология-1989.- №4.-с. 18-22.

41. Халиков Ш.Х., Исмаилов М.И. Шахматов А.Н. Синтез 17 членного пептида (143-159)- фрагмента белка VP1 вируса ящура A12.II. Синтез фрагментов (143145), (146-148), (149-152), (153-155) и (156-159)// Биоорган.химия.-1990.-т.16.-№11.-с.1477-1487.

42. Халиков Ш.Х.,Шахматов А.Н., Исмаилов М.И. Синтез 17- членного пепти-да(143-159)- фрагмента белка VP1 вируса ящура А.2. II. Конденсация рагментов//Биорган.химия.-1990.-т. 16.-№ 11.-с.1488-1499.

43. АшуровС.Г., ХаликовШ.Х., АлиеваС.В., Шахматов А.Н. Протективная активность синтетических пептидов.// Мат. науч. конф., посвященной 50-летию Института химии им. В.И.Никитина АН РТ // Тез. докл.-Душанбе, 1996.-е. 13.

44. Халиков Ш.Х.,Алиева С.В.,Ашуров С.Г.Синтез новых аналоговых фрагментов VP1 вируса ящера типа А22. Синтез фрагментов 134-139,134-145,MOMS,150-155,150- 159. Биоорган, химия-1994.-Т,20 -№24.-с.393-405.

45. Тремасов М.М.,Беляева Л.Л.,Абульханов А.Г.Равилов А.З. Синтез комъюгат-иммуногена для индикации Т-2 токсина.//Ветеринария.-1999.-№10.- С.24-25.

46. Петров Р.В.,Хаитов Р.М.Лиднер А.Л.,Томина Л.А.,Некрасов А.В.,Степанова

47. Е .Н.Андреев С.М., Борисова В.Н.,Ракова О.Л.Полностью синтетические пеп тид-полиионные комплексы обладают протективным эффектом при гриппозной инфекции.//Иммунология.-1986.-№1 .-С.29- 32.

48. Glazer A.N.,Delance R.J.,Sigman D.S.,Laboratory technique in biochemistry and biology. Elsevios Biomedical Press.- 1975.-p.230.

49. Ашуров С.Г. Синтез и исследование иммунологических свойств пептидов-фрагментов вируса ящура А12 и А22: автореф. дис.канд. хим.наук.-Душанбе, 1996-24с.

50. Алексеева М.Ю.,Вафина М.Г.,Некрасов А.В. Искусственные вакцины против сальмонеллезной инфекции в эксперементе. //Иммунология.-1986-№1.- с.32-36.

51. Reuter A.M., Ketelslegers I.M., Hendreck I.С., Franchimant P. Radioimmunoassay of Protein Hormones: Principles and Methodology. // Hormone Res.- 1978.- vol.9.- p. 404-421.

52. Klemola T.T. Quantitative Determination of ergot alkoloids in biological fluids by radioimmunoas say. //Br. J. Clin. Pharmacol,- 1978.-v. 6.-p. 255-260.

53. Spectors. Application of the Radioimmunoassaypsycho-active Drugs.//In: Psycho-pharmacology: A Generation of Progress. N.Y., Raven Press.- 1978.-p. 887-894.

54. Peskar B.A., Peskar B.M. Advances in hapten immunoassay. //Euro. J. Drug Metab. Pharmacokinetics.- 1977.- v.2.- p. 163-170.

55. Voller A., Bartlett A., Bidwell D.E. Enryme immunoassays with special reference to ELISA techniques. //J Clin. Pathol.- 1978.-v. 31.-p. 507-520.

56. Iwasa S., Kondo K., Miya Т., Takeda K. Enzyme immunoassay of a- adrenergic agent using galactosidase as label.// Immunopharmacology.- 1978.- vol. 1.- p. 3-12.

57. Montgomery M.R., Holtzman J.L., Leute R.K. Application of Electron Spin Resonance to determination of Serum Drug concentration.// Clin. Chem.- 1975- v. 4.- p. 1323-1328.

58. Wei R., Almirer R. Spinmmunoassay of progesterone. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1975.-v. 62.-p. 510-516.

59. Ullman E.F., Schwarrberg M., Rubenstein K.E. Fluorescent excitation transfer immunoassay. A general method for determonation of antigens.// J. Biol. Chem.-1976.-v. 251,-p. 4172-4178.

60. Cais M., Dani S., Josephy V., Modiano A., Gerson H., Mechaulam R. Studies of cannabinoid metabolites a free radical immunoassay. // FEBS Lett.- 1975.- v. 55.- p. 257-260.

61. Colburm W.A. Specific Antibodies and Fab fragments to alter the pharmacokinetics and reverse the pharmacologic toxicologic effects of drugs. // Drug Metab. Rev.-1980.- v. 11.-p. 223-262.

62. Khaw B.A., Bellar G.A, Haber E., Smeth T.W. Localization of cardiac myocardial infarction. // J. Clin. Invest.- 1976.- v. 58.- p. 439-446.

63. Khaw B.A., Fallon J.T., Strauss H.W., Haber E. Myocardial infarct imaging with Indium 111 - diethulene triamine pentaacetic acid - anticanine cardiac myosin antibodies,//Science.- 1980.- v. 209.-p. 295-297.

64. Davis T.R., Meade K.M. Biologically active antibodies to histamine.// Nature.-1970.- v. 226/- p. 360.

65. Wrenns., Haber E. An antibody specific for propranotol binding site of cardiac musele. // J. Biol. Chem.- 1979.- v. 254,- p. 6577-6582.

66. Haber E. Antibodies in vivo. // Pharmacol. Rev.- 1982- v. 34. -p. 77-84.

67. Koch R.B., Desaiah D., Gkick В., Subba Raos V., Stinson R. Antibody reactivation of kepone inhibited brain ATPase activaties.// Gen. Pharmacol.- 1977.- v.- 8.- p. 231234.

68. Latifi M., Tabatabai M. Immunological studies on Iranian scorpion venom and antiserum. // Toxicon.- 1979.- v. 17.- p. 617-621.

69. Ziehler E.J., Mccutchan J. A., Braude A.I. Successful treatment of human gram negative bacteremia with antiserum against endotoxin core. // Cein. Res.- 1981.- v. 29.- p. 576A.

70. Caldwell P.R., Wigger H.J. Angiotensin converting enryme: effect of antienryme antibody in vivo. // FEBS Lett.- 1976.- v. 63.- p. 82-84.

71. Dzau V. J., Kopelman R. I., Bazger A. C., Haber E. Reninspecifiue antibody or study of cardiovascular homeostasis.// Science.- 1980.- v. 207.- p. 1091 1093.

72. Kahn C.R., Flier J.S., Bar R.S., Archer J.A.,Gorden P., Martin M.M., Roth J. The syndromes of insulin resistance and acanthosis nigricans: insulin receptor dis-ordersin man.// New End. J. Ned.- 1970.- v. 294.- p. 739 - 745.

73. Shiu R. P., Friesen U.G. Blockade of prolactin action by an antiserum to its resep-tor.// Science.- 197 b. v. 192.- p. 259. 2 bl.

74. Heinemann S., Bevan S., kullbery R., Lindstrom J., Rice J. Modulation of acetylcholine receptor by antibody against the receptor. // Proc. Nat. Acad. Sci USA.-1977.-v. 74.-p. 3090-3094.

75. Christlieb A.R., Biber T.U., Hickler R.B. studies on the role of angiotensin in experimental renovascular hyper tension: An immunological approach. // J. Clin. Invest.-v. 48,-p. 150-158.

76. Frantz A.G., Kleinbery D.L. Prolactin :Evidence that it is separate from growth homone in human blood. //Science.- 1970.- v. 170.- p. 745 747.

77. Good frind T.L., Webster M.E., Me Guire J. S. Complex effects of antibodies to polypeptide hormones. // J. Clin. Endorinol. Metab.- 1970.- v. 30.- p. 565 572.

78. Lipshutz W., Hughes W., Cohen S. The genesis of lower esophagial sphincter pressure: Its identification through the use of gastrin antiserum. // J. Clin. Invest.- 1972.-v. 51.- p. 522-529.

79. Terry L.C., Willonghby J.O., Braren P., Martin J.B., Patel Y. Antiserum to somatostatin prevents stress-induced inhibition of growth hormone secretion in the rat. // Science.- 1976.- v. 192.- p. 565 567.

80. Woodside W. F., Heimberg M. Effects of antiinsulin serum, insulin and glucose on output of triglycerides and on ketogenesis by the perfused rat liver. // J. Biol. Chem.-1976.-v. 251.-p. 13-23.

81. Hoist J.J., Galbo H., Richter E.A. Neutralization of glucagon by antiserum as a tool inglucagon physiology: Lack of depression of basal blood glucose after antiserum treatment in rats.// J. Clin. Invest.- 1978.- v. 62.- p.l 82 190.

82. Neri R.O., Tolksdorf S., Beiser S.M., Erlanger B.F., Agate F.J., Lieberman S. Further stusies on the biological effects of passive immuniration with antibodies to steroid protein conjugates. // Endocrinology.- 1964.- v. 74.- p. 593 -598.

83. Ferin M., Dyrenfirth I., Cowchock S., Wazzen M., Vande Wide R.L. Active immunization to 17,3-estradiol and its effects upon the reproductive cycle of the rhesus monkey. // Endocrinology.- 1974.- v. 94.- p. 765 760.

84. Fitzpatrick F.A., Gorman R.R., Bundy G.L. An antiserum against 9,11-aro-15 hydroxy-prosta-5,13-dienoic acid recognises and binds prostaglandin endoperoxides. //Nature.- 1978.- v. 273.- p. 302 304.

85. Randive N.S.,Sehon A.H. Antibodies to serotonin. // Can.J.Bio chen.-1967.-v.45.-p.1701-1710

86. O'brien R.A.,Boublik M.,Spector S. Immunochemicological studies using 5-Hydroxytiramine antibody .//J.Pharmacol.Exp. Ther.-1975.- v.194.-p.145-153.

87. Niles L.R.,Brown G.M.,Grota L.J.Effects of hentralization of circulating melatonin and N-acetilserotonin on plasma prolactic levels.//Nervendocrinology.- 1977.-v.23.-p. 14-22

88. Berkowitz В., Spector S. Evidence for active immunity to morphine in mice. // Science.- 1972.- v. 178.- p. 1290 1292.

89. Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M., Schuster C.R. In vitro morthine antagonism by antibodies./Nature, 1973, vol. 241. p. 537 538.

90. Gunne L.M., Jonsson J., Paalrow L., Anggard E. Antibody-bound nalorphine. / Nature, 1975, vol. 255, p. 418 419.

91. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., Данилова Н.П. Ковалентное связывание фенобарбитала с белком для получения атнитела нейтрализующих токсическое действие фенобарбитала.//Хим.-фарм.- 1976.- № 1.- с. 7 10.

92. Butler Y.P., Smith T.W., Schmidt D.H., Haber E. Immunological reversal of the effects of dioxin./. Fed.Proc. 1977,-v. 36.- p. 2235 2241.

93. Flynn E.J., Cerreta K.V., Spector S. Pharmacologia respanse to pentobarbital in actively immunized mice.// Eur.J.Pharmacol.- 1977.- v. 42.-p. 21 29.

94. Cerreta K.V., Flynn E.J., Spector S. Pharmacological response to pentobarbital in passively immunized mice.// Eur.J.Pharmacol.- 1979.- v. 54.- p. 365 371.

95. Butler V.P., Atibodies as specific Antagonistsof Toxin, Drugs and Hormones.// Pharmacol.Rev.- 1982.- v. 34.- p. 109 114.

96. Berg D., Kuss E. Specific antibodies for ЮН of 4-hydroxy-estrogens and their characterization b I 125 labeled indicator haptens.// Hoppe- Slyler's Z. Physiol. Chem.- 1980.- v. 361.-p. 1743 - 1746.

97. Marton J., Meretey K., Stark E. Prepartion and assessment of antisera to ACTH.// Mol. Cell. Endokrinol.- 1977- v. 8.- p. 213 223.

98. Tateishi К., Hamaoka Т., Takatsu К., Hayashic. A novel immunization procedure for production of anti testosterone and anti-52 - dihydro testosterone antisera of low cross reactivity // J. Steroid Biochem.- 1980.- v. 13.- p. 951 - 959.

99. Kamel. R., Gardner J. Preparation of 1251 Iodine Labelled methotrexate and it use in a magneticable particle salid - phase radioimunization say.// Clim. Chim. Acta.-1978.-v. 89.-p.363 -370.

100. Talamo. R.C., Haber E., Austen K.F. Ahtibody to coupling on specificity and affinity.//J. Immund.- 1968.-v. 101.-p.333 341.

101. Erlanger B.G. Principle and Methods the Preparation of Druy Protein Conjugates for Immunologgical studies.// Pharmacol. Rev.- 1973.- v. 25. p. 271 - 280.

102. Butler V.P., Beiser S.M. Antibodies to small molecules: biological and clinical application s.// Adv.Immunol.- 1973.- v. 17.-p.255 310.

103. Hendel J., Sarek L.J. Production of Methotrexate antiserum in rabbits: the significance of immunogen solubility, haten content and mode of administration of the antibody response.// Scand. J. Clin. Lab. Invester.- 1977.- v. 37.- p. 273 278.

104. Wisser H.,Herrmann R.,Knoll E.Methodikal investigation of the production of antibodies towards 3,4 dimethoxyphenylethylamine. //Clin.Chim.Acta.- 1978.v. 8.-p. 179- 185.

105. Faraj B.A.,Lawson D.H.,Nexon D.H.,Murray D.R., Camp V.M., Ali F.M., Black M., Stacciarini W., Tarcan V. Melanoma Detection By Enrymeradioimmuno assay of L-DOPA, dopamine and 3-o- methyldopamine in urine. // Clin.Chem.- 1981.-v.27.-p.l08-112.

106. Shirahata A.,Voshoka M., Matsushita M., Tamurar.Studies on radioimmunoassay of metanephrint.// Chem. Pharm. Bull.- 1980.- v.28.- p.2994 3001.

107. PeskarB.A., Pesher.B.M, Levine L. Specificities of antibodies to normetaneph-rine.// Eur.J.Biochem.- 1972.- v.26.-p.l91 195.

108. Lam R., Artal R., Fesher D. Radioimmunoassay for free and conjugated urinary metanephrine. // Clin. Chim.- 1977.- v.23.- p. 1264 1267.

109. Kiceberg.L.J., Van Vunakis H. Estimation of В 3,4 - dimethopheny - lamine and related compounds in urine extracts by radioimmunoassay.// Biochem. Pharmacol.- 1975,- v.24.~ p.259 - 265.

110. Miwa A.,Yoshioka M.,Shirihata A.,Nakagava J.,Tamura Z.Preparation of a specific antibody to each one of cateholamins and L-DOPA. //Chem.Pharm.Bull.-1976.-v.24.-p.1422-1424.

111. Miwa A.,Yoshioka M.,Shirihata A.,Tamura Z.Preparation of a specific antibodies to cateholamins and L-3,4-dihydroxyphenylamine. Preparation of the Conju-gates.//Chem.Pharm.Bull.-l 977.-v.25.-p. 1904- 1910.

112. Miwa A.,Yoshioka M., Tamurar Z. Preparation of specific antibodies to catecholamines and L 3,4 - dihydroxyphenylanine.lll. Preparation of antibody to Epinephrine for radioimmuoassay. //Pharm. Bull.-1978.- v.26.- p.3347-3352.

113. Diener U., Knoll E., Wesser H. Preparation of antibodies to catechomines and metabolites syntheses of various immunogens and characterrization of the resulting. Antibodies. //Clin. Chim. Ac. -1981.- v.l09.-p.l-l 1.

114. Yoshioka M.,Miwa A.,Tamura Z. Antigene and verfahren zu ihrer herstelling.//Patent BRD,Jut.Cl.C0767/00,A61 K37/02, A/61k31/185,A61 K31/<195.-№2.608.096,1976.

115. Grota L. J., Brown G.M. Antibodies to Catecholamines.//Endoerinolode.- 1976.-v.92.-p.615 -622.

116. Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов. М.: Мир. -1965, 821 с.

117. Гросс Э., Майенхофер И. Пептиды, основные методы образования пептидных связей. Пер. с англ. М.: Мир, 1983 - 421 с.

118. Anderson G.W., Zimmerman J.E., Callahan F.M. A Reinvestigation of the Mixed Carbonic Anhydride Method of peptide Synthesis // J.Am. Chem. Soc. -1967.-v. 89.-p. 5012-5017.

119. Anderson G.W., Gregor A.C. t-butyloxycarbonyl-amino Acid and ther use in Peptide Synthesis // Amer. Chem. Soc. 1957.- № 79.- p. 6180-6193.

120. Bodanszky M., du Vigneaud V., //J. Am. Chem. Soc.-1959.-v. 81.- 5688-5691.

121. Bodanszky M., Williams N.J.// J. Am. Chem. Soc.-1967.- v. 89.-p.685-689 .

122. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев.: Наукова думка. 1987 39 с.

123. Patent. 3. 704 282 USSR, GOS g 20/38. Catecholamine Ahtigens and Antibodies Specific therefor // Spector S (USA).-Application Apr. 9, 1971.

124. Смотров С.П. Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого ка-техоламина на миокард: Дисс. канд. биолог, наук.- Москва, 1984- 102 с.

125. Grota L.J., Brown G.M. Antibodies to catecholamines .// Endocrinology. 1976.- v. 98.-p. 615-622.

126. Doty J.R. Photometric determination of epinephrine in pharmacentied products.//.!. Andl. Chem.-1948.-v.20.-p.l 166-1668.

127. Seatchard G/ The attraction of protein for small molecules and ions.//J. Ann. N.Y.Academ. Soi.-1949.-v.51.-p.660-672.1. J> осснйседзгоеуддрст0ЕУ1Щ.;1. OW-2-о/