Подходы к моделированию иммуногенных пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА и Ю. А. ОВЧИННИКОВА

I

на правах рукописи

I

Титова Майя Адольфовна

ПОДХОДЫ К МОДЕЛИРОВАНИЮ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДОВ.

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2003

Работа выполнена в Институте биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор химических наук О.М. Вольпина

Официальные оппоненты: доктор химических наук E.H. Олсуфьева

кандидат биологических наук Е.В. Свирщевская

Ведущая организация - НИИ Фармакологии РАМН

заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. .16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан » 2003 г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор химических наук

2©О5- А

742}

' Характеристика работы

Актуальность проблемы. Способность пептидных фрагментов белков в свободном виде индуцировать образование антител имеет большое значение для создания пептидных противовирусных и антибактериальных вакцин, разработки диагностических тест-систем, а также получения противобелковых антител для научных исследований. Обычно используемый для индукции противопептидных антител метод конъюгации пептидов с белком или другим высокомолекулярным носителем сопровождается рядом нежелательных процессов, таких как высокий уровень образования антител к носителю и индукция долговременной Т-клеточной памяти на чужеродный белок-носитель [Ben-Yedidia Т et. al., 1997]. В связи с этим особый интерес вызывают пептидные последовательности, способные вызывать образование антител in vivo без конъюгации с белковым носителем.

В соответствии с представлениями современной иммунологии, необходимым условием образования противопептидных антител является наличие в аминокислотной последовательности белкового антигена Т-хелперного эпитопа. Т-хелперный эпитоп участвует в образовании тройного комплекса с молекулой МНС П1 и Т-клеточным рецептором, что приводит к активации Т-хелперных клеток и к стимуляции выработки антител В-клетками. Существующие на данный момент способы теоретического предсказания расположения Т-хелперных эпитопов в белковых последовательностях основаны на результатах опытов in vitro, а в опытах in vivo не всегда обладают достаточной эффективностью и достоверностью. Поэтому одним из наиболее важных подходов к моделированию иммуногенных пептидов, способных в свободном виде индуцировать образование антител, является разработка простых и доступных методов предсказания расположения Т-хслпсрных эпитопов в молекуле белка, которые позволили бы быстро и эффективно выявлять в последовательности иммуногенные участки, а также открыли бы возможности повышения иммуногенных свойств пептидов путем точечных изменений в их структуре.

Другим подходом к моделированию иммуногенных пептидов является создание пептидных конструкций, включающих известные В-клеточные и Т-хелперные эпитопы белка, с помощью которых можно имитировать развитие протективного иммунитета к различным патогенам. Для применения этого подхода необходимы знания о локализации иммуноактивных участков в аминокислотных последовательностях белков изучаемого

1 Принятые сокращения: молекула МНС II - молекула главного комплекса гистосовместимости II класса; ТПЛ - титр противопептидных антител (-!§); ТВА - титр виттммЯтпа ггщуюпшх антител Мое-О: ПАФ - полный адъювантФрейнда | рос национальная!

1 библиотека i 1

СПегер^^ |

патогена и сравнительный анализ свойств различных вариантов конструкций для выбора соединений, наиболее эффективно имитирующих развитие протективного иммунитета.

Цели и задачи работы. Целью настоящего исследования являлась разработка подходов к моделированию иммуногенных пептидов: во-первых, создание простого и эффективного метода предсказания структуры пептидов, способных в свободном виде индуцировать выработку антител у мышей; во-вторых, конструирование высокоиммуногенных индуцирующих противовирусный иммунитет пептидов, включающих В- и Т-эпитопы структурного белка VPi вируса ящура. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода предсказания последовательности пептидов, способных в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем индуцировать выработку противопептидных антител у мышей гаплотипов H-2b, H-2d, H-2k.

2. Выбор иммуногенных фрагментов в последовательностях белков ОраВ и NspA из бактерии Neisseria meningitidis, белков Е и NS1 из вируса клещевого энцефалита с помощью предложенного метода.

3. Моделирование иммуногенных пептидов из неактивных фрагментов белка Рог А менингококка и белка VPi вируса ящура с помощью предложенного метода.

4. Дизайн конструкций, включающих в себя иммуноактивные участки белка на примере белка VP) вируса ящура.

5. Сравнительный анализ иммуногенных и протективных свойств полученных конструкций, изучение специфичности индуцируемых ими антител, выбор конструкции, наиболее эффективно защищающей животных от заболевания при заражении вирусом ящура. Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе в качестве

одного из подходов к моделированию иммуногенных пептидов предложен новый простой метод предсказания последовательности пептидов, способных вызывать выработку антител у мышей в свободном состоянии, без конъюгации с белком-носителем. На основании этого метода осуществлен выбор иммуногенных фрагментов в последовательности белков ОраВ и NspA бактерии Neisseria meningitidis, белков Е и NS1 вируса клещевого энцефалита. Кроме того, с помощью этого метода произведено моделирование иммуноактивных аналогов фрагментов белка VP| вируса ящура и бежа Рог А менингококка на основе неактивных последовательностей.

В рамках другого подхода к созданию иммуногенных пептидов предложена структура четырех новых пептидных конструкций, включающих известные В- и Т-хелперные эпитопы белка VPi вируса ящура. Изучены иммуногенные и протективные свойства полученных пептидных конструкций и проведен их сравнительный анализ. Выявлена высокоактивная конструкция, моделирующая индукцию противоящурного иммунитета.

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на Российско-германском симпозиуме по химии пептидов и белков (Пущино, 1994), симпозиуме по химии пептидов в иммунологии (Интерлакен, 1995), 10-м Германо-российском пептидном симпозиуме (Фридрихрода, 2003), IV и V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 1998 и 2000), 26-м и 27-м Европейских пептидных симпозиумах (Монпелье, 2000; Сорренто, 2002).

По материалам исследований опубликовано 13 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 151 ссылок.

Обсуждение результатов.

В настоящее время существует большое число методов теоретического анализа Т-хелперных эпитопов для молекул МНС II человека и мыши, основанных на закономерностях структуры пептидов, проявивших активность в тестах in vitro. При этом при проведении экспериментов in vivo часто активность, предсказанная на основании опытов in vitro, не воспроизводится. Кроме того, большинство методов предсказания Т-хелперных эпитопов доступно только в виде коммерческих компьютерных программ, в которых вклад каждой аминокислоты в структуру активных пептидов и алгоритм предсказания авторами не раскрываются.

Целью данного раздела исследования явилась разработка простого и доступного метода предсказания аминокислотной последовательности пептидов, способных индуцировать образование антител in vivo у мышей гаплотипов Н-2Ь, H-2d и Н-2к. Линейные мыши этих трех гаплотипов широко используются при изучении иммуногенной активности соединений пептидно-белковой природы, а также при проведении доклинических испытаний специфической активности иммунобиологических препаратов.

1. Разработка метода предсказания последовательности пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей.

Анализ данных литературы о структуре Т-хелперных эпитопов и выявление общих закономерностей. Известны два типа молекул МНС П мышей, ответственных за связывание с Т-хелперными эпитопами, - это молекулы Н-2А и Н-2Е различных гаплотипов. Анализ Т-хелперных эпитопов, связывающихся с молекулами Н-2А, не выявил закономерностей в структуре их аминокислотных последовательностей. В то же время в структурах Т-эпитопов для молекул Н-2Е типа наблюдаются выраженные закономерности. С молекулой Н-2Е связывается Т-эпитоп длиной в 9 аминокислотных остатков, в 1-м положении которого при

3

связывании с МНС П гаплотипа Н-2Ек наиболее часто расположены гидрофобные остатки (lie, Leu, Val), а при связывании с МНС II H-2Ed- или Н-2Еь-гаплотипа - гидрофобные ароматические остатки (Phe, Туг, Тгр). В 9-м положении участка связывания Т-эпитопа для этих гагоготипов наиболее часто встречаются положительно заряженные остатки (Arg и Lys). В связывании с молекулой МНС II гаплотипов H-2Ek, H-2Ed, Н-2ЕЬ участвуют также остатки аминокислот в 4-ом и 6-ом положениях девятичленного фрагмента. Эти закономерности были выведены при изучении активности пептидов в тестах in vitro. [Stein L.J. et. al., 1994, Fremont D.H. et. al., 1996]

На основании анализа литературных данных было выдвинуто предположение, что пептид, индуцирующий в свободном виде образования антител у мышей, независимо от гаплотипа, должен содержать ключевые аминокислотные остатки только в первом положении (гидрофобные Leu, Val, Ile, Тгр, Phe или Туг) и в девятом положении (положительно заряженные Arg или Lys) (условие 1-9). Природа аминокислотных остатков в остальных положениях менее важна (таблица 1).

Таблица 1. Структура фрагмента 1-9, определяющего иммуногенные свойства пептида

1 2 3 4 5 6 7 8 9

F,I,L,T,V,Y К, R

Применение условия 1-9 для анализа базы данных МНСРЕР Т-хелперных эпитопов. Для

подтверждения справедливости выполнения условия 1-9 был проведен анализ базы данных участков, связывающихся с МНС, и их способности активировать Т-хелперные клетки [Втек: V. et. а!., 1998], которая содержит информацию об аминокислотных последовательностях 13000 пептидов, связывающихся с молекулами МНС млекопитающих различных гаплотипов. Из базы данных были отобраны 306 пептидных последовательностей, обладающих сродством к молекулам МНС II мыши Н-2Ек, Н-2Е'1, Н-2ЕЬ и для которых имелась информация о способности активировать Т-хелперные клетки. Анализ структуры этих пептидов показал, что 71% (217) пептидов из них, содержат участок, соответствующий условию 1-9. В то же время, из 161 пептида, проявляющего высокую или среднюю активность по отношению как к молекулам МНС, так и к Т-хелперным клеткам, уже 91% (147) пептидов удовлетворяют условию 1-9, а из пептидов, проявивших высокую МНС и Т-хелперную активность, 100% (91) пептидов соответствуют условию 1-9.

Применение условия 1-9 для анализа структуры ранее описанных пептидов. На

следующем этапе исследований была изучена корреляция между ранее полученными в нашей лаборатории данными о способности синтетических фрагментов белков РогА менингококка, V?! вируса ящура и Е вируса клещевого энцефалита вызывать образование

антител у мышей различных линий и наличием в последовательности пептидов фрагмента, удовлетворяющего условию 1-9 [Volpina О.М. et.al., 1993, Волкова Т.Д. и др., 1998, Короев Д.О.идр., 2000].

Оказалось, что из 35 ранее изученных пептидных фрагментов только 9 удовлетворяли условию 1-9. Из этих 9 пептидов 7 проявили иммуногенные свойства на двух или трех линиях мышей, один пептид был активен только на одной линии мышей и еще один пептид не проявил иммуногенной активности. В то же время из 26 пептидных фрагментов, не соответствующих условию 1-9, 20 не индуцировали выработку противопептидных антител ни на одной линии мышей, два пептида были иммуногенны на одной линии, а четыре вызывали иммунный ответ у мышей двух или трех линий.

Этот анализ ранее опубликованных данных подтверждает высокую корреляцию между содержанием в пептидах участка, соответствующего условию 1-9, и проявлением ими иммуногенных свойств.

2. Выбор иммуногенных пептидов в белковых последовательностях на основании

условия 1-9.

Предложенный подход был применен для выбора в белковых последовательностях фрагментов, способных вызывать выработку противопептидных антител без конъюгации с высокомолекулярным носителем.

На основании выполнения условия 1-9 были выбраны пептидные фрагменты в последовательности белков менингококка ОраВ [Короев Д.О. и др., 2001] и NspA [Короев Д.О. и др., 2002] и белков вируса клещевого энцефалита Е [Волкова Т.Д. и др., 2001] и NS1 и изучены их иммуногенные свойства на мышах трех линий (таблица 2). Работы проводились с использованием синтетических пептидных фрагментов, полученных в нашей группе.

Все 19 выбранных пептидов содержали один или несколько участков, соответствующих условию 1-9 (таблица 2). Из них 16 пептидов вызывали выработку противопептидных антител у двух или трех линий мышей, два были иммуногенны только на одной линии мышей, и лишь один не проявил иммуногенных свойств.

Таким образом, 95% из выбранных на основании условия 1-9 пептидов проявили иммуноактивные свойства хотя бы на одной линии мышей, и только 5% оказались неиммуногенными.

Таблица 2. Иммуногенная активность синтетических пептидных фрагментов белков ОраВ и NspA N. meningitidis, белков Е и NS1 вируса клещевого энцефалита, содержащих Т-хелперные эпитопы, удовлетворяющие условию 1-9.

Белок № Фрагмент Аминокислотная последовательность* ТПА (-lg)

Balb/c C5,BI/6 CBA/J

ОраВ N. meningitidis 1 (30-51) ATGANNSTVSDYFRNIRTHSI 3.2 4.1 <1.0

2 (41-63) DYFRNYRTHSIHPRVSVGYDPGD 4.2 3.8 4.8

3 (55-73) VSVGYDPGDWRIAADYASY 4.2 1.0 3.5

4 (64-83) WRIAADYASYRKWNDNKYSV 2.5 3.8 4.8

5 (109-130) TFHAVSSLGLSAIYDFKLNDKF 4.8 4.8 4.5

6 (120-139) AIYDFKLNDKFDKFKPY1GV 3.1 2.2 1.9

7 (131-150) DKFDKFKPYIGVRVAYGHVKHQV 4.1 4.1 4.2

NspA N. meningitidis 8 (6-21) FYVQADAAHAKASSSL <1.0 3.5 3.2

9 (40-62) LRFAVDYTRYKNYKAPSTDFKLY 4.8 2.5 4.1

10 (79-95) KPYLGARLSLNRASVDL <1.0 2.0 2.2

11 (128-144) YRYNYIGKVNTVKNVRS 3.2 2.5 3.5

Е вируса клещевого энцефалита 12 (48-74) IYQENPAKTREYCLHAKLSDTKVAARC 4.8 3.9 <1.0

13 (90-113) TVCKRDQSDRGWGNHCGLFGKGSI <1.0 <1.0 4.2

14 (204-224) KTSEHLPTAWQVHRDWFNDLA 4.5 4.2 <1.0

15 (377-403) LPPGDNIIYVGELSHQWFQKGSSIGRVF 3.5 5.6 5.6

16 (392-409) WFQKGSSIGRVFQTRKG <1.0 <1.0 <1.0

NS1 вируса клещевого энцефалита 17 (99-114) RGGIPSLLKKGKDIKV 2.5 <1.0 <1.0

18 (244-267) LPASLAGPRSWYNRIPGYSEQVKG 4.1 3.4 2.5

19 (286-308) VTINADCDKRGASVRSTTESGKV 3.4 <1.0 3.7

* _

выделены участки, соответствующие условию 1-9

3. Моделирование иммуногенных пептидов на основе неактивных белковых последовательностей с использованием условия 1-9.

Создание иммуногенных пептидов на основе неактивных фрагментов белка РогА менингококка. Следующий этап проверки предложенного метода заключался в конструировании пептидов, способных вызывать образование антител, из неактивных белковых последовательностей. Так, полученный ранее фрагмент 223Р?НАМ\/вКМАРЕ1.РисзС50г42 белка РогА менингококка не индуцировал образование антител у мышей и не содержал участка, удовлетворяющего условию 1-9. Выбранный в соответствии с условием 1-9 удлиненный пептид 219РКУАР*НАМ\/С(*МАРЕ1_риС8С30242 белка РогА, был иммуногенен на мышах всех трех линий (таблица 3). Полученные противопетидные антитела связывались как с исходным пептидом последовательности 219242, так и с неиммуногенным фрагментом 223-242.

С помощью введения дополнительного фрагмента 1-9 удалось добиться усиления иммунного ответа на фрагмент 233ELFLIGSGSDQAKGTDPLKN252 белка РогА менингококка.

I

Этот пептид, содержащий в своей последовательности участок, отвечающий требованию 1-9,

)

был иммуногенен на мышах линий Balb/c и C57BI/6, но не индуцировал выработку противопептидных антител на мышах линии CBA/J. Выбранный удлиненный пептид 219FKYARHANVGRNAFELFLIGSGSDQAKGTDPLKN252, включающий два участка последовательности, соответствующие требованию 1-9, обладал по сравнению с фрагментами 233-252 и 219-242 значительно более высокой иммуногенной активностью (таблица 3). При этом антитела против пептида 219-252 перекрестно связывались с исходным фрагментом 233-252. Таблица 3. Иммуногенная активность пептидных фрагментов белка РогА N. meningitidis и их

аналогов.

Фрагмент белка Аминокислотная последовательность ТПА (-lg)

Balb/c C57Bl/6 CBA/J

(223-242) RHANVGRNAFELFLIGSGSD <1.0 <1.0 <1.0

(219-242) FKYARHANVGRNAFELFLIGSGSD 4.1a 4.1a 4.1a

3.86 3.88 3.2s

(233-252) ELFLIGSGSDQAKGTDPLKN 2.8 2.8 <1.0

(219-252) FKYARHANVGRNAFELFLIGSGSDQAKGTDPLKN 5.1" 5.1B 4.8B

4.7r 4.7r 4.Г

(346-363) SGAWLKRNTGIGNYTQIN 3.5 <1.0 3.2

(343-374) AIVSGAWLKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF 3.6 3.3 3.9

(178-199) YYTKDTN N N LTLVPAWGKPGS <1.0 <1.0 <1.0

„173 т 176 177 [I ,L ,R ]-(171-199) KS[I]YT[L][R]YYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS 3.5A 4.2Д 4.1я

3.5е 3.2е 3.5е

(118-143) ASQAIDP'vVDSNN'DVASQLGirKRKDD 3.5 3.1 3.2

(130-143) DVASQLGIFKRHDD 3.1 1.6 <1.0

(273-292) AQLDLSENGDKTKNSTTEIA <1.0 <1.0 <1.0

(276-292) DLSENGDKTKNSTTEIA 3.8 <1.0 3.2

[А277] - (276-292) D[A]SENGDKTKNSTTEIA <1.0 <1.0 2.3

В качестве антигена на планшету наносили пептиды: (а) 219-242, (®) 223-242, (в) 219-252, О 233-252, (д) [I1", L176, R177]-(171-199), (е) 178-199.

Аналогичный подход к повышению иммунногенной активности пептида был применен для фрагмента ^ЗСЛМЛ-КЗ^ТС^УТСИМ363 белка РогА менингококка. Несмотря на то, что последовательность данного пептида не содержит участка, отвечающего условию 1-9, иммунизация этим фрагментом приводила к образованию противопептидных антител у мышей линий Ва1Ь/с и СВАЯ, но не у мышей линии С57В1/6. Последовательность

удлиненного фрагмента 343AIVSGAWLKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF374 белка РогА менингококка содержала два участка, соответствующие условию 1-9; пептид 343-374 был иммуногенен на мышах трех линий (таблица 3). По нашему мнению, удлинение последовательности фрагмента 346-363 до 343-374 с включением участков, удовлетворяющих требованию 1-9, способствовало преодолению генетической рестрикции в отношении мышей линии C57BI/6 и развитию иммунного ответа на вводимый пептид. При этом также увеличился титр противопептидных антител на мышах линии CBA/J.

Целью следующего этапа исследований являлось получение антител на неактивный фрагмент 178YYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS199 белка РогА N. meningitidis. Данный фрагмент в свободном состоянии не способен вызывать выработку противопептидных антител ни на одной линии мышей.

Для создания иммуногенного аналога этого фрагмента в нем были произведены замены таким образом, чтобы сформировать участок 1-9. В полученном фрагменте 171KS[I]YT[L][R]YYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS199 белка РогА (в квадратных скобках приведены замены аминокислот) за счет замены аминокислотного остатка Ala173 на Tie был сформирован участок последовательности, удовлетворяющий требованию 1-9, замена остатка Ala177 на положительно заряженный остаток Arg должна была способствовать повышению иммуногенности пептида. Аминокислотный остаток Pro176 был заменен на остаток Leu, так как наличие остатка пролина в Т-эпитопном фрагменте может создавать стерические затруднения при связывании пептида с молекулой МНС П [Stille, et al., 1987]. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что появление в последовательности модифицированного пептида 171-199 белка РогА N. meningitidis участка 1-9 приводило к индукции образования антител у мышей всех трех линий. При этом антитела, индуцируемые неприродной последовательностью 171-199, были способны связываться с высоким титром с пептидом 178-199 природной последовательности. Таким образом, в данном случае точечные замены в последовательности пептида не влияли на специфичность индуцируемых антител.

Примеры получения антител на фрагменты белков менингококка и вируса ящура при иммунизации удлиненными пептидными последовательностями с введенными в них фрагментами 1-9 не исключают возможность того, что индукция такими пептидами антител является следствием увеличения молекулярной массы иммуногена. Для подтверждения гипотезы о важности наличия в иммуногенном пептиде фрагментов, удовлетворяющих условию 1-9, была изучена активность укороченного фрагмента иммуногенной последовательности 118ASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDD143 белка РогА менингококка. Пептид 118-143 содержит участок 1-9 в последовательности 131-139 и способен

индуцировать образование антител у мышей трех линий. Полученный укороченный фрагмент белка РогА последовательности 130DVASQLGIFKRHDD143, также содержащий участок 1-9, но имеющий почти в два раза меньший молекулярный вес, был способен вызывать образование антител у мышей линий Balb/c и C57BI/6 и лишь на мышах линии CBA/J пептид был неактивен (таблица 3). Таким образом, была продемонстрирована ключевая роль участка, удовлетворяющего условию 1-9, в индукции образования противопептидных антител.

Фрагмент ^AQLDLSENGDKTKNSTTEIA292 белка РогА менингококка, несмотря на наличие в последовательности двух участков 1-9 (275-283 и 277-285), не проявлял иммуногенной активности ни на одной линии мышей. Для выяснения причин отсутствия активности у этого пептида были синтезированы два укороченных пептида - фрагмент

276 292

DLSENGDKTKNSTTEIA , содержащий один участок 1-9, и его укороченный аналог фрагмента 276D[A]SENGDKTKNSTTEIA292c заменой Leu277 на Ala, не содержащий участка 1-9.

Пептид 276-292, содержащий один участок 1-9, в отличие от предшественника 273-292, проявлял способность индуцировать образование антител у мышей линий Balb/c и CBA/J. Повышение Т-клеточной активности при уменьшении длины пептида в данном случае может объясняться двумя причинами: либо конкурентным ингибированием двух перекрывающихся Т-эпитопов в случае более длинного пептида 273-292, либо наличием в нем выступающих за пределы МНС-связываемой области аминокислотных остатков, затрудняющих образование тройного комплекса МНС - Т-эпитоп - Т-клеточный рецептор [Moudgil K.D. et. al., 1998]. В случае Leu277-Ala аналога фрагмента 276-292, не содержащего участка 1-9, у мышей линии Balb/c иммуногенная активность пропадала, а у мышей линии CBA/J титр падал с 3.2 у пептида 276-292 до 2.3 у Leu277-Ala аналога (таблица 3). Полученные данные подтверждают важность присутствия участка, удовлетворяющего условию 1-9, в аминокислотной последовательности иммуногенного пептида, и в то же время демонстрируют неоднозначность развития противопептидного иммунного ответа in vivo при наличии в последовательности иммуногена перекрывающихся участков 1 -9.

Создание иммуногенных пептидов на основе неактивного фрагмента 197-213 белка VP¡

вируса ящура. Следующий этап в конструировании иммуногенных пептидов из

неиммуногенных пептидных последовательностей заключался в модификации пептидного

фрагмента 197SQDRHKQKIIAPAKQLL213 белка VPi вируса ящура штамма А22 ■ Данный пептид в

свободном состоянии не способен вызывать выработку противопептидных антител ни на

одной линии мышей. Ранее было показано, что фрагмент 197-213 содержит минорный В-

эпитоп вируса ящура, на который при конъюгации пептида с высокомолекулярным

белковым носителем - гемоцианином улитки вырабатываются вируснейтрализующие

9

антитела [Яров A.B. и др., 1989]. Для получения антител на фрагмент 197-213 необходимо добавление к нему участка, удовлетворяющего условию 1-9. Однако ближайший такой участок содержится в далеко отстоящем фрагменте белка 172-181. Поэтому в

188 213

аминокислотную последовательность фрагмента RPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQLL были введены изменения, приводящие к формированию участка 1-9. За счет пропуска остатка

194 ,193 „ „196 ,

Olu и замены остатка Val на Ser, a Ser на Val в последовательности 188-213 было образовано три участка, удовлетворяющих условию 1-9. Кроме того, во вновь

189

сформированной последовательности был пропущен остаток Pro для избежания

190

стерических затруднений во взаимодействии остатка Leu с молекулой МНС II. Были получены аналог фрагмента 192-213 [des-E194, v"5, s'96] 192V[S][V]SQDRHKQKIIAPAKQLLJ13,

t89

содержащий в последовательности два участка 1-9, и аналог фрагмента 188-213 [des-P , des-

„194 . 195 „1901189

Е ,V ,S J RLLAV[S][V]SQDRHKQKIIAPAKQLL213, содержащий три участка 1-9.

Появление двух участков 1-9 в последовательности аналога фрагмента 192-213 белка VPi вируса ящура приводило к индукции антител у мышей линии Balb/c, а наличие трех участков 1-9 в последовательности модифицированного фрагмента 188-213 белка VPj приводило к образованию антител уже у мышей двух линий - Balb/c и СВАЯ (таблица 4). Интересно, что антитела против неприродной последовательности 188-213 белка VPi способны связываться с природной последовательностью 197-213. Было показано, что антитела, вызываемые модифицированным фрагментом 188-213 белка VPi, обладают высокой вируснейтрализующей активностью на мышах Balb/c (титр вируснейтрализующих антител, выраженный в -logj разведения сыворотки, равен 4.5).

Таблица 4. Иммуногенная активность аналогов пептидного фрагмента 197-213 белка VPt

вируса ящура.

Фрагмент белка VPi вируса ящура Аминокислотная последовательность тпа (ig

Balb/c C57BI/6 CBA/J

(197-213) SQDRHKQKIIAPAKQLL <1.0 <1.0 <1.0

1У4 195 196 [des-E ,V ,S >(192-213) V[S][V]SQDRHKQKIIAPAKQLL 3.1 <1.0 <1.0

г, „!89 , „194 195 „196, [des-P , des-E , V , S ]-(188-213) RLLAV[S][V]SQDRHKQKIIAPAKQLL 3.5a <1.0a 3.8a

2.9б <1.0б 2.8б

В качестве антигена на планшету наносили пептиды: С) [des-P18', des-E194, V195, S1%]-188-213, (б) 197-213.

Таким образом, предложен подход к моделированию иммуногенных пептидов, способных в свободном виде индуцировать образование антител, заключающийся в выборе для синтеза фрагментов белков, содержащих участки 1-9, либо в формировании участков 1-9 в

неактивных пептидных фрагментах с помощью замен аминокислот в последовательности пептидов. Необходимо отметить, что предложенный подход позволяет выбирать пептиды, индуцирующие образование антител у мышей, несущих разные гаплотипы молекул МНС П.

В тоже время наличие в последовательности пептида участка 1-9 не является единственным условием проявления им иммуногенной активности, так как у мышей развитие иммунного ответа обеспечивают молекулы МНС П двух типов, а именно Н-2Е и Н-2А. Предложенное условие отражает закономерности только для молекул МНС II типа Н-2Е, тогда как пептиды, не удовлетворяющие условию 1-9, могут проявлять иммуногенные свойства за счет их взаимодействия с молекулой МНС П типа Н-2А.

4. Пептидные конструкции на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура.

Другой подход к моделированию иммуногенных пептидов, заключающийся в создании пептидных конструкций, был проведен на примере вируса ящура так как этот вирус является одним из наиболее изученных в ряду различных вирусов в иммунологическом аспекте. Капсид вируса ящура образован 4 белками. Входящий в их число белок VPi содержит иммуноактивные участки, ответственные за индукцию противоящурной защиты. Основной и минорный иммуногенные районы VPi содержат вируснейтрализующие В-эпитопы, которые соответствуют участкам последовательности белка 135-160 и 200-213. Т-хелперные эпитопы бежа локализованы в участках последовательности 20-41,135-160 и 170-189.

Для создания высокоиммуногенных пептидов, индуцирующих противоящурный иммунитет и включающих В- и Т-эпитопы структурного бежа вируса ящура, и последующего выбора наиболее эффективно обеспечивающей защиту от заболевания ящуром конструкции в состав единой молекулы были включены три участка белка v'Pi штамма А22: 135-159, 170-190 и 197-217.

Известно, что иммунодоминантный фрагмент 135KYSAGGMGRRGDLEPLAARVAAQLP159 белка VPi включает в себя вируснейтрализующие В-эпитопы и вирусспецифические Т-эпитопы вируса и защищает животных от заболевания ящуром [Гельфанов В.М. и др., 1991, Яров A.B. и др., 1989]. Этот пептид содержит в своей последовательности участок 136-144, удовлетворяющий требованию 1-9.

Фрагмент 170TTIHELLVRMKRAELYCPRP189 содержит мощный вирусспецифический Т-эпитоп. Однако в последовательности этого пептида отсутствуют вируснейтрализующие В-эпитопы и он не обеспечивает протективный иммунитет [Volpina ОМ., et. al., 1993]. Иммунизация вирусом ящура не вызывает образования антител, направленных к этому

фрагменту белка. Фрагмент 170-189 содержит участок 172-180, соответствующий требованию 1-9.

С-концевой фрагмент 197SQDRHKQK1IAPAKQLL213 белка VPi, содержащий минорный вируснейтрализующий В-эпитоп, способен индуцировать частичную защиту животных от заболевания лишь после конъюгации с белком-носителем. При этом в аминокислотной последовательности фрагмента отсутствует участок, удовлетворяющий требованию 1-9.

С целью конструирования соединений, эффективно моделирующих противовирусный иммунный ответ, были получены четыре пептидные конструкции (рис. 1). Все они содержат основной иммуногенный район 135-159, соединенный через GG-мостик с различными иммуноактивными участками белка VPi.

135 159 135 160

KYSAGGVGRRGDLEPLAARVAAQLP-GG-KYSAGGMGRRGDLEPLAARVAAQLPK

(конструкция I)

135 159 197 213

KYSAGGMGRRGDLEPLAARVAAQLP-GG-SQDRHKQKIIAPAKQLL

(конструкция П)

135 159 170 190

KYSAGGMGRRGDLEPLAARVAAQLP-GG-TTIHTLLVRMKRAELYCPRPL

Ряс. 1 Синтетические пептидные конструкции I, П, Ш и IV.

Конструкция I содержит две копии основного иммуногенного района. Такая конструкция получена с целью более эффективного представления иммунной системе протективного участка 135-159, а также для сравнительного анализа с другими синтетическими конструкциями близкой молекулярной массы.

В конструкцию II включены основной и минорный иммуногенные участки. Конструкция получена в расчете на дополнительный вклад в протективную активность минорного иммуногенного района 197-213, к которому возможно образование вируснейтрализующих антител при его представлении иммунной системе в сочетании с Т-хелперным эпитопом участка 135-159.

Пептидная конструкция Ш содержит кроме иммунодоминантного фрагмента 135-160 вирусспецифический Т-хелперный эпитоп 170-190, включенный в конструкцию для усиления образования вируснейтрализующих антител против фрагмента 135-159. Кроме тою, была создана конструкция IV Ра1т135-15800А170-188(Аст), в основном

(конструкция III)

Bu1

188

(конструкция IV)

Аст

отличающаяся от конструкции III наличием пальмитоильной группы на N-концевом остатке Lys135. Сульфгидрильная группа Cys185 в конструкциях Ш и IV была защищена для предотвращения окисления, приводящего к химической неоднородности конечного продукта

Иммуногенные и протективные свойства конструкций сравнивали со свойствами исходных фрагментов 135-160,170-190,197-213, Palm2135-159 и Palml70-189.

5. Иммуногенные и протективные свойства сннтетичёеских пептидных конструкций.

Способность пептидных конструкций индуцировать образование антител у мышей.

Сравнительный анализ способности синтетических пептидных конструкций I, II и III вызывать образование антител был проведен на мышах линий Balb/c, C57BI/6 и CBA/J. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5. Способность пептидных конструкций и исходных фрагментов индуцировать

образование противопептидных антител у мышей.

Иммуноген ТПА, (-lg)

Balb/c С57В1/6 CBA/J

135-160 3.2 3.2 <1.0

170-190 4.1 4.5 4.5

197-213 <1.0 <1.0 <1.0

Конструкция I 3.5 3.1 <1.0

Конструкция II 3.1 1.6 4.1

Конструкция III 4.2 4.5 5.1

Фрагмент 135-160 вызывал образование противопептидных антител на двух линиях мышей и не был активен на мышах линии CBA/J, пептид 170-190 проявил высокую иммуногенную активность на мышах всех трех линий, а пептид 197-213 не индуцировал ' образования антител ни на одной линии мышей. Пептидная конструкция I индуцировала у

мышей всех трех линий такой же уровень антител, как и исходный пептид 135-160. , Конструкция II была высокоиммуногенна на мышах CBA/J, т.е. по сравнению с исходным

неактивным на мышах CBA/J фрагментом 135-160 обладала более широкой МНС-специфичностью. Однако на мышах линии C57BI/6 титр противопептидных антител был несколько ниже, чем у фрагмента 135-160. Пептидная конструкция П1 проявила значительно более высокую активность на мышах всех трех линий, чем исходный фрагмент 135-160. Поскольку конструкция индуцировала практически такой же уровень антител, как и входящий в него пептид 170-190, можно полагать, что именно этот участок, содержащий мощный Т-хелперный эпитоп, обеспечил высокую иммуногенную активность конструкции III.

Сравнение иммуногенных и протективных свойств пептидных конструкций на морских свинках. Далее была изучена способность синтетических конструкций индуцировать образование вируснейтрализующих и противопептидных антител у морских свинок. Для этого животные были иммунизированы пептидами однократно в дозе 50 мкг. Полученные данные представлены в таблице 6.

Конструкция I индуцировала образование высокого уровня противопептидных и вируснейтрализующих антител, направленных к участку 135-160. Конструкция II индуцировала такой же уровень вируснейтрализующих и противопептидных антител, как и конструкция I, причем антитела образовывались только на иммунодоминантный участок 135-159. Ожидаемого же образования антител на участок 197-213 не наблюдалось.

Таблица б. Иммуногенная активность пептидных конструкций в опытах на морских свинках.

Иммуноген Антиген на планшете ТПА» (-lg) ТВА, (-log2)

Конструкция I 135-160 4.5 3.5

Конструкция I 4.5

Конструкция II 135-160 4.5 3.5

197-213 <1.0

Конструкция II 4.8

Конструкция III 135-160 4.8 6.0

170-190 <1.0

Конструкция III 5.1

Конструкция III индуцировала образование немногим более высокого уровня противопептидных антител, чем конструкции I и II. Эти антитела также были направлены только к иммунодоминантному району белка 135-159, но, по сравнению с антителами к двум другим конструкциям, обладали значительно более высокой вируснейтрализующей активностью.

Для изучения протекшвной активности морские свинки были иммунизированы синтетическими пептидными конструкциями и исходными фрагментами однократно в дозе 10 мкг на животное. Столь низкая иммунизирующая доза была выбрана для выявления различий в протективном эффекте пептидов. На 28 день после иммунизации животных заражали вирусом ящура (таблица 7).

Пептиды 170-190 и 197-213 не защищали животных даже при применении в высокой иммунизирующей дозе. По сравнению с исходным фрагментом 135-160, конструкция I обладала более высокой, а конструкция П - близкой протективной активностью. Максимальную защиту животных от заболевания вызвала конструкция III, содержащая В-эпитоп участка 135-159 и мощный Т-хелперный эпитоп участка 170-190.

Таблица 7. Протективная активность пептидных конструкций на морских свинках.

Иммуноген Защита*

135-160 4/7

170-190** 0/8

197-213** 0/8

Конструкция I 7/8

Конструкция II 5/8

Конструкция 1П 8/8

* - соотношение числа не заболевших животных к общему числу зараженных. ** - иммунизирующая доза 200 мкг

Изучение протективной активности пептидной конструкции III на свиньях. Для

дальнейших исследований была выбрана пептидная конструкция П1, индуцирующая наибольший уровень противопептидных и вируснейтрализующих антител и проявляющая высокий протективный эффект. Для этой конструкции был изучен протективный эффект на природно-восприимчивых к ящуру животных - свиньях, которых по сравнению с другими животными наиболее сложно защитить от заболевания с помощью традиционных противоящурных вакцин.

Две группы животных двукратно иммунизировали пептидной конструкцией III. При первой иммунизации одной группе животных пептид вводили в дозе 1 мг на животное, а другой - в дозе 4 мг на животное. Через 42 дня обе группы иммунизировали конструкцией Ш в дозе 1 мг на животное. На 56 день после первой иммунизации животных заражали вирусом ящура. В разные сроки у животных отбирали кровь и изучали уровень вируснейтрализующих антител (таблица 8).

Таблица 8. Протективная активность синтетической пептидной конструкции III на свиньях.

Доза № ТВА (-log2) Защита

иммунизации жив. 14 день 28 день 56 день

1+1 мг 1-3 <1.0 <1.0 <1.0 -

4 <1.0 3.3 5.8 +

4+1 мг 5 2.5 3.5 6.3 +

6 3.0 3.5 6.5 +

Иммунизация пептидной конструкцией III в дозе 1+1 мг не приводила к образованию вируснейтрализующих антител и не обеспечивала защиту от заболевания. При иммунизации в дозе 4+1 мг пептидная конструкция III вызывала образование высокого уровня вируснейтрализующих антител у всех животных, и все животные были защищены от заболевания ящуром.

Таким образом, показано, что наиболее эффективной по иммуногенным и протективным свойствам является пептидная конструкция, состоящая из фрагмента 135-159 иммунодоминантного района белка VPi, содержащего вируснейтрализукяций В-эпитоп и вирусспецифический Т-эпитоп и фрагмента 170-190, несущего мощный вирусспецифический Т-эпитоп.

Изучение иммуногенных и протективных свойств липофилъной пептидной конструкции TV. С целью более детального изучения иммуногенных и протективных свойств наиболее перспективной конструкции III был создан ее липофильный аналог -конструкция IV. Так как введение пальмитоильного остатка само по себе может усиливать иммунный ответ, активность пептидной конструкции IV сравнивали с активностью дипальмитоильного пептида Palm2l35-159, который, как было показано ранее, обладает высокой иммуногенной и протективной активностью, но в отличие от конструкции IV, не содержит дополнительный Т-хелперный эпитоп фрагмента 170-188.

Способность пептидной конструкции TV индуцировать образование антител на мышах. Способность пептидной конструкции IV вызывать выработку противопептидных антител была изучена на мышах трех линий (таблица 9).

Таблица 9. Способность синтетической пептидной конструкции iv вызывать образование антител на мышах.

Иммуноген ТПА (-lg)*

Balb/c C57BI/6 CBA/J

Конструкция IV 4.1 3.2 3.9

Palm2135-159 3.5 3.2 2.2

— * - в качестве антигена на планшету наносили пептид 135-159.

Результаты эксперимента показали, что конструкция IV проявила высокую активность на всех линиях мышей. По сравнению с пептидом Ра1т2135-159, содержащим только один эпитоп, титр противопептидных антител у конструкции IV был выше на линии Ва1Ь/с и особенно СВА/.Т, что объясняется вкладом фрагмента 170-188, содержащего Т-хелперный эпитоп.

В следующем эксперименте была изучена специфичность противопептидных антител, индуцированных конструкцией IV у мышей трех линий. Для этого исследовали связывание сыворотки крови мышей, имунизированных конструкцией IV, как с самой пептидной конструкцией, так и с ее отдельными эпитопами (таблица 10).

Результаты эксперимента показали, что у мышей линий С57В1/6 и СВАЯ конструкция IV индуцировала выработку антител, направленных к фрагменту 135-159, содержащему

иммунодоминантный В-эпитоп, а к Т-хелперному эпитопу 170-189 на этих линиях мышей антитела не образовывались. У мышей линии Ва1Ъ/с пептидная конструкция IV вызывала образование антител, направленных как к пептиду 135-159, так и к фрагменту 170-189, однако, титр последних был ниже. Таким образом, введение Т-хелперного эпитопа 170-188 способствует повышению уровня выработки антител на фрагмент 135-159, содержащий иммунодоминантный В-эпитоп.

Таблица 10. Специфичность противопептидных антител, индуцированных пептидной конструкцией IV на мышах.

Линия мышей ТПА (-lg)

Конструкция IV* 135-159* 170-189*

Balb/c 4.3 4.1 3.1

C57BI/6 3.5 3.2 <1.0

CBA/J 4.2 3.9 <1.0

* - пептиды, нанесенные в качестве антигена на планшету.

Антигензависимая пролиферация лимфоцитов мышей, иммунизированных пептидной ^ конструкцией IV. В следующей серии экспериментов была изучена способность

синтетической пептидной конструкции IV стимулировать пролиферацию периферических лимфоцитов мышей трех линий in vitro. Мыши линий Balb/c, С57В1/б и CBA/J были | иммунизированы конструкцией IV. Через семь дней после иммунизации лимфоциты из

периферических лимфоузлов были извлечены и рестимулированы in vitro пептидной конструкцией IV и ее фрагментами 135-159 и 170-189 в трех дозах.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 2, конструкция IV, пептиды 135-159 и 170-189 на всех линиях мышей обладали способностью стимулировать пролиферацию Т-хелперных лимфоцитов in vitro в зависимости от рестимулнрукдцей дозы. При этом на всех линиях мышей конструкция IV проявляла более высокую пролиферативную активность, чем входящие в нее фрагменты. Этот аддитивный эффект t можно объяснить присутствием в аминокислотной последовательности конструкции IV

дополнительного Т-хелперного эпитопа 170-188. Только в случае мышей линии Balb/c способность стимулировать пролиферацию Т-хелперных лимфоцитов фрагмента 170-189 в высокой рестимулирующей дозе была близка к конструкции IV.

I I

0,05 0,5 5,0

концентрация пептидов, рМ

0,05 О 5 5,0

концентрация пептидов, рМ

0,05 0,5 5,0

концентрация пептидов, рМ

лимфоциты мыши рестимулированы конструкцией IV

лимфоциты мыши рестимулированы фрагментом 136-159

£] лимфоциты мыши рестимулированы фрагментом 170-189

Рис. 2 Пролиферация Т-лимфоцитов мыши, иммунизированных конструкцией IV.

А - мыши линии С57В1/6, Б - мыши линии Ва1Ь/с, В - мыши линии СВАЛ

Изучение прптектияной активности конструкции IV на морских сеинках. Для определения способности пептидной конструкции IV обеспечивать защиту лабораторных животных от заболевания ящуром морские свинки были иммунизированы пептидной конструкцией IV. В качестве контроля иммунизировали животных пептидом Ра1т2135-159 в различных дозах и пептидом Ра1т170-189 в максимальной дозе. Кроме того, для оценки важности химического связывания элементов конструкции морские свинки были иммунизированы смесью пептидов Ра1т2135-159 и Ра1т170-189 в максимальной дозе (таблица 11).

Приведенные результаты показывают, что конструкция IV и пептид Ра1ш2135-159 в зависимости от дозы обеспечивали эффективную защиту морских свинок от заболевания ящуром. Хотя в максимальной иммунизирующей дозе оба соединения демонстрировали одинаковый протективный эффект, последующие ее двукратные разведения показали, что иммунизация конструкцией IV в низких дозах защищает большее количество животных от

18

заболевания. Пептид Ра1т170-189 не проявил протективной активности. Смесь пептидов Ра1т2135-159 и Ра1т170-189 проявила более низкую активность на морских свинках по сравнению с конструкцией IV. Это подтверждает важность ковалентного связывания эпитопов 135-158 и 170-188 для повышения протективной активности.

Таблица и. Протективная активность синтетических пептидов на морских свинках.

Иммуноген Доза (мкг/животное) Защита*

10 5/5

Конструкция IV 5 4/5

1 2/5

0.5 0/5

10 5/5

Ра1т2135-159 5 3/5

1 0/5

0.5 0/5

Ра1ш170-189 10 0/5

Ра1т2135-159 + Ра1т 170-189 10+10 2/5

* - отношение количества защищенных животных к общему числу зараженных

Усиление образования вируснейтрализующих антител в ответ на введение пептидной конструкции IV. Целью данной части исследований явилось изучение способности конструкции IV усиливать образование индуцированных вирусом ящура вируснейтрализующих антител у кроликов, то есть служить праймером при иммунизации вирусом.

Для этого одна группа животных была иммунизирована конструкцией IV, а вторая группа - смесью пептидов Ра1т2135-159 и Ра1т170-189 в ПАФ. Через 28 дней обеим группам был введен инактивированный вирус ящура в субиммунизирующей дозе. Контрольной группе животных вместо пептидов вводили ПАФ. У животных отбирали кровь перед иммунизацией вирусом ящура, на пятый и восьмой день после введения вируса и определяли титр противопептидных и вируснейтрализующих антител (таблица 12). Для определения специфичности противопептидных антител на планшету наносили фрагменты конструкции IV.

В сыворотках крови животных, иммунизированных конструкцией IV, были обнаружены высокие титры противопептидных антител к фрагменту 135-159. Таким образом, фрагмент 170-189 проявлял Т-хеяперную активность, способствуя индукции антител против фрагмента 135-159. При этом антитела против фрагмента 170-189 на момент заражения и пятый день не образовывались, а на восьмой день титр антител против фрагмента 170-189 был невысок. В группе животных, иммунизированных смесью фрагментов Ра1т2135-159 и Ра1т170-189,

19

также наблюдались высокие титры противопептидных антител, однако антитела были направлены к обоим фрагментам.

Таблица 12. Образование вируснейтрализуюгцих антител в ответ на введение пептидной

конструкции ГУ и смеси ее фрагментов.

Дни после 1зпажения Конструкция IV Ра1т2135-159 + Ра1т170-189 Контроль*

Антиген** ТПА(-1§) ТВА Антиген ТПА(-1ё) ТВА ТВА

0 135-159 3.4 0.6 135-159 3.4 <0.3 <0.3

170-189 <1.0 170-189 3.1

5 135-159 3.8 2.1 135-159 3.2 1.2 0.5

170-189 <1.0 170-189 3.2

8 135-159 4.4 2.1 135-159 3.1 1.5 1.2

170-189 1.3 170-189 3.2

контролем являлась группа кроликов, иммунизированная ПАФ. пептид, нанесенный на планшету.

Результаты определения титров вируснейтрализуюгцих антител свидетельствуют о различии в способности конструкции ту и смеси пептидов вызывать вирусспецифический Т-клеточный иммунный ответ: иммунизация животных конструкцией IV с последующим введением вируса приводит к образованию большего количества вируснейтрализующих антител, чем иммунизация животных смесью пептидов Ра1т2135-159 и Ра1т170-189.

Изучение протективной активности синтетической пептидной конструкции IV на природновосприимчивых животных. Для исследования способности пептидной конструкции ГУ обеспечивать эффективную защиту от заболевания ящуром овец животные были иммунизированы конструкцией IV в дозе 0,5 мг на животное (№1-4) или в дозе 0,1 мг — (№5-8). На 25-й день после иммунизации животные были заражены вирусом ящура. В эксперименте определяли титр противопептидных и вируснейтрализующих антител в сыворотках крови овец, а также способность конструкции IV обеспечивать защиту животных от заболевания (таблица 13).

Иммунизация конструкцией IV способствовала индукции большого количества

противопептидных антител у всех животных, получивших дозу 0,5 мг пептида, и у трех

животных, получивших 0,1 мг пептида. При этом противопептидные антитела были

направлены к фрагменту 135-159, а антитела против Т-хелперного фрагмента 170-189

отсутствовали. Вируснейтрализующие антитела были обнаружены у животных обеих групп.

При иммунизации высокой дозой конструкции ГУ от заболевания ящуром были защищены

все животные, при иммунизации в низкой дозе - трое из четырех. У заболевшей овцы

отсутствовали противопептидные антитела направленные к конструкции IV и ее фрагменту

135-159, а титр вируснейтрализующих антител был низок. На основании полученных данных

20

была определепа величина ПД$о (доза иммуногена, обеспечивающая 50%-ную защиту животных) конструкции IV, которая составляла 0,067 мг, в то время как ЦЦю ранее изученного пептидного фрагмента Ра1тг135-159 составляла 0,2 мг [Уо1рта О.М. й. а1., 1996].

Таблица 13. Лротективная активность конструкции IV на овцах.

№ Доза ТПА (-ф, антиген на планшете ТВА (-1о82) Защита

ЖИВОТНОГО (мг/жив) Конструкция IV 135-159 170-189

1 0.5 3.2 2.9 <1.0 1.8 +

2 0.5 3.8 3.2 <1.0 1.8 +

3 0.5 4.4 4.4 <1.0 1.7 +

4 0.5 3.8 3.5 <1.0 1.9 +

5 0.1 <1.0 <1.0 <1.0 0.5 -

6 0.1 4.4 3.5 <1.0 1.9 +

7 0.1 3.8 2.9 <1.0 1.5 +

8 0.1 3.2 2.6 <1.0 1.0 +

Аналогично была изучена способность конструкции IV обеспечивать защиту крупного рогатого скота от заболевания при заражении вирусом ящура. Первая группа животных была иммунизирована конструкцией IV в дозе 3,5 мг на животное (№1-3), а вторая группа иммунизирована в дозе 1 мг (№4-6). Контрольным животным № 7 и 8 вводили ПАФ. Титр противопептидных и вируснейтрализующих антител измеряли в различные сроки после иммунизации. Вирусом ящура заражали через 25 дней после иммунизации (таблица 14).

Результаты исследования продемонстрировали рост уровня противопептидных антител у животных обеих групп в течение 25 дней после иммунизации конструкцией IV. При этом уровень антител, направленных к содержащему В-эпигоп фрагменту 135-159 был несколько выше, чем уровень антител против фрагмента 170-189. Количество вируснейтрализующих антител также возрастало к 25-му дню после иммунизации. Однако прирост вируснейтрализующих антител зависел от иммунизирующей дозы: у животных №1-3 титр вируснейтрализующих антител был выше, чем у животных №4-6. Протективный эффект пептидной конструкции IV коррелировал с уровнем вируснейтрализующих антител: животные №1-3 из первой группы и №4 из второй группы имели высокий титр вируснейтрализующих антител и были защищены от заболевания при заражении вирусом ящура. Расчетная величина ЯД50 конструкции IV для крупного рогатого скота составила 1,24 мг. Следует отметить, что в отличие от конструкции IV, пептид Ра1т2135-159 не обеспечивал защиту крупного рогатого скота от заболевания при заражении вирусом ящура [Уо1рта О.М. <а. а1., 1996].

I )

Таблица 14. Протективная активность конструкции IV на крупном рогатом скоте.

Антиген Дни после иммунизации п е-2 ♦

№ жив. и на 5 14 21 25

планшете ТПА ТВА ТПА ТВА ТПА ТВА ТПА ТВА &в в

1 3.5 135-159 <1.0 <0.3 3.5 1.7 3.9 7 1 3.9 04 +

170-189 <1.0 2.9 3.5 2.9

2 3.5 135-159 <1.0 <0 3 3.5 1 в 4.2 7 7 4.2 >2.6

170-189 <1.0 3.2 3.5 3.2

3 3.5 135-159 <1.0 <0 3 2.6 1.6 3.5 7 1 4.2 >2.6

170-189 <1.0 <1.0 3.5 3.2

4 1 135-159 <1.0 <0 3 <1.0 08 3.8 1 4 3.9 1.9

170-189 2.2 2.9 2.9 3.5

5 1 135-159 <1.0 <0 3 <1.0 0,5 3.2 1 1 3.8 1.4 +

170-189 2.5 1.6 <1.0 3.5

б 1 135-159 <1.0 <0 3 <1.0 05 3.2 1 1 3.8 1.4 +

170-189 <1.0 <1.0 <1.0 2.9

7 135-159 <1.0 <0 3 <1.0 <0 3 <1.0 <0 3 <1.0 <0.3 + ++

170-189 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0

8 135-159 <1.0 <0 3 <1.0 <0 3 <1.0 <0 3 <1.0 <0.3 + ++

170-189 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что конструкция, включающая иммунодоминантный В-эпитоп вируса ящура - участок 135-159 и вирусспецифический Т-хелперный эпитоп вируса - участок 170-188 относится к числу наиболее активных противоящурных конструкций и обеспечивает эффективную защиту от заболевания при заражении вирусом ящура. Такая конструкция моделирует развитие противовирусного иммунитета, как и вирус ящура, стимулируя у животных при помощи Т-хелперного участка 170-188 индукцию вируснейтрализующих антител, направленных к иммунодоминантному участку 135-159.

Таким образом, в результате проделанной работы предложены следующие подходы к созданию иммуногенных пептидов:

1. Выбор для синтеза фрагментов белковой последовательности, отвечающих условию 1 -9

2. Искусственное формирование фрагментов, отвечающих условию 1-9 в последовательности неактивных пептидов

3. Создание на основе известных В-эпитопов и Т-хелперных эпитопов вируса ящура пептидных конструкций, эффективно моделирующих противовирусный иммунитет.

Выводы

1. Разработан метод предсказания последовательности пептидов, способных в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем индуцировать выработку противопептидных антител у мышей.

2. Показана высокая эффективность предложенного метода при выборе иммуногенных фрагментов в последовательности белков ОраВ и NspA из бактерии Neisseria meningitidis, белков Е и NSi из вируса клещевого энцефалита.

3. Показана возможность применения предложенного метода для моделирования иммуногенных пептидов из неактивных белковых последовательностей.

' Перспективность подхода продемонстрирована на примере создания иммуногенных

I аналогов фрагментов белков РогА менингококка и VPi вируса ящура.

4. Предложена структура четырех пептидных конструкций, включающих иммуноактивные фрагменты белка VPi вируса ящура.

5. На основе анализа иммуногенных и протективных свойств синтетических пептидных конструкций, а также специфичности индуцируемых ими антител, выявлены высокоактивные конструкции, моделирующие индукцию противоящурного

I иммунитета.

I

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

I

1. Volpina О.М., Zhmak M.N., Surovoy A.Yu., Ivanov V.S., Ostrovsky A.G., Tchikin L.D.,

' Kuprianova M.A.. Ivanov V.T. Approaches to synthesis of peptide constructs mimicking

the anti FMDV immune response. Abstracts of 9th Russia-Germany Symposium on Chemistry of Peptides and Proteins. Pushino, 1994, 34

2. Volpina O.M., Zhmak M.N., Suruvoy A.Yu., Ivanov V.S., Ostrovsky A.G., Tchikin L.D., Kuprianova M.A.. Ivanov V.T. Mimicking the anti foot-and-mouth disease immune response with the aid of synthetic peptide constructs. Abstracts of Symposium on Chemistry on Peptides in Immunology. Interlaken, Switzerland. 1995, Poster 2.

3. Kuprianova M.A.. Volpina O.M., Koroev D.O., Zmak M.N., Litvinov I.S., Kotelnikova O.V., Agafonova S.A., Alliluev A.P., Nesmeyanov V.A., Ivanov V.T. Immunogenic fragments of OMP1 protein from N. meningitidis serotype B. Abstracts of the 4th John Humphrey advanced summer programmer in immunology, Pushchino, 1998,35.

4. O.M. Volpina, A.Yu. Surovoy, M.N. Zhmak, M.A. Kuprianova. D.O. Koroev, A.V. Chepurkin, A.S. Toloknov, V.T. Ivanov. A peptide construct containing B-cell and T-cell epitopes from the foot-and-mouth disease viral VPi protein induces efficient antiviral protection, Vaccine, 1999,17, 577-584.

; 23

i

5. М.А. Куприянова. М.Н. Жмак, Д.О. Короев, А.В. Чепуркин, О.М. Вольпина, В.Т. Иванов. Синтетические пептидные конструкции на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура штамма Агг- Биоорган, химия, 2000, 26, 926-932.

6. Volpina О., Kuprianova М.. Koroev D., Zmak М., Kotelnikova О., Archipova V., Alliluev A., Nesmeyanov V., Ivanov V. Synthetic fragments of Neisseria meningitidis proteins PorA and OpaB induce protection against experimental infection. J. Peptide Sci., 2000, suppl. to v.6, 210,441.

7. Котельникова O.B., Несмеянов B.A., Вольпина O.M., Архипова B.C., Аллилуев А.П., Куприянова М.А.. Короев Д.О., Жмак М.Н., Иванов В.Т. Иммуногенная и протективная активность фрагментов поверхностных белков Neisseria meningitidis. Медицинская иммунология, 2000, №2,169-170

8. Kuprianova М.А.. Zhmak M.N., Koroev D.O., Chepurkin A.V., Volpina O.M., Ivanov V.T. Peptide construct including immunoactive fragments of the foot-and-mouth disease virus VPi protein. J. Peptide Sci., 2000, suppl. to v.6,206,425.

9. Д.О. Короев, О.М. Вольпина, М.Н. Жмак, М.А. Куприянова, Несмеянов В.А.,

A.П. Аллилуев, О.В. Котельникова, В.Т. Иванов. Индукция противоменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. II. Иммуноактивные синтетические фрагменты белка ОраВ из Neisseria meningitidis. Биоорган, химия, 2001,27,21-26.

10. Д.О. Короев, М.Б. Обозная, М.Н. Жмак, Т.Д. Волкова, М.А. Титова. О.В. Котельникова, О.М. Вольпина, В.А. Несмеянов, А.П. Аллилуев, В.Т. Иванов. Индукция противоменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. Ш. Иммуноактивные синтетические фрагменты белка NspA из Neisseria meningitidis. Биоорган, химия, 2002, 28,4,291-297.

11. О.М. Вольпина, М.А. Титова. М.Н. Жмак, Д.О. Короев, М.Б. Обозная, Т.Д. Волкова,

B.Т. Иванов. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей. Биоорган, химия, 2002, 28, 5, 387-395.

12. М.А. Titova. M.N. Zhmak, D.O. Koroev, M.B. Oboznaya, T.D. Volkova, O.M. Volpina, V.T. Ivanov. The motif for prediction of protein fragments able to induce antibody formation in mice. J. Peptide Sci., 2002, suppl. to v.8, 61,161.

13. Volpina O.M., Titova M.A.. Koroev D.O., Volkova T.D., Oboznaya M.B., Nesmeyanov V.A., Kotelnikova O.V., Timofeev A.V. Immunogenic synthetic fragments of bacterial and viral proteins. Abstracts of 10th German-Russian Peptide Symposium. Friedrichroda, 2003, 34

Сдано в печать 22.10 2003 г. Заказ № 293 Формаг 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Отпечатано: «ЮСК- полиграфия» г. Москва, ул. Краснобогатырская, д 92

2<ъоЗ-А

^17 4 2 3

( i'

Введение

1. Обзор литературы: «Определение структуры Т-хелперных эпитопов 7 и создание синтетических пептидных конструкций, содержащих эпитопы В-клеток и Т-хелперных клеток»

1.1. Развитие иммунного ответа на введение пептидного фрагмента

1.2. Определение структуры Т-хелперных эпитопов.

1.2.1. Определение структуры Т-эпитопов с помощью 10 рентгеноструктурного анализа.

1.2.2. Изучение связывания природных и синтетических пептидов с 18 молекулой МНС II для определения структуры Т-эпитопов.

1.2.3. Теоретические методы предсказания потенциальных Т-эпитопов.

1.3. Синтетические пептидные конструкции, включающие в себя 31 эпитопы В-клеток и Т-хелперных клеток

1.3.1. Введение Т-хелперных эпитопов в состав линейных пептидов.

1.3.2. Мультиантигенные пептидные комплексы, содержащие 35 Т-хелперные эпитопы

1.3.3. Липопептидные конструкции, содержащие Т-хелперные эпитопы. 42 2. Результаты и обсуждение

2.1. Разработка метода предсказания аминокислотной 47 последовательности пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей.

2.1.1. Анализ данных литературы о структуре Т-хелперных эпитопов и 47 выявление общих закономерностей.

2.1.2. Применение условия 1-9 для анализа базы данных МНСРЕР 49 Т-хелперных эпитопов.

2.1.3. Применение условия 1-9 для анализа структуры ранее описанных 51 пептидов.

2.2. Выбор иммуногенных пептидов в последовательностях белков 54 ОраВ и NspA Nesseria meningitidis и белков Е и NS1 вируса клещевого энцефалита.

2.3. Моделирование иммуногенных пептидов из неактивных белковых 57 последовательностей с использованием условия 1-9.

2.3.1. Создание высокоиммуногенных пептидов на основе неактивного 57 фрагмента 223-242 и низкоактивного фрагмента 233-252 белка

РогА Nesseria meningitidis.

2.3.2. Создание высокоиммуногенного пептида на основе низко 59 активного фрагмента 346-363 белка РогА Nesseria meningitidis.

2.3.3. Создание иммуногенного пептида на основе неактивного 60 фрагмента 178-199 белка РогА Nesseria meningitidis.

2.3.4. Создание иммуногенных пептидов на основе неактивного 61 фрагмента 197-213 белка VPi вируса ящура

2.3.5. Исследование активности укороченного фрагмента 130-143 белка 64 РогА Nesseria meningitidis, содержащего участок 1-9.

2.3.6. Создание иммуногенных пептидов на основе неактивного 65 фрагмента 273-292 белка РогА Nesseria meningitidis.

2.4. Создание пептидных конструкций на основе иммуноактивных 68 фрагментов белка VPi вируса ящура

2.5. Иммуногенные и протективные свойства синтетических 72 пептидных конструкций.

2.5.1. Способность пептидных конструкций индуцировать образование 72 антител у мышей.

2.5.2. Сравнение иммуногенных и протективных свойств пептидных 73 конструкций на морских свинках.

2.5.3. Изучение протективной активности пептидной конструкции III на 76 свиньях.

2.5.4. Изучение иммуногенных и протективных свойств синтетической 77 пептидной конструкции IV.

3. Экспериментальная часть

3.1. Химические реагенты и биологические препараты

3.2. Оборудование

3.3. Животные

3.4. Приготовление растворов пептидов для иммунизации

3.5. Получение сывороток крови

3.6. Иммунизация животных

3.7. Твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой метод)

3.8. Антигензависимая пролиферация клеток периферических 97 лимфоузлов мышей, праймированных конструкцией IV.

3.9. Определение титра вируснейтрализующих антител

3.10. Исследование протективной активности.

3.11. Определение величины ПДм конструкции IV.

4. Выводы

Способность пептидных фрагментов белков в свободном виде индуцировать образование антител имеет большое значение для создания пептидных противовирусных и антибактериальных вакцин, разработки диагностических тест-систем, а также получения противобелковых антител для научных исследований [1-4]. Обычно используемый для индукции противопептидных антител метод конъюгации пептидов с белком или другим высокомолекулярным носителем сопровождается рядом нежелательных процессов, таких как высокий уровень образования антител к носителю и индукция долговременной Т-клеточной памяти на чужеродный белок-носитель [5]. В связи с этим особый интерес вызывают пептидные последовательности, способные вызывать образование антител in vivo без конъюгации с белковым носителем.

В соответствии с представлениями современной иммунологии необходимым условием образования противопептидных антител является наличие в пептидной последовательности белкового антигена Т-хелперного эпитопа. Т-хелперный эпитоп участвует в образовании тройного комплекса с молекулой МНС II1 и Т-клеточным рецептором, что приводит к активации Т-хелперных клеток и к стимуляции продукции антител В-клетками. Существующие на данный момент способы теоретического предсказания расположения Т-хелперных эпитопов в белковых последовательностях основаны на результатах опытов in vitro, а в опытах ш vivo не всегда обладают достаточной эффективностью и достоверностью. Поэтому одним из наиболее важных подходов к моделированию иммуногенных пептидов, способных в свободном виде индуцировать образование антител, является разработка простых и доступных методов предсказания расположения Т-хелперных эпитопов в молекуле белка, которые позволили бы быстро и эффективно выявлять в последовательности иммуногенные

МНС II - молекула главного комплекса гистосовместимости класса II. участки, а также открыли бы возможности повышения иммуногенных свойств пептидов путем точечных изменений в их структуре.

Другим подходом к моделированию иммуногенных пептидов является создание пептидных конструкций, включающих известные В-клеточные и Т-хелперные эпитопы белка, с помощью которых можно имитировать развитие протективного иммунитета к различным патогенам. Для применения этого подхода необходимы знания о локализации иммуноактивных участков в аминокислотных последовательностях белков изучаемого патогена и сравнительный анализ свойств различных вариантов конструкций для выбора соединений, наиболее эффективно имитирующих развитие протективного иммунитета.

Настоящее исследование посвящено моделированию иммуногенных пептидов, заключающемуся в разработке эффективного метода предсказания последовательности пептидов, способных индуцировать выработку противопептидных антител у мышей без конъюгации с белком-носителем; применению разработанного метода для выбора иммуногенных фрагментов в последовательностях белков различных возбудителей и моделированию иммуноактивных пептидов на основе неактивных. Целью исследования также являлась разработка конструкций на основе иммуноактивных пептидных фрагментов белка VPi вируса ящура, обеспечивающих эффективный противовирусный иммунитет.

В обзоре литературы рассмотрены данные о современном состоянии методов идентификации участков последовательностей белковых молекул, способных взаимодействовать с молекулами МНС II и активировать Т-хелперные лимфоциты. Также рассмотрены описанные в литературе основные подходы к созданию иммуногенных пептидных конструкций, содержащих В- и Т-хелперные эпитопы.

Выводы

Разработан метод предсказания последовательности пептидов, способных в свободном виде без конъюгации с белком-носителем индуцировать выработку противопептидных антител у мышей.

Показана высокая эффективность предложенного метода при выборе иммуногенных фрагментов в последовательности белков ОраВ и NspA из бактерии Neisseria meningitidis, белков Е и NS1 из вируса клещевого энцефалита. Показана возможность применения предложенного метода для моделирования иммуногенных пептидов из неактивных белковых последовательностей. Перспективность подхода продемонстрирована на примере создания иммуногенных аналогов фрагментов белков Рог А менингококка и VPi вируса ящура.

Предложена структура четырех пептидных конструкций, включающих иммуноактивные фрагменты белка VPi вируса ящура.

На основе анализа иммуногенных и протективных свойств синтетических пептидных конструкций, а также специфичности индуцируемых ими антител, выявлены высокоактивные конструкции, моделирующие индукцию противоящурного иммунитета.

1. Francis M.J. in New generation vaccines: The role of basic immunology Eds G.

2. Gregoriadis, B. McCormack, A.C. Allison and G. Poste (Plenum Press, NY), 1993, p.23.

3. Steward M.W., Stanley C.M., Dimarchi R., Mulcahy G., Doel T.R. High-affinity antibodyinduced by immunization with a synthetic peptide is associated with protection of cattle against foot-and-mouth disease. // Immunology, 1991, v.12, p.99.

4. Sood A., Venugopalan P., Mysore N. and Vyas S.P. Synthetic peptides: A modernapproach to vaccination. // Indian J. Exp. Biol., 1998, v. 35, p. 846-861.

5. Townsend A.R.M. Recognition of influenza virus proteins by cytotoxic T lymphocytes. //1.munol. Res. 1987. V. 6. № 1-2. P. 80-100.

6. Ben-Yedidia T. and Arnon R. Design of peptide and polypeptide vaccines. // Curr. Opin.

7. Biotechol., 1997, v. 8, p. 442-448.

8. Brodsky F.M., Guagliardi L. The cell biology of antigen processing and presentation. //

9. Annu. Rev. Immunol., 1991, v. 9, p. 707-44

10. Barber L.D. and Parham P. Peptide binding to major histocompatibility complexmolecules. //Annu. Rev. Cell Biol., 1993, v. 9, p. 163-206.

11. Петров P.B. Иммунология, M., «Медицина», 1983, с.

12. А.А. Ярилин. Основы иммунологии. M. «Медицина». 1999

13. Madden D.R The three-dimensional structure of peptide-МНС complexes. // Annu. Rev. Immunol., 1995, v. 13, p. 587-622.

14. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология, М., «Мир», 2000, с. 195-215.

15. Cresswell P. Assembly, transport, and function of МНС class П molecules. // Annu. Rev. Immunol., 1994, v. 12, p. 252-293.

16. Mouritsen S., Meldal M., Werdelin O., Hansen A.S., Buus S. MHC molecules protect T cell epitopes against proteolytic destruction. //J. Immunol., 1992, v. 149, p. 1987-1993.

17. Janeway C.A.J, and Travers P., Eds. Immunobiology: the immune system in health and disease. Curr. Biol. Ltd./Garland Publ. Inc., 1994.

18. Babbit B.P., Allen P.M., Matsueda G., Harber E., Unanue E.R. Binding of immunogenic peptides to la histocompatibility molecules. // Nature, 1985, v. 312, p. 359.

19. Rosental A.S. Determinant selection and macrophage function in genetic control of the immune response. // Immunol. Rev., 1978, v. 40, p. 136.

20. Abbas A.K. A reassessment of the mechanisms of antigen-specific T-cell-depended B-cell activation. // Immunol. Today, 1988, v. 9, p. 89-94.

21. Hoop T. and Woods K. Prediction of protein antigenic determinants from aminoacid seqences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 3824-3828.

22. Welling G., Weijer W., Zee R. and Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. // FEBS Lett., 1985, v. 188, p. 215-218.

23. Hoop T. Prediction of protein surfaces and interaction sites from amino acid sequences.

24. Synthetic Peptides in Biology and Medicine, Eds K.Alitalo, P. Partanen, A. Vahery,

25. Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1985, p. 3-11.

26. Novotny J., Handschumacher M., Harber E. Location of antigenic epitopes on antibody molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1986, v.83, p. 226-230.

27. Евстигнеева P., Палькеева M. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой. // Биоорганическая химия, 2000, № 26, с. 243-262.

28. Stern L.J. and Wiley D.C. Antigenic peptide binding by class I and class П histocompatibility proteins. // Structure, 1994, v. 2, p. 245-251.

29. Stern L.J., Brown J.H., Jardetzky T.S., Gorga J.C., Urban R.G., Strominger J.L., Wiley D.C. Crystal structure of the human class П MHC protein HLA-DR1 complexed with an influenza virus peptide. // Nature, 1994, v. 368, p. 215-221.

30. Brown J.H., Jardetzky T.S., Gorga J.C., Stern L.J., Urban R.G., Strominger J.L., Wiley D.C. Three-dimensional structure of the human class П histocompatibility antigen HLA-DR1. // Nature, 1993, v. 364, p. 33-39.

31. Vasmatzis G., Cornette J., Sezerman U. and DeLisi C. TcR recognition of the MHC-peptide dimer: structural properties of a ternary complex. // J. Mol. Biol., 1996, v. 261, p. 72-89.

32. Hare B.J., Wyss D.F., Osburne M.S., Kern P.S., Reinherz E.L., Wagner G. Conformational isomers of a class П МНС-peptide complex in solution. // J. Mol. Biol,. 1999, v. 286, p. 207-218.

33. Fremont D.H., Hendrickson W.A., Marrack P. and Kappler J. Structures of an MHC class П molecule with covalently bound single peptides. // Science, 1996, v. 272, p. 1001-1004.

34. Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides. Recommendation 1983, Eur. J. Biochem. v. 138, p. 9-37.

35. Rammensee H.-G., Friede Т., Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. // Immunogen. 1995, v. 41, p. 178-228.

36. Falk K., Rotzschke 0., Stevanovic S., Jung G., Rammensee H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. // Nature, 1991, v. 351, p. 290-296.

37. Nakagawa T.Y., Von Grafenstein H., Sears J.E., Williams J., Janeway C.A., Flavell R.A. The use of the polymerase chain reaction to map CD4+ T cell epitopes. // Eur. J. Immunol., 1991, v. 21, p. 2851-2855.

38. Adler S., Frank R., Lanzavecchia A. and Weiss S. T cell epitope analysis with peptides simultaneously synthesized on cellulose membranes: fine mapping of two DQ dependent epitopes. // FEBS Lett., 1994, v. 352, p. 167-170.

39. Buus S., Sette A., Colon S.M., Miles C., Grey H.M. The relation between major histocompatibility complex (MHC) restriction and the capacity of la to bind immunogenic peptides. // Science, 1987, v. 235, p. 1353-1358.

40. Townsend A., Ohlen C., Bastin J., Ljunggren H.G., Foster L., Karre K. Association of class I major histocompatibility heavy and light chains induced by viral peptides. // Nature, 1989, v. 340, p. 443-448.

41. Moudgil K.D., Sercarz E.E. and Grewal I.S. Modulation of the immunogenicity of antigenic determinants by their flanking residues. // Immunol. Today, 1998, v. 19, p. 217-220.

42. Gogolak P., Simon A., Horvath A., Rethi В., Simon I., Berkics K., Rajnavolgyi E., Toth

43. G.K. Mapping of a protective helper T cell epitope of human influenza A virus hemagglutinin. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, v. 2, p. 190-198.

44. Brusic V., Rudy G., Кипе A.P. and Harrison L.C. MHCPEP, a database of MHC-binding peptides: update 1997. // Nucleic Acids Res. 1998, v. 26, p. 368-371. http://wehih.wehi.edu.au-/mhcpep/

45. DeLisi C., Berzofsky J.A. T-cell antigenic sites tend to be amphipathic structures. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, p. 7048-7052.

46. Berzofsky J.A. Features of T-cell recognition and antigen structure useful in the design of vaccines to elicit T-cell immunity. // Vaccine, 1988, v. 6, p. 89-93.

47. Cease K.B., Margalit H., Cornette J.L., Putney S.D., Robey W.G., Ouyang C., Streicher

48. Margalit H., Spouge J.L., Cornette J.L., Cease K.B., Delisi C., Berzofsky J.A. Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence. // J. Immunol., 1987, v. 138, p. 2213-2229.

49. Rothbard J.R. Synthetic peptides as vaccines // Nature, 1987, v. 330, p. 106-107.

50. Rothbard J.R., Taylor W.R. A sequence pattern common to T cell epitopes. // EMBO J., 1988, v. 7, p. 93-100.

51. Stille C.J., Thomas L.J., Reyes V.E., Humphreys R.E. Hydrophobic strip-of-helix algorithm for selection of T cell-presented peptides. // Mol. Immunol., 1987, v. 24, p. 1021-1027.

52. Roberts C.G.P., Meister G.E., Jesdale B.M., Lieberman J., Berzofsky J.A., De Groot A.S. Prediction of HIV peptide epitopes by novel algorithm. // AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1996, v. 12, p. 593-610.

53. Cornette J.L., Margalit H., DeLisi C. and Berzofsky J.A. The amphipathic helix as a structural feature involved in T cell recognition. // The Amphipatic Helix. (Ed). CRC Press, Boca Raton, FL, 1993.

54. Reyes V.E., Fowlie E.J., Lu S., Phillips L., Chin L.T., Humphreys R.E., Lew R.A. Comparison of three related methods to select T cell-presented sequences of protein antiges. // Mol. Immunol., 1990, v. 27, p. 1021-1027.

55. Rammensee H.-G., Bachmann J., Emmerich N.P.N, Bachor O.A., Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. // Immunogenetics, 1999, v.50, p. 213-219. http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/.

56. Honeyman M.C., Brusic V., Stone N.L. and Harrison L.C. Neural network-based prediction of candidate T-cell epitopes. //Nat. Biotechnol., 1998, v. 16, p. 966-969.

57. Arnon R. Synthetic peptides as basis for future vaccines. // Trens Biochem. Sci., 1986, v. 11, p. 521-524.

58. Dreesman G., Sparrow J., Frenchik P., Kennedy R. Synthetic hepatitis В surface antigen peptide vaccine. // Adv. Exp. Med. Biol., 1985, v. 185, p. 129-137.

59. Emini E., Jameson В., Wimmer E. Priming for and induction of anti-poliovirus neutralizing antibodies by synthetic peptides. // Nature, 1983, v. 304, p. 699-703.

60. Shupp J.W., Jett M., Pontzer C.H. Identification of a transcytosis epitope on staphylococcal enterotoxins. // Infect Immun., 2002, v. 70, p. 2178-2186.

61. Meng J., Dai X., Chang J.C., Lopareva E., Pillot J., Fields H.A., Khudyakov Y.E. Identification and characterization of the neutralization epitope(s) of the hepatitis E virus. // Virology, 2001, v. 30, p. 203-211.

62. Wu H.C., Yeh C.T., Huang Y.L., Tarn L.J., Lung C.C. Characterization of neutralizing antibodies and identification of neutralizing epitope mimics on the Clostridium botulinum neurotoxin type A. // Appl. Environ. Microbiol., 2001, v. 67, p. 3201-3207.

63. Kirkley J.E., Goldstein A.L. and Naylor P.H. Effect of peptide-carrier coupling on peptide-specific immune responses. // Immunobiology, 2001, v. 203, p. 601-615.

64. Gonzalez S., Alvarez A., Caballero E., Vina L., Guillen G., Silva R. P64k meningococcal protein as immunological carrier for weak immunogens. // Scand. J. Immunol., 2000, v. 52, p.113-116.

65. Lu Y., Xiao Y., Ding J., Dierich M., Chen Y.H. Immunogenicity of neutralizing epitopes on multiple-epitope vaccines against HIV-1. // Int. Arch. Allergy Immunol., 2000, v. 121, p. 80-84.

66. Kim S.K., Ragupathi G., Cappello S., Kagan E., Livingston P.O. Effect of immunological adjuvant combinations on the antibody and T-cell response to vaccination with MUC1-KLH and GD3-KLH conjugates. // Vaccine, 2000, v. 15, p. 530-537.

67. Laisney I.L. and Strosberg A.D. Dual specificity of a human neutralizing monoclonal antibody, specific for the V3 loop of GP120 (HIV-1). II Immunol. Lett., 1999, v. 15, p. 185-192.

68. Ijaz M.K., Alkarmi Т.О., el-Mekki A.W., Galadari S.H., Dar F.K. Babiuk L.A. Priming and induction of anti-rotavirus antibody response by synthetic peptides derived from VP7 and VP4. // Vaccine, 1995, v. 13, p. 331-338.

69. Иванов Б.Б., Мещерякова Е.А., Андронова Т.М. и Иванов В.Т. Использование синтетических носителей и адъювантов для повышения иммуногенности синтетического пептида белка CS Plasmodium falciparum. // Биоорган, химия, 1991, т.17, с. 732-746.

70. Muller G.M., Shapira М., Arnon R. Anti-influenza response achieved by immunization with a synthetic conjugate. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 81, p. 2461-2465.

71. Schutze M.-P., Leclerc C., Jovilet M., Audibert F., Chedid L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccine. // J. Immunol., 1985, v. 135, p. 2319-2324.

72. Steward M.W., Stanley C.M. and Obeid O.E. A mimotope from a solid-phase peptide library induced a measles virus- neutralizing and protective antibody response. // J. Virol., 1995, v.69, p. 7668-7673.

73. Obeid O.E., Partidos C.D. and Steward M.W. Identification of helper T cell antigenic sites in mice from the heamagglutinin glycoprotein of measles virus. // J. Gen. Virol., 1993, v.74, p. 2549-2557.

74. Obeid O.E., Partidos C.D. and Steward M.W. Analysis of the antigenic profile of measles virus heamagglutinin in mice and humans using overlapping synthetic peptides. // Virus Res., 1994, v.32, p. 69-84.

75. Obeid O.E. and Steward M.W. The potential of immunization with synthetic peptides to overcome the immunosuppressive effect of maternal anti-measles virus antibodies in young mice. // Immunology, 1994, v.82, p. 16-21.

76. Steward M.W., Partidos C.D., D'Mello F. and Howard C.R. Specificity of antibodies reactive with hepatitis и surface antigen following immunization with synthetic peptides. //Vaccine, 1993, v.ll,p. 1405-1414.

77. Shaw D.M., Stanley C.M., Partidos C.D. and Steward M.W. Influence of the T-helper epitope on the titre and affinity of antibodies to B-cell epitopes after co-immunization. // Mol. Immunol., 1993, v.30, p. 961-968.

78. Sedlik C., Sarraseca J., Rueda P., Leclerc C., Casal I. Immunogenicity of poliovirus В and T cell epitopes presented by hybrid porcine parvovirus particles. // J. Gen. Virol., 1995, v.76, p. 2361-2368.

79. Francis M.J., Hastings G.Z., Syred A.D., McGinn В., Brown F., Rowlands D.J. Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants. //Nature, 1987, v. 300, p. 168-170.

80. Leclerc C., Przewlocki G., Schutze M.-P., Chedid L.A. A synthetic vaccine constructed by copolymerization of В and T cell determinants. // Eur. J. Immunol., 1987, v. 17, p. 269-273.

81. Volpina O., Surovoy A., Ivanov V. Protection against viral infections with the aid of synthetic peptides. Foot-and-mouth disease as a example. // Biomed. Sience, 1990, v. 330, p.168-170.

82. Francis M.J., Fry C.M., Rowlands D.J., Bittle J.L., Houghten R.A., Lerner R.A., Brown F. Immune response to uncoupled peptides of foot-and-mouth disease virus. // Immunology, 1987, v. 61, p. 1-6.

83. Hervas-Stubbs S., Berasain C., Golvano J.J., Lasarte J.J., Prieto I., Sarobe P., Prieto J., Borras-Cuesta F. Overcoming class П-linked non-responsiveness to hepatitis В vaccine. // Vaccine, 1994, v. 12, p. 867-871.

84. Milich D.R., Hughes J.L., McLachlan A., Thornton G.B., Moriarty A. Hepatitis В synthetic immunogen comprised of nucleocapsid T-cell sites and envelope B-cell epitope. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, p. 1610-1614.

85. Tam J.P. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, p. 5409-5413.

86. Tam J.P. Recent advances in multiple antigen peptides. // J. Immunol. Methods, 1996, v. 196, p. 17-32.

87. Hewer R. and Meyer D. Producing a highly immunogenic synthetic vaccine construct active against HIV-1 subtype C. // Vaccine, 2002, v. 20, p. 2680-2683.

88. Toth G.K., Varadi G., Nagy Z., Monostori E., Репке В., Hegedus Z., Ando I., Fazekas G., Kurucz I., Мак M. Branched polypeptides as antigens for influenza virus hemagglutinin and T-cell receptor subunits. // Pept. Res., 1993, v. 6, p. 272-280.

89. Tam J.P., Lu Y.-A. Vaccine engineering: enhancement of immunogenicity of synthetic peptide vaccines related to hepatitis in chemically defined models consisting of T- and B-cell epitopes. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 9084-9088.

90. Pinto R.M., Gonzalez-Danaart J.F., Sanchez G., Guix S., Gomara M.J., Garcia M., Haro I., Bosch A. Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. // FEBS Letters, 1998, v. 438, p. 106-110.

91. Joshi M.B., Gam A.A., Boykins R.A., et al. Immunogenicity of Well-characterized Synthetic Plasmodium falciparum Multiple Antigen Peptide Conjugates. - Infect Immun., 2001, v. 69, pp. 4884-4890.

92. Taubman M.A., Smith D.J., Holmberg C.J., Eastcott J.W. Coimmunization with complementary glucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protection against dental caries. // Infect Immun, 2000, v. 68, p. 2698-2703.

93. Rose K., Zeng W., Brown L.E., Jackson D.C. A synthetic peptide-based polyoxime vaccine construct of high purity and activity. // Mol. Immunol., 1995, v.32, p. 1031-1309.

94. Wiesmuller K.-H., Freund S., Jung G. Novel FMDV vaccine consisting of a T-cell epitope and B-cell activating terminus of E. coli lipoprotein: synthesis, results of vaccination and molecular dynamics. // Immunobiol., 1988, v. 177, p. 158-161.

95. Prass W., Ringsdorf H., Bessler W., Wiesmuller K.H., Jung G. Lipopeptides of the N-terminus of E. coli lipoprotein: synthesis, mitogenicity and properties in monolayer experiments. // Biochim. Biophis. Acta, 1987, v. 900, p. 116-128.

96. Jung G. Synthesis and perspectives of new adjuvants and carriers systems for potential application for synthetic vaccines. Synthetic antigens. // Ann. Scalvo., 1984, N 2, p. 191-208.

97. Hoffman P., Heihle S., Shade U., Loppnow H., Ulmer A.J., Flad H.D., Jung G., Bessler W.G. Stimulation of human and murine adherent cells by bacterial lipoproteinvand synthetic lipopeptide analogues.//Immunobiol., 1988, v. 177, p. 158-170.

98. Петров P.B., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины. М., Медицина, 1988, с. 288.

99. Wiesmuller К.-Н., Bessler W., Jung G. Synthesis of the mitogenic S-2,3-bis(palmitoyloxy)propyl.-N-palmitoylpentapeptide from Escherihia coli lipoprotein. // Hoppe-Seyler s Z. Phisiol. Chem., 1983, v. 364, p. 593-606.

100. Nardelli В., Defoot J.-P., Huang W., Tam J. Design of a complete synthetic peptide-based AIDS vaccine with a built-in adjuvant. // AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1992, v. 8, p. 1405-1407.

101. Langhans В., Braunschweiger I., Schweitzer S., Jung G., Inchauspe G., Sauerbruch Т., Spengler U. Lipidation of T helper sequences from hepatitis С virus core significantly enhances T- cell activity in vitro. // Immunology, 2001, v. 102, p. 460-465.

102. Wiesmuller K.-H., Jung G. and Hess G. Novel low-molecular-weight synthetic vaccine against foot-and-mouth disease containing a potent B-cell and macrophage activator. // Vaccine, 1989, v. 7, p. 29-33.

103. Beck-Sickinger A.G., Rotering H., Wiesmuller K.H., Dorner F., Jung G. Mapping of antigenic and immunogenic sites of Haemophilus influenzae outer membrane protein P6 using synthetic lipopeptides. // Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1994, v. 375, p. 173-182.

104. Deres K., Schild H., Wiesmuller K.-H., Jung G., Rammensee H.G. In vivo priming of virus-specific cytotoxic T limphocytes with synthetic lipopeptide vaccine. //Nature, 1989, v. 342, p. 561-564.

105. Rouaix F., Grass-Masse H., Mazingue C., Diesis E., Ridel P.R., Estaquier J., Capron A., Tartar A., Auriault C. Effect of a lipopeptidic formulation on macrophage activation and peptide presentation to T cells. // Vaccine, 1994, v. 12, p. 1209-1214.

106. Huang W., Nardelli В., Tam J. Lipophillic multiple antigen peptide system for peptide immunogen and synthetic vaccine. // Mol. Immunol., 1994, v. 31, p. 1191-1199.

107. Benmohamed L., Krishnan R., Auge C., Primus J.F., Diamond D.J. Intranasal administration of a synthetic lipopeptide without adjuvant induces systemic immune responses. // Immunol., 2002, v. 106, p. 113-121.

108. Gomara M.J., Riedemarm S., Vega I., Ibarra H., Ercilla G., Наго I. Use of linear and multiple antigenic peptides in the immunodiagnosis of acute hepatitis A virus infection. // J. Immunol. Methods, 2000, v. 3, p. 23-34.

109. Horvath A., Olive C., Wong A., Clair Т., Yarwood P., Good M. and Toth I. Lipoamino acid-based adjuvant carrier system: enhanced immunogenicity of group a streptococcal peptide epitopes. //J. Med. Chem., 2002, v. 45, p.1387-1390.

110. P.M. Хаитов, И.С. Гущин, Б.В. Пинегин, А.И. Зебрев. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М., «Медицина», 2000, с.257.

111. Volpina О.М., Gelfanov V.M., Yarov A.V., Surovoy A.Yu., Chepurkin A.V., Ivanov V.T. New virus-specific T-helper epitopes of foot-and-mouth disease viral VPi protein. // FEBS Let. 1993. V. 333. P. 175-178.

112. Волкова Т.Д., O.M. Вольпина, B.T. Иванов, С.Г. Рубин , И.В. Семашко, А.С. Караванов. Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с помощью синтетических пептидов. // Биоорган, химия. 1998. Т.24. С. 100-111.

113. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Иванов В.Т., Ворович М.Ф., Тимофеев А.В. Синтез, иммуногенные и антигенные свойства фрагментов гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. // Биоорган, химия, 2001. Т.27. С.174-179.

114. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. // Журн. микробиол. 1997. № 6. С. 92-96.

115. Christodoulides M., Heckels J.E. Immunization with a multiple antigen peptide containing defined B- and T-cell epitopes: production of bactericidal antibodies against group В Neisseria meningitidis. II Microbiol., 1994, v. 140, p. 2951-2960.

116. Strohmaier K., Franze R., Adam K.H. Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein. // J. Gen. Virol., 1982, v.59, p.295-306.

117. Brett S.J., Cease К.В., Berzofsky A.J. Influences of antigen processing on the expression of the T cell repertoire. Evidence for МНС-specific hindering structures on the products of processing. //J.Exp. Med. 1988. V. 168. P. 357-373

118. Collen Т., Dimarchi R, Doel T.R. A T cell epitope in VPI of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle. // J. Immunol. 1991. V.146 P. 749-755.

119. Mulcahy G., Gale C., Robertson P., Iyisan S., DiMarchi R.D., Doel T.R. Isotype responses of infected, virus-vaccinated and peptide-vaccinated cattle to foot-and-mouth disease virus. // Vaccine 1990. V.8. P. 249-256.

120. DiMarchi R., Brooke G., Gale C., Cracknell V., Doel Т., Mowast N. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide. // Science 1986. V.232. P. 639-641.

121. Малярец П.В. Сельское хозяйство за рубежом. Животноводство. 1973. №2. С. 29-33.

122. A.V. Chepurkin, A.S. Toloknov, V.T. Ivanov. A peptide construct containing B-cell and T-cell epitopes from the foot-and-mouth disease viral VPi protein induces efficient antiviral protection, // Vaccine, 1999, 17,577-584

123. M.A. Куприянова, M.H. Жмак, Д.О. Короев, А.В. Чепуркин, О.М. Вольпина,

124. B.Т. Иванов. Синтетические пептидные конструкции на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура штамма А22. // Биоорган, химия, 2000,26,926.

125. Mishel В.В., Shady С.М. Selected methods in cellular immunology, Ed. W.H. Freeman, San Francisko. 1979. P. 281-296.