Синтез циклических β-(1→6)-связанных олигосахаридов и олигодентатных конъюгатов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Титов, Денис Валерьевич
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2013
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук
ТИТОВ
ДЕНИС ВАЛЕРЬЕВИЧ
СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ Р-(1-*6)-СВЯЗАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ И ОЛИГОДЕНТАТНЫХ КОНЪЮГАТОВ
НА ИХ ОСНОВЕ
02.00.03 - органическая химия
3 О МАП 2013
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва, 2013
005060662
Работа выполнена в Лаборатории химии гликоконъюгатов (№ 52) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН
Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор,
заведующий Лабораторией химии гликоконъюгатов ФГБУН ИОХ РАН Нифантьев Николай Эдуардович
кандидат химических наук, научный сотрудник Лаборатории химии гликоконъюгатов ФГБУН ИОХ РАН Генинг Марина Леонидовна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,
заведующий Лабораторией углеводов ФГБУН ИБХ РАН Бовин Николай Владимирович
доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории синтеза физиологически активных соединений ФГБУ ИБМХ РАМН Яшунский Дмитрий Владимирович
Ведущая организация: Химический факультет Московского
Государственного Университета им. М. В. Ломоносова
Защита состоится 25 июня 2013 г. в 1430 часов на заседании диссертационного совета Д 002.222.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН (ИОХ РАН) по адресу: 119991, Москва, Ленинский проспект, 47
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН Автореферат разослан 23 мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.222.01
д.х.н. Родиновская Л. А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность данной работы. Циклические ß-(l—>6)-связанные олигоглюкозамины являются новым классом циклических олигосахаридов и впервые подробно изучены в данной работе. Потенциал использования данных соединений в различных областях химии и биологии достаточно высок. Так, на их основе могут быть синтезированы разнообразные конъюгаты различной симметрии и дентатности. Использование циклических олигосахаридов, таких как циклодекстрины, для получения олигодентатных углеводных конъюгатов хорошо известно, однако циклоолигоглкжозамины обсуждаемого типа имеют ряд преимуществ: 1) наличие аминогрупп позволяет легко и региоизбирательно вводить необходимые лиганды; 2) дентатность и симметрия конъюгатов может легко варьироваться при использовании циклических олигосахаридов, содержащих различное число моносахаридных звеньев, а также за счет введения неглюкозаминовых остатков; 3) гибкость каркаса, образованного (1—>6)-гликозидными связями, предоставляет таким конъюгатам дополнительную возможность принимать конформацию, необходимую для взаимодействия с соответствующими рецепторами; 4) равномерная гидрофильная природа циклоглюкозаминов исключает нежелательные гидрофобные взаимодействия, которые наблюдаются в случае циклодекстринов и некоторых других носителей.
Одним из направлений практического использования циклических олигоглюкозаминов, исследуемых в данной работе, является создание гликокластеров для эффективного блокирования лектина LecA, являющегося одним из факторов вирулентности бактерии Pseudomonas aeruginosa. Данная бактерия является одним из распространенных возбудителей госпитальных инфекций, лечение которых затруднено ввиду высокой устойчивости к антибиотикам.
Другим направлением, также развиваемым в данном диссертационном исследовании, является создание агентов на основе ß-(l—>6)-связанных циклоолигосахаридов, способных образовывать искусственные ионные каналы (поры) в клеточных мембранах. Для их получения проводили присоединение к аминогруппам циклов различных гидрофобных цепей, обладающих сродством к липидам клеточных мембран. Размер пор в данном случае зависит от величины внутренней полости циклоолигосахаридов. Это открывает возможность конструирования ионных каналов с регулируемой ионной селективностью, а также новых антибактериальных средств.
Целью работы является разработка эффективных методов синтеза циклических ß-(1—>6)-связанных олигосахаридов, состоящих из различного числа остатков D-глюкозамина, и ряда родственных соединений, содержащих в своей структуре остатки D-глюкозамина и D-
глюкозы, а также получение конъюгатов на основе данных циклоолигосахаридов для решения различных биологических задач.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной диссертационной работы впервые получена серия индивидуальных циклических олиго-Р-(1—>6)-глюкозаминов, состоящих из 2-7 остатков П-глюкозамина. Также получен ряд новых циклических Р-(1—>6)-связанных тетрасахаридов, включающих в себя остатки о-глюкозамина и Б-глюкозы в различных комбинациях. Для получения линейных предшественников циклоолигосахаридов разработана эффективная схема блочного синтеза. Исследована необычная стереохимия реакции циклизации линейных бифункциональных олигосахаридов, а также показано влияние структурных факторов и условий проведения реакции циклизации на ее стереохимический результат. Получены две серии конъюгатов, с которыми были проведены биологические испытания. Первая серия состоит из 15 олигодентатных гликокластеров на основе циклических ди-, три- и тетрасахаридов. В этих соединениях остатки Э-галактозы посредством спейсерных групп различной природы и длины присоединены к аминогруппам циклов. Некоторые кластеры проявили высокую аффинность к лектину ЬесА. Вторая серия конъюгатов состоит из 15 соединений на основе циклических олигосахаридов, несущих гидрофобные цепи различной длины. Эти соединения являются потенциальными порообразующими агентами в отношении клеточных мембран, что уже подтверждено результатами специальных биофизических экспериментов.
Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 2 обзора. Отдельные части работы были представлены на российских и международных конференциях в 2006-2013 гг. (см. список публикаций).
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 204 страницах и включает 70 схем, 7 таблиц, 40 рисунков. Работа состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, посвященного синтезу олигодентатных конъюгатов на основе низкомолекулярных матриц (каликсаренов и циклодекстринов), обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Библиографический список включает 217 наименований.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 07-03-00603, 11-0392694 ИНД_а) и двусторонней программы РАН-СМЯ (грант 23964).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез линейных бифункциональных предшественников циклоолигосахаридов.
Для синтеза линейных предшественников циклических олигосахаридов были использованы специальным образом функционализированные моно-, ди-, три- и тетрасахаридные блоки. На основе Б-глюкозамина был получен основной моносахаридный
2
блок 3 (Схема 1). Выбор защитных групп был основан на эффективности их постановки и удаления, устойчивости в условиях реакций гликозилирования и способности обеспечивать необходимую стереоизбирательность образования Р-(1—>6)-гликозидных связей. Так, в качестве постоянных защитных групп для ОН-групп при С-3 и С-4 были выбраны бензоильные группы, так как они менее склонны к миграции, в отличие от ацетильных, а для защиты аминогруппы при С-2 была выбрана фталоильная группа, которая, благодаря способности соучаствовать в стабилизации гликозил-катиона (см. ниже Рисунок 1), обеспечивает образование 1,2-пгранс-гликозидных связей. В дальнейшем фталоильная и бензоильная защиты могут быть одновременно удалены с практически количественным выходом (см. раздел 6).
НО-, НО^ АеО-^ АсО^
мнг ри™ ритм РМЬМ Вг
1 2 3 (99%) 4 (95%)
Схема 1. Реагенты и условия: а. Ас20, Ру; Ь. Вг2, СН2С12; с. НС1, МеОН, СН2С12.
Для дальнейшего удлинения олигосахаридной цепи моносахарид 3 превращали в гликозил-донор другого типа (4), который может быть селективно активирован в присутствии тиогликозидов. Из блоков 2 и 4 в условиях реакции Гельфериха был получен дисахарид 5, последующее бромирование которого приводит к гликозил-донору 6, а селективное дезацетилирование — к гликозил-акцептору 7 (Схема 2). Аналогичным образом из моносахарида 4 и дисахарида 7 с высокими выходами были получены трисахариды 8 и 9.
RO—^ АсО^
^ ^ ™ Bzo-^o SE, PhlhN BZO-^O _
BzO-*—Т^-^1 . .„„, BzO-^—T^—1Br
. ( 5 R = Ac (84%)
"Wr = H
PhthN 6 (95%) PhthN
(94%)
PhthN
с ^ 8 = Ас (78%) * 9 ГЗ = Н (98%)
Схема 2. Реагенты и условия: а. Н§Вг2, 1^(СМ)2, \lcCN, МЯ 3 А; Ь. Вг2, СН2С12; с. НС1, МеОН, СН2С12.
Линейные бифункциональные олигосахариды, состоящие из 4-7 остатков п-глюкозамина (соединения 10-14, Схема 3), получали по аналогии с соответствующими ди- и трисахаридами. В качестве гликозил-донора использовали бромид 6, так как при использовании больших гликозил-доноров (три- и тетрасахариды-бромиды) выход реакций
гликозилирования снижался до 10-15%. Отметим, что все стадии гликозилирования при получении линейных олигомеров протекали стереоспецифично. Для выделения продуктов использовали гель-хроматографию, позволяющую отделить конечные вещества от исходных соединений за счет разницы в молекулярном весе.
© 0
[б] н°
' а,Ь ВгО
+ ---Вг(
Э
ь/101* = Ас (76%) 41 R = ОН (97%)
6 + а, ЬI
14 (45%)
Схема 3. Реагенты и условия: а. ШВг2, 1^(01)2, МеС1Ч, М8 3 А; Ь. НС1, МеОН, СН2С12.
2. Циклизация олигоглюкозаминовых бифункциональных блоков.
Реакцию внутримолекулярного гликозилирования бифункциональных линейных олигосахаридов 7, 9, 11-14 проводили под действием промотирующей системы МБ-ТГОН в хлористом метилене в условиях высокого разбавления реакционной смеси (концентрация олигосахаридов составляла 6 ммоль/л). Продукты циклизации 15-20 были получены с высокими выходами (69-95%, Схема 4).
но-^
Р(1№Ы
РЬ»| 15(90%)
РММ в/о о
ВгО 1 у
9 п = 1
11 п = 2
12 п = 3
13 п = 4
14 п = 5
ОВг ОТ,МРМ|1 +
i /
О-^—гЧ-0 ОВг рмим I
/п-1 16 п = 1 (95%) 17Ь п = 2 (68%) 18Ь п = 3 (81%) 19Ь п = 4 (69%) 20Ь п = 5 (59%)
Схема 4. Реагенты и условия: а. N15, ТГОН, СН2С12, МБ 4 А, -15 °С.
о-рнр
п-1
17а п = 2 (17%) 18а п = 3 (3%) 19а п = 4 (11%) 20а п = 5 (10%)
Анализ реакционных смесей с помощью гель-хроматографии показал, что в ходе всех рассмотренных циклизаций не происходит олигомеризации исходного бифункционального
реагента с образованием более высокомолекулярных продуктов. Внутримолекулярное гликозилирование тетрасахарида 11 проводили также и при повышенной в 10 раз концентрации (60 ммоль/л), однако и в этих условиях продукты олигомеризации не были зафиксированы, а циклические олигосахариды 17а и 17Ь были получены с теми же выходами, что и при более высоком разбавлении.
Как уже было отмечено ранее, благодаря наличию соучаствующей фталоильной группы, при получении линейных бифункциональных предшественников 7, 9, 11-14 происходило только стереоспецифичное образование 1,2-/я/э£шс-гликозидпых связей. Однако при циклизации олигосахаридов 11-14 фталимидный заместитель при С-2 гликозилирующего остатка не обеспечивал стереоспецифичного Р-гликозилирования и происходило также образование циклов с а-гликозидной связью 17а-20а. Эти минорные продукты были выделены в индивидуальном состоянии при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ и охарактеризованы соответствующими физико-химическими методами. Исключением являлся циклопентасахарид 18а, который не удалось окончательно отделить от основного продукта 18Ь (его выход, 3%, имеет оценочный характер, а строение установлено на основе спектров ЯМР полученной смеси).
Спектры 'Н и ,3С циклов 15, 16, 17Ь-20Ь содержат сигналы только одного повторяющегося моносахаридного остатка. В то же время спектры циклоолигосахаридов 17а-20а с а-гликозидной связью содержат наборы сигналов для каждого моносахаридного звена. Вследствие перекрывания пиков не представлялось возможным определить аномерную конфигурацию а-остатков в циклоолигосахаридах 17а-20а, исходя из значений КССВ между Н-1 и Н-2. а-Конфигурация была косвенно доказана на основе характеристичного слабопольного сдвига сигнала Н-3 а-остатка в область 6.9-7.3 м. д. Циклическая природа соединений 17а, 19а, 20а также была подтверждена присутствием корреляционных кросс-пиков в спектрах ЯОЕБУ между Н-1 а-остатка и Н-6 соседнего с ним остатка глюкозамина. Отсутствие в |3С-спектрах сигнала углерода, связанного с первичной ОН-группой (60-62 м. д.), также свидетельствует в пользу циклического строения этих соединений.
3. Стереохимия реакций циклизации.
Мы предположили, что образование циклов 17а-20а с а-связью может быть обусловлено конформационными особенностями их линейных предшественников 11-14. При помощи специальных методик ЯМР и молекулярно-динамических расчетов1 было показано, что энергетически наиболее выгодная конформация Р-(1—>6)-гликозидных связей в линейном
1 Регистрация спектров ЯМР выполнена к.х.н. А. А. Грачевым, а компьютерные расчеты - к.х.н. А. Г. Гербстом.
5
тетрасахариде 11 такова, что молекула имеет «свернутую» конформацию подобную спирали (Схема 5).
ВгО /х82 рмнм
50і
но'2/'<Р№
8гО ОВ2 15
г
ОВг 0В2
в2о ВгО
V
17а (17%)
ВгО' ВгО' О,
Стабилизация . гликозип-катиона
/ {а-атака]
I Конформационное і перестроение цепи в \ правозакрученную спираль
Конформационное перестроение цепи в левозакрученную спираль
РІІІПМ ; —О
рьшмго О-ІМРМИ
Р№Ы
17Ь (68%)
Схема 5. Стереохимия циклизации тетрасахарида 11. Реагенты и условия: а. N15, ТГОН, СН2С12, Мв 4 А,-15 °С.
В этой конформации молекула тетрасахарида 11 представляет собой один виток правозакрученной спирали, в результате чего атом С-1 гликозил-донорного остатка и группа 6-ОН гликозил-акцепторного остатка оказываются пространственно сближенными с «а-стороны». Именно такое их расположение способствует неожиданному а-гликозилированию, которое нами наблюдалось впервые для гликозил-доноров на основе А'-фталоилированных производных аминосахаров. В случае ди- и трисахаридов 7 и 9 нарушения стереоспецифичности гликозилирования не происходит, так как гликозил-донорный
и -акцепторный концы в этих соединениях не сближены в пространстве ввиду недостаточной длины олигосахаридной цепи. В то же время, анхимерное содействие фталимидной группы препятствует образованию цикла с а-связью, а также стабилизирует гликозил-катионный интермедиат, в результате чего он становится достаточно устойчивым, чтобы претерпеть конформационное перестроение молекулы тетрасахарида из правозакрученной спирали в левозакрученную. Такая пространственная структура способствует уже р-атаке (Схема 5). Наблюдаемый стереохимический итог циклизации соединения 11 является, по-видимому, следствием конкуренции указанных выше процессов. Аналогичное объяснение можно предложить и для образования а-продуктов в реакциях циклизации бифункциональных блоков 12-14, у которых терминальные остатки моносахаридов расположены на соседних витках спиральной структуры молекул.
4. Изучение влияния условий циклизации на стереохимический результат реакции (на примере циклизации тетрасахаридов).
Вследствие образования циклов с а-связью снижается выход основного симметричного цикла, а также требуется дополнительное проведение трудоемкого разделения стереоизомеров. Для поиска условий реакции, способствующих повышению стереоселективности циклизации, мы исследовали внутримолекулярное гликозилирование бифункционального тетрасахарида 11, так как в случае его циклизации наблюдали максимальный выход побочного а-продукта среди всех проводимых реакций. Также оптимизация циклизации этого соединения была важна и с точки зрения повышения эффективности его превращения в циклотетрасахарид 17Ь, широко использованный нами в синтезе олигодентатных конъюгатов.
В Таблице 1 приведены результаты экспериментов, в которых варьировали такие условия реакции, как растворитель, температура и промотирующая система. Использование метилтрифторметансульфоната (№ 2) значительно уменьшает скорость реакции и ее стереоселективность по сравнению с промотирующей системой Ы1Я-'1ГОН (№ 1). Влияние полярности растворителей на стереохимию циклизации не поддаётся четкому объяснению. Так, неполярный дихлорэтан (№ 3) и полярный нитрометан (№ 5) уменьшают стереоселективность по сравнению с дихлорметаном (№ 1). С другой стороны, высокую р-стереоселективность наблюдали в случае проведения реакции циклизации в неполярном толуоле (№ 4) и полярных нитрилах (№ 6, № 7). Использование диоксана как сорастворителя (№8), так же, как и понижение температуры реакции до -60 °С...-80 °С (№9, № 10), приводило к образованию сложной смеси неидентифицированных продуктов.
В следующей серии опытов было изучено влияние уходящих групп в гликозилирующем остатке на стереохимию циклизации. Из тиогликозида 11 был получен
соответствующий гликозил-бромид, попытка внутримолекулярного гликозилирования по Гельфериху которого привела к образованию сложной смеси, содержащей, помимо прочего, соединения 17а и 17Ь в качестве минорных компонентов.
Таблица 1. Вариация условий циклизации тетрасахарида 11.
NIS, TfOH, MS 4 А, растворитель
©
fl7a] + [17b]
Выход, %
№ Растворитель Т,°С Время 17а 17Ь 17а+17Ь соотн. выходов данные 'НЯМР
1 СН2С12 -20 15 мин 17 68 85 1:4 1:4
2а СН2С12 20 70 ч — ~70ь 1:2
3 С1СН2СН2С1 -20 20 мин — ~70ь 1:2.8
4 толуол -20 15 мин ~70ь 1:9.5
5 MeN02 -20 15 мин 18 59 77 1:3.3
6е MeCN -20 15 мин 8 60 68 1:7.5
7 CH3CH2CH2CN -20 15 мин — ~70ь 1:13
8 толуол-диоксан 1:1 -15 2ч сложная смесь
9 CH3CH2CH2CN -60 75 мин сложная смесь
10 СН2С12 -80 60 мин сложная смесь
аПромотор МеОТ£ ьОценка по ТСХ. "Использовали молекулярные сита 3 А.
Из тетрасахарида 10 был получен бифункциональный блок 21, содержащий пентенильную уходящую группу (Схема 6). Циклизация тетрасахарида 21 в дихлорметане (Таблица 2, № 1) привела к образованию циклов 17а,Ь с высоким суммарным выходом, однако доля а-связанного продукта 17а была неожиданно существенно выше (выходы а- и Р-продуктов циклизации в этом случае практически сравнялись), чем при циклизации тетрасахарида 11 в тех же условиях (см. Таблицу 1, № 1). При замене дихлорметана на нитрометан (№ 2) или ацетонитрил (№ 3) суммарный выход стереоизомеров 17а и 17Ь и их соотношение были близки к таковым при внутримолекулярном гликозилировании тетрасахарида 11 в тех же растворителях (см. Таблицу 1, № 5, № 6).
21 (77%)
Схема 6. Реагенты и условия: а. <) МеСПТ, СН2С12, МЭ 4 А, /7) НС1, МеОН, СН2С12; Ь. N18, ТГОН, -20 °С, 15 мин, М8, растворитель (см. Таблицу 2).
Таблица 2. Влияние растворителя на циклизацию тетрасахарида 21.
№ Растворитель Молекулярные Выход, % Соотношение а:р
сита 17а 17b 17а+17Ь стереоизомеров
1 СН2С12 4 Á 37 46 83 1:1.2
2 MeN02 4 Á 14 53 67 1:3.8
3 MeCN ЗА 10 59 69 1:5.9
Тритилирование первичной гидроксильной группы на невосстанавливающем конце молекулы 11 не создает принципиальных препятствий для внутримолекулярного гликозилирования, однако, в силу объема ТЮ-группы, могло бы повлиять на конформацию переходных состояний (Схема 5) таким образом, что р-атака гликозил-катиона стала бы единственным возможным вариантом. Однако активация тетрасахарида 22 под действием МеОТґ приводила исключительно к продукту 1,2-элиминирования — гликалю 23 (Схема 7).
Схема 7. Реагенты и условия: a. TrCI, Ру, 10 дней; b. MeOTf, СН2С12, MS 4 Á, 48 ч.
Таким образом, среди изученных методов для препаративного получения циклического тетрасахарида 17Ъ наиболее удачными являются первоначально использованные нами условия для циклизаций всех соединений (Таблица 1, № 1), так как в этом случае образование Р-продукта происходит с наибольшим выходом. Улучшение стереоселективности в случае использования нитрильных растворителей (Таблица 1, №6 и № 7) нивелируется тем, что реакция протекает с образованием других неидентифицированных продуктов, в результате чего снижается общий выход Р-цикла, а его выделение осложняется.
5. Изучение влияния соучаствующей группы при С-2 восстанавливающего остатка на стереохимию циклизации.
В ходе блочного синтеза были получены модельные тетрасахариды 36-39, 43, 44 (Схема 8), в которых некоторые или все остатки D-глюкозамина заменены на остатки D-глюкозы. Для получения этих соединений использовали схему, аналогичную получению бифункционального тетрасахарида 11. Гликозилирование соответствующих моно- и дисахаридов осуществляли по методу Гельфериха или активацией AgOTf. Все конечные и промежуточные соединения были полностью охарактеризованы с помощью спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии.
;r;s
25 R = NPhth
26 R = NHTroc
27 R = OBz
cO^
128, 30J
28 R = NPhth (77%)
29 R = NHTroc (90%)
30 R = OBz (90%)
AcO—
I-T^-O
34 R = NPhth
35 R = OBz
Л Br
HO--
BzO" BzO
;. Kl
31 R = NPhth (97%)
32 R = NHTroc (96%)
33 R = OBz (95%)
36 R = NPhth (76%)
37 R = NHTroc (54%)
38 R = OBz (52%)
BzO \ — . cp. BzO-»—T^J SEt \ PhthN/
\ /2 39 (73%)
r'o-
43 (73%)
0*®
, 40 R1 = SEt. R2 = Ac (68%), d I 41 R1 = SEt, R2 = H (83%) J 0 » 42 R1 = Br, R2 = Ac
®
(62%)
Схема 8. Реагенты и условия: а. AgOTf, СН2С12> MS 4 А, -20 °С; b. HgBr2, Hg(CN)2, MeCN, MS 3 А; с. HCl, МеОН, СН2С12; d. Br2, СН2С12. (NHTroc — 2,2,2-трихлорэтилоксикарбонил-амино).
Внутримолекулярное гликозилирование тетрасахаридов 36-39, 43, 44 проводили в одних и тех же условиях (см. Схему 9). По данным гель-хроматографии реакционных смесей ни в одной из реакций не наблюдали образования продуктов с большим молекулярным весом, чем исходный тетрасахарид. Для выделения циклических продуктов использовали колоночную хроматографию на силикагеле и обращенно-фазовую ВЭЖХ.
Результаты циклизаций приведены в Таблице 3. Так, в случае тетрасахарида 36 с N-фтапоильной защитой в гликозилирующем остатке наблюдали образование циклов 45а и 45Ь с соотношением стереоизомеров 1:6 (№ 1). Этот результат количественно похож на результат циклизации тетраглюкозамина 11 (см. Таблицу 1, № 1). С помощью компьютерных расчетов2 было подтверждено, что замена трех остатков D-глюкозамина на D-глюкозу практически не изменяет конформацию тетрасахаридов по сравнению с конформацией в 11,
2 Компьютерные расчеты выполнены к.х.н. А. Г. Гербстом.
10
а значит, стереохимический итог реакций на Схеме 9 определяется природой группы при С-2 гликозилирующего остатка. Стереохимия циклизации Л'-Тгос-защншепного олигосахарида 37 (№2) практически совпадает с 36 (№ 1). В то же время циклизация тетраглюкозида 38 протекает абсолютно стереоспецифично с образованием только продукта с 1,2-транс-гликозидной связью (47Ь, № 3).
Влияние заместителя при С-2 на стереоселективность циклизации особенно наглядно можно проследить на примере тетрасахаридов 39 и 43, состоящих из чередующихся остатков о-глюкозамина и о-глюкозы. Из соединения 39 с ЫРЬШ-группой на восстанавливающем конце образуется смесь а,Р-стереоизомеров 48а и 48Ь в соотношении 1:5 (№4), в то время как тетрасахарид 43 с 2-ОВг-группой в гликозилирующем остатке циклизуется в соединение 48Ь (№ 5). Также с образованием только р-гликозидной связи происходит циклизация тетрасахарида 44 (№ 6).
36-39,43,44 / \ ов2 / п
я вго-^^—о ов2 ¿л/вгоовг
^ о
45Ь-49Ь 45а, 46а, 48а
Схема 9. Реагенты и условия: а. N18, ТГОН, СН2С12, МБ 4 А, -20 °С.
Таблица 3. Результаты циклизации тетрасахаридов 36-39, 43 и 44.
№ Тетрасахарид Я' Я2 Я3 Я4 Продукты Суммарный выход, % а:Ра
1 36 ОВг ОВг ОВг 45а, Ь 54 1:6
2 37 >ШТгос ОВг ОВг ОВг 46а, Ь 57 1:6
3 38 ОВг ОВг ОВг ОВг 47Ь 88 только Р
4 39 ЫГ'ЫЬ ОВг ЫРЫЬ ОВг 48а, Ь 75 1:5
5 43 ОВг ЫРЫН ОВг ЫР1иЬ 48Ь 87 только р
6 44 ОВг ОВг №>ЫЬ N141111 49 Ь 91 только Р
"Соотношение на основе выходов выделенных продуктов.
Для проверки нашей гипотезы о том, что стереохимия циклизации тиогликозидов 3639, 43 и 44 зависит от эффективности анхимерного содействия заместителя при С-2, были проанализированы величины энергий стабилизации3 катионов (Рисунок 1). Разница в энергиях между конформациями катионов с соучаствующей и несоучаствующей ориентацией заместителя при С-2 (ОВг, МЧиИ, ЫНТгос) составляет стабилизационную энергию, которая была в 3-8 раз выше для 2-ОВг заместителей, чем для ЫРИШ- или ЫНТгос-
3 Расчеты энергии стабилизации катионов выполнены к.х.н. А. Г. Гербстом.
11
групп. Это свидетельствует о том, что в случае бензоильной группы энергетически выгодное соучастие является фактором, определяющим стереоспецифичное протекание реакции циклизации.
АсО-
X = О. NH. N
1 V
NPhth R=H OBZ NHTroc
I
Gl
(стабилизированный)
ированный) (дестабилизированный)
Рисунок 1. Структура гликозил-катиона G+.
Y
а4 ъг*
о
А
6. Получение незамещенных циклоолигосахаридов.
В циклоолигосахаридах 15, 16, 17Ь-20Ь, 48Ь и 49Ь присутствуют два вида защитных групп: бензоильные и фтапоильные. Их одновременное эффективное удаление возможно в условиях гидразинолиза в кипящем этаноле (Схема 10). Незамещенные циклические олигосахариды 50-57 очищали гель-хроматографией в водном растворе уксусной кислоты. Полученные соединения, благодаря наличию легко функционализируемых первичных аминогрупп, являются удобными матрицами для создания мультидентатных конъюгатов на их основе.
Схема 10. Реагенты и условия: a. N2H4-H20, ЕЮН, 90 °С, 3 ч.
7. Синтез гликокластеров - блокаторов бактериального лектина LecA.
Бактерия P. aeruginosa является причиной легочных и других инфекций, с трудом поддающихся лечению и поражающих людей с ослабленным иммунитетом. Эта бактерия продуцирует лектин LecA (другое название PA-IL), который в значительной степени определяет эффективность адгезии P. aeruginosa к клеткам организма-хозяина посредством углевод-белковых взаимодействий. Лектин LecA специфично связывается с остатками галактозы, находящимися на поверхности клеток, поэтому блокирование лектинной активности белка LecA рассматривается в качестве метода для прекращения распространения инфекции.
50 п = 0 (95%)
51 п = 1 (95%)
52 п = 2 (94%)
53 п = 3 (95%)
54 п = 4 (96%)
55 п = 5 (92%)
56 R1 = ОН, R2 = NH2 (100%)
57 R1 = NH2, R2 = ОН (97%)
Сам лектин структурирован в кластер из четырех субъединиц, в каждой из которых содержится по одному сайту связывания соответствующего галактозного лиганда. В случае, когда межлигандное расстояние в гликоконъюгате соответствует расстоянию между сайтами связывания в LecA, можно достичь высокой аффинности такого конъюгата к лектину. Увеличение аффинности обусловлено гликозидным кластерным эффектом, когда лектинный тетрамер одновременно взаимодействует с несколькими остатками D-галактозы в составе блокирующего гликокластера.
Для получения олигодентатных блокаторов LecA были использованы циклические олигосахариды 50-52, 56 и 57. Строение этих соединений позволяет синтезировать гликокластеры с различным числом и топологией расположения углеводных лигандов. В целевых конъюгатах остатки D-галактозы (лиганд LecA) и D-маннозы (неактивный лиганд в качестве отрицательного контроля) соединены с циклоолигоглюкозаминовым ядром посредством спейсеров, различных как по длине, так и по своей природе. Присоединение спейсерированных лигандов к циклическим носителям осуществляли двумя способами: по реакции yV-ацилирования или по методу 1,3-диполярного циклоприсоединения по Шарплессу между азидом и апкином (click-реакция, СиААС).
Гибкие гидрофильные линкеры 60 и 61, содержащие карбоксиметильную группу, были получены на основе три- и гексаэтиленгликолей. В результате гликозилирования соединений 60 и 61 согласно Схеме 11 были получены спейсерированные производные D-галактозы 63 и 64, которые далее были превращены в соединения 67, 68 содержащие активированную сложноэфирную группу.
О fg^l АоО ОАО Q
58 п = 2 60 п = 2 63 п = 2 (87%)
59 п = 5 61 п = 5 64 п = 5 (76%)
^ АсО ОАО Q АсО ОАО Q
65 n = 2 (95%) 67 п = 2 (72%)
66 n = 5 (70%) 68 n = 5 (96%)
Схема 11. Реагенты и условия: a. N2CHCOOMe, BF3'Et20, СН2С12; b. HgBr2, Hg(CN)2, MeCN, MS 3 A; c. Nal, Py, A; d. CF3COOC6F5, Py, CH2C12.
Конъюгация соединений 67 и 68 с матрицами 51 и 52 после дезацилирования по Земплену привела к образованию необходимых гликокластеров 69-72 (Схема 12), которые были очищены методом гель-хроматографии.
ноон
(ет) RHN-Jr^ A,nhr 69 n = 1, m = 3 (74%) но он
+ га ~ Лн Яї:і::ЦЯїі r=
® ног^і^ 72 п = 2, m = 6 (68%) но т0
Схема 12. Реагенты и условия: а. /') Et3N, ДМФА, it) MeONa, MeOH.
Для получения конъюгатов с применением техники «click-chemistry» были исследованы две различные схемы сборки. В первом случае циклоглюкозаминовые матрицы 50-52 первоначально были функционапизированы остатками 4-пентиновой кислоты (Схема 13). Полученные производные 74-76 конъюгировали с азидами 77, 79, 80 с образованием гликокластеров 78, 81-84. Эксперименты показали, что реакция ацилирования циклоглюкозаминов эфиром 73 протекает с выходом 65-75%, а стадия диполярного циклоприсоединения с выходом 65-80%. К сожалению, не удалось достичь более высоких выходов на стадии «с1іск»-реакции даже после оптимизации условий её проведения.
о но он
HN
53
1 50-52 I
АсО 0Ас
О
\о-но
о он
NH/U 74 n = 0(65%) ' 75 n = 1 (75%)
76 n = 2 (74%)
nhr
78 (53%)
'XXJuP^
HOrOH HO
HO __ 1
[ 75, 761
79
или
OH
HO-*—^
тон mNZoo\NtW
(V01
НРГС^ЦЬ "он
rhn /
81 n = 1, R - X (67%) 82n = 1,R = Y(75%)
83 n = 2. R = X (86%)
84 n = 2. R = Y (70%)
но OH
X * °
HO y но-
OH 1-^12,
N О
Схема 13. Реагенты и условия: a. Et3N, ДМФА; Ь. i) Cul, 'Pr2EtN, MeCN, ii) MeONa, MeOH; c. CuS04-5H20, аскорбат натрия, H20, MeOH, pW, 70 °C.
Для минимизации расхода циклоолигоглюкозаминов было решено поменять порядок
присоединения лигандов и линкеров таким образом, чтобы циклические носители были
задействованы только в одной заключительной стадии конъюгации. Для этого сначала
проводили click-реакцию между спейсерированным галактозным лигандом и
сукцинимидным эфиром пентиновой кислоты 73, а образующиеся производные, содержащие
14
активированную сложноэфирную группу, вводили в реакцию ацилирования с циклоолигоглюкозаминовыми матрицами. Несмотря на то, что для реализации данного подхода необходимо было использовать перацетилированные производные П-галактозы (77 и 85) и в дальнейшем проводить стадию дезацетилирования конечного конъюгата, это не приводило к существенному снижению общего выхода конъюгатов. По реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азидов 85, 77 к алкину 73 были получены сукцинимидные эфиры 86, 87 соответственно (Схема 14). В результате ацилирования этими эфирами циклических олигосахаридов 50, 52, 56, 57 получали с хорошими выходами (72-88%) целевые конъюгаты 88-93.
LV п Асо ОАО
+ ® — АСО^О-
86(71%)
® - О
АеО ОАс
87 (65%)
| 50, 521 + или
©
(86)
[56,57) + или
НО ОН
л
(■ÎS^P
88 п = О, R = X (87%)
89 п = 2, R = Y (72%)
ry V^ 90 R1 = OH. R = X (72%)
R,j}Q \ 91 R1 = OH. R2 = Y (83%)
\ °>OH 92 R1 = X. R2 = OH (88%)
HO^-O ГЦ 93 R1 = Y, R2 = OH (76%) i oh
Н0,_он
y Y о M r'V
H
Схема 14. Реагенты и условия: a. Cul, 'Pr2EtN, MeCN; b. ;) Et3N, ДМФА, ii) MeONa, MeOH.
Серия из 15 синтезированных гликокластеров, включая маннозные конъюгаты для отрицательного контроля (82 и 84) и монодентатное референсное соединение 94 (Рисунок 2), была изучена в экспериментах4 по взаимодействию с лектином ЬесА.
Эксперименты по блокированию лекгина ЬесА проведены к.х.н. В. Б. Крыловым в лаборатории профессора А. 1шЬеПу (Университет Гренобля, Франция) в рамках двустороннего (РАН-СЫНЯ) исследовательского проекта.
но он
rhn-
KHN
НО ОН
^Vhr но|О X
ТГип
НО
нп v 'гч Q
но но^он
\ /7 ] "у^-им
$>н в WA
nhr но 6 J
90 R = С
91 R = D
88 (п = 0), R = С ТГ
ЗЙЖХ он^ч он С
70 (n = 1), R = В но , но
r 4°» D
rhn i
69 (n = 1), R = A
70 (n = 1), R = В "о, о- V^XToh
81 (n = 1), R = С
82 (n = 1), R = E
71 (n = 2), R = A
72 (n = 2), R = В
83 (n = 2), R = С
89 (n = 2), R = D но-'—v—Ил"п \ ,r.
84 (n = 2)! R = E nhrho e HO^k
92 R = С ' , .
93 R = D v^oj^—
L ЗГ Hb
Рисунок 2. Серия синтезированных гликокластеров.
8. Изучение взаимодействия синтезированных гликокластеров с лектином LecA.
Для изучения взаимодействия полученных конъюгатов с лектином LecA были использованы следующие методы: ингибирование гемагглютинации эритроцитов (HLA), иммуноферментный лектиновый анализ (ELLA) и изотермическое микрокалориметрическое титрование (ITC). Полученные данные приведены в Таблицах 4 и 5. Согласно данным HIA монодентатные метил-Р-Б-галактопиранозид, ийра-нитрофенил-Р-о-галактопиранозид и соединение 94 ингибировали лектин-индуцированную агглютинацию эритроцитов в миллимолярном диапазоне концентраций, в то время как гликокластеры были активны уже при микромолярных концентрациях (Cmin, Таблица 4), при этом наиболее активными оказались конъюгаты 89 и 91. Данные ELLA (Таблица 4) хорошо согласуются с данными HIA. Некоторые из олигодентатных конъюгатов (78, 83, 89, 91, 93) продемонстрировали выраженный кластерный эффект при взаимодействии с лектином и оказались активнее метил-галактопиранозида в сотни и тысячи раз. Особенно наглядно возрастание аффинности при рассмотрении ряда конъюгатов с одним и тем же линкером (С), но различным числом лигандов: 94, 88, 81 и 83. Так, значения их относительной активности (Д) по методу ELLA составляют соответственно 0.63, 23.6, 189 и 279. Данные ITC по монодентатным референтным соединениям (Таблица 5) демонстрируют значения Ко в микромолярном диапазоне. Аффинности гликокластеров к лектину, измеренные этим методом, в целом, хорошо коррелируют с данными HLA и ELLA.
Таблица 4. Результаты тестов HIA и ELLA по взаимодействию гликокластеров с LecA.
Соединение
. . а Линкер, Матрица ь
лиганд
HIA
ELLA
Cm¡„, МкМ
р
1С5о, мкМ
Монодентатные соединения
ß-D-Gal-OMe — 6 250 1 69 1
ß-D-Gal-0-pPhN02 — — 1 ООО 6.3 28 2.5
94 С 6 250 1 83 0.63
Бидентатные соединения
88 С 625 10 2.9 23.6
78 WW D 19.5 320 0.12 574
90 с9г С 625 10 2.1 32.3
91 (SSt D 1.22 5122 0.057 1200
92 % . с 1250 5 2.9 23.6
93 Чт ' D 9.8 638 0.15 460
Тридеитатные соединения
69 А 391 16 1.29 45
70 m В 195 32 0.81 71
81 99 С 98 64 0.27 189
82 Е 781 8 > 2500е —
Тетрадентатные соединения
71 А 195 32 0.59 104
72 m в 98 64 0.50 118
83 | 49 128 0.15 279
89 D 1.2 5122 0.057 1210
84 Е 781 8 > 2500е —
(С1с1Ч), О (01с). Структуры линкеров и лигандов показаны на Рисунке 2. 7? = [Ст]п(Р-о--о-Са1-ОМе)/1С5о]. еНе наблюдали ингибирования ниже
указанной концентрации.
Проведённые эксперименты показали, что эффективность связывания с лектином во многом определяется природой связующего линкера в составе конъюгата. Так, различия в аффинности между конъюгатами с три- и гексаэтиленгликолевыми линкерами А и В оказались минимальными (например, соединения 71 и 72), в то время как наиболее активными оказались соединения, содержащие жесткий спейсер О с ароматическими фрагментами (78, 91, 93, 89).
Таблица 5. Результаты экспериментов ITC для взаимодействия синтезированных глико-кластеров с LecA.
Соединение Матрица3 Линкер, лигандь -АН, кДж/моль -TAS, кДж/моль Ко, мкМ ß
Монодентатные соединения
ß-D-Gal-OMe11 — 39 15 70 1
94 С 33.1±0.6 11.1±0.5 140±5 0.5
Бидентатные соединения
88 ^^ С 92±И 60±11 2.7±0.6 25
78 ^^ D 70.3±0.6 33.4±0.6 0.34±0.02 209
90 rfh С 84.8±0.9 52.4±0.9 2.15±0.07 33
91 ^Sr D 75.2±1.5 37.0±0.3 0.22±0.04 318
92 rfk С 90±4 58±3 3.0±0.3 23
47 D 76±9 40±9 0.53±0.06 132
Тридентатные соединения
69 А 98±8 65±9 1.59±0.65 47
В 90±2 56±2 0.98±0.27 71
81 С 90±6 54±6 0.46±0.07 151
Тетрадентатные соединения
71 А 117±5 83±6 1.45±0.03 48
А В 122±6 86±6 0.45±0.03 157
С 145±6 108±2 0.31±0.02 226
89 D 87±2 47±3 0.079±0.002 886
(GlcN), О (Glc). "Структуры линкеров и лигандов показаны на Рисунке 2. с/?= [Á^j(P~D-Gal-OMe)/A:D]. Результаты из работы S. Vidal et al., Chem. Eur. J., 18 (2012), 6250-6263.
Среди бидентатных гликокластеров на основе «смешанных» циклических тетрасахаридов (соединения 90-93), в которых линкеры с галактозными лигандами имеют различную пространственную ориентацию, наиболее активным оказался конъюгат 91 с диагональным расположением линкеров. Тетрадентатное производное 89 оказалось лидером по связыванию с лектином во всех трех испытаниях (HIA, ELLA, ITC) и имеет наибольшую аффинность с Ко = 80 нМ среди известных на сегодняшний день блокаторов адгезина LecA.
Для некоторых гликокластеров были также проведены компьютерные расчеты,5 направленные на анализ межлигандных расстояний и поиск структур, чья геометрия пространственного расположения галактозных лигандов наилучшим образом удовлетворяет
Компьютерные расчеты выполнены к.х.н. А. Г. Гербстом.
18
относительному расположению сайтов связывания Б-галактозы в двух смежных доменах лектина ЬесА, что отражает наиболее вероятную модель связывания. Результаты этих расчетов хорошо коррелируют с данными биологических испытаний.
9. Синтез агентов для изучения порообразования в клеточных мембранах.
Размер полости циклоолиго-р-(1—»6)-о-глюкозаминов (внутренний диаметр циклоди- и тетрасахаридов составляет 0.35-0.58 нм) достаточен для проникновения через нее небольших молекул или ионов. Для получения соединений, способных образовывать поры в клеточных мембранах, необходимо было конъюгировать циклоолигосахариды с гидрофобными цепями, обладающими сродством к липидными компонентам мембран. Гидрофобные составляющие были синтезированы на основе ряда производных бутиленгликоля (Схема 15), для которых известны примеры конъюгации с циклодекстринами в синтезе каналообразующих соединений [М. S. Gin et al., Angew. Chem., Int. Ed., 44 (2005), 7584-7587]. В зависимости от длины гидрофобной цепи конъюгаты могут образовывать ион-транспортные каналы различного строения (моно- или бимолекулярные).
В качестве матриц были выбраны циклические ди-, три-, тетра- и пентаглюкозамины (соединения 50-53), а также «смешанный» тетрасахарид 56. Синтез кислот 97, 101 и 105 приведен на Схеме 15. Для введения карбоксильной группы исходные спирты 95, 99 и 103 подвергали реакции с метилдиазоуксусным эфиром, образующиеся сложные эфиры очищали и гидролизовапи в щелочных условиях. На основе кислот 97, 101 и 105 получали активированные (пентафторфениловые) эфиры 98, 102 и 106, соответственно.
97 R = Н (86%) \ ,
98 R = C6F5 ,
Э___b RO___101R = H(95%)\
уо^^^ 7 15 -- у о^^^^ 7 15 102 R = C6F5 /
О 100(96%) О
^ 105 Ж ел)"
* 'ч п 5 п 5
103 Э ° 104(77%)
Схема 15. Реагенты и условия: a. N2CHCOOMe, BF3 Et20, СН2С12; b. і) КОН (aq), МеОН, И) НС1 (aq); с. CF3COOC6F5, Ру, СН2С12.
Целевые конъюгаты получали ацилированием аминогрупп циклов 50-53, 56 пентафторфениловыми эфирами кислот (Схема 16). В качестве альтернативного метода использовали конденсирующий реагент DMTMM (показан на Схеме 16), образование активированного эфира в этом случае происходит in situ. В целом, методика с Pfp-эфирами приводила к несколько большим выходам конъюгатов. В некоторых случаях выходы
целевых соединений были весьма низкими (27-46%) из-за потерь, связанных с амфифильной природой конъюгатов, усложняющей их очистку. Так, процедура выделения сочетала, как правило, последовательность нескольких видов хроматографии для каждого конъюгата 107121 (гель-фильтрацию, ВЭЖХ на нормальной и обращенной фазе).
но но.
о о-.
но4-о - ' он
но он
56
о
98 R = в, R1 = С6Р5 101 Я = М, R^ = Н 106 R = R1 =
ИОГ^О
nn ОН о—
|ГР ^
СІОН
к 0 Ж
Ю—г-^о / \ он но-^-*^—'0 он
но^Г о
107 К = Э (71%; 98 + а, Ь)
108 В = М (43%; 101+ с, «I, Ь)
109 Р = 1.(57%; 106 +а, Ь)
НО ОН
НО ОН
о
98 R = в. R1 = СвР5
101 R= М, R, = Н
102 К = М, R^ = С6Р5 105R = L, R1 = H 106 И = Ц R^ = С6Р5 110 п = 0, К= Э (65%; 98 + а, Ь)
111 п = 0, R = М (72%; 102 + а, Ь)
112 п = 0, К = (30%; 106 + а, Ь)
113 п = 1, И = Э (63%; 98 + а, Ь) |е 114п = 1^=М (72%; 101 + с)
115 п = 1. Я = (. (63%; 105 + с)
МеО
Ме,—ч
N V- N0 О м ,0(СН2)6СН, 116 п = 2, R = Э (54%; 98 + а, Ь)
/ \_, М V ^ ^ 117п = 2^=М(54%;101+с)
МеО и рмтмм
117 п = 2, К = М (54%; 101 + с)
118 п = 2, R = 1_ (27%; 105 + с, сі, Ь)
119 п = 3, R = Э (58%; 98 + а, Ь)
3 120 п = 3, К = М (39%; 101 + с, СІ, Ь)
121 п = 3, И = I. (46%; 106 + а, Ь, <1, Ь)
Схема 16. Реагенты и условия: а. Е^Ч ОМР; Ь. МеОЫа, МеОН, СН2С12; с. ОМТММ, Е131Ч, МеОН; й. Ас20, Ру.
Структура конъюгатов 107-121 была подтверждена с помощью методов ЯМР и масс-спектрометрии. Для регистрации спектров ЯМР использовали дейтерированный метанол ввиду того, что в неполярных или апротонных растворителях (СОС13, СбОб, дейтероацетон) наблюдали сильное уширение сигналов, затрудняющих интерпретацию спектров.
С использованием полученных гликоконъюгатов начаты мембранные исследования.6
Первые эксперименты показали, что синтезированные соединения являются
перспективными агентами для создания ионных каналов в клеточных мембранах. В
настоящее время проводятся исследования их ионной селективности.
ВЫВОДЫ
1. Впервые осуществлён синтез индивидуальных представителей нового класса циклических олигосахаридов — олиго-р-(1—>6)-0-глюкозаминов, содержащих от двух до семи остатков D-глюкозамина.
2. Установлено, что циклизация линейных бифункциональных олигосахаридов, состоящих из 4-7 остатков D-глюкозамина, приводит к образованию побочных циклических продуктов с а-гликозидной связью, несмотря на наличие соучаствующей фталимидной группы в положении 2 гликозилирующего остатка. Предложено объяснение этого необычного факта, основанное на конформационных особенностях линейных олиго-Р-( 1 —>6)-[)-глюкозаминов.
3. Исследования зависимости стереохимиии реакции циклогликозилирования от структурных факторов и условий проведения реакции, проведённые на примере циклизации различных ß-(l—>-6)-связанных тетрасахаридов, показали, что основным фактором, определяющим стереохимический результат циклизации, является заместитель во втором положении гликозилирующего остатка.
4. Продемонстрирована возможность применения циклоолигоглюкозаминов в качестве носителей для синтеза олигодентатных конъюгатов: получена серия из 15 гликокластеров на основе циклических ди-, три- и тетрасахаридов, к аминогруппам которых посредством спейсеров различной природы и длины присоединены остатки D-галактозы.
5. С помощью различных методов (HIA, ELLA, ITC) определена аффинность синтезированных гликоконъюгатов к белку LecA. Показано, что степень связывания кластеров с лектином возрастает с увеличением количества D-галактозных лигандов и степени жесткости линкеров. Найден наиболее эффективный блокатор LecA из известных на данный момент.
6. Получена серия из 15 гликоконъюгатов, состоящих из циклоолигосахаридных матриц и гидрофобных цепей различной длины, которые являются перспективными агентами для создания ионных каналов в клеточных мембранах.
6 Эксперименты проводятся в лаборатории профессора Р. Та1икс1аг (Индийский институт науки, образования и исследований. Пуна, Индия).
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. M. L. Gening, D. V. Titov, A. A. Grachev, A. G. Gerbst, О. N. Yudina, A. S. Shashkov, А. О. Chizhov, Y. Е. Tsvetkov, N. Е. Nifantiev / Synthesis, NMR, and conformational studies of cyclic oligo-(l—>6)-p-D-glucosamines // Eur. J. Org. Chem., (2010), 2465-2475.
2. A. A. Grachev, A. G. Gerbst, M. L. Gening, D. V. Titov, O. N. Yudina, Y. E. Tsvetkov, A. S. Shashkov, G. B. Pier, N. E. Nifantiev / NMR and conformational studies of linear and cyclic oligo-(l->6)-P-D-glucosamines // Carbohydr. Res., 346 (2011), 2499-2510.
3. D. V. Titov, M. L. Gening, A. G. Gerbst, A. O. Chizhov, Y. E. Tsvetkov, N. E. Nifantiev / Stereochemistry of intramolecular cyclization of tetra-p-(l—>6)-D-glucosamines and related tetrasaccharides: the role of the conformational stereocontrol and the neighboring group participation // Carbohydr. Res., 375 (2013), http://dx.doi.Org/10.1016/j.carres.2012.12.005.
4. M. L. Gening, Y. E. Tsvetkov, D. V. Titov, A. G. Gerbst, O. N. Yudina, A. A. Grachev, A. S. Shashkov, S. Vidal, A. Imberty, T. Saha, D. Kand, P. Talukdar, G. B. Pier, N. E. Nifantiev / Linear and cyclic oligo-p-(l—<-6)-D-glucosamines: synthesis, conformations and applications for design of a vaccine and oligodentate glycoconjugates // Pure Appl. Chem., 85 (2013), http://dx.doi.org/10.1351/PAC-CON-12-09-06.
5. M. L. Gening, D. V. Titov, S. Cecioni, A. Audfray, A. G. Gerbst, Y. E. Tsvetkov, V. B. Krylov, A. Imberty, N. E. Nifantiev, S. Vidal / Synthesis of multivalent carbohydrate-centered glycoclusters as nanomolar ligands of the bacterial lectin LecA from Pseudomonas aeruginosa // Chem. Eur. J., (2013), http://dx.doi.org/10.1002/chem.201300135.
6. Д. В. Титов, M. JI. Генинг, Ю. Е. Цветков, Н. Э. Нифантьев / Олигодентатные гликоконъюгаты на основе каликсаренов: методы синтеза и биологическая активность // Изв. АН, Сер. хим., (2013), № 3, 577-604 (Обзор).
7. Д. В. Титов, M. JI. Генинг, Ю. Е. Цветков, Н. Э. Нифантьев / Конъюгаты циклоолигосахаридных матриц с углеводными лигандами: методы синтеза и взаимодействие с лектинами // Биоорган, химия, 39 (2013), № 5, 509-540 (Обзор).
8. Д. В. Титов, М. Л. Генинг, А. А. Грачев, А. Г. Гербст, Ю. Е. Цветков, Н. Э.Нифантьев / Первый синтез циклических олиго-Р-(1—►6)-глюкозаминов // IX Молодежная научная школа-конференция по органической химии, Москва, 2006, тезисы докладов, С-307.
9. A. G. Gerbst, A. A. Grachev, M. L. Gening, D. V. Titov, Y. E. Tsvetkov, A. S. Shashkov, N. E. Nifantiev / Molecular dynamics investigation of cyclic and linear P-(l—>6)-linked oligomers of Л'-acctylglucosamine // XIV Европейский симпозиум по углеводам, Любек, Германия, 2007, тезисы докладов, с. 406.
22
10. M. JI. Генинг, Д. В. Титов, А. Г. Гербст, А. А. Грачев, Ю. Е. Цветков, Дж. Б. Пир, Н. Э. Нифантьев / Циклоолиго-Р-(1 —>6)-глюкозамины — новый класс функционализированных циклических олигосахаридов // XVIII Менделеевский съезд по обшей и прикладной химии, Москва, 2007, тезисы докладов, том XVIII, с. 42.
11. Д. В. Титов, М. Л. Генинг / Синтез и конформационные исследования циклоолиго-Р-(1—>6)-глюкозаминов, нового класса циклических олигосахаридов // XVIII Менделеевская конференция молодых ученых, Белгород, 2008, тезисы докладов, с. 81.
12. M. L. Gening, D. V. Titov, A. G. Gerbst, A. A. Grachev, Y. Е. Tsvetkov, G. В. Pier, N. E. Nifantiev / First synthesis of cyclo-oligo-P-(l—►6)-D-glucosamines — a new type of functionalized cyclic oligosaccharides // XXIV Всемирный симпозиум по углеводам, Осло, Норвегия, 2008, тезисы докладов, с. 58.
13. A. A. Grachev, A. G. Gerbst, M. L. Gening, D. V. Titov, Y. E. Tsvetkov, A. S. Shashkov, N. E. Nifantiev / Conformational study of linear and cyclic P-(l—»6)-glucosamines related to the fragments of intercellular polysaccharide of bacterium Staphylococcus aureus И Международный конгресс молодых химиков YoungChem 2008, Краков, Польша, 2008, тезисы докладов, с. 110.
14. А. А. Грачев, А. Г. Гербст, М. Л. Генинг, Д. В. Титов, Ю. Е. Цветков, А. С. Шашков, Н. Э. Нифантьев / Конформационное исследование линейных и циклических Р-(1—>6)-олигоглюкозаминов, структурно родственных внеклеточному полисахариду бактерии Staphylococcus aureus II XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009, тезисы докладов.
15. Д. В. Титов, Р. А. Зорин, М. Л. Генинг, Ю. Е. Цветков, Н. Э. Нифантьев / Изучение стереоселективности циклизации (1—»6)-связанных тетрасахаридов // Всероссийская конференция по органической химии, посвященная 75-летию со дня основания Института органической химии, Москва, ИОХ РАН, 2009, тезисы докладов, с. 401.
16. М. Л. Генинг, Д. В. Титов, О. Н. Юдина, А. Г. Гербст, А. А. Грачев, Ю. Е. Цветков, Дж. Б. Пир, Н. Э. Нифантьев / Синтез олиго-Р-(1—>6)-о-глюкозаминов // Международный симпозиум ASOC 2010, Мисхор, Крым, 2010, тезисы докладов.
17. N. E. Nifantiev, M. L. Gening, Y. E. Tsvetkov, O. N. Yudina, E. A. Khatuntseva, D. V. Titov, G. B. Pier / Syntheses towards the development of conjugated carbohydrate vaccines // Proceedings organic synthesis and human well being: emerging opportunities and challenges (OSHWB 2010), Хайдарабад, Индия, 2010, тезисы докладов.
18. M. L. Gening, Y. E. Tsvetkov, D. V. Titov, A. G. Gerbst, O. N. Yudina, A. A. Grachev, A. S. Shashkov, S. Vidal, A. Imberty, T. Saha, D. Kand, P. Talukdar, G. B. Pier, N. E. Nifantiev / Linear and cyclic oligo-P-(l—>6)-D-glucosamines: synthesis, conformations and application for design of a vaccine and oligodentate glycoconjugates // XXVI Всемирный симпозиум по углеводам, Мадрид, Испания, 2012, тезисы докладов, с. 58.
19. M. L. Gening, Y. E. Tsvetkov, D. V. Titov, A. G. Gerbst, O. N. Yudina, A. A. Grachev, A. S. Shashkov, S. Vidal, A. Imberty, N. E. Nifantiev / Cyclic oligo-p-(l-»6)-D-glucosamines as scaffolds for oligodentate glycoconjugates: rational design of oligodentate blockers of the adhesin LecA (PA-IL) of Pseudomonas aeruginosa // International symposium in Chemical biology «Chemistry & Biology Interface», Пуна, Индия, 2013, тезисы докладов.
Заказ № 52-А/05/2013 Подписано в печать 21.05.2013 Тираж 200 экз. Усл. п.л. 1.2
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г. ги
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук
На правах рукописи
04201357669
Титов Денис Валерьевич
Синтез циклических р-(1^6)-связаииых олигосахаридов и олигодентатных конъюгатов на их основе
02.00.03 - органическая химия
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научные руководители:
член-корреспондент РАН, профессор, заведующий Лабораторией № 52 ФГБУН ИОХ РАН Нифантьев Николай Эдуардович
кандидат химических наук, научный сотрудник Лаборатории № 52 ФГБУН ИОХ РАН Генинг Марина Леонидовна
Москва, 2013
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................4
2. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................7
3. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР............................................................................................................9
3.1. Гликоконыогаты на основе калпксаренов и резорцпнаренов.......................................10
3.1.1. Гликокаликсарены, полученные с помощью реакции гликозилирования....................11
3.1.2. Гликокаликсарены, полученные с помощью реакции N- или О-ацилирования...........14
3.1.3. Гликокаликсарены, полученные с использованием ацилирования аминов изотиоцианатами...........................................................................................................................20
3.1.4. Гликокаликсарены, полученные с помощью реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения....................................................................................................................26
3.1.5. Гликокаликсарены, полученные с помощью реакции нуклеофильного замещения ... 37
3.1.6. Другие методы получения гликокаликсаренов................................................................40
3.2. Гликоконыогаты на основе циклодекстрннов..................................................................44
3.2.1. Гликоконыогаты на основе циклодекстрннов, полученные с помощью реакции нуклеофильного замещения.........................................................................................................45
3.2.2. Гликоконъюгаты на основе циклодекстрннов, полученные по реакции ацилирования аминов и спиртов изотиоцианатами...........................................................................................57
3.2.3. Гликоконъюгаты на основе циклодекстрннов, полученные с помощью реакции N- или О-ацилирования............................................................................................................................63
3.2.4. Гликоконыогаты на основе циклодекстрннов, полученные с помощью реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения.............................................................................................73
3.2.5. Другие методы получения гликоконыогатов на основе циклодекстрннов..................79
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................................................85
4.1. Синтез линейных бифункциональных предшественников циклов..............................86
4.2. Циклизация олигоглюкозаминовых бифункциональных блоков................................88
4.3. Стереохимия реакции циклизации......................................................................................91
4.3.1. Конформационная гипотеза...............................................................................................91
4.3.2. Изучение влияния растворителя, промотора и уходящей группы на стереохимический результат циклизации (на примере внутримолекулярного гликозилирования тетрасахаридов).............................................................................................................................93
4.3.3. Изучение влияния соучаствующей группы при С-2 восстанавливающего остатка на стереохимию циклизации тетрасахаридов.................................................................................97
4.3.4. Реакции конкурентного гликозилирования моносахаридов.........................................102
4.3.5. Расчет стабилизации гликозил-катионов.......................................................................105
4.4. Получение незамещенных циклоолигосахарпдов..........................................................108
4.5. Синтез олигодеитатных глнкокластеров и изучение их взаимодействия с бактериальным лектииом LecA................................................................................................109
4.5.1. Синтез олигодеитатных глнкокластеров........................................................................109
4.5.2. Изучение взаимодействия глнкокластеров с лектииом LecA......................................117
4.5.3. Молекулярное моделирование взаимодействия глнкокластеров с LecA....................122
4.6. Синтез порообразующих соединений................................................................................124
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................................................127
6. ВЫВОДЫ.......................................................................................................................................187
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................188
1. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Сокращенные названия соединений и методов
АСМ — атомно-силовая микроскопия
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ГМФТА — гексаметилфосфортриамид
ДМСО — диметилсульфоксид
ДМФА — Л^/У-диметилформамид
КССВ — константа спин-спинового взаимодействия
ИФА — иммуноферментный анализ
ПМР — протонный магнитный резонанс
ТГФ — тетрагидрофуран
ТСХ — тонкослойная хроматография
ЯМР — ядерный магнитный резонанс
Ас — ацетил
ASF — асиалофетуин
Вп — бензил
Вое — /яре/я-бутилоксикарбонил
nBu — н-бутил
lBu — трет-бутил
Bz — бензоил
CD — циклодекстрин
CuAAC — Си(1)-катализируемое циклоприсоединение азидов к алкинам
DABCO — 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан
DCC — дициклогексилкарбодиимид
DEAD — диэтилазидокарбоксилат
DIC — уУ,уУ'-диизопропилкарбодиимид
DMAP — Л^Д-диметиламинопиридин
DMPU — 1,3-Диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Я)-пиримидинон
DMTMM — хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния
DTE— 1,4-димеркаптобутан-2,3-диол
EDAC — гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида
ELISA — иммуноферментный анализ
ELLA — иммуноферментный лектиновый анализ
Et — этил
HBTU-BF4 — тетрафторборат Обензотриазол-1-ил ^ДД'Д'-тетраметилмочевины
HIA — метод ингибирования гемагглютинации эритроцитов
HOBt — 1-гидроксибензотриазол
IC50 — концентрация 50%-ного ингибирования
ITC — изотермическое калориметрическое титрование
Ко — константа диссоциации
LPS — липополисахарид
MALDI — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация MS — молекулярные сита
MSNT — 1 -мезителенсульфонил-3 -нитро-1,2,4-триазол Me — метил
NIS —jV-иодсукцинимид Pent — пентен-4-ил Pfp — пентафторфенил Ph — фенил Phth — фталоил Рг — пропил 'Рг — изопропил Ру — пиридин
Ру-ВОР — гексафторфосфат бензотриазолил-1-окси-трипирролидинофосфония
Rf— фактор удерживания
SPR — поверхностный плазмонный резонанс
TES — триэтилсилил
Tf— трифторметилсульфонил
TNF-a — фактор некроза опухоли a
Тг — трифенилметил (тритил)
Troc — 2,2,2-трихлорэтилоксикарбонил
UDP-Gal — уридиндифосфатгалактоза
|aW — микроволновое излучение
Z — бензилоксикарбонил
Сокращенные названия лектинов и их углеводная специфичность
СопА — лектин конканавалин А из Canavalia ensiformis (канавалия мечевидная, конский боб), специфичен к D-маннозе и D-глюкозе
ЕСА — лектин из Erythrina cristagalli (эритрина петушиный гребень), специфичен к лактозе, N-ацетиллактозамину
ECorL — лектин из Erythrina corallodendron (эритрина коралловое дерево), специфичен к D-галактозе
GSI — лектин из Griffonia simplicifolia I (гриффония простолистная), специфичен к D-галактозе
KbCWL — лектин из дрожжей Kluyveromyces bulgaricus, специфичен к D-галактозе
LcH — лектин из Lens culinaris (чечевица обыкновенная), специфичен к D-маннозе, D-глюкозе и
L-фукозе
LecA (PA-IL) — лектин из Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), специфичен к D-галактозе
LecB (PA-IIL) — лектин из Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), специфичен к L-фукозе
PNA — лектин из Arachis hypogea (арахис), специфичен к D-галактозе
PSA — лектин из Pisum sativum (горох), специфичен к D-маннозе и D-глюкозе
RCA 120 — лектин из Ricinus communis (клещевина обыкновенная), специфичен к D-галактозе и
лактозе
VAA — лектин из Viscum album (белая омела), специфичен к D-галактозе
VVA — лектин из Vicia villosa, специфичен к iV-ацетил-О-галактозамину
WGA — лектин из проростков семян Triticum vulgaris (пшеница), специфичен к Д^-ацетил-п-
глюкозамину и сиаловой кислоте
2. ВВЕДЕНИЕ
Циклические (3-( 1 —>6)-связанные олигоглюкозамины являются новым классом циклических олигосахаридов и впервые получены в данной работе. Потенциал использования этих соединений в различных областях химии и биологии достаточно высок. Так, на их основе могут быть синтезированы разнообразные конъюгаты различной симметрии и дентатности. Использование циклических олигосахаридов, таких как циклодекстрины, для получения олигоделтатных углеводных конъюгатов хорошо известно, однако циклоолигоглюкозамины имеют ряд преимуществ по сравнению с циклодекстринами: (1) наличие аминогрупп позволяет легко и региоизбирательно вводить необходимые лиганды; (2) дентатность и симметрия конъюгатов может легко варьироваться при использовании циклических олигосахаридов, содержащих различное число моносахаридных звеньев, а также за счет введения неглюкозаминовых остатков; (3) гибкость каркаса, образованного (1—>6)-гликозидными связями, предоставляет таким конъюгатам дополнительную возможность принимать конформацию, необходимую для взаимодействия с соответствующими рецепторами; (4) гидрофильная природа циклоглюкозаминов исключает нежелательные гидрофобные взаимодействия, которые наблюдаются в случае циклодекстринов и некоторых других носителей.
Одним из направлений практического использования циклических олигоглюкозаминов, исследуемых в данной работе, является создание гликокластеров для эффективного блокирования лектина LecA, являющегося одним из факторов вирулентности бактерии Pseudomonas aeruginosa. Эта бактерия способна вызывать большое число тяжелых заболеваний лечение которых затруднено ввиду высокой устойчивости некоторых штаммов Р. aeruginosa к антибиотикам.
Другим направлением, также развиваемым в данном диссертационном исследовании, является создание на основе ß-(l—>6)-связанных циклоолигосахаридов агентов, способных образовывать искусственные каналы (поры) в клеточных мембранах. Для их получения проводили присоединение к аминогруппам циклов различных гидрофобных цепей, обладающих сродством к липидам клеточных мембран. Размер пор в данном случае зависит от величины внутренней полости циклоолигосахаридов. Это открывает возможность конструирования ионных каналов с регулируемой ионной селективностью, а также новых антибактериальных средств.
Целью работы является разработка эффективных методов синтеза циклических ß-(l—>6)-связанных олигосахаридов, состоящих из различного числа остатков D-глюкозамина, и ряда
циклов, сочетающих в себе о-глюкозамин и о-глюкозу, а также получение конъюгатов на основе данных циклоолигосахаридов для решения различных биологических задач.
Работа выполнена в Лаборатории химии гликоконъюгатов (№ 52) ФГБУН ИОХ РАН. Диссертация состоит из 7 частей: списка используемых сокращений, введения, литературного обзора, посвященного синтезу олигодентатных конъюгатов на основе низкомолекулярных матриц (каликсаренов и циклодекстринов), обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, и списка цитированной литературы.
Нумерация соединений дается арабскими цифрами полужирным шрифтом, причем соединения, схемы, рисунки и таблицы в литературном обзоре и в обсуждении результатов нумеруются независимо.
3. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Mono- и олигодентатные копъюгаты ннзкомолекулирных матриц с углеводными лигаидами: методы сиитеза и взаимодействие с лектииами
Множество важных физиологических и патологических процессов, таких как межклеточная коммуникация, иммунный ответ, вирусное или бактериальное инфицирование, воспалительные процессы, рост и метастазирование раковых опухолей, происходит благодаря распознаванию углеводных молекул соответствующими клеточными рецепторами — лектинами.1'2'3'4 Термин лектин5 был первоначально предложен для белков растительного происхождения, способных вызывать агглютинацию эритроцитов. Однако позже область применения данного термина расширили и лектинами стали называть все белки, специфично связывающиеся с углеводами, и не обладающие какой-либо ферментной активностью. Лектины характеризуются наличием особых участков (сайтов) специфичного связывания углеводов. Монодентатное взаимодействие лектина с углеводом, как правило, слабое (константы диссоциации находятся в миллимолярном диапазоне),3'6 тогда как одновременные мультидентатные1 взаимодействия обеспечивают намного более сильное связывание рецептора и лигандов.7'8 Такое явление получило название гдикозидпый кластерный эффект.9 Мультидентатные неогликоконъюгаты также называют гликокластералш.
Супрамолекулярная химия (химия нековалентных взаимодействий) в последние годы всё чаще оперирует понятиями концепции мультидентатности для характеристики процессов распознавания важных биологических молекул.10'11'12 Модельные супрамолекулярные системы являются более простыми, чем природные системы, что может помочь в понимании и количественном описании мультидентатных эффектов.13 Несмотря на то, что мультидентатные конъюгаты могут значительно отличаться друг от друга своей топологией, в общем случае они состоят из центрального кора (матрицы, носителя), связанного посредством линкеров (спейсеров) или без таковых с периферийными частями — лигандами. В качестве носителей могут быть использованы любые молекулы, начиная с низкодентатных, таких как производные бензола14'15, моносахариды16'17, комплексы переходных металлов18'19, а также каликсарены20,
21 22 23 "Ч 25 i 26 ~>Т>% i 29 30 31
азамакроциклы ' ' , циклопептиды , циклодекстрины , порфирины ' , фуллерены ' ' ,
' Мы отдаем предпочтение этому термину, так как ишрокоиспользуемый термин мулыпивалешпность более употребим для обозначения конъюгатов с различными лигандами в составе одной молекулы (например, олиговалентные вакцины).
до высокодентатиых соединений, например, дендримеров32, полимеров (пептидов)33, липосом34 и наночастиц35.
В данной диссертационной работе рассмотрен синтез гликоконъюгатов на основе циклоолиго-р-(1—>6)-о-глюкозаминов, выполненный в рамках поиска новых эффективных блокаторов адгезина Р. aeruginosa LecA (PA-IL). Именно эта часть работы определила выбор темы настоящего литературного обзора. Он посвящен рассмотрению основных методов сборки конъюгатов на основе двух типов низкомолекулярных матриц: каликсарепов (резорцинаренов) и циклодекстринов. Как правило, такая сборка представляет собой конъюгацию (спейсерированных) углеводных структур с определенным образом функционализированными матрицами, однако иногда гликоконъюгаты получают и из более простых соединений, используя различные реакции конденсации.
Основной целью синтеза конъюгатов с углеводными лигандами является достижение специфичного взаимодействия с различными углеводными рецепторами, что необходимо, например, для эффективного блокирования таких рецепторов или адресной доставки каких-либо молекул. В случае мультидентатных конъюгатов эффективность связывания может существенно возрастать благодаря кластерному эффекту. Также в большинстве случаев включение углеводных фрагментов в состав конъюгатов способствует значительному увеличению растворимости таких соединений в водных средах, что является необходимым условием для проведения большинства биологических экспериментов. Публикациям, в которых приводятся данные по взаимодействию синтезированных гликоконъюгатов с биологическими объектами, в данном обзоре уделено особое внимание.
3.1. Гликоконъюгаты на основе каликсарепов и резорцинаренов
Каликсарены — это циклические олигомеры, которые получают конденсацией фенолов или резорцинов с альдегидами. Каликсарены являются удобными матрицами для создания мультидентатных гликокластеров с заданными свойствами. Благодаря тому, что можно варьировать размер, дентатность и конформацию каликсаренов, существует возможность точной регулировки пространственного расположения углеводных лигандов в гликокаликсаренах. Кроме того, внедрение в структуру каликсаренов таких гидрофильных фрагментов, как остатки углеводов, может значительно увеличить растворимость получаемых гликоконъюгатов в воде. Это особенно актуально в свете использования конъюгатов для молекулярного распознавания высокополярных органических молекул, в том числе лектинов, в
водных растворах. За последние 15-20 лет было получено достаточно большое количество
11
конъюгатов па основе каликсареновых молекул. ' " Первые работы по синтезу этих соединений носили скорее фундаментальный характер и были направлены в основном на разработку эффективных методов их получения. В более поздних работах авторы рассматривают синтез конъюгатов для определенных биологических целей и приводят результаты соответствующих биологических исследований.
3.1.1. Гдикокаликсарепы, полученные с помощью реакции гликозшшрования
Использование реакции гликозшшрования для присоединения углеводов к каликсареновой матрице не получило широкого распространения. Это обусловлено, вероятно, тем, что техническое осуществление данной реакции достаточно трудоемкое, а выходы зачастую низкие. Более того, низкие выходы моногликозилирования дела
