Конъюгаты моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с соединениями, содержащими функциональные группы природных аминокислот: синтез и исследование свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

СЕРПОКРЫЛОВА ИННА ЮРЬЕВНА

КОНЪЮГАТЫ MOHO- И ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ С СОЕДИНЕНИЯМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ ПРИРОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ: СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

4843585

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Научный руководитель: д.х.н. Сальников Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Орецкая Татьяна Семеновна

к.х.н. Рябинин Владимир Алексеевич

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет

Защита состоится 2010 г. в $ "часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Учреждении Российской академии наук Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Учреждения Российской академии наук Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « /,5 » ИОЯлЙоР 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к конструированию реагентов, направленных на воздействие на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов. За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в олигонуклеотидном синтезе, что делает получение синтетических нуклеиновых кислот с широким спектром модификаций рутинной процедурой. Однако синтез конъюгатов олигонуклеотидов с молекулами, содержащими различные реакционноспособные группы, по-прежнему представляет сложную научную задачу, зачастую требующую в каждом конкретном случае поиска индивидуального решения. В настоящее время для получения таких конъюгатов преимущественно используют две принципиально разные стратегии, основанные на модификациях олигонуклеотидов во время (пресинтетическая модификация) и после (постсинтетическая модификация) олигонуклеотидного синтеза. Наибольшее распространение получила первая стратегия, подразумевающая предварительный синтез соответствующих амидофосфитов. Однако в случае молекул, содержащих различные функциональные группы, синтез таких амидофосфитов превращается в специальную задачу, решение которой требует значительных усилий. Постсинтетическая модификация является более привлекательной, поскольку не требует получения соответствующих амидофосфитов и позволяет получать серии конъюгатов на основе одного базового олигонуклеотида-предшественника.

Наиболее удачным примером постсинтетической модификации является метод, основанный на активации 5'- или 3'- концевых фосфатов с последующим либо прямым введением молекул, содержащих алифатические аминогруппы, либо с промежуточным введением линкерных групп на основе алифатических диаминов (В. Зарытова с сотр., 1989 г). Данный подход получил широкое распространение, однако в случае получения конъюгатов олигонуклеотидов с короткими пептидами или пептидоподобными молекулами, содержащими остатки гистидина, этот метод оказался неприемлемым, в основном из-за низких выходов и невоспроизводимости результатов синтеза.

Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время разработан целый ряд подходов, позволяющих получать конъюгаты олигонуклеотидов с различными лигандами, синтез олигонуклеотидных производных с молекулами, содержащими несколько функциональных групп (в первую очередь, остатки имидазола), по-прежнему остается актуальной задачей.

Целью данной работы являлась разработка стратегии и методов синтеза конъюгатов моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с соединениями,

содержащими алифатические аминогруппы и функциональные группы боковых радикалов природных аминокислот.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Изучение возможностей метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с молекулами, имеющими в своем составе алифатические аминогруппы и остатки имидазола, путем активации концевого фосфата парой РЬ3Р/(Ру8)2 в присутствии нуклеофильных катализаторов:

• изучение взаимодействия активированных фосфатных групп в монодезоксирибонуклеотидах с гистамином, карцинином и его аналогами;

• исследование стабильности фосфамидной связи в зависимости от структуры полученных соединений.

2. Разработка протоколов твердофазного синтеза олигонуклеотидных производных с использованием амидофосфитов, содержащих прекурсорные группы на основе слабоактивированных эфиров (монометиловые и моноцианметиловые эфиры моноамидов дикарбоновых кислот):

• оптимизация метода получения олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников в зависимости от числа и места расположения прекурсорных групп, температуры, времени конденсации, катализатора;

• синтез конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с низкомолекулярными лигандами, содержащими первичные алифатические аминогруппы.

3. Разработка новых методов получения олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с использованием оригинальных прекурсорных групп на основе полициклических ароматических соединений:

• конструирование и синтез новых прекурсорных групп на основе феназина и антрацена. Получение олигодезоксирибонуклеотидных производных, несущих в своей структуре прекурсорные группы на их основе;

• синтез конъюгатов пептидов с олигодезоксирибонуклеотидными производными путем взаимодействия прекурсорной группы на основе феназина с алифатической аминогруппой пептида;

• синтез пептид-олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов путем взаимодействия прекурсорной группы на основе антрацена с остатком малеимида, предварительно присоединенного к пептиду.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной работы, на примере полученных конъюгатов монодезоксирибонуклеотидов с природным дипептидом карцинином и его аналогами, было продемонстрировано, что фосфамидная связь в конъюгатах нуклеотидов с молекулами, содержащими остатки гистамина, неустойчива при нейтральных значениях рН. Впервые было показало, что устойчивость связей в группе -0-Р(0)2-№[-, объединяющей мононуклеотидную и пептидную части

конъюгата, зависит от природы гетероциклического основания нуклеотида и падает в ряду dTMP>dCMP>dAMP.

Разработаны методы автоматического синтеза олигодезоксирибонуклео-тидов, содержащих различное число прекурсорных групп на основе слабо активированных эфиров. С их использованием получены серии олигонуклеотидных производных, имеющих различное количество групп-предшественников на 5'-конце, а также олигонуклеотиды, содержащие прекурсорные группы внутри олигонуклеотидной цепи. На основе синтезированных производных олигонуклеотидов были предложены и опробованы методы твердофазного синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с различным числом остатков гистамина.

Впервые предложены прекурсорные группы на основе бисчетвертичных солей феназиния, позволяющие получать олигодезоксирибонуклеотидные конъюгаты с лигандами, содержащими алифатические аминогруппы в присутствие других функциональных групп (-ОН, -имидазольная и др.). Метод не требует какой-либо активации обеих компонентов и позволяет следить за образованием конъюгатов по изменению электронного спектра поглощения в видимом диапазоне.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты были представлены на международных конференциях "RNA as Therapeutic and Genomic Target", (Новосибирск, Россия, 2001), "Chemical probes in biology" (Греция, 2002), XV International Round Table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Бельгия, 2002), 7th Young Scientist Forum: "Molecular Networks" и 32nd FEBS Congress "Molecular Machines" (Австрия, 2007), IV Конгресс Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 18th International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids and 35th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (Япония, 2008), 34th FEBS Congress: "Life's Molecular Interactions" (Чешская Республика, 2009) и др. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 130 страницах, содержит 65 рисунков и 6 таблиц. Библиография включает 283 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез модифицированных мононуклеотидов

Как упоминалось выше, активация концевого фосфата широко используется для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов. Предложенный в ИХБФМ СО РАН метод активации окислительно-восстановительной парой трифенилфосфин - 2,2'- дипиридилдисульфид в присутствии нуклеофильных катализаторов позволяет осуществить синтез модифицированных конъюгатов без дополнительной защиты таких функциональных групп как гидроксильная

или функциональные группы гетероциклических оснований. При синтезе конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с производными иминодиуксусной кислоты, содержащими два остатка имидазола (В. Власов и др.., 1997), было обнаружено, что выходы целевых продуктов не отличались воспроизводимостью и зависели от ряда факторов: расположения фосфатной группы (5' или 3'- конец), типа нуклеотида, длины линкерной группы. Для объяснения наблюдаемых фактов нами были проведены эксперименты по получению и изучению свойств конъюгатов монодезоксирибонуклеотидов с гистамином, природным дипептидом — карцинином и его аналогами, содержащими различное число метиленовых звеньев в 1М-концевой аминокислоте.

Синтез конъюгатов дезокситимидина сГГМР (1а), дезоксицитидина (1СМР (1Ь), дезоксиаденозина (1АМР (1с) с природным дипептидом - карцинином ф-А1а-НА) проводили согласно схеме, представленной на рисунке 1.

А „ ~

о-р-о-| „в 9 9 9

(1а-с) (2 а-с) ¿7 он (5 а-с) он

ЗА1а-НА

Н

9

\ / II III

И ° "^Т0!^

(За-с) он (4 а-с) \1

он

Н01Ч ..... *

+ п к^к +°Т°>1 ,6, £Г 0 н

он

в=

Рве. 1. Общая схема протекания реакции карцинина с активированными моподезоксирибо-нуклеотидами («1ТМР, йСМР, 4АМР); продукты гидролиза соединений (За-с) и (4а-с).

Триэтиламмонийные соли 5'-фосфорилированных мононуклеотидов растворяли в минимальном объеме ДМСО, добавляли 5 кратный мольный

избыток пары РЬ3Р, (Ру8)2 и Ме1ш в ДМФА. К реакционным смесям, содержащим активные производные (2а-с), добавляли соответствующий пептидный компонент. Реакционные смеси анализировали с использованием обращенно-фазовой и ионообменной хроматографии, метода спектроскопии ЯМР 31Р. После удаления избытка трифенилфосфина и продуктов его превращения в ЯМР 31Р спектрах реакционных смесей фиксировались сигналы, отнесенные нами к целевым фосфамидам (За-с), фосфоимидазолидам (4а-с) и симметричным пирофосфатам (5а-с). Кроме выше перечисленных, в реакционных смесях наблюдался дополнительный продукт (6), количество которого было минимально для реакционной смеси, содержащей тимидин, и максимально для 2'-дезоксиаденозина (рис. 2).

Фосфамиды За-с Имидазолиды 4а-с Пирофосфаты 5а-с Фосфамид 6

Рис. 2. Состав реакционных смесей (%) по данным спектроскопии ЯМР 31Р при взаимодействии дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов ((1'ГМР, (!СМР, dAMP) с карцинином.

Влияние длины линкера, связывающего имидазольный остаток и концевую алифатическую аминогруппу, было исследовано на примере взаимодействия гистамина (НА), карцинина (Р-А1а-НА), у-аминобутирил-гистамина (у-АЬи-НА) и £-аминокапроил-гистамина (е-Аса-НА) с активированным 5'-монофосфатом дезокситимидина.

После отделения избытка активирующих реагентов и продуктов их превращения состав реакционных смесей анализировали с помощью спектроскопии ЯМР 31Р и ионообменной хроматографии. Соотношение продуктов реакции представлено в таблице 1. Фосфамидные производные были выделены из реакционных смесей в индивидуальном виде с помощью ВЭЖХ и охарактеризованы ЯМР 31Р и масс-спектроскопией. Как видно из представленных данных, с увеличением длины линкерной группы, соединяющей имидазольное кольцо и концевую аминогруппу, выходы фосфамидных производных падали и, в случае ¿-Аса-НА, основным продуктом становился симметричный пирофосфат. Наиболее высокие выходы целевого соединения в данной серии достигались в случае гистамина.

Таблица 1. Состав реакционных смесей (%) по данным ЯМР 3|Р при взаимодействии активированного 5'- дезокситимиднн фосфата (йрТ) с гистамином и его производными.

Продукт реакции НА Р-А1а-НА y-Abu-HA s-Aca-HA

Фосфамид 72 56 41 17

Имидазолид 9 15 33 23

Пирофосфат 19 27 25 59

Однако введение в состав молекулы дополнительной амидной связи приводило к снижению выхода целевого фосфамида с одновременным увеличением лабильности фосфамидной связи. Как видно из представленных данных (табл. 1), с увеличением длины линкерной группы, связывающей имидазольное кольцо и концевую алифатическую аминогруппу, выход фосфамидных производных уменьшался с 72% до 17%.

Гидролитическую стабильность полученных соединений исследовали при комнатной температуре (20 °С) в интервале времени от 1 до 30 часов в буферных системах: янтарная кислота -NaOH (рН 4.6 - 5.8); MES - NaOH (рН 5.8 - 7.0); HEPPS - NaOH (рН 7.0 - 8.2). Реакционные смеси анализировали с помощью аналитической хроматографии и спектроскопии ЯМР 31Р. Соединение (За) оказалось устойчивым в интервале рН 4.6-8.2 в течение 30 ч, тогда как соединение (ЗЬ) устойчиво в интервале рН 6.8-8.2, однако при дальнейшем снижении рН происходит его расщепление до дезоксицитидина и dCMP. При инкубировании соединения (Зс) в водном растворе при нейтральных значениях рН через 24 ч наряду с сигналом 8.67 м.д., отнесенного нами к фосфамиду (Зс), вновь наблюдали появление сигнала в области 7.89 м.д. (17%). С наибольшей вероятностью, данный сигнал может быть отнесен к фосфорилированному по аминогруппе карцинину (6), образующемуся в результате внутримолекулярного расщепления фосфоэфирной связи в соединении (Зс). В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что в масс-спектре образца появляются пики соответствующие дезоксиаденозину и фосфорилированному карцинину.

Факт гидролитической нестабильности фосфамидной связи при нейтральных значениях рН может быть объяснен внутримолекулярными взаимодействиями между компонентами дипептида и фосфатной группой. Наличие амидной группы в составе дипептида может увеличивать электрофильность атома фосфора за счет образования водородной связи с кислородом фосфатной группы, а имидазол выступать в качестве нуклеофильного катализатора.

Исследование гидролитической стабильности полученных конъюгатов показало, что устойчивость связей в группе -0-P(0)2-NH-, объединяющей мононуклеотидную и пептидную части конъюгата, зависит также от природы

гетероциклического основания нуклеотида и падает в ряду атМР>с!СМР><1АМР.

Таким образом, было показано, что хотя в отдельных случаях данный подход может быть использован для синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с лигандами, содержащими остатки имидазола, в целом, данный метод нельзя считать приемлемым из-за непредсказуемости результатов, как во время синтеза, так и стабильности синтезированных соединений.

2. Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с использованием слабо активированных групп-предшественников

В литературе было предложено использовать в качестве прекурсорных групп амиды метиловых эфиров щавелевой кислоты (Я. Полугиин, 1996). Такие эфиры оказались стабильны в условиях твердофазного амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов и, в тоже время, обладали достаточной реакционной способностью для получения олигонуклеотидных конъюгатов. Исходя как из коммерчески доступных, так и оригинальных, синтезированных в рамках данной работы, амидофосфитов, содержащих различное число прекурсорных групп, нами было синтезировано несколько серий олигонуклеотидных конъюгатов, предназначенных для последующего введения остатков гистамина.

Технические возможности современных ДНК-синтезаторов позволяют одновременно синтезировать несколько различных последовательностей, в том числе и содержащих различные модифицированные звенья. Основными стадиями цикла присоединения одного мономера являются деблокирование, конденсация, кэпирование и окисление. Причем этапы деблокирования, кэпирования и окисления проводятся одновременно для всех синтезируемых последовательностей, а стадия конденсации осуществляется отдельного для каждого нуклеотидного производного. Несмотря на то, что значительная часть амидофосфитов, несущих прекурсорные группы, была синтезирована на основе природных нуклеозидов, в целом их структура значительно отличается от стандартных мономеров. Учитывая также тот факт, что прекурсорные группы хотя и устойчивы на всех этапах твердофазного синтеза, тем не менее, являются реакционноспособными, нами были осуществлены подбор и оптимизация условий конденсации амидофосфитов, содержащих функциональные группы в зависимости от их числа и места введения.

Используя мономеры структуры (7) и/или (8) (рис. 3) во время олигонуклеотидного синтеза, были получены олигодезоксирибонуклеотиды-предшественники, имеющие на 5-конце 2 или 4 прекурсорные групп. Были синтезированы олигодезоксирибонуклеотидные производные, используя аналогичные амидофосфиты на основе 4-аминогексанола (17). Условия присоединения модифицированных амидофосфитов были следующие: концентрация амидофосфитов - 0.11 М, время конденсации - 15 мин, катализатор - Ш-тетразол, температура реакции - 30 °С. После введения

модифицированных мономеров на последней стадии твердофазного синтеза, олигодезоксирибонуклеотиды-предшественники обрабатывали 1 М раствором гистамина. Данный подход позволил получить олигодезоксирибонук-леотидные конъюгаты, содержащие 2 или 4 имидазольных остатка на 5'-конце.

Рис. 3. Структуры амидофосфитов для введения в 5'-коиец олигодезоксирибонуклеотндов 2 или 4 прекурсорных групп.

Предположив, что наблюдаемое снижение выходов имидазол содержащих конъюгатов на заключительной стадии синтеза с увеличением числа прекурсорных групп обусловлено трудностями при взаимодействии гистамина с жесткими, стерически затрудненными структурами на основе монометиловых эфиров моноамидов щавелевой кислоты нами был получен амидофосфит, содержащий прекурсорные группы на основе более подвижных цианметиловых эфиров янтарной кислоты (9) (рис. 4). Для введения амидофосфита (9) в олигодезоксирибонуклеотид использовали след. условия: концентрация амидофосфита - 0.11 М, время конденсации - 25-30 мин, катализатор — 5-этилтио-1Н-тетразол, температура реакции - 30 °С. Однако заметного возрастания выходов целевых конъюгатов в сравнении с применением мономера (8) достигнуто не было.

Рис. 4. Структура амидофосфита для введения на 5'-конец олигодезоксирибопуклеотндов прекурсорных групп на основе цианметиловых эфиров янтарной кислоты.

И X 5'-[7/8]-АААААй АСв АТ САА-3'

'Ы О 5'-[7/8]-АСТСССЗТССТСТСв-3' У 5^-^71B]-A^CGAACACAGGA^CC^-3^ 5'-[7/8]-ССАС6ССТТСТААСАТС-3' 5'-[7/8]-случайная десятизвенная ¡рг. последовательность-3'

МН 5'-[7/8]-ТСССССТССТТС вАА-З'

5-[7/81-АС6СССАССААСАСС-3'

Для введения молекул, содержащих первичную алифатическую аминогруппу внутри олигонуклеотидной последовательности (рис. 5), в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН были получены амидофосфиты, несущие 1 или 2 прекурсорные группы в гетероциклическом основании или по 2'-положению рибозы (Абрамова Т. и др., 2004; Васшьева С. и др., 2004).

омтю

ну

(А*

МССНгСНгО-р.

РМТгО'

МССНгСНгО

(10)

М(1Р[)2

РМТгО

о о-

ОМТгО

^О N МССНгСНгО-р. Н

^ ЫОРОг (")

N00420 НгО

7~М0Рг)2

Н N

РМТгО

о о-

0" -Ы

ОМТг°->оЛ

(14)

КССНгСНгО'

^ н о < о

"" и

о о-

М(!РгЬ

МССН2СН20 М(|Рг)2

Рис. 5. Амидофосфиты, позволяющие получать олигонуклеотидвые коиъюгаты, содержащие лигапды в гетероциклических основаниях или в 2'-положении остатка сахара внутри олигодезокснрибонуклеотидной последовательности.

С помощью оптимизированных условий синтеза были получены и

охарактеризованы серии олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов

различной длины, содержащих модифицированные основания внутри

олигонуклеотидной последовательности (рис. 6).

5'-АСАС САСТТС- [М]-СТТТСЗ-3'

5'-САСТ-1М]-ТССТТТСС-3' 5'АССАСТСТС-[М]-ТССТТГС<3-3'

5,-ССАСТ-[М]-ТССТТТСС-3' б'-АССАСТСТССИМЬТССПТСС-З'

5'-АССАСТ-{М]-ТССТТТСС-3' б'-АССАСТСТССНМЬТТССТТТСС-З'

5'-САССАСТ-[М]-ТССТТТСС-3' б'-Ав САСТСТС С-[ М]-СТТССТТТСС-3'

Рис. 6. Примеры конъюгатов с прекурсорными группами внутри олигонуклеотидпых последовательностей, где 1М] - модифицированный амидофосфит (10,11,12,13,14,15).

Выходы олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников, несущих модифицированные нуклеотиды (10, 12, 13, 14), составили от 75 до 90 %. Наиболее сложными для введения конструкциями оказались амидофосфиты (11) и (15), модифицированные по остатку рибозы. Для введения этих соединений использовали след. условия реакции: концентрация амидофосфита - 0.3 М, активатор - 5-этилтио-1Н-тетразол, время реакции - 30 мин, температура - 35 °С. Однако выходы олигонуклеотидных производных были незначительны и составляли не более 10 %.

Чтобы увеличить конформационную подвижность олигонуклеотидных конъюгатов был синтезирован амидофосфит ненуклеотидной природы (16) (рис. 7). Для получения олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников использовали следующие условия конденсации: концентрация амидофосфита -0.11 М, активатор - 5-этилтио-1Н-тетразол, время реакции - 15 мин, температура - 35 °С (выход 76 %).

З'-в СТТТССТ [16] Т С А С в А С А-5'

Рис. 7. Амидофосфит ненуклеотидной природы, позволяющий получать конъюгаты, содержащие 2 лиганда внутри олигодезоксирибонуклеотидной цепи.

Для функционализации олигонуклеотидов-предшественников, несущих различное число прекурсорных групп, как на 5'-конце, так и внутри олигодезоксирибонуклеотида, использовали схожую методику синтеза. После завершения твердофазного синтеза, защищенные олигонуклеотиды на смоле обрабатывали 1-2 М раствором гистамина в ДМФА в течение нескольких часов (2-6 ч) при 30 °С. Далее имидазолсодержащие олигодезоксирибонуклеотиды снимали с полимера и деблокировали в стандартных условиях. Выделение и очистку продукта осуществляли с помощью ЯР-картриджа, гель-электрофореза или обращено-фазовой ВЭЖХ. Выходы олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов варьировали от 75 до 90% при введении модифицированных амидофосфитов в 5'-, З'-конец и содержащих прекурсорные группы на гетероциклическом основании. При введении амидофосфитов, модифицированных по остатку рибозы, выходы конечных олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников составляли от 3 до 10%.

Общая схема синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с остатками гистамина на 5'-конце с использованием прекурсорной стратегии представлена на рис. 8.

груп пы-предшественни ки

В - реакция защищенного олигануклеотида с гистамином С - деблокирование и отщепление олигонукпеотидного конъюгата от полимерного носителя

Рис. 8. Схема синтеза олигодезоксирибонуклеотидных копыогатов, содержащих остатка гистамина на 5'-копце.

Таким образом, прекурсорная стратегия синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с использованием прекурсорных групп на основе слабоактивированных эфиров оказалась перспективной. Данный подход был использован для получения с высокими выходами конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с рядом лигандов, содержащих алифатические аминогруппы (гистамин, диамины, флуоресцентные и фотоактивируемые группы). Однако необходимость использовать высокие концентрации лиганда на постсинтетической стадии накладывала ограничения на строение вводимых молекул.

3. Синтез олигонуклеотидных конъюгатов на основе полициклических ароматических прекурсорных групп

3.1 Использование феназиниевых производных для получения олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов

Введение в структуру олигонукпеотидного конъюгата полициклических ароматических соединений приводит к появлению у таких конъюгатов новых свойств. Наиболее значимым является повышение стабильности комплементарных комплексов и изменение спектральных свойств. Таким образом, создание на основе полициклических ароматических структур новых прекурсорных групп для дальнейшей функционализации олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов позволит решить сразу несколько задач: расширение возможностей прекурсорной стратегии; достижение разницы в стабильности комплексов с модифицированными и

13

немодифицированными олигонуклеотидами; контроль за протеканием образования конъюгата по изменению спектров поглащения в видимом диапазоне. Большой выбор полициклических ароматических структур и разнообразие их химических и спектральных свойств позволяет создавать на их основе прекурсорные группы, придающие олигодезоксирибонуклеотидам заданные свойства.

Выбор феназина в качестве базовой структуры был обусловлен двумя основными причинами. С одной стороны физико-химические свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих различные производные этого гетероцикла, ранее были детально исследованы в ИХБФМ СО РАН. С другой стороны, для четвертичных солей феназиния характерна реакция с алифатическими аминами, приводящая к нуклеофильному замещению атома

водорода во втором (седьмом) положении в мягких условиях. Квантово-механические расчеты, выполненные с привлечением программы НУРЕЯСНЕМ, методом РМЗ с оптимизацией геометрии по алгоритму ро1ка-ЫЫеге, показали, что введение аминогруппы, которая является донором электронов, по С2 положению четвертичной соли феназиния значительно уменьшало суммарный положительный заряд в симметричном С7 положении молекулы, таким образом, препятствуя введению второго заместителя (рис. 9). Этот факт позволил предположить, что уменьшив донорный эффект заместителя можно активировать свободное С7 положение гетероцикла. Принципиальная возможность реализации такого подхода была продемонстрирована нами экспериментально. Ацилирование первичной или вторичной аминогруппы по С2 положению приводило к восстановлению дефицита электронной плотности в С7 положении, что позволило вводить в это положение вторую аминогруппу, хотя и с меньшей скоростью.

<18> (19,20) (21,22)

Для соединений (19,21): Я, = 1*2 = -(СНгЬ-КНг, = Н ;

(20,22): И, = —Ы^^р, К2 = ^ = -СН3

Рис. 10. Схема получении мопо- и днзамещенных производных феназина.

Чтобы избежать предварительной активации для введения второго

в 10 4

Рис. 9. Распределение электронной плотности в структуре четвертичной соли феназина.

заместителя в С7 положение необходимо, исходно увеличить дефицит электронной плотности в феназиниевом кольце. Для этой цели было синтезировано производное феназина (18) (рис. 10), содержащее в своей структуре два положительных заряда. Синтез, исходя из описанного ранее Ы-(2-бромэтил)феназиний бромида, включал 4 стадии без выделения промежуточных продуктов (выход 60%).

В рамках данной работы были исследованы взаимодействия бис-четвертичной соли (18) с различными аминами: 1,3-диаминопропаном, морфолином и диметиламином. Реакционные смеси анализировали с помощью ВЭЖХ. На рис. 11 показаны кинетические кривые реакции производного феназина (18) с десятикратным избытком 1,3-диаминопропана. Из приведенных данных видно, что содержание монозамещенного продукта (19) в реакционной смеси реакции (~95 %) становилось максимальным через 30 мин. Скорость реакции в С7 положении соединения (19) была намного ниже, а выход дизамещенного продукта (21) в этот момент не превышал 4-5 %.

0 60 120 180 240 300 360

^ Щ|п

Рис. 11. Кинетические кривые реакции 1,3-диамннопропана с фепазипиевым производным (18).

Поскольку четвертичные соли феназиния в исследованных условиях практически не реагировали с другими функциональными группами, входящими в состав биополимеров (экзоциклические группы гетероциклических оснований, гидроксигруппы, имидазольные и гуанидиниевые группы), то соединение (18) может быть использовано для получения широкого спектра пептид-олигонуклеотидных конъюгатов. Необходимым условием является наличие стерически доступных алифатических аминогрупп в структурах обоих компонентов. Возможность применения соединения (18) в качестве прекурсорной группы была продемонстрирована на примере получения конъюгата динуклеотида (рТрТ) и трипептида (Н1з-р-А1а-НА) (рис. 12). На первой стадии остаток 1,4-

диаминобутана присоединяли к концевой фосфатной группе рТрТ, которая была предварительно активирована с помощью пары трифенилфосфин и 2,2'-дипиридил дисульфид в присутствии ^-метилимидазола. Выход этой реакции был практически количественным. Обработка аминопроизводного рТрТ (23) избытком феназиниевой соли (18) приводила к образованию соединения (24) с высоким выходом (> 95%, по данным ВЭЖХ). Электронный спектр соединения (24) содержал максимумы поглощения, соответствующие динуклеотиду на длинах волн 276 нм и феназину на 236, 293, 397 и 524 нм. Олигонуклеотидное производное, содержащее феназиниевую прекурсорную группу, отделяли с помощью осаждения раствором перхлората лития в ацетоне и использовали для получения модельного пептид-олигонуклеотидного конъюгата.

(РуБуРЬзР

Г\

Рис. 12. Схема синтеза нептид-дииуклеотида с использованием феназиниевой нрекурсорной группы.

Взаимодействие соединения (24) с небольшим избытком (20%) трипептида Шз-Р-А1а-НА приводило к образованию конъюгата (25) с выходом 74 %. В электронных спектрах продукта (25) исчезали максимумы поглощения на длинах волн 397 и 524 нм и появлялся новый максимум поглощения, соответствующий дизамещенной феназиниевой соли (540 нм).

Таким образом, в результате проделанной работы был предложен новый тип прекурсорных групп, позволяющих получать пептид-олигонуклеотидные конъюгаты при условии наличия в их структурах алифатических аминогрупп, без защиты других функциональных групп биополимеров. Появление интенсивных полос поглощения в видимой области спектра при введении

прекурсорной группы и образовании конъюгата (длины волн 397 нм, 524 нм и 540 нм для первой и второй стадий, соответственно), позволяет осуществлять контроль над протеканием реакции в реальном времени.

3.2 Прекурсорные группы па основе антрацена

Для ряда задач дополнительная стабилизация комплементарного комплекса, вызываемая введением прекурсорной группы на основе феназина, является нежелательной. Для исключения этого эффекта нами было предложено использовать в качестве прекурсорных групп производные антрацена. Особенность прекурсорной группы на его основе заключается в превращении плоской структуры молекулы в объемную на последней стадии синтеза. Другим принципиальным отличием от прекурсорных групп на основе четвертичных солей феназиния является необходимость введения в пептидный фрагмент активированной двойной связи.

Для введения в олигодезоксирибонуклеотид остатка антрацена на первой стадии была применена активация концевой фосфатной группы парой РЬ3Р/(Ру8)2 в присутствии БМАР. Обработка реакционной смеси 9-аминометилантраценом приводила к образованию соответствующего антрацен-олигодезоксирибонуклеотидного производного (26) с высоким выходом (рис. 13). В качестве модели при получении пептид-олигонуклеотидного конъюгата было использовано соединение (27). Несмотря на наличие в структуре полярных, хорошо растворимых в воде, остатков имидазола при нейтральных значениях рН и комнатной температуре соединение (27) в воде практически не растворялось. Добавление к реакционной смеси органических растворителей (ДМФА, ДМСО) увеличивало его растворимость, однако выход конъюгата (28) не превышал 15-20 %. Оптимальными условиями проведения реакции оказалась инкубация в водной среде олигодезоксирибонуклеотидного производного (26) и пептидного компонента (27) при рН 5.5-6.0 и 50°С. За протеканием реакции следили с помощью УФ-спектроскопии по исчезновению полосы поглощения в области 338 нм, относящейся к антраценовому производному (выходы 90-95 %).

Несмотря на то, что в структуре конъюгата присутствуют два остатка имидазола, фосфамидная связь оказалось устойчивой, вероятно за счет стерического блокирования последней объемным продуктом циклоприсоединения.

Для введения лиганда в любое положение олигонуклеотидного адреса был предложен амидофосфит ненуклеотидной природы, содержащий остаток антрацена (29) (рис. 15). Условия присоединения модифицированного амидофосфита: концентрация 0,1М, активатор - 5-этилтио-1Н-тетразол, время реакции - 5 мин, температура - 30 °С.

Эффективность присоединения составляла 95-97 %. Олигодезоксирибонуклеотидные конъюгаты, содержащие остатки антрацена внутри последовательности, были очищены с помощью гель-электрофореза, их структура была подтверждена методом МА1ЛЭ1-ТОР масс-спектрометрии.

включения прекурсорной группы внутрь олигодезоксирибонуклеотидной цепи.

Таким образом, несмотря на то, что использование прекурсорных групп на основе антрацена требует предварительной модификации второго компонента конъюгата (введение малеимидного фрагмента), отсутствие каких-либо побочных реакций между антраценом и любыми функциональными группами биополимеров и практически количественные выходы целевой реакции делает этот метод чрезвычайно перспективным.

выводы

1. В результате исследования взаимодействия 5'-фосфо-Лг-метилимидазолидов мононуклеозидов с гистамином, ацилированным «о-аминокислотами с различным числом атомов углерода, впервые было установлено, что:

• направление реакции фосфорилирования зависит как от строения аминокомпоненты, так и от природы гетероциклического основания нуклеотида. Выходы алифатических фосфамидов при амидировании мононуклеотидов падают в ряду: гистамин > карцинин > ^-аминобутирил-гистамин > е-аминокапроил-гистамнн. Показано, что амидофосфаты пиримидиновых нуклеотидов образуются с большим выходом (сГГМР > (1СМР) по сравнению с ¿АМР;

• гидролитическая стабильность алифатической фосфамидной связи в конъюгатах определяется как природой гетероциклического основания (сГГМР > (1СМР > с!АМР), так и строением имидазолсодержащего фрагмента (карцинин > ^-аминобутирил-гистамин > г-аминокапроил-гистамин, 20 "С, рН 4.6-8.2).

2. Разработаны протоколы твердофазного синтеза олигонуклеотидных производных, содержащих прекурсорные группы на основе слабоактивированных эфиров (цианметиловые эфиры, монометиловые эфиры моноамидов щавелевой кислоты). На их основе осуществлен синтез конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с низкомолекулярными лигандами, содержащими первичные алифатические аминогруппы. Показано, что выходы целевых продуктов зависят как от числа прекурсорных групп, так и от их месторасположения в олигодезоксирибонуклеотиде и могут достигать 93%.

3. Предложен новый тип прекурсорных групп на основе бис-четвертичных солей феназиния, позволяющих по изменениям поглощения в видимой области спектра контролировать все стадии образования олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов. На примере получения соединения рТрТ-Шв-А 1а-НА впервые продемонстрирована возможность применения таких прекурсорных групп для синтеза пептид-олигонуклеотидных конъюгатов.

4. Осуществлен дизайн амидофосфитов и разработан метод синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остаток антрацена. На основе реакции Дильса-Альдера предложен метод синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с пептидами, содержащими различные функциональные группы.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Гарипова И.Ю., Сильников В.Н. Сайт-специфичные синтетические рибонуклеазы на основе конъюгатов олигонуклеотидов с металлонезависимыми органическими катализаторами гидролиза фосфодиэфирных связей. // Известия академии наук. Серия химическая. 2002. № 7. С. 1025-1030.

2. Гарипова И.Ю., Сильников В.Н. Синтез фосфамидных конъюгатов 5'-мононуклеотидов с карцинином и его аналогами. // Известия академии наук. Серия химическая. 2002. № 10. С. 17871791.

3. Inna Y. Garipova, Vladimir N. Silnikov. New approaches for synthesis of multifunctional phenazinium salt derivatives. // Molecules.2003. N 8. P. 505-519.

4. L. S. Koroleva, I. Yu. Serpokrylova, V. V. Vlassov, V. N. Silnikov Design and Synthesis of Metal-free Artificial Ribonucleases. // Protein & Peptide Letters. 2007. V. 14. N. 2. P. 151-163.

5. I. Serpokrylova, L. Koroleva, N. Svischeva, D. Novopashina, V. Silnikov. Design and synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates as potential artificial ribonucleases. // Nucleic Acids Symposium Series. 2008. N. 52. P. 529-530.

Подписано к печати 23.11.2010 г. Формат 60x84,1/16. Тираж 120 экз. Заказ №604. Отпечатано «Прайс-курьер», 630128, Новосибирск, ул. Кутателадзе 4/г, тел. 330-72-02.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Гпава 1. Искусственные рибонуклеазы на основе олигонуклеотидных конъюгатов (Обзор литературы)

1.1. Дизайн искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидных конъюгатов. Выбор каталитических групп.

1.1.1. Каталитические группы на основе металлокомплексов

1.1.2. Конструирование аналогов каталитических центров, металлонезависимых ферментов

1.1.3. Металлонезависимые каталитически активные группы

1.1.3.1. Расщепление РНК аминосоединениями и катионными пептидами

1.1.3.2. Методы увеличения гидролитической активности металлонезависимых соединений

1.2. Выбор природы олигонукпеотида

1.3. Выбор места и способа введения каталитической группы в олигодезоксирибонуклеотиды

1.3.1. Введение каталитической группы по гетероциклическому основанию

1.3.2. Введение каталитической группы по рибозному фрагменту

1.3.3. Положение каталитической группы в олигонуклеотиде

1.3.4. Подходы к увеличению эффективности гидролиза РНК с помощью олигонуклеотидных конъюгатов

1.4. Методы синтеза искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидных конъюгатов:

1.5. Влияние строения РНК-мишени на эффективность расщепления

Гпава 2. Результаты и обсуждение

2.1. Конъюгаты монодезоксирибонуклеотидов с карцинином и его. аналогами, их синтез и исследование гидролитической стабильности

2.1.1. Основные направления реакции при получении конъюгатов 5'-мононуклеотидов с природным дипептидом - карцинином

2.1.2. Влияние длины линкера, разделяющего имидазольное кольцо и концевую аминогруппу, на условия протекания реакции

2.1.3. Определение гидролитической стабильности конъюгатов

2.2. Синтез олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с использованием слабо активированных групп-предшественников

2.2.1. Использование прекурсорной стратегии для синтеза 5'-концевых имидазол-олигонуклеотидных конъюгатов

2.2.2. Олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие остатки имидазола внутри олигонуклеотидной последовательности

2.3. Синтез олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов на основе полициклических ароматических прекурсорных групп

2.3.1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов на основе феназина

2.3.2. Получение олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих прекурсорные группы на основе антрацена

Гпава 3. Экспериментальная часть

3.1. Реактивы и материалы

3.2. Основные методы работы

3.2.1.Определение гидролитической стабильности конъюгатов монодезоксинуклеотидов с карницином

3.2.2. Осаждение олигодезоксирибонуклеотидов в виде солей

3.2.3. Гель-электрофорез

3.2.4. Очистка олигодезоксирибонуклеотидных производных с помощью 1ЧР-картриджа

3.3. Органический синтез

3.3.1. Синтез модифицированных монодезоксирибонукпеотидов

3.3.2. Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов

3.3.3. Методики получения феназиниевых производных

ВыводыОшибка! Закладка не определена.

Благодарности

Одним из наиболее эффективных подходов к конструированию реагентов, направленных на воздействие на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов. За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в олигонуклеотидном синтезе, чго делает получение синтетических нуклеиновых кислот с широким спектром модификаций рутинной процедурой. Однако синтез конъюгатов олигонуклеотидов с молекулами, содержащими различные реакциониоспособные группы (в первую очередь пептиды и пептидоподобные соединения), по-прежнему представляет сложную научную задачу, зачастую требующую в каждом конкретном случае поиска индивидуального решения. В настоящее время для получения таких конъюгатов преимущественно используют две принципиально разные стратегии, основанные на модификациях олигонуклеотидов во время (пресинтетическая модификация) и после (постсинтетическая модификация) основного олигонуклеотидного синтеза. Наибольшее распространение получила первая стратегия, подразумевающая предварительный синтез соответствующих амидофосфитов. Однако в случае молекул, содержащих различные функциональные группы, синтез таких амидофосфитов превращается в специальную задачу, решение которой требует значительных усилий. Трудозатраты данной стратегии особенно очевидны в случае необходимости оптимизации строения функциональной части олигонуклеотидного конъюгата, поскольку в этом случае возникает необходимость синтезировать серии как амидофосфитов, так и олигонуклеотидных конъюгатов. Напротив, постсинтетическая модификация, основанная на введении функциональных групп на постсинтетической стадии, позволяет получить серии конъюгатов на основе одного базового олигонуклеотида, при этом также исключается необходимость синтеза серии амидофосфитов.

В ИХБФМ СО РАН был предложен оригинальный подход к синтезу олигонуклеотидных конъюгатов, основанный на активации 5'- или З1- концевых фосфатов с последующим либо прямым введением молекул, содержащих алифатические аминогруппы, либо с промежуточным введением линкерных групп на основе алифатических диаминов. Данный подход, являющийся частным случаем постсинтетической стратегии, получил широкое распространение, однако в случае получения конъюгатов олигонуклеотидов с короткими пептидами или пептидоподобными молекулами, содержащими остатки гистидина (гистамина), этот метод оказался неприемлемым, в основном из-за низких выходов и невоспроизводимости результатов синтеза.

Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время разработан целый ряд подходов, позволяющих получать конъюгаты олигонуклеотидов с разнообразными лигандами, синтез олигонуклеотидных производных с молекулами, содержащими функциональные группы, по-прежнему остается актуальной задачей.

Целью данной работы являлась разработка стратегии и методов синтеза конъюгатов моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с соединениями, содержащими алифатические аминогруппы и функциональные группы боковых радикалов природных аминокислот.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Изучение возможностей метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с молекулами, имеющими в своем составе алифатические аминогруппы и остатки имидазола, путем активации концевого фосфата парой РЬзР/(Ру8)г в присутствии нуклеофильных катализаторов:

• изучение взаимодействия активированных фосфатных групп в монодезоксирибо-нуклеотидах с гистамином, карцинином и его аналогами;

• исследование стабильности фосфамидной связи в зависимости от структуры полученных соединений.

2. Разработка протоколов твердофазного синтеза олигонуклеотидных производных с использованием амидофосфитов, содержащих прекурсорные группы на основе слабоактивированных эфиров (монометиловые и моноцианметиловые офиры моноамидов дикарбоновых кислот):

• оптимизация метода получения олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников в зависимости от числа и места расположения прекурсорных групп, температуры, времени конденсации, катализатора;

• синтез конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с низкомолекулярными лигандами, содержащими первичные алифатические аминогруппы.

3. Разработка новых методов получения олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с использованием оригинальных прекурсорных групп на основе полициклических ароматических соединений:

• конструирование и синтез новых прекурсорных групп на основе феназина и антрацена. Получение олигодезоксирибонуклеотидных производных, несущих в своей структуре прекурсорные группы на их основе;

• синтез конъюгатов пептидов с олигодезоксирибонуклеотидными производными путем взаимодействия прекурсорной группы на основе феназина с алифатической аминогруппой пептида;

• синтез пептид-олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов путем взаимодействия ирекурсорной группы на основе антрацена с остатком малеимида, предварительно присоединенного к пептиду.

выводы

1. В результате исследования взаимодействия 5' - ф о с ф о -уУ-м ети л и м и дазол и дов мононуклеозидов с гистамином, ацилированным су-аминокислотами с различным числом атомов углерода, впервые было установлено, что:

• направление реакции фосфорилирования зависит как от строения аминокомпоненты, так и от природы гетероциклического основания нуклеотида. Выходы алифатических фосфамидов при амидировании мононуклеотидов падают в ряду: гистамин > карцинин > ^-аминобутирил-гистамин > гг-аминокапроил-гистамин. Показано, что амидофосфаты пиримидиновых нуклеотидов образуются с большим выходом (сГГМР > <1СМР) по сравнению с с!АМР;

• гидролитическая стабильность алифатической фосфамидной связи в конъюгатах определяется как природой гетероциклического основания (сГГМР > (1СМР > с1АМР), так и строением имидазолсодсржащсго фрагмента (карцинин > /-аминобутирил-гистамин > е-аминокапроил-гистамин, 20 °С, рН 4.6-8.2).

2. Разработаны протоколы твердофазного синтеза олигонуклеотидных производных, содержащих прекурсорные группы на основе слабоактивированных эфиров (цианметиловые эфиры, монометиловые эфиры моноамидов щавелевой кислоты). На их основе осуществлен синтез конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с низкомолекулярными лигандами, содержащими первичные алифатические аминогруппы. Показано, что выходы целевых продуктов зависят как от числа прекурсорных групп, гак и от их месторасположения в олигодезоксирибонуклеотиде и могут достигать 93%.

3. Предложен новый тип прекурсорных групп на основе бис-четвертичных солей феназиния, позволяющих по изменениям поглощения в видимой области спектра контролировать все стадии образования олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов. На примере получения соединения рТрТ-Нлз-А1а-НА впервые продемонстрирована возможность применения таких прекурсорных групп для синтеза пептид-олигонуклеотидных конъюгатов.

4. Осуществлен дизайн амидофосфитов и разработан метод синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остаток антрацена. На основе реакции Дильса-Альдера предложен метод синтеза конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с пептидами, содержащими различные функциональные группы.

Благодарности

Автор благодарит:

Своих коллег и соавторов, сотрудников лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН.

Кандаурову В.В. (НИОХ СО РАН) за регистрацию ЯМР-спектров, Герасимову Ю. В. (ИХБФМ СО РАН) и Карпова В. А. (ООО "НПФ Литех", Москва) за регистрацию масс-спектров.

Автор выражает особую благодарность научному руководителю — Сильникову Владимиру Николаевичу — за помощь и поддержку на всех этапах работы.

Заключение

В ходе решения задач направленного воздействия на нуклеиновые кислоты на различном уровне, в частности при создании сайт-направленных искусственных рибонуклеаз на основе олигодезоксирибонуклеотидов и их аналогов, содержащих каталитически активные молекулы, за последние десятилетия был достигнут огромный прогресс в химии олигонуклеотидных конъюгатов. В литературе опубликовано множество работ, посвященных развитию и оптимизации методов синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с различными биологически или химически активными молекулами. Однако, несмотря на большое число публикаций и разнообразие предложенных методов синтеза таких конъюгатов, универсального подхода не существует. Также в литературе отсутствуют сведенья о создании фармацевтических или терапевтических препаратов на основе таких конъюгатов. Во многом отсутствие прогресса в области практического использования сайт-специфических искусственных рибонуклеаз обуславливается сложностью и дороговизной синтез, что делает их использование коммерчески невыгодным.

Таким образом, разработка простого и в тоже время универсального метода синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с молекулами, содержащими две или несколько различных функиональных групп, по-прежнему является актуальной задачей.

Глава 2. Результаты и обсуждение

Наиболее эффективным подходом к конструированию реагентов, воздействующих на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов. Перспектива создания рациональных подходов в химиотерапии, воздействии на функционирование отдельных генов с целью коррекции биохимических процессов в организме, подавлении размножения инфекционных агентов (вирусов, бактерий и т.д.), основанных на применении конъюгатов олигонуклеотидов с пептидоподобными молекулами, несущими функциональные группы, вызвала в последние годы появление большого количесша работ, связанных как с синтезом, так и с изучением их химической и биологической активности [207, 263, 264].

При построении олигонуклеотидных конъюгатов используется широкий спектр функциональных групп, которые можно присоединять как к 3'-, 5'- концам, так и внутри олигонуклеотидного адреса [108].

Для функционализации олигодезоксирибонуклеотидов используют различные стратегии. Наиболее распространенными из них являются синтез соответствующих амидофосфитов с последующим их использованием в стандартном олигонуклеотидном синтезе (пресинтетический подход) и постсинтетическая модификация олигонуклеотидов. Используя пресинтетический подход, для синтеза каждого олигонуклеотидного конъюгата необходимо создание соответствующего уникального амидофосфита. Особенно задача усложняется в случае необходимости введения молекулы, содержащей функциональные группы различной природы. Зачастую выбор защитных групп, способных выдержать вначале многостадийный синтез амидофосфита, а затем условия олигодезоксирибонуклеотидного синтеза, и в тоже время удаляемых в мягких условиях, не приводящих к деградации олигонуклеотида, становится непреодолимой задачей. Таким образом, пресингетическая стратегия синтеза является неэффективной для синтеза олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов с полифункциональными молекулами. Постсинтетический подход, основанный на получении олигонуклеотида с группой-предшественником, которая затем легко может менять свою функцию после обработки соответствующим реагентом, выглядит более предпочтительно. В этом случае задача сводится к получению одного амидофосфита, содержащего прекурсорную группу. Решение задачи - выбор двух взаимодействующих только друг с другом функциональных групп позволяет избежать необходимости защищать другие функциональные группы, как в олигонуклеотиде, так и в присоединяемом лиганде.

Наиболее распространенным вариантом постсинтетической функционализации олигодезоксирибонуклеотида является модификация концевого фосфата. Олигодезоксирибонуклеотиды, несущие на 5'- или З'-конце фосфатную группу, являются коммерчески доступными. Это, при наличии простой процедуры активации концевого фосфата на фоне остальных реакционноспособных центров деблокированного олигодезоксирибонуклеотида (азоты гетероциклических оснований, окзоциклические аминогруппы, межнуклеотидные фосфаты, алифатические гидроксильные группы), позволяет рассматривать фосфатную группу как одну из наиболее простых групп-предшественников.

В настоящей работе нами были оценены возможности применения методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидных производных для получения конъюгатов олигонуклеотидов в первую очередь с молекулами, содержащими остатки имидазола. Выбор в качестве модели соединений, содержащие имидазольный фрагмент, обусловлен двумя основными причинами. С одной стороны во многих случаях именно остатки имидазола являются ключивыми элементами функциональных групп олигонуклеогидных конъюгатов (см. литературный обзор). С другой стороны введение имидазольного фрагмента в олигонуклеотидный конъюгат вызывает наибольшие синтетические трудности, связанные с высокой реакционной способностью имидазольного кольца и сложностью выбора для него защитных групп, совместимых со всеми стадиями получения олигонуклеотидного конъюгата.

2.1. Конъюгаты монодезоксирибонуклеотидов с карцинином и его аналогами, их синтез и исследование гидролитической стабильности

Одним из распространенных способов активации концевого фосфата в олигонуклеотидах является метод Мукоямы [265] в модификации Годовиковой с сотрудниками [242] с помощью окислительно-восстановительной пары трифенилфосфин/2,2'-дипиридилдисульфид (РЬзР/(Ру8)2) в присутствии Дометил имидазола (Ме1ш). Отличительной особенностью такого варианта модификации является формирование интермедиата, обладающего высокой реакционной способностью по отношению к алифатическим аминогруппам и практически невзаимодействующего с функциональными группами деблокированного нуклеогида. Была показана возможность получения таким методом конъюгатов олигонуклеотидов с короткими пептидами, содержащими гуанидиниевые группы [182, 183], были получены конъюгаты тетрануклеотида с гистамином [266], а также природным антибиотиком блеомицином [267].

Ранее, используя эту методику, были синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеот идов с производными иминодиуксусной кислоты, содержащими два остатка имидазола (1) (рис. 46) [171, 243].

Рис. 46. Общая структура олигонуклеотндных конъюгатов, содержащих два имидазольных остатка.

Однако в случае имидазолсодержащих конъюгатов выходы целевых продуктов не отличались воспроизводимостью и зависели от ряда факторов: расположения фосфатной группы (51 или 3'- конец), типа нуклеотида, длины линкерной группы. Для объяснения наблюдаемых фактов нами были синтезированы и изучены свойства конъюгатов монодезоксирибонуклеотидов с гистамином, природным дипептидом - карцинином и его аналогами, содержащими различное число метиленовых звеньев в /У-концевой аминокислоте.

2.1.1. Основные направления реакции при получении конъюгатов 5'-мононуклеотидов с природным дипептидом - карцинином

Синтез конъюгатов дезокситимидина сГГМР (2а), дезоксицитидина (1СМР (2Ь), дезоксиаденозина с1АМР (2с) с природным дипептидом - карцинином ((3-А1а-ПА) проводили согласно схеме, представленной на рисунке 47. Триэтиламмонийные соли 5'-фосфорилированных мононуклеотидов растворяли в минимальном объеме ДМСО, добавляли 5 кратный мольный избыток пары РЬзР, (РуБ)2 и Ме1т в ДМФА. В течение 1015 мин при комнатной температуре происходило образование промежуточного цвиттерионного соединения (За-с). К реакционным смесям, содержащим активные производные (За-с), добавляли дипептид, растворенный в ДМФА (0,1-0,5 моль-л"1) и реакционные смеси перемешивали в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Нуклеотидный материал и частично карцинин осаждали 6%-ным раствором ЫС1О4 в ацетоне. После удаления избытков активирующих реагентов и продуктов их превращения реакционные смеси анализировали с использованием обращеннофазовой, ионообменной хроматографии, а также спектроскопии 51МР. Более длительное инкубирование реакционных смесей при комнатной температуре приводило к накоплению примесей неустановленной природы, имеющих в спектрах ЯМР 31Р сигналы сложной структуры в п= 2-5

О Н области -10 - -16 м.д. При этом соотношение основных продуктов реакции практически не изменялось.

Рис. 47. Общая схема протекания реакции карцинина с активированными монодезоксирибонуклеотидами (с!ТМР, (]СМР, (1АМР); продукты гидролиза соединений (3 а-с) и (4ас).

Наиболее информативным методом, позволившим оценить количественный состав 1 реакционной смеси, оказалась спектроскопия ЯМР Р. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР было сделано в соответствии с имеющимися литературными данными [268]. Так в случае реакции с карцинином, после удаления избытка трифенилфосфина и продуктов его превращения в реакционных смесях фиксировались сигналы, отнесенные нами к целевым фосфамидам (4а-с) (8р = 8.57 - 10.46 м.д.), фосфоимидазолидам (5а-с) (5р = -8.36 - -9.36 м.д.) и симметричным пирофосфатам (ба-с) (8р = -10.22 - -11.54 м.д.). Кроме выше перечисленных в реакционных смесях наблюдался дополнительный сигнал в области 7.77.9 м.д., отнесенный нами к соединению (7). Интенсивность этого сигнала была минимальна для реакционной смеси, содержащей тимидин (2%) и максимальна в случае 2'-дезоксиаденозина (13%) (табл. 1). После хроматографического разделения реакционных смесей индивидуальные продукты дополнительно были охарактеризованы методом спектроскопии ЯМР 'Н, а также масс-спектрометрией. Спектры ЯМР 'II полученных соединений соответствовали ожидаемым, однако в спектрах соединений (4а) и (4Ь) наблюдалось расщепление сигналов от протона во втором положении имидазольного кольца (./ = 12.5 Гц). Данный эффект воспроизводим и, по-видимому, связан с наличием различных изомеров. Для корректного объяснения наблюдаемого эффекта требуются дополнительные исследования.

1. Belikova A., Zarytova V., Grineva N. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleosides phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. // Tetrahedron Lett. 1967. N 37. P. 3557-3562.

2. Agrawal S. Factors affecting the specificity and mechanism of action of antisense oligonucleotide. // Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 1999. N. 9. P. 371-375.

3. Zamecnik P., Stephenson M. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V.75. N. 1 .P. 285288.

4. Webb A., Cunningham D., Cotter F., Clarke P., de Stefano F., Ross P., Corbo M. Dziewanowska Z. BCL-2 antisense therapy in patients with non-Hodgkin lymphoma. // Lancet. 1997. N. 19. V. 349(9059). P. 1137-1141.

5. Власов В., Сильников В., Зенкова М. Химические рибопуклеазы. // Молекулярная биология. 1998. Т. 32. N. 1. С. 62-70.

6. Сильников В., Власов В. Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот. // Успехи хим. 2001. N. 70(6). С. 562-580.

7. Tamm I., Dorken В., Hartmann G. Antisense therapy in oncology: new hope for an old idea? // Lancet. 2001. N. 11. V. 358 (9280). P. 489-497.

8. Sasaki S., Nagatsugi F. Application of unnatural oligonucleotides to chemical modification of gene expression. // Curr. Opinion in Chem. Biology. 2006. N.10. P. 615621.

9. Trawick В., Daniher A., Bashkin J. Inorganic mimics of ribonucleases and ribozimes: from random cleavage to sequence-specific chemistry to catalytic antisense drugs. // Chem. Rew. 1998. N. 98. P. 939-960.

10. Oivanen M., Kuusela S., Lonnberg H. Kinetics and mcchanisms for the cleavage and isomerization of the phosphodiester bonds of RNA by bponsted acids and bases.// Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 961-990.

11. Muragawa G., Chen Т., Nierlich D., Sigman D. Scission of RNA by the chemical nuclease of 1, 10 phenantroline-copper ion preference for single-stranded loops. // Nucleic Acids Res. 1990. V. 17. N. 13. P. 5361-5375.

12. Celander D., Cech Т., Iron (II) — ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. // Biochemistry. 1990. V. 29. N. 6. P. 1355-1361.

13. Holmes C., Duff R., Van der Marel G., Van Boom J., Hetch S. On the chemistry of RNA degradation by Fe (II) Bleomicin. // Bio. Med. Chem. 1997. V. 5. N. 6. P. 12351248.

14. Сергеев Д., Зарытова В. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами. // Успехи химии. 1996. Т. 65. N. 4. С. 377402.

15. Young М., Chin J. Dinuclear copper (II) complex that hydrolyzes RNA. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 10577-10578.

16. Hegg E., Deal K., Kiessling L., Burstyn J. Hydrolysis of double-stranded and single-stranded RNA in hairpin structures by the copper (II) macrocycle Cu(9.aneN3)Cl2. // Inorg. Chem. 1997. V.36. P. 1715-1718.

17. Stern M., Bashkin J., Sail E. Hydrolysis of RNA by transition metal complexes. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 5357-5359.

18. Bashkin J., Jenkins L. The role of metals in the hydrolytic cleavage of DNA and RNA. // Comments Inorg. Chem. 1994. V. 16. P. 77-93.

19. Liu S., Hamilton A. Rapid and highly base selective RNA cleavage by a nuclear Си (II) complex. // Chem. Commun. 1999. P.587-588.

20. Hendry P., Sargeson A. Metal ion promoted reactions of phosphate derivative. // Prog. Inorg. Chem. 1990. V. 38. P. 201.

21. Breslow R., Berger D., Huang D. Bifunctional zinc-imidazole and zinc-thiophenol catalysts. // J. Am. Chem. Soc. 1990. N.l 12. P. 3686-3687.

22. Bashkin J., Frolova E., Sampath U. Sequence-specific cleavage of HIV mRNA by a ribozyme mimic.//J. Am. Chem. Soc. 1994. N.l 16. P. 5981-5982.

23. Bruice Т., Tsubouchi A., Dempcy R., Olson L. One- or two-metal ion catalysis of the hydrolysis of adenosine З'-alkyl phosphate esters. Models for one- and two-metal ion catalysis of RNA hydrolysis. // J. Am. Chem. Soc. 1992. N. 118. P. 9867-9875.

24. Bashkin J., Jenkins L. Hydrolysis of 2',3'-cyclic amp by aqueouscopper(II) terpyridine: breakdown of the analogy between activated phosphodiesters and RNA. // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1994. P. 3631-3632.

25. Morrow J., Iranzo O. Synthetic metallonucleases for RNA cleavage. // Current Opinion in Chemical Biology. 2004. N. 8. P. 192-200.

26. Rizzarelli E., Veccio G. Metal complexes of functionalized cyclodextrins as enzyme models and chiral receptors. // Coord. Chem. Rev. 1999. V. 188. N. 1. P. 343-364.

27. Baskin J. Hydrolysis of phosphates, esters and related substrates by models of biological catalysts. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. N. 6. P. 752-758.

28. Van der Beuken E., Felinga B. Bimetallic catalysis by late transition metal complexes. // Tetrahedron. 1998. V. 54. N. 43. P. 12985-13011.

29. Jenkins L., Bashkin J., Autry M. The embedded ribonucleotide assay: a chimeric substrate for studying cleavage of RNA by transesterification. // J. Am. Chem. Soc. 1996. N. 118. P. 6822-6825.

30. Komiyama M., Matsumoto Y., Takahashi H., Shiiba T., Tsuzuki H., Yajima H., Yashiro M., Sumaoka J. RNA hydrolysis by cobalt(III) complexes. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1998. N. 2. P. 691-695.

31. Morrow J., Buttrey L., Shelton V., Barback K. Efficient catalytic cleavage of RNA by lanthanide (III) macrocyclic complexes: toward synthetic nucleases for in vivo applications.// J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 1903-1905.

32. Weiner D., Wiemann T., Wolfe M., Wentworth P., Janda K. A pentacoordinate oxorhenium(V) metallochelate elicits antibody catalysts for phosphodiester cleavage. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 4088-4089.

33. Matsumura K., Komiyama M. Enormously fast RNA hydrolysis by lanthanide (III) ions under physiological conditions: eminent candidates for novel tools of biotechnology. // J. Biochem. 1997. V. 122. N. 2. P. 387-394.

34. Komiyama M., Matsumura K., Matsumoto Y. Unprecedentedly fast hydrolysis of the RNA dinucleoside monophosphates ApA and UpU by rare earth metal ions // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992. P. 640-641.

35. Molenveld P., Engbersen J., Reinhoudt D. Specific RNA dinucleotide cleavage by a synthetic calyx4.arene-based trinuclear metallo(II)-phosphodiesterase. // Angew. Chem. Int. Ed. 1999. V. 38. N. 21. P. 3189-3192.

36. Matsuda S., Ishikubo A., Kuzuya A., Yashiro M., Komiyama M. Conjugates of dinuclear zinc (II) complex oligomers as novel sequence-selective artificial ribonucleases. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. V. 37. N. 23. P. 3284-3286.

37. Yashiro M., Ishikubo A., Komiyama M. Efficient and unique cooperation of three zinc (II) ions in the hydrolysis of diribonucleotides by a trinuclear zinc(II) complex. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1997. P. 83-84.

38. Matsumura K., Endo M., Komiyama M. Lanthanide complex-oligo-DNA hybrid for sequence-selective hydrolysis of RNA. // J. Am. Chem. Soc. Commun. 1994. P. 2019" 2020.

39. Magda D., Wright M., Crogts Sh., Lin A., Sessler J.L. Metal complex conjugates of antisense DNA which display ribozyme-like activity.// J. Am. Chem. Soc. 1997. N. 119. P. 6947-6948.

40. Hall J., Husken D., Haner R. Towards artificial ribonucleases: the sequence-specific cleavage of RNA in a duplex. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. N. 18. P. 3522-3526.

41. Baker B., Khalili H., Wei N., Morrow J. Cleavage of the 5' cap structure of mRNA by a europium (III) macrocyclic complex with pendant alcohol groups.// J. Am. Chem. Soc.1997. V. 119. N. 38. P. 8749-8755.

42. McCue K., Voss D., Marks C., Morrow J. Dinuclear copper(II) complexes that promote hydrolysis of GpppG, a model for the 5'-cap of mRNA. // J. Chem. Soc. Dalton Trans.1998. P. 2961-2963.

43. McCue K., Morrow J. Hydrolysis of a model for the 5'-cap of mRNA by dinuclear copper(II) and zinc(II) complexes. Rapid hydrolysis by four copper(II) ions. // Inorg. Chem. 1999. V. 38. P. 6136-6142.

44. Putnam W., Bashkin J. De novo synthesis of artificial ribonucleases with benign metal catalysts. // Chem. Commun. 2000. P. 767-768.

45. Astrom H., Williams N., Stromberg R. Oligonucleotide based artificial nuclease (OBAN) systems. Bulge size dependence and positioning of catalytic group in cleavage of RNA-bulges. //Org. Biomol. Chem. 2003.N.l. P. 1461-1465.

46. Haner R., Hall J. The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. N. 7. P. 423-430.

47. Raines R. Ribonuclease A. // Chem. Rev. 1998. N. 98. V. 3. P. 1045-1066.

48. Park C., Raines R. Catalysis by ribonuclease A is limited by the rate of substrate association. // Biochemistry. 2003. N. 42. P. 3509-3518.

49. Pace N., Heinemann U., Hahn U., Saenger W. Ribonuclease T1: structure, function and stability. 11 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991. V. 30. N. 4. P. 343-360.

50. Perreault D., Anslyn E. Unifying the current data on the mechanism of cleavage-transesterification of RNA. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997. V. 36. N. 5. P. 432-450.

51. Schultz L., Quirk D., Raines R. His—Asp catalytic dyad of ribonuclease A: structure and function of the wild-type, D121N, and D121A enzymes. // Biochemistry. 1998. N. 37. P. 8886-8898.

52. Breslow R., Labelle M. Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidazole. //J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 2655-2659.

53. Breslow R. Kinetics and mechanism in RNA cleavage. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90.N. 4. P. 1208-1211.

54. Breslow R., Xu R. Recognition and catalysis in nucleic acid chemistry. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 1201-1207.

55. Breslow R. How do imidazole groups catalyze the cleavage of RNA in enzyme models and in enzymes? Evidence from "Negative catalysis". // Acc. Chem. Res. 1991. V. 24. N. 11. P. 317-324.

56. Breslow R., Doherty J., Guillot G., Lipsey C. P-Cyclodextrinyl-bisimidazole, a model for ribonuclease. // J. Am. Chem. Soc. 1978'. V. 100. P. 3227-3229.

57. Anslyn E., Breslow R. Geometric evidence on the ribonuclease model mechanism. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 5972-5973.

58. Breslow R., Anslyn E., Huang D.-L. Ribonucleases mimics. // Tetrahedron 1991. V. 47. N. 14/15. P. 2365-2376.

59. Варфоломеев С., Пожитков А. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа. // Вестн. Моск. Университета. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. С. 147-156.

60. Yoshinari К., Yamazaki К., Komiyama М. Oligoamines as simple and efficient catalysts for RNA hydrolysis. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 5899-5901.

61. Komiyama M., Yoshinari K. Kinetic analysis of diamine-catalyzed RNA hydrolysis. // J. Org. Chem. 1997. V. 62. P. 2155-2160.

62. Komiyama M., Yoshinari K. Co-operation of two amino residues for the facile cleavage of bis(nitrophenyl) phosphates. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989. P. 1880.

63. Komiyama M., Inokawa Т., Yoshinari K. Ethylenediamine-oligo DNA hybrid as sequence selective artificial ribonuclease. // J. Am. Chem. Soc. Commun. 1994. P. 77-78.

64. Komiyama M., Inokawa T. Selective hydrolysis of tRNA by ethylenediamine bound to a DNA oligomer. // J. Biochem. 1994. V. 116. N. 4. P. 719-720.

65. Barbier В., Brack A. Search for catalytic properties of simple polypeptides. // Orig. Life Evol. Biosph. 1987. V. 17. P. 381-390.

66. Brack A., Barbier B. Chemical activity of simple basic peptides. // Orig. Life Evol. Biosph. 1990. V. 20. P. 139-144.

67. Perello M., Barbier B., Brack A. Hydrolysis of oligoribonucleotides by alpha-helical basic peptides. // Int. J. Pept. Protein Res. 1991. V. 38. N. 2. P. 154-160.

68. Muche M., Gobel M. Bis(guanidinium) Alcohols as Models of Staphylococcal Nuclease: Substrate Binding through Ion Pair Complexes and Fast Phosphoryl Transfer Reactions. // Angew. Chem. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 2126-2129.

69. Jubian V., Veronese A., Dixon R., Hamilton A. Acceleration of a Phosphate Diester Transesterification Reaction by Bis(alkylguanidinium) Receptors Containing an Appended General Base. //Angew. Chem. Ed. Engl. 1995. V. 34. P. 1237-1239.

70. Piatek A., Gray M., Anslyn E. Guanidinium groups act as general-acid catalysts in phosphoryl transfer reactions: A two-proton inventory on a model system. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 9878-9879.

71. Scheffer U., Strick A., Ludwig V., Peter S., Kalden E., Gobel M. Metal-free catalysts for the hydrolysis of RNA derived from guanidines, 2-aminopyridines, and 2-aminobenzimidazoles. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 2211-2217.

72. Lorente A., Espinosa J., Fernandez-Saiz M., Lehr J., Wilson W., Zhong Y. Synthesis of imidazole-acridine conjugates as ribonuclease A mimics. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. N. 25. P. 4417-4420.

73. Smith J., Ariga K., Anslyn E. Enhanced imidazole-catalyzed RNA cleavage induced by a bis-alkylguanidinium receptor. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 362-364.

74. Tung C-H., Wei Z., Leibowitz M., Stein S. Design of peptide-acridine mimics of ribonuclease activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 7114-7118.

75. Endo M., Hirata K., Ihara T., Sueda S., Takagi M., Komiyama M. RNA hydrolysis by the cooperation of carboxylate ion and ammonium ion. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 5478-5479.

76. Yang Q., Xu J., Sun Y., Li Z., Li Y., Qian X. Hydrolysis of plasmid DNA and RNA by amino alkyl naphthalimide as metal-free artificial nuclease. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. N. 16. P. 803-806.

77. Gao Y., Marcus R. Theoretical investigation of the directional electron transfer in 4-aminonaphthalimide compounds. //J. Phys. Chem. 2002. V. 106. P. 1956-1960.

78. Xu Y., Qian X., Yao W., Mao P., Cui J. Novel naphthalimide hydroperoxide photonucleases: The role of thiocyclic-fused area and the difference in spectra, photochemistry and photo biological activity. // Bioorg. Med. Chem. 2003. V. 11. P. 54275433.

79. Cui D., Qian X., Liu F., Zhang R. Novel fluorescent pH sensors based on intermolecular hydrogen bonding ability of naphthalimide. // Org. Lett. 2004. V. 6. N. 16. P. 2757-2760.

80. Podyminogin M., Vlassov V., Giege R. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. N. 25. P. 5950-5956.

81. Сильников В., Лукьянчук H., Шишкин Г., Жиже Р., Власов В. Имидазолсодержащие производные, моделирующие активный центр РНКазы А. Синтез и РНК-расщепляющая активность. // Доклады академии наук. 1999. Т. 364. С. 690-694.

82. Beaucage S., Iyer R. The synthesis of modified oligonucleotides by the phosphoramidite approach and their applications. // Tetrahedron. 1993. V. 49. N. 28. P. 6123-6194.

83. Beaucage S., Iyer R. The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives. // Tetrahedron. 1993. V. 49. P. 1925-1963.

84. Vlassov V. Oligonucleotide derivatives: Biologically active compounds targeted to specific genes. // Pure & Appl. Chemistry. 1993. V. 65. N. 6. P. 1337-1342.

85. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement though novel chemical modifications. // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 1628-1644.

86. Eckstein F. Phosphorothioate oligonucleotides: What is their origin and what is unique about them? // Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 2000. V. 10. P. 117-121.

87. Crooke S. Progress in antisense technology: the end of the beginning. // Methods Enzymol. 2000. V. 313. P. 3-45.

88. Levin A. A review of issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1489. P. 69-84.

89. Zamaratski E., Pradeepkumar P., Chattopadhyaya J. A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNase H. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 48. P. 189-208.

90. Wilson C., Keefe A., Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. // Curr. Opinion in Chem. Biology. 2006. N. 10. P. 607-614.

91. Nielsen P. Antisense properties of peptide nucleic acid. // Methods Enzymol. 1999. V. 313. P. 156-164.

92. Elayadi A., Corey D. Application of PNA and LNA oligomers to chemotherapy. // Curr. Opinion Invest. Drugs. 2001. N. 2. P. 558-561.

93. Braasch D., Corey D. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 4503-4509.

94. Kurreck J., Wyszko E., Gillen C., Erdmann V. Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids. //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 1911-1918.

95. Gryaznov S., Chen J. Oligodeoxyribonucleotide N3'-P5' phosphoramidites: synthesis and hybridization properties. //J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 3143-3144.

96. Summerson J., Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. // Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 1997. V. 7. P. 187-195.

97. Damha M., Wilds C., Noronha A., Brukner I., Borkow G., Arion D., Patiak M. Hybrids of RNA and arabinonucleic acids. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 12976-12977.

98. Rait V., Shaw B. Boranophosphates support the RNA H cleavage of polyribonucleotides. // Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 1999. V. 9. P. 53-60.

99. Monoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. N. 12. P. 103-128.

100. Niittymaki T., Lonnberg H. Artificial ribonucleases. // Org. Biomol. Chem. 2006. N. 4. P. 15-25.

101. Ilerdewijn P. Heterocyclic modification of oligonucleotides and antisense technology. // Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 2000. V. 10. P. 297-310.

102. Takayama H., Sakamoto S., Kitamura M., Inoue H. Development of site-specific artificial ribonucleases. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2007. N. 51. P. 203-204.

103. Pyle A. Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes. // Science. 1993. V. 261. P. 709-714.

104. Bashkin J., Sampath U., Frolova E. Ribozyme mimics as catalytic antisense reagents. // Appl. Biochem. & Biotech. 1995. V. 54. P. 43-56.

105. Daniher A., Bashkin J. Precise control of RNA cleavage by ribozyme mimics. // Chem. Commun. 1998. P. 1077-1078.

106. Mukoguchi D., Sakamoto S., Takayama H., Kitamura M., Inoue H. Structure-activity relationship of an antisense oligonucleotide-two Cu(II) complex conjugate as an artificial ribonuclease. //Nucleic Acids Symp. Ser. 2008. N. 52. P. 377-378.

107. Hara K., Kitamura M., Inoue Ii. Synthesis and ribonuclease activity of oligonucleotides with N3-terpyridine*Cu(II)-linked thymine residues. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2006. N. 50. P. 71-72.

108. Baker B. Decapitation of a 5'-capped oligoribonucleotide by o-phenanthroline:copper(II). //J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 3378-3379.

109. Baker B., Ramasamy K., Kiely J. Decapitation of a 5' capped RNA by an antisense copper complex conjugate. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. N. 6. P. 1647-1652.

110. Wang G., Bergstrom D.E. Synthesis of oligonucleotides containing N-(5-Carboxypentyl)-2'-deoxyguanosine and 5-2-(4'-methyl-2,2'-dipyrid-4-yl-carboxamido)ethylthio.-2'-deoxyuridine. // Tetrahedron Lett. 1993. V.34. N. 42. P. 76217624.

111. Bergstom D., Chen J. Sequence-specific oligodeoxyribonucleotides cleavage by a major-groove-positioned metal-binding ligand tethered to C-5 of deoxyuridine. // BioMed. Chem. Lett. 1996. V.6. N.18. P. 2211-2214.

112. Sandbrink J., Murtola M., Stromberg R. Solid support post-conjugation of amino acids and a phenanthroline derivative to a central position in peptide nucleic acids. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2007. V. 26. P. 1485-1489.

113. Murtola M., Ossipov D., Sandbrink J., Stromberg R. RNA cleavage by 2,9-diamino-1,10,-phenanthroline PNA conjugates. //Nucleos. Nucleot. Nucleic Acids. 2007. V.26. P. 1479-1483.

114. Murtola M., Stromberg R. Development of 2'-0-methyloligoribonucleotide and peptide nucleic acid based artificial ribonucleases. //Nucleic Acids Symp. Ser. 2007. N. 51. P. 201202.

115. Tung C., Rudolph J., Stein S. Preparation of oligonucleotide-peptide conjugates. //

116. Bioconjugate Chem. 1991. N. 2. P. 464-465.

117. DeNapoli L., Messere A., Montesarchio D., Piccialli G., Benedetti E., Bucci E., Rossi F. A new solid-phase synthesys of oligonucleotides 3'-conjugated with peptides. // Bioorg. Med. Chem. 1999. N. 7. P. 760-765.

118. Bashkin J., Gard J., Modak A. Synthesis and characterization of nucleoside peptides: toward chemical ribonucleases.I. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 5125-5132.

119. Wang G., Bergstrom D.E. Synthesis of oligonucleotides containing N2-2-(Imidazole-4-ylacetamido) ethyl.-2'-deoxyguanosine. // Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. N. 42. P. 67256728.

120. Bashkin J., Xie J., Daniher A., Jenkins L., Yeh G. Ribozyme mimics for catalytic antisense strategy. // DNA & RNA Cleavers and Chemotherapy of Cancer and Viral Diseases. Meunier B. (ed.). 1996. P. 355-366.

121. Bashkin J., Xie J., Daniher A., Sampath U., Kao J. Building blocks for ribozyme mimics: conjugates of terpyridine and bipyridine with nucleosides. // J. Org. Chem. 1996. N. 61. P. 2314-2331.

122. Inoue H., Furukawa T., Tamura T., Komatsu Y., Ohtsuka E. Two-terpyridine-Cu(II) complexes-containing antisesnse systems for rapid and highly site-specific RNA cleavage. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2000. N. 44. P. 279-280.

123. Madder A., Ehrl R., Stromberg R. Stabilisation of RNA bulges by oligonucleotide complements containing an adenosine analogue. // ChemBioChem. 2003. N.4. P. 11941200.

124. Polushin N. Synthesis of functionally modified oligonucleotides from methoxyoxalamido precursors. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. N. 19. P. 3231-3234.

125. Polushin N., Malykh A., Morocho A., Slesarev A., Kozyavkin S. Title-high-throughput production of optimized primers (fimers) for whole-genome direct sequencing. // Methods Mol. Biol. 2005. P. 291-304.

126. McMurry T., Brechbiel M., Kumar K., Gansow A. Convenient synthesis of bifunctional tetraaza macrocycles // Bioconjugate Chem. 1992. V. 3. P. 108-117.

127. Huang L., Chappell L., Iranzo O., Baker B., Morrow J. Oligonucleotide conjugates of Eu(III) tetraazamacrocycles with pendent alcohol and amide groups promote sequence-specific RNA cleavage. // JBIC. 2000. N. 5. P. 85-92.

128. Astrom H., Stromberg R. A method for synthesis of an artificial ribonuclease. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 1385-1388.

129. Behan M., Miller P. Preparation of an imidazole-conjugated oligonucleotide. // Bioconjugate Chem. 2000. N. 11. P. 599-603.

130. Beaucage S., Bergstrom D., Glick G., Jones R. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2000. Wiley. New York.

131. Качалова А., Зубин E., Орецкая Т. Методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки. // Успехи химии. 2002. Т. 71. С. 1173-1192.

132. Hovinen J. Synthesis of carbon-3-substituted 1,5,9-triazacyclododecanes, RNA cleavage agents suitable for oligonucleotide tethering. // Bioconjugate Chem. 1998. V. 9. P. 132-136.

133. Hovinen J., Salo H. C-Glycoside phosphoramidate building block for versatile fictionalization of oligonucleotides. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1997. V. 1. P. 30173020.

134. Стеценко Д., Арзуманов А., Коршун В., Гейт М. Пептид-олигонуклеотидные коныогаты как антисмысловые агенты нового поколения. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. N. 6. С. 998-1006.

135. Zatsepin Т., Romanova Е., Stetsenko D., Gait М., Oretskaya Т. Synthesis of 2'-modified oligonucleotides containing aldehyde or ethylenediamine groups. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 1383-1385.

136. Kalchanova A., Zatsepin Т., Romanova E., Stetsenko D., Gait M., Oretskaya T. Synthesis of modified nucleotide building blocks containing electrophilic groups in the 2'-position. //Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2000. V. 19. P. 1693-1707.

137. Manoharan M. 2'-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. // Biochim Biophys Acta. 1999. N.10. V. 1489. P. 117-130.

138. Prakash Т., Bhat B. 2'-Modified oligonucleotides for antisense therapeutics. // Curr. Top Med. Chem. 2007. V. 7. P. 641-649.

139. Komiyama M., Sumaoka J., Kuzuya A., Yamamoto Y. Sequence-selective artificial ribonucleases. II Methods in enzymology. 2001. V. 341. P. 455-468.

140. Husken D., Goodall G., Blommers M., Jahnke W., Hall J., Haner R., Moser H. Creating RNA bulges: cleavage of RNA in RNA/DNA duplexes by metal ion catalysis. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 16591-16600.

141. Pan T., Dichtl B., Uhlenbeck O. Properties of an in vitro selected Pb2+ cleavage motif. //Biochemistry. 1994. V. 33. P. 9561-9565.

142. Astrom II., Stromberg R. Synthesis of new OBAN's and further studies on positioning of the catalytic group. // Org. Biomol. Chem. 2004. N. 2. P. 1901-1907.

143. Brittain I., Huang X., Long E. Selective recognition and cleavage of RNA loop structures by Ni(II)-Xaa-Gly-His metallopeptides. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1211312120.

144. Komiyama M., Inokawa T., Shiiba T., Takeda N., Yoshinari K., Yashiro M. Molecular design of artificial ribonucleases. //Nucleic Acids Symp. Ser. 1993. V. 29. P. 197-199.

145. Komiyama M. Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA by lanthanide complex-oligo-DNA hybrids. // J. Biochem. 1995. V.l 18. N. 4. P. 665-670.

146. Hall J., Husken D., Pieles V., Moser H., Haner R. Efficient sequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides. // Chemistry & Biology. 1994. V.l. N. 3. P. 185-190.

147. Haner R., Hall J., Pfutzer A., Husken D. Development of artificial ribonucleases. // Pure & Appl. Chem. 1998. V. 70. N. l.P. 111-116.

148. Husken D., Deichert A., Hall J., Haner R. Combinatorial library of artificial ribonucleases. //Nucleosides Nucleotides. 1999. N. 18(6-7). P. 1507-1511.

149. Komiyama M., Sumaoka J. Progress towards synthetic enzymes for phosphoester hydrolysis. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.3. N. 6. P. 751-757.

150. Whitney A., Gavory G., Balasubramanian S. Site-specific cleavage of human telomerase RNA using PNA-neocuproine*Zn(II) derivatives. // Chem. Commun. 2003. P. 36-37.

151. Sandbrink J., Murtola M., Stromberg R. Solid support post-conjugation of amino acids and a phenanthroline derivative to a central position in peptide nucleic acids. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2007. V.26. P. 1485-1489.

152. Murtola M., Ossipov D., Sandbrink J., Stromberg R. RNA cleavage by 2,9-diamino-1,10,-phenanthroline PNA conjugates. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2007. V. 26. P. 1479-1483.

153. Murtola M., Stromberg R. Development of 2'-0-methyloligoribonucleotide and peptide nucleic acid based artificial ribonucleases. //Nucleic Acids Symp. Ser. 2007. V. 51. P. 201202.

154. Niittymaki T., Kaukinen U., Virta P., Mikkola S., Lonnberg H. Preparation of azacrown-functionalized 2'-0-methyl oligoribonucleotides, potential artificial RNAses. // Bioconjugate Chem. 2004. V. 15. P. 174-184.

155. Niittymaki Т., Virta P., Ketomaki K., Lonnberg H. Di(azacrown) conjugates of 2'-0-metyl oligoribonucleotides as sequence-selective artificial ribonucleases. // Bioconjugate Chem. 2007. V. 18. P. 1583-1592.

156. Silnikov V., Zuber G., Behr J., Giege R., Vlassov V. Design of ribonuclease mimics for sequence specific cleavage of RNA. // Phosphorus, Sulfur & Silicon. 1996. V. 109-110. P. 277-280.

157. Vlassov V., Abramova Т., Godovikova Т., Giege R., Silnikov V. Sequence-specific cleavage of yeast tRNAphc with oligonucleotide conjugated to a diimidazole construct. // Antisense & Nucleic acid Drug Development. 1997. N. 7. P. 39-42.

158. Yurchenko L., Silnikov V., Godovikova Т., Shishkin G., Toulme J., Vlassov V. Cleavage of leishmania mini-exon sequence by oligonucleotides conjugated to a diimidazole construction.//Nucleos. Nucleot. 1997. N. 16(7-9).* P. 1721-1725.

159. Polushin N., Chen В., Anderson L., Cohen J. Synthesis and characterization of imidazole-linked synthons and З'-conjugated thymidine derivatives. // J. Org. Chem. 1993. N. 58. P. 4606-4613.

160. Ushijima K., Shirakawa M., Kagoshima K., Park W., Miyara-Kurosaki N., Takaku H. Anti HIV-I activity of an antisense phosphorotioate oligonucleotide bearing imidazole and primary amino groups. // BioMe& Chem. Lett. 2001. N. 9. P. 2165-2169.

161. Белоглазова Н.Г., Полушин H.H., Сильников B.H., Зенкова М.А., Власов В.В. Сайт-специфическое расщепление дрожжевой тРНКР11е производными олигонуклеотидов, несущими бисимидазольные конструкции. // Доклады Академии Паук. 1999. Т.369. N. 6. С. 827-830.

162. Guerniou V., Gillet R., Berree F., Carboni В., Felden B. Targeted inhibition of the hepatitis С internal ribosomal entry site genomic RNA with oligonucleotide conjugates. // Nucleic Acids Res. 2007. N. 5. P. 1-10.

163. Graccarini С., Peter S., Scheffer U., Vonhoff S., Klussmann S., Gobel M. Site-specific cleavage of RNA by a metal-free artificial nuclease attached to antisense oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 8063-8067.

164. Polushin N. The precursor strategy: terminus methoxyoxalamido modifiers for single and multiple functionalization of oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. N. 16. P. 3125-3133.

165. Pyshyi D., Repkova М., Ivanova Е., Venyaminova A., Zarytova V. Oligonucleotide peptide conjugates for RNA cleavage. // Nucleosides & Nucleotides. 1997. N. 16(7-9). P. 1571-1574.

166. Mironova N., Pyshnyi D., Ivanova E., Zarytova V., Zenkova M., Gross H., Vlassov V. Sequence-specific cleavage of the target RNA with oligonucleotide-peptide conjugates. // Russ. Chem. Bull. 2002. V. 51. P. 1177-1186.

167. Mironova N, Pyshnyi D., Ivanova E., Zenkova M., Gross H., Vlassov V. Covalently attached oligonucleotides induce Rnase activity of a short peptide and modulate its base specificity. //Nucleic Acid Res.2004. V. 32. N. 6. P. 1928-1936.

168. Bibillo A., Figlerowicz M., Kierzek R. The non-enzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides VI. The role of biogenic polyamines. //Nucleic Acid Res. 1999. V. 27. P. 3931-3937.

169. Mironova N., Pyshnyi D., Shtadler D., Fedorova A., Vlassov V. Zenkova M. RNase T mimicking artificial ribonuclease. // Nucleic Acid Res. 2007. V. 35. P. 2356-2367.

170. Reynolds M., Beck Т., Hogrefe R., McCaffrey A., Armold L.,Vaghefi M. A non-nucleotide-based linking method for the preparation of psoralen-derivatized methylphosphonate oligonucleotides. // Bioconjugate Chem. 1992. V. 3. N. 5. P. 366-374.

171. Endo M., Azuma Y., Saga Y., Kuzuya A., Kawai G., Komiyama M. Molecular design for a pinpoint RNA scission. Interposition of oligoamines between two DNA oligomers. // J. Org. Chem. 1997. V. 62. P. 846-852.

172. Smith T., LaTour J., Bochkariov D., Chaga G., Nelson P. Bifunctional phosphoramidite reagents for the introduction of histidyl and dihistidyl residues into oligonucleotides. // Bioconjugate Chem.,1999. V. 10. P. 647-652.

173. Putnam W., Daniher A., Trawick B., Bashkin J. Efficient new ribozyme mimics: direct mapping of molecular design principles from small molecules to macromolecular, biomimetic catalysts. //Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. N. 10. P. 2199-2204.

174. Inoue. H., Shimizu M., Furukawa T., Tamura T., Matsui M., Ohtsuka E. Site-selective RNA cleavage using terpyridine*Cu(II)-linked 2'-0-metyloligonucleotides. // Nucleos. Nucleot. 1999. V. 18. P. 1503-1505.

175. Inoue H., Furukawa T., Shimizu M., Tamura T., Ohtsuka E. Efficient site-specific cleavage of RNA using a terpyridine*copper(II)complex joined to a 2'-0-methyloligonucleotide by a non-flexible linker. // Chem. Commun. 1999. P. 45-46.

176. Trawick B., Osiek T., Bashkin J. Enhancing sequence-specific cleavage of RNA within a duplex region: incorporation of 1,3-propanediol linkers into oligonucleotide conjugates of serinol-terpyridine. // Bioconjugate Chem. 2001. V. 12. P. 900-905.

177. Verbeure B., Lacey C., Froeyen M., Rozenski J., Herdewijn P. Synthesis and cleavage experiments of oligonucleotide conjugates with a diimidazole-derived catalytic center. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 333-350.

178. Kuzuya A., Mizoguchi R., Morisawa F., Machida K., Komiyama M. Metal ion-induced site-selective RNA hydrolysis by use of acridine-bearing oligonucleotide as cofactor.// J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 6887-6894.

179. Kuzuya A., Komiyama M. Non-covalent ternary systems (DNA-acridine hybrid/DNA/lanthanide(III)) for efficient and site-selective RNA scission. // Chem. Commun. 2000. P.2019-2020.

180. Kuzuya A., Komiyama M. Sequence-selective RNA scission by non-covalent combination of acridine-tethered DNA and lanthanide(IIl) ion. // Chem. Lett. 2000. N. 12. P. 1378-1379.

181. Shi Y., Machida K., Kuzuya A., Komiyama M. Design of phosphoramidite monomer for optimal incorporation of functional intercalator to main chain of oligonucleotide. // Bioconjugate Chem. 2005. V. 16. P. 306-311.

182. Kuzuya A., Machida K., Komiyama M. A highly acidic acridine for efficient site-selective activation of RNA leading to an eminent ribozyme mimic. // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 8249-8252.

183. Kuzuya A., Machida K., Mizoguchi R., Komiyama M. Conjugation of various acridines to DNA for site-selective RNA scission by lanthanide ion. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 365-369.

184. Inoue H., Furukawa T., Tamura T., Komatsu Y., Ohtsuka E. Two-terpyridine-Cu(II) complexes-containing antisesnse systems for rapid and highly site-specific RNA cleavage. // Nuclcic Acids Symp. Ser. 2000. V. 44. P. 279-280.

185. Inoue. H., Furukawa T., Tamura T., Kamada A., Ohtsuka E. Rapid RNA cleavage using an antisense system with two terpyridine*Cu(II) complexes. // Nucleos. Nuclcot. Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 833-835.

186. Sakamoto S., Tamura T., Furukawa T., Komatsu Y., Ohtsuka. E, Kitamura M., Inoue H. RNA cleavage efficiency and catalytic turnover of an oligonucleotide-two copper complexes conjugate. //Nucleic Acids Res. Supp. 2003. N.2. P. 157-158.

187. Knorre D., Vlassov V., Zarytova V., Lebedev A., Fedorova O. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. // CRC Press Boca Raton-Ann Arbor-London-Tokyo. 1994.

188. Akhtar S, Juliano R. Cellular uptake and intracellular fate of antisense oligonucleotides. //Trends Cell Biol. 1992N. 2(5). P. 139-144.

189. Juliano R. Intracellular delivery of oligonucleotide conjugates and dendrimer complexes. // Ann N Y Acad Sci. 2006. V. 1082. P. 18-26.

190. Akhtar S., Hughes M„ Khan A., Bibby M., Nawaz M., Double J., Sayyed P. The delivery of antisense therapeutics. // Adv. Drug Delivery Rev. 2000. V. 44. N. l.P. 3-21.

191. Maier M., Yannopoulos C., Mohamed N., Roland A., Fritz H., Mohan V., Just G., Manoharan M. Synthesis of antisense oligonucleotides conjugated to a multivalent carbohydrate cluster for cellular targeting. // Bioconjugate Chem. 2003. V. 14. P. 18-29.

192. Pogocki D., Schoneich C. Chemical stability of nucleic acid-derived drugs. // J. Pharm. Sciences. 2000. V. 89. N. 4. P. 443-456.

193. Синяков А., Рябинин В., Гримм Г., Буторин А. Стабилизация тройных спиралей ДНК с помощью конъюгатов олигонуклеотидов и синтетических лигандов. // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35(2). С. 298-308.

194. Fox К. Targeting DNA with triplexes. // Curr. Med Chem. 2000. N. 7(1). P. 17-37.

195. Silver G., Sun J., Hguyen C., Boutorine A., Bisagni E., Helene C. Stable triple-helical DNA complexes formed by benzopyridoindole- and benzopyridoguinoxaline-oligonucleotide conjugates. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 263-268.

196. Da Ros Т., Spalluto G., Prato M., Saison-Bchmoaras Т., Boutorine A., Cacciari B. Oligonucleotides and oligonucleotide conjugates: a new approach for cancer treatment. // Curr. Medicinal Chem. 2005. V. 12. P. 71-88.

197. Gait M.(Ed.) Oligonucleotide synthesis. A practical approach. // IRL Press Lim. Oxford. 1984.

198. Beaucage S. Strategies in the preparation of DNA oligonucleotide arrays for diagnostic applications. // Curr. Med. Chem. 2001. N.8. P. 1213-1244.

199. Agrawal S. (Ed.) Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Synthesis and Properties, in Methods in Molecular Biology.// Totowa. NJ: Humana Press. 1993. V. 20.

200. Herdewijn P. Oligonucleotide synthesis, Methods and Applications, in Methods in Molecular Biology. // Totowa. NJ: Humana Press. 2005. V. 288.

201. Stetsenko D., Gait M. Efficient conjugation of peptides to oligonucleotides by "native ligation". // J. Org. Chem. 2000. V. 65. P. 4900-4908.

202. Stetsenko D., Gait M. A convenient solid-phase method for synthesis of 3'-conjugates of oligonucleotides. // Bioconjugate Chem. 2001. V. 12. P. 576-586.

203. Stetsenko D., Gait M. Chemical methods for peptide-oligonucleotide conjugates synthesis. Methods in Molecular Biology // Totowa. NJ: Humana Press. 2005. V. 288. P. 205-224.

204. Zuckermann R., Corey D., Schultz P. Site-selective cleavage of RNA by a hybrid enzyme. //J. Am. Chem. Soc. 1988. V.110. P.1614-1615.

205. Tor Y., Dervan P. Site-specific enzymatic incorporation of an unnatural base, N6-(6-aminohexyl)isoguanosine, into RNA. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 4461-4467.

206. Seelig В., Jiischke A. Site-specific с modification of enzymatically synthesized RNA: transcription initiation and Diels-Alder reaction. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 77297732.

207. Seelig В., Jiischke A. Ternary conjugates of guanosine monophosphate as initiator nucleotides for the enzymatic synthesis of 5'-modified RNAs. // Bioconjugate Chem. 1999. V. 10. P. 371-378.

208. Porter K., Tomasz J., Huang F., Sood A., Shaw B. N7-cyanoborane-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate is a good substrate for DNA polymerase.// Biochemistry. 1995. V. 19. P. 11963-11969.

209. Pljevaljcic G., Pignot M., Weinhold E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 3486-3492.

210. Arimondo P., Boutorine A., Francois J. Oligonucleotide conjugates targeted to single-stranded and double-stranded nucleic acids. // Recent Res. Devel. Bioconjugate Chem. 2002. N. l.P. 29-53.

211. Годовикова Т., Зарытова В., Халимская JL Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов. // Биоорганическая химия. 1986. Т. 12. С. 475-481.

212. Miller P. Preparation of psoralen-derivatized oligodeoxyribonucleotides methylphophonates. // Methods in enzymology. 1992. V. 211. P. 54-64.

213. Gottikh, M., Asseline, U. and Thuong, N. Synthesis of Oligonucleotides Containing a Carboxyl Group at Either Their 5'-End or З'-End and Their Subsequent Derivatization by an Intercalating Agent. // Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. P. 6657-6660.

214. Готтих М., Ивановская М., Скрипкин Е., Шабарова 3. Конструирование новых производных олигонуклеотидов, устойчивых к действию клеточных нуклеаз. // Биоорганическая химия. 1990. Т. 16. С. 514-523.

215. Fedorova О., Gottikh М., Oretskaya Т., Shabarova Z. Cyanogen bromide-induced chemical ligation: mechanism and optimization of the reaction conditions. // Nucleos. Nucleot. 1996. V. 15. P. 1137-1147.

216. Shabarova Z., Fedorova O., Dolinnaya N., Gottikh M. Derivatization and template-guided ligation of oligodeoxyribonucleotides using cyanogen bromide and N-substituted morpholines. // Origins Life Evol. 1997. V. 27. P. 555-566.

217. Годовикова Т., Зарытова В., Мальцева Т., Халимская JI. Активные производные олигонуклеотидов с цвиттер-ионной концевой фосфатной группой для конструирования аффинных реагентов и зондов. // Биоорганическая химия. 1989. Т. 15. С. 1246-1252.

218. De la Torre В., Albericio F., Saison-Behmoaras E., Bachi A., Eritja R. Synthesis and binding properties of oligonucleotides carrying nuclear localization sequences. // Bioconjugate Chem. 1999. V. 16. P. 1005-1012.

219. Ede N., Tregear G., Haralambidis J. Routine preparation of thiol oligonucleotides: application to the synthesis of oligonucleotide-peptide conjugates. // Bioconjugate Chem. 1994. V. 5. P. 373-378.

220. Corey D., Munoz-Medellin D., Huang A. Strand invasion by oligonucleotide-nuclease conjugates. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 93-100.

221. Soukup G., Cerny R., Maher J. Preparation of oligonucleotide-biotin conjugates with cleavage linkers. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 135-138.

222. Ермолинский Б., Михайлов С. Реакция периодатного окисления в химии нуклеиновых кислот. Диальдегидные производные нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов. // Биоорганическая химия. 2000. Т. 26. С. 483-504.

223. Kierzek R. Hydrolysis of oligoribonucleotides: influence of sequence and lenght. // Nucleic Acids Res. 1992. N. 20. P. 5073-5077.

224. Kierzek R. Structural considerations for the spontaneous cleavage of RNA. // Proceeding in Nucleic Acids and Molecular Biology. Artificial nucleases. M.A. Zenkova (Ed.). 2004. Springer-Verlag. V. 13. P. 33-48

225. Bibillo A., Figlerowicz M., Ziomek K., Kierzek R. The nonenzimatic hydrolysis of oligoribonucleotides VII. Structural elements affecting hydrolysis. // Nucleosides Nucleotides & Nucl. Acids. 2000. V. 19. P. 977-994.

226. Kierzek R. Nonenzymatic cleavage of oligoribonucleotides. // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 657-675.

227. Suck D., Saenger W. Molecular and crystal structure of 6-methyluridine. A pyrimidinc nucleoside in the syn conformation. // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 6520-6526.

228. Ziomek K., Kierzek E., Biala E., Kierzek R. The influence of various modified nucleotides placed as З'-danging end on thermal stability of RNA duplexes. // Biophys. Chem. 2002. V. 97. P. 243-249.

229. Ziomek K., Kierzek E., Biala E., Kierzek R. The thermal stability of RNA duplexes containing modified base pairs placed at internal and terminal positions of the oligoribonucleotides. // Biophys. Chem. 2002. V. 97. P. 233-241.

230. Chen X., Kierzek R., Turner D. Stability and structure of RNA duplexes containing isoguanosine and isocytidine. // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 1267-1274.

231. Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1992. N. 20. P. 5079-5084.

232. Tavale S., Sobell H. Crystal and molecular structure of 8-bromoguanosine and 8-bromoadenosine, two purine nucleosides in the syn conformation. // J. Mol. Biol. 1970. V. 28. P. 109-123.

233. Cook P. in Antisense research and applications. // Eds. S.T. Crooke and B. Lebleu. CRC. Boca Raton. 1993.

234. Helene C., Tulme J. Oligonucleotides. Antisense inhibitors of gene expression. // Ed. J.S.Cohen.Macmillan Press. London. 1989.

235. Mukaiyma T. An application of organic phosphorus in the peptide and nucleotide synthesis. // Phosphorus, Sulfur and Silicon. 1076. V. 1. P. 371-387.

236. Кнорре Д., Биченкова E., Ковши, В., Алексеев П., Кнорре В., Нордхоф Э., Годовикова Т. Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами // Биоорг. Химия. 1998.Т. 24. N. 9. С. 663-669.

237. Zarytova V., Sergeev D., Godovikova Т. Synthesis of bleomycin A5 oligonucleotide derivatives and site-specific cleavage of the DNA target. // Bioconjugate Chem. 1993. V. 4. N. 3.P. 189-193.

238. Лебедев А., Резвухин А. Закономерности изменений химических сдвигов ядер5 1фосфора в спектрах Р-ЯМР производных нуклеотидов. // Биоорг. химия. 1983. Т. 9. С. 149-185.

239. B.C. Богачев. Синтез дезоксинуклеозид-5-трифосфатов с использованием в качестве активирующего реагента три фторуксусного ангидрида. // Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 699-705.

240. Boutorine A., Grimm G., Helene С. Methods of Attaching Unprotected Oligonucleotides DNA-binding, Fluorescent, or Reactive Ligands for Synthesis of Antisense or Gene-directed Agents and Probes. // Molecular Biol. 2000. V. 34. N. 6. P. 804-813.

241. Чупахин О., Постовский И. Нукеофильное замещение водорода в ароматических системах. //Успехи химии. 1976. Н. 5. С. 908-937.

242. Чарушин В., Чупахин О. Превращения азинов под действием 1,3-бифункциональных нуклеофилов. //Успехи химии. 1984. Н. 10. С. 1648-1674.

243. Weissberger A. The Chemistry of Heterocyclic Compounds, 11. Phcnazines Interscience Publishers Inc. New York. 1957.

244. Дядюша Г., Пономарева Э. Об ориентации при нуклеофильном замещении в возбужденных молекул четвертичных солей азотистых гетероциклов. // Укр. Хим. Ж. 1963. Н. 29. С. 1279-1282.

245. Keller-Schierlein W., Geiger A., Zahner H., Brandl M. Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen. 251. Mitteilung. Die Esmeraldine A und B, tief grüne Farbstoffe aus Streptomyces antibioticus, Stamm Tü 2706. // Helv. Chim. Acta. 1988. 71. 2058-2070.

246. Шишкин Г. Диазабициклоалкаы с атомами азота в узловом положении. Сообщение 11*. Синтез дибензо \Ь,е.-\А- диазабицикло2.2.2]октадиена. // Хим. Гетероцикл. Соедин. 1984. Н. 10. С. 1407-1411.

247. Kisfaludy L., Roberts J., Jonson R. Synthesis of N-carbobenzoxyamino acid and peptide pentafluorphenyl esters as intermediates in peptide synthesis. // J. Org. Chem. 1970. V. 35. P. 3563-3565.

248. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // Мир. Москва. 1976.

249. Абрамова Т., Васильева С., Иванова Т., Шишкин Г., Силышков В. Мономеры для олигонуклеотидного синтеза с линкерами, несущими рсакционноспособные остатки.

250. Синтез производных дезоксинуклеозидов с метоксиоксалиламидными группами, присоединенными к гетероциклическим основаниям. // Биоорган. Химия. 2004. Т. 30. N. 3. С. 254-263.

251. Borer Р. // Handbook of biochemistry and molecular biology. Ed. Fasman G. CRC Press. 1975. V. 1.