Конструирование нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.113.4

ЛЕБЕДЕВА Ирина Владимировна

КОНСТРУИРОВАНИЕ НЕРАДИОАКТИВНО МЕЧЕННЫХ ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ НА БАЗЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор З.А.Шабарова;

кандидат химических наук, ст.н.с.М.Г.Ивановская.

Официальные оппоненты: доктор химических наук В.К.Потапов

кандидат биологических наук Н.О.Калинина

Ведущая организация - Всероссийский медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук

Защита состоится "28"сентября 1993 года в часов на

заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном .Университете им.М.В.Ломоносова по адресу:119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан

августа 1993 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Д.Г.СмирноЕа

Общая характеристика работы.

Актуальность работы. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот (НК) является уникальным по простоте и специфичности методом, позволяющим выявлять заданные последовательности в структуре НК. Именно поэтому он получил широкое распространение не только в научных исследованиях, но и при решении практических задач. Наиболее перспективным оказалось применение его для диагностики вирусных, инфекционных, генетических заболеваний, детекции различных патогенов и бактерий внешней среды, генотипирования и фингерпринтинга ДНК (в медицине, криминалистике и сельском хозяйстве).

Существующие к настоящему моменту методы анализа НК основаны на использовании радиоактивных зондов, что существенно одерзмвает широкое внедрение метода молекулярной гибридизации в практику. Поэтому весьма актуальным представляется совершенствование методов получения нерадиоактивно меченных гибридизациояных зондов, разработка систем нерадиоак-тиеной детекции таких зондов, а также создание быстрых и удобных схем диагностики с их использованием.

Описанные в литературе методы нерадиоактивной диагностики сложны и недоступны для широкого применения в отечественной практике. В связи о этим дальнейшая разработка удобных л доступных нерадиоактивных диагностических методов остается на сегодняшний день вазкной и перспективной задачей.

Наиболее перспективными для практического применения в качестве пибридизационных зондов представляются синтетические олигонуклеотиды, благодаря их высокой специфичности и легкости синтеза и мечения.

Проблеме получения нерадиоактивно меченных зондов на основе синтетических олигонуклеотидов и отработке методологии их использования для создания гибридизациояных диагностикумов посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы явилось создание общих химических и методологических подходов к конструированию нерадиоактивно меченных гибри-дизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезокеирибонук-леотидов. Для решения этой задачи необходимо было, во-первых, выработать химические подходы, позволявшие путем пост-синтетической модификации получать на Сазе готовых синтетических олигонуклеотидов зонды с различными нерадиоактивнкми метками. Во-вторых, разработать методологию использования полученных нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов в гибридизациокном анализе, включая подбор услое;:?. гибридизации

- г -

и нерадиоактивной детекции гибрида. И, наконец, мы хотели показать возможность применения разработанной методологии при конструировании диагностикумов для выявления вироидных заболеваний растений, точечных мутаций р-глобинового гена человека, а также для создания системы нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в качестве универсальной базы для создания нерадиоактивных гибридизационных диагностикумов предложена общая химическая методология получения оли-гонуклеотидных гибридизационных зондов, несущих нерадиоактивные метки различного типа. Отработаны новые методики получения биотинилированных и флуоресцентно меченных олигонуклеотидов, позволяющие, в отличие от использовавшихся ранее, получать требуемые соединения с количественным выходом. Оптимизирована методика детекции биотинилированных олигонук-леотидных зондов в дот-гибридизационном анализе. Отработанные условия позволяют надежно детектировать I нг анализируемой ДНК за 3 часа анализа.

Предложены три новых метода получения фермент-меченных зондов, являющихся ковалентными конъюгатами олигонуклеотидов с ферментами -щелочной фосфатазой (!!№) и пероксидазой хрена (ПОХ). Отработана методология использования этих зондов в гибридизационном анализе НК без выделения их из реакционной смеси после синтеза.

Для выявления вироидных заболеваний картофеля и хризантем предложена 26-звенная олигонуклеотидная последовательность, универсальная для вироида веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем. На основе этого зонда, меченного биотином, создан гибридизацион-ный диагностикум. Проведена апробация гибридизационной тест-системы и показана ее пригодность для широкомасштабного и быстрого выявления•ви-роидов в клеточных культурах растений.

Для диагностики точечной мутации ГУБ 1-110 р-глобинового гена человека, вызывающей р-талассемию, были подобраны оптимальные структуры олигонуклеотидных 19-звенных зондов. На основе этих зондов, меченных биотином и ПОХ, и в сочетании с амплификацией ДНК методом голимеразной цепной реакции (ПЦР) был создан диагностикум. Впервые для диагностики этой мутации были применены биотинилированные зонды.

Для определения точечных мутаций р-глобинового гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию, впервые в нашей стране был разработан диагностикум на основе биотинилированных аллель-специфичных олигонуклеотидов в сочетании с методом ПЦР.

Предложен универсальный диагностикум для определения точечных мутаций р-глобинового гена, основанный на методе обратной гибридизации. Методика позволяет проводить массовый скрининг клинических образцов, банков крови и т.п., в том числе на множественные мутации.

Впервые для генетической паспортизации растений применен метод нерадиоактивного олигонуклеотидного фингерпринтинга. Оптимизированы и сравнены методики нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений в геле и на мембранах с использованием биотинилированного 15-звенного олиго-нуклеотида.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, I находится в печати. Материалы диссертации докладывались на 2-ой международной конференции по фингерпринтингу ДНК, Бело Оризонте (Бразилия), 1992.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 2-Я страницах машинописного текста и содержит 42 таблиц, /У рисунков и список цитируемой литературы ( 358 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный новым направлениям использования нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов в анализе НК. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья - экспериментальная часть.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка общей методологии получения нерадиоактивно меченных зондов на базе синтетических олигонуклеотидов.

Для получения нерадиоактивно меченных зондов мы выбрали стратегию пост-синтетической модификации олигонуклеотидов. Такой подход показался нам наиболее целесообразным, так как его использование позволяет нам на основе одного и того же синтетического олигонуклеотида получать зонды с различными метками, а также разрабатывать разные схемы гибри-дизационного анализа.

За основу разработки технологии нерадиоактивного мечения зонда мы взяли методы селективной модификации концевого фосфата олигонуклеотидов, поскольку в этом случав меньше всего нарушаются комплементацион-ные свойства зонда. В своей работе мы воспользовались методами постсинтетической модификации, хорошо разработанными в нашей лаборатории.

Стратегия нерадиоактивного мечения заключается в том, что в оли-гонуклеотид вводится функциональная группа, отличащаяся по своим

свойствам от всех функциональных групп олигонуклеотида. На следующей стадии синтеза эту группу используют для специфичного присоединения метки к зонду. Для введения аминогруппы мы использовали диамины, для введения карбоксигруппы - аминокислоты, для введения тиольной группы -тиол-содержащие аминокислоты или пептиды. Активацию фосфата проводили карСодиимидным методом и методом М-оксибензотриазоловых (Ы-НОВТ) эфиров.

В качестве меток для зондов мы выбрали биотиновую и флуоресцентную в силу их небольшого размера, простоты детекции и некоторых особенных свойств, о которых будет сказано ниже. Биотинилированные зонды стабильны. Технология их проявления, основанная на свойстве биотина образовывать прочные комплексы с белками авидином и стрептавидином, хорошо отработана и не требует сложного оборудования. Еиотин-авидшо-вая система детекции обусловливает универсальность биотинилированных зондов, так кок дает возможность присоединять к зонду метки любого типа в кокъюгате со стрептавидином (флуоресцентную, ферментативную и т.п.). Высокая чувствительность детекции этих меток достигается за счет присоединения к стрептавидину нескольких маркирующих групп.

Флуоресцентно меченные зонды тоже стабильны и легко детектируются. Однако из-за сравнительно низкой чувствительности детекции таких зондов наиболее целесообразно их использовать в сочетании с методом амплификации ДНК. Важное достоинство флуоресцентных меток - возможность использовать в одном анализе несколько красителей, различающиеся длинами волн возбуждения и флуоресценции.

Для получения олигонуклеотидяых производных с биотинсм и флуорес-иеином мы синтезировали аминоалкиламидное производное олигонуклеотида, которое далее ацилировали активированными производными соединений-маркеров по схеме:

Л н2м(сн2)2ин2 Л П'-Х Л

гг-о-р-он -> Р-О-Р-МНКСНзЭзМНг -» R-0-P-^IH(CH2)2NH-R'

о" 0ЭС о- ^ о"

где К - остаток олигонуклеотида;

СН3

СН3 + 1

scn

X

-N=C=S

или -с-о

о

или -1

Аминоалкиламидное производное (I) было получено нами методом конденсации под действием 1-этил-3,3'-диметиламшопропилкарбодиимида (EDC). Анализ полученного соединения электрофорезом в 20% ПААГ показал, что выход соединения (I) количественный (рис.1), поэтому после обессоливания мы ацилировали его без выделения из реакционной смеси. В качестве ацилирущего агента мы использовали имидазолид биотина, РИС, N-оксисукцинимиднне эфиры производных биотина и (флуоресцентных красителей. Концентрация ацилирущего агента в реакционной смеси составляла 50-100 мМоль, рН 9.0-10.0. Для получения целевых соединений с количественным выходом реакцию с имидазолидом биотина проводили 10 час, с остальными активированными производными - 3 часа. Продукты реакции анализировали электрофорезом в ПААГ или методом ион-парной хроматографии. Количественные выходы биотинилированных и флуоресцентно меченных оли-гонуклеотидов (рис.1) позволяют использовать их в дальнейшем в качестве гибридизационных зондов или амплификационных праймеров без выделения из реакционной смеси.

Методы с использованием N-оксисукцинимидных эфиров и изотиоциана-та более просты экспериментально по сравнению с имидазолидным методом и не требуют приготовления ацилирущего агента перед реакцией. В то же время имидазолидный вариант активации является хорошей альтернативой, когда коммерческие препараты N-оксисукцинимидных эфиров или изотиоциа-натов по каким-либо причинам недоступны.

1 2 3 4 5 6 7

- 6 -

ХС

Рис Л. Электрофореграмма б 20% денатурирущем ПААГ исходного 23-звенного олигонукле-отида (дорожка I) и реакционных смесей, образующихся при синтезе его производных с этилендиамином (2), биоти-ном (3), глутатионом (4), аьамино-энантовой кислотой (5), 5'-карбокси~ флуоресцеином (Б), 6-карбокситетраме-тилродамином (7).

Стрелками обозначено положение красителя-маркера ксиленцианола (ХС).

i 2 Ъ к 5 & 7

А

i S 3 4 5 67_

БРВ

Рис.2. Электрофореграмма в 12% денатурирущем ПААГ по Лэммли реакционных смесей, образующихся при получении ковалентных конъюгатов олигонуклеотид-ЩФ и олигонуклеотид-ПОХ. А - вид геля в УФ-евете, Б - вид геля после прокрашивания раствором кумасси G-250. Дорожки Г, 4 и 7 - контроли исходного олигонуклеотида и ПОХ соответственно, дорожки 2 и 6 - эквимолярные смеси исходного олигонуклеотида с ЩФ и ПОХ соответственно, дорожки 3 и 5 -реакционные смеси с lit? и ПОХ.

Стрелками обозначено положение маркера красителя бромфенолового

оинего -'ртр,).

2. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с ферментами.

Высокая чувствительность детекции фермент-меченных зондов делает перспективным их использование в гибридизационном анализе. Обычно фермент присоединяют к зонду посредством биотин-авидиновой системы. Однако прямое присоединение фермента позволяет упростить процедуру детекции образующегося гибрида и может быть полезным в тех случаях, когда нельзя использовать биотинилированные зонда (например, при гибридизации в образцах тканей).

Для получения конъюгатов мы использовали ЩФ и ПОХ. Эти ферменты обладают высокой каталитической активностью и достаточно стабильны в условиях гибридизационного анализа. Мы присоединяли ЩЕ и ПОХ к олиго-нуклеотиду либо непосредственно по концевому фосфату, либо через спей-серную группировку с активной функциональной группой (-БН, -СООН).

2.1. Ковалентное присоединение ПОХ и № по концевой фосфатной группе олигодезоксирибонуклеотида.

Для прямого присоединения ЩФ и ПОХ по концевой фосфатной группе олигодезоксирибонуклеотида мы использовали два разработанных нами метода: с использованием водорастворимого EDC и N-H0BT эфиров.

EDC является очень удобным конденсирующим агентом для получения производных олигонуклеотидов с различными аминосоединениями. При этом реакция протекает в водной среде в мягких условиях и достаточно быстро, не затрагивая гетероциклических оснований олигонуклеотида. Мы опробовали эту реакцию для получения конъюгатов олигонуклеотид-фермент:

Ro—р—он ♦ h2n - фермент о

EDC

r-0—p—nh -| фермент о-

Нами были подобраны такие условия прямой конденсации З'-фосфорилиро-ванного олигонуклеотида с ферментом под действием водорастворимого ЕБС, которые исключают нежелательные побочные реакции, приводящие к снижению активности фермента или к модификации олигонуклеотида. Контроль активности фермента после реакции проводили спектрофотометричес-ким методом, используя для ЩФ реакцию гидролиза п-нитрофенилфосфата, а

для ПОХ - окисление о-дианизидина в растворе. Эксперименты показали, что активность ЩФ и ПОХ практически не изменяется в условиях синтеза конъюгатов.

Ковалентный характер связи в полученных коныогатах доказывали методом электрофореза в 12% денатурирующем ПААГ по Лэммли. По данным электрофореза в геле определяли также выход конъюгатов в расчете на исходный олигонуклеотид. Выход ковалентного конъюгата олигонуклеотида с ВД> количественный, а с ПОХ составляет более 60% (рис.2). Мы не определяли точное место присоединения олигонуклеотида к ферменту, поскольку при синтезе гибридизационных зондов главной задачей является образование ковалентной связи между двумя молекулами при условии сохранения ферментативной активности.

В подобранных нами условиях фермент-меченные олигонуклеотида получаются с высокими выходами, позволяющими использовать полученные конъюгаты в гибридизации без выделения из реакционной смеси.

Второй метод присоединения Щ® и ПОХ напрямую по концевой фосфатной группе олигонуклеотида основан на использований метода N-оксибензотриазоловых эфиров:

r-o-p-oh 1_ о

но +

N-

V

Л

EDC

r-o-p-o

I

О

к.

h2n - фермент

SN

(И)

о

r-o-p-nR - фермент

Полученный на первой стадии синтеза 11-оксибензотриазоловый эфир (II) эффективно фосфорилирует непротонированную аминогруппу соединений с образованием соответствующих фосфоамидов. При этом концентрация амин-ной компоненты (т.е. коныогируемого белка) может быть достаточно низкой без снижения эффективности реакции. Реакция аминогрупп фермента с Н-оксибензотриазоловым эфиром олигонуклеотида происходит в очень мягких условиях, благодаря чему активность фермента после коныогирования не снижается. Мы изучали реакцию фосфорилирования белков Ы-оксибензо-триазоловыми эфирами олигонуклеотидов в условиях катализа 11-метилими-дазолом, в нейтральном НЕРЕБ буфере и в щелочном ТЕАВ буфере. Продукты

реакций анализировали в ПААГ в денатурирующих условиях. Для получения конъюгатов со ЩЕ наиболее эффективна реакция в Ы-метилимидазольном буфере, выход конъюгата при этом количественный. Максимальный выход конъюгата олигонуклеотида с ПОХ составляет 30% и наблюдается для реакции, проводимой в 0,2 М НЕРЕЕ-буфере (рН 8,26).

Реакции присоединения Щ5 по концевой фосфатной группе олигонуклеотида в обоих случаях более эффективны, чем реакции присоединения ПОХ. Вероятно, это можно объяснить тем, что в ЩФ есть несколько аминогрупп, хорошо доступных для реакции с активированным фосфатом олигонуклеотида. В молекуле ПОХ есть только две аминогруппы, которые могут реагировать с олигонуклеотидом, к тому же доступ к ним реагирующих групп затруднен. В случае реакции ферментов с Ы-оксибензотриазоловым эфиром (II) вначале последний, видимо, гидролизуется до активированного интермедиата, который далее может реагировать с аминогруппами ферментов. Доступные аминогруппы ЩФ легко вступают в реакцию, и лучший выход достигается в условиях нуклеофильного катализа 1}-метилимидазолом, когда происходит наиболее быстрый и эффективный гидролиз соединения (II). В случае реакции с труднодоступными аминогруппами ПОХ быстрый гидролиз соединения (II), наоборот, невыгоден, и реакция максимально эффективна при проведении ее в НЕРЕЗ-буфере ( рН 8,26) (т.е. в-том из трех случаев, когда гидролиз активированного эфира идет медленнее).

2.2. Ковалентное присоединение ЩФ и ПОХ к олигодезоксирибонуклеотиду через спейсерную группу.

Вторая предложенная нами схема присоединения 1Щ> или ПОХ предусма-тптдрярт рредение по концевому фосфату олигодезоксирибонуклеотида спей-сорной молекулы, содержащей сульфгидрильную или карбоксильную группы. Эти функциональные группы на следующей стадии синтеза реагируют с ферментом. Введение спейсерной группировки, во-первых, позволяет пространственно разделить олигонуклеотид и белок, что может оказаться полезным для дальнейшего использования полученных зондов в гибридизации, и, во-вторых, дает возможность применять различные методики синтеза.

В качестве спейсерных группировок мы выбрали глутатион (И1;) -трипептид С1и-Суз-Иу, содержащий три реакционноспособные группировки (аминную, сульфгидрильную и карбоксильную), - и и-аминоэнантовую кислоту (ш-АЭК), содержащую две функциональные группы (аминную и карбоксильную). Для введения обеих спейсерных групп мы использовали метод И-оксибензотриазоловой активации фосфата, позволяющий селективно полу-

чать производные олигонуклеотидов с полифункциональными соединениями по наиболее нуклеофильной - аминной груше.

R-0-P-0—N I I

COOH

I

h,n-Clt-sh

h2n(ch2)ecooh

0 COOH

II I

r-o-p-hn-Clt-sh

1

О

(III)

r-o—p—hn—(ch,)e-cooh

L

0 (IV)

При этом не требуется дополнительной защиты сульфгидрильной и карбоксильной групп, необходимых для последующего присоединения фермента. Электрофорез продуктов реакций в 20Ж денатурирующем ШУГ показал, что выход глутатионового 'производного (III) составляет 70 - 9ОТ, а выход производного (IV) с шАЭК - количественный (рис.1).

Для выделения (III) пользовались электрофорезом в 20Ж ПААГ. Далее производные (III)-(IV) использовали для дальнейшего коньюгирования с ферментом при помощи сульфгидрильной и карбоксильной групп.

Присоединение фермента по сульфгидрильной груше осуществляли путем обработки глутатионового производного (III) предварительно модифицированными ЩВ и ПОХ:

0 соон II I

r-0-p-hn-Glt-sh +

1

О" (III)

bi—сн2—с—nh -

фермент

соон

R-o4pm-Glt-s-CH2-c-NH -| фермент о" (V)

Вначале фермент обрабатывали Н-оксисукцинимидным эфиром бромук-сусной кислоты по стандартной методике, обессоливали гель-фильтрацией на биогеле Р-2 и прибавляли к раствору производного (III). В результате происходило алкилирование фермантом сульфгидрильной групш глута-тиона с образованием конъюгата (V). Реакция протекает в мягких условиях, не влияющих на активность фермента, что было подтверждено конт-

рольными экспериментами. Электрофорез реакционных смесей в 12" ПААГ гю Лэммли показал для обоих ферментов близкие к количественным выходы конъюгатов.

Присоединение ПОХ и Щ5 по карбоксильной группе полученных производных (III) и (IV) проводили под действием водорастворимого EDC:

о

r-0-p-hn-GIt-cdoh 1_ о

0

R-O-P-HN (сн2 ) .соон

1

О

h2n - фермент

ЕБС

h2n - фермент

EDG

R-O-P-HN-Glt-C-HN ■ О

фермент

R-o—р—hn(сн2)ес—HN - фермент о"

Условия карбодиимидной активации карбоксильной группы, не снижающие активность ферментов, следующие: 0,1 М концентрация ЭДК, рН 4-4,5, время реакции 3-4 часа при +8°С. Фермент брали в 10-кратном избытке по отношению к олигонуклеотиду (концентрация фермента Ю-4 М). Выход конъюгатов с ПОХ и Щ5, по данным электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли, составил 80-90%.

Таким образом, нами были предложены два подхода для синтеза кова-лентных конъюгатов олигонуклеотид-белок: напрямую по концевому фосфату олигонуклеотида и через спейсерную группировку. Подобраны условия, позволяющие получать выходы конъюгатов, близкие к количественным. Методы просты и эффективны, активность ферментов при такой обработке не снижается. Оба подхода используют для образования ковалентной связи в коныогате аминогруппы белка, то есть группы, доступные для модификации практически в любом белке. Следовательно, предлагаемые нами методы позволяют получать конъюгаты олигонуклеотидов с широким кругом белков, в том числе для получения конъюгатов с другими ферментами-маркерами для использования в гибридизационном анализе. Далее, используемые нами активированные соединения можно использовать в качестве аффинных реагентов при изучении любых белков, узнающих НК, для исследования структуры и механизма действия белков нуклеинового обмена, факторов транскрипции и трансляции. На основе разработанных нами методологий можно получать также олигонуклеотидные реагенты для использования в антисен-совой технологии.

3. Использование полученных нарадиоактивно меченных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе.

Нерадиоактивно меченные олигонуклеотида использовали в качестве зондов для гибридизационного анализа по наиболее простой и удобной дот-схеме, позволяющей проводить полуколичественное определение исследуемой ДНК. Все условия гибридизации, отмывки и детекции зонда определяли на модельной системе, в которой мишенью являлась ДНК фага М13, закрепленная на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах, а в качестве зондов использовали олигодезоксирибонуклеотиды с1(САСССТ0СССастСТ)р (V), (1 (АСТСАССАССТТСТААААСС)р и <КССАСТСАСОАС(;ТТОТААААССА)р (VI), комплементарные этой ДНК и меченные биотином, флуоресцеином, родамином, ЩФ и ПОХ. На этой системе мы сравнивали чувствительности детекции всех исследуемых типов зондов.

Детекцию биотинилированных зондов осуществляли с помощью комплексов стрептавидин-Щ5 и стрептавидин-полимеризованная ПОХ, флуоресцентные зонды детектировали визуально, используя источник возбуждения флуоресценции с длиной волны излучения 500 нм для производных флуоресцеи-на и 550 нм для производных родамина. Для определения и ПОХ использовали колориметрическую детекцию скорости реакции гидролиза субстратов тетразолиевого нитросинего (КВТ) и 3-бром-4-хлор-5-индолилфосфата (ВИР) и реакции окисления о-дианизидина, соответственно.

3.1. Отработка схемы дот-гибридизационного анализа для нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов.

Для проведения дот-гибридизации ДНК фага М13, нанесенную на нит-роцеллюлозную или нейлоновую мембраны, закрепляли Уа^облучением в течение 2-3 мин. Далее проводили прегибридизацию фильтров I час при температуре гибридизации в гибридизационном буфере, не содержащем зонда. Мы показали, что стадия прегибридизации не влияет на уровень неспецифического связывания зонда. Однако чувствительность детекции гибрида после ее проведения была выше. Это говорит о том, что проведение стадии прегибридизации повышает эффективность образования комплекса зонд-мишень.

После прегибридизации мембраны с закрепленными на них ДНК инкубировали в гибридизационном буфере, содержащем меченые зонды. В контрольных экспериментах образование и сохранность гибридного дуплекса на всех стадиях анализа подтверждали с использованием зондов, меченных,

помимо 3'-концевой нерадиоактивной метки, ■32Р по 5'-концу.

Температура гибридизации (Тгийр ) с радиоактивно меченным олиго-нуклнотидом определяется по эмпирической формуле:

Т„„л = Т - 5°С, где Т = 2 (А + Т) + 4(й + С), гибр пл ' 14 пл. 4 ' 4 '

Проведенные нами эксперименты показали, что при использовании нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов температуру гибридизации следует снизить еще на 5°С, поскольку введение в зонд довольно большой молекулы-метки может частично дестабилизировать образовавшийся гибридный дуплекс.

Для выяснения оптимального соотношения концентрации зонда и времени гибридизации мы провели серию экспериментов. Для нас это было важно еще и потому, что фермент-меченные зонды не выдерживают длительной гибридизации и инактивируются. Кроме того, концентрация зонда и время гибридизации оказывают влияние на величину фона, вызванного неспецифическими взаимодействиями зонда с мембраной. Нами было установлено, что для эффективной гибридизации оптимальными являются концентрация зонда 2 пмоль/мл и 2 часа гибридизации. Если количество зонда ограничено (в случае проведения большой серии экспериментов или при необходимости использовать большие объемы буфера), эффективная гибридизация достигается при концентрации зонда 0.2 пмоль/мл, при этом время гибридизации увеличивается до 16-20 час. В случае же ограничения реакции во времени (использование ферментативных зондов) до 30-40 мин, концентрация зонда должна быть повышена до 10 пмоль/мл. Во всех трех случаях эффективность гибридизации примерно одинаковая.

Гибридизация биотинилированных зондов с ДНК фага М13 является высокоспецифичной: даже 100-кратный избыток негомологичной ДНК не обнаруживается с помощью используемых биотинилированных зондов.

После гибридизации мы проводили отмывку мембран от неспецифически связавшегося зонда. Говоря о неспецифической сорбции зонда, следует подчеркнуть, что для нитроцеллюлозы она ниже, чем для нейлона, из-за отрицательных зарядов, имеющихся на нитроцеллюлозе в силу ее химической природы. Однако эффективность гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах так же ниже, видимо, по той же причине (зонд как бы отталкивается от отрицательно заряженной поверхности).

Мы подобрали такие условия проведения отмывок, которые полностью позволяют удалить неспецифически связавшийся зонд с поверхности как нитроцеллюлозных, так и нейлоновых мембран. Мы обнаружили, что при ги-

бридизации и последующих отмывках суммарная концентрация солей в буфере должна быть не ниже 0.S М, при более низких концентрациях гибридный дуплекс неустойчив и частично распадается. После отмывок мы проводили детекцию образовавшегося гибрида на мембранах.

Чувствительность-гибридизационного анализа определяется соотношением сигнала, получаемого от метки, и фона. В нашей система основным видом неспецифической сорбции является связывание авидина или стрепта-видина с мембраной, с неспецифически связавшимся биотинилированным зондом, а также связывание с мембраной белков-меток - ПОХ и

Для предотвращения неспецифической сорбции белков мы обрабатывали (блокировали) мембраны специальным составом, препятствующим связыванию белков с мембраной. При подборе условий блокировки мы сравнивали бло-кпрущ*» действие BSA, Tween 20, казеина, желатина и варьировали состав буфера, время и температуру обработки мембран (табл.1). Для нит-роцеллвлозных 'фильтров достаточно проводить более слабую блокировку, чем для нейлоновых (таЗл.1). После стадии блокировки проводили коныо-гироьание биотина в составе гибрида со стрептавидином и отмывки неспецифически сорбировавшегося белка.

Так*"« образе;»;, для предотвращения появления i^jChs при детекции Си— отинилированных зондов необходимы тщательная отмывка зонда после гибридизации, блокировка мембран (табл.1) и отмывки после стадии конъюги-рования со стрептавидином.

Гибридизацию флуоресцентных зондов проводили так же, как и биоти-килироьанных. На стадии детекции флуоресцентные зонды не требуют блокировки мембран, поскольку их неспецифическое связывание с мембранами незначительно, а детектируются они визуально.

Сравнение гибридизации флуоресцентно меченных зондов на нитроцеллюлозе и нейлоне показало сильное гашение сигнала для нитроцеллюлозных фильтров. Поскольку проблема фона для флуоресцентных зондов в нашем случае практически не существует, мы рекомендуем для дот-гибридизационного анализа с их применением' и пользовать нейлоновые фильтры.

Таблица 1.

Условия блокировки разных типов мембран при гибридизации с различными типами нерадиоактивно меченных зондов

Тип мембраны Тип метки

биотин фермент

Нитроцеллюлоза Schleicher&ShuelI 3% желатина, 30 мин, Т комн. 3% желатина, 1% казеин, 30 мин, Т комн

Hybond С 3% желатина, 1% казеин, 30 мин, 30°С Ъ% желатина, 30 мин, 30°С

Hybond N 3% желатина, 1% казеин, 2 час, 30°С 5% же лапша, 2% казеин, 2 час, Т комн

Гибридизацию фермент-меченных зондов мы проводили в стандартном гибридизашонном буфере при концентрации зонда 10 пмоль/мл в течение 30-40 мин, чтобы фермент не инактивировался. Чтобы использовать в гибридизации конъюгаты олигонуклеотидов с ПОХ и ЩФ сразу после синтеза без выделения из реакционной смеси, мы подобрали такие условия детекции, в которых избыток белка в гибридизационной смеси не мешал бы определению гибрида (разбавление реакционной смеси в 100 раз перед добавлением в гибридизационный буфер и специальные разработанные нами условия блокировки мембран после прегибридизации, перед гибридизацией).

3.2. Сравнение чувствительности детекции различных типов нерадиоактивно меченных зондов.

Сравнение чувствительности определения нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов проводили при одинаковых условиях гибридизации и одинаковой концентрации зондана описанной выше системе ДНК фага MI3 с 23-звенннм олигодезоксирибонуклеотидсм (VI), меченным биотином, производными флуоресцентных красителей, 1И> и ПОХ. Детекцию зондов проводили, как описано выше. Полученные данные по чувствительности нерадиоактивно меченных зондов сравнивали с чувствительностью детекции

этого же Р-меченного 23-звенного олигонуклеотида (VI). Детекцию радиоактивного зонда проводили методом радиоавтографии. Полученные нами данные представлены в табл.2.

Таблица 2.

Чувствительность методов детекции ДНК в гибридизационном анализе (кроме фермент-меченных зондов)

Метка Метод детекции Чувствительность детекции зонда(пг Чувствительность детекции гибрида

32р радиоавтография о. 5 0,1 нг

биотин СА-ПОХ 5-20 I-IO нг

биотин СА-поли-ПОХ 0 5 I нг

биотин СА + био-Н№ 5-20 10 нг

биотин СА-Нф 5 5 нг

биотин СА-родамин loo 100 нг

TAMRA 2 DO 100 нг

TRITC BOO 200-250 нг

FITC 500 250 нг

РАМ 200 100 нг

Чувствительность детекции зондов снижается примерно на порядок при их использовании в гибридизационном анализе (по сравнению с чувствительностью детекции индивидуального зонда (табл.2)).

Использование биотин-авидиновой системы проявления позволило нам детектировать 1-10 нг ДНК (в зависимости от качества реагентов). Эти данные сравнимы с чувствительностью радиоактивных методов детекции в применяемых нами стандартных условиях работы (табл.2). Флуоресцентные зонды обладают более низкой чувствительностью - 100-250 нг ДНК. Мы рекомендуем использовать эти зонды в сочетании с методом ПЦР-амплифика-ции. Преимущество использования разных красителей для синтеза зондов заключается в возможности их одновременного применения в анализе.

Данные по чувствительности детекции разных типов ПОХ- и Щф-меченных зондов представлены в табл.3. Результаты экспериментов показывают, что зонды, меченные ферментом напрямую, по чувствительности не

уступают зондам, в которых фермент присоединен при помощи биотин-авидиновой системы. В то же время для проявления фермент-меченных оли-гонуклеотидов не требуются многократные стадии ксныогирования - отмывок, что упрощает процедуру детекции. В разработанных нами условиях неспещфгееская сорбция бежа не затрудняет детекции гибрида. Поэтому мы рекомендуем для создания различных диагностикумов использование зондов, являющихся конъюгатами олигонуклеотида с ферментами. Необходимо учесть, что во избежание частичной дестабилизации дуплекса зонды с ферментами, присоединенными напрямую по фосфату, должны иметь длину не менее 20 звеньев, более короткие зонды следует получать с использованием спейсерных группировок (табл.3).

Таблица 3.

Сравнение чувствительности детекции ДНК с помощью полученных разными методами конъюгатов олигонуклеогид-фермент.

Щелочная фосфатаза Пероксидаза хрена

Метод Олигонуклеотида: Олигонуклео тиды:

(VII) | (VIII) (VII) | (VIII)

EDO по концевому фосфату - I нг - I нг

HOBT по концевому фосфату - 30 нг - 60 нг

EDC по карбоксилу соАЭК 100 нг 50 нг 100 нг 100 нг

EDC по карбоксилу Git 50 нг 10 нг 50 нг 50 нг

по сульфгидрильн.группе Git 50 нг 10 нг 100 нг 10 нг

4. Использование разработанных методов введения метки и схем гибридизационного анализа для конструирования целевых диагностикумов.

Зная объект и цель анализа (конкретную задача диагностики для данного объекта), мы выбирали наиболее подходящую схему гибридизации и метку для зонда. На данном этапе работы одной из наиболее важных является стадия подготовки образца: исследуемая ДНК (очищенная или из неочищенных образцов) обязательно должна быть денатурирована, поскольку гибридизация олигонуклеотидного зонда с двутяжевой неденатурированной ДНК очень низкоэффективна. Для повышения чувствительности анализа очень удобно амплифицировать исследуемую ДНК.

4.1. Создание универсального диагностикума для детекции вироидных заболеваний картофеля и хризантем.

Ранее для диагностики вироидов - инфекционных агентов, вызывающих заболевания растений и состоящих только из РНК, - использовались трудоемкие и малочувствительные методы растений-индикаторов и электрофореза в ПААГ. Для широкомасштабной диагностики вироидов наиболее перспективным является метод молекулярной гибридизации НК. С целью создания гибридизационного диапностикума для определения вироидов веретено-видности клубней картофеля (ВВКК) и карликовости хризантем (ВКХр) мы выбрали 26-звенную олигонуклеотидную последовательность, универсальную для обоих вироидов: (КАССТТСАСТТСТТТССАСССССТАИЧр, и опробовали ее в качестве гибридизационного зонда. Полученный зонд биотинилировали по разработанной нами методике.

Исследуемую суммарную фракцию НК, выделенную из листового материала картофеля и хризантем, а также чистые препараты ВВКК и ВКХр наносили на нитроцеллюлозный фильтр. Гибридизацию с биотинилированным зондом, взятом в концентрации I мкмоль/смг фильтра, проводили в течение 20 часов при температуре 37°С. Отмытый фильтр блокировали в растворе бычьего сывороточного альбумина. Детекцию образовавшегося гибрида проводили двумя способами: либо фильтр постадийно обрабатывали стрептави-дином, а затем биотинилированной ЩФ, либо использовали конъюгат стреп-тавидин~ЩФ. Для проявления ЩФ фильтр инкубировали в растворе, содержащем ГОТ и ВИР.

При использовании биотинилированного зонда оказалось невозможным диагностировать наличие вироидов непосредственно в клеточном соке растений,. нанесенном на мембрану, так как клеточный сок имеет такую же окраску, как и продукты реакции ЩХ> с ШГ и ВИР. Поэтому для проведения анализа необходимо наносить на фильтр уже выделенную из клеточного сока суммарную РНК.

Метод прямой детекции с использованием конъюгата стрептавидин-ЩФ позволяет определять 0,65 нг ВВКК или ВКХр, тогда как для метода с по-стадийным использованием стрептавидияа и биотинилированной ЩФ чувствительность детекции составляет 3,2 нг вироида.

Таким образом, общая методология конструирования нерадиоактивных диагностикумов для выявления вироидов картофеля и хризантем включает в себя выбор олигонуклеотидной последовательности зонда на основании изучения первичной структуры РНК исследуемого объекта, синтез и нера-даоактивное мечение зонда, отработку условий гибридизации и проявления

получающихся гибридов. Б целом предложенная методология нерадиоактивной диагностики универсальна, может быть применена для обследования большого числа объектов. Простота, технологичность и легкость предложенной методологии позволила легко внедрить ее в практику для широкомасштабного и быстрого выявления вироидов в клеточных культурах расте-!пй, что особенно важно при отборе посадочного материала.

4.2. Конструирование диагностикумов для определения точечных мутаций р-глобиномго гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию и р-тэлассемию.

Тестирование носителей точечных мутаций и пренатальная диагности-са вызванных этими точечными мутациями заболеваний являются особенно ¡ажной задачей здравоохранения и возможны только на основе анализа ШК. Один из методов, позволяющих напрямую определять столь малые ге-[етические нарушения, основан на дифференциальной гибридизации олиго-(уклэотидных зондов. Значительное упрощение метода, повышение его чув-:твительности и специфичности было достигнуто при использовании ПЦР.

№ разработали схемы гибридизационного анализа, позволяющие опре-;елять в амплифицированной ДНК, выделенной из крови, некоторые мута-ии, вызывающие серповидно-клеточную анемию и р-талассемию.

Для изучения замены Б -» А в ПО кодоне малого интрона (мутация УБ 1-110, вызывающая р-талассемию) фрагмент р-глобинового гена длиной 47 пар оснований был амплифицирован с помощью синтетических олигонук-еотидных праймеров. Диагностирование точечной мутации в амплифициро-анном фрагменте проводили с помощью 19-звенных олигонуклеотидных гиб-идизационных зондов: 5'- ААААТАСАССААТАСССАС-З' (VII) - для определе-ия нормальной ДНК) и 5'-САСССТАТТАСТСТАТТТТ-3' (VIII) - для определена мутантной ДНК. Первичная структура зондов была выбрана нами таким Зразом, чтобы максимально дискриминировать нормальную и мутантную эследовательности гена, основываясь на том факте, что более прочным зляется совершенный комплекс между олигонуклеотидом и ДНК, нежели змплекс с одной некомплементарной парой оснований.

Были обследованы образцы ДНК из крови гомозиготных и гетерозигот-IX больных р-талассемией. В качестве контрольных образцов были взяты И клонированных фрагментов нормального и мутантного р-глобинового ша. После амплификации образцов и нанесения их на мембраны проводили [бридизацию с нормальным и мутантным зондами, меченными биотином и >Х, взятыми в концентрации 2 пкмоль/мл. Температуру гибридизации

определяли по формуле: = 2(А + Т) + 4(С + С) - Ю°С (1), а для

того, чтобы дискриминировать нормальную и мутантную последовательности ДНК, подбирали особый температурный режим отмывок после гибридизации, при котором стабильными оставались только совершенные дуплексы. Для визуализации гибридов мы использовали реакцию ПОХ с о-дианизидином. Снижение неспецифической сорбции при использовании ПОХ-меченных олиго-нуклеотидов достигается 1000-кратным разбавлением реакционной смеси после синтеза и специальными разработанными нами условиями блокировки (табл.2). Образующийся при детекции фон, хотя и выше, чем в случае би-отинилированного зонда, тем не менее выявление, точечных мутаций с использованием этих приемов является эффективным. Еиотинилированные и ПОХ-меченные зонды позволяют специфично дискриминировать нормальные и мутантные аллели ДНК в I ш амплифицированного материала.

Для изучения мутаций р-глобинового гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию, участок ДНК в НО пар оснований был амплифицирован с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров. Для определения точечных замен С -» А в 5 кодоне и А •» Т в 6 кодоне р-глобинового гена мы использовали синтетические аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды, меченные по 3'—концу бистином: с!(СТССТААССАСААСА-АСТСТСС) (для определения мутации в 6 кодоне), сЦСТОСТСАССАСААСААСТСТСС) (для нормальной ДНК), ¿(СТССТОТССАСААСААОТСТСС) (для определения мутации в 5 кодоне).

После нанесения амплифицированных образцов ДНК гомозиготных и гетерозиготных носителей, а также ДНК здоровых людей на нейлоновые мембраны и после прегибридизации проводили гибридизацию мембран отдельно с каждым зондом, взятом в концентрации 50 нг/мл. Температуру гибридизации определяли по формуле (1). Для дискриминации аллелей использовали разный температурный режим отмывок. После отмывки мембраны блоюфо-вали (табл.2) и детектировали гибриды с помощью конъюгата стрептави-дин-ЩХ> и реакции ЩФ с КВТ и ВСГР.

Еиотинилированные зонды гибридизуются специфично: гомозиготные образцы дают сигнал только с одним из зондов, а гетерозиготные гибридизуются с нормальным, и с каким-либо из мутантных зондов.

Таким образом, общая методология диагностирования точечных мутаций методом прямой гибридизации включает в себя амплификацию образца ДНК, выбор последовательности зондов для четкой дискриминации аллелей, синтез и мечение зондов по разработанным нами методикам, подбор температурных условий гибридизации и отмывок для каждого зонда. Метод может быть применен для выявления любых точечных мутаций, вызывающих наслед-

ственные заболевания. Для анализа достаточно иметь I мкг исходной исследуемой ДНК.

Для одновременного диагностирования сразу нескольких точечных мутаций р-глобинового гена, вызывающих р-талассемию, а также для анализа большого числа образцов мы разработали диагностикум на основе метода обратной гибридизации. В работе использовались 6 олигонуклеотидных зондов: (VII) и (VIII) - для диагностики мутации IVS 1-110; d(GCAGGTTGGTATCAAGGTT)p и d(GCAGGTTGGCATCAAGGTT)p - для диагностики мутации IVS 1-6; d(CCTTGGACCCAGAGGTTCT)р и d(AGAACCTCTAGGTCCAA)p - для диагностики нонсенс-мутации в 39 кодоне. Эти зонды были иммобилизованы по разработанной нами методике через концевой фосфат на нейлоновую мембрану Biodyne А при помощи EDC. Участок анализируемой ДНК длиной в !6Э пар оснований амплифицирояали с помощью флуоресцентно меч-нчых олигонуклеотидных праймеров, полученных, как описано выше. Ампли^ици-рованную ДНК, содержащую флуоресцентную метку, денатурировали и гибря-дизовали в течение 16 час при 40°С с зондами, иммобилизованным;! на мембране. Посла отмывок проводили визуальную детекцию полученных гибридов. Амплифицированная ДНК гибридизуется специфично только с соот-г.úтствуíjiijTT'j* зондами, ;п,™о^;;л;;зовакБыж на мембране.

Иммобилизация нескольких олигонуклеотидов на одной и той же мембране позволяет выявлять в исследуемом образца ДНК наличие или отсутствие сразу нескольких мутаций. Использование флуоресцентно егеч^нккх ттраймеров для амплификации ДНК значительно упрощает анализ образцор благодаря исключению трудоемких стадий блокировки и проявления гибридов с помощью ферментативных коньюгатов. Разработанная методология монет применяться для массового скрининга клинических образцов.

4.3. Разработка метода нерадиоакгивного фингерпринтинга ДНК растений.

Фингерпринтинг ДНК, или геномная дактилоскопия, позволяет устанавливать различия индивидуумов на генетическом уровне за счет присутствия гипервариабельных повюрякщихся последовательностей ДНК в геномах эукариот. Мы разработали методику проведения нэрадиозктивного фингерпринтинга ДНК растений, пригодную для широкомасштабного использования в целях генетической паспортизации сортов и видов в селекционной работе.

Для еыяелрнил межвидовых и межсортовых отличий использовали ДНК разных сортов груш и яблонь и три 15-эьеншх олигонуклеотидных зонда: d (CAOGGIGGCGOCT^T >р (7), d(CACCCTCAGAGCCGC)p (IX), d(CAC)^p

- гг -

Все три зонда по 3'-концу были помечены Оиотином, а по 5'-концу - 32Р (для контроля за разными стадиями фингерпринтинга и за специфичностью гибридизации).

Образцы ДНК, обработанные эндонуклеазами рестрикции Alul и HiniT, разделяли в 0,7$ агарозном геле, после этого фрагменты ДНК в геле денатурировали и нейтрализовали. Для проведения гибридизации и детекции либо высушивали гель, либо ДНК из геля переносили на мембрану.

Для переноса фрагментов ДНК из геля на капроновую или нейлоновую мембрану использовали методику нисходящего переноса и иммобилизацию УФ-облучением 2-3 мин. Для предотвращения неспецифического связывания зонда с мембраной проводили стадии првгибридизации и блокировки мембраны. Блокировку проводили дважды - перед Гибридизацией и после нее. Блокирующий раствор содержал 1% казеина, 3% желатины и 0.05% Tween 20. Для гибридизации биотиншшрованный зонд брали в концентрации 20О нг/мл, температуру гибридизации определяли по формуле (1). После проведения отмывок проводили контроль за гибридизацией методом авторадиографии. Затем полученную мембрану инкубировали с раствором коньюгата стрептавидин-ЩФ и проявляли по стандартной методике.

Несмотря на двойную блокировку, из-за длительного проявлонял мембрана характеризуется повышенным фоном. Однако при использовании зонда (X) полученный дактоотпечаток позволял идентифицировать различия между близкими видами груш. Дактоотпечатки, полученные с применением зондов (Т) и (IX), гораздо менее информативны.

Альтернативный метод фингерпринтинга ДНК не требует переноса ДНК из геля. После денатурации ДНК, ее нейтрализации и отмывок гель высушивали в вакууме, после чего проводили гибридизацию, исключая стадии првгибридизации и блокировки, поскольку для агарозы отсутствует неспецифическая сорбция зонда и белков системы проявления. Для проявления гибрида гель после гибридизации инкубировали в течение 48 часов с конъюгатом стрептавидин-ЩФ. Такое длительное время инкубации объясняется тем, что конъюгат имеет болыш.э размеры и с трудом проникает в поры геля. Попытки использовать для проявления конъюгат стрептавидин-полимеризованная ПОХ были безуспешными, по-видимому, в силу той же причины: комплекс стрептавидин-полимеризованная ПОХ не входит в поры геля. Проявление обработанного конъюгатом геля проводили по стандартной методике в растворе NBT и BCIP. Дактоотпечатки, полученные на геле с использованием (X), также позволяют дискриминировать слабые отличия у геномов близких сортов груш.

Нами были отработаны условия проведения нерадиоактивного фингер-принтинга ДНК в геле и на нейлоновых мембранах (после переноса ДНК с геля) с использованием биотинилированных зондов. Оба метода позволяют дискриминировать различие близких сортов растений на генетическом уровне. Метод нерадиоактивного фингеряринтинга в геле с использованием биотинилированных зондов более прост экспериментально. Однако обработка гелей после гибридизации лимитируется размерами конъюгата, используемого для проявления. В целом, обе методики сравнимы по результатам.

ВЫВОДЫ

1. Разработана общая химическая методология получения олигонуклеотид-ных зондов, содержащих различные нерадиоактивные метки.

2. Отработаны эффективные методики получения олигонуклеотидных зондов, меченных биотином и флуоресцентными производными. Подобраны оптимальные .схемы их применения в дот-гибридизационном анализе и дана оценка чувствительности метода.

3. Предложены три новых типа конъюгатов олигонуклеотидов с ПОХ и Щ5. Разработаны методы их получения и схемы использования без выделения из реакционной смеси в качестве фермент-меченных зондов для гибри-дизационного анализа НК. Достигнутая при этом чувствительность детекции ДНК сравнима с чувствительностью , полученной при использовании биотин-авидиновой системы.

4. Разработан диагностикум для выявления вироидных заболеваний картофеля и хризантем на основе 26-звенного биотинилированного зонда. Проведена апробация диагностикума на базе СХА Латвии и на Приекуль-ской опытно-селекционной станции и показана его пригодность для широкомасштабного и быстрого выявления вироидов в клеточных культурах растений.

5. Для выявления точечных мутаций р-глобинового гена человека, вызывающих р-талассемию и серповидно-клеточную анемию, созданы гибридиза-ционные диагностикумы на основе биотинилированных и фермент-меченных аллель-специфичных олигонуклеотидов. Для одновременного определения нескольких мутаций в образце ДНК разработан диагностикум с использованием методов обратной гибридизации и ПЦР.

6. Отработаны методы нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений в геле и на мембранах с использованием биотинилированных олигонуклеотидных зондов. Показано применение разработанных методов для генетической паспортизации растений.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Мелдрайс Я.А., Друка А.Я., Лине И.Э., Ложа В.П., Ивановская М.Г., Романова Е.А., Лебедева И.В., Шабарова З.А. Использование синтетического олигодезоксирибонуклеотида для диагностики вироидных заболеваний картофеля и хризантем. // Молекулярн.биология. 1989. Т.23. С.816-821.

2. Мелдрайс Я.А., Лебедева И.В., Друка А.Я., Ивановская М.Г., Шабарова З.А., Гуркнович Т.И., Вирзниекс К.А., Кекс В.Г., Зейдака А.А. Определение вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и карликовости хризантем (ВКХр) с использованием биотинилированного олиго-дезоксирибонукле- олда. // Молекулярн.биология. 1991. Т.26. К 3. С.540-545.

3. Федоров А.Н., Расулов Э.М., Орецкая Т.С., Лебедева И.В., Ивановская М.Г., Шабарова З.А., Лимборская С.А. Тестирование мутации G - А в ПО положении малого интрона р-глобинового гена у больных талассе-мией из Азербайджана. // Мол.генетика, микробиология и вирусология.

ТППП ИТ ТП Oil

J-^JU. Jtu. . ^.ю-йй.

4. Лебедева И.В., Ивановская М.Г., Гуринович Т.И., Готтих М.Б., Мелдрайс Я.А., Шабарова З.А. Конструирование универсального биотин-содержащего олигонуклеотидного диагностикума для выявления вироидных заболеваний растений. // Биоорг.химия. 1993. T.I9. J6 9. С.894-904.

5. Лебедева И.В., Ивановская М.Г., Федоров А.Н., Лимборская С.А., Шабарова З.А. Новый метод нерадиоактивного мечения олигонуклеотидов и использование их в качестве аллель-специфичных зондов для выявления мутаций, вызывающих р-талассемию. // Молекулярн. биология. 1993. В печати.

6. Ovchlnnlkov I.V., Lebedeva I.V., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. DNA profiling for the paternity testing by "color" PCR oi Lome human VNTR loci and fluorescence detection. // Abstr. ША-fingerprln-tlng, Second Intl.Conf. Belo-Horlsonte. 1992. P.355.

7. lebedeva I.V., Samigullln Т.Н., Ovchinnikov I.V. Determination of molecular characteristics of apple-trees and pear-trees by oligonucleotide fingerprinting. // Abstr. DNA-flngerprlntlng, Second Intl.Conf. Belo-Horlsonte. 1592. P.356.