Синтез и свойства нерадиоактивно 5-меченных олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

^ л

-л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА и Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.113.G

КОРШУН Владимир Аркадьевич

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА НЕРАДИОАКТИВНО 5-МЕЧЕННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных , и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕ PAT

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в груше генетической инженерии ингерлейкнноз Института биооргавической химии им. М.М.Шемякина и С.А.Овчинникова РАЕ

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Берлин.Ю.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Потапов Б.К.

канд. химических наук Друца В.2.

Ведущая организация:

Институт молекулярной оиолсгш им. В.А.Зкгельгзрдта РАН

Зашита состоится " € " о^тя^рх 1993т. в I О часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте Сиоорганической химии им. М.М.Шемякина и . Ю.А.Овчинникова РАЕ по адресу: 117871 ГСП-7, Москва-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке Института биоорганической' химии им. М.М.Шемякина и В.А.Овчинникова РАН.

г С

Автореферат разослан " / " сшегяорд 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических ;«ук

В.А.Несмеянов

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В настоящее время наряду с относительно дешевыми и чувствительными изотопными методами мечення биомолекул вон более широкое применение находит нерадиоактивиое мвчение. Разработаны различимо неиэотошше метки, основными достоинствами которых являются большая экологической безопасность и практически неограниченный срок хранения. Норадиоактивно меченные олигонуклеотидц используются в анализе хромосомных де>|«ктов и диагностике молекулярных патологий. Кроме того, нерадиоактивно меченные олигонуклеотиди находят применение в стандартных молек,, лярно-биологических методах и почти везде могут заменить олигонуклеотиди с изотопной меткой. Например, флуоресцентное мече.ние лежит в основе методов автоматизированного секвенирования, которые, по мере совершенствования, позволят настолько увеличить скорость извлечения наследственной информации, что станет возможным решение масштабных проблем, подобных расшифровке первично!! структуры генома человека.

С нерадиоактивиши меткам;:' связаны перспективы автоматизации зондодиагностики. Важной проблемой является поиск эффективной системы прямой детекции гибридизации зондов в растворе. Один из подходов состоит в использовании присоединенных к олигонуклеотиду флуоресцентных меток, чувствительных к микроокружению. Такие зонды позволят количественно определять нуклеиновые кислоты не только с го-мощью экспрессного гомогенного анализа, но даже непосредственно в живой клетке.

Широкому применению нерадиоактивно меченных олигонуклеотидов препятствует громоздкость и дороговизна их синтеза. Некоторые зарубежные фирмы производят очень дорогие патентованию реагенты для получения нерадиоактивно меченных олигонуклеотидов. В нашей стране подобные реагенты не производятся.

Цель работы. Настоящая диссертация посвящена разработке, синтезу и изучению свойств реагентов для введеыя в олигонуклеотиды флуоресцентной (пиреновой) и аффинной (биотиновой) меток, а также разветвляющих реагентов, позволяющих проводит! .'.тожественное концевое мечение олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая значимость. В работе предложены новые эффективные реагенты для автоматизированного синтеза нерадиоактивно меченных олигонуклеотидов. Набор из нескольких реагентов позволяет в автоматическом режиме синтезировать большие серии

коньюгатов олигонуклеотид-метка с различной структурой. Впервые синтезированы олигонуклеотиды, модифицированные большим числом остатков пирена.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и границы практического использования" (Москва,1991), на 18-ом симпозиуме по хшш нуклеиновых кислот (Сендай,1991), на международном симпозиуме по нуклеиновым кислотам и мембранам в честь X, Г. Кораны (Ванкувер,1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трек глав, выводов и списка литературы, включающего работ. Работа изложена на 432 страницах, соде ришт 4 рисунка и 2 таблицы.

В первой главе обобщены и критически рассмотрены имеющиеся в литературе данные по методам синтеза олнгонуклеотидов с реакционно-способными функциональными группами и с репортернымн группами.

Вторая глава посвящена обсуждению получегошх в диссертации результатов по разработке и применению новых реагентов для синтеза нерадиоактивно меченных олнгонуклеотидов.

В третьей главе содержатся сведения о реактивах, материалах, оборудовании и методиках, использованных в диссертационной работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.В настоящей работе предлагается набор новых реагентов, позволяющих получать олигонуклеотиды, меченные бйотинои и пиреном, в том числе содержащие большое число репортерши групп.

Нерадиоактивно меченные олигонуклеотиды находят все более широкое применение в стандартных молекуля;?;э-биологических методах и медицинской диагностике. Наиболее эффективны методы получения таких олнгонуклеотидов с использованием модифицирующих реагентов в автоматических синтезаторах. При наличии набора модифицирующих реагентов этот подход не требует дополнительных затрат труда по сравнению с обычным олигонуклеотидным синтезом и поэтому наиболее йригоден при синтезе больших серия модифицированных олнгонуклеотидов .

Описанные в литературе реагенты для мечения олнгонуклеотидов в процессе фосфитного триэфирного синтеза представлены на схеме 1.

Реагенты типа (1) служат для введения одной репортерной группы по 5'-концу олигонуклеотида. С их помощью можно получать лишь моно-

меченые олигсмерц. ■ Нуклеотшаше реагенты (2) могут быть использованы для последовательного введения нескольких молекул метки (метка может бить присоединена не только к основанию, но и к сахарно!) части нуклеозида, например, по 2'0-атому). Синтез таких реагентов часто довольно сложен, к тому же модификация нуклеинового основания влияет на гиСридпзационше свойства модифщировашюго нуклеотида. В большинстве случаев реагенты (2) могут Сыть заменены более простыми

2

3

к:

ОСИ,СИ,си

)-

-СНоООИТ

Ы - нуклеиновое основание

фосфат (-0Р(0)(0 )0-)

Схема 1

ненуклеотидшши блоками (з) (в схематическом лзображении реагента (з) символ)—Ц обозначает не остаток дезоксирибозы, а какую-либо другую структурную сынову для присоединения метки). Недавно предложенные реагенты (*) (К«1а1ксшз1и еЪ а1.,1989) позволяют синтезировать разветвленные структуры. Комбинация реагентов (з) и (*) может быть применена для синтеза олигонуклеотидов, содержащих большое чи-

ело молекул мотки. Например, если после синтеза олигонуклеотида провести еще два синтетических цикла с реагентом (4), а затем два цикла с реагентом (з), то после деблокщювания будет получен модифицированный олигонуклеотид (5), содержащий восемь молекул метки.

В основу настоящей работа били положены блоки типа (з) и (4) ввиду их универсальности.

II.1 Синтез пнренсодержащего фэсфамидптного реагента и олигонуклеотидов, меченных пиреном

II.1.1 Синтез ниренсодержащего реагента

Из-за Оолыюго времени жизни возбуждешюго состояния флуоресценция пирена в водных растворах подвергается эффективному тушению. В литературе имеются противоречивые сведения о том, как присоединение к олигонуклеотиду влияет на флуоресценцию пирена, Так, в случае 4-(1-пиреш1Л)бутирильного остатка, введенного но алифатической аминогруппе модифицированного олигонуклеотида, интенсивность флуоресценции практически не изменялась (Telser et al.,1989); присоедине-inie (1-1шренил)матильной группы по 2'0-атому уридина вызывало значительное снижение квантового выхода флуоресценции (который снижается еще больше при встраивании модифицированного мономера е олигонуклеотид) (Yamana et а 1., 19У2); а реакция И-(1-шфешл)мал9-имида с тиолмодифцшгрова иными олигоиуклеотидаии приводит к значительному усилении флуоресценции пиренильного остатка (Kumar et al., 1991).

флуоресценция

hv Ч

лее.мера «луоресцешшя

f " монсмера

!и,1 " У ■

hv Ч. п *'

лог- п.'тнге Коми MGH 1 npMOli послелога гельиостп

аж-отгомер У -Ь- ' |Ш|||||1Ш

ЛНК-мть-екь

I .....I - пирг;н Схема %

С целью исследования флуоресцентных свойств меченых олпгонуклеотидов в настоящей работе предполагалось синтезировать реагент типа (з), содержащий в качестве метки остаток пирена. В.этом случае

при последовательном ¡¡ведении двух блоков (з) по 5'-концу олигонук-леотида можно Сило ожидать проявлешм эксшерноН флуоресценции. При гибридизации с комплементарной матрицей эксимер должен разрушаться в результате ннтеркаллции но крайней мере одного пиренильного остатка в ДКК-дуплекс, но дйшшгл Kitamura et al.U991) (см. схему 2).

Использованная нами последовательность реакций в синтезе пи-ренсодержлщего реагента типа (з) изображена на схема 3. Гладко протекающее апллиропание лирена (6) янтарным ангидридом в присутствии безводного Л1С13 дает 4-( 1--пиренил)-4-оксомасляную кислоту (7), Б качестве растворителя для реакции Фриделя-Крафтса вместо использовавшегося ранее нитробензола бь'Л взят с.лее летучий нитрометан, что упростило выделение кетог.кслотн (?). Еа карбонильная группа Сила восстановлена до метиленовсй по реакции Больфа-Киалюра (термолиз гидразона). Полученная 4-(1-пире1шл)0утбНОЕая кислота (а) при реакции с пентафторфзнолсм и II,H'-длцнклогексилкзреодкишдом в THF с высоким Ы'ходом Сила превращена ъ пентафтог^ениловий эфир (9). в условиях синтеза rie нтафторфе кило eux эф!1ров II-защищенных амшгокис-лот. Взаимодейтвие активировали :'/о эфира (9) с З-амино-1,2-пропан-диолом (ю) прииело к амидодиолу (и). Для ускорения этой реакции использовалось двойное мольное количество аминодшла (ю), один эквивалент которого связывает образующийся кислый пентафторфенол.

Реакция соединения (il) с 4,4'-диметокситригилхлоридом проводилась при 0°С, что позволило избирательно получить продукт мот-тритилирования по первичной гидооксильной группе (12). Перед использованием в последней стадии это вещество должно быть очищено и тщательно высушено, так как качество реагентов особенно сильно влияет на выход соединения (и). Заключительное фосфятилирование спирта (12) Оис-(1(1Н-д1шзопропила!яето)-2-цианзтокскфос',' -ном (гз) проводилось в безводном ацетонитриле в присутствии тетразолида диизопро-пиламмония в качестве катализатора. Последние две стадии - тритнли-рование по первичному и фосфитилкрование по вторичному гидроксилу -аналогичны рааыда. ., применявши в синтезе нух.леотлдных блоков для фосфитного триэфирного метода.

Использованный в качестве ненуклеотиднс. структурной основы блока модифицирующего реагента (±)-3-амино-1,2-пропандиол (№) pail. . применялся в сш..езе реагентов для получения олигонуклеотидов с алифатическими аминогруппами (Nelson et al., 1989). Фосфамидит (\н ) представляет собой смесь диастереомеров, поскольку молекула вещества (14) содержит два хиральных центра - 2С-этом З-амшга-1,2-пропан-

диола и атом фосфора. 31 р-ямр-спектр соединения (14) в Сй^СИ содержит два сигнала приблизительно равной интенсивности при 152,094 и 152,432 м. д., каждый из которых соответствует паре энантиомеров.

Синтез реагента (1*) довольно прост, его выход составляет 52% в расчете на коммерчески доступную 4-(1-пиренил)бутановую кислоту (8). Вещества (9), (и), (12) и (и) ранее не были описаны.

11.1.2 Синтез и свойства олигонуклеотидов, меченных пиреном

Модифицирующий фосфамидит (14) использовался наш для автоматического синтеза олигонуклеотидов, ме .енных пиреном. Реагент (1«) хорошо растворим в ацетонитриле и может быть использован в обычном синтетическом цикле автоматического синтезатора. С целью увеличения выхода модификации для стадии конденсации был взят 0,2 м раствор фосфамидита (14) в ацетонитриле Еместо обычно использующихся 0,1 М растворов нуклеозидных фосфамидитов. Время конденсации также было увеличено До 2-3 мин. Выход на этой стадии составлял 95-99$ (определен спектрофэтометрически по поглощению катиона 0МТ+).

Для проверки предположения о существовании эксимерной флуоресценции были синтезированы конгюгаты (15) и (16), которые содержат

СквМА Ч

один и два пиреновых остатка, присоединенных по 5'-концу олигонук-леотида. В качестве олигонунлеотидной части С_д использован обратный праймер для амплификации фрагмента 7-го зкзона гена интерлейки-н. И-1а человека (..Ьейепко е1 а1.,1991).

Однако предположение, что пиреновые остатки в коныогате (16) будут ассоциированы и проявят в основном эксимерную флуоресценцию, не подтвердилось. На рис. 1 приведены спектры флуоресценции конъю-

РиС 1 СпекП'Ы W. |';t <4 "/' ПК,"I' Милиции IUM CM' M гг-иггид" (J5)

ь (me. Eo.t.vwit»«' .'>•.■ 510мм. AM„--6,i2.

гатов (15) h (ie) в водном растворе. Видно, что па кривой интенсивности флуоресцешши соединения (ie) имеется лишь незначительный максимум при 420 им и не наблюдается экспмерной флуоресценции (широкого максимума в области -150-470 км). Поскольку спектр« Цшуоресцен-ции модифицированных олигоморов ( 15 ) и (ig) оказались посыла похожими, зонда вида (16) не могут бить использованы, как предполагалось, для мониторинга их гибридизации с матрицей (см. схему 2). Отсутствие эксимерной флуоресценции в этой случае мижнэ объяснить значительным расстоянием между пиреношмп остатками в конъюгате (164, разделенными 18-атомной цзпочкой.

Вместо эффекта эксимерии при присоединении второго остатка пи-рена к олигонуклеотиду с превращением юаопроизводного (15) в дппроизводное (16) происходит возрастание интенсивности флуоресценции, заметно превышающее аддитивное. Так, из рис. 1 видно, что у конъюгэта (16) интенсивность флуоресценции примерно вдвое выше, чем у конъюгата (is), хотя последний взят в удвоенной мольной концентрации, так что концентрация пиреношх y.j>o».»tiopo» в растворах веществ (15) и (16) одинакова. Рассмптриг л ь этот Факт можно с помощью гипотезы (Yamana et al.,1992), объясняющей усиление ^шуоресцен-щш меченного пиреном по 5'-концу олпгонуклеотида при гибридизации с комплементарной последовательностью предположением, что в меченом олигомере между 5'-концевым основанием и ппреновим остатком существует стэкинг-вззимодействие, приводящее к эффективному тушению флуоресценции; при гибридизации пиреновый флуорофор выводится из \ стэкинга и тушение флуоресценции ослабляется. Возможно, в конъюгате (15) за счет стзкинга имеет место тушение флуоресценции, в то время как в конъюгате (16) один пиреновый остаток свободен.

а

ё г .."31 саи к

I

рис

з'естго^оре! i {оч.-ых* (1ааг лмачгтоа

»ИПИ«фИГ.«и,11И ^»ГненГ» 7-Г» 5»}ОЧ» ген» IС, 4«..

прям«» прцйигг е.е5йе ЛТ&СС-тоасгтдс с.сдааас оеглткый ЮиИнег С о-сс тс£ тттт ССА г^татст(а)'

("15") (¿) ; ((), Астеици* Пчте* лео^Рдшивлни» ЬРоичстыл! Сгинем.

Модифицированные олигонуклеотида (15) и (14) были использованы наш в полимеразной цепной реакции в качестве праймеров для получения терминально меченных продуктов амплификации фрагмента 7-го экзона гена интерлейкина-1а. Поскольку меченые прэймеры (15) и (16) в количестве, использовавшемся для амплификации (30 пмоль), флуоресцируют недостаточно кнтенсь:,.ю, чтобы их можно было увидеть на электрофореграмме, для визуализации продуктов амплификации применяли обычное прокрашивание геля бромистым этидием. Соотношение тт.л-сивности наблюдавшихся полос (рис. 2) позволяет заключить, что оба этих праймера столь же эффективны в ПЦР, как и немодифицированный обратный праймер. Таким образом, показано, что присоединение одного или двух пиреновых остатков по 5'-концу олигонуклеотида с помощью реагента (и> не влияет существенно на гибридизационные свойства олигонуклеотида и его способность к элонгации по 3'-концу.

Способ введения пиреновых остатков в олигонуклеотида с помощью реагента (14) имеет некоторые преимущества перед описанными ранее (Уашапа £ 1965; 1,ее а1,, 1990; Уашапа еЬ а1., 1991),

поскольку синтез нуклеотидных пиренсодержащих блоков довольно громоздок; к тому же присоединение активированных пиреновых производных по а. лфатическим амида- или гиол-.шм группам модифицированных олигонуклеогидов (Те1вег аХ., 1989; Киааг еЬ а1., 1991) протекает с низким выходом из-за различной рг творимости реагентов. В то же время реагент (14) позволяет просто и с высоким выходом случать олигонукл лиды, содержащие на 5'-конце одну или несколько пиренильных групп.

11.2 Синтез биотинсодержащего реагента

Биотин в настоящее время наиболее употребителен среди меток, присоединяемых к олигонуклеотидам. Для синтеза биотинилированных олигонуклеотидов представлялось необходимым синтезировать реагент типа (з). Однако синтез описанных реагентов такого рода довольно сложен. Анализ литературы показал, что нет необходимости защищать карбамидную функцию биотина в фосфамидитном реагенте. Обычно к этому прибегают для определения выхода реакции конденсации и улучшения растворимости реагента в ацетонитрилз <1-И-Г)МТ-защита) или для предотвращения побочных реакций при использовании 5-(4-нитроФенил)~ тетразола в качестве кислотного катализатора конденсации в синтезе модифицированных Оиотином 2-0'-алкилолмгориОонуклеотидов (4-трет-бутилбензоильная защита по 1-Н-атому) (Р1е1ез еЬ а1,, 1991).

В качестве ненуклеотидной структурной основы реагента был использован диэтаноламин, ранее применявшийся для введения в олигону-клеотида остатка антрахинона ,(1лп £ МаЬЬеиссх, 1991). Для снижения стоимости синтеза представлялось также целесообразным использовать биотин в возможно меньшем числе стадий. Поэтому разработанная схема синтеза целевого реагента включает в себя всего три стадии с участием биотина.

Сначала (+)-биотин (17) был превращен в пентафторфениловый эфир (18) (схема 5). Из-за наличия карОамидной группы биотин слабо растворяется в большинстве растворителей, поэтому использование обычного метода синтеза пентафторфениловых эфиров - взаимодействия

и и

А А

МН ни Ш1

РРР/ОСС/Гу \_/

98г

Схема 5

о

а

соответствующей кислоты с пентафторЗенолом и Н, N' -дициклогексижар-Оодиимидом - связано с определенными трудностям! (описан синтез соединения (18) из биотина с использованием бис-пентафторфештлкар-боната или пентафторфенилтрифторацетата (Рабинков и др., 1989)).

Превращение (схема 5) удалось провести, применяя пересыщенный раствор биотипа в пиридине; в этом случае реакцию с-РРР и ОСС можно проводить при пониженной температуре, что позволяет изОеаать побочной реакции образования Н-ацилмочевины. Эфир (х») бил выделен кристаллизацией с выходом 98%. Хотя в присутствии даже следов пиридина и води этот эфир разлагается, в тщательно высушенном состоянии он устойчив при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

Для взаимодействия биотина с авидином или стрептавидином существенно, чтобы Оиотиновый остаток был стерически незатрудненным, поэтому во многих случаях Онотин присоединяют к биомолекулам через различные спейсеры. В данной работе ь качестве такого удлинителя был использован остаток с-аминокапроновой кислоты (19) (схема 6).

0 РлюсС1/Ма2 СО$ /

ННРтог

ИНГтос

Сначала аминогруппу этой кислоты защитили (9-флуоренил)метоксикар--' бонильным остатком с образованием Гтос-проязводного (20). Полученный из него пентафторфениловый эфир (21) был превращен при взаимодействии с диэтаноламипом в пиридине в эмидодиол (22), причем реакция протекает практически полностью, так что следующая стадия проводилась без сыделеш1Я соединения (гг)'.

Обработка реакционной массы зквимолышм количеством СМТ-С1 привела к смеси продуктов моно- и бис-диметокситрптилирования (23) и (2«), из которой с помощью колоночной хроматографш выделили целевое соединение (23) с выходом 47$, а также некоторое количество исходного амидодиолэ (22) и бис-РИТ-производного (24). • Повторное диметокситритилирование непрореагировавшего соединения (22) и кислотная обработка соединения (24) снова привели к смеси продуктов (22), (23) и (24), из которой хроматографически удалось выделить дополнительное количество (23%) соединения (гэ).

Удаление Ггаос-защиты осуществлялось действием на моно~ШТ-про-изводное (23) гшрролидина (схема ?), в результате чего был выделен аминоспирт (25); Его реакция с пентафторфениловым эфиром биотина (18) в пиридине количественно привела к образовашмо спирта (26). Очищенное колоночной хроматографией и тщательно высушенное в вакууме вещество (26) фосфнтилировэли бйс-(М,М-дш1зопропиламино)-2-циан-этоксифосфином (13) в абсолютном ацетоштриле в присутствии тетра-золида даизопропиламмония. После обычной обработки реакционной смеси и быстрой колоночной хроматографии был выделен фэсфамидит (27) с выходом 64% в расчете на биотип. Вещества (22)-(27) ранее в литературе не описаны.

В "р-ЯМГ-спектре реагента (27) в СС^СН наблюдаются два сигнала при 151,239 и 151,520 м. д., которые соответствуют, по-видимому, двум диастереомерзм по фосфзмидатной группе, не различимым при ТСХ.

фосфамидит (27) хорошо растворим в ацетонитрилё и был успешно использован в автоматическом синтезаторе для введения в олигонукле-этида одного или нескольких биотиновых остатков. Время конденсации з 0,2 М раствором фосфзмидита в абс. ацетонитриле составляло 75 с, зыход нз стадию конденсащш - 90-99$ (определен по поглощению кати-зна РМТ+).

Поскольку в основе реагента легат нехиральная и даже непрохи-зальная псевдосахарная единица, исключается образование' диастерео-леров посте превращения фосфамидита в фосфат^и, следовательно, по-генциальная гйтерогейность гибридизационных свойств модифицирован-

Ш1Х ОиГЬГОНУКЛЗОТИДОВ.

II.3 Синтез ненуклеотидшд фосфамидитных реагентов для множественного мечения олигонуклеотидов

В процессе работы над проблемой 5'-концевого мечения олигонуклеотидов мы столкнулись с необходимостью разработать удобный и универсальный метод введения нескольких молекул модификатора в олиго-нуклеотид для изучения взаимосвязи между структурой и свойствами у таких коныогатов и конструирования меченых зондов -и праймеров. За основу был принят принцип "разветвления" 5'-конца (после завершения синтеза нуклеотидной последовательности) с использованием -специально разработанных реагентов.

Как уже указывалось выше, реагенты вида (4) представляются оптимальными для'Получения 5'-полимечешшх олигонуклеотидов. Описанные ранее реагенты такого рода (Ки1а1коетзк1 е1 а1.,1989) не удовлетворяли нас по ряду причт, в первую очередь из-за сложности их сиртеза.

Мы разработали более простой синтез аналогичных реагентов, лл-пофилыгостъ и длину ножки которых можно легко изменять. Исходным веществом служит 1,3-диаминопропанол-2, симметричный (нехиралышй) аюшоспирт. Присоединяя по обеим аминогруппам остатки алифатических и-гидроксикислот, можно получать структурные основы различных видов дпя узла разветвления. В рамках такого подхода нами были синтезированы реагенты (31) и (35) с использованием в качестве удлиняющих

о

но

ВО с,.--,, i 31

ножек остатков 4-гидроксимасляной и 12-гидроксидодекановой кЗслот.

В синтезе реагента с короткими ножками (31) на первой стадии аминоспирг (28) бил ацилировэн г-бутиролактоном в метаноле при кипячении (схема 8). Эта реакция, приводящая к соединению (гэ), протекает полностью в течение нескольких часов в присутствии небольшого количества шш\ известного в качестве сильноосновного катализатора реакций ашшфования. В отсутствие катализатора продукт реакции (29) также образуется, но для полного ее протекания требуется несколько больше времени. Диамидотриол (29) плохо растворим в хлороформе, что использовалось для его выделения и очистки: после осаждения хлороформом из метанольного раствора вещество было получено в кристаллическом виде,

Дальнейшие реакцш аналогична применяемым для синтеза нуклео-зидных фосфамидитных блоков. Действием DHT-C1 в пиридине на диамидотриол (29) был получен продукт селективного бис-диметокситритили-ров а ни я по первичным гидроксилышм группам (за). Выход воспроизводим лишь при использовании свежевысушенного пиридина, переосажденного DHT-C1 и исключении доступа влаги, фосфитилирование спирта (зо) было проведено действием бис-(Н,К-дш1зопропиламино)-2-циан-этоксифосфина (13) в сухом ацетонитриле в присутствии тетразолида диизопропиламмония. При этом необходимо использовать относительно небольшое для подобных реакций количество катализатора (0,5 экв), а выделение и очистку продукта фосфитилирования, фосфамидита (эг), проводить как можно быстрее - в противном случае выход резко падает. Применение в качестве катализатора свободного тетразола соиро-воя&ается образованием побочных продуктов, которые практически невозможно отделить колоночной хроматографией; по-видимому, они образуются в результате фосфитилирования по амидной функции. Общий выход модифицирующего реагента (за) составил' 64$ в расчете на исходный аминоспирт (2в). В спектре "Р-ЯМР фосфамидита (31) в CD3CN имеется лишь один сигнал, при 151,432 м. д., что согласуется со структурой.

В синтезе реагента с более длинными ножками (35) порядок сборки целевого соединения из блоков был несколько изменен: сначала диметскситритильную защиту вводили в 12-гидроксидодекановуп кислоту (32) и лишь затем проводили активацию карбоксила превращением в пентпфчср»ениnopiitt эфир (зз) (схема 9). Первичная гидроксильная группа огоикиплоты (32) реагировала с DMT-C1 ч абсолютном пиридине. Прошву точно образующуюся 1й-<4,4 *-димзтокситритялокси )додекзиовую

о

33

Схема 9

кислоту без выделения обрабатывали пентафторфенолом в присутствии РСС и активированный эфир (зз) выделяли колоночной хроматографией с выходом 83% в виде бесцветного масла, неустойчивого в присутствии -следов вода и ашшов.

Это соединение в присутствии пиридина в тетра'гидрофуране количественно взаимодействует с вминоспиртом (28) (схема 10). Образовавшийся бис-ОМТ-защищешшй диамидотриол (34), структурно аналогичный веществу (зо), был. выделен колоночной хроматографией. Он довольно плохо растворим в ацетонитриле, поэтому в данном случае при фосфишшровании в качестве растворителя использовали не просто ацетонитрил, а его смесь с метилешслоридом; в остальном же условия реакции были аналогичны тем, в которых фосфитилировали соединение (зо). Целевой фосфамидит (35) был выделен с выходом 57%. в спектре

31Р-ЯМР фосфэмидитэ (as) в CD., СМ, как и в спектре его аналога (зх), присутствует один сигнал (при 151,466 м. д.), подтверждавший структуру,

Строение всех промежуточных продуктов и целевых веществ было подтверждено данными ЦК-, масс- и ШР-спектров. Вещества (29)-(3i) и (зз)—(35) ранее описаны не били.

Выбор структур реагентов (3i) и (зз) бил обусловлен следующими требованиями:

а) реагенты. должны быть пригодны для использования в автоматическом синтезаторе по стандартным или модифицированным программам фэсфитного триэфирного синтеза;

б) синтез реагентов должен осуществляться из недорогих реактивов :ю хорошо воспроизводимым методикам;

в) вводимая с помощью реагентов структурная единица должна вндер-кивать условия щелочного деблокирования и очистки модифицированного злигомера.

Симметричные реагенты (31) и (зз) не создают в модифицированию олпгомерэх хиралышх центров, а следовательно, и диастпреоме • тов. Это, однако, справедливо лишь для идеальных структур, получавших с помощь» таких реагентов и в точности соответствующих »кидаемым. Поскольку же вещества (зг) и (зз) прохиралыш и служат [сточником хиральности при протекании последующей конденсации лишь ю одной ноже, разнообразные "недоразвитые" структуры должны уществовать в виде набора диэстереомеров.

фосфамидитн (31) и (35) использовались в синтезаторе в виде ,2 М раствора в абс. ацетонитриле, причем время конденсации не ревышэло 75 с. Выход на стада» конденсации составлял для реагентов 31) и (з5) 95-99% для реакции с 5'-гидроксилыюй группой нуклеози-а растущей цепи и, соответственно, 75-90?; и'90-95& для конденсации на себя" (выхода определены по поглощению катиона DMT+).

II.4 Синтез и свойства 5'-меченных олигонуклеотидов

Повышение чувствительности детекции путем увеличения числя зодимых в олигонуклеотид молекул флуорофэра в случае фпуоресцеинэ зет неудовлетворительные результаты из-за эффективного тушения иуоресценшш, обусловленного пространствешюй сближенностью флу-зесцеиновых остатков (Haralambidis et al., 1991). Для плренового туорофора, как отмечалось выше, в случае близкого расположен!!ч ни-

ренильншс. 'остатков наблюдается экснмерная флуоресценция. Поэтсг представляло значительный интерес исследовать флуоресцентные сво? с-"за олигонйклеотипов, содержащих большое число пиренилышх остз!

ТСГАТСАССТГПССТСССС — Р —<

3 6

Все стадии разветвления в синтезе конъюгата (1£) проведены с использованием реагента (Я ), а для синтеза конъюгата (3?) использован разветвляющий реагент ( В схематическом изображении кокьюгатоо 04) 'т (3?) символов Г обозначены фосфатные группы.

101 С'ХСг

г' |о]

"Р-Д?)

Р -Ю1

' (ото) р

15 ).

,-101. ЮГ р > ГОДСЯ

,р ) - р р

ТСТАТСАССТСТГССТСССС-

р

V

р

>

Ю1

ГСЩ) / ^ '

\ . У ' •"••••

щз

от

/

- Г "

37

КЗГО)

р-р-

-

4-1) 'О'ГР 1и30 ^Г

/ч р <( 1Т() |

тог

-р. (.ОГЙ

жз1

\

ков. С помощью модифицирующих реагентов (14), (31), (35) были синтезированы олигонуклеотмда с предполагаемыми структурам (зв) и (37).

р

р

Поело деблокирования смесью моноэтаноламина с этанол&м 1:1 олигонуклеотиды осаждались 5-10-кратным объемом ацетона из 2 М водного ЫСЮ,, Осаждение проходило эффективно, о чем легко судить по флуоресценции, хотя можно было ожидать, что большое число гидрофобных остатков в конъюгатах (36) и (зт) приведет к значительному повышению их растворимости в ацетоне. Затем олигонуклеотиды подвергались очистке электрофорезом в денатурирующем ПААГ (7 М мочевина). По завершении электрофореза при облучении УФ-светом четко видны полосы, флуоресцирующие зеленым цветом (рис. 3). Подвижность олигонуклеотидов сильно зависит от степени разветвления. Олигонуклэотид (13), содержащий один пиренильный остаток и выделявшийся таким же образом, на геле невооруженным глазом не виден. Олигомер (16) с двумя пиренильними остатками виден с трудом.

Ясно видно наличие большого числа пятен на треках олигомеров

(36).и (37). Это неудивительно, поскольку выход на стадии модификации был относительно невысоким,и поэтому должно существовать большое число разнообразных "недоразвитых" структур (например, для вещества (36) таких структур может быть не менее 7, а для вещества

(37) не менее 56 только за счет разветвляющих реагентов).

'/ .< г 1

Рис.Э. Разделение модифицирован!« олигонуклеотидов электрофорезом 8 12%-ном ПААГ (С-2,5%): 1 - <£б); г - (35); э,4 - (37)

(¿5); г - (35); э,4 - (37)

Интересы? сравнить треки 3 и 4 на рис. 3. в карман 4 бил нанесен олигонуклзотид, виделенный электрофорезом ранее и соответствующий пятну, отмеченному стрелкой. Видно, что при повторном электрофорезе его подвижность соответствует верхнему пятну на треке 3 (количество олигонуклеотидов в лунках 3 и 4 соответственно составляет 0,6 и 0,1 01) ). Объяснить такое изменение подвижности затруднительно. Возможно, что первоначально неблагоприятно ориентированные молекулы кошюгата (37) вблизи старта подвергаются механическому удерживанию в поперечно -сшитом ПААГ. Не исключено также, что после элшроватш из геля происходит частичная самоагрегация модифицированных олигомеров (37).

Флуоресцирующие верхние полоски вырезались и подвергались элю-кровашю 2 м водным 1ЛСЮЧ. Степень элшроьания олигонуклеотидов (36) и (зт) невысока и даже при неоднократных последовательных сменах буферного раствора не превышает 50% (судя по наблюдаемой флуоресценции). Интересно, что после элюирования из геля полидадифтировашше олигонуклеотицц плохо осаждаются этанолом или ацетоном, поэтому они были обессолены гель-фильтрацией на сефадексе..

С использованием модифицирующие фосфэмицптов (27) и (31) синтезированы олигомерц со следующими структурами (В1 обозначает остаток биотина, вводимый реагентом (27): схематически показаны также разветвления, образующиеся из реагента (31)):

(38)

(39)

(40)

Ь" В1-ТСС-ТАТ-СОС-АТО-СОЛ -СЛС-АА 5' В1-В1-В1-В1-Тте-ТАТ-С(;С-АТС-ССАЧЗАС-АА

В1—.

м-/ \

"-у/

В1—/

5' >-ТСа-ТАТ-СвС-АТС-аСА-еЛС-АА

"л7

5" В1-СТС-ССТ-ССА-0ТС-аТТ-ТАТ-СТТ-С (41)

5' В1-Б1-В1-В1-аС-ССТ-ССА-6ТС-СТТ-ТАТ-СТТ-С (42)

счосет-ссл-атс-атт-тлт-стт-с (аз)

(праймеры для амплификации участка генома вируса простого герпеса 2)

ь' В1-атл-тсл-тст-тто-г,тс-тт 5' 1и-в1-в1-в1-лтл~тсл-тст-ттс-(угс-тт

(44)

(»3)

-ЛТЛ-ТСЛ-ТСТ-ТТЙ-СТС-ТТ

(46)

5' М-ЛТА-ТСЛ-ГГС-б'ге-ТТТ-сс 5 ■ В1-В1-ВЬВ1-ЛТА-ТСЛ-ТТ£-СТа-ТТТ-СС

(48)

атл-тсл-ттс-втс-гтт-сс

(4?)

[нормальный и мутантный зонды для гена кистозного фиброза человека) >' в1-лсл-стс-тст--стс-тсл-лет-ст (50)

¡' в1-в1-в1-в1-лса-стс-тст-стс-тсл-л0т-ст (51)

В i—

bí-/ * v

5' vaCA-CTG-tgt-ctg-tca-agt-ct (52)

Bi ^

Bi

(зонд для диагностики цптомегаловируса человека)

Посла аммонолиза и осаждения ацетоном олигснуклеотиды выдел^-лись с помощью препаративной ион-парной офВЭЖХ (колонка с сбращеййй фазой С18 и элюирующий буфер с добавлением гндросульфата тетрабу-тиламмония). Олигонуклеотида, содержащие биогин, обладают большим временем удерживания на колонке, чем соответствующие немодифициро-ванные олигонуклаотиды.

Предварительные результаты показывают, что подобше модификации с разветвлением на 5'-конце олигонуклеотида не препятствуют гибридизации и элонгации по 3'-концу., и поэтому полученные конъюгаты могут быть использованы в качестве нерадиоактивно меченных зондов и праймеров.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и синтезированы реагенты для автоматического синтеза олигонуклеотидов, меченных пиреном (флуоресцентная метка) и биотином (аффинная метка) - К-(4-(1-пиренил)бутирил-01-(4,4'-диме-токситритил )-02-(Я, Н-диизопропиламшо-2-цианэтоксифосфщшл )-3-ами-но-1,2-пропандиол и О1-(4,4'-диметокситритил)-О5-(н,Н-диизопропил-амино-2-цианэтоксифосфинил )-3-(М-биотшшл-6-аминокапроил )-3-аза-

1,5-пентандиол.

2. Разработаны и синтезировании реагенты для множественного нерадио активного мечеыш олигонуклеотидов: Н,М'-оис-(4-(4,4'-диме-токситритилокси)бутирил)-02-(Н,Н-дш13опрога1лам1шо-2-щ1анэтоксифос-4ша1л)-1,3-диамшюпропанол-2 и N,И'-бис-(12- (4,4' -диметокситритил-окси)додеканоил )-02-(Н,N-диизопропилам1шо-2-цианэтоксифосфинил)-

1,З-даашшопропанол-2.

3. с использованием указанных реагентов синтезирован ряд "моно- и полнмечешшх олигонуклеотидов; меченные пиреном олигонукяеотпда охарактеризованы спектрами флуоресценции.

4. Показана возможность применения ряда меченых олигонуклеотидов в качестве прайыеров в полимерззной цепной реакции.

Список публикащШ по теме диссертации

1. Korshun V. Л. , Boreskov Vu.G., Pestov fi.В., Berlin Yu.A. Non-nucleotide phosptioramidite reagent for non-radioactive polyla-belling of oligo- and polynucleotides. - tlucl. Acids Res. Symp. Ser., 1991, N 24, p. 269.

2. Berlin Yu.A., Korshun V.A., Boreskov Yu.G. Multiple non-radioactive labeling of oligonucleotides. - Ifucl. Acids Res. Symp. Ser., 1991, N 25, p. 85-86.

3. Korshun V.A., Pestov H.B., Birikh K.R., Berlin Yu.A. Reagent for introducing pyrene residues in oligonucleotides. - Bioconjugate Chera., 1992, v. 3, II 6, p. 559-562.

4. Коршун В.А., Кожевникова E.B., Берлин Ю.А. Новый реагент для фосфамидитного синтеза олигонуклеотидов, меченных Оиотином. -Биооргэн. ХИМИЯ, 1993, т. 19, И 1, с. 139-141.

5. Korshun V.A., Pestov M.В., Prokhorenko I.A., Berlin Yu.A. Mon-nucleotide phosphoramidite reagents for synthesis of modified oligonucleotides. - In: International symposium on nucleic acids and membranes (in honour of Dr. H.G.Khorana). Abstracts. Vancouver, Canada, 1993, p. 30-31.

"Подписано к печати / / 0 8 93 г .Формат 60x841 /16 Усл. иеч. л. Тираж 100 экз. Бесплатно. Заказ 6 9Р.

ИПП Госэкоиомплана Республик! Л>еларусь.