Аффинная модификация РНК-полимеразы E. coli в транскрибирующем комплексе реакционноспособными производными олигонуклеотидов-затравок тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи

ЦАРЕВ Игорь Геннадьевич

УДК 577.153.35.02

АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ E.coli В ТРАНСКРИБИРУЩЕМ КОМПЛЕКСЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ 0ЛИГ0НУКЛЕ0ТИД0В-ЗАТРАВ0К

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1990 г.

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО АН СССР

Научный руководитель - член-корр. АН СССР М.А.Грачев Официальные оппоненты:

Доктор химических наук Ольга Ивановна Лаврик Кандидат химических наук Сергей Викторович Нетесов

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится "_"_1990 г. в _часов на

заседании специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, просп. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии

Автореферат разослан "_"_1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение структуры активного центра РНК-полимеразы - ключевого фермента в процессе реализации генетической информации - является важной задачей биоорганической химии. Тем не менее, информация о топографии комплекса РНК-полимеразы с промотором к настоящему времени получена лишь на субьединичном уровне. Следовательно, разработка методов более детального изучения структуры этого комплекса является актуальной задачей.

Цель работы заключалась в изучении функциональной топографии РНК-полимеразы E.ooli методом высокоселективного аффинного мечения при помощи реакционноспособных производных оли-гонуклеотидов-затравок.

Научная новизна. В работе проведено аффинное мечение РНК-полимеразы s.ooli различными произзодными олигонуклеоти-дов-затравок. Установлена природа модифицированных аминокислот. Предложена модель "коридора выхода продукта" РНК-полимеразы. Предложен механизм процесса отщепления а-субъединицы от минимального фермента.

Практическая ценность. Получена информация о структуре активного центра РНК-полимеразы - одного из важнейших ферментов матричного биосинтеза.

Публикации и апробэция работы. По материалам диссертации 'опубликовано 5 статей. Результаты работы докладывались на vffl-ом Советско-Французском симпозиуме по молекулярной биологии, Москва, I98S г., и на xvffl конференции Ф2Б0, Любляна, 1987 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит б таблиц, 19 рисунков и фотографий, состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, зкспериментальной части, выводов и списка литературы (98 ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение топографии участка связывания продукта. Возможность использовать для решения этой проблемы метод высокоселективного аффинного мечения появилась после того, как

была продемонстрирована активность олигонуклеотидов,

комплементарных участку [-8......+21 промотора А2 фага

Т7 в качестве затравок синтеза РНК. Мы считаем, что олигонук-леотиды - затравки связываются с теми же самыми участками "коридора выхода", что и природные, синтезируемые РНК-полиме-разой олигонуклеогиды. Исходя из этого, мы использовали оли-гонуклеотиды - затравки в качестве основы для создания аффинных реагентов, направленных на "коридор выхода продукта". Ранее для аналогичных целей использовали системы с остановкой синтеза РНК в условиях ограниченного набора нтр. При этом, как правило, получался довольно сложный набор синтезируемых продуктов, что затрудняло интерпретацию данных. Использование же производных олигонуклеотидов дает возможность делать более однозначные выводы о соответствии между длиной продукта и местом модификации.

I.Синтез аффинных реагентов.

В качестве основы для аффинных реагентов были использованы две серии олигонуклеотидов, комплементарных промотору А2(Схема I): (I) олигонуклеотиды i - vi и XIV, у-концевое звено которы комплементарно нуклеотиду +2 промотора А2, и (2) олигонуклеоти да VII-ХШ с 3'-концевым зевном, комплементарным нуклеотиду -I промотора А2.

Аффинные реагенты получали путем присоединения реакцион-носпособкых группировок к 5'-фосфату олигонуклеотидов I -XIV. Структуры реакционноспособных группировок приведены на Схеме i

Структуры полученных реагентов доказаны сочетанием различных методов. Спектральные отношения реагентов Alk1, Aid1 соответствуют сушам спектральных отношений, ожидаемых для суммы соответствующих олигонуклеотидов и реакционноспособных группировок. При восстановлении соединений Aid.1'2, Alk1 боргидрвдом натрия происходит резкое изменение У&-спектров: уменьшение поглощения в области 350 нм и увеличение в области 260 нм для Aid1 и Alk1; уменьшение в области 290 нм и 260 нм для Aid2. Это соответствует изменению спектра арильного остатка при превращении альдегидной группы в спиртовую.

Соединения Alk2'подвергаются кислотному гидролизу (pH I, 56°С, I час) с образованием исходных олигонуклеотидов, чтс

Схема I.

Первичные структуры прсмо-. торного участка А2 (вверху) и комплементарных ему олигонукле-отидов. сг и сг-рибонуклзотидные звенья олигонук-лэотидов. Стрелкой показана точка инициации (+1).

'T-A-C-A-A-A-T-C-G-C-T

/

.CAGÜAAGA .GACATTCT

\ / A-T-G-T-T-T-A-G-C-G-A

\

AGGTAACA. TCCAITGT.

pGpCp I

pCpGpCr П

pTpCpGpCr Ш

pApTpCpGpCj, IY

pApApTpCpGpCr V

pApApApTpCpGpCr VI

prpor vn

pApApTpCj, IX

рАрАрАрГрСг X

pCpApApApTpCr XI

рАрСрАрАрАрТрС ХП

рШрАрСрАрАрАрТрСг ХШ

pOypG^Oj. XIV

соответствует наличию фосфамидной связи с реакционноспособной грушой.

Содержание 2-хлорэтиламиногрупп в соединениях Alk1,2,3-тшха определяли по реакции с тиофенолятом натрия. Для активации 2-хлорзтиламиногрупш в соединениях Alk1 в реакционную смесь добавляли боргидрид натрия до концентрации 0,01 М. У соединений Alk1 типа содержание этих групп было стехио-метрическим, у соединений типа Alk2'3- не менее 90? от стехиометрии.

Обработка фосфомоноэстеразой соединений Aid1, Alk1 типа не приводила к изменению их подвижности. Устойчивость соединений к действию этого фермента доказывает, что бензальдегидная группа действительно связана с фосфатным остатком, а не с гетероциклическими основаниями.

Для дополнительного доказательства строения соединений Ali1, Aiv1 типа мы применили гидролиз фосфодиэстеразой змеин-

Im i(Q)r Melm ch3-i(^ DMAP

Aid Aid' Alk Alk' Alk'

ch3

«-CK

_/СН0

Ф-

0ch-<g

асн2сн2\

2Ш2\

0-

■ch2ch2ci ch2nh-

сн/

ш/ ¿hg

0 А

о

0 А

О

О А 10 А

О

5 А

о *

6 А

в А

9 А

Схема 2. Структуры реакционноспособных группировок реагентов. Правый столбец - радиусы действия реакционноспособных группировок ( отсчет - от б'- атома фосфора). « - Расстояние до алкилирующей группы.

ного яда. По данным микроколоночной хроматографии, при таком гидролизе образуются соответствующие нуклеозад-5■-монофосфаты и еще один продукт реакции, имеющий, судя по результатам микроколоночной хроматографии, гораздо большую гидрофобность Его УФ-спектр соответствует сумме спектров исходного альдегида и концевого нуклеозид-б'-монофосфата. В более жестких условиях, этот продукт также подвергается ФДЭ-гидролизу с образованием свободного нуклеозид-5'-монофосфата и соответствущего остатка альдегида.

3. Свойства аффинных реагентов.

По химической специфичности реагенты, представленные на Схеме 2, можно подразделить на фосфорилирупцие (Im, DIU?, Melm), альдегидные (Aid1'2) и алкилируицие (Alk2'3). Pea-

ганты первого типа способны фосфорилировать нуклеофильные остатки аминокислот. Альдегидные группы реагентов Aid1 ,г реагируют с белками, образуя основания Шиффа с е-аминогруппами остатков лизина. Алкилирупцие реагенты Alk2,3 взаимодействуют с различными нуклаофильными аминокислотными остатками, проявляя предпочтение к цистеину и гистидану. Соединения типа Alk1 обладают двойственной реакционной способностью, так как содержат как альдегидную, так и алкилирующую группировки. При этом алкилирующая группировка активируется после восстановления альдегидной боргидридом натрия, что дает возможность "запускать" эти группировки поочередно.

4. Изучение затравочных свойств олигонуклзотидсв.

Как уже отмечалось выше, в качестве основы для синтеза аффинных реагентов были использованы две серии олигонуклэоти-дов, комплементарных промотору А2 (Схема I). Ранее было показано, что олигонуклеотиды первой серии, а также олигонуклео-тид ХШ могут служить затравкам для синтеза РНК с промотора А2. На Рис. I представлены данные, свидетельствующие о том, что олигонуклеотиды VH-ХП второй серии удлинняются на одно звено при инкубации с РНК-полимэразой, промотором А2, [а-32Р] GTP и, следовательно, также обладают затравочными свойствам. Таким образом, можно утверждать, что все изображенные на Схеме I олигонуклеотиды эффективно связываются с бинарным комплексом [ РНК-поламзраза » промотор ] и могут быть использованы для получения аффинных реагентов.

5. Аффинное ыэчение РНК-пошшерагы.

В данной работе для аффинной модификации РНК-полимеразы E.coli применялся метод высокоселективного аффинного мечения. Если классический метод аффинной модификации основан на принципе сродства реакционного аналога субстрата к активному центру, то данный метод, кроме сродства аффинного реагента, использует способность РНК-полимэразы катализировать обрззова-ние фосфодиэфирных связей:фермент достраивает аффинный реагент, присоединившийся в инициирующем центре, радиоактивным остатком нуклеозидтрифосфата, который пуляете* субстратом для второго (елонгирувщвго) центра. В результате образуется

-12 3 4 5 6 7

Рис.1 Результаты

изучения затравочных свойств олигонуклеотидов VII -ХП. Представлена авторадиограмма геля. Дорожка I -смесь [5'-згР] олигонуклеотидов (римские цифры слева - их обозначения). Дорожки 2-7- эксперименты с олигонуклеотидами УП, VIII, IX и ХП соответственно (арабские цифры обозначают длины радиоактивных продуктов односубстратной элонгации).

радиоактивный аналог динуклеотида, ковалентно пришитый в инициирующем центре фермента:

в ЕХ ЕХрИ

Остатки реагентов, присоединившиеся вне инициирующего активного центра, достраиваться не могут и, следовательно, остаются нерадиоактивными.

В Табл. I, 2 суммированы количественные данные по аффинному мечению РНК-полимеразы различными производными олигонуклеотидов первой серии.

При изучении аффинного мечения РНК-полимеразы олигонуклеотидами второй серии оказалось, что и-метилимидазольные производные олигонуклеотидов VII - ХШ дают картины относительного мечения субъединиц (А), сходные с таковыми, наблюдавшимися в случае ы-метилимидазольных производных олигонуклеотидов I -VI. Это означает, что структура комплекса [РНК-полимераза* ДНК*олигонуклаотид] мало зависит от "сдвига" олигонуклеотида два звена относительно матрицы крайней мере с точностью до

"разрешающей способности" метода).

Картина мечения качественно не меняется и при замене N -метилимидазольного производного тринуклеотида П на соответствующее производное тринуклеотида XIV, имеющего ту же первичную структуру, но состоящего исключительно из рибонуклеотид-ных звеньев. Это свидетельствует о том, что дезоксирибоолиго-нуклеотиды с 3'-концевым рибонуклеотидным звеном достаточно хорошо "моделируют" природные рибонуклеотидные затравки.

Реагенты Ald^-rana дают картины мечения субъединиц, качественно сходные с таковыми для фосфорилирующих реагентов, хотя относительная степень мечения о-субъединицы в случае альдегидных реагентов значительно нижа, чем в случае фосфорилирупщтх).

В случае реагентов Alk1-типа наблюдается деэ выраженных максимума мечения ß-субьеданицы при длинах олигонуклео-тида, равных трем и пяти звеньям. Степень мечения производным тетрануклеотида в 15-25 раз ниже. Такая резкая зависимость степени мечения от длины олигонуклеотида при достаточно близком расположении реакционноспособной группы относительно 5'-концевого фосфата (<6А) позволяет предположить, что производные три- и пентануклеотидов метят разные участки ß-субъединицы.

Особенностью алкилирующих реагентов является также мече-ние ДНК. К сожалению пока не ясна причина нескольких полос • модифицированной ДНК. Возможно, это связано с модификацией разных цепей, либо разных нуклеотидных остатков одной цепи.

6. Длина ковалентно связанных радиоактивных олигонук-леотидоз.

Для того, чтобы доказать истинность схемы аффинной модификации, было необходимо установить, что радиоактивные олигонуклеотида, связанные с РНК-полимеразой, на одно звено длиннее тех, которые соответствуют аффинным реагентам. Для этого радиоактивные олигонуклеотида отщепили от субъединиц фермента в кислотной среде ( 10% нсоон, 50°с, г часа) и проанализировали гель-электрофорезом в присутствии стандартов.

Оказалось, что олигонуклеотида, отщепленные от ß-субъеди-ницы гКК-пошгсрггы, м«ч«ттой производными олигонуклеотида

СУБЪЕДИНИЦА

тип.реакц. группы Р ' P' 0 ДНК

имп/м мечен, остат. ИМП/М мечен, остат. имп/м мечен, остат.

I 1700 His+lys 0 - 0 - 0

П 33000 His 0 - 0 - 0

Ш 680 His+Lye 0 - 0 - 0

Uelm IV 260 lys 380 Lys 100 - 0

V 670 Lys 350 Ьув 1400 His 0

VI 290 Xys 670 Ьув 18000 His 0

XIV 7200 His 0 - 0 - 0

Aid2 П 3200 Lys 0 - 0 - 0

П 10000 Nuol 0 - 10000 Nuol 62000

Ш 400 Nuol 0 - 14000 Nuol 220000

Alk1 IV 6800 Nuol 0 - 11000 Nuol 20000

V 1200 Nuol 600 Nuol 2400 Nuol 6000

VI 600 Nuol 1000 Nuol 2600 Nuol 2000

Alk2 п 1200 Nuol 0 - 1200 Nuol 88000

Таблица I. Результаты аффинного мечения транскрипционного комплекса с помощью реагентов Melm-, Aid2-, Alk1- и ацетилов.

Степень мечения субъединиц и ДНК определялась путем просчета вырезанных из геля фрагментов. Данные ( имп/мин ) приведены с вычетом фона ( радиоактивности соседних зон геля, не содержащих субъеданиц и ДНК ), и соответствуют одинаковому количеству РНК-полимеразы. Nuol - нуклеофиль-ный остаток неустановленной природы.

Субъединица ДНК

Тип.реакц. Относ. мечен. Относ. мечен. Относ. мечен Относ.

группы Олиг. степ, мечен. остат. степ, мечен. остат. степ, мечен. остат. степ, мечен.

П 160 Ьуз 0 - 0 - 0

Ш 19 Ьуз 0 - 0 - 0

Aid1 IV 36 Ьуз 13 Lys 0 - 0

V 46 Ъув 68 Lys 0 - 0

VI 20 Lys 29 lys 12 Lys 0

П 80 Nuol 0 - 120 Nuol 2180

Ш НО Nuol 0 - 380 Nuol 960

Alk3 IV 340 Nuol 0 - 470 Nuol 770

V 30 Nuol 0 - 80 Nuol 270

VI 50 Nuol 60 Nuol 70 Nuol 200

Таблица 2. Величины мечения субъединиц РНК-полимеразы и ДНК с помощью реагентов Aid1- и Alk3- типов. Степень мечения определяли сканированием авторадиограмм. Результаты выражены в условных единицах, пропорциональны площадям пиков на денситограммах и приведены в расчете на одинаковое количество РНК-полимеразы.

П( имидазолидом, N-метилимвдазолидом и 4-диметиламинопириди-ниевым производным) с последующим добавлением [a-32P]UTP, все скссслнсь твтрануклеотидами. Аналогично, продукты, отщепленные от субъединиц фермента, меченного к-метиликздасолпд?"и

олигонуклеотидов (pdN)pdGprC в комбинации с [a-32P]UTP, оказались олигонуклеотидами с длиной на одно звено больше исходной. Гомогенность отщепленных продуктов указывает на высокую специфичность мечения.

7. Определение природа меченных аминокислотных остатков.

В случае фосфорилирующих реагентов модификации, в принципе, может подвергаться любой нуклеофильный остаток ( например остатки Lys, His, Arg, Ihr, Ser, Cys, Авр и Glu ). Однако неустойчивость в кислотной среде и стабильность связи при нейтральных рН предполагает наличие фосфамидной связи. Кроме того, известно, что фосфорилированные гуанидины нестабильны даже в нейтральной среде . Следовательно, кандидатами на роль аффинномеченных остатков в случае фосфорилирующих агентов могли быть только Lys и His. Для того, чтобы различить эти два случая, была использована катализируемая кислотой демодификация белка, кинетика которой сравнивалась с кинетикой гидролиза фосфамидной связи в Б'-имидазолиде pdCpdGprC и в метиламиде AMP. Эти вещества брались в качестве моделей меченных Hie и Lys, соответственно.

Оказалось, что кинетика демодификации fi-субъединицы, меченной N-метилимидазолидом П + [а-згр]игр (рН 4,8, 50 с) имеет константу к= 0,05 + 0,007 мин-1 и очень сходна с кинетикой гидролиза 5'- имидазолида pdCpdGprC (k= 0,040 + 0,005 мин-1). Следовательно, можно сделать вывод, что аффинномвченным является остаток His. Метиламид AMP намного более стабилен при этих рН и температуре (к= 10-4мин"1)- Быстрый гидролиз этого соединения ( и фосфорилированного Lys ) происходит только при рН<з.

В результате проведенных исследований оказалось, что другие производные тринуклеотида ( 5'-имидазолидное и 4-диметил-аминопиридиниевое производное) также модифицируют остаток His. Кроме того, остаток гистидина оказывается мишенью модификации в о-субъединице в случае производных олигонуклеотидов

V и VI. Однако, демодификация р и/или (3' субъединиц, меченных N-метилимидазолидными производными олигонуклеотидов IV, V и

VI не наблюдалась при рН 4,8, но шла при рН 2,1 с кинетикой, похожей на кинетику гидролиза метиламина AMP, что указывает

на модификацию лизина. Кинетика демодификации (З-субъединицы в случае Ы-метилимидазолада XIV оказалась тождественной аналогичной кинетике для П.

Альдегидные реагенты могут взаимодействовать лишь с е-аминогруппами лизина.

В случае алкилирукдцих реагентов модификации может подвергаться любой из аминокислотных остатков, перечисленных в начале этого раздела, но какие именно остатки модифицируются в нашем случае, пока не выяснено.

8. Изучение элонгации олигонуклеотидов, ковалентно фиксированных в активной центре РНК-поликеразы.

При проведении экспериментов по инкубации транскрипционного комплекса, содержащего ковалентно фиксированный остаток октануклеотида aaatcg(геи), с различными комбинациями нерадиоактивных NIP оказалось, что электрофоретическая подвижность меченной о-субъединицы уменьшается, причем этот эффект тем больше выражен, чем больше различных субстратов было в смеси при элонгации.

Можно полагать, что наблюдаемое "утяжеление" а-субъеди-ницы связано с удлинением ковалентно присоединенного к ней олигонуклеотида.

Чтобы подтвердить это предположение, фрагменты геля (Рис. 2 А), содержащие модифицированную а-субъединицу, обрабатывали 10% нсоон и отщепленные в результате этого олигонуклеотида анализировали гель-электрофорезом (Рис. 2 Б). Оказалось, что длины отщепленных олигонуклеотидов соответствуют длинам продуктов элонгации октануклеотида AAATCGr(си), ожидаемых на основании первичной структуры промотора А2:

АТР

РНК-полимераза 5' AAATCGr (С1Г) -

3' TTTAGCGATCCATTG...СТТАА (матрица) +1 +10 +30

-»AAATCGr(CUA)

ATP+GIP

-►AAATCGr(CUAGQ)

ATP+GTP+UTP

-►AAATCGr(CUAGG

UAA) ATP+GTP+UTP+CTP

-►AAATCGr(CUAGG

UAAC...GAAUU)

•I 234567*9

Л 2 3 4 5

*

Рис. 2 Элонгация остатка AAATCGr(cu), ковалентно фиксированного в активном центре РНК-полимеразы.

А - электрофорез по Лэммли реакционных смесей до элонгации (дорожка I) и после элонгаци в присутствии АТР (2, 3), ATP+GTP (4, 5), ATP+GTP+UTP (6, 7) И ATP+GTP+UJP+CTP '(8, 9). Пробы, соответствующие дорожкам 3, 5, 7 и 9, перед денатурацией обрабатывали РНКазой А (100 мкг/мл, 37 С, 20 мин). Разделяющий гель содержал градиент полиакриламида от 5 до 12%;

Б - электрофорез продуктов демодификации а-субъединицы в 25% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Дорожки I, 2, 3, 4 и 5 соответствуют а-субъединицам дорожек 1,2, 4, 6 и 8 рисЛА. Цифры слева и справа обозначают длины олигонук-леотидов, определенные путем сравнения с олигонуклеотидными маркерами.

Кроме того, из сравнения Рис. 2 А и 2 Б видно, что степень "утяжеления" а-субъединицы коррелирует с длиной продукта

элонгации ковалентно присоединенного олигонуклеотида: при удлинении на 1,3 или б звеньев оно незначительно (Рис. 2А, дор.2,4,6), но ста^-Еится судестланным при удлинении на 30 звеньев (Рис. 2А, дор.8). После обработки РНКазой "утяжеленная" а-субъединица приобретает прежний подвижность (Рис. 2 А, д.р. 3, б, 7 и 9).

Анализ олигонуклеотидов, отщепленных от а-субъединицы показал, что элонгироваться способны остатки не только окта-нуклеотида, но также гепта- и гексануклвотида (хотя в последнем случае эффективность элонгации существенно ниже). В то же время ни гептануклеотид ААТСОг(СП) ни октануклеотид ААЛТС1}г(С!и), ковалентно фиксированные на р-субьединице, при инкубации с тремя нерадиоактивными 1ПР в тех же условиях не удлиняются.

Очевидно, что необходимым условием элонгации олигонуклеотида, находящегося в активном центре РНК-полимеразы, является возможность смещения (транслокации) каталитического центра фермента относительно матрицы и продукта. Если 5'-конец олигонуклеотида ковалентно фиксирован на ферменте, то такая транслокация должна быть затруднена, поскольку в этом случае для ее осуществления необходимы сильные деформации пространственной структуры либо олигонуклеотида, либо фермента. Поэтому способность олигонуклеотидов длиной 6-8 звеньев элонгироваться следует интерпретировать как свидетельство ослабления взаимодействия а-субъединицы с минимальным ферментом, которое предшествует окончательной ее диссоциации. Можно также предположить, что непосредственное взаимодействие б'-конца транскрипта длиной 6-7 нуклеотидов с а- субъединицей и приводит к выталкиванию последней из транскрипционного комплекса при после дущих актах элонгации.

9. Топография "коридора выхода продукта".

Результаты мечения транскрипционного комплекса (Табл. I, 2) позволяют сделать следующие выводы:

1. В организации участка связывания продукта ("коридора выхода продукта") принимают участие р-, р'- и а-субъединицы РНК-полимеразы, а также ДНК.

2. р-Субъединица имеет следугацие точки контакта с расту-

Рис.3 Топография "коридора выхода продукта", основанная ка результатах данной работы.

щей РНК: (а) остатки Eis и Lys на расстоянии трех нуклеотид-шх звеньев от активного центра ( возможно, роль этих остатков заключается в координации отрицательнее заряженных фосфатных групп транскрипта Еблизл его 3'-конца); (б) остаток bys на расстоянии приблизительно шести нуклаотидных звеньев от активного центра; (в) нуклеофильные остатки ( отличные от Lys и Eis ) на расстоян:^: трах и пяти звеньев от активного центра.

3. р'-Субъвдпница имеет остатки lys, контактируювще с 5'- концом РНК на расстоянии 7 звеньев, а также другие нукле-офяльнкэ остатки на расстоянии 4-5 звеньев от активного центра.

4. а-Субъединкца имеет остатки Hie, Ьув, а также, возможно, еще один нуклаофильный остаток, контактирующие с 5'-концом РНК в семя нуклеотидах от активного центра.

5. ДНК тлеет наиболее тесный контакт с 5'-концом РНК на расстоянии 3-4 нуклеотидных остатков от активного центра.

На Рис.3 представлена схема "коридора выхода продукта", построенная на основании вышеизложенных выводов.

В последупцем представляется необходимым локализовать точки контакта субъединиц РНК-полимеразы и ДНК с РНК-продуктом на известных первичных структурах этих биополимеров.

ВЫВОДЫ

1.0лигонуклеотиды, комплементарные области [-8...-I] промотора А2 ДНК фага Т7, могут выступать в качестве затравок катализируемого РНК-полимеразой E.coli сштеза РИС на содерзаэзй этот промотор двунитсвой матрице.

2.Синтезировано около 40 производных олигонуклеотидсв-затравок разной длины, содержащих на 5'-конце реакционноспособные группировки фосфорилирупцего, алкилируккего или альдегидного типа. Эти производные олигонуклеотидов эффективны как аффинные реагенты -аналоги РНК-продукта для Еысокоселективного афрпшого течения комплекса РНК-полимераза - промотор А2.

3.Аффинному мечепию в зависимости от длины олнгопуклзотлднсй части реагентов и типа рэакциошоспособпсй груптгроЕки подвергаются р, Р' или о субъединицц РНК-поллмеразы.Реагенты аг^и.-згруи-щего типа помимо белка реапфуют и с ДНК-матрицей.

4.В случае фосфорилирупвих производных три- и гептзнуклеоти-дов мишенями мечения является остатки гистидина Э- или о- субье-диниц, фосфорилирупцие производные остальных олигонуклеотидов присоединяются к остаткам лизина и/или гистидина р- и/или р'-субъединицы.

5.Показано, что ковалентно связанный с о-субъединицей олигс-нуклеотид длиной семь звеньев способен эффективно достраиваться РНК-полимеразой при наличии соответствующих субстратов.

нальной топографии тройного комплекса [промотор-РНК-поли-мераза-продукт] в области "коридора выхода продукта".

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах.

1. Буторин A.C., Власов В.В., Грачев М.А., Зайчиков Е.Ф., Коневец Д.А., Кутявин И.В., Царев И.Г. // Адресованная модификация промоторного участка ДНК в комплексе с РНК-поли-меразой алкилирупцими производными олигонуклеотидов // Биоорг. химия -1987- т.13, N-6.- С.845-847.

2. Грачев М.А., Зайчиков Е.Ф., Кут&аин И.., Царев И.Г.// Аффинная модификация РЖ-полиыеразы E.ooli в комплексе с промотором фосфорилирупцими производными олигонуклеотидов-затра-вок // Биоорг.химия-1586-т.12, N-12,- С.1678-1681.

3. Godovikova Т.Б., Graohev U.A., Kutavin I.V., Tsarev

I.0., Zarytova V.F. and Zayohikov Б.Г. // Studies оI the functional topography oi Esoheriohia ooli ENA polymerase.// Eur.J. Bloohem.-1987-v.l66.-P.6l1-6l6.

4. Зайчиков Е.Ф., Царев И.Г.// Изучение элонгации олигонуклеотидов, ковалентно фиксированных в активном центре FHK-полимеразы.// Биоорг.химия-I988-т.14, N-1.-C.I2I-I24.

5. Царев И.Г., Мустаев A.A., Зайчиков Е.Ф., Алигаша Т.О., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н. // Высокоселективное мечение комплекса РНК-полимераза E.ooli с промотором реакционноспособ-ными производными олигонукле отадов-затравок различной специфичности. // Биоорг.химия-1990- т.16, N-6.-С.765-779.