Разработка методов нерадиоактивного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот с использованием новых полимерных носителей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ЕМ. М.Н. ШБМЯКИНА

.На правах рукописи УДК 577.113.4

ВЕНЕР Татьяна Ивановна

/

РАЗРАБОТКА НЕГОДОВ НЕРАДИОАКТИВНОГО ГИБРИДИЗАЦИОННОГО . АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИИ! НОВЫХ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ

02.00.10 - Екоорганичасквя химия, химия природных н $изиологически ахтивЕшс веществ

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата гнмическшс наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в лаборатории полимеров для биологии Института биоорганической химии им.Ы.Ы. Шемякина РАН (зав. лабораторией - д. х. н., проф. в.П. Зубов)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Зубов В.П. :

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, Скрябин К.Г. доктор химических наук, Потапов В.К.

Ведущая организация:

МГУ им.Ы.В.Ломоносова, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

Защита диссертации состоится "<22:".

иногосов<

1992 г.

в-^часов на заседании специализированного7совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им.Ы.М. Шемякина РАН по адресу: 117871 ГСП-7, Ыосква-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии вм.И.И. Шемякина РАН.

Автореферат разослан 992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актхэльность_проблемн. В настоящее время в медицинской диагностике вирусных и наследственных заболеваний человека зевотных и растений все более широкое применение находят новые экспрессные высокочувствительные метода нерадиоактивного гибридизационного анализа (ГА) нуклеиновых кислот (НК). Существующие метода нерадиоактивного гибридизационного анализа НК достаточно многочисленны, однако, методы прямой регистрации обладают низкой чувствительностью, а большинство методов опосредованной регистрации требуют использования дорогих реагентов и сложной детектирующей аппаратуры, хотя и обеспечивают довольно высокую чувствительность.

В нашей стране в области клинической диагностики до сих пор преимущественно используется опасный, и неудобный для эксплуатации метод радиоактивного ГА, т.к. использование нерадиоактивных диагностических систем зарубежных фирм требует значительных валютных затрат. Аналогичных конкурентно-способных систем ГА отечественного производства пока но существует. Следует отметить, что ведутся отдельные работы по совершенствованию методов детекции, ко особо остро стоит проблема создания материалов пригодных для использования в ГА и отработки дагностических систем на их основа.

Целью данной диссертационной работы является разработка экспрессных методов нерадиоактивного ГА ШС при использовании новых полимерных материалов отечественного производства, таких как полиакролеиновые латексы н лавсановые мембраны, для создания высокочувствительных диагностических систем удобных в клинической и лабораторной практике.

Научная новизна. Впервые рэзрзботпн новый способ нера-дзоактивного ГА НК, основанный на применении флуоресцентных латекспых частиц для опосредованной дотекши гнбрвдизоцвон-ного сигнала. Метод не уступает по чувствительности широко применяющимся методам ГА, использущш фзрмзнтные ковъвгаты; отличается зкспрвссностьо, т.к. детекция проводится непосредственно в одну стадию, и простотой з оперировании; Впервые разработаны эффективные метода иммобилизации, гибридизации и детекции ДНК в дот- варианта для лавсановой мембраны отечественного производства. Отработаны способы

детекции гибридизационного сигнала как ферментным, так и латексным коныогатом со стрептавидином и показано, что латексный гибридизационный анализ (ЛГА> на лавсане не уступает по чувствительности методам ГА, использующим ферментные конъюгаты и стандартные импортные мембраны. С целью использования высоко аффинной полимерной подложки в сэндвич-гибридизационном анализе для детекции РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) разработан способ ковалентной иммобилизации фрагментов НК на лавсановую .подложку с сохранением ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы.

Практическая ценность работы. Разработанный метод ЛГА отличается высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой оперирования и может эффективно использоваться в дот-варианте для диагностики некоторых вирусных заболеваний человека, животных и растений в клинических условиях. Лавсановая мембрана может заменить стандартные импортные мембраны для проведения ГА как при ферментном проявлении, так и при использовании флуоресцентного латексного . конъвгата. Более того, лавсан нашел'применение не только в дот-, по и в сзндвич-гибридазационном анализе при создании реального нерадиоактивного диагностикума на РНК ВКЭ.'

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано II работ и получены положительные решения по 2 заявкам на изобретение. Результаты'докладывались на 6-ой Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганрческой химии /Чехословакия, Бехин, 1989/; 20-ой конференции ФЕЮ /Венгрия, Будапешт, 1990/; Международном симпозиуме по проблемам и перспективам применения синтетических олигонуклеотидов /Москва, 1991/.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 13Еработ. Работа .изложена на страницах, содержит«?^ рисунков и 12 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. ПРИНЦИП МЕТОДА ЛАТЕКСНОГО ГИЕРИДИЗ АНИОННОГО АНАЛИЗА (ЛГА).

Особый интерес в гибридизационном анг изе нуклеиновых кислот (ГА НК) представляет использование дисперсных меток-носителей, поскольку они обеспечивают быстрый, простой и эффективный способ опосредованной детекции гибридизацион-ного сигнала. В настоящей работе было предложено использовать в качестве корпускулярной метки-носителя окрашенные полиакролеиновые латексные частицы, содержащие флуоресцентный краситель. Разработка высокочувствительных методов нерадиоактивного ГА с использованием полимерных носителей нового типа проводилась на основе высоко аффинной биоспецифической системы биотин-стрептавидин.

Разработанный в работе новый подход к нерадиоактивному гибридизационному анализу НК, иммобилизованных на синтетических мембранах, с использованием флуоресцентных латексных частиц - это многостадийный процесс,, зкспрессность и чувствительность которого зависит от оптимизации условий проведения каждого из этапов анализа. Стратегию ЛГА можно 'представить в виде 8-стадийного процесса:

1 Синтез полиакролеинового латекса, содержащего флуорофор (ПАЛ).

2 Получение латексного конъюгата со стрептавидином (ПАЛ-СА), проверка его активности, лиофилизация.

3 Введение биотина в зонд и выделение биоткншшрованного зонда.

4 Иммобилизация искомой ДНК на синтетической мембране (вклю-' чая модификацию полимерных мембран нового типа).

5 Гибридизация искомой ДНК с биотинилированнкм зондом.

6 Отмывка мембраны от избытка биотинилнрованного зонда.

7 Детекция биотинилнрованного гибрида конъпгатом ПАЛ-СА.

8 Отмывка мембраны и УФ-визуализзция.

Принципиальная схема ЛГА приведена на рис.1. Сущность разработанного метода заключается в том, что после гибридизации искомой ДНК, иммобилизованной на синтетической мембрана, с нуклеотидным зондом, несущим метку - биотин, визуализация осуществляется с помощью латексов, содержащих флуоресцентный краситель и покрытых стрептаввдиноы, при УФ-облучении мембраны.

з

- латекс (маркер)

- стрептавидин (детектор)

Рис.1. Схема опосредованной детекции биотинилированного гибрида на синтетической мембране с использованием конъюгата полиакролеинового латекса со стрептавидином.

2. СИНТЕЗ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ГОЛИАКРОЛЕИНОШХ (ПА) ЛАТЕКСОВ.

Окрашенные ПА латексы получали двух'стадийныы катодом анионной полимеризации акролеина в водночцелочной среде в присутствии водорастворимого органического красителя с последующей радикальной полимеризацией полимерных частиц по двойным связям с использованием персульфата калия в качестве радикального инициатора. Методики синтеза были разработаны в лаборатории полимеров для биологии ИБХ РАН Б.В.Лукиным .В настоящей работе с целью получения частиц с оптимальными дисперсными и спектрально-флуоресцентными характеристиками, обеспечивающими высокую чувствительность ЛГА, была проведена оптимизация условий синтеза флуоресцентных ПА латексов, содержащих родамин К.

Были использованы ПА-латексы, подвергнутые двум разлита-» ним способам полимеризации по двойным связям: I) в присутствии термораспадакщегося радикального инициатора и 2) путем

СП '

"^Со-г-облучения. Шло проведено сравнение параметров ПА-латексов, полученных после радикальной полимеризации в присутствии 4Я (в расчете на массу мономера) персульфата калия (ПАЛ I) и подвергнутых ^Со-г-облучению в инертной атмосфере (I Ырад, 10 час.) (ПАЛ 2). Структура полученных полимеров подтверждалась методом ПК-спектроскопии. Из сравнения спектров следует, что для ПАЛ1 2 интенсивность

А

полос поглощения двойных С=С связей при 3080 и 1680 см-1 значительно уменьшается в сравнении с ПАЛ I. Этот факт подтверждает, что полимеризация по двойным связям латекса под действием радиационного облучения преимущественно происходит по винильной связи, а присоединение по карбонильной груше протекает в меньшей степени. ;

Для получения стабильных латексных конъюгатов со стропт-авидином была изучена химическая устойчивость полимерной матрицы от времени у-облучения полимера при постоянной мощности дозы облучения - 0,1 Мрад/час. Шло показано, что наивысшую активность проявляют конъюгаты на основе ПАЛ 2, подвергнутые радиационному облучению при дозе I Мрад в течении 10 час.

Для изучения зависимости среднего размера частиц и интенсивности флуоресценции ПА латексов от концентрации введенного в систему родамина Ж была синтезирована серия полиакролеиновых латексов в присутствии родамина Ж от 0,00125 до 0,02 масс.% от общего объема реакционной смеси. В процессе изучения влияния красителя на размер частиц были получены данные, представленные на рис'. 2, из которых следует, что с увеличением концентрации введенного в систему красителя размер ПАЛ 2 увеличивается от 600 до 2300 нм.

Было проведено исследование зависимости относительного квантового выхода флуоресценции родамина 1 от' концентрации красителя в латексной микросфере. С ростом концентрации красителя от 0,00125 до 0,02 масс.!« квантовый выход флуоресценции возрастает, а затем падает примерно в 2 раза, тогда как суммарная интенсивность флуоресценции от кавдой микросферы растет, что очевидно связано с"увеличением количества флуоресцирующих молекул в кавдой микросфере (рас.З). Наибольший рост интенсивности флуоресценции происходит при увеличении концентрации родамина Ж до 0,015 масс.я! , а затем он замедляется.

На основе полученных данных был сделан вывод, что оптимальные спектрально-флуоресцентные параметры микросфер получаются при концентрации родамина Ж в латексной частице -0,015 масс.Я, что соответствует ПА-микросфере с диаметром 1,8 мкм (рис. 2). Как следует из гистограммы распределения частиц по размерам, так.;е микросферы обладают узким средае-

Рис.2. Зависимость диаметра ПА частиц от-концентрации родамина Я для незашитого ПАЛ (I) и ^Со-т-облученного • ПАЛ 2 (2).

Рис.3. Концентрационная зависимость относительного квантового выхода флуоресценции (а) и суммарной интенсивности флуоресценции (б) водных суспензий ПАЛ 2, содержащего родамин Ж, ох концентрации красителя, добавленного в реакционную систему.

в

весовым распределением (коэф!ициент вариации составляет 12%). Таким образом, ПА-латексы с размером частиц 1,8 мкы были отобраны как наиболее подходящие для ЛГА; и использовались далее во всех экспериментах по детекции гибридизационного сигнала.

3. ПОЛУЧЕНИЕ ЛАТЕКСНЫХ КОНЪИГАТОВ СО СТРЕПГАВИДШЮМ ДЛЯ ЛГА.

При получении латексных конъюгатов, применимых в ЛГА, выдвигались следующие требования: а.) высокая активность конъюгатов ПАЛ-СА, б.) сохранение оптимальных спектрально-флуоресцентных свойств ПА латексов, в.) физическая и химическая стабильность при хранении.

Благодаря наличию на поверхности ПА частиц альдегидных груш, которые легко вступают в реакцию с.первичными аминогруппами с образованием оснований Шиффа, конъюгаты ПАЛ-СА получали в одну стадию путем инкубации лЗтексной суспензии со стрептавидином в ФСБ (рН=7,4) при комнатной температуре в течении 2 часов. Образование ковалентнцх связей латекс-стрептавидин происходит на поверхности латексной частицы, поэтому нами была отработана методика количественного определения поверхностных, альдегидных групп колориметрическим методом по красителю п-нитрофенилгидразину.

Латексный конызгат отмывали от реакционной смеси центрифугированием и определяли в супернатанте количество несвязавщегося с носителем стрептавидина по реактиву Фолина. Пригодность конъюгата ПАЛ-СА в ЛГА определяли с помощью реакции латексной агглютинации (РЛА). Агглютинацию проводили в и-образных лунках микропланшет. Биотинилированную ДНК, которая используется в данной тест-системе в качестве голинуклеотидного зонда, вносили в лунки в последовательных двухкратных разведениях в ФСБ, содержащем"О,5% овальбумина. Затем добавляли в кавдую лунку равный 'объем латексного конъюгата и через 2 часа наблюдали реакцию!'

С целью получения физически и химически устойчивых конъюгатов стрепгавидин иммобилизовали на радикально зашитый ПАЛ I (I) и 7-облученный ПАЛ 2 (2) и провели сравнение характеристик полученных конъюгатов. Как видно из табл.1 для ПАЛ 2 (2) расход стрептавидина при получении латексного конъюгата значительно ние, чем для необлученного при дости-

Таблица 1. Зависимость параметров латексных конъюгатов ПАЛ-СА от метода

зашивки латекса.

ПА-латекс (1,8 мкм) Количество поверхностных альдегидных групп, мкмоль/г Нагрузка стрептави-дина на 1 мл 5Х суспензии, мкг Связующая емкость 1 г ПАЛ по СА Срок хранения в стабилизаторе, мес. Минимальная тестируемая концентрация В1о-ДНК в РЛА,нг/мл

радикально зашитый необлучен-ный (1) 40 1000 11 мг, 200 нм 1 1

¡(-облученный (1Мрая,10ч) (2) 28 700 9,8 мг, 140 нм Б 1

Таблииа 2. Зависимость характеристик латексных конъюгатов ПАЛ-СА от способа их получения.

Конъюгат Блокирующий ■ буфер, стабилизатор Минимальная детектируемая концентрация ДНК по ЛГА на нейлоне, пг Минимальное детектируемое количество ВЮ-ДНК по РЛА, нг/мл Срок хранения в стабилизаторе, мес.

1А ПАЛ-СА ФГБ, 0,5Хр-р овальбумина 40 Ч Б

16 ПАЛ-СА ' ФСБ, IX Р-Р глицина 1 1 • • 1

2 ПАЛ-СА(БСА) ФСБ, 0,5Хр-р овальбумина 1 1 6

5 («елати-низирован-ный ПАЛ)- 200 0,5 6

кении конъигатами одинаковой активности по РЛА. Другим важным критерием выбора в пользу ПАЛ-СА(2) является больший срок его хранения в стабилизирующем буфере (6 мес.) без изменения активности и агрегативных свойств.

С целью оптимизации условий синтеза и хранения конъюга-тов ПАЛ-СА, применимых в ЛГА, было проведено сравнение характеристик латексннх конъюгатов в зависимости от способа их получения. Как следует из результатов представленых в табл.2 конъюгат 2. полученный при иммобилизации на латекс стрептавидина в смеси с БСА, проявляет наивысшую активность в ЛГА и наиболее стабилен при хранении в белковом стабилизаторе (6 мес.). Следует особо отметить, что в ЛГА максимальную чувствительность проявляли только те латексные конъюга-ты, которые в реакции латексной агглютинации детектировали концентрацию биотинилированной ДНК не менее 4 нг/мл в лунке. Латексные конъюгаты детектирующие > 4нг/мл в!о-ДНК не давали на нейлоне флуоресцентного сигнала для 1,6 пг ДНК. Поэтому в дальнейшей работе использовались только высокоактивные конъюгаты ПАЛ-СА, полученные способом 2.

Для долговременного хранения латексных конъюгатов, а также для создания удобной формы их комплектовки в диагностических наборах была отработана методика лиофшизации ПАЛ-СА. В течении 12 месяцем активность лиофыгазоваяных конъюгатов по тестам РЛА и ЛГА оставалась неизменной.

4. БИОТИНИЛИРОВАНИЕ ПОЛИНУКЛШГЩЩЫХ ЗОНДОВ

Следующий этап работы заключался в выборе биотшилиро- . ванных полинуклеотидных (ПНК) зондов, эффективно ра'Тотащих в латексном гибридизационном анализе (ЛГА) нуклеиновых кислот. Были исследованы ПНК зонды, в которые биотпн вводился двумя различными способами: I) химическим - путем реакции бисульфит-катализируемого трансаминирования цнтозиновых остатков зонда; 2) ферментативным - путем реакции амплификации (полимеразной цепной реакции - ПЦР).

При химическом методе биотинилирования использовалась реакция замещения С-4-аминогрушш цитозинового ядра на остаток алифатического диамина (в присутствии бисульфит-иона) для введения в ДНК алифатических аминогрупп, служащих затем реакционными цен.рами для присоединения н-оксисук-

э

цинимидного эфира биотинил-с-аминокапроновой кислоты (п=1) и ее производных с удвоенной (п-2) и утроенной (п»з) е-амино-кайролоильной группировкой. Метод 2-ух стадийного биотинили-рования ДНК, включающий две гель-фильтрации занимает 3 часа, что ненамного дольше, чем биотинилирование методом ник-трансляции или фотобиотинилирования, но использует более дешевые реагенты.

Испытания в ЛГА биотинилированной ДНК фага л со спейсерной с-аминокапролоильной группой' различной длины (п-1-з) показали, что наибольшая чувствительность анализа достигается в случае удвоенного и утроенного спейсера, а в случае одинарного - гибридизационный сигнал не детектируется, что объясняется различной степенью доступности биотино-вых остатков дуплекса, иммобилизованного; на синтетической мембране, для молекул стрептавидина, ковалентно связанных с поверхностью латекса. Аналогичные результаты наблюдались в случае ферментативно биотинилированных зондов (табл.3).

Таблица 3. Чувствительность ЛГА в зависимости от метода биотинилирования ПНК-зондов и длины спейсерной группы.

Метод введения био.тина Минимально детектируемое количество ДНК (пг) на ПЭИ-целлофане

химический ДНК фага л

П-1 ----

П=2 0,3

п=з 0,3

ферментативный (ПНР) В1о—1-сШТР в1о-и-аитр рви 322 со вставкой 100 н.п. 1.6 .

5. ЛГА НА НЕЙЛОНОВОЙ МЕМБРАНЕ.

Чувствительность ЛГА непосредственным образом зависит от типа мембраны (химического состава полимерного материала, структуры и размера пор). Поиск мембраны с оптимальными параметрами, т.е. мембраны, на которой ЛГА будет давать

чр

максимальную чувствительность, был начат, с использования традиционных нитроцеллюлозных мембран с размером диаметра пор 0,45 мкм. При проведении ГА с использованием окрашенных латексов в качестве модельной системы для отработки методик анализа была использована ДНК фага л. Однако, на нитроцеллюлозе неспецифический фон был настолько высок, что маскировал сигнал, поэтому отработка метода ЛГА проводилась на нейлоновой мембране (0,45 мкм). После нанесения ДНК на нейлоновую мембрану и проведения дот-Слот гибридизации с биотинилированным зондом мембрану отмывали от избытка зонда и проводили блокировку трисовым буфером' ТБТ (0,5М НаСЬ, 0,0596 Твин-20), содержащим 1%-ный раствор желатина. Далее, гибридизационный сигнал детектировали 0,001$ суспензией латексного конъюгата.

На рис.4, представлены результаты дот-блот гибридизации ДНК фага л, нанесенной на нейлоновую мембрану в количествах от 5 нг до 1,6 пг с 5-ти кратным шагом- разбавления. При облучении мембраны УФ-светом (х„„ -365 нм) в местах

Пол

нанесения ДНК появлялись розовые флуоресцирующие пятна, причем максимального значения соотношение фон-сигнал достигало через 30 мин. Чувствительность ЛГА составила до 1,6 пг ДНК фага л. Гетерологическая ДНК из спермы лосося, нанесенная в количестве 10 нг, флуоресцентного сигнала не давала, что указывало на отсутствие неспецифического связывания латексного конъюгата с ДНК.

6. ЛГА НА ПОЛИЭТМЕНИМИНПШОФАНЕ.

Для повышения чувствительности ЛГА,. т.е. увеличения степени доступности биотиновых остатков, было предложено использовать синтетические мембраны с меньшим диаметром пор, в которые ДНК не проникает и остается экспонированной на поверхности. Доступным материалом, удовлетворяющим этим требованиям, оказался целлофан, применяющийся для диализа. Целлофановая пленка предварительно модифицировалась полиэти-ленимином (ПЭИ М.в. 50000) с целью введения положительного заряда на поверхность мембраны для ионной адсорбции отрицательно заряженной ДНК. :

ДНК фага а наносили на ПЭИ-подложку из водного раствора в количествах от 5 нг до 0,3 пг с последовательным пятикрат-

Рис.4. Дот-гибридизация ДНК фага л, иммобилизованной на нейлоновой мембране. Проявление с •• помощью ПАЛ-СА. Фотография в УФ-свете (365 нм): I - контрольная ДНК из спермы лосося (10 нг), 2-6 - ДНК фага I нг, 200 пг, 40 пг, 8 пг, 1,6 пг соответственно. <

Рис.5. Дог-гибридизация ДНК фага иммобилизованной на ГОИ-целлофане. Проявление с помощью ПАЛ-СА. Фотография в УФ-свете (365 нм): 1-6 - ДНК фага I нг, 200 пг, 40 пг, 8 пг, 1,6 пг, 0,3 пг соответственно; V- контрольная ДНК из спермы лосося - 10 нг.

ным разведением, фиксировали 15 мин. под ИК-лампой и блокировали ПЭИ-целлофан смесью тэт с 0,1% желатином. В этом случае, как показано на рис.5, после проведения гибридизации ДНК фага х с биотинилированным зондом по методике аналогичной для нейлоновых мембран чувствительность ЛГА при облучении пленки УФ-светом составила 0,3 пг ДНК на дот.

Полученные результаты убедительно показывают, что использование флуоресцентных латексннх частиц, применяющихся для детекции биотинилированных гибридов. на синтетических мембранах, позволило повысить чувствительность гибридизаци-онного анализа НК на 3-4 порядка в сравнении с методом, применяющим флуоресцентно меченные зонды, • т.к. полимерная частица содержит Ю5 молекул флуорофора. Другой причиной повышения чувствительности анализа является эффективная блокировка неспецифического фона на мембранах при использовании смеси Твин-го и желатина вместо БСА в качестве блокирующего реагента. :

Таким образом, преимущества разработанного метода следующие: I. ЛГА не уступает по чувствительности широко применяющимся методам ГА, использующим ферментные;койъюгаты, поскольку позволяет определять до 0.3 пг или 6 * Ю3 молекул ДНК фага а (на ПЗИ-целлофане); 2. ЛГА является экспрессным методом в отличии от 2-ух стадийной ферментативной детекции гибридизационного сигнала, требующей 90 мин. для проведения анализа. Непосредственная детекция с использованием латекс-ных частиц является одностадийным процессом и занимает в среднем 30 мин.; 3. Метод отличается простотой в выполнении, т.к. не требует специальной аппаратуры для визуализации гибридизационного сигнала.

7. ЛГА НА ЛАВСАНОВОЙ МЕМБРАНЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ПОЛИНУМЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ. : ПЭИ-целлофан, несмотря на высокую чувствительность проводимого на нем ЛГА, является хрупким материалом и не выдерживает механических воздействий, кроме того, слишком малые размеры пор целлофана приводят к низкой фильтрующей способности мембраны. В связи с этим в настоящей работе в качестве полимерной подложки для нанесения нуклеиновых

кислот и проведения ЛГА было предложено использовать

>

лавсановую ядерную мембрану. Основой этой мембраны является сложный полиэфир этиленгликоля и тере-'фгалевой кислоты (полиэтилентерефталат). В соответствии с технологией производства ядерной лавсановой мембраны на ее поверхности и в цилиндрических порах содержатся карбоксильные группировки, величина дзета-потенциала поверхности такой мембраны составляла -5-Ю мв. В работе были испытаны лавсановые ядерные мембраны толщиной 10 мкм с размером пор 0,07 мкм и плотностью пор 2,1 * Ю9 на см2. Пористость такой мембраны составляла Ш5.

В соответствии с особенностями химической структуры и свойств лавсана как гладкой и гидрофобной мембраны были разработаны новые методики для 4-7 этапов ЛГА' (нанесения ДНК на мембрану, гибридизации с последующей стадией отмывки от избытка НК-зонда и детекции гибридизационного сигнала). Детекция на лавсане проводилась двумя независимыми способами: латексным конъюгатом ПАЛ-СА' и ферментным -пероксидаза-стрептавидин (ЦЦ-СА). Предварительно было показано, что на лавсане ГА с использованием ПД-СА дает большую чувствительность в сравнении с конъюгатом щелочной фосфатазы со стрептавидином

Перед нанесением водных растворов ДНК на лавсановую подложку проводилась предварительная подготовка мембраны -обработка поверхности мембраны органическими растворителями: ацетоном и этиловым спиртом, последовательно, затем мембрана смачивалась дистилированной водой и в ней хранилась. Для эффективной адсорбции одноцепочечных ДНК (фага а и рви згг) на поверхности лавсана по принципу гидрофобных взаимодействий был отработан способ нанесения ДНК -из высокосолевого водного буфера, обладающего высокой -ионной силой и содержащего 0,ЗМ нась и 0,1М ыаон. Предварительно растворы ДНК подвергали двойной денатурации: щелочной и термической, далее ДНК фиксировали в течении 15 мин. при ИК-облучении.

.Для количественной оценки эффективности удержания ДНК на лавсане был использован полинуклеотидный зонд, несущий радиоактивную метку 32Р. В качестве зонда использовались индивидуальные фрагменты ДНК фага л, полученные при расщеплении рестриктазой н1па ш. Мечение рестрикта проводили методом ник-трансляции по стандартной методике, при этом

о

удельная активность зонда составила 2*10 имп/мин*мкг. Было показано, что при иммобилизации денатурированной ДНК с последующей фиксацией ИК-облучением (15 мин.) эффективность удержания ДНК резко возрастает до 75%. Предельная сорбцион-ная емкость лавсановой мембраны для ДНК составила 100 мкг/см2, однако, при нанесении на фильтр свыше 10 мкг/см2 ДНК эфЕективность иммобилизации начинает падать. Таким образом, нанося от 5 нг до I пг ДНК на дот (4 мм2) мы работали в начальной линейной области изотермы адсорбции ДНК на лавсане.

Для изучения эффективности различных блокаторов фона при гибридизации лавсановые мембраны выдерживали в блокирующих растворах различного состава, добавляли радиоактивно ме-

7

ченную ДНК до концентрации 8*10 имп/мин*мл, инкубировали 16 часов при 65°С, после отмывки мембраны, экспонировали с рентгеновской пленкой и просчитывали в сцийтилляторе (табл.4) Наиболее эффективным блокатором фона на. лавсане оказался 0,1% sds. Шло предложено в качестве инертного полимера увеличивающего эффективность гибридизации использовать полиэти-ленгликоль (ПЭГ М.в. 6000) вместо декстран1 сульфата. В результате было показано, что для лавсана оптимальной блокирующей смесью является 0,1% sds, содержащийся в гибридизацион-ном буфере (4*setj, в котором 10%-ный декстран сульфат заменен на БЯ-ный ПЭГ. В этих условиях степень неспецифической адсорбции ДНК-зонда была минимальной и составила 0,023%.

Было проведено сравнение эффективности ГА при использовании биотинилированного ДНК-зонда с последующим проявлением гибридизационного сигнала ферментным конъвгатом пероксидазы со стрептавидином и дисперсным - латексом со стрептавидином. В табл.4, приведено сравнение чувствительности ГА в зависимости от способа детекции на лавсане и от состава гибридизационного буфера. Из приведенных результатов видно, что высокомолекулярные компоненты гибридизационной. смеси I и 2: ДНК из спермы лосося и раствора Денхарда (полившпшшроллидон, фиколл и БСА), обычно применяющиеся в ГА нё стандартных мембранах, препятствуют детекции гибридизациойного сигнала ла-тексным коньюгатом. Таким образом, оптимальными для проведения ЛГА оказались условия гибридизации 3, исключающие высокомолекулярные блокаторы и высокую концентрацию детергента.

Также были отработаны условия эффективной детекции

гибридов латексным конъюгатом. При проявлении сигнала ферментным конъюгатом использовали стандартную методику аналогичную методике детекции на нейлоне. Блокировка лавсана осуществлялась в проявляющем буфере, -содержащем 0,05% Твин-20 и ЗЯ-ный раствор желатина в смеси с 0,456-ным раствором казеина. В случае использования ПАЛ-СА для повышения, степени доступности биотиновых остатков из проявляющего буфера были удалены все белковые компоненты и блокировка проводилась только 0,05% Твин-20, содержащимся в тэт. Результаты дот-гибридизации ДНК фага* а при проявлении гибридов на лавсане ферментным конъюгатом приведены на рис.6., а латексным конъюгатом - на рис.7. Следует особо отметить, что чувствительность ГА обоих случаях детекции (ферментативной и латексной) одинакова и не уступает по чувствительности ЛГА на стандартной импортной мембране -нейлоне. Следовательно, лавсановая мембрана отечественного производства в комплексе с ПА латексным конъюгатом может использоваться для создания высокочувствительных диагностических систем, работающих в варианте дот-гибридизации.

Таблица 4. Минимально детектируемое на лавсане количество ДНК фага а в зависимости от способа детекции и состава гибридизационного смеси (пг)..

\Состав гибрида-зационной N. смеси Тип детектируемой метки N. I. 50£формамид I56SDS, 5%декстран сульфат, ДНК лосося в ts, 42°С 2. 4хбет, р—р- Денхар-да, бЯдекст-ран:сульфат, ДНК лосося, 65°С 3. 4xset , 6% ПЭГ, 0,1% sds, 65°С

Пероксидаза-стрепт-аввдин (ПД-СА) 0,1 I

Полиакролеиновый латекс-стрепт-авидин (ПАЛ-СА) - I

32р-ДНК 100 !Ю 10

Рис.6. Дот-гибридизация ДНК фага а, иммобилизованной на лавсано в количествах: I - 5 нг, 2 - 1нг, 3 - 200 пг, 4-40 иг, 5 - 8 пг, 6 - 1,6 пг, 7 - 0,3 пг, 8 -'.10 нг контрольной ДНК из спермы лосося. Проявление конъюгатом ПД-СА.

7

Рис.7. Дот-гибридизация ДНК фага а, иммобилизованной на лавсане в количества» I - I пг, 2 - 200 пг; 3 - 40 пг, 4 -8 пг, 5 - 1,6 пг, 6. - 0,3 пг, 7. - 10 нг Контрольной ДНК из спермы лосося.Проявление с помощью ПАЛ-СА.:Фотография в УФ-света (365нм).

8. ПОЛУЧЕНИЕ АФФИННОМ ЛАВСАНОВОЙ ПОДЛОЖКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ СЭНДВИЧ-ГИБРИДИЗАЦИИ.

Лавсановые мембраны оказались универсальным полимерным материалом, т.к. нашли применение не только в дот-гибридизации, основанной на гидрофобной адсорбции ДНК и ее фрагментов на поверхность подложки, но и в сэндвич-гибридизационном анализе при выявлении определенных нуклеотидных последовательностей, для выделения индивидуальных нуклеиновых кислот и выявления точечных мутаций.

В работе был разработан способ иммобилизации на лавсановую мембрану коротких олигонуклеотидов (ОНК), гозволяиций сохранять способность ОНК образовывать прочные комплементарные комплексы. Данный способ включает активацию группировок полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами НК. По 5'-концевому фосфату фрагментов предварительно вводами аминоспейсер, в качестве подложки использовали лавсановую мембрану, содержащую карбоксильные 'группы, которые активировали превращением в хлорангидридные с помощью пентахлорида фосфора. Таким образом, способ иммобилизации состоит из трех стадий: I) присоединение к ОНК полиметиленполиамина (1,10-диамино-4,7-диазадекана) путем взаимодействия одной из алифатических аминогрупп с б'-фосфо-4-н,к-диметилзминопирщшниевым производным ОНК;

2) активация с помощью пентахлорида фосфора карбоксильной группы полимерно,* подложки;

3) взаимодействие аминогруппы полиметиленполиаминового спейсера ОНК с активированной электрофильной группой полимерной подложки в присутствии третичного амина, необходимого для депротонирования аминогруппы спейсера.

При иммобилизации на лавсановую мембрану использовались ОНК-зонды на вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), полученные в лаборатории проф. В.Ф.Зарытовой НИБХ СО РАН. В качестве образца I использовали "17-звенный" ОНК ра^сстстссАССгтАСАТт. Количество присоединенного к лавсану ОНК оценивали, используя 32Р-меченныЙ образец. Для определения;равномерности иммобилизации ОНК на поверхность лавсана различнее образцы модифицированного лавсана разрезали на одинаковые по площади полоски. Радиоактивность на полосках детектировали просчетом в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Аффинность полученных материалов определяли по способности связывать комплементарный (34-звенный). и некомплементарный (17-звенный) ОНК, меченные 32Р. Меченный комплементарный ОНК СССАСССАСААСТААТСААССССССТССАСАССТ СВЯЗЫВЭЛСЯ С МОДИфй-

цированным лавсаном, а некомплементарный . асстстссассттсатт не связывался. Специфическая и неспецифическая сорбционная емкость аффинной подложки представлена в таблице 5.

Способность иммобилизованных ОНК образовывать прочные комплементарные комплексы оценивалась > путем сравнения температуры денатурации комплекса на поверхности полимерной подложки с температерой плавления этого дуплекса в растворе. Следует особо отметить незначительное отличие сраниваемых температур плавления комплекса в растворе и денатурации на лавсане для двух пар: "34"- и "17"-звенный олигонуклеотиды (образцы 1,2 и 3) и "10"- и "28"-звенный ОЖ (4) (табл.5).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет присоединять к лавсановой мембране фрагмента НК с сохранением ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы. Полученным подложкам свойственна высокая'аффинная емкость (до Ю-10 молей/см2). Этих двух факторов достаточно, чтобы обеспечить возможность использования аффинной лавсановой мембраны в сэндвич-гибридизационном анализе для детекции РНК ВКЭ, а также при выделении индивидуальных НК.

Таблица 5. Характеристики аффинных лавсановых подложек с иммобилизованными ОНК: рллсстстссассттасатт (образец 1,2 и 3) и раттстААсстт (образец 4).

н Площадь Специфичес- Неспеци- тпл. Т дена-

образ- лавсано- кая сорбци- фическая комплек- турации,

ца вой под- онная ем- сорбци- са в рас- комплекса

ложки, кость, моль онная творе, на лавса-

см2 ОГУсм2*™-12 емкость °С не, °С

I 4,5 0,8 - 61,2 51

. 2 2,9 3,8 - 51,2 51

3 0,9 4,4 - 51,2 51

4. 2,9 3,5 - 43 42

выводы

1. Впервые разработай способ нерадиоактивного гибридизацион-ного анализа нуклеиновых кислот, основанный на применении флуоресцентных латексных частиц для детекции гибридизацион-ного сигнала. Метод не уступает по чувствительности широко применящимся методам ГА, использующим ферментные конъпгаты; отличается экспрессностью, т.к. детекция проводится непосредственно в одну стадию, и простотой в оперировании, поскольку не требует специальной аппаратуры для визуализации сигнала.

2. Оптимизированы методы синтеза флуоресцентных полиакролеи-новых латексных частиц и установлено, что'латексы с диаметром 1,8 мкм максимально соответствуют требованиям ЛГА. Также оптимизированы способы получения и хранения латексных коньюгатов со стрептавидином с целью использования их в диагностических наборах.

3. Впервые разработаны эффективные методы иммобилизации, гибридизации и детекции ДНК в дот- варианте для лавсановой мембраны отечественного производства. Отработаны способы детекции гибридизационного сигнала как ферментным, так и латексным конъюгатом со стрептавидином и показано, что ЛГА на лавсане не уступает по чувствительности;методам ГА, использующим . ферлентные конъюгаты и стандартные импортные мембраны.

4. Разработан способ ковалентной иммобилизации фрагментов НК на лавсановую подложку с сохранением ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы с целью использования высоко аффинной полимерной подложки в сэндвнч-гибридиза-ционном анализе для детекции РНК вируса клещевого энцефалита.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Заявка на изобретение н 4652161, положит, решение от 22.С8.89. Способ проведения гибридизационного анализа. /Щербо С.Н., Лукин Ю.В., Венер Т.И., Турчинский, М.Ф., Кнорре В.Д., Зубов В.П., Коваленко В.А., Свердлов Е.Д./

2. Венер Т.Н., Турчинский М.Ф., Кнорре В.Д., Генералова

А.Д., Лукин С.В., Щербо С.Н., Туркин С.И., Зубов В.П.

Гибридизационный анализ нуклеиновых колот о использованием окрашенных латексов. - Еиоорган. химия, 1390, т. 16, н з, с. 424-426.

3. Vener T.I., Turchinsky H.F., Lukin Yu.V., Knorre V.D., Sherbo S.N., Turkin S.I., Zubov V.P.- Nucleic acid hybridization analysis using stained latexes. - in: 20th Conference of FEBS. Abstracts. -Budapest,Hungary,1990,p. 169.

4. Vener T.I., Turchinsky M.F., Knorre V.D., Lukin Yu.V., Scherbo S.N., Zubov V.P., Sverdlov E.D. A novel approach to non-rsdioactive hybridization assay of nucleic acids using stained latex particles. - Anal. Biochem., 1991, V. 193, N. 2, p. 308-311.

5. Lukin Yu., Avdesv D., Vener Т., Kuznetoov A., Generalova A., Erokhin Ev., Zorov O., liartsev S., Zubov V. Novel biospe-cific reagents on the fine polyme particles bases. - In: World Congress on Hedical Physics and Biomedical Enganee-ring. Abstracts. - Kyoto, Japan, 1991, p.35.

6. Венер Т.И., Генералова А.Н., Лукин D.B. Полимерные флуоресцентные метки в качестве биоспецпфических маркеров. - В сб.: 10-ой конференции молодых ученых по синтезу и исследованиям биологически активных соединений. Тезисы докладов. - Рига, 1989, с. 103.

1. Vener T.I., Lukin Yu.V., Zubov V.P. Detection of nucleic

acids by latex agglutination in aicrotitration plates. - In: Sixth conference of young scientists on organic and bioorgo-nic chemistry. Abstracts. - Bechyna, cssr, 1989, p.120-121.

ii. Vener T.I., Knorre V.D., Lukin Yu.V. The novel method o£

non-radioactive hybridization analysis of. nucleic acids. -In: Seventh international conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry. Abstracts.- Varna, Bulgaria, 1990, p. 97-100.

Венер Т.Н., Петрова Л.В., Лукин Ю.В. Нерадиоактивный гибридизационнгй анализ нуклеиновых кислотно использованием полимерных флуоресцентных частиц. - в сб.? 4-ой всесоюзной школы молодых ученых по перспективным направлениям и новым методам в молекулярной биологии. Тезисн докладов. - Рига, 1990, с. 50.

10. Венер Т.Н., Турчинский Н.Ф., Кнорре В.Д., Щербо С.Н., Лукин D.B., Петрова Л.В., Сабуров В.В., Зубов В.П.

Разработка новых методов анализа белков и нуклеиновых кислот с использованием полимерных носителей для генной и клеточной инженерии. - В сб: 1-ой Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия". Тезисы докладов. - Пущино-на-Оке, 1990, с. 60-61.

11. Vener T.I., Petrova L.V., Lukin Yu.V., Saburov V.V., Turchinsky M.F. Development of non-radioactive methods of nucleic acids hybridization assay using the new type of polymer supports. - Ins 8-th conference, of young scientist on organic and bioorganic chemistry. Abstracts. - Riga, 1991, p.150-152.

12. Vener T.I., Turchinsky M.F., Zubov V.P., Godovikova T.S., Orlova T.N., Shamanin V.A., Kulikova V.F. Development of non-radioactive methods of nucleic acids hybridization assay on polymer supports of a new type using poly- and oligonucleotide probes, - Nucl. Acids Res., 1991, v.19, Suppl. No.24, p. 267.

13. Заявка на изобретение н 4922414/13, положит, решение от 3.01.1992. Способ ииммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке. /Годовикова Т.е., Орлова Т.Н., Щеголь Н.Ю., Куликова В.Ф., Венер т!и., Сабуров В.В., Ычедлишвили Б.В., Зубов В.П./ *