Подходы к повышению эффективности гетерофазного анализа биомолекулярных маркеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ДМИТРИЕНКО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕТЕРОФАЗНОГО АНАЛИЗА БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

005015603

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Новосибирском государственном университете

Научный руководитель:

к.х.н., доцент Пышный Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

Анненков Вадим Владимирович, д.х.н. Лимнологический институт СО РАН, в.н.с.

Ведущая организация:

Институт биофизики СО РАН

Защита состоится « 16 » марта 2012 г. в 12.30 на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 14 » февраля 2012 г.

Новопашина Дарья Сергеевна, к.х.н. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, н.с.

Учёный секретарь диссертационного о к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для решения фундаментальных и практических задач современной науки в области молекулярной биологии, биотехнологии и молекулярной диагностики особое внимание уделяется исследованиям, направленным на создание простых в экспериментальном отношении, недорогих, чувствительных и селективных методов анализа, обеспечивающих быстрое выявление биомолскул-маркеров в образце.

Биосенсорные устройства - аналитические системы, сочетающие в себе перечисленные качества. Роль биосенсора - обеспечить платформу, позволяющую перевести факт обнаружения аналита (образования комплекса олигонуклеотидный зонд/мишень, антиген/антитело, лиганд/рецептор и др.) в регистрируемый сигнал. Для достоверной регистрации сигнала биосенсоры должны обладать высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к определяемому компоненту. При этом чувствительность сенсора главным образом зависит от способа детекции аналита, а специфичность - от природы взаимодействия иммобилизованных на биосенсоре молекул с аналитом. Повышение эффективности гетерофазного анализа биомолекул возможно практически на каждом этапе создания и работы биосенсора, начиная с иммобилизации молекул на твердотельные носители до генерации сигнала анализа. Следует отметить, что не для всех молекул существуют природные аффинные агенты, обеспечивающие образование комплекса и выявление аналита. В таких случаях в качестве распознающего элемента биосенсора могут выступать искусственные конструкции, способные к специфичному молекулярному распознаванию. К таким конструкциям можно отнести молекулярно импринтированные полимеры (МИПы).

Цель работы - исследование перспектив использования различных типов материалов в качестве твердотельных подложек для гетерофазного анализа биомолекулярных объектов (главным образом, нуклеиновых кислот (НК) и белков), а также разработка и оптимизация подходов к их быстрому и специфичному выявлению.

В ходе данной работы необходимо было решить следующие задачи:

• провести скрининг быстрых и эффективных способов иммобилизации биомолекул (НК и белков) на твердотельные носители различной природы (кремниевые слайды и микроканальные матрицы (МКМ), микрочастицы из органических и неорганических полимеров, полимерные мембраны), основанных на использовании химически активированных или неактивированных подложек, в том числе с привлечением фотоиндуцируемых процессов;

• изучить процесс генерации сигнала гибридизационного анализа ДНК в гетерофазном формате, проводимого при ограниченном удлинении олиго-нуклеотидов на ДНК-матрице с помощью ДНК зависимой ДНК-полимеразы ТИегтш сщиаИсю (Taq ДНК-полимеразы) в изотермических условиях (минисеквенирование);

• разработать перспективные ДНК-диагностические подходы к высокоселективному гетерофазному анализу вариабельных сайтов в составе нуклеиновых кислот с помощью биочипов низкой плотности, создаваемых на основе капроновых мембран в качестве носителя и пригодных для геноти-пирования вирусных инфекций;

• разработать подход к получению молекулярно импринтированых полимеров (МИПов) на основе нейлона-6 (капрона) для специфичного связывания различных биомолекулярных маркеров, в том числе белковой и нук-леотидной природы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Представленная работа является детальным и систематическим исследованием этапов, необходимых при разработке диагностических систем для селективного анализа биомолекулярных маркеров нуклеотидной и белковой природы.

В настоящей работе исследована эффективность иммобилизации биомолекул (нуклеиновых кислот, белков) на различные химически активированные или неактивированные твердотельные носители. Определен ряд факторов, влияющих на данный процесс и позволяющих значительно оптимизировать схему быстрого и эффективного получения гетерофазных носителей, несущих на поверхности иммобилизованные биомолекулы.

Детально изучен процесс генерации сигнала гибридизационного анализа НК в реакциях ограниченного удлинения олигонуклеотидных зондов в составе комплементарных комплексов с анализируемой ДНК в изотемпературных условиях. Показана возможность амплификации сигнала анализа при сохранении его сиквенс-специфичности. Предложена кинетическая схема процесса мечения зонда в режиме минисеквенирования ДНК при постоянной температуре, позволяющая оценивать эффективность образования сигнального продукта в зависимости от условий гибридизации, длины и структуры зонда и продукта его ферментативного удлинения.

Предложен новый подход к получению молекулярно импринтарованных полимеров (МИПов) из раствора капрона в 2,2,2-трифторэтаноле, содержащем молекулы-шаблоны. Показано, что создаваемые МИПы способны к специфичному распознаванию различных низко- и высокомолекулярных шаблонов.

На основе результатов проведенного исследования предложены прототипы диагностических платформ для селективного анализа биомолекулярных маркеров нуклеотидной и белковой природы с использованием различных методов генерации сигнала.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях, в том числе: Международная конференция «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006, 2011; 15th International symposium «Nanostructures: physics and technology», Novosibirsk, 2007; II Международный Молодежный Медицинский конгресс

«Санкт-Петербургские научные чтения-2007», Санкт-Петербург, 2007; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; The sixth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, 2008; Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», г.Судак, Украина, 2008; Первый, Второй и Третий международные форумы по нанотехнологиям Rusnanotech, Москва, 2008, 2009, 2010; Международная конференция «Химическая биология -фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, 2009; Медицинская геномика и протеомика, Новосибирск, 2009; 8th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids, Sheffield, UK, 2010.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 191 страницах, содержит 92 рисунок и 13 таблиц. Библиография включает 335 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Оптимизация протоколов иммобилизации олигонуклеотндов на твердотельные носители

Иммобилизацию аминосодержащих олигонуклеотндов, отличающихся по длине и составу, осуществляли на твердотельные носители, несущие на своей поверхности различные реакционно-способные группы (табл. 1).

Тип носителя Активирующий агент Иммобилизуемый зонд 5'-3'

S1 Стекло-С(0)8и" - Z1 pGCATCAAG-NH2 Z2 pATTTGGGCGTGCCCC-NH2

S2 CTeicio"-C(0)Su

Р1 ДМЭГ-С(0)8и

Р4 ДМЭГ""-С(0)5и

Р2 ДМЭГ-NHi 1,1 '-карбонилдиимидазол

РЗ ДМЭГ-NHt 1,4-фенилендиизогиоцианат

S3 Nucleosil 100-5-NHi 2,4,6-трихлор-1,3>5-триазин Z3 pTCAGGCAGTACCA-CAAGGCC-NH2

Р5 Латекс-С(0)Н -

*8и - остаток Ы-оксисукцинимида; "стеклянный носитель с порами контролируемого размера разных производителей; '"разные партии полимерных микрочастиц на основе метакрилата (ДМЭГ).

С целью увеличения эффективности иммобилизации олигонуклеотндов на поверхность твердотельных носителей было исследовано влияние на этот процесс №С1, различных четвертичных солей аммония, в том числе катионных детергентов цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) и додецилтриметилам-монийбромида (ДТАБ), а также анионного (8Э8) и неионных (Твин-20 и Тритон Х-100) детергентов. Было показано, что в водных средах эффективная иммобилизация (на любую из исследуемых поверхностей) олигонуклеотида, содержащего концевую аминогруппу, происходила только в присутствии ЦТАБ и ДТАБ (рис. 1). Влияние ЦТАБ и ДТАБ на протекание гетерофазной реакции, вероятнее всего, связано с экранированием активных групп на поверхности

носителя от контакта с водой и со способностью данных солей концентрировать (осаждать) олигонуклеотид на поверхность носителя (рис. 1 А).

ПП

- <\>V

носитель

^ 80

а 70

5

Я 60

s

4 5 50

1С

О г 40

7.

s 30

—

Z В 20

н и 10

0

□ ВОДА

□ ЦТАБ

□ ДТАБ

JL

Р4

и

Р2 РЗ S3 Р5

Рис. 1. Схема взаимодействия ЦТАБ с олигонуклеотидом и поверхностью твердотельного носителя (А). Эффективность иммобилизации олигонуклеотидов на разные носители в водном растворе при 25°С в присутсвии 22 мМ ЦТАБ или ДТАБ (Б).

Таким образом, предложен простой подход к повышению эффективности ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов на химически активированные твердотельные носители в вводных условиях, основанный на введении в реакционную смесь катионных детергентов, например, ЦТАБ и ДТАБ.

Из рассмотренных активирующих агентов для дальнейшего использования при разработке сенсорных поверхностей был выбран 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин, поскольку данный реагент позволяет проводить эффективную иммобилизацию как олигонуклеотидов, так и белков на широкий круг носителей, а активированная им поверхность стабильна в течение продолжительного времени. Предложенный подход к иммобилизации биомолекул использован при разработке систем селективного анализа биомолекулярных маркеров нуклеотидной и белковой природы. С использованием сканирующей эллипсомстрии регистрировали увеличение толщины слоя при иммобилизации белков на кремниевую пластину. После обработки такой поверхности, несущей, например, иммобилизованные антивидоспецифичные антитела (кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши), видоспе-цифическим иммуноглобулином происходит усиление детектируемого сигнала (рис. 2), что свидетельствует о возможности использования сканирующей эллипсометрии для прямой детекции белок-белковых взаимодействий (label-free детекция).

Рис. 2. Результаты эллипсометрического сканирования кремниевой пластины с иммобилизованными антителами до (А) и после (Б) обработки видоспецифическим иммуноглобулином.

УФ-иммобилизацию олигонуклеотидных зондов (ОЗ) на капроне исследовали с использованием в качестве базового протокола методику нанесения растворов олигонуклеотидов на капроновую мембрану, смоченную 5 М раствором NaCl, с последующим облучением ее УФ-светом (254 нм)

ртутных ламп низкого давления [Калачиков С.М. и др., 1992]. На данном этапе использовали нативный 03 (Z4) и модифицированные 03 (Z5, T„AZ4, 7"„AZ5), содержащие в углеводно-фосфатном остове ненуклеотидную вставку на основе фосфодиэфира диэтиленгликоля (мостиковые 03). Данную гибкую вставку использовали в качестве звена, модифицирующего сиквенс-специфическую часть Z5, и/или линкера, отделяющего олиготими-дилатный домен Т„ (л=3 или 10) от основной части зонда (рис. 3).

капроновая мембрана

ЗОНДЫ \ _/

та, Z5 X j j _« / - j __ / j _-

нанесение гибридизация с ферментативное удлинение

олигонуклеотидных анализируемой ДНК зонда с включением колориметрическая

зондов и --биотинилированного детекция

УФ-иммобилизация нуклеотида в состав зонда

Рис. 3. Схема имммобилизации и ферментативного мечения 03 Z4 (pTCAGGCAG-TACCACAAGGCC), Z5 (pGGATCAACCCGCTCAATGCACTGGAG), Т„л ТА (7"„ATCAGGC AGTACCAC AAGGCC), Г„лZ5 (Г/СОАТСААСССОСТСЛЛТОСлСТ-GGAG) в присутствии ДНК-матрицы, где л - ненуклеотидная вставка на основе фосфодиэфира диэтиленгликоля (pDEG), п= 3 или 10.

Максимальная длина Т„ составила 10 звеньев (7V домен), поскольку, с нашей точки зрения, такое количество дополнительных пиримидиновых остатков, с одной стороны, незначительно увеличивает стоимость олиго-нуклеотида и, с другой стороны, превосходит число тимидиновых остатков в сиквенс-специфической части типичных ОЗ длиной 20-30 звеньев. Последнее обстоятельство должно в значительной степени повысить вероятность иммобилизации зонда именно через тимидилатный домен, обеспечив при этом функциональную целостность и доступность сиквенс-специфической части олигонуклеотида для взаимодействия с НК (рис. 3).

Матрицу точек на поверхности капроновой мембраны формировали при нанесении растворов зондов в концентрациях от 10"4 до 10" М (рис. 4А). Для анализа эффективности УФ-зависимой иммобилизации в каждую точку был добавлен 5'-[у-32Р]-мсченый аналог соответствующего ОЗ в постоянной (10~8 М, не менее 250 Бк) концентрации. Дозу УФ-облучения мембраны варьировали от 0.088 до 1.33 Дж/см2, что соответствовало выдерживанию мембраны под источником УФ-света (мощностью 30 Вт) в течение 2-30 минут. Эффективность иммобилизации ОЗ рассчитывали как отношение необратимо связавшегося с мембраной зонда к общему количеству олигонуклеотида, нанесенному в каждую точку, а также на основании анализа интенсивности пятен на радиоавтографе мембраны (рис. 4А).

т10лта

т,лта та

Концентрация олигонуклеотидов, М 1 2 3 4 ;1 2 3 4:1 2 3 4 4 2 3 4 Д 2 34-1 2 3 4

Б £

40

20

ЛТА

Т1 К7А

0

К. .

та

Доза УФ-облучения, Дж/см

3 г

2

Щ

1

0 0,3 0,6 0,9 1,2 Доза УФ-обдучеиия, Дж/см2

......• ю-4

Доза УФ-облучения, Дж/см

о оо 0::;С"--0 0,3 0,6

10

ю6

Ю-7

о

0,9 1,2 Доза УФ-облучения, Дж/см2

Рис. 4. Радиоавтографы капроновых мембран после иммобилизации ОЗ Т]0ЛХ4, Т3Л7А и ТА, нанесенных в концентрациях 10"4 (1), 10"5 (2), 10"6 (3), 10"7 (4) М (А). Зависимость степени иммобилизации Т,0ЛТА, Т3ЛТА и ТА (10"6 М) от мощности УФ-облучения (Б). Влияние дозы УФ-облучения на количество иммобилизованных Т/0ЛТА (В) и Т10АХ5 (Г) при нанесении их в соответствующих концентрациях.

Видно (рис. 4А,Б), что введение Г,«-фрагмента в состав зондов увеличивает как скорость иммобилизации ОЗ на капроновой мембране, так и степень их ковалентного связывания (до 2 раз) по сравнению с немодифициро-ванным зондом. При нанесении на мембрану ОЗ в низких концентрациях (10"7 М) наблюдаются высокие выходы иммобилизации (> 80%), в то время как только ~10% зонда, нанесенного в высокой концентрации (0.1 мМ), оказывается зафиксированным на мембране. Значение предельной ёмкости носителя по зонду составило 2.5 пмоль/мм2, что сравнимо с таковым, достигаемым при фотоиммобилизации зонда, содержащего длинный 7„-домен (п~800 нт) [Багкз Я.К. й а1., 1989], и значительно превышает ёмкость иммобилизации зондов на химически активированные плоские стеклянные носители (0.3-0.5 пмоль/мм2) [Beaucage БХ. й а1., 2001]. Следует отметить, что скорость иммобилизации и значения предельной ёмкости капрона по зонду при иммобилизации Тщ^ТЛ (2.5 пмоль/мм2) и Т10А7,5 (2.6 пмоль/мм2) практически совпадают, хотя длина адресных частей и содержание в них тими-дилатных звеньев различаются (рис. 4В,Г). Таким образом, введение Т]г домена в состав зонда оказывается достаточным для выравнивания эффективности УФ-иммобилизации олигонуклеотидных зондов, различающихся как по длине, так и по нуклеотидному составу.

Кроме того, было установлено, что упразднение аминогрупп капрона путем их ацилирования не приводит к значимому снижению эффективности УФ-иммобилизации 03 на данном носителе, хотя, по литературным данным, такая модификация поверхности [Church G.M. et al., 1984] должна исключить возможность фиксации ДНК на полиамидной подложке. Изучив влияние различных добавок, вносимых в смачивающий мембрану раствор, установлено, что амиды, содержащие алифатические остатки при атоме азота (например, тетраметилмочевина) эффективно ингибируют фотоиммобилизацию 03 на капроне. Полученные данные указывают на то, что именно амидные составляющие капрона выступают в роли реакционных центров при УФ-индуцированной иммобилизации ОЗ.

Исследование эффективности выявления специфической ДНК с помощью УФ-иммобилизованных зондов проводили, вводя остаток биотина в составе С5-модифицированного производного 2-дезоксиуридин 5'-трифосфата под действием Taq ДНК-полимеразы в состав 03 в присутствии ДНК-матрицы F*, как описано ранее [Пышная И.А. и др., 2009]. В результате такого фермент-зависимого ограниченного удлинения иммобилизованных ОЗ метка фиксируется на поверхности подложки. Колориметрическое выявление остатка биотина проводили с использованием конъюгата стреп-тавидин-щелочная фосфатаза и хромогенных субстратов (BCIP, NBT), регистрируя специфическое окрашивание мембраны после гибридизационно-го анализа ДНК. В экспериментах использовали мембраны, полученные на этапе анализа эффективности фотоиммобилизации ОЗ.

Видно (рис. 5А), что интенсивность окрашивания пятен после проведения анализа зависит как от ёмкости носителя по зонду, так и от дозы УФ-облучения мембраны при иммобилизации. Наличие Гл-домена повышает эффективность выявления анализируемой ДНК с помощью 03, иммобилизованных на капроне. Повышение эффективности иммобилизации за счет увеличения дозы УФ-облучения до -0.66 Дж/см2 способствует возрастанию интенсивности колориметрического сигнала при выявлении ДНК Дальнейшее повышение дозы облучения увеличивает ёмкость подложки по 03, но не приводит к повышению интенсивности сигнала анализа (рис. 5А-Г). Возможно, это является отражением УФ-индуцированной деградации 03, снижающей вероятность комплексо-образования его с выявляемой ДНК и/или ферментативного мечения в составе дуплекса. Мы показали, что, как и следовало ожидать [Church G.M. et al, 1984], основными сайтами УФ-зависимой модификации 03 ТА и ТША7А были пири-мидиновые основания. Количественный анализ распределения продуктов деструкции 03 свидетельствовал о том, что наличие Тггдомена приводило к снижению степени деградации адресной части ОЗ.

*F -продукт ПЦР (230 п.о.), соответствующий 5-нетранслируемому участку РНК вируса гепатита С (-259 -30 нт от начала трансляции).

Концентрация олигонуклеотидов, М

т,„*та Т^ТА та

0,15

123 4 1234 1234 1 234 1234 1 234

т%» »МИ ШШ • щш %

Щш* Щ вЙММ

1 - ••«и «и Г шт ■р*

## ♦ ♦ »■ ###:: • <

ф:ф ф* л

0 0.088 0.22 0.44 0.66 1.33

160

¡120

80

40

. Т,„ *ТА

.♦'. ш ■

♦ Г^ЛZ4

ТА

0,1

ч0,05

Доза УФ-облучения, Дж/см

т,ол2л

♦ ,

0 0,3 0,6 0,9 1,2 Доза УФ-облучення, Дж/см2

150

120 Я о

я

90 о

н

60 в

3

30

0

0,15

0,1

г 0,05

л75

80

60

40 *в н

20 ^ в

0

о

0,5

1

1,5

0

0,5

1

1,5

Доза УФ-облучения, Дж/см

Доза УФ-облучения, Дж/см

Рис. 5. Сканированное изображение капроновой мембраны, содержащей 03 Т^ТА, Т^ТА и 74, нанесенные в концентрациях 10"4 (1), 10~5 (2), 10"6 (3), 10"7 (4) М, после проведения реакции ферментативного мечения в присутствии матрицы Р и колориметрического выявления продуктов хромогенными субстратами в течение 10 мин (А). Зависимость эффективности колориметрического выявления Р в местах нанесения ОЗ Тц^'/А, Т3^ТА и ТА (10^ М) от мощности УФ-облучения (Б). Сравнение зависимостей степени иммобилизации (черные точки) ОЗ Тю*7А (В), Т,0Л25 (Г) и эффективности их колориметрического выявления в присутствии матриц (серые точки) от дозы УФ-облучения. ИОП - интегральная оптическая плотность.

Таким образом, введение в структуру зонда ^-домена приводит к повышению эффективности гибридизационного анализа специфической последовательности ДНК с помощью ОЗ, У Ф-иммобилизо ванных на капроне.

2. Исследование эффективности выявления специфической последовательности ДНК с помощью реакции минисеквенироваиия

Важным аспектом при разработке методов анализа биомолекул и конструировании сенсорных поверхностей является обеспечение высокой чувствительности анализа. Одним из перспективных подходов к повышению чувствительности анализа НК может быть многократное ограниченное удлинение зондов в составе комплекса с анализируемой ДНК с помощью ДНК-полимеразы в изотермических условиях [ЮиЫ1су Б. е1 а1., 1999]. Схема изотермического накопления сигнального продукта (рис. 6) предполагает, что при выборе оптимальных условий может происходить «катализируемое» ДНК-матрицей ферментативное превращение ОЗ. В этом случае одна молекула анализируемой ДНК может обеспечить мечение значительно большего числа молекул зонда, что приводит к усилению гибридизационного сигнала.

z

: I v^i

R2 R-

Щ1"

R2 R3

dNTP

R3

Rl R?"

R1 R2 /

R1 R2 R3

Рис. 6. Схема изотермического ферментативного удлинения зонда, где М - ДНК-матрица, Z„ - ОЗ. Z„+i - продукт ферментативной реакции, Е - Taq ДНК-нолимераза, dNTP - меченый нуклеозидтрифосфат, Ri - 5'-ОН-группа или твердотельный носитель, R2 - остаток dUMP, меченный флуоресцеином (Fam) или ненуклеотидная вставка на основе фосфоди-эфира диэтиленгликоля (pDEG), Rj - остатки [3 Р]-мсченого фосфата, биотина (Bio) или тетрамегилродамина (Тшг) в составе встраиваемого полимеразой нуклеотидного звена. Остатки красителей и биотина введены по С5-положеншо 2'-дезоксиуридина.

Установлено, что усиление гибридизационного сигнала анализа в ходе реакции минисеквенирования ДНК в изотермических условиях возможно при согласовании двух основных условий: 1) стабильности дуплексов OJ/ДНК-матрица и продукт удлинения Ш/ДНК-матрица различаются незначительно; 2) температура реакции находится вблизи температуры плавления (ТГ1Я) этих комплексов, обеспечивая эффективный обмен олигонукле-отидных цепей зонда(продукта) в дуплексе с ДНК-матрицей.

Исследование изотермического накопления сигнального продукта реакции удлинения 03 с помощью Taq ДНК-полимеразы проводили в гомофазном варианте (I, II), используя радиоизотопную и флуоресцентную метки, и в гетеро-фазном - с помощью модельной системы III, предполагающей колориметрическое выявление вводимой в иммобилизованный 03 биотиновой метки (табл. 2).

Структура модели Используемый dNTP Продуктf Код

МЫ 3 'AGTCCGTCATGGTGTTCCGGACTGCGTTG5' 1Л 5' TCAGGCAGTACCACAAGGCC3 dTTP* 21 1.1

dNTP, N=A, G, С, T* 29 1.1.N4

MI.1 3' AGTCCGTCATG -GTGTTCCGGACTGCGTTG5 ZIA S'TCAGGCAGTACACACAAGGCC3' dTTP' 21 1.1л

МЫ 3' ÄGTCCGTCA- TGGT- GTTCCGGACTGCGTTG5 Z1Ä" 5' TCAGGCAGT л АССАА CAAGGCC3 dTTP* 21 1.1лл

Mi.2 3 ■ AGTCCGTCATGGTGTTCCGGAAAGCGTTG5' ZI ^TCAGGCAGTACCACAAGGCC3' dTTP* 23 1.2

МП 3'GTCGA—GGTCCGTAGTAGTTC5 ZII 5,CAGCTF—CCAGGCA3" dUT"*TP 13 II

dNTP, N=UTmr, G 14 II.N2

dNTP, N= U""r, G, А 16 II.N3

dNTP, N=UTmr, G, А, С 20 II.N4

MII.-l 3'GTCGA--GGTCCGcAGTAGTTC5' ZI] 5' CAGCTFaJBCCAGGCA3' dUr°"TP 13 II.-1

M1I.-6 3' GTCGA- - GaTCCGCAGTAGTTC5 ZII 5' CAGCTFaBCCAGGCA3 dUT""TP 13 II.-6

F 31-- AGTCCGTCATGGTGTTCCGGTAAA- -5' Zill ^TCAGGCAGTACCACAAGGCC3' dUB'°TP, dATP 24 III

dUB"'TP, dNTP N=G, А, С 230 III.N4

Влияние температуры реакции и стабильности формируемых дуплексов зонд/ДНК-матрица на эффективность ферментативного превращения 03, исследовали, используя системы I и II. Было показано, что температура реакции существенно влияет на эффективность удлинения 03, взятого в 50-кратном избытке по отношению к ДНК-матрице (рис. 7 А). В ряде случаев накопление продукта удлинения 03 подтверждали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях.

А 500

£ =>400 5 ь. и X

= г

5? я

ё =300

100

ЛКП[,4

58.6°С

56.2°С

44°

Т1/2 (40°С)

40°

II.N1 ГГЛ'З П.N4

0 10 20 30 40 50 60 70 Продолжительность реакции, мин Рис. 7. Температурные зависимости эффективности и скорости тушения флуоресценции в реакциях удлинения зонда в системе II, где - время полуреакции, ДИРи -изменение интенсивности флуоресценции (например, Х\п (4(г-с> и ЛКРи^с) при 40°С) (А). Сопоставление изменения относительной флуоресценции со временем полуреакции и расчетной Тпл дуплексов продукт/ДНК-мишень для разных систем П-серии (Б).

Влияние стабильности комплекса продукт/ДНК-матрица на интенсивность регистрируемого сигнала также исследовали с помощью флуорометрического подхода. Реакции удлинения ОЗ (при 45°С) проводили в присутствии различных наборов сЮТР (см. табл. 2), встраивание которых (в соответствии со структурой матричной цепи) обеспечивало накопление продуктов различной длины, а следовательно, и стабильности формируемых ими дуплексов. Сопоставляли параметры кинетических кривых, полученных при использовании модельных систем II (удлинение на 1 нт), ШЧ2 (+2 нт),- П.ГО (+4 нт), ШЧ4 (+8 нт). Видно (рис. 7Б), что удлинение продукта реакции приводит к снижению наблюдаемой глубины превращения ОЗ, характеризуемой величиной АКРЬТ, и одновременно с этим падением скорости реакции - возрастанием величины т1/2.

Аналогичные данные получены и при использовании радиоизотопной метки, что подтверждает справедливость схемы (рис. 6) изотермического мечения ОЗ на матрице ДНК. Для каждой системы, определяемой структурой комплекса зонд/ДНК, существует температура, при которой происходит наиболее..оптимальное мечение ОЗ в результате реализации обмена * 10

матричной цепи между различными дуплексами. Низкая температура реакции или повышенная стабильность дуплексов зонд/ДНК и/или продукт/ДНК снижают эффективность изотермической амплификации сигнала. Температура реакции выше температуры плавления субстратного комплекса также негативно сказывается на эффективности мечения зонда в реакции минисеквенирования.

Детальный анализ процесса накопления сигнального продукта, а именно изотермической амплификации сигнала, при ограниченном удлинении 03 на матрице ДНК с помощью ДНК-полимеразы может быть проведен только при наличии кинетической схемы многостадийного превращения ОЗ. Была детально изучена зависимость тушения флуоресценции Fam-содержащего зонда ZII (50 мкМ) в системе II от концентрации ДНК-матрицы Mil (10"5-^5xl0~i0 М) при удлинении 03 на один нуклеотид, несущий остаток тушителя (Тшг). 800

Рис. 8. Кинетические кривые реакции ферментативного мечения зонда ZII (50 мкМ) на матрице МИ, введенной в реакцию минисеквенирования в концентрации: 1 - 10, 2 - 5, 3 - 1, 4 -0.5,5-0.1,6-0.05, 7-0.01, 8 -0.005, 9 - 0.001,10- 0.0005 мкМ, соответственно. Температура проведения реакции 45°С. Концентрация dUTmTP - 100 мкМ.

20 40 60

Продолжительность реакции, мин

В результате анализа наблюдаемых профилей зависимости флуоресценции от времени реакции при различных концентрациях МП (рис. 8) была предложена кинетическая схема процесса, хорошо описывающая экспериментальные данные. С помощью пакета программ Dynafit 3.28 (BioKin, Ltd., США ) определены величины кинетических констант отдельных реакций (табл. 3). Таблица 3. Кинетическая схема мечения зонда в ходе реакции минисеквенирования ДНК и полученные величины констант скоростей реакций.

к, М + MZ+E п, л k-i к2 к, -- MZnE +dNTP MZn+iE ^ MZn+i k-z k2 \ E-iV Е0 к4 _ м к, + z„+i

к,/10', М-'с1 к.,, с"' М106, M V к-2, с"' к,/10", М"'с"' kt.c' ki/ЮЛ с"1

0.219±0.001 7.72±0.01 52.63+0.06 7.49±0.02 0.719±0.001 3.45±0.02 3.04±0.01

Кроме того, было показано, что предложенный способ усиления сигнала гибридизационного анализа при выявлении специфической последовательности ДНК может быть использован и в гетерофазных системах.

3. Разработка прототипов тест-систем для гетерофазного анализа НК

С использованием разработанного способа получения ДНК-чипов на основе капроновых мембран и явления увеличения чувствительности гибри-дизационного анализа ДНК в ходе реакции минисеквенирования разработан прототип тест-системы для выявления и генотипирования вируса гепатита С (ВГС, генотипы: 1а, 1Ь, 2а, 2Ь, За, ЗЬ). В качестве генотип-специфичного участка генома вируса была выбрана 5'-нетранслируемая область (5'-НТО). Проведен анализ 5'-НТО генома различных субтипов ВГС, опубликованных в международной базе данных [http://hcv.lanl.gov], и выбраны ОЗ, обеспечивающие высокую эффективность и селективность выявления не только соответствующих синтетических 30- и 70-звенных матриц, но и протяженных ДНК-фрагментов (F), полученных методом ОТ-ПЦР с использованием вирусной РНК, выделенной из препаратов крови пациентов.

Известную проблему снижения эффективности анализа при увеличении длины анализируемой ДНК мы преодолевали путем химического и ферментативного способов статистического фрагментирования полученного после ПЦР ДНК-фрагмента [Виноградова O.A. и др., 2007]. Химическое фрагмен-тирование осуществляли в кислых условиях (pH 2) с образованием апури-новых сайтов с дальнейшим гидролизом ДНК при термической обработке. Для ферментативного гидролиза ДНК-образец, содержащий остатки дезок-сиуридина, обрабатывали ферментом урацил-ДНК-гликозилазой Е. Coli.

Показано, что в оптимизированных условиях (62°С) использование фрагментированной ДНК-пробы приводит к увеличению интенсивности сигнала гибридизационного анализа по сравнению с нативным ДНК-образцом (рис. 9). При этом повышение таким способом чувствительности гибридизационного анализа не приводит к снижению его селективности.

dUTP

Н+(мин) dTTP Рис- 9. Сканированное изображение

30' 15' F П.2 0.6 1.2 капроновых мембран после проведения • • • • • $ ферментативного мечения иммобилизованных олигонуклеотидов в присутствии нативного и фрагментированного путем кислотного и ферментативного гидролиза ПЦР-фрагментов. F дцДНК-ампликон, соответствующий типоспецифическому участку гена ВГС.

ВГС 1

1а 1Ь

2а 2Ь За ЗЬ К+

Шф\

• Л

1Л

I Ф • 1» ш | ф § | ф » ф 9 »

• • '

В результате проведенных исследований был сконструирован чип, содержащий 10 зондов (рис. 10): 1 константный ВГС-специфичный, 7 генотип-специфичных и 2 ОЗ, обеспечивающих внутренний контроль тест-системы (К|+, К2+). Показано, что разработанный ДНК-чип позволяет достоверно различать генотип ВГС. Появление окрашивания в ВГС-специфичной и генотип-специфичной областях мембраны позволяет отнести к соответствующему генотипу генетический материал ВГС (рис. 10).

Генотип I h Генотип 2a Генотип За

• « • •

• • • •

о о

# # • •

о о

о о

о о

о о

• •

» • • •

• •

о о

» « • •

о о

0 # • •

о о

о о

о о

ф ф • •

• •

• • • •

о о

о о

о о

о о

о о

• * • •

# ш о о

• •

• •

ВГС

Тип la. lh

Тип 1а, 2а Тип lb Тип 2Л Тип 2Ь Тип За Тип ЗЬ К,+ К2+

Рис. 10. Шаблоны окрашивания капроновой мембраны (справа для каждого типа) и типичные изображения сканированных мембран после проведения генотипирования, где К,+ - контроль работы в системе конъюгата стрептави-дин-щелочная фосфатаза, а К2+ - контроль работы Taq ДНК-полимеразы.

Система анализа была апробирована более чем на 70 клинических образцах ВГС. Достоверность получаемых нами результатов подтверждена референс-методами (секвенирование, типоспецифичная ПЦР). Таким образом, разработанная тест-система позволяет надежно выявить и отнести к соответствующему субтипу генетический материал ВГС.

Анализ значимых нуклеотидных замен в составе высоковариабельных участков ДНК. Как правило, 03 являются высокоспецифичными, т.е. способными выявлять только определенные фрагменты ДНК, различающиеся одним или несколькими нуклеотидными остатками. Однако в генетическом материале, например, вирусов и бактерий, наряду с мутациями, определяющими в частности лекарственную устойчивость патогенов, могут возникать мутации, не влияющие на данный признак. Таким образом, возникает задача эффективного и селективного выявления конкретной нуклео-тидной замены, приводящей к значимой мутации, в присутствии дополнительных диагностически незначимых замен в сайте связывания ОЗ.

Для решения этой задачи использовали предложенную гетерофазную платформу на основе капроновой мембраны с УФ-иммобилизованными 03, а также схему выявления анализируемой ДНК с введением метки в состав иммобилизованных зондов путем ферментативного лигирования с биотин-содержащим олигонуклеотидным компонентом. Ферментативное лигиро-вание осуществляли с использованием ДНК-лигазы фага Т4 или термостабильных ДНК-лигаз [Закабунин А.И. и др., 2011].

Каждая система (табл. 4) состояла из двух ОЗ (З'-биотинилированного фосфатного компонента, иммобилизованного ОН-компонента) и матрицы -олигонуклеотида, соответствующего последовательности гена pol ВИЧ-1 и содержащего один из кодонов (62, 184, 70 и 215), мутации в котором приводят к возникновению лекарственной устойчивости. Анализ участков фрагмента кДНК гена pol ВИЧ-1 в непосредственной близости от исследуемых кодонов выявил, что помимо мутации в самом кодоне, приводящей к лекарственной устойчивости штамма вируса, в сайтах связывания 03 присутствуют дополнительные замены. Были проанализированы последовательности фрагмента кДНК гена роI ВИЧ-1 с использованием базы данных Стенфорд-ского университета [http://hiv.lanl.gov]. Часто встречаемые мутации (>5%) учитывали при выборе структур ОЗ, вводя в них вырожденные нуклеотидные

звенья (табл. 4). Таким образом, при синтезе 03 получали не одну последовательность, а набор, содержащий все необходимые комбинации.

Таблица. 4. Модельные системы для выявления значимых нуклеотидных замен в составе полиморфных участков ДНК на примере гена pol ВИЧ-1.

Система

Матрица/ тандем зондов

Ыо-

Поспедовательпости олигонуклеотидов Д1|К-лнтц

- Ью-

62 L

62L7

62LD+62Lbio

5 ' tacaatactccagtatttgTyataaagaaaaargayagya-

bio-AGGTATGTTATGAGGTCATAAACp"

3'aRTATTTC'TTTITYCTRTCRTG&TTY<Iio!

52 L™/

62Lm+62Lbio

5'TACAATACTCCAGTATTTGCYATAAAGAAAAA£GAYAGYA3 'bio-AGGTATGTTATGAGGTCATAAACps~

_'' GRTATTTCTTTTTYCTRTCRTGATTY-Тц' '

70L

70L"/

*70L"+ 70Lbio

'MAAAGAAAAAGRAYAGYACTAÄRTGGAGRAAATTAGTAGATT3' 'bio-CGRTATTTCTTTTTCYTRTCRTGAT£5

3'TYACCTCYaTTTAATCATCTAAAGTCYaTk

70L /

A70Lm+70Lbio

1 ataaagaaaaagrayagyactaGrtggagraaattagtagatt3'

bio-CGRTATTTCTTrTTCYTRTCRTGATp5'

3' CYACCTCYaTTTAATCATCTAAAGTCYaT) o5 '

184L

184L7 184L°+184Lbio

5 ' tc^acataí^artcatccaTgtatwgrtagatrwctatntc3'

' bi О - AGRRTGTATKKTYAGTAGGTp5 '

3'ACATAWCYAATCTAYWGATANAGACCATI0

184L7

484Lm+184Lbio

5 ' tcyyacatammartcatccaCgtatwgrtagatrwctathtc3'

'Ь i o-AGRRTGTATKKTYAGTAGGTp5 '

3'GCATAMCY*ATCIAYWGATAHAGACC*T,0

215L

215L7

215Ln+215Lbio

5 'tgakgytttttrtckggkgtrGTaprtccccanctcaacagat 3 ' Ъ1о-САС1мснааааа7А13МССМСАЬ>5'

- ~ JCATHYAGGAGGTNGAGTrrGTCTACACCAGARATK

2151/7

215Lm+215Lbio

51 tgakgytttttrtckggkgtrTAaprtccccanctcaacagat3'

'biO-GACTMCRAAAAAYAGMCCMCAYp5'

rATTHYAGGAGGTMGAGTTGTCIACACCAGARATio5'

Вырожденные звенья подчеркнуты и обозначены, согласно принятой номенклатуре (И - А, в; У = С, Т; М = А, С; К = в, Т; Б = С, в; \У = А, Т; Н = А, С, Т; В = С, в, Т;К = А, а С, Т). Значимые несоответствия выделены крупным шрифтом. Обозначения "и" отражают отсутствие (°) или наличие (") значимого несоответствия.

При анализе смеси матриц реакционная смесь на носителе содержала одновременно биотинилированные компоненты для всех систем. Поставленная задача будет решена, если продукт ферментативного лигирования образуется только в случае максимального соответствия менаду последовательностями зондов и матриц. На рисунке 11 приведены типичные результаты анализа смеси четырех синтетических матриц. Видно, что специфический сигнал наблюдается только в случае реализации максимально полного соответствия. Значимые однонуклеотидные замены в модельных ДНК достоверно выявляются. Смеси матриц

Рис. 11. Сканированное изображение ДНК-чипа после проведения параллельного анализа смесей матриц:

I - (62Ь"+70Ь"+184Ь"+215Ь"),

II - (62Ь1п+70Ь°+184Ь"1+215Ьт), Ш - (62Ь"+70Ь"+184Ъ°+215Ьт)

путем мультиплексного лигирования термостабильной ДНК-лигазой МеЛапоЬа^епит ЛегтоаиЮ^орЫсит. К+ - положительный контроль системы выявления.

О» I II III

s к+ « « » 9 « ®

s А62п s о • в

ее со _ л62ш • ©

е* чА70п • в в ff

§ ол70ш

О "л184п • • • 0

О S л184т • •

S л215п • •

s л215т О » ф fi

Таким образом, на модельных системах показано, что методом мультиплексного лигирования олигонуклеотидных тандемов удается точно определить состояние анализируемого полиморфного сайта при использовании капроновых ДНК-чипов, при этом наличие незначимых несоответствий в структуре ДНК, учтенное в последовательностях зондов, не препятствует проведению анализа. Использование такого подхода может быть крайне полезно при исследовании высоковариабельных геномов.

4. Молекулярно импринтированные полимеры

Гибридизационный анализ НК основан на их способности образовывать дуплекы с комплементарными последовательностями и на переведении акта образования комплекса в аппаратно-регистрируемый сигнал. Аналогично возможно выявление других биомолекул, имеющих собственные специфичные рецепторы. Однако в случае отсутствия природного рецептора или при сложности его получения и использования возможно создание синтетических материалов, способных специфично связываться с анализируемой молекулой и являться основой биосенсорного устройства. Молекулярно импринтированные полимеры (МИПы) - полимеры, способные к специфическому распознаванию молекул-шаблонов, в присутствии которых они были получены.

Мы предложили простой и оригинальный подход к формированию структурированных капроновых матриксов, способных к молекулярному распознаванию. В основе предложенного подхода лежит предположение, что при переходе, например, полимерных цепей капрона из растворенного в твердотельное состояние и при наличии в исходном растворе молекулярного шаблона в формируемом полиамидном матриксе могут образоваться сайты, специфически удерживающие шаблон, т.е. способные к специфическому распознаванию. Для реализации предложенного подхода выбран растворитель для полиамидов - 2,2,2-трифторэтанол (ТФЭ), обеспечивающий высокую растворимость капрона и сохранность молекулы-шаблона.

Строение полимерного матрикса - важный аспект исследования при получении МИПов, т.к. пространственная организация капронового каркаса оказывает существенное влияние на доступность сайтов специфического связывания молекулы-шаблона, расположенных во внутренних участках МИПа.

Для формирования капроновых пленок раствор капрона (1-10% по массе) в ТФЭ наносили на различные плоские твердотельные подложки (стекло, кремний и т.д.) и высушивали. Характеризацию структуры полимеров проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Видно (рис. 12А), что полученная из 1% раствора капрона в чистом ТФЭ полимерная пленка имеет непористую, гладкую структуру. В таких пленках недоступна внутренняя часть полимерного каркаса, следовательно, для получения МИПов необходимо использовать дополнительные компоненты, способствующие порообразованию.

Рис. 12. СЭМ-изображения пленок капрона, полученных после высушивания из 1% раствора капрона в: ТФЭ (А); ТФЭ в присутствии: 33% воды (Б); 5% ДМФА, 10 % воды (В); 10% глицерина (Г); 0.1% ПЭГ, 10 % воды (Д); О.Р/о^ПВП, 10 % воды (Е). Изображения пленок капрона, сформированных при 4, 20 и 50 "С из 1% раствора капрона в 90% ТФЭ, 10% воды, полученные с помощью оптической микроскопии (Ж-И). СЭМ-изображения получены в ЦКП «Наноструктуры» ИФП СО РАН.

В качестве порообразующих добавок использовали объёмные соединения, обладающие большой молекулярной массой (рис. 12Д,Е), например, биополимеры (бычий сывороточный альбумин (BSA) М=66.4 КДа) или синтетические полимеры (полиэтиленгликоль (ПЭГ) М=6 КДа, поливинил-пирролидон (ПВП) М=360 КДа), и сорастворители, скорость испарения которых отличается от скорости испарения основного растворителя (рис. 12Б-Г), а именно: протонные (вода, глицерин, бутанол), апротонные (пиридин, диметилсульфоксид, диметилформамид) или комбинация добавок (например, вода/ДМФА, вода/глицерин). Видно, что структура полимера значительно изменяется при смене порообразующего агента.

Температура формирования полимера также является значимым параметром, влияющим на скорость испарения растворителя и, следовательно, на структуру самоорганизующегося капронового каркаса, что было подтверждено с помощью оптической микроскопии (рис. 12Ж-И).

Получение МИПов на основе капрона проводили в двух форматах: в объемном, в виде суспензий микрочастиц, и на поверхности, в результате высыхания раствора полиамида с шаблоном на плоских носителях (стеклянные слайды) или на пористых подложках (фильтры на основе стекловаты). В

16

качестве шаблонов использовали как низкомолекулярные соединения (нук-леотиды, рибофлавин), так и высокомолекулярные (белки). Эффективность вторичного связывания МИПа с шаблоном оценивали с помощью спектрофо-тометрического, радиоизотопного или флуорометрического методов детекции. Во всех случаях в качестве контрольных выступали неимпринтирован-ные полимеры (НИПы), которые получали в отсутствии шаблона.

5 0,05

МИП до этапа вторичного связывания

Рис. 13. Электронные спектры поглощения растворенного

в ТФЭ МИПа и НИПа на гемоглобин, после удаления шаблона и проведения этапа вторичного связывания.

320

360

400

480

Длина волны, нм

Видно (рис. 13), что раствор МИПа после удаления шаблона (гемоглобин (НЬ)) в жестких условиях (5% 808, 5% СН3СООН) не содержит НЬ, что подтверждает полное вымывание шаблона из полимерного каркаса. При контакте с раствором НЬ МИП способен связывать шаблон, что подтверждается появлением оптического поглощения (Хтах=395 нм), характерного для гем-содержащего белка. Поглощение раствора НИПа в этой области спектра после инкубации с раствором НЬ отражает уровень неспецифической сорбции шаблона на капрон, однако его интенсивность существенно ниже. Ёмкость МИПа составила 28.3±9 мг НЬ на 1 г капрона, а средний коэффициент селективности (Аз95(МИП)/А395(НИП))-2.6±0.3.

При использовании низкомолекулярного шаблона нуклеотидной природы - аденозинтрифосфата (гАТР) - детекцию связывания шаблона с МИПом и НИПом осуществляли с помощью радиоизотопной метки [у-32Р].

Рис. 14. Специфическое связывание [у-32Р]гАТР с я капроновыми МИПами (темные столбцы) и & НИПами (светлые столбцы). Условия получения полимеров: / - 8% капрон в присутствии 5 % | воды; 2 - 6% капрон в присутствии 10% воды и

2 5% ДМФА, двумерный формат; 3 - 4% капрон в § присутствии 10% воды и 5% ДМФА; 4 - 2% ка-

3 прон в присутствии 10% воды и 5% ДМФА. Чер-| ными точками обозначен коэффициент селектив-д ности, рассчитанный как отношение эффектив-я ности связывания анализируемой молекулы с

МИПом и НИПом.

80

3 40 --

Варьируя как состав раствора полиамида (содержание капрона в растворе, присутствие сорастворителей), так и условия формирования твердотельного каркаса (пленки, микрочастицы), получен ряд гАТР-специфичных МИПов (рис. 14). Максимальный коэффициент селективности - отношение значений эффективности связывания [у-,2Р]гАТР с МИПом и НИПом, полученных в одинаковых условиях,- составил 3.6.

Флуоресцентную детекцию осуществляли с использованием в качестве молекул-мишеней флуоресцентно меченных белков (яичный (ОА) и бычий сывороточный альбумин (BSA) и др.).

D ~1ГИИ|р||1ШШр11

В D

50 м км

Д □ BSA-FITC

10

□ ОА-Тшг

Э 4

МИПОА M ИП BSA

Рис. 15. Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, капроновых МИПов для яичного (А, Б) и бычьего сывороточного (В, Г) альбумина после этапа молекулярного распознавания в присутствии флуоресцентно меченных белков: BSA-FITC (А, В), ОА-Тшг (Б, Д). Относительная интенсивность флуоресценции (за вычетом неспецифического связывания с НИПом) полимеров (МИП-BSA, МИП-ОА) после связывания с BSA-FITC (светлые столбцы) и ОА-Тшг (темные столбцы) по оценки с помощью программы ImageJ (Д).

Визуализацию связывания белка с МИПом и НИПом, а также полимером, полученным в присутствии другого белка, осуществляли с помощью флуоресцентной микроскопии в индивидуальных системах и при добавлении смеси белков (рис. 15А-Г). Во всех случаях максимальную эффективность связывания регистрировали при взаимодействии меченого белка и соответствующего МИПа. Коэффициент селективности относительно НИПа составил 1.4±0.1 для ОА и 1.8±0.3 для BSA. Селективность МИПов при распознавании шаблона из смеси белков относительно конкурирующего белка, с учетом неспецифического связывания шаблона с НИПом, составила 16 и 4 для МИП BSA и ОА, соответственно (рис. 15Д).

В результате на данном этапе продемонстрирована возможность формирования структурированных капроновых носителей, способных к молекулярному распознаванию как низкомолекулярных шаблонов, так и высо-

неорганизованных биополимеров. Универсальность предложенного подхода позволяет легко применить предложенную схему для приготовления МИПов к широкому спектру биомолекулярных шаблонов.

5. Заключение

Таким образом, в ходе данной работы исследованы различные этапы разработки подходов к анализу биомолекул. Высокая эффективность иммобилизации олигонуклеотидных зондов на твердотельный носитель, а также чувствительная и специфичная схема фермент-опосредованного выявления заданной последовательности ДНК позволила создать удобные системы анализа точечных мутаций.

Предложен простой и удобный подход к формированию капроновых МИПов, способных к специфичному связыванию различных молекул-шаблонов.

ВЫВОДЫ

1. Предложены новые подходы к повышению эффективности иммобилизации олигодезоксирибонуклеотидов на твердотельные носители различной природы, содержащие и не содержащие на поверхности химически активные группы.

> Показано, что в водных условиях эффективность ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов на микрочастицы, несущие на поверхности химически активные остатки активированных эфиров, изотиоционатов, ди-хлортриазина и др., повышается от 3 до 40 раз при наличии в реакционной смеси катионных поверхностно активных веществ цетил- или доде-цил-триметиламмония бромидов в концентрациях от 0.8 до 22 мМ.

> Продемонстрировано, что введение в структуру олигонуклеотидов короткого концевого декатимидилатного домена значительно повышает эффективность их УФ-индуцированной иммобилизации на нейлоне-6 (капроне), а также их фермент-зависимого мечения при гетерофазном выявлении специфических последовательностей ДНК. Представлены данные, свидетельствующие о том, что амидные, а не алифатические аминогруппы в структуре капрона являются центрами УФ-индуцированной фиксации олигонуклеотидных зондов.

2. Исследовано накопление продуктов ограниченного удлинения (мечения) олигодезоксирибонуклеотидов с помощью Taq ДНК-полимеразы в составе комплексов с анализируемой ДНК в изотемпературных условиях (реакция минисеквенирования).

> Установлено, что наиболее эффективное накопление продукта такой реакции вне зависимости от её формата (гомофазная или гетерофазная) происходит при температуре, близкой к температуре плавления комплексов олигонуклеотидный зонд/ДНК и продукт/ДНК. Предложена кинетическая схема процесса мечения зонда при минисеквенировании ДНК, позволяющая проводить количественный анализ эффективности образования сиг-

нального продукта в зависимости от условий гибридизации, структуры зонда и продукта его ферментативного уд линения.

3. Предложены прототипы аналитических тест-систем для диагностики молекулярных маркеров белковой и нуклеотидной природы.

> Продемонстрирована перспективность использования эллипсометриче-ского анализа для прямой (label-free) визуализации нативных белков и белок-белковых комплексов, иммобилизованных на поверхности кремниевых пластин в отсутствии или при наличии поверхностного монослоя наночастиц золота.

> Разработаны подходы к получению ДНК-чипов низкой плотности на основе капроновых мембран, несущих УФ-иммобилизованные олигонукле-отидные зонды. Предложены прототипы тест-систем для выявления и ге-нотипирования вируса гепатита С с помощью реакции минисеквенирова-ния ДНК и для анализа высоковариабельных участков ДНК на наличие значимых нуклеотидных замен, обуславливающих, например, лекарственную устойчивость ВИЧ-1, с помощью ферментативного лигирования олигонуклеотидов.

4. Предложен удобный оригинальный подход к получению молекулярно им-принтированных полимеров (МИПов) на основе капрона, основанный на переводе полиамидных цепей из растворенного в твердотельное состояние в присутствии молекулы-шаблона. С использованием 2,2,2-трифторэтанола в качестве основного растворителя получены МИПы, проявляющие способность к специфическому связыванию различных низко- и высокомолекулярных шаблонов, в том числе нуклеотидной и белковой природы, с коэффициентами селективности от 1.4 до 4.6.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Пышная И.А., Дмитриенко Е.В., Пышный Д.В. Способ получения ДНК-чипа // Патент РФ № 2340677, дата приоритета 07.05.2007.

2. Дмитриенко Е.В., Пышная И.А., Пышный Д.В. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидных производных. I. Ковалентная иммобилизация олигонуклеотидных зондов на капроне // Биоорган. химия. - 2010. - Т. 36. - С. 700-713.

3. Дмитриенко Е.В.. Хомякова Е.А., Пышная И.А., Брагин А.Г., Ведерников В.Е., Пышный Д.В. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидных производных. II. Изотермическая амплификация сигнала при анализе ДНК методом минисеквенирования // Биоорган, химия. - 2010. - Т. 36. - С. 802-814.

4. Дмитриенко Е.В.. Пышная И.А., Рогоза A.B., Пышный Д.В. Способ получения молекулярно-импринтированных полимеров // Патент РФ № 2385889, дата приоритета 25.08.2008.

5. Дмитриенко Е.В.. Булушев Р.Д., Ломзов A.A., Косолобов С.С., Латышев A.B., Пышная И.А., Пышный Д.В. Наноструктурированные полимерные мат-риксы для селективного распознавания биомолекул // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. -2011. - Т. 9. - С. 100-108.

6. Дмитриенко Е.В.. Булушев Р.Д., Пышная И.А., Пышный Д.В. Наноструктурированные полимерные матриксы для селективного распознавания биомолекул // Наука из первых рук. - 2011. - Т. 37. - С. 86-93.

7. Власов В.В., Синяков А.Н., Пышный Д.В., Рыхлицкий C.B. Дмитриенко Е.В. и др. всего 9 человек. Эллипсометрический мониторинг в микрочиповых label-free биотехнологиях // Автометрия. - 2011. - Т. 47. - С. 67-77.

8. Дмитриенко Е.В.. Шопаева Г.А., Бейсембаева Ш.А., Пышная И.А., Зары-това В.Ф., Пышный Д.В. Способ диагностики вирусного гепатита С и определение генетического типа вируса // Патент Республики Казахстан № 22681, дата приоритета 19.05.2009.

9. Дмитриенко Е.В., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., Пышный Д.В. Разработка новых подходов к параллельному анализу ДНК // Ученые записки СПбГМУ им. ак. Павлова. - 2008. - Т. 15. - С. 73-75.

10. Дмитриенко Е.В.. Шопаева Г.А., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., Пышный Д.В., Бейсембаева Ш.А. Анализ вируса гепатита С с использованием ДНК-биочипов // Терапевтический вестник. - 2010. - Т. 1. - С. 30-32.

Подписано в печать 11.02.2012г. заказ № 211 тираж 150 экз. Формат печати А4. Бумага офсет 80 гр. Печать цифровая Отпечатано в «Срочная полиграфия» ИП Малыгин А.М. Новосибирск проспект Академика Лаврентьева 6/1 оф. 104, тел.: 217-43-46.

61 12-2/576

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕТЕРОФАЗНОГО АНАЛИЗА БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

ДМИТРИЕНКО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

02.00.10 - биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Пышный Дмитрий Владимирович

Новосибирск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 5

1. Введение 7

2. БИОСЕНСОРНЫЕ УСТРОЙСТВА: ПРИРОДНЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ 9 СИСТЕМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ

(обзор литературы)

2.1 Биосенсоры 9

2.1.1 Детекция нуклеиновых кислот 11

2.1.1.1 Оптические методы детекции 14

2.1.1.1.1 Флуоресцентная детекция 14

2.1.1.1.2 Спектроскопия усиленного поверхностью комбинационного рассеяния 16 (КР)

2.1.1.1.3 Поверхностный плазмонный резонанс 18

2.1.1.1.4 Хемилюминесцентная детекция 19

2.1.1.1.5 Биолюминесцентная детекция 20

2.1.1.1.6 Колориметрическая детекция 21

2.1.1.2 Микромеханические (пьезоэлектрические) устройства 23

2.1.1.2.1 Кварцевые кристаллические микровесы 24

2.1.1.2.2 Микровесы на основе кантилевера для атомно-силовой микроскопии 26 (АСМ)

2.1.1.3 Электрохимические ДНК-сенсоры 28

2.1.1.3.1 Электрохимические label-free биосенсоры 29

2.1.1.3.1.1 Методы детекции, основанные на прямом переносе электронов в ДНК 29

2.1.1.3.1.2 Методы, основанные на изменениях проводящих свойств поверхности 30

2.1.1.3.1.3 Использование медиаторов в электрохимических методах детекции 33 ДНК

2.1.1.3.2 Электрохимический анализ с использованием репортерных групп 34

2.1.1.3.2.1 Электрохимический анализ ДНК, с использованием интеркаляторов и 34 малобороздочных лигандов

2.1.1.3.2.2 Использование Ox/Red репортерных групп для амплификации сигнала в 35 ДНК-сенсорах с электрохимическим принципом детекции

2.2 Получение и применение биотехнологически значимых молекулярно 39 импринтированных полимеров

2.2.1 Получение МИПов 40

2.2.2 Классификация методов молекулярного импринтинга 45

2.2.2.1 Нековалентный импринтинг 46

2.2.2.2 Ковалентный импринтинг 49

2.2.2.3 Полуковалентный импринтинг 51

2.2.3 МИПы на основе готовых полимеров 54

2.2.3.1 Полимерные мембраны и МИПы на основе капрона 54

2.2.3.2 МИПы на основе биополимеров 55

2.2.4 Импринтинг биологических объектов 5 8

2.2.4.1 Трудности импринтинга биомолекул 59

2.2.4.2 Трехмерный импринтинг биомолекул 61

2.2.4.2.1 Молекулярно импринтированные полимеры на основе гидрогелей 62

2.2.4.2.2 Импринтинг с использованием композитных материалов 63

2.2.4.2.3 Использование координирующих катионов металлов в процессе 65 импринтинга

2.2.4.2.4 Подход антигенной детерминанты 66

2.2.4.3 Двумерный импринтинг (импринтинг на поверхности) 67

2.2.4.4 Импринтинг биологических объектов (вирусы, бактерии, клетки) 69

2.2.5 Применение МИПов 74

2.2.5.1 Синтетические антитела in vivo 77

2.3 Заключение 78

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 86

3.1 Исходные материалы 86

3.2 Методики измерений и экспериментов 87

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 100 4.1 Иммобилизация нуклеиновых кислот на твердотельные подложки 100

4.1.1 Ковалентная иммобилизация аминосодержащих олигонуклеотидов на 100 различные гетерофазные поверхности

4.1.1.1 Эффективность иммобилизации 102

4.1.1.2 Гибридизационный анализ с использованием микроканальных кремниевых 111 матриц (МКМ)

4.1.1.3 Выявление биомолекул с помощью эллипсометрического сканирования 113

4.1.2 Фотоиммобилизация олигонуклеотидных зондов на капроне 116

4.1.2.1 Анализ факторов, определяющих эффективность иммобилизации 118 олигонуклеотидных зондов на капроновой мембране

4.1.2.2 Исследование эффективности выявления специфических 121 последовательностей ДНК с помощью УФ-иммобилизованных зондов

4.1.2.3 Влияние аминогрупп капрона на эффективность фотоиммобилизации 125 олигонуклеотидов

4.1.2.4 Анализ факторов, влияющих на светочувствительность капрона 127

4.2 Исследование эффективности выявления специфической 131 последовательности НК

4.2.1 Изотермическая амплификация сигнала при анализе ДНК методом 132

минисеквенирования

4.2.1.1 Описание модельных систем 134

4.2.1.1.1 Гомофазные модельные системы 135

4.2.1.1.2 Гетерофазные модельные системы 136

4.2.1.2 Изотермическая амплификация сигнала гибридизационного анализа в 136 гомофазном варианте

4.2.1.2.1 Влияние температуры реакции на эффективность ферментативного 136 мечения зонда

4.2.1.2.2 Анализ кинетической схемы изотермической амплификации сигнала 141

4.2.1.2.3 Анализ сиквенс-специфичности превращения зонда в реакции 143 минисеквенирования ДНК

4.2.1.3 Изотермическая амплификация сигнала в гетерофазном варианте 144

4.3 Разработка прототипов тест-систем для гетерофазного анализа НК 147 4.3.1. ДНК-чипы для выявления и генотипирования вируса гепатита С (ВГС) 147

4.3.1.1 Выбор и дизайн олигонуклеотидных зондов 149

4.3.1.2 Этапы проверки, отбора зондов и пробоподготовки анализируемой ДНК 152

4.3.1.3 Конструирование «empuña» 154 4.3.2 Анализ значимых нуклеотидных замен в составе полиморфных участков ДНК 156

4.4 Молекулярно импринтированные полимеры 161

4.4.1 Выбор растворителя 161

4.4.2 Структура полимерных матриксов 163

4.4.3 Получение МИПов 165

4.5 Заключение 173 5. ВЫВОДЫ 174 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 176

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСМ - атомно-силовая микроскопия

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВГС - вирус гепатита С

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВНТ - вирус некроза табака

ВТМ - вирус табачной мозаики

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГКР - гигантское комбинационное рассеяние

ДМАП - диметиламинопиридин

ДМЭГ - мелкодисперсный полимер на основе метакрилата

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТАБ - додецилтриметиламмония бромид

ИОП - интегральная оптическая плотность

кд - круговой дихроизм

ККМ (<2СМ) - кварцевые кристаллические микровесы

КР - комбинационное рассеяние

мип - молекулярно импринтированный полимер

МКМ - микроканальная кремниевая матрица

нип - неимпринтированный полимер

нк - нуклеиновая кислота

5'-НТО - 5'-нетранслируемая область

ГТААГ - полиакриламидный гель

ПАВ - поверхностно активное вещество

ПВП - поливинилпирролидон

ПЗС - прибор с зарядовой связью

пнк - полинуклеотидкиназа

ППР - поверхностный плазмонный резонанс

ПСА - персульфат аммония

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНКаза А - рибонуклеаза А

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТГФ - тетрагидрофуран

Трис - трисоксиметиламинометан

ТФП - 2,2,3,3-тетрафторпропанол

ТФЭ - 2,2,2-трифторэтанол

ТЭА - триэтиламин

УФ - ультрафиолет

хл - хемилюминесценция

ЧРВ - риновирус человека

ЧСА - сывороточный альбумин человека

ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид

ЭИС - электрохимическая импедансная спектроскопия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АА

AAc

ABCN

ABTS

AIBN

AMPSA

APBA

APS

APTMS

APTES

BAA

BIO

BSA

BCIP

Cy3

Cy5

dNTP

ddNTP

DAPA

DGEBA

DEAEM

DMAEM

DMAPMAA

DTT

DVB

EBA

EGDMA

FAM

FITC

FRET

Hb

HSA

MA

MAA

MBA

NBT

NIPAm

NOBE

Oa

Ob

PAA-HC1

PETEA

PGDM

PMMA

PS

SDS

Tamra

TBAA

TB Am

TEOS

VBIDA

- акриламид

- акриловая кислота

- азобис(циклогексанкарбонитрилл)

- 2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)

- 2,2-азобисизобуторонитрил (2,2-azobisisobutyronitrile)

- 2-акриламидо-2,2'-диметилпропан сульфоновой кислоты

- 3-аминофенилбороновая кислота

- N-(3 -аминопропил)метакриламида гидрохлорид

- 3-аминопропилтриметоксисилан

- аминопропилтриэтоксисилан

- бензилакриламид

- остаток биотина

- бычий сывороточный альбумин

- 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат натиевая соль

- индокарбоцианин

- индодикарбоцианин

- дезоксинуклеотидтрифосфат

- дидезоксинуклеотидтрифосфат

- 1Ч,]\Р-диакрилпиперазин

- N,N'-1,2-дигидроксиэтилен-бис(акриламид)

- диэтиламиноэтилметакрилат

- диметиламиноэтилметакрилат

- N-[3-(диметиламино) пропил]метакриламид

- дитиотреитол

- дивинилбензол

- ]\[,1Ч'-этиленбисакриламид

- этиленгликольдиметакрилат

- остаток флуоресцеина

- флуоресцеинизотиоцианат

- резонансный перенос энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

- гемоглобин

- сывороточный альбумин человека

- малеиновая кислота

- метакриловая кислота

- Ы,М'-метилен-бис(акриламид)

- нитротетразолиевый синий

- N-изопропилакриламид

- NjO-бисметакрилоил этаноламин

- яичный альбумин

- обелин

- полиаллиламин гидрохлорид

- пентаэритритолтетракрилат

- пропиленгликоль диметакрилат

- полиметилметакрилат

- полистирол

- додецилсульфат натрия

- тетраметилкарбоксиродамин

- N-тетрабутилакриламид

- N-трет-бутилакриламид

- тетраэтилортосиликат

- Ы-(4-венилбензол)иминодиуксусная кислота

VI - винилимидазол

2-УРу - 2-винилпиридин

4-УРу - 4-винилпиридин

УР - 1-винил-2-пироллидон

ТВА - 3-тиофенбороновая кислота

ТСБА - триглицерин диакрилат

ТМЯ - остаток тетраметилродамина

ТМРБ - триметоксипропилсилан

ТШМ - триметилпропантриметакрилат

ШЮ - урацил-ДНК-гликозилаза

1. ВВЕДЕНИЕ

При решении фундаментальных и практических задач современной науки в области молекулярной биологии, биотехнологии и молекулярной диагностики особое внимание уделяется исследованиям, направленным на создание простых в экспериментальном отношении, недорогих, чувствительных и селективных методов анализа, обеспечивающих быстрое выявление биомолекул-маркеров в образце [1,2].

Биосенсорные устройства - аналитические системы, сочетающие в себе вышеперечисленные качества. В основе действия биосенсоров лежит процесс высокоспецифичного распознавания анализируемых молекул-мишеней [3]. Роль биосенсора - обеспечить платформу, позволяющую перевести факт обнаружения аналита (образования комплекса НК-зонд/мишень, антиген/антитело, лиганд/рецептор) в аппаратно или визуально регистрируемый сигнал [4]. Самыми известными примерами биосенсорных устройств являются биочипы [5, 6]. Разработка биосенсорного устройства требует согласования многих факторов, важное место среди которых отведено эффективности формирования специфического взаимодействия (связывания) между распознающим слоем биосенсора и анализируемой молекулой. Распознающий элемент биосенсора, как правило, представляет собой иммобилизованные биомолекулы, способные к специфическому связыванию аналита, следовательно, эффективность распознавания зависит от степени иммобилизации биомолекул на поверхность твердотельного носителя в составе биосенсорного устройства и их доступности для специфических взаимодействий. В основе любых биосенсорных систем лежит реализация молекулярного распознавания аналита и образование специфического комплекса. Однако не для всех молекул существуют природные аффинные агенты, обеспечивающие образование комплекса и выявление аналита. В таких случаях в качестве распознающего элемента биосенсора могут выступать искусственные конструкции, имитирующие природные агенты [7]. К таким конструкциям можно отнести молекулярно импринтированные полимеры (МИПы). МИПы - это полимеры, полученные в присутствии молекулы-шаблона (аналита) и способные (после удаления шаблона из состава полимера) к специфичному молекулярному распознаванию молекулы, подобной шаблону [см. напр., 8].

Для достоверной регистрации сигнала биосенсоры должны обладать высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к определяемому компоненту. При этом чувствительность сенсора - то есть способность обнаруживать аналит в очень низких концентрациях - главным образом зависит от способа детекции формируемого комплекса, а специфичность определяется природой взаимодействия иммобилизованных на

биосенсоре молекул с аналитом. Повышение эффективности гетерофазного анализа биомолекул возможно практически на каждом этапе создания и работы биосенсора, начиная с иммобилизации молекул на твердотельные носители до генерации сигнала анализа.

Цель данной работы - исследование перспектив использования различных типов материалов в качестве твердотельных подложек для гетерофазного анализа биомолекулярных объектов (главным образом, нуклеоиновых кислот и белков), а также разработка и оптимизация подходов к их быстрому и специфичному выявлению.

В ходе данной работы необходимо было решить следующие задачи:

• провести скрининг быстрых и эффективных способов иммобилизации биомолекул (НК и белков) на твердотельные носители различной природы (кремниевые слайды, кремниевые микроканальные матрицы (МКМ), микрочастицы из органических и неорганических полимеров, полимерные мембраны), основанных на использовании химически активированных или неактивированных подложек, в том числе с привлечением фотоиндуцируемых процессов;

• изучить процесс генерации сигнала гибридизационного анализа ДНК в гетерофазном формате, проводимого при ограниченном удлинении олигонуклеотидных зондов на ДНК-матрице с помощью ДНК зависимой ДНК-полимеразы Ткегтия ациаИсш (Тад ДНК-полимеразы) в изотермических условиях (минисеквенирование);

• разработать перспективные ДНК-диагностические подходы к высокоселективному гетерофазному анализу вариабельных сайтов в составе нуклеиновых кислот с помощью биочипов низкой плотности, создаваемых на основе мембранного капронового носителя и пригодных для генотипирования вирусных инфекций;

• получить молекулярно импринтированые полимеры (МИПы) на основе нейлона-6 (капрона) для специфичного связывания различных биомолекулярных маркеров, в том числе белковой и нуклеотидной природы.

2. БИОСЕНСОРНЫЕ УСТРОЙСТВА: ПРИРОДНЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ

{обзор литературы)

Создание биосенсорных устройств - популярная тематика последних лет, развитие биочиповых технологий происходит крайне быстро. В литературе представлено огромное разнообразие различных подходов к анализу таких биомолекул как нуклеиновые кислоты и белки с использованием различных подложек и способов визуализации сигнала анализа.

В первой части обзора представлены основные принципы действия биосенсорных устройств, способы детекции и чувствительность выявления анализируемых молекул. Учитывая неугасающий интерес и большой объем работ, представленных в литературе, мы сделали акцент на гибридизационном анализе нуклеиновых кислот (НК). Вторая часть посвящена молекулярному импринтингу как способу получения синтетических рецепторов и их использованию в процессах выявления и выделения различных биомолекул.

2.1 Биосенсоры

Биосенсор - аналитическое устройство, в котором распознающий элемент содержит материал, способный к специфическому связыванию биомолекул, например, ферменты, низкомолекулярные рецепторы, антител а/антигены, нуклеиновые кислоты и т.д. [9]. Распознающий элемент может реагировать непосредственно на присутствие анализируемого компонента или генерировать сигнал, обусловленный содержанием аналита. Далее с помощью физического преобразователя (трансдьюсера) образование специфического комплекса между распознающим элементом и анализируемым веществом переводится в аппаратно-регистрируемый сигнал. Существует большое количество физических трансдьюсеров, используемых в биосенсорных системах: оптические, электрохимические, микромеханические, спектроскопические, термические, пьезоэлектрические и другие. Общее устройство сенсора схематически изображено на рисунке 2.1.

Аналит

О А О Д ДО ДО Д

Рис. 2.1." Схема биосенсорного устройства, где Y - распознающий элемент биосенсора, О -анализируемая молекула, Д - примеси в растворе аналита.

Для достоверной регистрации сигнала, биосенсоры должны обладать высокой чувствительностью (то есть способностью обнаруживать минимальное количество аналита), специфичностью к определяемому компоненту и возможностью регенерации, позволяющей повторное использование сенсора без существенной потери эффективности. Чувствительность сенсора, главным образом, зависит от способа детекции формируемого комплекса. Условно все методы детекции аналита, применяемые в сенсорных технологиях, можно разделить на два принципиально различных типа:

• без использования репортерных групп (Label-free) [10];

• основанные на использовании репортерных групп (или меток) [11].

В первом случае детектируют непосредственно акт связывания анализируемой молекулы с распознающим элементом, который может быть визуализирован с помощью физических преобразователей биосенсоров. Во втором - в качестве генераторов аналитического сигнала могут выступать различные репортерные группы, позволяющие проводить визуализацию во время или сразу после формирования специфического комплекса. Различают прямой метод детекции репортерной группы и метод опосредованной визуализации (например, после проведения фермент-зависимых реакций), основанный на превращении специфических субстратов, обеспечивающих появление регистрируемого сигнала. Присутствие анализируемой мишени может быть выявлено как при обнаружении сигнала от репортерной группы, так и при «выключении» сигнала (например, тушение флуоресценции). Выбор типа метки зависит от многих параметров, но, как правило, к соединению, используемому в качестве мет�