Особенности химического лигирования в ДНК-дуплексах необычной пространственной структуры тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

: МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.113.4

ФЕДОРОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ХИМИЧЕСКОГО ЛИГИРОВАНИЯ В ДНК-ДУПЛЕКСАХ НЕОБЫЧНОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных вешеств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на Химическом факультете МГУ.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

З.А. Шабарова

кандидат химических наук М.Б. Готтих

Официальные оппоненты: доктор «Риз-лит; наук, профессор

Ю.С. Лазуркин

кандидат химических наук A.B. Цытович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В .А. Энгельгардта РАН

Защита состоится "М" ^¿¿/OlfßX 1995 года в /У часов на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 117234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан ttDü&S 1995 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

V

.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Метод химического лигирования был впервые предложен в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ в 70-х годах. В дальнейшем он был развит как альтернативный энзнматическому метод сборки протяженных фрагментов ДНК. Этот метод основан на сближении концов олигонуклеотидов на комплементарной матрице с последующим образованием межнуклеотидной связи под действием химических реагентов. В основе его лежат два основных подхода. Первый предусматривает предварительную активацию фосфомоноэфирной группы, вовлеченной в образование межнуклеотидной связи в составе ДНК-дуплекса. Второй подход состоит в использовании конденсирующего реагента для синтеза фосфодиэфирной связи непосредственно в ДНК-дуплексе. В настоящее время нашли широкое применение два конденсирующих агента - 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК) и бромциан. Необходимо отметить, что метод активации фосфатной группы с использованием карбодиимида имеет два существенных недостатка. С одной стороны, синтез природной межнуклеотидной связи протекает достаточно медленно, от 40 до 48 часов. С другой стороны, карбодиимид способен модифицировать гетероциклические основания олигонуклеотидов (гуанин и тимин), поэтому продукт лигирования обладает недостаточной чистотой. Это может создавать определенные проблемы, например, при изучении взаимодействия такого продукта с ферментами. Указанные недостатки отсутствуют, если ХЛ осуществляется в присутствии ВгС1М. Существуют два способа активации фосфатной группы с использованием бромииана. Первый способ предусматривает проведение реакции в имидазольном буфере. Показано, что в этом случае реальным активирующим агентом является 1-цианоимидазол и скорость реакции сравнима со скоростью образования межнуклеотидной связи под действием карбодиимида (5-20 ч). Второй способ активации, предложенный Н.И.Соколовой в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ, предполагает использование морфолиноэтансульфонатного (МЭС) буфера, оттитрованного триэтиламином до рН 7.5, вместо имидазольного. Этот способ примечателен уникальной скоростью реакции - образование продукта лигирования заканчивается за 3-5 минут. В лаборатории Химии

нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ была подробно исследована зависимость эффективности ВгСМ-индуцируемого лигировання от природы реагирующих групп и нуклеозидов в месте образования межнуклеотидной связи. Однако механизм этой реакции детально не исследовался. Невыясненным оставатся и вопрос о зависимости эффективности ХЛ от пространственной организации дуплекса. В то время как лигирование в линейном дуплексе с использованием бромииана в МЭС-буфере позволяет получить необходимый продукт с практически количественным выходом (90-95 9с), при попытке применения ВгС1\[-индуцируемого метода лигирования к синтезу более сложных структур (например, циклических олигонуклеотидов) было отмечено снижение выхода продукта реакции. Следует отметить, что получение одно- и двутяжевых фрагментов ДНК необычной пространственной структуры может представлять интерес как с точки зрения изучения некоторых аспектов белково-нуклеинового взаимодействия, так и в прикладной области - сенсовой и антисенсовой биотехнологии.

Целью настоящей работы является изучение механизма ХЛ под действием ВгСМ и оптимизация методики лигирования с использованием ВгСЫ для получения фрагментов ДНК необычной пространственной структуры (например, тех же циклических однотяжевых олигонуклеотидов). Кроме того, важно было выяснить, можно ли использовать метод лигирования под действием карбодиимида и бромииана для тестирования пространственной структуры ДНК-дуплексов. Это позволило бы быстро получать необходимую информацию о структуре исследуемых дуплексов с использованием простых методик и относительно дешевых реагентов. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе изучен механизм активации фосфатной группы под действием бромциана в МЭС-буфере. Показано, что этот реагент можно использовать не только для химического лигирования, но и для получения производных олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе. Метод химического лигирования впервые использован для тестирования пространственной структуры ДНК-дуплексов и получения информации о том, какие из нескольких возможных способов гибридизации реализуются на практике. Оптимизированы условия ХЛ в применении к синтезу олигонуклеотидов необычной пространственной структуры (например, циклических

однотяжевых олигонуклеотидов, которые могли бы найти применение в антисенсовой биотехнологии). Исследованы особенности лигирования линейного олигонуклеотида на циклической матрице. Показано, что при лигировании линейного олигонуклеотида на циклической матрице возможно образование катенанов. Изучена зависимость направления реакции и выхода продуктов лигирования от нуклеогилной последовательности линейного олигонуклеотида и циклической матрицы. С помощью методов лигирования под действием карбодиимида и BrCN изучено строение места разветвления в трехлучевом ДНК-дуплексе с разрывом. Также с использованием этих реагентов показано, что 3'-концевой а- и э'-концевой p-аномерные фрагменты 76-звенного олигонуклеотша образуют внутримолекулярный параллельный дуплекс. Полученные данные значительно расширяют область применения метода химического лигирования под действием BrCN и ЭДК. Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3-й Международной конференции по рибонуклеазе Н (Осака, Япония, 1994 г.) и на Международной конференции "Therapeutic oligonucleotides: from cell to man" (Сейяк, Франция, 1995 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и одна статья принята в печать.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на /// страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (/¡^ссылок), содержит ¿'/ рисунков и/¡^таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Синтез, выделение и очистка олигонуклеотидов, используемых в работе, были проведены сотрудниками лаборатории химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ Орецкой Т.С., Романовой Е.А., Волковым Е.М., Ташлицким В.Н. 76-звенный олигонуклеотид, состоящий из фрагментов с а- и р-аномерной структурой, был любезно предоставлен д-ром Клодом Мальви (Институт Гюстава Русс», Вильжюиф, Франция). В работе также использовали 5 М раствор бромциана в абс. аиетонитриле (Aldrich, США), 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК) (Aldrich, США). Реакции химического лигирования под действием BrCN проводили в 1 М МЭС-

или М-метилморфолиновом буфере, рН 7.6, 0.02 М М§СЬ, при 0°С в течение 3-5 мин., концентрация BгCN в реакционной смеси составляла

0.5 М. Реакция с использованием ЭДК проводили в 0.05 N1 МЭС-буфере, рН 5.0. 0.02 М МвСЬ, при 0°С в течение 48 ч.. концентрация ЭДК составляла 0.2 М. Реакционные смеси анатизироваш ион-парной ВЭЖХ или электрофорезом в 20 или 15 5с полиакриламилном геле, содержащем 7 М мочевину, фрагменты ДНК или РНК визуализировали авторадиографией или прокрашиванием геля раствором бромистого этидия.

1. Изучение протекания химического лигирования в ДНК-ду/ыексах при неигичии нескольких возможных способов гибридизации.

Как уже отмечаюсь выше, ХЛ было детатьно изучено для канонических линейных ДНК-дуплексов. Однако подробного изучения ХЛ в дуплексах необычной пространственной структуры к настоящему времени проведено не было. Необходимость такого изучения объясняется тем, что метод ХЛ можно использовать для исследования систем, в которых возможно несколько направлений гибридизации. Кроме этого, в результате лигирования в таких системах возможно получение фрагментов ДНК необычной структуры. В работе изучены две системы: протяженный линейный олигонукдеотид, концы которого комплементарны а) линейной матрице или б) фрагменту циклической матрицы.

1.1 Лигировапие линейного олигоиуклеотида на линейной матрице.

Необходимо отметить, что система, состоящая из протяженного линейного олигоиуклеотида, концы которого комплементарны короткой линейной матрице, интересна тем. что при лигирования в ней возможно образование циклического олигоиуклеотида. В лаборатории Химии нуклеиновых кислот было начато изучение ХЛ в такой системе. При этом ставилась двоякая задача: с одной стороны, важно было разработать метод синтеза циклических однотяжевых олигонуклеотидов, поскольку они могли бы использоваться в антисенсовоп биотехнологии. С другой стороны, было интересно использовать ХЛ для изучения формирования дуплексов в системе с несколькими возможными направлениями гибридизации. В системе, состоящей из протяженного линейного

олигонуклеотнда, концы которого комплементарны короткой линейной матрице, может реализоваться несколько способов гибридизации (рис. 1): Линейный

олигонуклеотид д- Матрица д.

Рис. 1. Возможные способы гибридизации линейного олигонуклеотнда с линейной матрицей. Стрелкой обозначено место разрыва.

Ятя того, чтобы выяснить, какие из этих вариантов реализуются на практике, было предложено ковапентно соединить концы линейного олигонуклеотнда с использованием метода химического лигирования. Тогда по продуктам реакции можно судить о том, какие из трех дуплексов преимущественно образуются. Как видно из рис. 1, при лигировании в такой системе возможно образование трех продуктов: циклического олигонуклеотнда (путь В), линейного димера (путь А) и циклического димера (путь Б). Было подробно изучено влияние первичной структуры олигонуклеотнда на эффективность его циклизации и показано, что образование внутренних элементов вторичной структуры может значительно препятствовать образованию циклических продуктов. В связи с этим было предложено ввести в состав олигонуклеотнда группировки ненуклеотидной природы, которые уменьшали бы вероятность нежелательного структурирования лигируемого олигонуклеотида.

1.1.1. Изучение влияния нсиуклеопшдных фрагментов, введенных в состав олигонуклеотида, на его гибридизацию с линейной матрицей.

В настоящей работе продолжены начатые в лаборатории исследования по химическому лигированию линейных олигонуклеотидов. содержащих ненуклеотидные фрагменты, на линейной матрице. Были выбраны пять линейных 38-звенных олигонуклеотидов: немодифицированный, со вставками 1,2-дидезокси-0-рибофуранозы и три олигонуклеотида с различным числом вставок гексаэтиленгликоля (Рис. 2). Представлялось интересным выяснить, каким образом введение в олигонуклеотид подобных вставок будет влиять на его гибридизацию с матрицей.

А СТА ттс стс ств ссс тстт_^ т , т

т СТТ ОАО Т5 I 3 рСТТ САС Т

т т

т ТТСАСТ5 I 3;рСТТСАСТ т—у

(^ЛИН^

-((ЕС16)П

т СТТСАОТ5' | 3 рСТТСАСТт (Злчн-) - п=3

<4лин> П=4 (5Лнн.) "

5' С\\ СТС АСА АОТ СА 3' (6)

т У

т

Рис. 2. Линейные олигонуклеотиды-предшественники для исследования направления гибридизации с матрицей (6). Стрелкой указано место образования межнуклеотидной связи. Я - вставки 1,2-дидезокси-0-рпбофуранозы. ([ЕС]^),, - вставки гексаэтиленгликоля.

Вначале реакцию проводили под действием бромииана в условиях, разработанных в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ (0.25 М МЭС. рН 7.5. 0.02 М МяСЬ, 0.5 М ВгСЫ). Оказалось, что при лигировании ^модифицированного предшественника ('тин.) образуется единственный продукт - циклический олигонуклеотид цикл) с выходом 55-60 %, то есть реакция протекает согласно пути В (Рис. 1). При лигировании линейного олигонуклеотида (2Л1Ш),

' "Здесь и далее арабскими цифрами обозначены олигонуклеотиды.

содержащего вставки 1.2-дидезокси-0-рибофуранозы, кроме 38-звенного циклического олигонуклеотида (55-60 ^с) образуется также в небольших количествах (около 10 5?) 76-звенный циклический димер (Рис. 1, путь Б). Что касается линейных олигонуклеотидов со вставками гексаэтиленгликоля, то в этом случае наблюдается более сложная картина: образуются все три возможных продукта (линейный димер с выходом 1519 %, циклический димер с выходом 12% и циклический олигонуклеотид с выходом 20-30 %). Это может быть вызвано тем, что с одной стороны, вставки гексаэтиленгликоля могут взаимодействовать с ионами магния буфера с образованием структур, напоминающих краун-эфиры. В этом случае способность предшественника к гибридизации с матрицей будет меняться непредсказуемым образом. С другой стороны, можно предположить, что значительное увеличение гибкости олигонуклеотида. обусловленное вставками гексаэтиленгликоля, приводит к тому, что все возможные направления гибридизации становятся практически равновероятными.

Таким образом, мы установили, что при лигировании олигонуклеотидов со вставками 1,2-дидезокси-0-рибофуранозы~ и ^модифицированного основным продуктом реакции является циклический однотяжевой олигонуклеотид, который образуется с достаточно высоким выходом (55-60 %). Циклические олигонуклеотиды могли бы стать новым перспективным классом антисенсовых олигонуклеотидов, поскольку они обладают повышенной устойчивостью к действию экзонуклеаз и не содержат чужеродных для клетки модификаций. Поэтому нам представлялось важным оптимизировать методик}' получения этих соединений. Для этого было необходимо исследовать механизм активации фосфатной группы под действием ВгСЫ в МЭС-буфере. Как отмечалось выше, преимуществом этого метода является исключительно высокая скорость реакции и отсутствие модификации гетероциклический оснований.

1.1.2. Изучение механизма химического лигирования под действием бромциана.

Первой стадией образования межнуклеотидной связи в процессе ХЛ является активация фосфатной группы. В связи с этим было необходимо выяснить, осуществляется ли эта активация непосредственно при

взаимодействии ВгСЬ' с фосфатной группой или активирующим агентом я ил я с г с я продукт взаимодействия ВгСЫ с компонентом буфера. Для этого мы исследовали протекание В гС М-индуцируемого лигирования в дуплексе, образованном линейным олигонуклеотидом (1лш| ) и матрицей (6) (рис. I) в различных буферных системах (МЭС, К-метилморфолин, ХЕПЕС. Ы-метилимидазол, Ка-фосфат и Ыа-карбонат).

Оказалось, что образование продукта реакции происходит только в буферных системах, содержащих М-замещенный морфолин (морфолиноэтансульфонат (МЭС) или Ы-метил морфолин) и К-метилимидазол. Отметим также, что реакция в буферах на основе Гч-замещенных морфолинов протекает значительно эффективнее (55-60 %), чем в Ы-метилимидазольном буфере (15-20 %). Во всех случаях реакция заканчивалась за 3 - 5 мин. Присутствие в реакционной среде триэтиламина не оказывает никакого влияния на эффективность реакции. Полученные нами данные позволили предположить, что для активации фосфатной группы необходимо совместное присутствие бромциана и 1М-замещенного морфолина (или М-метилимидазола).

Для того, чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали взаимодействие гуанозин-5'-фосфата с этанолом под действием бромциана в воде и в 1 М водных растворах различных третичных аминов: Г\'-метилморфолина. МЭС, Ы-метилимидазола (рН 7.6) и триэтиламина (рН 10). Образование этилового эфира гуанозин-5'-фосфата с высоким выходом (около 70%) происходило за 3-5 мин. Обработка нуклеотида бромцианом в отсутствие амина в 50% водном этаноле не приводила к образованию эфира.

Полученные результаты подтвердили нашу гипотезу о том. что для активации фосфатной группы действительно необходимо совместное присутствие бромциана и третичного амина. То, что трпэтилампн способен участвовать в реакции при рН 10, но не оказывает никакого влияния на эффективность лигирования при рН 7.5, свидетельствует о том. что в активации фосфатной группы может участвовать только непротонированная амипо; ;>уппа. Следует отметить, что скорость образования этилового эфира гуанозино-фосфата (то есть межмолекулярного фосфорилирования) так же высока, как и скорость образования фосфодиэфирной связи в месте разрыва в ДНК-дуплексе. Это позволило предположить, что оба процесса протекают по

одинаковому механизму. При этом ХЛ. как уже отмечаюсь, протекает наиболее эффективно в буферах на основе М-замешенных морфолинов. Поэтому в дальнейших исследованиях мы сосредоточили свое внимание на этих буферных системах.

Было изучено влияние концентрации К'-замещенного морфолнна на эффективность образования межнуклеотиднои связи в дуплексе, образованном линейным олигонуклеотпдом (1Л„Н.) и матрицей (6). Оказалось. что ХЛ протекает наиболее эффективно при I М концентрации М-замешенного морфолина, а с уменьшением и увеличением концентрации буфера эффективность ХЛ падает.

Для того, чтобы объяснить полученные результаты, было проанализировано изменение рН М-метилморфолинопых буферов разной концентрации после окончания реакции. Исходное значение рН всех буферов составляло 7.6. Известно, что при ХЛ происходит разложение ВгС1^, сопровождающееся закислением срелы из-за выделения НВг. Если в ходе реакции М-метилморфолин выполняет только роль буфера, то должно было наблюдаться плавное повышение рН реакционной смеси с увеличением концентрации Ы-метилморфолина. Оказалось. что зависимость конечного значения рН реакционной смеси от концентрации метилморфолина является более сложной и проходит через минимум при концентрации 0.5 М, то есть при эквимолярном- соотношении метилморфолина и бромциана. Следовательно, изменение рН реакционной смеси можно объяснить только тем, что выделение НВг происходит в результате взаимодействия с М-метилморфолином.

Таким образом, повышение выхода продукта реакции с увеличением концентрации Г^-замещенного морфолина от 0.05 до 0.5 М можно объяснить тем, что при этом возрастает концентрация активирующего агента, который представляет собой продукт взаимодействия бромциана с 1Ч-метилморфолином. Для выяснения природы активного интермедиата использоватся метод ЯМР. С помощью 'Н и 'ЗС-ЯМР спектроскопии было установлено, что первой стадией реакции яатяется образование соединения (А). Это соединение устойчиво в водных растворах, но способно практически мгновенно взаимодействовать с фосфатной группой. Образующийся смешанный ангидрид фосфата с циановой кислотой быстро реагирует с любым нуклеофилом: Н2О, ОН-группой спирта и т.д.:

+ ВгСМ

н2о

(А)

0

1

н,со-р-осм

о

н2о

Очевидно, что синтез межнуклеотидной связи под действием ВгСЫ в ДНК-дуплексе протекает по аналогичному механизму.

Таким образом, на основании установленного механизма активации фосфатной группы в присутствии ВгСЫ можно предложить оптимальные условия ХЛ: 1 М МЭС или Ь'-метилморфолин, рН 7.6, 0,5 М ВгС1М, 0°С, 3-5 мин.

1.1.3. Выявление оптимального метода синтеза циклических олигонуклеопшдов.

Было важно сравнить эффективность различных методов лигирования при синтезе циклических олигонуклеотидов с тем, чтобы выбрать оптимальный метод с точки зрения выхода целевого продукта. Для этой цели проводилось химическое и ферментативное лигирование в дуплексе, сформированном линейным немодифнцированным олигонуклеотидом (1ЛШ1.) и матрицей (6) (Рис. 2). Лигирование под действием ВгСЫ проводилось по методике, описанной в разделе 1.1.2. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в денатурирующих условиях или ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Полученные результаты приведены в Табл. 1.

Как видно из Табл. 1, минимальный выход циклического олигонуклеотпда наблюдается при использовании ферментативного метода лигирования. Это может быть обусловлено тем, что одноцепочечный фрагмент предшественника, не участвующий в гибридизации с матрицей, создает стсрические затруднения, мешающие работе фермента. Оба химических метода позволяют получить циклический олпгонуклеотид с достаточно высоким выходом (до 80 сс).

Табл. 1. Эффективность циклизации линейного олигонуклеотида (1лим.) на матрице (6) при использовании различных методов лигирования._

Метод лигирования Реагирующие группы в месте образования межнуклеотидной связи Выход циклического олигонуклеотида, %

Ферментативный (с помощью Т4 ДНК-лигазы) 5'-фосфатная и 3'-гидроксильная 60-65

Химический, с использованием карбодиимида 5'-фосфатная и 3'-фосфатная 75-80

Химический, с использованием бромииана 5'-гидроксильная и 3'-фосфатная 75-80

Однако при выборе оптимального метода предпочтение стоит:отдать ВгСМ-индуцируемому лигированию, поскольку реакция протекает значительно быстрее и не сопровождается модификацией гетероциклических оснований. Выбор реагирующих групп в месте разрыва связан с тем, что при лигировании в канонических линейных дуплексах эти группы являются оптимальными для каждого метода лигирования. В случае реакции между двумя фосфатными группами образующаяся межнуоеотидная связь является пирофосфатной. Эта межнуклеотилная связь может быть получена и с использованием ВгС!^, но в этом случае эффективность ХЛ ниже. Так, при лигировании линейного олигонуклеотида, содержащего 3'- и 5'-концевые фосфатные группы, выход циклического олигонуклеотида составляет не более 50-55 %. При использовании 5'-фосфатной и З'-гидроксильной группы эффективность лигирования еще понижается и не превышает 45 %. В связи с этим в дальнейшем при изучении ХЛ линейных олигонуклеотидов, содержащих 3-Р-метку на 5'-коние, лигирование как в присутствии ЭДК. так и в присутствии ВгСЫ проводилось с участием двух фосфатных групп.

Таким образом, установлено, что направление гибридизации линейного протяженного олигонуклеотида с матрицей зависит от его

структуры. Введение в линейный олигонуклеотид ненуклеотидных вставок повышает вероятность гибридизации такого олигонуклеотида с матрицей по пути А и Б (рис. 1), что приводит к увеличению выхода димерных продуктов в результате ХЛ. Оптимизирована методика получения циклических олигонуклеотидов. Использование новой У(етодики ХЛ в присутствии ВгСК позволяет ползать циклические олигонуклеотилы с выходом, который на 20 % выше, чем в условиях, предложенных ранее.

2.2. Особенности лнгироваиия линейного олнгоиуклеотида на циклической матрице.

Изучение протекания лигирования линейного олигонуклеотида на циклической матрице было весьуш интересно как с точки зрения выяснения того, какие способы гибридизации с матрицей реашзуются в такой сложной системе, так и с точки зрения возможности получения полициклических соединений с использованием метола химического лигирования. Как и в предыдущем случае, было решено коватентно соединить концы линейного олигонуклеотида с использованием метода химического лигирования и по продуктам реакции определить, какие из возможных путей гибридизации реализуются в этой системе. Для того, чтобы изучить особенности лигирования линейного олигонуклеотида на

ДНК-дуплексы.

(11)

циклической матрице, были сконструированы приведенные на рис. 3.

т ААОСТТССТССООТС С Т

(7цж.)-> А 5' 3' Т

ТТСТТССС7'Ф рССТСАСТ' (8)-> „СААСССЛ— ССАОТОА^.

я ллс.сттсстсссстс т

£ 3

(7лии.)-» А_ 5' 3' _/

ТТСТТС,6'(77'Ф />ССТСАСТТ т С ЛАС ССА — 6"СЛОТОАТТ

(9ш.кл.) V 3

^ССАСПТССЛССССС-'

-"Здесь и далее римскими цифрами обозначены ДНК-дуплексы.

Рис. 3. Дуплекс (Iii. сконструированный для изучения особенностей лигирования линейного олигонухлеоти^.! на циклической матрице по сравнению с лигированием на .синенной матрице в луплексе (П.

Сайт узнавания ферментом рестрикции HindlU подчеркнет.

Сайт узнавания ферментом рестрикции Mva\ вьоелен жирным

курсивом.

Место образопания меж>".:<леотид:-:оп связи обозначено стрелкой.

5-звенные фрагменты 55-зьекногс олигон\-клеотила (7111Н) и 36-звенной циклической матрицы ). способные образовывывать

дуплекс в дополнение к основному ¡4-зЕенному дуплексу, выделены жирным шрифтом.

Дтя облегчения идентификации продуктов лигирования. в олигонуклеотидную последовательность предшественника и матрицы были введены участки узнавания ферментами рестрикции Mva\ и HincüU.

Гибридизация линейного ол;:гон>~с:еот1иа и циклической матрицы может проходить по различным напраалекиям (рис. 4).

Линейный

Рис. 4. Возможные п\ти гибридизации линейного олигонуклеотпда на циклической матрице.

При лигировании в такой системе возможно образование циклического олигонуклеотида (путь А), катснана (путь Б), линейного димсра (путь В) и циклического димсра (путь Г). Как и при исследовании лигирования на линейной матрице, мы использовали химические и ферментативный методы (Рис. 5). Образование межнуклеотидной связи происходило с участием З'-фосфатной и 5'-фосфатной групп предшественника при использовании карбодиимида и бромциана и с участием З'-гидроксильнои и 5'-фосфатной групп при использовании ДНК лигазы.

1 2 3 4 5 6 7

^ кат. 2

7кат.1

7лин.лнм

7ЦИКЛ.

7ЛИН.

Рис. 5. Радиоавтограф электрофоретпческого разделения реакционных смесей, содержащих продукты лигирования в дуплексе (II) с использованием ЭДК (дорожка 3), ДНК-лигазы (дорожка 5) и ВК^ (дорожка 7) и для сравнения продукты лигирования в дуплексе (I) с использованием карбодиимида (дорожка 2), ДНК-лигазы (дорожка 4) и ВгСК (дорожка 6). Дорожка 1 - исходный 38-звенный линейный олигонуклеотид (7Л11Н).

Как видно из рис. 5.. лигирование линейного олигонуклеотида (7Лин.) на Циклической матрице (9ЦИКЛ_) привело к образованию четырех продуктов. При этом при использовании карбодиимида и ДНК лигазы основным продуктом лигирования я&тяется 38-звенный циклический олигонуклеотид (7Ш1КЛ). Аналогичная ситуация наблюдается и при лигировании на линейной матрице. ВгС1М-индуцируемое лигирование в дуплексе (II) приводит к образованию всех продуктов в приблизительно равных количествах, в то время как при лигировании в дуплексе (I) основным продуктом таьЬке является циклический олигонуклеотид

(7ШПС1). Структуру продуктов лигирования подтверждали с помошыо ферментов рестрикции МусА и НтсП1\. Было доказано, что продукт (7Ш1КЛ) является циклическим олигонуклеотидом. продукт (7 Л1Ш Л||м ) ' яатяется линейным димером олигонуклеотида^.-шн.)- а продукты (7кат ]) и (7мт2) °°а являются катенанами. Необходимо было выяснить, в чем состоит различие между полученными катенанами. Одноцепочечные фрагменты 38-звенного олигонуклеотида (7ЛИН) и 36-звенной циклической матрицы (9ЦНКЛ.) (не участвующие в образовании 14-звенного дуплекса) способны формировать дуплекс из 5 пар оснований (эти участки выделены жирным шрифтом на рис. 3). Было сделано предположение, что если при гибридизации линейного олигонуклеотида с матрицей сначала образуется 5-звенный дуплекс, а потом уже 14-звенный. то в результате лигирования образуется катенан с переплетенной пространственной структурой (б) (Рис. 6). Если же сначала образуется 14-звенный дуплекс, то продуктом реакции будет катенан с пространственной структурой (а) (Рис. 6).

38-звенное кольцо катенана

36-звенное кольцо катенана Рис. 6. Возможные способы пространственной организации катенана.

Для того, чтобы проверить эту гипотезу, были синтезированы линейный олигонуклеотид и циклическая матрица, в которых одноцепочечные участки не могут гибридизоваться и значит возможно образование только катенана со структурой (а):

Т1ТТ Тл

тТТТТТТТТТТТ Т 5' 3'

ТсЗСССТАСр 1 рТАТССССТ-тССССАТС —АТАСССС-^ т т

т ТТТ1ТТТТТТТТТТТТ Т-^

• (Юл,ш.) (' 'цикл.)

Лигирование в дуплексе (III) также проводили с использованием

- ферментативного и химического (под действием ЭДК и ВгСМ) методов. Линейный олигонуклеотид (10лин) был 5'-мсченным. Образование межнуклеотидной связи происходило с участием З'-фосфатной и 5'-фосфатной групп линейного олнгонуклеотида при использовании карбодиимида и бромциана и с участием З'-гнлроксильной и 5'-фосфатной групп при использовании ДНК лигазы (рис. 7).

Как видно из рис. 7, про лигировании в дуплексе (III) образуется только один катенан. Так как в этом дуплексе образование переплетенной структуры (б) (рис. 6) невозможно, очевидно, что образующийся катенан имеет структуру (а) (рис. 6). Тогда обладающий аналогичной электрофоретической подвижностью (7каТ2) тоже имеет структуру (а), а соединение *(7кат [) с более высокой электрофоретической подвижностью имеет более компактную структуру, то есть структуру (б).

При конструировании системы (III) также ставилась цель изучить влияние расположения GC-тракта (вблизи ника или по флангам дуплекса) на направление протекания лигирования. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при перемещении GC-участков к флангам дуплекса направление реакции независимо от выбранного метода лигирования смещается в сторону образования 38-звенного циклического олнгонуклеотида (Рис. 7, дорожки 3-5).

Таким образом, показано, что из четырех возможных способов гибридизации линейного олнгонуклеотида с циклической матрицей (рис. 4), в основном, ре&тизуются толко три. Не обнаружено образования

12 3 4 5

Рис. 7. Радиоавтограф электрофоретического разделения реакционных смесей, содержащих продукты лигирования с помощью BrCN в дуплексах (II) (дорожка 2) и (III) (дорожка 3), а также продукты лигирования в дуплексе (III) под действием ДНК-лигазы и ЭДК (дорожки 4 и 5 соответственно). Дорожка 1 - 38-звенный олигонуклеотид (7Л|Ш).

циклического димера. Также установлено, что на направление гибридизации влияет первичная структура предшественника н матрицы. При смешении ОС-участков от середины к концам дуплекса гибридизация происходит преимущественно по пути А (рис. 4).

3. Применение конденсирующих реагентов (ЭДК и ЛгС1\') дм изучения пространственной структуры ДНК-душексов. 3.1. Исследование трехлучевых ДНК-дуплексов.

Среди многочисленных конформашш ДНК существует множество структур, отличных от классической В-формы ДНК, но в то же время играющих важную биологическую роль. Например, разветатенные структуры (такие, как, к примеру, структура Холидея), могут возникать в процессе репликации, рекомбинации и репарации ДНК. Поэтому такие структуры являются предметом тщательного изучения для многих исследователей. Исследование трехлучевых ДНК-структур показало, что место разветвления обладает необычными свойствами по сравнению с линейной ДНК. Для того, чтобы получить дополнительную информацию о структуре места разветвления в трехлучевых дуплексах с разрывом, впервые предложено использовать метод химического лигирования с использованием ВгСХ и водорастворимого карбодиимида (ЭДК).

Был изучен трехлучевой дуплекс с разрывом (IV), образованный 40-звенным олигонуклеотидом (12), формирующим внутреннюю шпильку, и двумя комплементарными олигонуклеотидами (13) и (14) (рис. 8).

Существование дуплексов (IV) и (V) было подтверждено метолом электрофореза в неденатурирующих условиях. Была изучена термическая устойчивость дуплекса (IV) и показано, что он устойчив в условиях химического лигирования. Для того, чтобы оценить, будет ли дуплекс (IV) расплетен вблизи места разветвления в такой же степени, как трехлучевая структура без разрыва (V), а также чтобы определить, насколько в этом дуплексе сближены 3'- конец олигонуклеотида (14) и 5'-конеи олигонуклеотида (13). использовался метод химического лигирования. В качестве конденсирующих агентов использовались ЭДК и бромциан. При попытке осуществить ХЛ в дуплексе (IV) с использованием обоих конденсирующих реагентов обнаружено, что образования ожидаемого

продукта - 22-звенного олигонуклсотпда (16) - не происходит ни в одном

(12)

СОАТАССТАС

тт

г Т

с с с с с с

Т А с с с й А Т С о

ТТСАСАОТСС

ССТАТССАТСр , рААСТСТСАССТТ

5' I 3-

(13)

(14)

(iv)

ТТ Т Т

с с с с с с Т А с в с о С2) А Т

СС 3'

ССАТАССТАС ТТСАСАОТСС ССТАТССАТСр —рААСТСТСАССТТ (16)

(V)

5' 05)

СОАТАССТАС ■—ТТСАСАОТСС ' ССТАТССАТСр 1 рААОТСТСАОСТТ .. 3' (13) 5' 13' (И) 5

(VI)

Рис. 8. Трехлучевые дуплексы (IV) и (V), сконструированные для изучения места разветвления. и контрольный линейный дуплекс (VI). Олигонуклеотид (16) был предварительно синтезирован с использованием ХЛ под действием ВгСЫ в дуплексе (VI). Стрелкой обозначено место разрыва в дуплексе, р-р - пирофосфагная связь.

случае. Можно объяснить это обстоятельство тем, что реагирующие группы месте разветвления недостаточно сближены для образования межнуклеотидне связи. Поэтому было дополнительно исследовано протекание химическо!

лигирования в следующих дуплексах:

тт т т с о в с в с

Т А

с в с в

(12) А Т (12)

5' С С 3' 5'

СОАТАССТАС ТТСАСАОТСС СОАТАССТАС

ССТ.АТССАТСТр . рААСТСТСАССТТ ССТАТССАТСр I рТААСТСТСАССТТ З- (17) 5' ] 3' (14) 5' 3'

ТТ Т Т

с с о с о с

Т А С о

с с

А Т

СС^. 3'

ТТСАСАОТСС

(13)

1')

3'

(18)

(VII)

(VIII)

тт т т

С G G С G С Т А С G С G (12) А Т 5 С G J

CGATACGTAG TTCACAGTCG G CTATG САТСТр, pTAAG TG TCAG СТТ 3' (17) 5- ¡ з' (18) 5'

(IX)

3 CGATACGTAG GCTATGCATCTp 3' (

\

<15)

— TTCACAGTCG 3 pAAGTGTCAGCTT (17) <14) -i1

(15)

5 CGATACG TAG-TTCACAGTCG3

3' GCTATGCATCp pTAAGTGTCAGCTTj' (13) (1S)

^CGATACGTAG GCTATGCATCTp 3' (17)

(15)

TTCACAGTCG3' pTAAGTGTCAGCTT (18) 5'

(XIi

(XII)

Эти дуплексы содержат одно (VII, VIII) или два (IX) "лишних" тимидиновых звена в сайте .пигирования по сравнению с дуплексом (IV). „Цитирование проводили в сравнении с линейными дуплексами (Х-ХП), в которых также имелись один или два "лишних" нуклеотида в месте разрыва.. Полученные результаты показали, что лигирование с использованием ЭДК в дуплексах (VII-XII) приводит к образованию 23-или 24-звенных олигонуклеотидов (Рис. 9), что свидетельствует о том, что во всех этих дуплексах 3'- и 5'-концевые фосфатные группы в разрыве сближены на расстояние, достаточное для образования ковалентной связи.

Рис. 9. Радиоавтограф электрофоре-тического разделения реакционных смесей, содержащих продукты ЭДК-пндуцируемого лигирования в дуплексах (IV) (дорожка 2), (VI) (дорожка 3), (VIII) (дорожка 4), (XI) (дорожка 5), (VII) (дорожка 7). (X) (дорожка 8), (IX) (дорожка 9) и (XII) (дорожка 10). Дорожки 1 и 5 - исходные олигонуклеотиды (13) и (17). Полосы с меньшей, чем у исходных олигонуклеотидов. электрофоретической подвижностью соответствуют продуктам модификации гетероциклических оснований карбодиимндом.

■i i 3 Ч г с ц g в ю

Выход продукта лигирования в разветаненных дуплексах (\'П-1Х) не зависит от числа "лишних" тиминовых звеньев в нике и составляет 8-10 сс. что существенно ниже, чем в линейном дуплексе (VI). Такие же данные

были получены и при лигировании в линейных дуплексах (Х-ХП). Поскольку эффективность реакции была достаточно низкой, можно предположить, что реагирующие группы в месте образования межнуклеотидноп связи обладают повышенной конформационной подвижностью.

Химическое лигпрование с помощью ВгСХ протекает в линейных дуплексах (X) и (XI) с одним "лишним" тимидиновым остатком в никс. В то же время лигпрование отсутствует в дуплексах со шпилькой (\/П-1Х). а также в линейном дуплексе (XII) с двумя "лишними" тимидиновыми остатками в нике. Сравнивая результаты, полученные при использовании обоих методов лигирования, можно сделать следующие выводы:

1. Реагирующие группы в разветвленных дуплексах (VI1-1Х) могут быть сближены на расстояние, достаточное для образования межнуклеотидной связи.

2. Исходя из полученных данных по ХЛ с помощью бромциана, видно, что концевые- -группы олигонуклеотидов в месте образования межнуклеотидной-связи в дуплексах (\711-1Х) и (XII) менее закреплены, чем в дуплексах (X) и (XI). Можно предположить, что водородные связи между парами оснований, примыкающими к месту разветвления в дуплексах (IV) и (УП-1Х), разрушены, и высвобожденные нуклеотиды обладают такой же конформационной подвижностью, как и "лишние" тимидиновые остатки в дуплексе (XII). В то же время следует отметить, что может быть "распарено" только по одной паре с каждой стороны, поскольку в случае "распаривания" большего числа нуклеотидных пар лигпрование не могло бы происходить вообще. Кроме того, можно заключить, что стебель шпильки не расплетен, так как в противном случае сближение фосфатных групп в дуплексах (VI¡-IX) было бы невозможным.

Следовательно, согласно данным по химическому лигированию, можно заключить, что дуплексы со шпилькой (IV) и (У11-1Х) обладают У-образной пространственной структурой (рис. 10). Вряд ли можно предположить, что геометрия трехлучевых дуплексов с разрывом в месте разветвления (VIЫХ) будет аналогична геометрии трехлучевых структур с выпетливанием, то есть приближаться к Т-образной структуре (рис. 10). В противном случае эффективность химического лигирования должна зависеть от числа "лишних" тимидиновых остатков в нике, что противоречит экспериментальным данным.

о

о

У-образная структура Т-образная структура

Рис. 10. Две возможные модели пространственного строения трехлучевых структур.

3.2. Применение -конденсирующих реагентов для подтверждения пространственной структуры 76-звенного олигоиуклеощда, состоящего из а- и р-аномерных фрагментов.

В рамках сотрудничества с Лабораторией физико-химии и фармакологии биологических макромолекул Института Гюстава Руссн (Вильжюиф, Франция) был прехтожен новый тип антисенсовых олигонуклеотидов. содержащих З'-кониевой а-аномерный фрагмент, комплементарный 5'-концевой р-аномерной последовательности (олигонуклеотид (19), рис. 11). Потенциально такой олигонуклеотид способен образовывать псевдоциклическую вторичную структуру за счет образования З'-концевым а- и 5'-кониевым р-фрагментами параллельного дуплекса. Такой олигонуклеотид. образующий внутримолекулярный параллельный дуплекс, интересен тем, что может быть бифункциональным агентом, поскольку его олноцепочечная часть может содержать антисенсовую последовательность, а параллельный дуплекс, образованный а- и р-фрагментами. может формировать триплекс с одноиепочечной ДНК или РНК или служить ловушкой для ДНК-связываюших белков. Кроме того, такая псевлоииклическая молекула должна обладать повышенной устойчивостью к нуклеазной деградации, поскольку наиболее чувствительные к действию нуклеаз концы олигонуклеотида вовлечены в образование дуплекса. Так как наряду с внутримолекулярным дуплексом этот олигонуклеотид способен образовывать межмолекулярный дуплекс, нам было необходимо выяснить, какая из двух альтернативных структур предпочтительно образуется.

(19) 24 (5 антисенс

Т ТАССТСТАССССАСААСГТССс

С Т

Т—КН2 Т

Т 5'

Т А'

АОАААААОССОООААТСАААОА Т Т ТСТТТТТССС ССС ТТАС 7Т7Г7р-кн<сн2)6соон

22 р

Т

22а

О 9

II и ...

н

T-NH = 0 ^

1 к

Рис. 11. Смешанный 76-звенный а-р олигонуклеотид. Последовательность 22 а-нуклеотидов выделена курсивом.

Для этого был использован—.прием,-' заключающийся в кросс-линкинге двух цепей дуплекса. Для этого в нуклеотидную последовательность р-фрагмента изучаемой молекулы было введено модифицированное звено с алифатической аминогруппой, а на З'-конец молекулы был присоединен остаток 7-аминоэнантовой кислоты. Для образования ковалентной связи между амино- и карбоксильной группами использовались конденсирующие агенты (ЭДК и ВгСМ). В результате кросс-линкинга было получено соединение, обладающее при электрофорезе в денатурирующих условиях подвижностью, отличной ог подвижности исходного 76-звенного линейного олигонуклеотида, но совпадающей с подвижностью специально синтезированного контрольного 76-звенного циклического олигонуклеотида и контрольного 120-звенного линейного олигонуклеотида. Это свидетельствует о том, что а-р-олигонуклеотид (19) формирует внутримолекулярный, а не димерный дуплекс, который обладал бы меньшей подвижностью в геле, чем 120-звенный олигонуклеотид. Для подтверждения того, что полученный продукт ковалентно связан линкером З'-р-МЖСН^^СОХН-, мы провели избирательное расщепление фосфоамидной связи уксусной кислотой и

показати, что при этом наблюдается образование линейного 76-звенного

олигонуклеотила.

\

ВЫВОДЫ

1. Изучен механизм химического лигирования под действием бромииана. Устаноыено. что реатьным активирующим фосфомоноэфирную фуппу агентом является продукт взаимодействия ВК^ с Ы-замешенным морфолином. Показано, что бромииан можно использовать не только для химического лигирования. но и для получения аткиловых эфиров нуклеотидов.

2. Оптимизирована методика синтеза циклических олигонуклеотидов методом химического лигирования под действием ВгС1Ч.

3. Исследованы особенности лигирования линейного олигонуклеотила на циклической матрице. Показано, что структура и выход продуктов реакции зависит от метода лигирования и нуклеотидной последовательности как в дуплексе, так и в одноцепочечных участках

" матрицы и лигируемого олигонуклеотила. Установлено, что химическое лигирование в этой системе может приводить к образованию катенанов. Формированию катенанов способствует наличие СС-участков вблизи места образования межнуклеотидной связи в дуплексе.

4. Показано, что метод химического лигирования можно использовать для тестирования пространственного строения ДНК-дуплексов неканонического типа. С помощью этого метода исследована структура места разветвления в трехлучевых ду плексах с разрывом.

5. Показано, что ВгСЫ можно использовать для кросс-линкинга в ДНК-дуплексах. С помощью конденсирующих агентов ЭДК и ВК^ изучена пространственная структура смешанного а-р-олигонуклеотида и показано, что его концевые фрагменты образуют внутримолекулярный параллельный дуплекс.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. Федорова. О.А.. Готтих. М.Б.. Романова, Е.А., Орецкая, Т.С., Лолинная. Н.Г., Шабарова. З.А. : Циклические олигонуклеотиды: гибридизационные свойства и способность вызывать расщепление РНК РНКазойН (1995) Мол. биол. т. 29. 1161-1167.

2. Федорова. О.А.. Готтих, М.Б., Максименко, А.В., Орецкая, Т.С., Шабарова. З.А. Изучение механизма химического лигирования ДНК под действием бромциана (1995) Бноорган. химия 21, 869-874.

3. Gottikh, М.В., Fedorova. О.А.. Baiid-Demattei, M.-V., Giorgi-Renault, S.. Bertrand, J.-R.. Shabatova, Z.A., Malvy, C. Alpha-beta chimeric oligonucleotides form a new stable "snail-like" structure. J. Am. Cliem. Soc.. in press.

4. Shabarova. Z. A., Blumenfeld, M., Cliebotar (Fedorova). O. A.. Oretskaya, T. S., Vasseur, M. (1994): Design and Synthesis of Substrates to Study RN'ase H. 3rd International Conference on Ribonuclease H, Osaka, Japan, April 1994.

5. Shabarova. Z. A., Fedorova. O. A.. Maksimenko, A. V., Blumenfeld, M., Merenkova, I. N.. Gottikh, M. B, (1995): Circular single-stranded oligonucleotides: synthesis and biological properties. International

. , q{mfeyence:,..rrherapeutic. oligonucleotides: from cell to man", poster abstract 1 9, Seillac, France, April 1995.